ES2323651T3 - Dominios sinteticos de inmunoglobulina con propiedades de union elaborados por ingenieria en regiones de la molecula diferentes de las regiones que determinan la complementariedad. - Google Patents
Dominios sinteticos de inmunoglobulina con propiedades de union elaborados por ingenieria en regiones de la molecula diferentes de las regiones que determinan la complementariedad. Download PDFInfo
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Abstract
Método de preparación por ingeniería de una inmunoglobulina que comprende una región bucle estructural modificada, para proporcionar un sitio de unión no-CDR, y determinar la unión de dicha inmunoglobulina a un epítopo de un antígeno, en donde la región bucle estructural sin modificar no se une significativamente a dicho epítopo, el cual método comprende los pasos de: - provisión de un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina que comprende por lo menos una región bucle estructural, - modificación de por lo menos un radical nucleótido de dicha región bucle estructural mediante mutagénesis, en donde dicha modificación, o bien a) se selecciona por un método de mutagénesis, del grupo formado al azar, semi-azar, aleatorización dirigida al sitio, mutagénesis por scanning y métodos combinatorios, o b) hay más de un bucle estructural para proporcionar una unión de sitio a dicho epítopo, o c) excluye la incorporación de un péptido biológicamente activo de 2 a 40 aminoácidos en un dominio Fc. - transferencia de dicho ácido nucleico modificado en un sistema de expresión, - expresión de dicha inmunoglobulina modificada, - puesta en contacto de la inmunoglobulina modificada expresada, con unos epítopos, y - determinación de si dicha inmunoglobulina modificada se ha unido a dicho epítopo.
Description
Dominios sintéticos de inmunoglobulina con
propiedades de unión elaborados por ingeniería en regiones de la
molécula diferentes de las regiones que determinan la
complementariedad.
La presente invención se refiere a un método
para el diseño y fabricación de una inmunoglobulina modificada.
El campo general es la ingeniería de proteínas
con la finalidad de conferirles propiedades de enlace específicas.
Más específicamente, las proteínas de diseño de relevancia aquí son
inmunoglobulinas (anticuerpos), y aún más específicamente, dominios
sencillos o pares o combinaciones de dominios sencillos de
inmunoglobulinas. Las propiedades de enlace específicas de
inmunoglobulinas son características importantes ya que controlan
la interacción con moléculas tales como antígenos, y hacen útiles a
las inmunoglobulinas para aplicaciones de diagnóstico y
terapéuticas.
La estructura de anticuerpos básica se explicará
aquí utilizando como ejemplo una inmunoglobulina IgG1 intacta.
Dos cadenas pesadas idénticas (H) y dos ligeras
idénticas (L) se combinan para formar la molécula de anticuerpo en
forma de Y. Las cadenas pesadas tienen cada una cuatro dominios. Los
dominios variables amino terminales (VH) están en las puntas de la
Y. A estos siguen tres dominios constantes: CH1, CH2 y el CH3
carboxi terminal, en la base del tronco Y. Un tramo corto, el
conmutador, conecta las regiones constantes y variables de la
cadena pesada. La bisagra conecta los CH2 y CH3 (el fragmento Fc) al
resto del anticuerpo (los fragmentos Fab). Un Fc y dos fragmentos
Fab idénticos se pueden producir por escisión proteolítica de la
bisagra en una molécula de anticuerpo intacta. Las cadenas ligeras
están construidas con dos dominios, el variable (VL) y el constante
(CL), separados por un conmutador.
Los enlaces disulfuro en la región bisagra
conectan dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras se acoplan a las
cadenas pesadas por enlaces disulfuro adicionales. Las porciones de
hidratos de carbono enlazadas por Asn se conectan en diferentes
posiciones en dominios constantes dependiendo de la clase de
inmunoglobulina. En la IgG1, dos enlaces disulfuro en la región
bisagra, entre los pares Cys235 y Cys238, unen las dos cadenas
pesadas. Las cadenas ligeras se acoplan a las cadenas pesadas a
través de dos enlaces disulfuro adicionales, entre Cys229s en los
dominios CH_{1} y Cys2l4s en los dominios CL. Las porciones de
hidratos de carbono se conectan a la Asn306 de cada CH_{2},
generando un bulto pronunciado en el tronco de la Y.
Estas características tienen consecuencias
funcionales profundas. Las regiones variables tanto de las cadenas
pesadas como de las ligeras (VH) y (VL) se encuentran en las
"puntas" de la Y, donde se ubican para reaccionar con el
antígeno. Esta punta de la molécula es el lado en el que se ubica el
extremo N de la secuencia de aminoácidos. El tronco de la Y se
proyecta de forma que medie eficientemente en funciones efectoras
tales como la activación del complemento y la interacción con
receptores Fc ó ADCC y ADCP. Sus dominios CH2 y CH3 se abultan para
facilitar la interacción con proteínas efectoras. El terminal C de
la secuencia de aminoácidos se ubica en el lado opuesto de la
punta, que puede denominarse "fondo" de la Y. La estructura de
una IgG1 intacta se ilustra en la Figura 1a.
En los anticuerpos se encuentran dos tipos de
cadenas ligeras, denominadas landa (\lambda) y kappa (\kappa).
Una inmunoglobulina dada, tiene ó cadenas \kappa ó cadenas
\lambda, nunca una de cada. No se ha encontrado diferencia
funcional entre anticuerpos que tengan cadenas ligeras \lambda ó
\kappa.
La organización estructural de los monómeros de
la clase de inmunoglobulina humana principal se ilustra en la
Figura 1b. Las clases difieren en la composición y la secuencia de
sus cadenas pesadas respectivas. Tanto IgM como IgE carecen de una
región bisagra pero cada una contiene un dominio de cadena pesada
extra (CH4). Los números y las ubicaciones de los enlaces disulfuro
(líneas) que enlazan las cadenas difieren entre los isotipos.
También difieren en la distribución de los grupos hidrato de carbono
N-enlazados, mostrados simbólicamente como
círculos.
Cada dominio en una molécula de anticuerpo tiene
una estructura similar de dos hojas beta empaquetadas apretadamente
entre sí en un barril beta antiparalelo comprimido. Esta estructura
conservada se denomina pliegue de la inmunoglobulina. El pliegue de
la inmunoglobulina de dominios constantes contiene una hoja de
3-hebras empaquetadas contra una hoja de
4-hebras. El pliegue se estabiliza por puentes de
hidrógeno entre las hebras beta de cada hoja, por enlace
hidrofóbicos entre los residuos de hojas opuestas en el interior, y
por un enlace disulfuro entre las hojas. La hoja de
3-hebras comprende las hebras C, F y G, la hoja de
4-hebras tiene las hebras A, B, E y D. Las letras A
a G representan las posiciones secuenciales de las hebras beta sobre
la secuencia de aminoácidos del pliegue de la inmunoglobulina.
El pliegue de los dominios variables tiene 9
hebras beta dispuestas en dos hojas de 4 y 5 hebras. La hoja de
5-hebras es estructuralmente homóloga a la hoja de
3-hebras de los dominios constantes, pero contiene
las hebras extra C' y C''. El resto de las hebras (A, B, C, D, E, F,
G) tienen la misma topología y una estructura similar a sus
complementarias en el dominio constante de los pliegues de la
inmunoglobulina. Un enlace disulfuro une las hebras B y F en hojas
opuestas, como en los dominios constantes. El pliegue de la
inmunoglobulina se ilustra en la Figura 2 para un dominio constante
y uno variable de una inmunoglobulina.
Los dominios variables tanto de las cadenas de
inmunoglobulina ligeras como de las pesadas contienen tres bucles
hipervariables, o regiones para la determinación de
complementariedad (CDRs). Las tres CDRs de un dominio V (CDR1, CDR2,
CDR3) se agrupan en un extremo del barril beta. Las CDRs son bucles
que conectan las hebras beta B-C,
C'-C'' y F-G del pliegue de la
inmunoglobulina. Los radicales de las CDRs varían de una molécula de
inmunoglobulina a otra, impartiendo especificidad de antígeno a
cada anticuerpo.
Los dominios VL y VH en las puntas de las
moléculas de anticuerpo están estrechamente empaquetados de tal
manera que las 6 CDRs (3 en cada dominio) cooperan para construir
una superficie (o cavidad) para el enlace específico al antígeno.
Así, el sitio de enlace del antígeno natural de un anticuerpo se
compone de los bucles que conectan las hebras B-C,
C'-C'' y F-G del dominio variable de
la cadena ligera y las hebras B-C,
C'-C'' y F-G del dominio variable de
la cadena pesada.
Utilizando la estructura 3D de una proteína como
ayuda para el diseño, los residuos aminoácidos ubicados en la
superficie de muchas proteínas se han distribuido aleatoriamente
utilizando como patrón la estructura del núcleo de la proteína.
Ejemplos de esta estrategia se describen o resumen en las siguientes
referencias, incorporadas aquí como referencia: Nygren PA, Uhlen
M., Curr Opin Struct Biol. (1997) 7:463-9; Binz HK,
Amstutz P, Kohl A, Stumpp MT, Briand C, Forrer P, Grutter MG,
Pluckthun A. Nat Biotechnol. (2004) 22:575-82; Vogt
M, Skerra A. Chembiochem. (2004) 5:191-9; US
6.562.617.
El principio básico de esta técnica se basa en
la observación de que muchas proteínas tienen un núcleo estable,
formado por configuraciones específicas de elementos de estructura
secundaria, tales como hojas beta o hélices alfa, que se
interconectan a través de estructuras tales como bucles, giros o
vueltas o espirales al azar. Típicamente, estos tres elementos
estructurales son poco cruciales para la estructura total de la
proteína, y los residuos aminoácidos en estos elementos
estructurales pueden intercambiarse a menudo sin destruir el
pliegue general de la proteína. Un ejemplo de origen natural para
este principio de diseño son las CDRs de los anticuerpos. Ejemplos
artificiales incluyen lipocalinas, anquirinas y otras estructuras de
proteínas.
Los bucles que no son bucles CDR en una
inmunoglobulina nativa no tienen especificidad de unión a antígeno
o a epítopo pero contribuyen al pliegue correcto de la molécula de
inmunoglobulina y/o su efector u otras funciones y por lo tanto se
denominan bucles estructurales para el propósito de esta
invención.
En la patente US Nº 6.294.654 se muestra que
pueden elaborarse anticuerpos alterados donde un antígeno peptídico
se puede incorporar en un bucle no-CDR de un
anticuerpo (Ab) en la región CH1 entre la región bisagra y la
región variable, y el Ab resultante puede ser recuperado en una APC
de tal manera que el antígeno peptídico se presente en la
superficie de la APC en el contexto de MHC II, produciendo de este
modo una respuesta inmune. Estos péptidos insertados son epítopos y
la estructura total de la molécula portadora no es importante. Se
demostró que un péptido ras puede situarse en un bucle
(no-CDR) de una inmunoglobulina y ésta aún ser
secretada. Hay un "control de calidad" severo en las células
que evita que la inmunoglobulina sea secretada a menos que se
pliegue adecuadamente, y alterando la secuencia de aminoácidos del
bucle puede provocar que la proteína pliegue en una estructura que
la célula detectará como incorrecta, y por lo tanto la degradará. De
esta manera, además de los ejemplos mostrados, se considera difícil
modificar adicionalmente los bucles estructurales sin cambiar la
naturaleza de la inmunoglobulina.
La solicitud de patente de U.S. nº 2004/0101905
describe el enlace de moléculas que comprenden un sitio de enlace
diana y un péptido efector Fc. El péptido efector Fc es un péptido
que interactúa con la molécula efectora. Se muestra la inserción de
un péptido efector en un bucle no-CDR de un dominio
CH1 de un fragmento de inmunoglobulina.
Los péptidos efectores Fc son estructuras de
origen natural en bucles no-CDR de anticuerpos y por
lo tanto se espera que no perturben la estructura de la
inmunoglobulina si se injertan en diferentes sitios equivalentes en
una inmunoglobulina.
Sin embargo, todo péptido injertado en un bucle
no-CDR de acuerdo con esta descripción tiene una
alta probabilidad de ser inactivo por el diferente entorno
estructural que se ha seleccionado.
Se establece en los dos documentos de la técnica
anterior mencionados previamente, que es difícil insertar péptidos
en el bucle que debe retener su estructura y su función, siendo
crítico no perturbar la estructura de pliegue de la
inmunoglobulina, ya que esto es importante para su funcionamiento y
secreción.
Las solicitudes de patente US nº 2004/0132101 y
2005/0244403 describen inmunoglobulinas mutantes con afinidad
alterada de unión a un ligando efector, que son ligandos naturales
para bucles estructurales de anticuerpos. En este documento se
describe una variedad de mutaciones en diversas regiones a lo largo
de toda la molécula de inmunoglobulina, que influencian la función
efectora del anticuerpo completo.
La patente WO 01/83525 se refiere a proteínas
que comprenden dominios Fc fundidos con péptidos biológicamente
activos, en que dichos péptidos están fundidos a los dominios Fc en
sus extremos N ó C.
La patente US 2002/0106370 da a conocer
polipéptidos quiméricos que comprenden una porción de enlace que
muestra una afinidad específica de unión a la superficie de la
célula eucariótica diana y una porción efectora.
La patente WO 02/32925 da a conocer proteínas
capaces de una función anticuerpo similar. Para conseguirlo, se
introducen también estructuras de bucle en dichas proteínas, que
corresponden en estructura y posición a bucles CDR.
La patente WO 2006/036834 da a conocer moléculas
y métodos en los que los péptidos biológicamente activos se
incorporan en una región del bucle de un dominio Fc. El péptido
biológicamente activo con la actividad biológica deseada se
selecciona en primer lugar y después se introduce en los dominios
Fc, bien enlazando en péptido con la proteína o por inserción del
ácido nucleico respectivo en el ácido nucleico que codifica el
dominio Fc.
Otras patentes de la técnica anterior muestran
que el patrón tipo inmunoglobulina se ha empleado hasta ahora con
el propósito de manipular el sitio de unión al antígeno existente,
introduciendo de este modo nuevas propiedades de unión. Sin
embargo, hasta la fecha sólo las regiones CDR han sido sometidas a
ingeniería para el enlace al antígeno, en otras palabras, en el
caso del pliegue de la inmunoglobulina sólo se ha modificado el
sitio de unión del antígeno natural para cambiar su afinidad o
especificidad de unión. Existe una gran cantidad de bibliografía
que describe diferentes formatos de estas inmunoglobulinas
manipuladas, expresadas frecuentemente en forma de fragmentos Fv de
cadena sencilla (scFv) ó fragmentos Fab, ya sean presentados en la
superficie de partículas fago o expresados en forma soluble en
diversos sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos. Entre
los autores principales en este campo están Greg Winter, Andreas
Plückthun y Hennie Hoogenboom.
Un objeto de la presente invención es el de
proporcionar inmunoglobulinas con nuevos sitios de unión al antígeno
introducidos y métodos para diseñar por ingeniería y fabricar dichas
inmunoglobulinas.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
un método para la obtención por ingeniería de una inmunoglobulina
la cual comprende una región bucle estructural modificada para
proporcionar un sitio de unión no CDR y la determinación de la
unión de dicha inmunoglobulina a un epítopo de un antígeno, en donde
la región bucle estructural no modificada no se une
significativamente a dicho epítopo, el cual comprende los pasos
de:
- provisión de un ácido nucleico que codifica
una inmunoglobulina que comprende por lo menos una región bucle
estructural,
- modificación de por lo menos un residuo de
nucleótido de dicha región bucle estructural mediante mutagénesis,
en donde dicha modificación, o bien
- a)
- se selecciona mediante un método de mutagénesis del grupo formado al azar, semi-azar, randomización dirigida al sitio, mutagénesis por scanning y métodos combinatorios, o
- b)
- hay más de un bucle estructural para proporcionar un sitio de unión a dicho epítopo, o
- c)
- excluye la incorporación de un péptido biológicamente activo de 2 a 40 aminoácidos en un dominio Fc.
- transferencia de dicho ácido nucleico
modificado a un sistema de expresión
- expresión de dicha inmunoglobulina
modificada,
- puesta en contacto de la inmunoglobulina
modificada expresada con un epítopo, y
- determinación de si dicha inmunoglobulina
modificada se une a dicho epítopo.
\vskip1.000000\baselineskip
En particular, la presente invención se refiere
a un método para la obtención por ingeniería de una inmunoglobulina
que se une específicamente con un epítopo de un antígeno
seleccionado del grupo que consiste en alérgenos, antígenos
asociados a tumores, auto-antígenos, enzimas,
antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos protozoarios y
antígenos virales. A través de la modificación en la región del
bucle estructural, la inmunoglobulina puede ser diseñada por
ingeniería para unirse al epítopo. En una versión preferida, la
inmunoglobulina se une específicamente a por lo menos dos de dichos
epítopos, que difieren entre sí, ya sean del mismo antígeno o de
diferentes antígenos.
Por ejemplo, el método de acuerdo con la
invención se refiere al diseño de una unión específica de
inmunoglobulina con por lo menos un primer epítopo y que comprende
por lo menos una modificación en por lo menos una región del bucle
estructural de dicha inmunoglobulina y la determinación del enlace
específico de por lo menos dicha región del bucle hasta por lo
menos un segundo epítopo, seleccionándose éste del grupo de
antígenos mencionados anteriormente, donde la región no modificada
del bucle estructural (región no-CDR) no se une
específicamente por lo menos a dicho segundo epítopo, comprendiendo
los pasos de:
- provisión de un ácido nucleico que codifica
una inmunoglobulina que se une específicamente con por lo menos un
primer epítopo que comprende por lo menos una región del bucle
estructural,
- modificación por lo menos de un residuo
nucleótido de por lo menos una de dichas regiones del bucle
codificadas por dicho ácido nucleico,
- transferencia de dicho ácido nucleico
modificado en un sistema de expresión,
- expresión de dicha inmunoglobulina
modificada,
- puesta en contacto de la inmunoglobulina
modificada expresada con por lo menos dicho segundo epítopo, y
- determinación de si dicha inmunoglobulina
modificada se une específicamente al segundo epítopo.
\vskip1.000000\baselineskip
El método, de acuerdo con la invención, se
refiere de preferencia a por lo menos una modificación en por lo
menos una región del bucle estructural de la inmunoglobulina y a la
determinación de por lo menos dicha región del bucle con por lo
menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste en alérgenos,
antígenos asociados a tumor, auto-antígenos,
enzimas, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos
víricos y antígenos protozoarios, en donde la inmunoglobulina que
contiene una región del bucle estructural no modificada no se une
específicamente a por lo menos dicho antígeno.
El término "inmunoglobulinas" que se
modifican de acuerdo con la presente invención (como se emplea
aquí, los términos inmunoglobulina y anticuerpo son intercambiables)
pueden mostrar propiedades de unión mono- o
multi-específicas o multivalentes, por lo menos dos,
de preferencia por lo menos tres sitios de unión específicos para
epítopos de, por ejemplo, antígenos, moléculas/proteínas efectoras.
Las inmunoglobulinas de acuerdo con la invención también son
fragmentos funcionales aceptados en la técnica, tales como Fc, Fab,
scfv, dímeros de cadena sencilla de los dominios CH/CL, Fv, u otros
derivados o combinaciones de las inmunoglobulinas, dominios de las
cadenas pesadas y ligeras de la región variable (tales como Fd, Vl,
Vk, Vh) y la región constante de un anticuerpo intacto tal como
CH1, CH2, CH3, CH4, C-landa y
C-kappa, así como mini-dominios
consistentes en dos hebras beta de un dominio de inmunoglobulina
conectado por un bucle estructural.
Se entiende que el término
"inmunoglobulina", "inmunoglobulina modificada" ó
"inmunoglobulina de acuerdo con la invención", incluye también
un derivado de inmunoglobulinas. Un derivado es cualquier
combinación de una o varias inmunoglobulinas de la invención y/o
una proteína de fusión en la que cualquier dominio o
mini-dominio de la inmunoglobulina de la invención
se puede fundir en cualquier posición de una o varias proteínas
(tales como otras inmunoglobulinas, ligandos, proteínas patrón,
toxinas enzimáticas y similares). Un derivado de la inmunoglobulina
de la invención también se puede obtener mediante el enlace con
otras substancias mediante diversas técnicas químicas, tales como
el enlace covalente, una interacción electrostática, enlaces
disulfuro, etc.
Las otras substancias unidas a las
inmunoglobulinas pueden ser lípidos, hidratos de carbono, ácidos
nucleicos, moléculas orgánicas e inorgánicas o cualquier combinación
de ellas (por ejemplo, PEG, profármacos o fármacos). Un derivado
también es una inmunoglobulina con la misma secuencia de
aminoácidos, pero construida completa o parcialmente a partir de
aminoácidos no naturales o químicamente modificados.
Las moléculas diseñadas de acuerdo con la
presente invención serán útiles como proteínas autónomas, así como
proteínas de fusión o derivados, más típicamente fusionadas de
manera tal que sean parte de estructuras de anticuerpo mayores o
anticuerpo completo mo-action, enlaces disulfuro,
etc..
Las otras substancias unidas a las
inmunoglobulinas pueden ser lípidos, hidratos de carbono, ácidos
nucleicos, moléculas orgánicas e inorgánicas o cualquier combinación
de ellas (por ejemplo, PEG, profármacos o fármacos). Un derivado
también es una inmunoglobulina con la misma secuencia de
aminoácidos, pero construida completa o parcialmente a partir de
aminoácidos no naturales o químicamente modificados.
Las moléculas diseñadas de acuerdo con la
presente invención serán útiles como proteínas autónomas, así como
proteínas de fusión o derivados, más típicamente fusionadas de
manera tal que sean parte de estructuras de anticuerpo mayores o
moléculas de anticuerpo completas o partes de ellas, tales como
fragmentos Fab, fragmentos Fc, fragmentos Fv y otros. Será posible
utilizar las proteínas diseñadas para producir moléculas que son
monoespecíficas, biespecíficas, triespecíficas e incluso pueden
soportar más especificidades al mismo tiempo, y también será
posible controlar y preseleccionar la valencia de enlace al mismo
tiempo de acuerdo con los requerimientos del uso planeado de dichas
moléculas.
De acuerdo con la presente invención, las
regiones de unión a antígenos o sitios de unión de antígenos, de
todo tipo de alérgenos, antígenos asociados a tumores,
auto-antígenos, enzimas, antígenos bacterianos,
antígenos fúngicos, antígenos protozoarios y antígenos víricos,
pueden introducirse en un bucle estructural de una estructura de
anticuerpo dada.
El término "antígeno" de acuerdo con la
presente invención representa moléculas o estructuras que se sabe
que interactúan o son capaces de interactuar con la región del bucle
CDR de las inmunoglobulinas. Las regiones del bucle estructural de
la técnica anterior no interactúan con antígenos sino que más bien
contribuyen a la estructura total y/o al enlace a moléculas
efectoras.
El término "alérgenos, antígenos asociados a
tumores, auto-antígenos, enzimas, antígenos
bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos protozoarios y antígenos
víricos" de acuerdo con la presente invención debe incluir todos
los alérgenos y antígenos capaces de ser reconocidos por una
estructura de anticuerpo y fragmentos de dichas moléculas (en
especial subestructuras a las que se refiere generalmente como
"epítopos" (por ejemplo, epítopos de células B)), siempre que
sean inmunológicamente relevantes, es decir, que también sean
reconocibles por anticuerpos naturales o monoclonales.
El término "epítopo" de acuerdo con la
presente invención representa una estructura molecular que puede
constituir completamente un socio de unión especifica o ser parte de
un socio de unión específica al dominio de enlace o la
inmunoglobulina de la presente invención.
Químicamente, un epítopo puede estar compuesto
por un hidrato de carbono, un péptido, un ácido graso, una
substancia inorgánica o sus derivados y cualquier combinación de las
mismas. Si el epítopo es un polipéptido, usualmente incluirá por lo
menos 3 aminoácidos, de preferencia 8 a 50 aminoácidos, y con más
preferencia, entre aproximadamente 10 y 20 aminoácidos en el
péptido. No hay límite superior crítico para la longitud del
péptido, que puede comprender casi toda la longitud de la secuencia
del polipéptido. Los epítopos pueden ser lineales o epítopos
conformacionales. Un epítopo lineal comprende un solo segmento de
una secuencia primaria de una cadena de polipéptido. Los epítopos
lineales pueden ser contiguos o superpuestos. Los epítopos
conformacionales comprenden aminoácidos reunidos por plegado del
polipéptido, para formar una estructura terciaria y los aminoácidos
no son necesariamente adyacentes entre sí en la secuencia
lineal.
Específicamente, los epítopos son por lo menos
parte de moléculas relevantes para el diagnóstico, es decir, la
ausencia o presencia de un epítopo en una muestra se correlaciona
cualitativa o cuantitativamente ya sea con una enfermedad o con un
estado de salud o con el estado de un proceso de fabricación o un
estado ambiental y alimentario. Los epítopos también pueden ser por
lo menos parte de moléculas terapéuticamente relevantes, es decir,
moléculas que pueden ser diana del dominio de unión especifica que
cambia el curso de la enfermedad.
Los "alérgenos, antígenos asociados a tumores,
auto-antígenos, enzimas, antígenos bacterianos,
antígenos fúngicos, antígenos protozoarios y antígenos víricos"
preferidos, son aquellos alérgenos o antígenos que ya han
demostrado su capacidad de ser inmunológica o terapéuticamente
relevantes o que lo son, en especial aquéllos en los que se ha
probado su eficacia clínica.
Por otra parte, de acuerdo con otro aspecto de
la presente invención, también pueden introducirse otras
capacidades de enlace en las regiones del bucle estructural, por
ejemplo capacidades de enlace para moléculas pequeñas, tales como
fármacos o enzimas, sitios catalíticos de enzimas o substratos
enzimáticos o para un análogo del estado de transición de un
substrato enzimático.
De preferencia, el nuevo sitio de unión del
antígeno en los bucles estructurales es ajeno a la inmunoglobulina
no modificada. De esta manera, las dianas como moléculas efectoras o
receptoras Fc se excluyen de preferencia de las moléculas de enlace
y la especificidad de las inmunoglobulinas de acuerdo con la
invención.
De preferencia, los nuevos sitios de enlace del
antígeno en los bucles estructurales se introducen por sustitución,
deleción y/o inserción de la inmunoglobulina codificada por el ácido
nucleico seleccionado.
De acuerdo con otra versión preferida de la
presente invención, la modificación de por lo menos un nucleótido
da como resultado una substitución, deleción y/o inserción de la
inmunoglobulina codificada por dicho ácido
nucleico.
nucleico.
La modificación de por lo menos una región del
bucle puede dar como resultado una substitución, deleción y/o
inserción de 1 ó varios aminoácidos, de preferencia una mutación
puntual, intercambio de bucles enteros, con más preferencia el
cambio de por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 hasta 30
aminoácidos.
También es preferible la mutación aleatoria
dirigida al sitio. Con este método uno o varios residuos aminoácido
específicos del bucle se intercambian o introducen utilizando
insertos generados aleatoriamente en dichos bucles estructurales.
De forma alternativa, es preferible el uso de métodos
combinatorios.
De preferencia por lo menos una región del bucle
se muta o modifica de forma aleatoria,
semi-aleatoria, o en particular por métodos de
mutagénesis aleatoria dirigida al sitio. Estos métodos pueden
emplearse para hacer modificaciones de aminoácidos en posiciones
deseadas de la inmunoglobulina de la presente invención. En estos
casos las posiciones se eligen al azar, o los cambios de aminoácidos
se realizan utilizando reglas simplistas. Por ejemplo, todos los
residuos pueden mutarse en alanina, en referencia al cribado de
alanina. Estos métodos pueden acoplarse con métodos de ingeniería
más sofisticados que emplean métodos de selección para cribar
niveles superiores de diversidad de secuencia. Un método preferido
de acuerdo con la invención se refiere a la molécula de ácido
nucleico modificada aleatoriamente que comprende por lo menos una
unidad de repetición de nucleótido que tiene la secuencia
5'-NNS-3',
5'-NNN-3' ó
5'-NNK-3'.
La molécula de ácido nucleico modificada
aleatoriamente puede comprender las unidades repetitivas
identificadas anteriormente, que codifican todos los aminoácidos de
origen natural conocidos.
Como es bien conocido en la especialidad, hay
una variedad de técnicas de selección que pueden emplearse para la
identificación y el aislamiento de proteínas con ciertas
características y afinidades de enlace, incluyendo por ejemplo
tecnologías de expresión tales como presentación en fago,
presentación en ribosoma, presentación en superficies celulares y
similares, como se describe a continuación. Los métodos para
producción y cribado de variantes de anticuerpos son ya bien
conocidos en la técnica. Los métodos generales para biología
molecular de anticuerpos, expresión, purificación y cribado se
describen en Antibody Engineering, editado por Duebel &
Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; y
Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol
5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev
Biomed Eng 2:339-76.
Un "bucle estructural" o "bucle
no-CDR" de acuerdo con la presente invención debe
entenderse de la forma siguiente: las inmunoglobulinas están
formadas de dominios con el llamado pliegue de la inmunoglobulina.
En esencia, las hojas beta antiparalelas se conectan mediante bucles
formando un barril beta antiparalelo comprimido. En la región
variable, varios de los bucles de los dominios contribuyen
esencialmente a la especificidad del anticuerpo, es decir, la unión
al antígeno. Estos bucles se denominan bucles CDR. Todos los otros
bucles de dominios de anticuerpo contribuyen más bien a la
estructura de la molécula y/o a la función efectora. Estos bucles se
definen aquí como bucles estructurales o bucles
no-CDR.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican
las inmunoglobulinas modificadas (e incluidas siempre a través de
toda la especificación siguiente: fragmentos de inmunoglobulina)
pueden clonarse en células anfitrionas, expresadas y ensayadas para
sus especificidades de unión. Estas prácticas se llevan a cabo
utilizando procedimientos bien conocidos y una variedad de métodos
que pueden usarse en la presente invención se describen en Molecular
Cloning-A Laboratory Manual, 3.sup.rd Ed.
(Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), y
Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Los
ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas modificadas de
la presente invención pueden incorporarse en un vector de expresión
para expresar dichas inmunoglobulinas. Los vectores de expresión
comprenden típicamente una inmunoglobulina enlazada operativamente
que se coloca en una relación funcional, con control de secuencias
reguladoras, marcadores seleccionables, cualquier socio de fusión
y/o elementos adicionales. Las inmunoglobulinas modificadas de la
presente invención se pueden producir por cultivo de una célula
anfitriona transformada con ácido nucleico, de preferencia un vector
de expresión que contiene ácido nucleico que codifica las
inmunoglobulinas modificadas, bajo las condiciones apropiadas para
inducir o provocar la expresión de las inmunoglobulinas modificadas.
Los métodos de introducción de moléculas de ácido nucleico exógenas
en un anfitrión son bien conocidas por la técnica y variarán según
el anfitrión empleado. Por supuesto, también se pueden emplear
sistemas de expresión libre celular o acelular para la expresión de
inmunoglobulinas modificadas.
En una versión preferida de la presente
invención, las inmunoglobulinas modificadas se purifican o aíslan
después de la expresión. Las inmunoglobulinas modificadas pueden
aislarse o purificarse en una variedad de formas ya conocidas por
los especialistas en la técnica. Los métodos de purificación
estándar incluyen técnicas cromatográficas, técnicas
electroforéticas, inmunológicas, de precipitación, de diálisis,
filtración, concentración y cromatofocalización. La purificación se
puede facilitar a menudo mediante un socio de fusión particular.
Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser purificados utilizando
resina de glutatión si se emplea una fusión GST, usando
cromatografía de afinidad Ni^{+2} si se emplea un
His-tag o usando un anticuerpo
anti-flag inmovilizado y se utiliza un flag tag.
Como guía general sobre técnicas de purificación apropiadas, véase
Antibody Purification: Principles and Practice ("Purificación de
los anticuerpos: Principios y Práctica"), 3 sup.rd Ed., Scopes,
Springer-Verlag, NY, 1994. Por supuesto, también es
posible expresar las inmunoglobulinas modificadas de acuerdo con la
presente invención en la superficie de un anfitrión, en particular
en la superficie de una célula bacteriana, de insecto o de levadura
o en la superficie de fagos o virus.
Las inmunoglobulinas modificadas se pueden
cribar utilizando una variedad de métodos, incluyendo pero sin
limitarse a ellos, los que utilizan ensayos in vitro, ensayos
in vivo y basados en células, y técnicas de selección.
Las técnicas de automatización y cribado de alto rendimiento pueden
utilizarse en los procedimientos de cribado. El cribado puede
emplear un socio o marcador de fusión, por ejemplo una enzima, un
marcador inmunológico, un marcador isotópico o un marcador de
molécula pequeña como un colorante fluorescente o colorimétrico o
una molécula luminogénica.
En una versión preferida, las propiedades
funcionales y/o biofísicas de las inmunoglobulinas se criban en un
ensayo in vitro. En una versión preferida, se criba la
funcionalidad del anticuerpo, por ejemplo su capacidad de catalizar
una reacción o su afinidad de enlace a su diana.
Los ensayos pueden emplear una variedad de
métodos de detección, incluyendo pero sin limitarse a marcadores
cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes, o isotópicos.
Como ya es conocido en la técnica, un
subconjunto de métodos de cribado son aquellos métodos que
seleccionan miembros favorables de una biblioteca. Los métodos se
refieren aquí como "métodos de selección", y estos métodos se
usan en la presente invención para el cribado de inmunoglobulinas
modificadas. Cuando se criban las bibliotecas de inmunoglobulinas
utilizando un método de selección, sólo aquellos miembros de una
biblioteca que son favorables, es decir, que satisfacen algún
criterio de selección, se propagan, aíslan y/u observan. Como se
apreciará, debido a que se observan sólo las variantes más aptas,
estos métodos permiten la criba de bibliotecas más grandes que las
que se pueden cribar por métodos que analizan individualmente la
aptitud de los miembros de bibliotecas. La selección es posible por
cualquier método, técnica o socio de fusión que une de forma
covalente o no covalente el fenotipo de inmunoglobulinas con su
genotipo, que es la función de un anticuerpo con el ácido nucleico
que lo codifica. Por ejemplo, el uso de presentación en fagos como
método de selección es permitido por la fusión de miembros de la
biblioteca a la proteína gen III. De esta forma, la selección o el
aislamiento de inmunoglobulinas modificadas que satisfacen algunos
criterios, por ejemplo la afinidad del unión a la diana de la
inmunoglobulina, también selecciona o aísla el ácido nucleico que la
codifica. Una vez aislado, el gen o los genes que codifican las
inmunoglobulinas modificadas pueden ser amplificados. Este proceso
de aislamiento y amplificación, referido como selección por ciclos
de adsorción-deserción puede repetirse, permitiendo
que se enriquezcan las variantes de anticuerpo favorables en la
biblioteca. La secuenciación del ácido nucleico del ácido nucleico
unido permite finalmente la identificación del gen.
Una variedad de métodos de selección se conocen
en la técnica que pueden emplearse en la presente invención para el
cribado de bibliotecas de inmunoglobulina. Estos incluyen, sin estar
limitados a ellos, la presentación de fagos (Phage display of
peptides and antibodies: a laboratory manual, Kay et al.,
1996, Academic Press, San Diego, Calif., 1996; Lowman et
al., 1991, Biochemistry 30:10832-10838; Smith,
1985, Science 228:1315-1317) y sus derivados tales
como la infección selectiva por fagos (Malmborg et al., 1997,
J Mol Biol 273:544-551), fagos infectivos
selectivos (Krebber et al., 1997, J Mol Biol
268:619-630) y selección por ciclos de
adsorción-desorción de infectividad retardada
(Benhar et al., 2000, J Mol Biol
301:893-904), expresión en superficie celular
(Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399)
tales como presentación en bacterias (Georgiou et al., 1997,
Nat Biotechnol 15:29-34; Georgiou et al.,
1993, Trends Biotechnol 11:6-10; Lee et al.,
2000, Nat Biotechnol 18:645-648; Jun et al.,
1998, Nat Biotechnol 16:576-80), levadura (Boder
& Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328:430-44;
Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol
15:553-557) y células de mamíferos (Whitehorn et
al., 1995, Bio/technology 13:1215-1219), así
como tecnologías de presentación in vitro (Amstutz et
al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:400-405)
tales como expresión de polisoma (Mattheakis et al., 1994,
Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026) expresión de
ribosoma (Hanes et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA
94:4937-4942), expresión de ARNm (mRNA) (Roberts
& Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA
94:12297-12302; Nemoto et al, 1997, FEBS
Lett: 414:405-408) y el sistema de expresión por
inactivación de ribosoma (Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc
124, 538-543).
Otros métodos de selección que se pueden usar en
la presente invención incluyen métodos que no se basan en
expresión, como métodos in vivo, incluyendo pero sin
limitarse a ellos, la criba citométrica y la expresión periplásmica
(Chen et al., 2001, Nat Biotechnol.
19:537-542), el ensayo de complementación de
fragmentos de anticuerpo (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc
Natl Acad Sci USA 91:10340-10344; Pelletier et
al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA
95:12141-12146) y la criba de dos híbridos de
levadura (Fields & Song, 1989, Nature
310:245-246) empleada en el modo de selección
(Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA
96:11723-11728). En una versión alternativa, la
selección se activa por un socio de fusión que se une a una
secuencia específica en el vector de expresión, enlazándose así de
forma covalente o no covalente al socio de fusión y al miembro de la
biblioteca variante de Fc asociado, con el ácido nucleico que los
codifica. Por ejemplo, las patentes PCT WO 00/22906; PCT WO
01/49058; PCT WO 02/04852; PCT WO 02/04853; PCT WO 02/08023; PCT WO
01/28702 y PCT WO 02/07466 describen un socio de fusión y una
técnica tales, que se pueden usar en la presente invención. En una
versión alternativa, se puede producir la selección in vivo
si la expresión del anticuerpo imparte alguna ventaja de
crecimiento, reproducción o supervivencia a la célula.
Un subconjunto de métodos de selección referidos
como métodos de "evolución dirigida" son aquellos que incluyen
el acoplamiento o desarrollo de secuencias favorables durante la
selección, en ocasiones con la incorporación de nuevas mutaciones.
Como apreciarán los expertos en la materia, los métodos de evolución
dirigida pueden facilitar la identificación de las secuencias más
favorables en una biblioteca y pueden incrementar la diversidad de
las secuencias que se criban. Una variedad de métodos de evolución
dirigida conocidos en la técnica se puede usar en la presente
invención para cribar variantes de anticuerpo, incluyendo pero sin
limitarse a ellos, el barajado de ADN (PCT WO 00/42561 A3; PCT WO
01/70947 A3), el barajado de exones (patentes US nº 6.365.377;
Kolkman & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol
19:423-428), el barajado de familias (Crameri et
al., 1998, Nature 391:288-291; la patente US nº
6.376.246), RACHITT.TM (Coco et al., 2001, Nat Biotechnol
19:354-359; PCT WO 02/06469), "STEP" y cebado
aleatorio de la recombinación in vitro (Zhao et al.,
1998, Nat Biotechnol 16:258-261; Shao et
al., 1998, Nucleic Acids Res 26:681-683),
ensamblaje de genes mediado por exonucleasa (patente US nº
6.352.842; patente US nº 6.361.974), Gene Site Saturation
Mutagenesis TM (Patente US nº 6.358.709), Gene Reassembly.TM.
(Patente US nº 6.358.709), SCRATCHY (Lutz et al., 2001, Proc
Natl Acad Sci USA 98:11248-11253), métodos de
fragmentación de ADN (Kikuchi et al., Gene
236:159-167), barajado de ADN de una sola hebra
(Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133-137) y
tecnología de ingeniería de anticuerpos de evolución dirigida
AMEsystem (Applied Molecular Evolution) (patente US nº 5.824.514;
patente US nº 5.817.483; patente US nº 5.814.476; patente US nº
5.763.192; patente US nº 5.723.323).
En una versión preferida, las variantes de los
anticuerpos se pueden cribar utilizando uno o varios ensayos
basados en células o in vivo. Para dichos ensayos, las
inmunoglobulinas modificadas purificadas o no purificadas se añaden
típicamente de forma exógena, de tal manera que las células se
exponen a inmunoglobulinas individuales o conjuntos de
inmunoglobulinas que pertenecen a una biblioteca. Estos ensayos,
típicamente pero no siempre, se basan en la función de la
inmunoglobulina; esto es, la capacidad del anticuerpo de unirse a
su objetivo y mediar varios eventos bioquímicos, por ejemplo la
función efectora, la inhibición de unión ligando/receptor, la
apoptosis y similares. Estos ensayos a menudo incluyen la
monotorización de la respuesta de las células frente al anticuerpo,
por ejemplo, la supervivencia celular, la muerte celular, el cambio
en la morfología celular o la activación transcripcional, como la
expresión celular de un gen natural o gen reporter. Por ejemplo,
estos ensayos pueden medir la capacidad de las variantes de los
anticuerpos para producir DAC, ADCP ó CDC. Para algunos ensayos
puede ser necesaria la adición de células o componentes adicionales,
es decir, además de las células diana, puede ser necesario añadir,
por ejemplo, complemento de suero o células efectoras tales como
monocitos de sangre periférica (PBMCs, del inglés peripheral blood
monocytes), células NK, macrófagos y similares. Dichas células
adicionales pueden ser de cualquier organismo, de preferencia de
humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Las inmunoglobulinas
pueden provocar la apoptosis de ciertas líneas celulares que
expresan la diana, o pueden mediar el ataque en células diana por
células inmunológicas que se han añadido al ensayo. Los métodos
para la monotorización de la muerte o la viabilidad celular son
conocidos por la técnica e incluyen el uso de colorantes, reactivos
inmunoquímicos, citoquímicos y radiactivos. Por ejemplo, los ensayos
de tinción con caspasa pueden permitir la medición de la apoptosis
y la absorción o liberación de sustratos radioactivos o colorantes
fluorescentes, tales como el azul alamar pueden permitir la
monotorización del crecimiento o la activación celular. En una
versión preferida, se puede emplear el ensayo de citotoxicidad
basado en DELFIA.RTM.EuTDA (Perkin Elmer, MA). De forma
alternativa, se puede monitorizar la muerte o el daño de las células
diana midiendo el desprendimiento de uno o varios componentes
intracelulares naturales, por ejemplo la lactato deshidrogenasa. La
activación transcripcional también puede servir como un método para
ensayar la función en los ensayos basados en células. En este caso,
se puede monitorizar la respuesta mediante el análisis de genes
naturales o inmuoglobulinas que pueden ser reguladas al alza, por
ejemplo, se puede medir la liberación de ciertas interleucinas o de
forma alternativa, se puede realizar la lectura mediante una
construcción reporter. Los ensayos basados en células también
pueden incluir la medición de cambios morfológicos de las células
como respuesta a la presencia de inmunoglobulinas modificadas. Las
células para estos ensayos pueden ser de tipo procariótico o
eucariótico y se puede emplear una variedad de líneas celulares
conocidas en la técnica. De forma alternativa, los tamices basados
en células se elaboran usando células que se han transformado o
transfectado con ácidos nucleicos que codifican las variantes. Es
decir, las variantes de anticuerpos no se añaden de forma exógena a
las células. Por ejemplo, en una versión, el tamiz basado en
células utiliza la expresión en superficie celular. Puede emplearse
un socio de fusión que permita la expresión de inmunoglobulinas
modificadas en la superficie de las células (Witrrup, 2001, Curr
Opin Biotechnol, 12:395-399).
En una versión preferida, la inmunogenicidad de
las inmunoglobulinas modificadas puede determinarse
experimentalmente utilizando uno o más ensayos basados en células.
En una versión preferida, los ensayos de activación de células T
ex vivo se emplean para cuantificar experimentalmente la
inmunogenicidad. En este método, las células que presentan antígeno
y las células T nativas de donantes apareados se prueban una o
varias veces con un péptido o un anticuerpo entero de interés.
Entonces, la activación de las células T puede detectarse
utilizando una variedad de métodos, por ejemplo, haciendo la
monotorización de la producción de citocinas o midiendo la
absorción de timidina tritiada. En la versión más preferida, la
producción de interferón gamma se monitoriza utilizando ensayos
Eilspot (Schmittel et. al., 2000, J. Immunol. Meth., 24:
17-24).
Las propiedades biológicas de las
inmunoglobulinas modificadas de la presente invención pueden
caracterizarse en experimentos en células, tejidos y organismos
enteros. Como se conoce en la técnica, a menudo los fármacos se
ensayan en animales, incluyendo pero sin limitarse a ellos, ratones,
ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y monos, a fin de medir la
eficacia de un fármaco para el tratamiento de una enfermedad o un
modelo de enfermedad o para medir la farmacocinética, toxicidad y
otras propiedades de un fármaco. Los animales pueden ser referidos
como modelos de enfermedad. Los agentes terapéuticos a menudo se
prueban en ratones, incluyendo pero sin limitarse a ellos, ratones
inmunodeprimidos, ratones SCID, ratones de xenoinjerto y ratones
transgénicos (incluyendo "knockins" y "knockouts"). Dicha
experimentación puede proporcionar datos significativos para la
determinación del potencial del anticuerpo que se debe utilizar
como agente terapéutico. Cualquier organismo, de preferencia los
mamíferos, puede emplearse para las pruebas. Por ejemplo, debido a
su similaridad genética con los humanos, los monos pueden ser
modelos terapéuticos apropiados y de esta manera pueden emplearse
para analizar la eficacia, toxicidad, farmacocinética u otra
propiedad de las inmunoglobulinas modificadas de la presente
invención. Finalmente se requieren pruebas en humanos para la
aprobación como fármacos y por supuesto se contemplan estos
experimentos. De esta manera, las inmunoglobulinas modificadas de la
presente invención pueden ensayarse en humanos para determinar su
eficacia terapéutica, toxicidad, inmunicidad, farmacocinética y/u
otras propiedades clínicas.
Las inmunoglobulinas modificadas de la presente
invención pueden encontrar utilidad en un amplio margen de
productos de anticuerpos. En una versión, la variante de anticuerpo
de la presente invención se utiliza para la terapia o la
profilaxis, para uso preparativo o analítico, como un compuesto de
diagnóstico, un compuesto industrial o un reactivo de
investigación, de preferencia un agente terapéutico. La variante del
anticuerpo puede utilizarse en una composición de anticuerpos que
es monoclonal o policlonal. En una versión preferida, se usa una
inmunoglobulina modificada de la presente invención para exterminar
células diana que contienen el antígeno diana, por ejemplo células
cancerosas. En una versión alternativa, las inmunoglobulinas
modificadas de la presente invención se utilizan para bloquear,
antagonizar o agonizar el antígeno diana, por ejemplo por
antagonización de una citocina o un receptor de citocina. En una
versión alternativa preferida las inmunoglobulinas modificadas de
la presente invención se utilizan para bloquear, antagonizar o
agonizar el antígeno diana y exterminar las células diana que
contienen el antígeno diana. En una versión preferida alternativa,
las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención se
utilizan para bloquear, antagonizar o agonizar factores de
crecimiento o receptores de factores de crecimiento y exterminar
las células diana que contienen o requieren el antígeno diana. En
una versión preferida alternativa, las inmunoglobulinas modificadas
de la presente invención se utilizan para bloquear, antagonizar o
agonizar enzimas y sustratos de enzimas.
Las inmunoglobulinas modificadas de la presente
invención pueden emplearse para diversos propósitos terapéuticos.
En una versión preferida, un anticuerpo que comprende las
inmunoglobulinas modificadas se administra a un paciente para
tratar un transtorno específico. Un "paciente" para los
propósitos de la presente invención incluye tanto a humanos como a
otros animales, de preferencia mamíferos y con más preferencia
humanos. Aquí se entiende por "transtorno específico" un
transtorno que puede mejorar por la administración de una
composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina
modificada de la presente invención.
En una versión, una inmunoglobulina modificada
de acuerdo con la presente invención es el único agente
terapéuticamente activo administrado a un paciente. De forma
alternativa, la inmunoglobulina modificada de acuerdo con la
presente invención se administra en combinación con uno o varios
agentes terapéuticos, incluyendo pero sin limitarse a ellos,
agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, citocinas, agentes
inhibidores del crecimiento, agentes
anti-hormonales, inhibidores de quinasa, agentes
anti-angiogénicos, cardioprotectores u otros
agentes terapéuticos. Las inmunoglobulinas modificadas pueden
administrarse de forma concomitante con uno e varios regímenes
terapéuticos. Por ejemplo, una variante del anticuerpo de la
presente invención puede administrarse al paciente junto con
quimioterapia, con terapia de radiación o con ambas terapias de
quimioterapia y radiación. En una versión, las inmunoglobulinas
modificadas de la presente invención pueden administrarse junto con
uno o varios anticuerpos, que pueden o no comprender una variante
del anticuerpo de la presente invención. De acuerdo con otra
versión de la invención, las inmunoglobulinas modificadas de la
presente invención y uno o varias terapias anticáncer distintas se
emplean para tratar células cancerosas ex vivo. Se contempla
que dicho tratamiento ex vivo pueda ser de utilidad en el
trasplante de médula ósea y particularmente en trasplante de médula
ósea autólogo. Por supuesto, se contempla que los anticuerpos de la
invención se puedan emplear en combinación con aún otras técnicas
terapéuticas, como la cirugía.
Una variedad de otros agentes terapéuticos se
puede usar para la administración con las inmunoglobulinas
modificadas de la presente invención. En una versión, la
inmunoglobulina modificada se administra con un agente
anti-angiogénico, que es un compuesto que bloquea o
interfiere en cierto grado en el desarrollo de los vasos
sanguíneos. El factor anti-angiogénico, por ejemplo,
puede ser una molécula pequeña o una proteína, por ejemplo un
anticuerpo, fusión Fc, o citosina, que se une a un factor de
crecimiento o receptor del factor de crecimiento involucrado en la
estimulación de la angiogénesis. El factor
anti-angiogénico preferido aquí es un anticuerpo
que se une al Factor de Crecimiento Vascular Endotelial (VEGF, del
inglés Vascular Endothelial Growth Factor). En una versión
alternativa, la inmunoglobulina modificada se administra con un
agente terapéutico que induce o mejora la respuesta inmune
adaptativa, por ejemplo, un anticuerpo que hace diana en
CTLA-4. En una versión alternativa, la
inmunoglobulina modificada se administra con un inhibidor de
tirosina quinasa, que es una molécula que inhibe en cierta medida
la actividad tirosina quinasa de una tirosina quinasa. En una
versión alternativa, las inmunoglobulinas modificadas de la
presente invención se administran con una citocina. Por
"citocina", tal y como se emplea aquí, se entiende un término
genérico para las proteínas liberadas por una población celular que
actúa en otra célula como mediadores intercelulares, incluyendo las
quimiocinas.
Se contemplan composiciones farmacéuticas donde
se formulan las inmunoglobulinas modificadas de la presente
invención y uno o varios agentes terapéuticamente activos. Las
formulaciones de las variantes de anticuerpo de la presente
invención se preparan para su almacenamiento mezclando dicha
inmunoglobulina que tiene el grado deseado de pureza, con soportes,
excipientes o estabilizantes opcionales farmacéuticamente
aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol,
A. Ed., 1980), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones
acuosas. Las formulaciones que se tienen que usar para la
administración in vivo son de preferencia estériles. Esto se
logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración
estériles u otros métodos. Las inmunoglobulinas modificadas y otros
agentes terapéuticamente activos aquí descritos pueden formularse
también como inmunoliposomas y/o encerrados en microcápsulas.
La administración de la composición farmacéutica
que comprende una inmunoglobulina modificada de la presente
invención, de preferencia en forma de una solución acuosa estéril,
puede realizarse en una variedad de formas, incluyendo pero sin
limitarse a ellas, oralmente, subcutáneamente, intravenosamente,
intranasalmente, intraóticamente, transdérmicamente, tópicamente
(por ejemplo geles, pomadas, lociones, cremas, etc.), en forma
intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar (por ejemplo, la
tecnología inhalable AERx^{TM} comercialmente disponible de
Aradigm, o el sistema de suministro pulmonar Inhance^{TM}
comercialmente disponible en Inhale Therapeutics), en forma vaginal,
parenteral, rectal o intraocular.
Como se emplea aquí, la expresión "se une
específicamente", se refiere a una reacción de unión que es
determinante del ligando afín, de interés en una población
heterogénea de moléculas. De esta manera, bajo las condiciones
designadas (por ejemplo, las condiciones de inmunoensayo en el caso
de una inmunoglobulina), el anticuerpo especificado se une a su
"diana" particular y no se une en cantidad significativa a
otras moléculas presentes en una muestra. De forma comparable a las
CDRs de anticuerpos, las regiones modificadas del bucle estructural
son porciones de proteínas de unión de antígeno o de unión de
molécula y no son antígenos como tales.
El término "sistema de expresión", se
refiere a moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia
de codificación deseada y secuencias control en unión operativa, de
manera que los anfitriones transformados o transfectados con estas
secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas. Para
efectuar la transformación, el sistema de expresión puede estar
incluido en un vector; sin embargo, el ADN relevante también puede
estar integrado en el cromosoma anfitrión.
De acuerdo con una versión preferida de la
presente invención, el sistema de expresión comprende un vector.
Cualquier vector de expresión conocido en la técnica puede ser
empleado para este propósito como apropiado.
La inmunoglobulina modificada se expresa de
preferencia en un anfitrión, de preferencia en una célula
bacteriana, de levadura, de planta, en una célula de animal o en una
planta o en un animal.
Se puede emplear una amplia variedad de células
anfitrionas apropiadas para expresar la inmunoglobulina modificada,
incluyendo pero no limitadas a células de mamíferos (células de
animales), células de plantas, bacterias (por ejemplo, Bacillus
subtilis, Escherichia coli), células de insecto y levadura (por
ejemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae). Por
ejemplo, una variedad de líneas celulares que pueden ser de
utilidad en la presente invención se describe en el catálogo de
líneas celulares ATCC, disponible en American Type Culture
Collection. Además, también pueden emplearse plantas y animales como
anfitriones para la expresión de la inmunoglobulina de acuerdo con
la presente invención. La expresión así como los vectores o casetes
de transfección pueden seleccionares de acuerdo con el anfitrión
empleado.
Por supuesto también se pueden emplear sistemas
de expresión de proteínas libres de células o acelulares. Las
plataformas de expresión de proteínas de transcripción/traducción
in vitro, que producen cantidades suficientes de proteínas,
ofrecen muchas ventajas de una expresión de proteínas libres de
células, eliminando la necesidad de pasos laboriosos corriente
arriba y corriente abajo (por ejemplo, transformación de la célula
anfitriona, cultivo, o lisis) típicamente asociadas con sistemas de
expresión basados en células.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un método para la producción de una inmunoglobulina o una
preparación farmacéutica de la misma, que comprende por lo menos una
modificación en una región del bucle estructural de la
inmunoglobulina y que determina la unión de dicha inmunoglobulina a
un epítopo de un antígeno, en donde la inmunoglobulina no
modificada no se une significativamente a dicho epítopo, el cual
método comprende los pasos de:
- provisión de un ácido nucleico que codifica
una inmunoglobulina que comprende por lo menos una región del
bucle,
- modificación por lo menos de un radical
nucleótido de por lo menos una de dichas regiones del bucle,
- transferencia de dicho ácido nucleico
modificado a un sistema de expresión,
- expresión de dicha inmunoglobulina
modificada,
- puesta en contacto de la inmunoglobulina
modificada expresada, con un epítopo,
- determinación de si dicha inmunoglobulina
modificada se une a dicho epítopo, y
- provisión de la unión de la inmunoglobulina
modificada a dicho epítopo, y opcionalmente, finalización en una
preparación farmacéutica.
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En particular, la presente invención se refiere
a un método para la fabricación de una inmunoglobulina
multi-específica que se une de forma específica por
lo menos a una primera molécula o a una preparación farmacéutica de
la misma que comprende por lo menos una modificación en por lo
menos una región del bucle estructural de dicha inmunoglobulina y
determina el enlace específico de por lo menos una región del bucle
a por lo menos una segunda molécula seleccionada del grupo que
consiste en alérgenos, antígenos asociados a tumores,
auto-antígenos, enzimas, antígenos bacterianos,
antígenos fúngicos, antígenos protozoarios y antígenos víricos, en
donde la inmunoglobulina que contiene una región del bucle
estructural sin modificar no se une específicamente a por lo menos
la segunda molécula como mínimo, el cual método comprende los pasos
de:
- provisión de un ácido nucleico que codifica
una inmunoglobulina que se une específicamente por lo menos a una
primera molécula que comprende por lo menos una región del bucle
estructural,
- modificación por lo menos de un radical
nucleótido de por lo menos una de dichas regiones del bucle
codificada por dicho ácido nucleico,
- transferencia de dicho ácido nucleico
modificado a un sistema de expresión,
- expresión de dicha inmunoglobulina
modificada,
- puesta en contacto de la inmunoglobulina
modificada expresada, con por lo menos dicha segunda molécula, y
- determinación de si dicha inmunoglobulina
modificada se une específicamente a la segunda molécula y
- provisión de la inmunoglobulina modificada que
se une específicamente a por lo menos dicha segunda molécula y,
opcionalmente, finalización en una preparación farmacéutica.
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Se prefiere el diseño por ingeniería de más de
una especificidad en un miembro de un par de unión específico (Kufer
et al. (2004) Trends in Biotechnology ("Tendencias en
Biotecnología") vol. 22, páginas 238-244).
Se han realizado numerosos intentos para
producir anticuerpos o fragmentos de anticuerpos monoclonales
multiespecíficos, por ejemplo biespecíficos. Un problema en la
producción de anticuerpos biespecíficos hechos de dos cadenas de
polipéptido diferentes (cadena pesada y ligera), consiste en la
necesidad de expresar 4 cadenas diferentes (dos cadenas pesadas y
dos cadenas ligeras) en una célula, dando como resultado numerosas
combinaciones diferentes de moléculas que se tienen que separar de
la molécula biespecífica deseada en la mezcla. Debido a su
similitud, la separación de estas moléculas es difícil y costosa. Se
han empleado numerosas técnicas para reducir al mínimo la
concurrencia de estos apareamientos indeseados (Carter (2001)
Journal of Immunological Methods ("Revista de Métodos
Inmunológicos"), vol 248, páginas 7-15).
\newpage
Una solución al problema es la producción de una
cadena de polipéptido con dos especificidades, como por ejemplo dos
scFvs enlazados entre sí o la producción de los denominados
diacuerpos. Estas moléculas han demostrado estar muy lejos del
pliegue de una molécula natural y son notoriamente difíciles de
producir (LeGall et al., (2004) Protein Engineering, Design
& Selection ("Ingeniería de Proteínas, Diseño &
Selección"), vol 17, páginas 357-366).
Otro problema del presente desarrollo de
anticuerpos biespecíficos consiste en el hecho de que incluso si los
anticuerpos precursores se unen bivalentemente a su socio de enlace
respectivo (p. ej. IgG), el anticuerpo biespecífico resultante es
monovalente para cada socio de enlace respectivo.
Las moléculas multiespecíficas preferidas de la
presente invención resuelven estos problemas:
Es posible la expresión de una molécula
biespecífica como cadena polipeptídica (un dominio Ig modificado
con dos especificidades de unión, ver sección de ejemplos) que es
más fácil de lograr que la expresión de las dos cadenas
polipeptídicas de anticuerpo (Cabilly et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984)).
También se puede elaborar como una molécula tipo
anticuerpo (es decir, hecha de dos cadenas de polipéptido), debido
al hecho de que la segunda especificidad se ubica en la parte no
variable de la molécula, no hay necesidad de dos cadenas pesadas
diferentes o cadenas ligeras diferentes. De esta manera, no hay
posibilidad de un apareamiento erróneo de las dos cadenas.
Un anticuerpo de la presente invención puede
consistir en una cadena pesada y una cadena ligera, que forman
juntamente una región variable que se une a un socio de enlace
específico, pudiendo estar formada la segunda especificidad por un
bucle modificado de cualquiera de los bucles estructurales ya sea de
la cadena pesada o de la cadena ligera. El sitio de unión también
puede estar formado por más de un bucle no-CDR que
puede ser estructuralmente un vecino (ya sea en la cadena pesada o
en la cadena ligera o en ambas cadenas).
El anticuerpo o derivado modificado puede ser un
anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo (p. ej. Fab.
CH1-CH2, CH2-CH3).
Se puede unir de forma mono o multivalente a los
socios de enlace o incluso con diferente valencia a socios de
enlace diferentes, dependiendo del diseño.
Como hay numerosos bucles diferentes disponibles
para la selección y el diseño de un sitio de enlace específico en
las regiones no-CDR de las cadenas pesadas y
ligeras, es posible diseñar derivados de anticuerpo con incluso más
de dos especificidades sin los problemas anteriormente
mencionados.
Los dominios de enlace específico dentro de una
cadena de polipéptido se pueden conectar con o sin un péptido
enlazador.
Algunas clases de anticuerpo pueden considerarse
multiespecíficas, en particular biespecíficas, por naturaleza: se
unen a un antígeno (que típicamente es, por ejemplo, una estructura
extraña o una estructura asociada a un cáncer) con la región
variable y se unen a moléculas efectoras Fc con la parte Fc (por
ejemplo, receptores Fc en diversas células inmunológicas o una
proteína de complemento) permitiendo así efectos tales como ADCC,
ADCP ó CDC.
Las moléculas Fc efectoras se unen por la parte
Fc de una molécula de inmunoglobulina (para IgG1 consiste en los
dominios CH2 y CH3) y se han descrito numerosos métodos para
optimizar la función efectora al mejorar el enlace de la parte Fc
de una molécula de anticuerpo ya sea por técnicas de glicoingeniería
(patente US nº 6.602.684) ó por ingeniería de proteínas o bien
directamente en Fc (US 2005/0054832), o indirectamente por
ingeniería fuera de Fc (US 2005/02944403). Ambos, la unión de la
región Fc al receptor Fc, y/o la unión a las proteínas de
complemento, tales como Cql, se ha alterado por estas técnicas.
Usualmente, se busca mejorar la afinidad de unión a estas moléculas
Fc efectoras, ya que esto se correlaciona con funciones efectoras
mejoradas.
Con la presente invención es posible diseñar el
anticuerpo que se une a las moléculas efectoras Fc fuera de la
región natural de unión Fc. Bucles modificados en dominios del
anticuerpo distintos de los bucles implicados en una unión
"natural" a una molécula efectora Fc, pueden seleccionarse de
una biblioteca o diseñarse para unir a una o más moléculas
efectoras Fc. Un anticuerpo con tales sitios de unión adicionales a
la molécula efectora Fc, tendría o bien una avidez más fuerte a
cierta molécula efectora Fc, o bien una célula efectora presentando
una molécula efectora Fc, y por lo tanto, puede tener un efecto
incluso más fuerte que los anticuerpos obtenidos por
glicoingeniería o de otra manera, regiones Fc mejoradas. Sin
embargo, para ciertas versiones de la presente invención, las
características efectoras de un anticuerpo determinado que se tienen
que modificar, no deben cambiarse directamente sino que permanecen
sin ser afectadas por la modificación en el bucle estructural, de
acuerdo con la presente invención.
Los fragmentos de anticuerpos tienen ciertas
ventajas cuando se comparan con los anticuerpos enteros. Los
fragmentos tienen habitualmente buenas propiedades de
biodistribución y pueden producirse con más facilidad. Sin embargo
la mayoría de los diseños de fragmentos de anticuerpos carecen de
funciones efectoras y tienen in vivo una semi vida corta
(Holliger P. et al., Nat Biotechnol. (2005) 23:
1126-36).
\newpage
Ni el dominio CH1 ni los dominios C\kappa ó
C\lambda influyen sobre las funciones efectoras, lo cual es la
razón por la cual los Fabs no muestran ADCC, ADCP ó CDC. La patente
WO 02/44215 describe la unión de moléculas que consiste del sitio
de unión del antígeno de un anticuerpo y una unión peptídica de las
moléculas Fc-efectoras. De esta manera puede
construirse un fragmento de anticuerpo que muestra funciones
efectoras. El péptido se incorpora en la molécula de unión en una
posición que ni destruye la unión del antígeno ni la capacidad del
péptido para unirse a una molécula efectora Fc.
De acuerdo con la presente invención sin
embargo, la unión a las moléculas efectoras Fc puede efectuarse con
dominios modificados de inmunoglobulina los cuales han sido
seleccionados de la unión de la molécula efectora Fc a partir de
bibliotecas de secuencias bucle aleatorias, dentro de una estructura
fija de un dominio de la inmunoglobulina. Por lo tanto, es posible
seleccionar secuencias del bucle específicas que no se unirían a
las moléculas efectoras Fc fuera de la estructura del dominio de la
Ig. Los polipéptidos resultantes de la presente invención pueden
por lo tanto constar de preferencia de más de 100 aminoácidos.
Con el fin de seleccionar una función efectora
potencial de dichos dominios de acuerdo con la presente invención,
pueden seleccionarse bibliotecas del mutante CH1, los dominios
C\kappa ó C\lambda, para la unión a los receptores Fc y/o los
factores complementarios tales como el C1q.
con el fin de aumentar la semi vida in
vivo de una molécula que consiste en, o contiene, dicho dominio
(por ejemplo, CH1, CH2, CH3, CH4, C\kappa ó C\lambda), la unión
al FcRn puede seleccionarse con bibliotecas de mutante, por ejemplo
los dominios CH1-, CH2-, CH3-, CH4-, C\kappa ó C\lambda, de
acuerdo con la presente invención.
Los receptores FcRn para la selección pueden
proporcionarse bien sea sobre la superficie de las células que
expresan naturalmente los respectivos receptores, o bien mediante la
expresión y purificación de la parte extracelular del respectivo
receptor. Para la finalidad de esta invención un primer cribado del
FcRn puede seleccionar dominios mutantes que pueden además
analizarse in vitro e incluso además caracterizarse en
experimentos FACS, mediante la unión a células que expresan el
receptor FcRn. Puede además caracterizarse mediante el grado de
afinidad de la unión a varios FcRn recombinantes, isoformas y
alotipos, por ejemplo con técnicas de resonancia plasmón de
superficie.
superficie.
De acuerdo con una versión preferida de la
presente invención, la inmunoglobulina es de origen humano o de
ratón.
Como la inmunoglobulina modificada se puede
emplear para diversos propósitos, en particular en composiciones
farmacéuticas, la inmunoglobulina es de preferencia, de origen
humano o de ratón. Por supuesto, la inmunoglobulina modificada puede
ser también una inmunoglobulina humanizada o quimérica.
De acuerdo con otra modalidad preferida de la
presente invención, la inmunoglobulina humana se selecciona del
grupo formado por IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y
IgM.
La inmunoglobulina de ratón se selecciona, de
preferencia, del grupo formado por IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2A,
IgG2B, IgG2C, IgG3 e IgM.
La inmunoglobulina modificada puede derivarse de
una de las clases de inmunoglobulina identificadas más arriba.
La inmunoglobulina comprende de preferencia una
cadena pesada y/o una cadena ligera de la inmunoglobulina o una
parte de la misma.
La inmunoglobulina modificada puede comprender
una cadena pesada y/o una cadena ligera, por lo menos un dominio
variable y/o uno constante.
la inmunoglobulina de acuerdo con la presente
invención comprende de preferencia por lo menos un dominio constante
y/o por lo menos un dominio variable de la inmunoglobulina o una
parte de la misma incluyendo un mini-dominio.
Un dominio constante es una unidad de pliegue de
la inmunoglobulina de la parte constante de una molécula de
inmunoglobulina, también referida como un dominio de la región
constante (por ejemplo, CH1, CH2, CH3, CH4, C-kappa,
C-landa).
Un dominio variable es una unidad de
inmunoglobulina plegada de la parte variable de una inmunoglobulina,
referida también como un dominio de la región variable (por ejemplo,
Vh, Vk, VI, Vd).
Una inmunoglobulina preferida de acuerdo con la
invención consiste en un dominio constante que se selecciona del
grupo que consiste en CH1, CH2, CH3, CH4,
Ig-kappa-C,
Ig-landa-C, o una parte de la misma
que incluye un minidominio, con por lo menos una región bucle, y se
caracteriza porque por lo menos una región del bucle comprende por
lo menos una modificación de aminoácido que forma por lo menos una
región del bucle modificada, en la que por lo menos dicha región
modificada del bucle se une específicamente por lo menos a un
epítopo de un antígeno.
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La inmunoglobulina puede comprender por lo menos
un dominio simple o parte del mismo, incluyendo un minidominio que
consta de dos hebras beta de un dominio de inmunoglobulina conectado
mediante un bucle estructural, un dominio variable de una
inmunoglobulina simple, o una cadena simple Fv.
Otra inmunoglobulina preferida de acuerdo con la
invención consiste en un dominio variable de una cadena pesada o
ligera, o una parte de la misma que incluye un minidominio, por lo
menos con una región bucle, y se caracteriza porque por lo menos
dicha región bucle comprende por lo menos una modificación de
aminoácidos que forma por lo menos una región bucle modificada, en
donde por lo menos dicha región bucle modificada se une
específicamente por lo menos a un epítopo de un antígeno.
De acuerdo con una versión preferida, el dominio
constante se selecciona del grupo formado por CH1, CH2, CH3, CH4,
Ig-kappa-C,
Ig-landa-C y combinaciones de los
mismos.
La inmunoglobulina modificada de acuerdo con la
presente invención puede comprender uno o varios dominios
constantes (por ejemplo, por lo menos dos, tres, cuatro, cinco,
seis, diez dominios). Si más de un dominio está presente en la
inmunoglobulina modificada, estos dominios pueden ser del mismo tipo
o de tipos diferentes (por ejemplo,
CH1-CH1-CH2,
CH3-CH3). Por supuesto, el orden de los dominios
simples también puede ser de cualquier tipo (por ejemplo,
CH1-CH3-CH2,
CH4-CH1-CN3-CH2).
Toda la numeración de las secuencias de
aminoácidos de las inmunoglobulinas sigue el esquema de numeración
IMGT (IMGT, The International ImMunoGeneTics Information
system@imgt.cines.fr; http://imgt.cines.fr; Lefranc et al.,
1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212; Ruiz et
al., 2000 Nucleic Acids Res. 28: 219-221;
Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29:
207-209; Lefranc et al., 2003, Nucleic Acids
Res. 31:307-310; Lefranc et al., 2005, Dev
Comp Immunol 29:185-203).
De acuerdo con otra versión preferida de la
presente invención, las regiones bucle modificadas CH1, CH2, CH3 y
CH4 comprenden los aminoácidos 7 a 21, los aminoácidos 25 a 39, los
aminoácidos 41 a 81, los aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 89 a
103 y los aminoácidos 106 a 117, en donde la numeración está de
acuerdo con la IMGT.
Las regiones del bucle de
Ig-kappa-C y
I4-landa-C de origen humano
comprenden de preferencia los aminoácidos 8 a 18, los aminoácidos 27
a 35, los aminoácidos 42 a 78, los aminoácidos 83 a 85, los
aminoácidos 92 a 100, los aminoácidos 108 a 117, y los aminoácidos
123 a 126, en donde la numeración está de acuerdo con la IMGT.
Las regiones bucle de
Ig-kappa-C e
Ig-landa-C de origen ratón,
comprenden de preferencia los aminoácidos 8 a 20, los aminoácidos 26
a 36, los aminoácidos 43 a 79, los aminoácidos 83 a 85, los
aminoácidos 90 a 101, los aminoácidos 108 a 116 y los aminoácidos
122 a 125, en donde la numeración está de acuerdo con la IMGT.
Las regiones del bucle estructural del dominio
variable de la inmunoglobulina de origen humano comprenden de
preferencia los aminoácidos 8 a 20, los aminoácidos 44 a 50, los
aminoácidos 67 a 76, y los aminoácidos 89 a 101, en donde la
numeración está de acuerdo con la IMGT.
De acuerdo con una versión preferida de la
presente invención, las regiones bucle estructurales del dominio
variable de la inmunoglobulina de origen ratón, comprenden los
aminoácidos 6 a 20, los aminoácidos 44 a 52, los aminoácidos 67 a
76, y los aminoácidos 92 a 101, en donde la numeración está de
acuerdo con la IMGT.
Las regiones de los aminoácidos anteriormente
identificadas de las inmunoglobulinas respectivas comprenden las
regiones del bucle que se tienen que modificar.
La inmunoglobulina de acuerdo con la invención,
es de preferencia de origen camello.
Los anticuerpos del camello comprenden solamente
una cadena pesada y tienen la misma afinidad al antígeno que los
anticuerpos normales formados de cadenas ligeras y pesadas. En
consecuencia los anticuerpos de camello son mucho más pequeños que
por ejemplo los anticuerpos humanos, lo cual les permite penetrar
tejidos densos para alcanzar el antígeno, en donde las proteínas
más grandes no pueden. Sin embargo, la simplicidad comparativa, la
alta afinidad y especificidad y el potencial para alcanzar e
interactuar con sitios activos, los anticuerpos de cadena larga de
camello presentan ventajas sobre los anticuerpos habituales, en el
diseño, producción y aplicación de compuestos de valor clínico.
La inmunoglobulina de origen camello, comprende
de preferencia por lo menos un dominio constante seleccionado del
grupo formado por CH1, CH2 y CH3.
Las regiones bucle de CH1, CH2 y CH3 de la
inmunoglobulina de camello, comprenden los aminoácidos 8 a 20, los
aminoácidos 24 a 39, los aminoácidos 42 a 78, los aminoácidos 82 a
85, los aminoácidos 91 a 103 y los aminoácidos 108 a 117, en donde
la numeración está de acuerdo con la IMGT.
De acuerdo con una versión preferida de la
presente invención, la unión específica de la inmunoglobulina
modificada a la molécula se determina mediante un ensayo de unión
seleccionado del grupo formado por ensayos inmunológicos, de
preferencia ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (ELISA),
ensayos de resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de
resonancia magnética nuclear con diferencia de transferencia de
saturación, espectroscopia de resonancia magnética nuclear de
transferencia NOE (trNOE), ensayos competitivos, ensayos de unión de
tejidos, ensayos de unión de células vivas y ensayos de extracto
celular.
Los ensayos de unión se pueden llevar a cabo
empleando una variedad de métodos ya conocidos en la técnica,
incluyendo, pero no limitándose, a métodos basados en FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfer) ("Transferencia de
energía de resonancia-fluorescencia") y BRET
(Bioluminescence Resonance Energy Transfer) ("Transferencia de
energía de resonancia-bioluminiscencia"),
AlphaScreen (Amplified Luminiscent Proximity Homogeneus Assay
("Ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificada"),
Scintillation Proximity Assay ("Ensayo de centelleo de
proximidad"), ELISA (Enzyme Linked immunosorbent Assay ("Ensayo
inmunosorbente ligado a enzima"), SPR (Surface Plasmon
Resonance ("Resonancia de plasmón superficial"), también
conocida como BIACORE), Isotermal Titration Calorimetry
("Calorimetría de titulación isotérmica"), Diferential scanning
calorimetry ("Calorimetría de cribado diferencial"), Gel
electrophoresis ("Electroforesis sobre gel"), y Chromatography
including gel filtration ("Cromatografía incluyendo la gel
filtración"). Estos y otros métodos pueden aventajar a algún
socio de fusión o alguna marca de señalización.
La inmunoglobulina modificada se conjuga de
preferencia con un marcador seleccionado del grupo formado por
moléculas orgánicas, marcadores enzimáticos, marcas radiactivas,
marcas de color, marcas fluorescentes, marcas cromogénicas, marcas
luminiscentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complejos metálicos,
metales, oro coloidal y sus mezclas.
La inmunoglobulina modificada puede conjugarse
con otras moléculas que permiten la detección simple de dicho
conjugado, por ejemplo, en ensayos de unión (por ejemplo, análisis
ELISA) y estudios de unión.
Una versión preferida de la presente invención
se refiere a un método para la producción de una inmunoglobulina con
una mayor semivida, el cual método comprende los pasos de:
- obtención por ingeniería de una
inmunoglobulina modificada mediante un método de acuerdo con la
presente invención, que comprende un dominio mutante seleccionado
del grupo formado por CH1, CH2, CH3, CH4, C-kappa y
C-landa, y tiene una especificidad de unión para un
autoantígeno mediante una modificación en la región del bucle
estructural, y
- elaboración de una preparación que tiene una
mayor vida media.
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Una versión preferida de la presente invención,
se refiere a un método, de acuerdo con la presente invención, en
donde la inmunoglobulina modificada tiene una especificidad de unión
al FcRn.
Una versión preferida de la presente invención
se refiere a un método para producir una inmunoglobulina por
ingeniería, con función efectora, el cual método comprende los pasos
de:
- obtención por ingeniería de una
inmunoglobulina modificada mediante un método de acuerdo con la
presente invención, que comprende un dominio mutante seleccionado
del grupo formado por CH1, CH2, CH3, CH4, C-kappa y
C-landa, y tiene una especificidad de unión para una
molécula efectora mediante una modificación en la región del bucle
estructural, y
- elaboración de una preparación que tiene una
función efectora, en donde dicho fragmento de anticuerpo obtenido
por ingeniería es de preferencia un fragmento Fab ó Fc.
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La inmunoglobulina de la presente invención
puede consistir en un dominio constante seleccionado del grupo
formado por CH1, CH2, CH3, CH4,
Ig-kappa-C,
Ig-landa-C, ó una parte de los
mismos incluyendo minidominios, o combinaciones de los mismos, con
por lo menos una región bucle, caracterizada porque por lo menos
dicha región bucle comprende por lo menos una modificación de
aminoácidos, formando por lo menos una región bucle modificada, en
donde por lo menos dicha región bucle modificada se une
específicamente a por lo menos un epítopo de un antígeno.
Se prefiere combinar molecularmente por lo menos
un dominio de anticuerpo modificado (= unión al socio específico
por medio de secuencias no variables o bucle estructural), con por
lo menos otra molécula de unión que puede ser un anticuerpo, un
fragmento de anticuerpo, un receptor soluble, un ligando, u otro
dominio de anticuerpo modificado.
La molécula se selecciona del grupo formado por
moléculas proteínicas, ácidos nucleicos, e hidratos de carbono.
Las regiones bucle de las inmunoglobulinas
modificadas pueden unirse específicamente a cualquier tipo de
moléculas de unión, en particular a moléculas proteínicas,
proteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicanos,
hidratos de carbono, lípidos, pequeñas moléculas orgánicas,
moléculas inorgánicas. Por supuesto, las inmunoglobulinas
modificadas pueden comprender por lo menos dos regiones bucle en
donde cada una de los regiones bucle pueden unirse específicamente a
otras moléculas o epítopos.
De acuerdo con una versión preferida de la
presente invención, la molécula que se une a la región bucle
estructural modificada, se selecciona del grupo formado por
antígenos asociados a un tumor, en particular EpCAM,
glicoproteína-72 asociada a un tumor
(TAG-72), antígeno asociado a un tumor CA 125,
Prostate specific membrane antigen (PSMA), ("Antígeno de membrana
específico de la próstata"), High molecular weight
melanoma-associated antigen
(HMW-MAA) ("Antígeno, asociado con melanoma, de
alto peso molecular"), antígeno asociado con un tumor que
expresa hidratos de carbono relacionado con Lewis Y,
Carcinoembryonic antigen (CEA) ("antígeno carcinoembriónico"),
CEACAM5, HMFG PEM, mucina MUC1, MUC18 y antígeno asociado con un
tumor de citoqueratina, antígenos bacterianos, antígenos víricos,
alérgenos, fluoresceína, lisozima, receptor 9 tipo toll,
eritropoyetina CD2, CD3, CD3E, CD4, CD11, CD11a, CD14, CD18, CDI9,
CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD33 (proteína p67), CD38,
CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, GD3,
IL-1, IL-1R, IL-2,
IL-2R, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-6R, IL-8,
IL-12, IL-15,
IL-18, IL-23, interferón alfa,
interferón beta, interferón gamma; TNF-alfa,
TNFbeta2, TNF. alfa, TNF alfabeta, TNF-R1,
TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL,
TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEGI, OX40L,
receptor-1 de TRAIL, receptor de adenosina Al,
receptor de linfotoxina beta, TACI, BAFF-R,
EPO;LFA-3, ICAM-1,
ICAM-3, integrina beta1, integrina beta2, integrina
alfa4/beta7, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4,
integrina alfa5, integrina alfa6, integrina alfav, integrina
alfaVbeta 3, factor de crecimiento de queratinocitos
FGFR-3, VLA-1,
VLA-4, L-selectina,
anti-Id, E-selectina, HLA,
HLA-DR, CTLA-4, receptor de células
T, B7-1, B7-2, VNRintegrina,
TGFbeta1, TGFbeta2, eotaxina 1, BlyS (estimulador de
linfocitos-B), complemento C5, IgE, factor VII,
CD64, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu
(ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4
(ErbB4), factor tisular, VEGF, VEG-FR, receptor de
endotelina, VLA-4, hidratos de carbono tales como
antígenos de grupo sanguíneo e hidratos de carbono relacionados,
glicosilación Galili, gastrina, receptores de gastrina, hidratos de
carbono asociados a un tumor, hapteno NP-cap ó
NIP-cap, receptor de células T alfa/beta,
E-selectina, digoxina, fosfatasa alcalina
placentaria (PLAP) y fosfatasa alcalina testicular tipo PLAP,
receptor de transferrina, heparanasa I, miosina cardíaca humana,
glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), glicoproteína de la cubierta gH
del citomegalovirus humano (HCMV)gH, HIV gp120, HCMV, virus
sincitial respiratorio RSV F, RSVF Fgp, VNRintegrina, Hep B gp120,
CMV, gpIIbIIIa, bucle HIV IIIB gp120 V3, virus sincitial
respiratorio (RSV) Fgp, glicoproteína gD del virus del Herpes
simplex (HSV), glicoproteína HSV gB, glicoproteína de la cubierta
HCMV gB, toxina Clostridium perfringens y sus fragmentos.
La inmunoglobulina modificada de acuerdo con la
presente invención se puede unir de preferencia a una de las
moléculas descritas anteriormente. Estas moléculas comprenden
también alérgenos.
De acuerdo con otra versión preferida de la
presente invención se modifican los residuos aminoácido de las
posiciones 15 a 17, 29 a 34, 85,4 a 85,3, 92 a 94, 97 a 98 y/o 108 a
110 de CH3, en donde la numeración está de acuerdo con la IMGT:
La modificación de la inmunoglobulina de acuerdo
con la presente invención es de preferencia una deleción, una
sustitución o una inserción.
De acuerdo con la presente invención se eliminan
por lo menos 1, de preferencia por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10 y 15 aminoácidos, substituyendo con otros aminoácidos (también
con aminoácidos modificados) o se insertan en la región del bucle
de la inmunoglobulina. Sin embargo, el número máximo de aminoácidos
insertados en la región del bucle de una inmunoglobulina no puede
exceder de 30, de preferencia 25, con mayor preferencia, 20
aminoácidos. La sustitución y la inserción de los aminoácidos se
realiza de preferencia de forma aleatoria por métodos ya conocidos
en la técnica, como se describe en la presente solicitud de
patente.
La inmunoglobulina de acuerdo con la invención
se corresponde con una versión específica caracterizada porque la
región CH3 comprende SEQ ID nº 16 ó SEQ ID nº 18, cuando EpCam se
une a dicha inmunoglobulina, SEQ ID nº 20, cuando la fluoresceína
se une a la inmunoglobulina, SEQ ID nº 22, 24, 26, 28, 30 ó 32,
cuando la lisozima se une a dicha inmunoglobulina, SEQ ID nº 34,
36, 38 ó 40, cuando TLR9 se une a la inmunoglobulina, y SEQ ID nº
42, cuando la lisozima y/o la eritropoyetina se unen a dicha
inmunoglobulina.
De acuerdo con una versión específica de la
invención, la inmunoglobulina se caracteriza porque comprende la
SEQ ID nº 44 ó SEQ ID nº 46, cuando la lisozima y gp41 se unen a
dicha inmunoglobulina.
La inmunoglobulina modificada se conjuga de
preferencia con una molécula marcadora o reporter, seleccionada
entre el grupo que consiste en moléculas orgánicas, marcas
enzimáticas, marcas radiactivas, marcas coloreadas, marcas
fluorescentes, marcas cromogénicas, marcas luminescentes, haptenos,
digoxigenina, biotina, complejos metálicos, metales, oro coloidal y
sus mezclas.
Las inmunoglobulinas modificadas conjugadas a
los marcadores como se ha especificado más arriba, pueden emplearse,
por ejemplo, en métodos de diagnóstico.
La inmunoglobulina obtenida por un método de
acuerdo con la presente invención puede emplearse para la
preparación de una vacuna para la inmunización activa. A este
respecto, la inmunoglobulina se emplea, o bien como sustancia
fármaco antigénica para formular una vacuna, o bien se emplea para
captar o capturar estructuras antigénicas para emplear en una
formulación de una vacuna.
La inmunoglobulina obtenida por un método de
acuerdo con la presente invención, puede también emplearse para la
preparación de una biblioteca de proteínas de inmunoglobulinas.
Las inmunoglobulinas según la invención pueden
emplearse para aislar específicamente moléculas a partir de una
muestra. Si se emplean inmunoglobulinas multiespecíficas, puede
aislarse más de una molécula de una muestra. Es especialmente
ventajoso utilizar inmunoglobulinas modificadas en estos métodos,
porque permite, por ejemplo, generar una matriz con una superficie
homogénea con cantidades definidas de socios de unión (es decir,
inmunoglobulinas modificadas) inmovilizadas allí, que son capaces de
unirse a las moléculas que se tienen que aislar. En contraste a
ello, si se emplean socios de enlace monoespecíficos no se puede
generar una matriz homogénea debido a que los socios de enlace
sencillos no se unen con la misma eficacia a la matriz.
Esto puede lograrse con un método para unir
específicamente y/o detectar una molécula, el cual método comprende
los pasos de:
(a) puesta en contacto de una inmunoglobulina
modificada de acuerdo con la presente invención o una
inmunoglobulina modificada que se puede obtener por un método de
acuerdo con la presente invención, con una muestra de ensayo de la
que se sospecha que contiene dicha molécula, y
(b) detección de la formación potencial de un
complejo específico molécula/inmunoglobulina, o mediante un método
para aislar específicamente una molécula, el cual método comprende
los pasos de:
- (a)
- puesta en contacto de una inmunoglobulina modificada de acuerdo con la presente invención o una inmunoglobulina modificada que se puede obtener por un método de acuerdo con la presente invención, con una muestra que contiene dicha molécula,
- (b)
- separación del complejo específico inmunoglobulina/molécula, formado, y
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Las inmunoglobulinas modificadas de acuerdo con
la presente invención pueden emplearse para suministrar por lo menos
un compuesto ligado a las regiones CDRs y/o modificadas del bucle, a
una diana. Estas inmunoglobulinas pueden emplearse para hacer diana
en substancias terapéuticas en un sitio de acción preferido en el
curso del tratamiento de una enfermedad.
Esto puede lograrse mediante un método para
dirigir un compuesto a una diana, el cual método comprende los pasos
de:
(a) puesta en contacto de una inmunoglobulina
modificada de acuerdo con la presente invención o una
inmunoglobulina modificada que se puede obtener por un método de
acuerdo con la presente invención, capaz de unirse específicamente a
dicho compuesto;
(b) suministro del complejo
inmunoglobulina/compuesto a la diana.
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La inmunoglobulina de acuerdo con la presente
invención, o que puede obtenerse mediante el método de acuerdo con
la presente invención, puede estar contenida en una biblioteca de
proteínas.
Los métodos preferidos para la construcción de
dicha biblioteca pueden encontrarse más arriba y en los ejemplos.
La biblioteca de acuerdo con la presente invención, puede emplearse
para identificar las inmunoglobulinas que se unen a una molécula
distinta.
Una inmunoglobulina existente puede ser cambiada
para introducir sitios de unión al antígeno en cualquier dominio o
minidominio mediante el empleo de una biblioteca de proteínas del
respectivo dominio de por lo menos 10, de preferencia 100, con
mayor preferencia 1000, con mayor preferencia 10000, con mayor
preferencia 100000, con mayor preferencia más de 1000000 dominios
diferentes, con por lo menos un bucle modificado. La biblioteca se
criba mediante la determinación de la unión al antígeno específico.
Después de la caracterización molecular por las propiedades
deseadas, el dominio o minidominio seleccionado se clona en la
inmunoglobulina original mediante técnicas de ingeniería genética
de forma que se reemplace la región tipo salvaje. Alternativamente,
sólo el ADN que codifica los bucles o codifica los aminoácidos
mutados, puede ser intercambiado para obtener una inmunoglobulina
con el sitio de unión adicional para el antígeno específico.
La elección del sitio para el bucle estructural
específico para el antígeno, mutado, depende de la estructura de la
inmunoglobulina original y del propósito del sitio de unión
adicional. Si, por ejemplo, la molécula original es una
inmunoglobulina completa que necesita tener insertado un sitio de
unión de antígeno adicional sin perturbación de la función
efectora, los bucles a modificar se seleccionarán a partir de
dominios distantes de CH2 y CH3, que son los socios de unión
naturales para las moléculas efectoras Fc. Si la inmunoglobulina
original es una Fab, es posible la modificación de bucles en
dominios constantes de las cadenas ligeras o las cadenas pesadas o
los dominios variables respectivos. Para generar una biblioteca se
pueden preparar bibliotecas de moléculas originales mutantes que
tienen mutaciones en uno o varios bucles estructurales de uno o
varios dominios. La selección con moléculas originales mutadas
completas puede tener ciertas ventajas, ya que la selección para la
unión de antígeno con un bucle estructural modificado proporcionará
las modificaciones estéricamente ventajosas si también se analizan
para las otras propiedades que deberá mostrar la inmunoglobulina
mutada.
El tamaño requerido (es decir, el número de
variantes de proteínas) de una biblioteca de proteínas de un
dominio o un minidominio mutado o una molécula de fusión, depende de
la tarea a realizar. En general, una biblioteca para generar un
sitio de unión al antígeno "de novo", requiere ser mayor que
una biblioteca empleada para modificar adicionalmente un sitio de
unión al antígeno obtenido por ingeniería, ya existente, construido
de un bucle estructural modificado (por ejemplo, para potenciar la
afinidad o cambiar la especificidad fina al antígeno).
La inmunoglobulina de la invención puede estar
comprendida en una biblioteca de inmunoglobulinas o una biblioteca
de ácidos nucleicos que comprende una pluralidad de
inmunoglobulinas, por ejemplo un dominio constante o variable, un
minidominio y/o por lo menos una región del bucle estructural
contenida en un minidominio, o moléculas de ácido nucleico que los
codifican. La biblioteca contiene miembros con diferentes
modificaciones, en donde la pluralidad se define por las
modificaciones en por lo menos una región del bucle estructural. La
biblioteca de ácidos nucleicos incluye de preferencia por lo menos
10 miembros diferentes (que dan como resultado el intercambio de un
aminoácido) y con mayor preferencia incluye por lo menos 100, con
más preferencia 1000 ó 10000 miembros diferentes (por ejemplo,
diseñados por estrategias de aleatorización o técnicas
combinatorias). Incluso son también preferidos, números de miembros
individuales más diversificados, tales como por lo menos 1000000 ó
por lo menos 10000000.
Pueden combinarse dos diferentes dominios o
minidominios seleccionados de por lo menos dos bibliotecas de
acuerdo con la invención, con el fin de generar inmunoglobulinas
multiespecíficas. Estas inmunoglobulinas específicas seleccionadas
se pueden combinar entre sí y con otras moléculas, de forma similar
a bloques de construcción, para diseñar la disposición óptima de
los dominios o minidominios para obtener las propiedades
deseadas.
Además, una o varias inmunoglobulinas
modificadas de acuerdo con la invención pueden introducirse en
varios o en todos los sitios diferentes de una proteína posible sin
destruir la estructura de la proteína. Mediante esta técnica de
"barajado de dominios" se crean nuevas bibliotecas que a su vez
pueden seleccionarse para determinar las propiedades deseadas.
La biblioteca preferida contiene
inmunoglobulinas de acuerdo con la invención, seleccionadas del
grupo que consiste en dominios de una inmunoglobulina, mini dominios
o sus derivados.
Una versión preferida de la presente invención
es una molécula de unión para un antígeno (molécula de unión al
antígeno) que comprende por lo menos un dominio de inmunoglobulina y
una región del bucle estructural que se modifica de acuerdo con la
presente invención para unir el antígeno, en que dicha molécula de
unión no comprende dominios variables de un anticuerpo. Puede
comprender otras partes utilizables para las actividades del
anticuerpo (por ejemplo, como regiones efectoras naturales o
modificadas (secuencias)); sin embargo, carece de la región de
unión "natural" de anticuerpos, es decir, los dominios
variables en su posición de origen natural. Estas moléculas de
unión al antígeno de acuerdo con la presente invención tienen las
ventajas descritas anteriormente para las presentes moléculas,
aunque sin la actividad de unión específica de los anticuerpos; sin
embargo, con una actividad de unión específica recientemente
introducida en la región del bucle estructural.
De preferencia, estas moléculas de unión de
antígeno de acuerdo con la presente invención comprenden CH1, CH2,
CH3, CH4, Ig-kappa-C,
Ig-landa-C y sus combinaciones;
dichas combinaciones comprenden por lo menos dos, de preferencia
por lo menos cuatro, especialmente por lo menos seis dominios
constantes y por lo menos una región del bucle estructural
modificada de acuerdo con la presente invención. De preferencia
estas regiones del bucle estructural o bien se conectan mediante la
región del bucle estructural modificada de acuerdo con la presente
invención o bien mediante los bucles estructurales que están
naturalmente presentes entre estos dos dominios constantes. Una
versión de estas moléculas de unión de antígeno de acuerdo con la
presente invención, consta de la región Fc de un anticuerpo con por
lo menos una modificación en un bucle estructural de acuerdo con la
presente invención. También para las moléculas de unión al antígeno
de acuerdo con la presente invención, se prefiere que los nuevos
sitios de unión de antígeno en los bucles estructurales se
introduzcan por tecnologías de aleatorización, es decir,
intercambiando uno o varios radicales aminoácido del bucle por
técnicas de aleatorización o introduciendo insertos generados
aleatoriamente en dichos bucles estructurales. De forma alternativa
se prefiere el uso de métodos combinatorios.
Una inmunoglobulina modificada puede tener un
sitio de unión de antígeno ajeno a la inmunoglobulina no modificada
e incorporado en uno o varios bucles estructurales. El término
"ajeno" significa que el sitio de unión de antígeno no se
forma naturalmente mediante la región específica de la
inmunoglobulina, y un socio de unión ajeno, pero no el socio de
unión natural de una inmunoglobulina, se une por el sitio de unión
del antígeno. Esto significa que un socio de unión como un receptor
Fc ó un efector del sistema inmune, no se considera ligado por el
sitio de unión de antígeno ajeno a la inmunoglobulina no
modificada.
De preferencia, el antígeno se selecciona del
grupo formado por antígenos patógenos, antígenos asociados a un
tumor, enzimas, substratos, autoantígenos, moléculas orgánicas o
alérgenos. Los antígenos más preferidos se seleccionan del grupo
formado por antígenos víricos, antígenos bacterianos o antígenos de
patógenos de eucariotas o fagos. Los antígenos virales preferidos
incluyen antígenos de los virus HAV, HBV, HCV, HIV I, HIV II,
Parvovirus, virus de la gripe, HSV y Hepatitis, Flavivirus, virus
del Nilo Occidental, virus Ebola, virus pox, virus de la viruela,
virus del sarampión, virus del Herpes, Adenovirus, virus del
Papiloma, virus del Polioma, Parvovirus, Rinovirus, virus
Coxsackie, virus de la Polio, Ecovirus, virus de la Encefalitis
Japonesa, virus del Dengue, virus de la Encefalitis transportado por
garrapatas, virus de la fiebre amarilla, Coronavirus, virus
sincitial respiratorio, virus de la parainfluenza, virus de La
Crosse, virus de Lassa, virus de la Rabia, Rotavirus; los antígenos
bacterianos preferidos incluyen antígenos de Pseudomonas,
Micobacterias, Estafilococos, Salmonella, Meningococos, Borelia,
Listeria, Neisseria, Clostridium, Escherichia, Legionella, Bacilos,
Lactobacilos, Estreptococos, Enterococos, Corynebacterium, Nocardia,
Rhodococcus, Moraxella, Brucella, Campylobacter, Cardiobacterium,
Francisella, Helicobacter, Haemophilus, Klebsiella, Shigella,
Yersinia, Vibrio, Chlamydia, Leptospira, Rickettsia, Micobacterias,
Treponema, Bartonella. Los antígenos eucarióticos preferidos de
eucariotas patógenos incluyen antígenos de Giardia, Toxoplasma,
Cyclospora, Cryptosporidium, Trichinella, Levaduras, Candida,
Aspergillus, Cryptococcus, Blastomyces, Histoplasma,
Coccidioides.
Las inmunoglobulinas preferidas de acuerdo con
la presente invención comprenden por lo menos dos sitios de unión de
antígeno, el primer sitio enlaza a un primer epítopo, el segundo
sitio enlaza a un segundo epítopo.
De acuerdo con una versión preferida, la
presente inmunoglobulina comprende por lo menos dos regiones del
bucle, la primera región del bucle une a un primer epítopo, y la
segunda región del bucle liga a un segundo epítopo. Tanto por lo
menos la primera como por lo menos la segunda región del bucle o
ambas, pueden contener un bucle estructural. Las inmunoglobulinas
de acuerdo con la presente invención incluyen fragmentos de las
mismas, conocidos en la técnica por ser funcionales los cuales
contienen los elementos esenciales de acuerdo con la presente
invención: la región bucle estructural modificada de acuerdo con la
presente invención.
De preferencia, la inmunoglobulina de acuerdo
con la presente invención, está compuesta de por lo menos dos
dominios de inmunoglobulina, o una parte de los mismos que incluye
un minidominio y cada dominio contiene por lo menos un sitio de
unión de antígeno.
Se prefiere también una inmunoglobulina de
acuerdo con la invención, la cual comprende por lo menos un dominio
de la región constante y/o por lo menos un dominio de la región
variable de la inmunoglobulina, o una parte del mismo que incluye
un minidominio. De esta manera, un dominio variable que, por
ejemplo, se modifica en la región C-terminal o el
dominio variable enlazado a una región CH1 modificada, por ejemplo
un minidominio CH1 modificado, es una de las versiones
preferidas.
La inmunoglobulina preferida de acuerdo con la
invención, comprende un dominio que tiene por lo menos un 50% de
homología con el dominio no modificado.
El término "homología" indica que los
polipéptidos tienen los mismos radicales o radicales conservados en
una posición correspondiente en su estructura primaria, secundaria o
terciaria. El término también se extiende a dos o más secuencias de
nucleótidos que codifican los polipéptidos homólogos. "Dominio de
inmunoglobulinas homólogo" significa un dominio de
inmunoglobulina de acuerdo con la invención, que tiene por lo menos
aproximadamente un 50% de identidad de la secuencia de aminoácidos
con respecto a una secuencia del dominio de inmunoglobulina de la
secuencia nativa de longitud completa o cualquier otro fragmento de
una secuencia de dominio de inmunoglobulina de longitud completa
como se describe aquí. De preferencia, un dominio de inmunoglobulina
homólogo tendrá por lo menos aproximadamente un 50% de identidad de
secuencia de aminoácidos, de preferencia por lo menos
aproximadamente un 55% de identidad de la secuencia de aminoácidos,
con más preferencia por lo menos aproximadamente un 60% de
identidad de la secuencia de aminoácidos, con más preferencia por lo
menos aproximadamente un 65% de identidad de la secuencia de
aminoácidos, con más preferencia por lo menos aproximadamente un 70%
de identidad de la secuencia de aminoácidos, con más preferencia
por lo menos aproximadamente un 75% de identidad de la secuencia de
aminoácidos, con más preferencia por lo menos aproximadamente un 80%
de identidad de la secuencia de aminoácidos, con más preferencia
por lo menos aproximadamente un 85% de identidad de la secuencia de
aminoácidos, con más preferencia por lo menos aproximadamente un
90% de identidad de la secuencia de aminoácidos, con más
preferencia por lo menos aproximadamente un 95% de identidad de la
secuencia de aminoácidos respecto a una secuencia de dominio de
inmunoglobulina nativa, o cualquier otro fragmento específicamente
definido de una secuencia de dominio de inmunoglobulina de longitud
completa como se describe aquí.
"Porcentaje (%) de identidad de la secuencia
de aminoácidos" con respecto a las secuencias de dominio de
inmunoglobulina aquí identificadas, se define como el porcentaje de
radicales aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a
los radicales aminoácido en la secuencia de dominio de
inmunoglobulina específica, después de alinear la secuencia e
introducir espacios, si es necesario, para lograr el máximo
porcentaje de identidad de la secuencia, y sin considerar ninguna
substitución conservadora como parte de la identidad de la
secuencia. El alineamiento con el propósito de determinar el
porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos puede
lograrse de diversas formas que están dentro de la destreza en la
técnica, por ejemplo, utilizando programas informáticos disponibles
para el público, tales como BLAST, BLAST-2, ALIGN o
Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar
parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo
cualquier algoritmo necesario para lograr el máximo alineamiento a
lo largo de toda la longitud de las secuencias que se comparan.
Los valores del % de identidad de la secuencia
de aminoácidos, se pueden obtener como se describe a continuación,
utilizando el programa informático
WU-BLAST-2 (Altschul et al.,
Methods in Enzymology ("Métodos de Enzimología")
266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de
búsqueda del WU-BLAST-2 se ajustan a
los valores predefinidos. Aquellos valores no ajustados a los
valores predefinidos, es decir, los parámetros ajustables, se
definen con los valores siguientes: overlap span=l, overlap
fraction=0,125, word threshold (T)=11, y scoring matrix=BLOSUM62.
Cuando se emplea el WU-BLAST-2, se
determina un valor del % de identidad de la secuencia de
aminoácidos al dividir (a) el número de radicales aminoácidos
idénticos que se corresponden con la secuencia de aminoácidos del
dominio de inmunoglobulina de interés que tiene una secuencia
derivada del dominio de inmunoglobulina nativo y la secuencia de
aminoácidos de comparación de interés (es decir, la secuencia
frente a la que se compara el dominio de inmunoglobulina de interés
que puede ser el dominio de inmunoglobulina no modificado), como se
determina por el WU-BLAST-2 por (b)
el número total de radicales aminoácidos de las partes no
aleatorizadas del dominio de la inmunoglobulina de interés. Por
ejemplo, en la declaración "un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos A que tiene por lo menos un 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos frente a la secuencia de
aminoácidos B", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia de
aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de aminoácidos
B es la secuencia de aminoácidos del dominio de
inmunoglobulina
de interés.
de interés.
En una versión preferida, la inmunoglobulina de
acuerdo con la invención es un anticuerpo biespecífico o un
anticuerpo de simple cadena biespecífico. Además, se prefiere que la
inmunoglobulina comprenda un dominio biespecífico o una parte del
mismo que incluya un minidominio.
La inmunoglobulina de acuerdo con la presente
invención, puede emplearse para cualquier propósito conocido en la
técnica para inmunoglobulinas, pero también permite aplicaciones que
dependen de la combinación de especificidades introducidas por la
presente invención. De acuerdo con esto, las inmunoglobulinas según
la presente invención se emplean de preferencia para uso
terapéutico y preventivo (por ejemplo, como inmunoterapia activa o
pasiva); para uso preparativo y analítico y para empleo
diagnóstico.
La inmunoglobulina de la invención puede también
estar contenida en un kit de socios de unión, el cual contiene
(a) una inmunoglobulina modificada que tiene un
sitio de unión de antígeno ajeno a la inmunoglobulina incorporada en
uno o varios bucles estructurales, y
(b) una molécula de unión que contiene un
epítopo de dicho antígeno.
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Dicha molécula de unión de este kit de acuerdo
con la presente invención, se puede emplear para identificar la
especificidad de la unión de la inmunoglobulina modificada de
acuerdo con la presente invención. Al utilizar la molécula de unión
de este kit de acuerdo con la presente invención, se puede
determinar la potencia de las inmunoglobulinas modificadas de
acuerdo con la presente invención.
La potencia como aquí se define, es la propiedad
de enlace de la molécula modificada a su antígeno. El enlace puede
determinarse cuantitativa y/o cualitativamente en términos de
especificidad y/o afinidad y/o avidez, como se emplea para fines de
control de calidad.
Además, la molécula de unión de un kit de
acuerdo con la presente invención, puede emplearse para seleccionar
la inmunoglobulina modificada de acuerdo con la presente invención,
a partir de una biblioteca que consiste en por lo menos 10, de
preferencia por lo menos 100, con más preferencia por lo menos 1000,
con más preferencia por lo menos 10000, en especial por lo menos
100000 inmunoglobulinas con diferentes modificaciones en los bucles
estructurales.
De acuerdo con la presente invención, una de las
características clave de la presente invención es que el diseño por
ingeniería de los dominios de inmunoglobulina se lleva a cabo en
regiones que normalmente no están involucradas en la unión del
antígeno, en otras palabras, en regiones distintas de los CDRs de un
anticuerpo. Se observó que el pliegue específico de dominios de
inmunoglobulina permite la introducción de mutaciones aleatorias en
regiones que estructuralmente son análogas a los CDRs pero
diferentes en la posición en la secuencia. Las regiones
identificadas por la presente invención son, como los CDRs, regiones
del bucle que conectan las hebras beta del pliegue de la
inmunoglobulina.
Más específicamente, se describe aquí que al
introducir mutaciones aleatorias en los bucles que conectan las
hebras beta A-B y E-F de un dominio
IgG1 CH3 humano, se seleccionaron los dominios CH3 mutados que se
unen específicamente a un péptido 9 receptor tipo Toll
(TLR-9) ó a una lisozima de huevo de gallina, que
son un péptido y una proteína respectivamente que normalmente no
son reconocidos y unidos por dominios CH3 humanos de IgG1. Las
mutaciones introducidas por nosotros incluyen mutaciones en las que
los radicales aminoácidos seleccionados en la secuencia salvaje se
reemplazaron por radicales seleccionados aleatoriamente, y también
incluyen inserciones de radicales aminoácidos extra en los bucles
anteriormente mencionados.
Por analogía, los dominios de inmunoglobulina de
cualquier clase de inmunoglobulinas y de inmunoglobulinas de
cualquier especie son susceptibles a este tipo de ingeniería.
Además, no sólo se pueden manipular los bucles específicos objetivo
de la presente invención, sino que cualquier bucle que conecta
hebras beta en dominios de inmunoglobulina puede ser manipulado de
la misma forma.
Los dominios de inmunoglobulina diseñados por
ingeniería a partir de cualquier organismo y de cualquier tipo de
inmunoglobulina, pueden emplearse de acuerdo con la presente
invención ya sea como tales (como dominios simples), o como parte
de una molécula más grande. Por ejemplo, pueden ser parte de una
inmunoglobulina intacta, que de acuerdo con esto tendrá su región
de unión de antígeno "normal" formada por los 6 CDRs y la nueva
región de unión de antígeno diseñada. De la misma manera, se puede
generar una inmunoglobulina multiespecífica, por ejemplo
biespecífica. Los dominios de inmunoglobulina diseñados por
ingeniería también pueden formar parte de cualquier proteína de
fusión. El empleo de estos dominios de inmunoglobulina diseñados por
ingeniería forma parte del campo general de empleo de las
inmunoglobulinas.
Los dominios de las siguientes inmunoglobulinas
se entienden aquí como dominios de inmunoglobulina:
| para IgG, IgD e IgA: | VL, CL, VH, CH1, CH2, CH3 |
| para IgM e IgE: | VL, CL, VH, CH1, CH2, CH3, CH4 |
\vskip1.000000\baselineskip
1. Dominios de inmunoglobulina sencillos
aleatorizados en un lado, es decir, ya sea en bucles que conectan
hebras beta B-C, D-E ó
F-G (la "punta", con la excepción de dominios
variables que están cubiertos por muchas patentes) o hebras beta
A-B, C-D, (C-C' y
C''-D en el caso de dominios variables) ó
E-F (el "fondo"). Se pueden aleatorizar los
bucles sencillos o cualquier combinación de bucles. Pueden
cambiarse, eliminarse o insertarse radicales adicionales.
2. Dominios de inmunoglobulina sencillos
aleatorizados en ambos lados, la punta y el fondo.
3. Cualquier proteína que contiene uno de los
dominios sencillos aleatorizados, tales como:
- a)
- dímeros de "CH3 de cadena sencilla" (scCH3), scCH2, scCH1/CL, aleatorizados en uno o ambos lados
- b)
- Fv de cadena sencilla aleatorizado en el "fondo", es decir, en el lado opuesto a los CDRs
- c)
- fragmentos Fab aleatorizados en el "fondo", es decir, en el extremo C-terminal del dominos CH1 y del CL
- d)
- fragmentos Fc (es decir, proteínas que consisten en CH2-CH3) aleatorizadas en uno o ambos lados
- e)
- inmunoglobulinas completas aleatorizadas en el fondo de Fc
- f)
- otros dominios adecuados
\vskip1.000000\baselineskip
Las ventajas primarias de los dominios
sencillos: son muy similares a todos los argumentos que se utilizan
para estimular las moléculas VH de camello ("nanocuerpos", ver
www.ablynx.com). Los dominios de inmunoglobulina aleatorizados son
proteínas muy pequeñas (peso molecular aproximado
12-15 kDa, dependiendo del número de radicales
aminoácidos insertados) y por tanto tendrán las siguientes ventajas
en comparación con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
convencionales tales como scFv y Fabs: reconocer epítopos no comunes
u ocultos, unirse en cavidades o sitios activos de dianas de
proteína, facilidad de fabricación, y muchos otros. En el caso de un
dominio de inmunoglobulina que está aleatorizado en ambos lados,
puede generarse una molécula bivalente o biespecífica. Las ventajas
principales de los dominios sencillos como parte de proteínas de
fusión son las propiedades de enlace adicionales que pueden
diseñarse por ingeniería en cualquier otra proteína.
Se contempla que cualquier sistema de expresión
pueda emplearse para obtener proteínas. Una analogía con los
dominios sencillos como se describen aquí, se puede encontrar en los
anticuerpos del camello, que sólo tienen un VH pero ningún VL. En
estas proteínas, sólo 3 CDRs (en lugar de 6 como en los anticuerpos
"normales" son responsables de la unión de antígeno).
Las siguientes referencias de patentes se
incorporan a la presente como referencia, incluyéndolas en su
totalidad:
Patente U.S. 6.294.654 Modified immunoglobulin
molecule incorporating an antigen in a non-CDR loop
region ("Molécula de inmunoglobulina que incorpora un antígeno en
una región bucle no-CDR")
Patente U.S. 5.844.094 Target binding
polypeptide ("Unión de un polipéptido a una diana")
Patente U.S. 5.395.750 Methods for producing
proteins which bind to predetermined antigens ("Métodos para la
producción de proteínas que se unen a antígenos
predeterminados")
Patente U.S. 2004/0071690 High avidity
polyvalent and polyspecific reagents ("Reactivos polivalentes y
poliespecíficos de alta avidez")
Patente U.S. 2004/0018508 Surrogate antibodies
and methods of preparation and use thereof ("Anticuerpos
substitutos y métodos de preparación y empleo de los mismos")
Patente U.S. 2003/0157091 Multifunctional
proteins ("Proteínas multifuncionales")
\newpage
Patente U.S. 2003/0148372 Method to screen phage
display libraries with different ligands ("Método para cribar
bibliotecas que muestran fagos, con diferentes ligandos")
Patente U.S. 2002/0103345 Bispecific
immunoglobulin-like antigen binding proteins and
method of production ("Proteínas que se unen a antígenos tipo
inmunoglobulinas biespecíficas, y método de producción")
Patente U.S. 2004/0097711 Immunoglobulin
superfamily proteins ("Proteínas de una superfamilia de
inmunoglobulinas")
Patente U.S. 2004/0082508 Secreted proteins
("Proteínas de secreción")
Patente U.S. 2004/0063924 Secreted proteins
("Proteínas de secreción")
Patente U.S. 2004/0043424 Immunoglobulin
superfamily proteins ("Proteínas de una superfamilia de
inmunoglobulinas")
Patente U.S. 5.892.019 Production of a
single-gene-encoded immunoglobulin
("Producción de una inmunoglobulina codificada por un gen
único")
Patente U.S. 5.844.094 Target binding
polypeptide ("Polipéptido de unión a una diana")
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se ilustra además con las
siguientes figuras y ejemplos, sin estar limitada por los
mismos.
La Figura 1a muestra la estructura de una IgG1
intacta. Los dominios se indican con flechas.
La Figura 1b ilustra la organización estructural
de los monómeros principales del isotipo de la inmunoglobulina
humana. Los enlaces disulfuro se muestran como líneas, los grupos
hidratos de carbono N-enlazados se muestran como
círculos.
La Figura 2 muestra el pliegue de la
inmunoglobulina para un dominio constante (izquierdo) y uno variable
(derecho) de una inmunoglobulina. Las hebras beta se indican
mediante flechas.
La Figura 3 muestra un modelo molecular del
dominio diseñado por ingeniería CH3, de acuerdo con la presente
invención, con la parte aleatorizada indicada por una superficie
accesible a solvente. La superficie está en un círculo.
La Figura 4 muestra una presentación esquemática
de los PCRs utilizados para la producción de los fragmentos
empleados para el ensamblaje del dominio CH3 mutado. Los cebadores
PCR se indican mediante flechas con su orientación
5'-3' respectiva, y las líneas verticales indican
las posiciones aproximadas de los sitios de restricción introducidos
que se emplearon para el ensamblaje del gen mutado. Los siguientes
sitios de restricción están contenidos en los cebadores para las
ligaciones de los fragmentos PCR: CH3LNCO: NcoI; CH3LSAC y CH3CSAC:
SacI; CH3CHIN y CH3RHIN: HindIII; CH3RNOT: NotI.
La Figura 5 muestra algunos ejemplos de cómo
pueden utilizarse los dominios de la inmunoglobulina de la presente
solicitud. Las regiones aleatorizadas se indican mediante un símbolo
de estrella. Las especificidades de las regiones aleatorizadas en
una molécula pueden ser idénticas o diferentes.
La Figura 6 muestra una presentación esquemática
del diseño del dominio CH3 biespecífico de ingeniería. Los nombres
de los cebadores se dan en casillas y las flechas indican la
dirección en la que se alargan los cebadores. Las casillas con
líneas inclinadas indican las posiciones relativas de las regiones
que se aleatorizan en esta construcción, las casillas con líneas
verticales indican las posiciones relativas de las regiones que se
introdujeron para la generación del clon C24, y se indican los
sitios de restricción empleados para el procedimiento de
clonación.
La Figura 7 muestra una presentación esquemática
del diseño del dominio CH3 biespecífico diseñado por ingeniería. La
secuencia de nucleótidos y su traducción se muestra en el diseño
básico del dominio CH3 biespecífico diseñado. Las secuencias rojas
indican regiones aleatorizadas a fin de generar la construcción
biespecífica, mientras que las casillas verdes indican regiones en
las que la secuencia se aleatorizó a fin de generar el clon C24.
La Figura 8 muestra el listado de secuencias de
las secuencias aquí descritas.
La estructura cristalina de un fragmento IgG1
Fc, que se publica en la Base de Datos Brookhaven como entrada
1OQO.pdb, se empleó para ayudar en el diseño del dominio CH3
mutado.
La secuencia que se utiliza como base para la
construcción de la biblioteca CH3 se indica en la SEQ ID Nº 1. En
esta secuencia, el primer aminoácido corresponde a Prolina 343 de la
cadena A de la entrada loqo.pdb de la base de datos Brookhaven. El
último radical contenido en loqo.pdb es Serina 102 de la SEQ ID Nº
1. Después del análisis detallado de la estructura de loqo.pdb y
mediante la inspección visual de los radicales que forman los
bucles que conectan las hebras beta, se decidió aleatorizar los
radicales 17, 18 y 19, que son parte del bucle que conecta la hebra
A-B así como 71, 72, 73, 76 y 77, que son parte del
bucle que conecta a la hebra beta E-F de SEQ ID Nº
1. Un modelo molecular del dominio CH3 diseñado, con la parte
aleatorizada indicada por una superficie accesible a solvente se
muestra en la Figura 3. El gen diseñado se produjo mediante una
serie de reacciones PCR seguidas por ligación de los productos PCR
resultantes. Para facilitar la ligación, algunos de los codones de
la secuencia de nucleótidos que codifica para SEQ ID Nº 1 se
modificaron para producir sitios de restricción sin cambiar las
secuencias de aminoácidos (mutaciones silenciosas). Para la
inserción en el vector de clonación pHEN1 (Nucleic Acids Res. 1991
Aug 11; 19(15):4133-7.
Multi-subunit proteins on the surface of
filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy
and light chains ("Proteínas de multi-subunidades
sobre la superficie del fago filamentoso: metodologías para mostrar
las cadenas pesada y ligera del anticuerpo (Fab)"). Hoogenboom
HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G.) en
cuadro con la señal de secreción peIB, los radicales nucleótidos
extra que codifican Met-Ala se conectaron en el
extremo 5' de la secuencia para crear un sitio de restricción NcoI.
Para los radicales aleatorizados, se eligió el codon NNS (código
IUPAC, donde S significa C ó G) que codifica todos los 20
aminoácidos de origen natural, pero se evitan 2 de 3 codones de
parada. La secuencia diseñada por ingeniería se indica como una
secuencia de nucleótidos en SEQ ID Nº 2 y como una secuencia de
aminoácidos en SEQ ID Nº 3. La letra X en SEQ ID Nº 3 representa
radicales aminoácidos aleatorizados. Las secuencias de los cebadores
PCR utilizados para el ensamblaje del dominio CH3 mutado se indican
en SEQ ID Nº 4 a 9. La Figura 4 muestra una presentación
esquemática de los fragmentos PCR generados para el ensamblaje del
gen mutado y los cebadores empleados para eso.
El ADNc de la cadena pesada del anticuerpo
monoclonal humano 3D6 (Felgenhauer M. Kohl J. Rüker F., Nucleotide
sequences of the cD-NAs encoding the
V-regions of H- and L-chains of a
human monoclonal antibody specific to
HIV-1-gp41 ("Secuencias de
nucleótidos de los cD-Nas que codifican las regiones
V de las cadenas H y L de un anticuerpo monoclonal humano
específico para el HIV-1-gp41").
Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25; 18(16):4927), se usó como
molde para las reacciones PCR. Los 3 productos PCR se digirieron con
SacI y/o HindIII respectivamente y ligaron en conjunto. El producto
de ligación se digirió adicionalmente con NcoI y NotI y se ligó en
el vector fágmido pHEN1 de expresión de superficie, que previamente
se digirió con NcoI y NotI. Un número de clones seleccionados se
controló por análisis de restricción y por secuenciado del ADN y se
encontró que contienen el inserto planificado, incluyendo las
secuencias aleatorizadas insertadas de forma correcta. Para las
siguientes etapas de preparación del fago se siguieron protocolos
estándar. Brevemente, la mezcla de ligación se transformó en
células TGI de E. coli por electroporación. Posteriormente,
las partículas del fago se rescataron de células TG1 de E.
coli con el fago M13-KO7 auxiliar. Después, las
partículas del fago se precipitaron a partir del sobrenadante del
cultivo con PEG/NaCl en 2 etapas, se
disolvieron en agua y se usaron para la selección por ciclos o, de forma alternativa, se almacenaron a menos 80ºC.
disolvieron en agua y se usaron para la selección por ciclos o, de forma alternativa, se almacenaron a menos 80ºC.
Esta biblioteca se construyó y clonó de la misma
forma que la biblioteca CH3. La secuencia de aminoácidos de la
construcción está indicada en SEQ ID Nº 10, la secuencia de
nucleótidos correspondiente en SEQ ID Nº 11, y los cebadores
empleados para la construcción fueron SEQ ID Nº 4-7,
SEQ ID Nº 9 y SEQ ID Nº 12.
Esta biblioteca se construyó y clonó de la misma
forma que la biblioteca CH3. La secuencia de aminoácidos de la
construcción se indica en SEQ ID Nº 13, la secuencia de nucleótidos
correspondiente en SEQ ID Nº 14, y los cebadores empleados para la
construcción fueron SEQ ID Nº 4-7, SEQ ID Nº 9 y SEQ
ID Nº 15.
Se realizaron 3 rondas de selección por ciclo de
adsorción-desorción de acuerdo con protocolos
estándar. Brevemente, se aplicó el siguiente método. Se recubrieron
placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc) con un péptido sintético que
representa parte de la secuencia del receptor 9 tipo Toll
(TLR-9). Se agregaron 200 \mul por pocillo de la
siguiente solución: tampón de carbonato Na 0,1 M, pH 9,6, con las
siguientes concentraciones de péptido disuelto:
- Primera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 1 mg/ml de péptido TLR-9
- Segunda ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 500 \mug/ml de péptido TLR-9
- Tercera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 100 \mug/m1 de péptido TLR-9
Se realizó la incubación durante 1 hora a 37ºC,
seguida de bloqueo con leche deshidratada al 2%
(M-PBS) con 200 \mul por pocillo durante 1 hora a
temperatura ambiente.
A continuación, la biblioteca de fagos de
expresión en superficie se dejó reaccionar con el péptido unido por
adición de 100 \mul de suspensión del fago y 100 \mul de leche
deshidratada al 4% (M-PBS), seguido de incubación
durante 45 minutos con agitación y durante 90 minutos sin agitación
a temperatura ambiente.
Las partículas de fago no ligadas se lavaron por
arrastre como sigue. Después de la primera ronda de selección por
ciclos de adsorción-desorción: 10 x 300 \mul de
T-PBS, 5 x 300 \mul de PBS; después de la segunda
selección por ciclos de adsorción-desorción: 15 x
300 \mul de T-PBS, 10 x 300 \mul de PBS; después
de la tercera selección por ciclos de
adsorción-desorción: 20 x 300 \mul de
T-PBS, 20 x 300 \mul de PBS.
La elución de las partículas de fago ligadas se
realizó añadiendo 200 \mul por pocillo de glicina 0,1 M, pH 2,2 e
incubación con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, se neutralizó la suspensión del fago mediante
adición de 60 \mul de base Tris 2M, seguida de infección en
células TG1 de E. coli por mezcla de 10 ml de cultivo de
crecimiento exponencial con 0,5 ml de fago eluido e incubación
durante 30 minutos a 37ºC. Finalmente, las bacterias infectadas se
plaquearon en medio TYE con glucosa al 1% y 100 \mug/ml de
ampicilina y se incubaron a 30ºC durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN fágmido del fago seleccionado a través de
3 rondas de selección por ciclos de
adsorción-desorción se aísla con un
midi-prep. El ADN que codifica regiones CH3 mutadas
se amplificó por lotes mediante PCR y se clonó
NcoI-NotI en el vector
pNOTBAD/Myc-His, que es el vector de expresión E.
coli pBAD/Myc-His (Invitrogen) con un sitio de
restricción NotI insertado para facilitar la clonación. Las
construcciones ligadas se transformaron en células E. coli
LMG194 (Invitrogen) con electroporación, y se crecieron a 30ºC en
medio TYE con 1% de glucosa y ampicilina durante la noche. Los
clones seleccionados se inocularon en 200 \mul de medio 2xYT con
ampicilina, se desarrollaron durante la noche a 30ºC, y se
indujeron por adición de L-arabinosa hasta una
concentración final de 0,1%. Después de la expresión a 16ºC durante
la noche, las células de recolectaron por centrifugación y se
trataron con 100 \mul de tampón de borato de sodio, pH 8,0 a 4ºC
durante la noche para la preparación de extractos periplásmicos. Se
emplearon 50 \mul de extractos periplásmicos en el análisis ELISA
(ver más adelante).
\vskip1.000000\baselineskip
Revestimiento: Placa de microtitulación (NUNC,
Maxisorp), 100 \mul por pocillo, 20 \mug de péptido
TLR-9/ml de tampón de carbonato 0,1 M pH 9,6, 1 hora
a 37ºC
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Bloqueo: BSA-PBS al 1%, l hora a
temperatura ambiente
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Unión de extractos periplásmicos: 50 \mul de
extracto periplásmico, 50 \mul de BSA-PBS al 2%, a
temperatura ambiente durante la noche.
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Primer anticuerpo: anti-His4
(Qiagen), 1:1000 en BSA-PBS al 1%, 90 min a TA, 100
\mul por pocillo
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo anticuerpo: cabra antiratón*HRP (SIGMA),
1:1000 en BSA-PES al 1%, 90 min a TA, 100 \mul
por pocillo
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Detección: 3 mg/ml de OPD en tampón
citrato/fosfato de Na, pH 4,5, 0,4 \mul H_{2}O_{2} al 30%
\vskip1.000000\baselineskip
Parada: 100 ml de H_{2}SO_{4} 3M
\vskip1.000000\baselineskip
Absorbancia lectura: 492/620 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones que dieron señal alta en este primer
ELISA preliminar se cultivaron en un volumen de 20 ml en las mismas
condiciones descritas anteriormente. Sus extractos periplásmicos se
aislaron en 1/20 del volumen de cultivo como se ha descrito
anteriormente y se ensayaron con ELISA (como se ha descrito más
arriba), para confirmación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron 3 rondas de selección por ciclos
de adsorción-desorción. Se recubrieron placas de 96
pocillos Maxisorp (Nunc) con lisozima de huevo de gallina, por
adición de 200 \mul de la siguiente solución por pocillo:
PBS, con las siguientes concentraciones de
lisozima de huevo de gallina disuelta:
- Primera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 2 mg/ml HEL
- Segunda ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: l mg/ml HEL
- Tercera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 1 mg/ml HEL
\vskip1.000000\baselineskip
La incubación se realizó durante 1 hora a 37ºC,
seguida de bloqueo con leche deshidratada al 2%
(M-PBS) con 200 \mul por pocillo durante 1 hora a
temperatura ambiente.
A continuación, se dejó que la biblioteca de
fagos de expresión en superficie reaccionara con la lisozima de
huevo de gallina ligada mediante adición de 100 \mul de suspensión
de fago y 100 \mul de leche deshidratada al 4%
(M-PBS), seguido de incubación durante 45 minutos
con agitación y durante 90 minutos sin agitación a temperatura
ambiente.
Las partículas de fago no ligadas se lavaron por
arrastre como sigue:
- Primera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 20 x 300 \mul de T-PBS, 5 x 300 \mul de PBS.
- Segunda ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 15 x 300 \mul de T-PBS, 10 x 300 \mul de PBS.
- Tercera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 20 x 300 \mul de T-PBS, 20 x 300 \mul de PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
La elución de las partículas de fago ligadas se
realizó añadiendo 200 \mul por pocillo de glicina 0,1 M, pH 2,2 e
incubación con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, la suspensión de fago se neutralizó por adición de
60 \mul de base Tris 2M, seguido de infección en células TG1 de
E. coli por mezcla de 10 ml de cultivo de crecimiento
exponencial con 0,5 ml de fago eluido e incubación durante 30
minutos a 37ºC. Finalmente, las bacterias infectadas se plaquearon
en medio TYE con glucosa al 1% y 100 \mug/ml de ampicilina, y se
incubaron a 30ºC durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La clonación de los clones seleccionados para la
expresión soluble se realizó como se ha descrito anteriormente para
los mutantes CH3 seleccionados frente a TLR-9.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión soluble de los clones seleccionados
se realizó como se ha descrito anteriormente para los mutantes CH3
seleccionados frente a TLR-9. Los extractos
periplásmicos se ensayaron en un análisis ELISA preliminar (para el
protocolo, ver ejemplo 10).
Los clones que dieron una señal alta en este
primer análisis ELISA preliminar se cultivaron en un volumen de 20
ml en las mismas condiciones descritas anteriormente. Sus extractos
periplásmicos se aislaron en 1/20 de volumen de cultivo como se ha
descrito anteriormente y se ensayaron con un análisis ELISA (como se
describe en el ejemplo 10) para confirmación.
\vskip1.000000\baselineskip
Revestimiento: Placa de microtitulación (NUNC.
Maxisorp), 100 \mul por pocillo, 100 \mug de lisozima de huevo
de gallina/ml en PBS l hora a 37ºC.
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Bloqueo: BSA-PBS al 1%, l hora a
TA
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Unión de extractos periplásmicos: 50 \mul de
extracto periplásmico 50 \mul de BSA-PBS al 2% a
temperatura ambiente durante la noche
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Primer anticuerpo: anti-His4
(Qiagen), 1:1000 en BSA-PBS al 1%, 90 min a TA, 100
\mul por pocillo
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo anticuerpo: cabra
anti-ratón*HRP(SIGMA), 1:1000 en
BSA-PBS al 1%, 90 min a TA (temperatura ambiente),
100 \mul por pocillo
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Detección: 3 mg/ml OPD en tampón citrato/fosfato
Na. pH 4,5, 0,4 \mul de H_{2}O_{2} al 30%
Parada: 100 ml de H_{2}SO_{4} 3M
Absorbancia, lectura: 492/620 nm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se observa que la lisozima de huevo de gallina
reacciona con el anticuerpo anti-his_{4}, por lo
que se observa un fondo relativamente alto.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La inspección visual de la estructura cristalina
de un fragmento de Fab (se emplea la estructura del Fab del
anticuerpo monoclonal humano 3D6: RSCB Protein Data Bank ("Banco
de Datos de Proteínas")(http://www.rcsb.org/pdb/), entrada
1DFB.PDB (He XM, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Aug
1;89(15):7154-8) y el análisis asistido por
ordenador (por ejemplo, para este propósito se emplea el programa
Protein
Explorer(http://molvis.sdsc.edu/protexpl/
frntdoor.htm)) de la estructura secundaria y terciaria de esta proteína) permite identificar residuos localizados en regiones del bucle que conectan las hebras beta de la plantilla del dominio CL. Estos residuos comprenden los aminoácidos 8 a 18, los aminoácidos 27 a 35, los aminoácidos 42 a 78, los aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 92 a 100, los aminoácidos 108 a 117 y los aminoácidos 123 a 126 (numeración de acuerdo con el sistema de numeración IMGT (Lefranc MP. et al., Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33 (Database issue):0593-7; Lefranc MP, et al., Dev Comp Immunol. 2005; 29(3):185-203)).
frntdoor.htm)) de la estructura secundaria y terciaria de esta proteína) permite identificar residuos localizados en regiones del bucle que conectan las hebras beta de la plantilla del dominio CL. Estos residuos comprenden los aminoácidos 8 a 18, los aminoácidos 27 a 35, los aminoácidos 42 a 78, los aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 92 a 100, los aminoácidos 108 a 117 y los aminoácidos 123 a 126 (numeración de acuerdo con el sistema de numeración IMGT (Lefranc MP. et al., Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33 (Database issue):0593-7; Lefranc MP, et al., Dev Comp Immunol. 2005; 29(3):185-203)).
Más específicamente, los residuos 11, 12,
14-18, y 92-95 se aleatorizan dentro
del dominio CL humano (SEQ ID Nº 48). La aleatorización se logra
por amplificación PCR de las secuencias de codificación con
cebadores PCR en que las posiciones de los codones relevantes se
codifican por la secuencia de nucleótidos
5'-NNS-3', que potencialmente
codifican todos los 20 aminoácidos, evitando 2 de los 3 codones de
parada. El inserto de la biblioteca se amplifica mediante dos
reacciones PCR separadas y los dos fragmentos PCR se ligan en
conjunto mediante un sitio de restricción HpyCH4IV que se introduce
como mutación silenciosa mediante los cebadores PCR. Además, los
cebadores proporcionan los sitios de restricción de endonucleasa
NcoI y NotI respectivamente para clonar en el vector de expresión
de fago pHEN (Hoogenboom HR, et al., Nucleic Acids Res. 1991
Aug 11; 19(15):4133-7). La cisteína
C-terminal del dominio CL no se incluye para la
expresión de fago, pero puede agregarse posteriormente cuando se
utiliza un clon CL modificado, por ejemplo para la construcción de
un fragmento Fab.
Como molde para la amplificación PCR, se usa un
plásmido pRcCMV-3D6LC (Rüker F. et al., Ann N
Y Acad Sci. 1991 Dec 27; 646:212-9), que contiene
como inserto la cadena ligera completa del anticuerpo monoclonal
humano.
Para las bibliotecas CL+3 (SEQ ID Nº 50, 51) y
CL+5 (SEQ ID Nº 52, 53), que contienen residuos adicionales
insertados entre las posiciones 92 y 95 del dominio CL, se emplean
los cebadores CLRHPY3 y CLRHPY5 respectivamente en lugar del cebador
CLRHPY.
A continuación se muestra la secuencia (SEQ ID
Nº 48, 49), ó sea la secuencia de nucleótidos y aminoácidos del
producto final del PCRs y las ligaciones, clonada en el sitio NcoI
de pHEN1, que conduce a la unión de una secuencia líder peIB con el
extremo N de la construcción:
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante análisis de restricción y secuenciación
de ADN se controla que un número de clones seleccionados de la
biblioteca (dominios CL mutados clonados en el vector fágmido pHEN1)
contengan el inserto planificado, incluyendo las secuencias
aleatorizadas correctamente insertadas. Para los siguientes pasos de
preparación del fago, se siguen protocolos estándar. Brevemente, la
mezcla de ligación se transforma en células TG1 de E. coli
por electroporación. Posteriormente, se rescatan partículas fago de
las células TG1 de E. coli con el fago auxiliar
M13-KO7. A continuación, las partículas de fago se
precipitan a partir del sobrenadante del cultivo con PEG/NaCl en 2
etapas, se disuelven en agua y se utilizan para la selección por
ciclos de adsorción-desorción o, de forma
alternativa, se pueden almacenar a menos 80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La inspección visual de la estructura cristalina
de un fragmento Fab (se usa la estructura del Fab del anticuerpo
monoclonal humano 3D6: RSCB Protein Data Bank Entry 1DFB.PDB) y el
análisis asistido por ordenador (se utiliza Protein Explorer para
este propósito) de la estructura secundaria y terciaria de esta
proteína permite identificar radicales ubicados en regiones del
bucle que conectan las hebras beta de la estructura del dominio
CH1. Estos radicales comprenden los aminoácidos 7 al 21, los
aminoácidos 25 al 39, los aminoácidos 41 al 81, los aminoácidos 83
al 85, los aminoácidos 89 al 103 y los aminoácidos 106 al 117
(numeración de acuerdo con el sistema de numeración IMGT).
Más específicamente, los radicales
12-19 y 93-100 se aleatorizan dentro
del dominio CH1 humano (SEQ ID Nº 54, 55). La aleatorización se
logra mediante amplificación PCR de las secuencias de codificación
con cebadores PCR en los cuales las posiciones de los codones
relevantes se codifican por la secuencia de nucleótidos
5'-NNS-3', que codifica
potencialmente todos los 20 aminoácidos, evitando 2 de los 3 codones
de interrupción. El inserto de la biblioteca se amplifica mediante
dos reacciones PCR separadas y los dos fragmentos PCR se ligan
juntamente mediante un sitio de restricción BstEII que aparece de
forma natural en el dominio CH1. Los cebadores proporcionan además
los sitios de restricción de endonucleasa NcoI y NotI
respectivamente para la clonación en el vector de expresión del fago
pHEN. La cisteína C-terminal del dominio CH1 no se
incluye para la expresión del fago pero puede agregarse
posteriormente cuando se utiliza un clon CH1 modificado, por
ejemplo, para la construcción de un fragmento Fab.
Como molde para la amplificación PCR, se emplea
un plásmido como por ejemplo, el pRcCMV-3D6HC, el
cual contiene como inserto la cadena pesada completa del anticuerpo
monoclonal humano.
A continuación se muestra (SEQ. ID Nº 54, 55) la
secuencia de nucleótidos y aminoácidos del producto final de los
PCRs y ligaciones, clonada en el sitio NcoI de pHEN1, que lleva a la
unión de una secuencia líder peIB con el extremo N de la
construcción:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante análisis de restricción y secuenciación
de ADN se controla que un número de clones seleccionados de la
biblioteca (dominios CH1 mutados clonados en el vector fágmido
pHEN1) contengan el inserto planificado, incluyendo las secuencias
aleatorizadas correctamente insertadas. Para los siguientes pasos de
preparación del fago, se siguen protocolos estándar. Brevemente, la
mezcla de ligación se transforma en células TG1 de E. coli
por electroporación. Posteriormente, se rescatan partículas fago de
las células TG1 de E. coli con el fago auxiliar
M13-KO7. A continuación, las partículas de fago se
precipitan a partir del sobrenadante del cultivo con PEG/NaCl en 2
pasos, se disuelven en agua y se utilizan para la selección por
ciclos de adsorción-desorción o, de forma
alternativa, se pueden almacenar a menos 80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizan 3 rondas de selección de ciclos de
adsorción-desorción con la biblioteca del
fago-CH1 (ver ejemplo 12). Placas de 96 pocillos
Maxisorp (Nunc) se recubren con lisozima de huevo de gallina.
añadiendo 200 \mul de la siguiente solución por pocillo: PBS, con
las siguientes concentraciones de lisozima de huevo de gallina
disuelta:
- Primera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 2 mg/ml de HEL
- Segunda ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: l mg/ml de HEL
- Tercera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 1 mg/ml de HEL
\vskip1.000000\baselineskip
La incubación se realizó durante 1 hora a 37ºC.
seguida por un bloqueo con leche deshidratada al 2%
(M-PBS) con 200 \mul por pocillo durante 1 hora a
temperatura ambiente.
A continuación, se deja que la biblioteca de
fagos de expresión en superficie reaccione con la lisozima de huevo
de gallina ligada mediante adición de 100 \mul de suspensión de
fago y 100 \mul de leche deshidratada al 4%
(M-PBS), seguido de incubación durante 45 minutos
con agitación y durante 90 minutos sin agitación a temperatura
ambiente.
Las partículas de fago no ligadas se lavaron por
arrastre como sigue:
- Primera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 10 x 300 \mul de T-PBS, 5 x 300 \mul de PBS.
- Segunda ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 15 x 300 \mul de T-PBS, 10 x 300 \mul de PBS.
- Tercera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 20 x 300 \mul de T-PBS, 20 x 300 \mul de PBS.
\newpage
La elución de las partículas de fago ligadas se
realizó añadiendo 200 \mul por pocillo de glicina 0,1 M, pH 2,2 e
incubación con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, la suspensión de fago se neutralizó por adición de
60 \mul de Base Tris 2M, seguido de infección en células TG1 de
E. coli por mezcla de 10 ml de cultivo de crecimiento
exponencial con 0,5 ml de fago eluido e incubación durante 30
minutos a 37ºC. Finalmente, las bacterias infectadas se plaquearon
en medio TYE con glucosa al 1% y 100 \mug/ml de ampicilina, y se
incubaron a 30ºC durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN fágmido del fago seleccionado a través de
3 rondas de selección por ciclos de
adsorción-desorción se aísla con un
midi-prep. El ADN que codifica los dominios CH1
mutados, se amplifica por lotes por PCR y se clona
NcoI-NotI en el vector
pNOTBAD/Myc-His, que es el vector de expresión E.
coli pBAD/Myc-His (Invitrogen) con un sitio de
restricción NotI insertado para facilitar la clonación. Las
construcciones ligadas se transformaron en células LMG194 de E.
coli (Invitrogen) con electroporacción y se desarrollaron a 30ºC
en medio TYE con glucosa al 1% y ampicilina durante la noche. Los
clones seleccionados se inocularon en 200 \mul de medio 2xYT con
ampicilina, se desarrollaron durante la noche a 30ºC y se indujeron
por adición de L-arabinosa a una concentración final
de 0,1%. Después de la expresión a 16ºC durante la noche, las
células se recolectaron por centrifugación y se trataron con 100
\mul de tampón de borato Na, pH 8,0, a 4ºC durante la noche para
la preparación de extractos periplásmicos. 50 \mul de los
extractos periplásmicos se emplearon en el análisis ELISA.
Los clones que dan una señal alta en este primer
ELISA preliminar se cultivan en un volumen de 20 ml en las mismas
condiciones que se describen anteriormente. Sus extractos
periplásmicos se aíslan en 1/20 del volumen de cultivo como se
describió anteriormente y se ensayan con un análisis ELISA (como se
describe a continuación) para confirmación.
\vskip1.000000\baselineskip
Recubrimiento a 37ºC: placa de microtitulación
(NUNC, Maxisorp), 100 \mul por pocillo, 100 \mug de lisozima de
huevo de gallina/ml en PBS, l hora a 37ºC
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Bloqueo: BSA-PBS al 1%. l h a
TA
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Unión del extracto periplásmico: 50 \mul de
extracto periplásmico 50 \mul de BSA-PBS al 2%, a
temperatura ambiente durante la noche
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Primer anticuerpo:
anti-His_{4} (Qiagen). 1:1000 en
BSA-PBS al 1%, 90 min a TA. 100 \mul por
pocillo
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo anticuerpo: cabra
anti-ratón*HRP(SIGMA), 1:1000 en
BSA-PBS al 1%, 90 min a TA (temperatura ambiente),
100 \mul por pocillo
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Detección del pH: 3 mg/ml de OPD en tampón
citrato/fosfato de Na, pH 4,5, 0,4 \mul de H_{2}O_{2} al
30%
Parada: 100 ml de H_{2}SO_{4} 3M
Lectura de la absorbancia: 492/620 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones se interpretan como positivos cuando
su señal ELISA es por lo menos tres veces la de la señal de
fondo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizan 3 rondas de selección por ciclos de
adsorción-desorción con la biblioteca de
fago-CL (ver ejemplo 11). Se recubren placas de 96
pocillos Maxisorp (Nunc) con lisozima de huevo de gallina, añadiendo
200 \mul de la solución siguiente por pocillo: PBS, con las
concentraciones siguientes de lisozima de huevo de gallina:
- Primera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 2 mg/ml de HEL
- Segunda ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: l mg/ml de HEL
- Tercera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 1 mg/ml de HEL
\vskip1.000000\baselineskip
La incubación se realizó durante 1 hora a 37ºC,
seguida de bloqueo con leche deshidratada al 2%
(M-PBS) con 200 \mul por pocillo durante 1 hora a
temperatura ambiente.
A continuación, se deja que la biblioteca de
fagos de expresión en superficie reaccione con la lisozima de huevo
de gallina ligada mediante adición de 100 \mul de suspensión de
fago y 100 \mul de leche deshidratada al 4%
(M-PBS), seguido de incubación durante 45 minutos
con agitación y durante 90 minutos sin agitación a temperatura
ambiente.
Las partículas de fago no ligadas se lavaron por
arrastre como sigue:
- Primera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 10 x 300 \mul de T-PBS, 5 x 300 \mul de PBS
- Segunda ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 15 x 300 \mul de T-PBS, 10 x 300 \mul de PBS
- Tercera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 20 x 300 \mul de T-PBS, 20 x 300 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
La elución de las partículas de fago ligadas se
realizó añadiendo 200 \mul por pocillo de glicina 0,1 M, pH 2,2 e
incubación con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, la suspensión de fago se neutralizó por adición de
60 \mul de Base Tris 2M, seguido de infección en células TG1 de
E. coli mediante la mezcla de 10 ml de cultivo de crecimiento
exponencial con 0,5 ml de fago eluido e incubación durante 30
minutos a 37ºC. Finalmente, las bacterias infectadas se dispusieron
en medio TYE con glucosa al 1% y 100 \mug/ml de ampicilina y se
incubaron a 30ºC durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN fágmido del fago seleccionado a través de
3 rondas de selección por ciclos de
adsorción-desorción, se aísla con un
midi-prep. El ADN que codifica los dominios CL
mutados se amplifica por lotes por PCR y se clona
NcoI-NotI en el vector
pNOTBAD/Myc-His, que es el vector de expresión E.
coli pBAD/Myc-His (Invitrogen) con un sitio de
restricción NotI insertado para facilitar la clonación. Las
construcciones ligadas se transformaron en células LMG194 de E.
coli (Invitrogen) con electroporacción y se desarrollaron a 30ºC
en medio TYE con glucosa al 1% y ampicilina durante la noche. Los
clones seleccionados se inocularon en 200 \mul de medio 2xYT con
ampicilina, se desarrollaron durante la noche a 30ºC y se indujeron
por adición de L-arabinosa a una concentración final
de 0,1%. Después de la expresión a 16ºC durante la noche, las
células se recolectaron por centrifugación y se trataron con 100
\mul de tampón borato Na, pH 8,0, a 4ºC durante la noche para la
preparación de extractos periplásmicos. 50 \mul de los extractos
periplásmicos se emplearon en el análisis ELISA.
Los clones que dan una señal alta en este primer
análisis ELISA preliminar se cultivan en un volumen de 20 ml en las
mismas condiciones que se han descrito anteriormente. Sus extractos
periplásmicos se aíslan en 1/20 del volumen de cultivo como se
describió anteriormente y se ensayan con un análisis ELISA (como se
describe a continuación) para confirmación.
\vskip1.000000\baselineskip
Recubrimiento: placa de micro titulación (NUNC,
Maxisorp). 100 \mul por pocillo, 100 \mug de lisozima de huevo
de gallina/ml en PBS, l hora a 37ºC
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Bloqueo: BSA-PBS al 1%, l hora a
TA
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Unión del extracto periplásmico: 50 \mul de
extracto periplásmico 50 \mul de BSA-PBS al 2%, a
temperatura ambiente durante la noche
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Primer anticuerpo:
anti-His_{4} (Qiagen), 1:1000 en
BSA-PBS al 1%, 90 min a TA, 100 \mul por
pocillo
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo anticuerpo: cabra
anti-ratón*HRP(SIGMA), 1:1000 en
BSA-PBS al 1%, 90 min a TA (temperatura ambiente),
100 \mul por pocillo
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Detección: 3 mg/ml OPD en tampón citrato/fosfato
Na, pH 4,5, 0,4 \mul de H_{2}O_{2} al 30%
Parada: 100 ml de H_{2}SO_{4} 3M
Lectura de la absorbancia: 492/620 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones se interpretan como positivos cuando
su señal ELISA es por lo menos tres veces la de la señal de
fondo.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe un dominio de
inmunoglobulina de diseño con dos especificidades de enlace.
El diseño de este dominio de inmunoglobulina de
diseño comprende la siguiente estrategia:
* se emplea como punto de partida, un dominio
C_{H}3 de diseño, por ingeniería, el clon C24 (ver ejemplo 10),
derivado de la biblioteca C_{H}3+5 que se une específicamente a la
lisozima como punto de partida
* los residuos que se tienen que aleatorizar se
identificaron en este dominio CH3 modificado, conectando hebras
\beta del pliegue de la inmunoglobulina y disponiéndose en el lado
opuesto del dominio comparado con los radicales que se mutaron al
generar el clon C24.
* se diseñaron los cebadores PCR que permiten la
aleatorización de estos radicales y la síntesis de este dominio de
inmunoglobulina de diseño en un procedimiento similar al descrito
anteriormente para las bibliotecas de C_{H}3, C_{H}3+3 y la
C_{H}3+5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ligaron 4 productos PCR que contienen
posiciones aleatorizadas y se amplificaron insertos de longitud
completa por PCR. Posteriormente, se clonaron en
pHEN-1 mediante sitios NcoI-NotI y
transformaron en células TG-1 de E. coli para
construir una biblioteca de aproximadamente 10^{8} colonias. Se
secuenciaron 20 colonias seleccionadas aleatoriamente y se encontró
que las posiciones aleatorizadas mutaron independientemente. Tampoco
se observó la secuencia "salvaje" (C24). La biblioteca del fago
se generó siguiendo protocolos estándar, y se logró un título de
fago de 6,32 x 10^{10} TU/ml.
Con el fin de probar la biespecificidad, se
eligió eritropoyetina humana recombinante (rhEPO) como segundo
antígeno, mientras que se espera que la construcción retenga su
especificidad diseñada originalmente para la lisozima de huevo de
gallina. El fago reactivo a rhEPO se seleccionó en 4 rondas de
selección por ciclos de adsorción-desorción. A fin
de conservar la población de clones C24 que después de la
mutagénesis todavía se unen a lisozima de huevo de gallina, la
primera ronda de selección en rhEPO fue seguida de una ronda de
selección por ciclos de adsorción-desorción de la
población fago en lisozima de huevo de gallina (1 mg/ml en PBS). 200
\mul de rhEPO se recubrieron en los 5 pocillos de la placa de
microtitulación (Maxisorp, Nunc) en tampón carbonato Na 0,1 M, pH
9,6, en concentraciones decrecientes en rondas sucesivas de
selección por ciclos de adsorción-desorción (ver
tabla siguiente). Después de bloquear con M-PBS al
2%, se permitió la unión del fago en el agente de bloqueo a
temperatura ambiente durante 2 h. Después de 20 lavados con
T-PBS y 20 con PBS, se eluyó con glicina 0,1 M, pH
2,2, y se neutralizó con Tris 2M. El fago eluido se utilizó
inmediatamente para infectar TG-1 de crecimiento
exponencial. Las células infectadas se seleccionaron en medio que
contiene ampicilina. Las partículas de fago se rescataron de
sobrenadantes de cultivo hasta superinfección con fago auxiliar
M13-KO7, se concentraron con PEG y se utilizaron en
otra ronda de selección por ciclos de
adsorción-desorción. Los números de entrada y salida
de fago se determinaron como comunidades de transformación de E.
coli después de cada ronda de selección por ciclos
adsorción-desorción (Tabla 8).
\vskip1.000000\baselineskip
Las colonias resultantes se desprendieron de las
placas, se cultivaron en 2xYT con ampicilina y su ADN plasmídico se
aisló con un midi-prep. Los insertos se amplificaron
con una PCR y después se subclonaron en el vector pNOTBAD y se
transformaron en una cepa E104 de E. coli. Se cultivaron 4x72
colonias en 200 \mul de 2xYT con ampicilina y se indujeron con
L-arabinosa al 0,1% al día siguiente. Tras 24 horas
de expresión a 16ºC, se lisaron con 200 \mul de tampón borato Na,
pH 8,0 durante 6 h a 4ºC y se usó extracto periplásmico en el
análisis ELISA.
Para el análisis ELISA, se revistieron placas
Maxisorp con lisozima de huevo de gallina en PBS (20 \mug/ml) ó
rhEPO en tampón carbonato Na 0,1 M, pH 9,6, respectivamente, durante
1 hora a 37ºC. Después del bloqueo con BSA-PBS al
1%, se dejó que el extracto periplásmico se uniera en el mismo
agente de bloqueo durante la noche. El enlace se reveló con un
anticuerpo anti-His-(4) y un anticuerpo IgG de cabra
anti-ratón, conjugado con HRP (para la detección de
lisozima de huevo de gallina) ó AP (para la detección de rhEPO). La
reacción coloreada de la conversión de OPD (HRP) se leyó a 492/620
nm después de interrumpir con H_{2}SO_{4} 1,25 M y la conversión
pNPP (AP) se leyó a 405/620 nm. 14 clones con valores prometedores
de absorbancia se seleccionaron para la expresión a escala de 20 ml.
Después de 24 h de inducción de arabinosa a 16ºC, las células se
recolectaron y se lisaron durante la noche en 1 ml de tampón de
borato Na a 4ºC, y el lisado se empleó para el análisis ELISA. El
análisis ELISA se realizó como antes en 4 ensayos paralelos y se
emplearon pocillos sin extracto periplásmico y sin antígenos como
controles negativos. Los resultados (Tabla 9) se obtuvieron con
clones de acuerdo con SEQ ID Nº 42, 43.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la construcción empleada en este ejemplo,
tanto la cadena VL como la cadena VH de un anticuerpo se fusionan
en un dominio C_{H}3 de diseño.
Las regiones VL y VH del anticuerpo monoclonal
humano 3D6 (He XM, et al., Pro Natl Acad Sci USA. 1992
89:7154-8.; Kohl J. et al., Ann N Y Acad Sci.
1991 646:106-14.; Felgenlauer M. et al.,
Nucleic Acids Res. 1990 18:4927), que reconocen un epítopo en gp41
de HIV-1, se utilizaron como socio de fusión para el
clon C24 del dominio C_{H}3 diseñado que se une específicamente a
la lisozima de huevo de gallina.
Con el fin de promover la formación del dímero
VL-CH3/VH-CH3 mediante un enlace
disulfuro, se añadieron los radicales Ser-Cys al
extremo C de las secuencia C24.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
respectivamente de las dos cadenas 3D6VL-C24 y
3D6VH-C24 están indicadas en SEQ ID Nº 47, 46 y SEQ
ID Nº 45, 44, respectivamente.
Se diseñaron cebadores que permiten la
amplificación de las regiones de codificación, introduciendo al
mismo tiempo sitios de restricción (mutaciones silenciosas) que se
emplearon para ligar juntamente las regiones de codificación. Para
la expresión de los genes, se escogió el sistema de expresión de
Pichia pastoris. Se clonaron las construcciones en vectores
de expresión apropiados de Pichia pastoris:
3D6VL-C24 se clonó en pPIC9K (nombre final:
pPIC9K3LC) y 3D6VH-C24 (nombre final: pPICZ3HC) se
clonó en pPICZalphaA. La construcción pPICZ3HC se linealizó con
Bgl II, se transformó en Pichia pastoris GS115 y los
transformantes se seleccionaron en medio sólido que contiene
zeocina. Uno de los transformantes se usó posteriormente como célula
anfitriona para la construcción pPIC9K3LC linealizada Sal I-.
A continuación, se seleccionaron dobles transformantes en medio
RDB.
Los clones se inocularon en 30 ml de medio YPG y
se desarrollaron hasta OD_{600}=10, y después se indujeron por
adición de metanol al 1% en medio BMMY. La inducción se continuó
durante 36 horas a 16ºC. Se retiraron los sobrenadantes por
centrifugación y después se concentraron aproximadamente 10 veces.
La presencia de la proteína recombinante se confirmó por
transferencia Western con un anticuerpo anti-His (4)
y se estimó una concentración de aproximadamente
50-100 \mug/l de cultivo inicial.
Las primeras pruebas funcionales se realizaron
con sobrenadante concentrado 10x. En primer lugar, los pocillos de
las placas Maxisorp se revistieron con 20 \mug/ml de lisozima de
huevo de gallina en PBS ó 20 \mug/ml de epítopo del anticuerpo 3D6
en tampón carbonato Na 0,1 M, pH 9,6, respectivamente, durante 1
hora a 37ºC. El epítopo 3D6 se utilizó en forma de una proteína de
fusión GST producida recombinantemente. Después de bloquear con
BSA-PBS al 1%, se dejó que los sobrenadantes
concentrados se unieran durante la noche en el mismo agente
bloqueante. El enlace se reveló con un anticuerpo
anti-His(4) y anticuerpo cabra
anti-ratón, conjugado con HRP, y se visualizó como
reacción de color resultante de la conversión OPD a 492/620 nm
(Tabla 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (32)
1. Método de preparación por ingeniería de una
inmunoglobulina que comprende una región bucle estructural
modificada, para proporcionar un sitio de unión
no-CDR, y determinar la unión de dicha
inmunoglobulina a un epítopo de un antígeno, en donde la región
bucle estructural sin modificar no se une significativamente a dicho
epítopo, el cual método comprende los pasos de:
- provisión de un ácido nucleico que codifica
una inmunoglobulina que comprende por lo menos una región bucle
estructural,
- modificación de por lo menos un radical
nucleótido de dicha región bucle estructural mediante mutagénesis,
en donde dicha modificación, o bien
- a)
- se selecciona por un método de mutagénesis, del grupo formado al azar, semi-azar, aleatorización dirigida al sitio, mutagénesis por scanning y métodos combinatorios, o
- b)
- hay más de un bucle estructural para proporcionar una unión de sitio a dicho epítopo, o
- c)
- excluye la incorporación de un péptido biológicamente activo de 2 a 40 aminoácidos en un dominio Fc.
- transferencia de dicho ácido nucleico
modificado en un sistema de expresión,
- expresión de dicha inmunoglobulina
modificada,
- puesta en contacto de la inmunoglobulina
modificada expresada, con unos epítopos, y
- determinación de si dicha inmunoglobulina
modificada se ha unido a dicho epítopo.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque, dicha inmunoglobulina se une
específicamente por lo menos a dos diferentes epítopos.
3. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, el cual método comprende por lo menos una
modificación en por lo menos una región bucle estructural de dicha
inmunoglobulina y determinación de la unión específica de por lo
menos una región bucle estructural a por lo menos una molécula
seleccionada del grupo formado por alérgenos, antígenos asociados a
un tumor, autoantígenos, enzimas, antígenos bacterianos, antígenos
fúngicos, antígenos víricos y antígenos protozoarios, en donde
dicha región bucle estructural sin modificar no se une
específicamente a dicha por lo menos una molécula.
4. Método de acuerdo con la reivindicación 3,
caracterizado porque, por lo menos se selecciona una molécula
del grupo formado por, antígenos asociados a un tumor, en particular
EpCAM, glicoproteína-72 (TAG-72)
asociado a un tumor, antígeno CA 125 asociado a un tumor, antígeno
de membrana específico de la próstata (PSMA), antígeno de alto peso
molecular asociado a un melanoma (HMW-MAA), antígeno
asociado a un tumor que expresa hidratos de carbono relacionados con
Lewis Y, antígeno carcinoembriónico (CEA), CEACAMS, HMFG PEM, mucina
MUC1, MUC18 y antígeno asociado a un tumor de citoqueratina,
antígenos bacterianos, antígenos víricos, alérgenos, fluoresceína,
lisozima, receptor 9 tipo toll, eritropoyetina, CD2, CD3, CD3E, CD4,
CD11, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29,
CD30, CD33 (proteína p67), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56,
CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R,
IL-2, IL-2R, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-6R,
IL-8, IL-12, IL-15,
IL-18, IL-23, interferón alfa,
interferón beta, interferón gamma; TNF-alfa,
TNFbeta2, TNF-alfa, TNF alfabeta,
TNF-R1, TNF-RII, FasL., CD27L,
CD30L, 4-1BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF,
LIGHT, VEG1, OX40L, TRAIL Receptor-1, A1 Adenosina
Receptor, Linfotoxina beta receptor, TACI, BAFF-R,
EPO; LFA-3, ICAM-1,
ICAM-3, integrina beta1, integrina beta2, integrina
alfa4/beta7, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa 4,
integrina alfa 5, integrina alfa6, integrina alfav, alfaVbeta3
integrina, FGFR-3, factor de crecimiento de los
queratinocitos, VLA-1, VLA-4,
L-selectina, anti-Id,
E-selectina, HLA, HLA-DR,
CTLA-4, receptor de células T, B7-1,
B7-2, VNRintegrina, TGFbeta1, TGFbeta2, eotaxina 1,
BLyS (estimulador de los linfocitos B), complemento C5, IgE, factor
VII, CD64, CBL, NCA, 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu
(ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4
(Erb-84), factor tisular, VEGF, VEGFR, receptores de
endotelina, VLA-4, hidratos de carbono como por
ejemplo antígenos del grupo sanguíneo e hidratos de carbono
relacionados, glicosilación Galili, gastrina, receptores de
gastrina, hidratos de carbono asociados a un tumor, hapteno
NP-cap ó NIP-cap, receptor de
células T alfa/beta, selectina E, dioxina, fosfatasa alcalina de
placenta (FLAP) y fosfatasa alcalina tipo PLAP testicular, receptor
de transferrina, heparanasa I, miosina cardíaca humana,
glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), glicoproteína de la cubierta gH
del citomegalovirus humano (HCMV), HIV gp 120, HCMV, virus
sincicitial respiratorio RSV F, RSVF Fgp, VNRintegrina, Hep B gp120,
CMV, gpIIbIIIa, bucle HIV IIIB gp 120 V3, virus sincitial
respiratorio (RSV)Fgp, glicoproteína gD del virus del Herpes
simplex (HSV), glicoproteína gB del HSV, glicoproteínas de la
cubierta del HCMV gB, toxina del Clostridium perfringens, y
fragmentos de los mismos.
5. Método de acuerdo con la reivindicación 3, en
donde dicha inmunoglobulina modificada tiene especificidad de unión
al FcRn.
6. Método de acuerdo con la reivindicación 3, en
donde dicha inmunoglobulina modificada tiene especificidad de unión
a una molécula efectora.
7. Método para la producción de una
inmunoglobulina o una preparación farmacéutica de la misma mediante
ingeniería de una inmunoglobulina modificada por un método de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque
- la inmunoglobulina modificada se acaba en una
preparación farmacéutica.
8. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque, dicha
inmunoglobulina es una unión multiespecífica, específicamente a por
lo menos una primera molécula y por lo menos una segunda molécula a
través de por lo menos una modificación en por lo menos una región
de bucle estructural de dicha inmunoglobulina la cual segunda
molécula se selecciona del grupo formado por, alérgenos, antígenos
asociados a un tumor, autoantígenos, enzimas, antígenos bacterianos,
antígenos fúngicos, antígenos víricos y antígenos protozoarios.
9. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque, las
inmunoglobulinas comprenden una cadena pesada y/o una cadena ligera
de la inmunoglobulina o una parte de la misma.
10. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque, la
inmunoglobulina comprende por lo menos uno de un dominio constante
y/o por lo menos un dominio variable de la inmunoglobulina.
11. Método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque, la
inmunoglobulina comprende por lo menos uno de un dominio simple o
parte del mismo, incluyendo un minidominio que consiste en dos
hebras beta de un dominio de inmunoglobulina conectado por un bucle
estructural, un dominio simple de inmunoglobulina variable, o una
cadena simple Fv.
12. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque, la
inmunoglobulina contiene un dominio constante seleccionado del grupo
formado por CH1, CH2, CH3, CH4, CL, y combinaciones de los mismos,
incluyendo un fragmento Fab, un fragmento Fc, o la inmunoglobulina
en toda su longitud.
13. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque, la
inmunoglobulina contiene cualquiera de la Ig-kappa ó
Ig-landa.
14. Métodos de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque, la
inmunoglobulina comprende cualquiera de las regiones bucle de CH1,
CH2, CH3 ó CH4, que comprende una modificación en una de las
posiciones no ácida dentro de la secuencia de aminoácidos
seleccionados del grupo formado por los aminoácidos 7 a 21,
aminoácidos 25 a 39, aminoácidos 41 a 81, aminoácidos 83 a 85,
aminoácidos 89 a 103 y aminoácidos 106 a 117, en donde la numeración
está de acuerdo con la IMGT.
15. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque, la
inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana, humanizada o
quimérica.
16. Métodos de acuerdo con la reivindicación 14,
caracterizados porque, la inmunoglobulina comprende una
cualquiera de las regiones bucle de Ig-kappa ó
Ig-landa, que comprende unas modificaciones en una
de las posiciones de aminoácidos, dentro de la secuencia de
aminoácidos seleccionados del grupo formado por los aminoácidos 8 a
18, aminoácidos 27 a 35, aminoácidos 42 a 70, aminoácidos 83 a 85,
aminoácidos 92 a 100, aminoácidos 108 a 117, y aminoácidos 123 a
126, en donde la numeración está de acuerdo con la IMGT.
17. Método de acuerdo con la reivindicación 15 ó
16 caracterizado porque, la inmunoglobulina contiene
cualquiera de las regiones bucle estructurales de un dominio
variable que comprende una modificación fuera de las posiciones de
los aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo formado por, los aminoácidos 8 a 20, los aminoácidos 44 a
50, los aminoácidos 67 a 76, y los aminoácidos 89 a 101, en donde la
numeración está de acuerdo con la IMGT.
18. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque, la
inmunoglobulina se ha seleccionado del grupo formado por, IgA1,
IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y IgM.
19. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque, la
inmunoglobulina es de origen ratón.
20. Método de acuerdo con la reivindicación 19,
caracterizado porque, la inmunoglobulina es una
inmunoglobulina de ratón seleccionada del grupo formado por IgA,
IgD, IgE, IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3, e IgM.
21. Método de acuerdo con la reivindicación 19 ó
20, caracterizado porque, la inmunoglobulina comprende una
cualquiera de las regiones bucle de Ig-kappa ó
Ig-landa, que comprende una modificación en una de
las posiciones de aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo formado por los aminoácidos 8 a 20,
aminoácidos 26 a 36, aminoácidos 43 a 79, aminoácidos 83 a 85,
aminoácidos 90 a 101, aminoácidos 108 a 116 y aminoácidos 122 a 125,
en donde la numeración está de acuerdo con la IMGT.
22. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque, la
inmunoglobulina comprende una cualquiera de las regiones bucle
estructurales de un dominio variable, que comprende unas
modificaciones en una de las posiciones de los aminoácidos dentro de
la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por los
aminoácidos 6 a 20, aminoácidos 44 a 52, aminoácidos 67 a 76 y
aminoácidos 92 a 101, en donde la numeración está de acuerdo con la
IMGT.
23. Método de acuerdo con una cualquiera de la
reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque, la
inmunoglobulina se selecciona del grupo formado por un fragmento de
Fab, un fragmento Fc, un dominio simple de inmunoglobulina, un
dímero CH3 de cadena sencilla (scCH3), scCH2, scCH1/CL y una
inmunoglobulina completa.
24. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque, dicha
modificación da por resultado la sustitución de un nucleótido y/o
una deleción y/o una inserción.
25. Método de acuerdo con una cualquiera de la
reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque, la secuencia
de nucleótidos de por lo menos una región bucle, está modificada por
una mutación dirigida al sitio y una mutación al azar y una mutación
semi al azar.
26. Método de acuerdo con la reivindicación 25,
caracterizado porque, dicha secuencia de nucleótidos
modificada comprende por lo menos una unidad de repetición de
nucleótidos, que tiene la secuencia
5'-NNS-3',
5'-MNN-3' ó
5'-NNK-3'.
27. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque, el sistema de
expresión comprende un vector.
28. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque, la
inmunoglobulina modificada se expresa en un anfitrión, de
preferencia en un anfitrión bacteriano, una levadura, una célula
vegetal, en una célula animal, o en un vegetal o animal.
29. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 28, caracterizado porque, la unión
específica de la inmunoglobulina modificada a la molécula, se
determina mediante un ensayo de unión seleccionado del grupo formado
por los ensayos inmunológicos, de preferencia el ensayo
inmunosorbente ligado a una enzima (ELISA), ensayos de resonancia
del plasmón de superficie, espectroscopia de resonancia magnética
nuclear por diferencia de transferencia de saturación,
espectroscopia de resonancia magnética nuclear por transferencia NOE
(trNOE), ensayos competitivos, ensayos de unión a tejidos, ensayos
de unión a células vivas, y ensayos de extractos celulares.
30. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque, la
inmunoglobulina modificada está conjugada a un marcador
seleccionado del grupo formado por moléculas orgánicas, marcadores
enzimáticos, marcadores radiactivos, marcadores coloreados,
marcadores fluorescentes, marcadores cromogénicos, marcadores
luminiscentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complejos metálicos,
metales, oro coloidal y mezclas de los mismos.
31. Método para prolongar la
semi-vida in vivo de una molécula mediante la
incorporación de una inmunoglobulina modificada de acuerdo con la
reivindicación 5.
32. Método para la producción de una molécula
con funciones efectoras mediante la incorporación de una
inmunoglobulina modificada de acuerdo con la reivindicación 6.
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