ES2327693T3 - Composiciones que comprenden el adyvante qs-21 y polisorbato o ciclodextrina excipiente. - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende a) un antígeno o un ácido nucleico que codifica un antígeno peptídico o un antígeno proteico, b) un adyuvante de saponina, y c) una a-ciclodextrina.

Description

Composiciones que comprenden el adyuvante QS-21 y polisorbato o ciclodextrina como excipiente.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los adyuvantes inmunológicos y a su uso como adyuvantes inmunológicos en vacunas. Las composiciones de la presente invención muestran unas propiedades significativamente mejoradas con respecto al efecto lítico, la tolerancia al dolor asociado a QS-21 y la estabilidad de un producto de QS-21, y mantienen una actividad adyuvante completa.

Antecedentes de la invención

Se han identificado y purificado saponinas adyuvantes a partir de un extracto acuoso de la corteza del árbol sudamericano Quillaja saponaria Molina. Entre los 22 picos que son separables y que muestran actividad saponina, la QS-21 es una de las saponinas purificadas más predominantes. Esta saponina se ha purificado sustancialmente mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía en sílice líquida de baja presión y cromatografía interactiva hidrófila (HILIC). Se ha descubierto que la QS-21 es útil como adyuvante inmunológico para potenciar respuestas inmunológicas en individuos a una concentración mucho más baja que la de las preparaciones de saponina heterogéneas previamente disponibles, sin los efectos tóxicos asociados con preparaciones de saponina
brutas.

La QS-21 es una saponina triterpenoide glicosídica de lisis de membrana. Forma micelas de aproximadamente el mismo radio que la albúmina de suero bovina (Kensil, patente de EEUU nº 5.057.540) y tiene una concentración micelar crítica de aproximadamente 50 \mug/ml en PBS (Soltysik, S., et al., 1995, Vaccine, 13:1403-1410).

La potencia de una formulación adyuvante que contiene un antígeno más QS-21 puede evaluarse en experimentos que abordan la relación entre la dosis de adyuvante y la función inmunológica (experimentos de dosis-respuesta). Se espera que una disminución en la potencia del adyuvante aumente la dosis mínima (dosis umbral) requerida para la potenciación de la respuesta inmunológica. Se espera que una composición deseable mantenga una potencia mejor o equivalente a la de la formulación que se utiliza como referencia. Para la QS-21, la formulación de referencia es una sencilla disolución en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) o disolución salina.

La actividad adyuvante de QS-21 se evalúa en modelos animales, como ratones. Las principales respuestas medidas son los aumentos en los anticuerpos específicos de antígenos y de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígenos. Se ha medido la dosis umbral de QS-21 que potencia una respuesta inmunológica murina (anticuerpos o CTL) en una disolución tampón sencilla, como PBS. Se ha demostrado que una dosis de 2,5 \mug es la dosis umbral para los anticuerpos (Kensil, C.R., et al., 1993, Vaccine Research, 2:273-281) y para CTL (Newman, M.J., et al., 1992, J. Immunology, 148:2357-2362) contra el antígeno ovoalbúmina (OVA) en ratones C57BL/6 en PBS. Se han observado dosis umbral similares cuando se incluye hidróxido de aluminio en la formulación de PBS (Kensil, C.R., et al., 1993, Vaccine Research, 2:273-281). Sin embargo, se espera que existan diferencias entre la potencia de las diferentes composiciones de un adyuvante concreto.

A pesar de estas cualidades beneficiosas, la QS-21 también posee algunas cualidades desagradables. Por ejemplo, la QS-21 se asocia con bicapas fosfolipídicas y provoca un efecto lítico en ciertas membranas celulares (es decir, eritrocitos). La QS-21 se absorbe sobre la bicapa fosfolipídica de eritrocitos de oveja y provoca que los eritrocitos liberen hemoglobina. Esta liberación de hemoglobina, que es conocida como hemolisis, se produce a una concentración de aproximadamente 5-7 \mug/ml en una tampón sencillo, como disolución salina o PBS (Kensil, C.R., et al., 1991, J. Immunology, 146:431-437). A concentraciones mayores (por encima de la concentración micelar crítica de la QS-21) se produce la lisis total de la membrana de los eritrocitos. Por tanto, el efecto lítico de la QS-21 es una propiedad indeseable para una composición.

En estudios in vivo no se ha advertido hemolisis. Sin embargo, después de la inyección intramuscular de disoluciones de QS-21/disolución salina a conejos blancos de Nueva Zelanda se advierte una necrosis o unos daños en fibroblastos de suaves a moderados en algunos animales cuando el sitio de inyección se analiza histopatológicamente (Kensil, C.R., et al., 1995, en: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell, M.F. y Newman, M.J., eds., Plenum Press, NY). Además, la creatina quinasa, un marcador de daños musculares, aumenta después de una inyección de QS-21 en disolución salina o PBS. Se cree que este aumento es debido al efecto lítico de la QS-21 sobre las membranas celulares.

Además, en ensayos clínicos, algunos individuos han experimentado un dolor inmediato y transitorio después de la inyección de QS-21 en disoluciones tampón sencillas (disolución salina o PBS). Este dolor, descrito por la mayoría de los individuos como un dolor ardiente, puede ser una reacción secundaria correlacionada con el efecto lítico del adyuvante QS-21. Asimismo, el dolor del paciente es una propiedad desagradable para una composición.

La estabilidad del producto es otro problema en las composiciones que contienen QS-21. La caducidad de un producto de vacuna se define, de forma típica, como la extensión de tiempo hasta alcanzar un bajo nivel de degradación definido y aceptable (como el tiempo hasta 10% de degradación, también conocido como t_{90}). La mayoría de los productos de vacuna comerciales tienen una caducidad de al menos 18 a 24 meses cuando se conservan en la nevera a 4ºC. Por tanto los adyuvantes, que son componentes esenciales de las vacunas, también deben tener una caducidad igualmente alta. Sin embargo, la caducidad de una disolución 50 \mug/ml de QS-21 a pH 7,0 a 4ºC se alcanza en aproximadamente 3 meses. La razón para esta menor caducidad es porque el enlace éster de QS-21 es cada vez más lábil a medida que aumenta el pH, y porque los monómeros de QS-21, en oposición a las micelas, son sometidos a hidrólisis. La necesidad de estabilizar composiciones del adyuvante QS-21 es significativa.

La patente de EEUU nº 5.650.398 se refiere a composiciones que comprenden saponinas modificadas que no tienen sustancialmente actividad adyuvante o irritabilidad pero que mantienen el suficiente efecto lítico para el transporte de fármacos. El documento JP 06 343419 se refiere a composiciones alimentarias para evitar la obesidad que comprenden una saponina, ácido \gamma-linoleico y \alpha-ciclodextrina. El documento WO 91/04052 se refiere a composiciones de vacuna sólidas que comprenden un antígeno, una saponina y un adyuvante policatiónico, como DEAE-dextrano. El documento EP 0187286 se refiere a vacunas que comprenden un antígeno, una saponina y aceite. La patente de EEUU nº 4.806.350 se refiere a vacunas que comprenden un antígeno y dos adyuvantes, como una saponina y aceite. El documento GB 1083815 se refiere a vacunas que comprenden una preparación de antígenos de origen protozoario junto con una preparación de saponina.

Sumario de la invención

Son necesarias composiciones del adyuvante de saponina QS-21 que puedan utilizarse para potenciar una respuesta inmunológica antigénica a una dosis relativamente baja con bajas reacciones locales y efectos secundarios, pero que también incluyan un reducido efecto lítico, una mejor tolerancia a la QS-21 y una mayor estabilidad. Por consiguiente, la presente invención proporciona nuevas composiciones de QS-21 que tienen estas características mejoradas, comparadas con un disolución sencilla de QS-21 en un tampón como disolución salina o PBS. De forma sorprendente, la potencia adyuvante total de la QS-21 en las composiciones descritas no está comprometida, comparado con una formulación control de QS-21 en PBS.

Descripción de las figuras

La figura 1 ofrece un gráfico que muestra la potencia adyuvante de diversas composiciones. La figura 1A muestra el efecto del polisorbato 40, polisorbato 60 y polisorbato 80 en la respuesta inmunológica de ratones Balb/c frente a la ovoalbúmina a diferentes concentraciones de QS-21. La figura 1B muestra el efecto de la metil-\beta-ciclodextrina sobre la respuesta inmunológica de ratones Balb/c frente a la ovoalbúmina a diferentes concentraciones de QS-21.

La figura 2 ofrece un gráfico que muestra el efecto del polisorbato 80 y la hidroxipropil-\beta-ciclodextrina en la respuesta de anticuerpos IgG3 de tipo 14 a un antígeno de polisacárido independiente de T.

La figura 3 muestra una gráfica de barras de la tolerancia al dolor de pacientes para diversos excipientes en composiciones adyuvantes de QS-21 del ensayo 1. Esta figura muestra la puntuación del dolor, clasificado como sin dolor, dolor suave, dolor moderado o dolor fuerte, siendo 0 = sin dolor, 1,3 = dolor suave, 4-7 = dolor moderado y 8-10 = dolor fuerte.

La figura 4 muestra las puntuaciones individuales de la tolerancia al dolor de pacientes en la figura 3. Esta figura muestra las puntuaciones del dolor inmediato individuales tras la inyección de una formulación concreta, en una escala de 0-10, siendo 0 sin dolor y 10 es el máximo dolor.

La figura 5 muestra una gráfica de barras de la tolerancia al dolor de pacientes para diversos excipientes en composiciones adyuvantes de QS-21 del ensayo 2. Esta figura muestra la puntuación del dolor, clasificado como sin dolor, dolor suave, dolor moderado o dolor fuerte, siendo 0 = sin dolor, 1,3 = dolor suave, 4-7 = dolor moderado y 8-10 = dolor fuerte.

La figura 6 muestra las puntuaciones individuales de la tolerancia al dolor de pacientes en la figura 5. Esta figura muestra las puntuaciones del dolor inmediato individuales tras la inyección de una formulación concreta, en una escala de 0-10, siendo 0 sin dolor y 10 es el máximo dolor. Debajo de cada formulación se listan la media y la mediana de las puntuaciones para cada formulación.

Descripción de las realizaciones preferidas

La presente invención se refiere a una composición que comprende un antígeno o un ácido nucleico que codifica un antígeno peptídico o un antígeno proteico, un adyuvante de saponina y una \beta-ciclodextrina.

Las saponinas de la presente invención pueden obtenerse a partir del árbol Quillaja saponaria Molina.

El término "saponina", tal como se emplea en la presente, incluye compuestos triterpenoides glicosídicos que producen espuma en una disolución acuosa, que tienen actividad hemolítica en la mayoría de los casoso y que poseen actividad adyuvante inmunológica. La invención incluyen las propias saponinas así como sus fragmentos biológicamente activos.

La invención también incluye composiciones, tales como composiciones inmunológicas, que comprenden una o más fracciones de saponinas sustancialmente puras, y métodos para utilizar estas composiciones como adyuvantes inmunológicos.

Más en concreto, las composiciones de la presente invención pueden reducir los efectos líticos in vitro de una formulación que contiene el adyuvante de saponina. Otra composición preferida es aquella que puede mantener la máxima actividad adyuvante de una saponina. Otra composición preferida puede aumentar la estabilidad de una composición que contiene un adyuvante de saponina frente a la hidrólisis alcalina. Otras composiciones pueden mejorar, preferiblemente, la tolerancia de un individuo al dolor asociado a un adyuvante de saponina contenido en una formulación que contiene un adyuvante de saponina.

Como se describe en Kensil, et al., patente de EEUU nº 5.057.540, la actividad adyuvante de estas saponinas puede determinarse mediante uno cualquiera de una serie de métodos conocidos por los expertos en la técnica. El aumento en la valoración de anticuerpos contra un antígeno concreto tras la administración de un adyuvante puede utilizarse como criterio de la actividad adyuvante (Dalsgaard, Acta Verterinia Scandinavica, 69:1 (1987); Bomford, Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 77:409 (1985)). Brevemente, este ensayo implica inyectar por vía intravenosa a ratones CD-1 un antígeno (por ejemplo, albúmina de suero bovina, BSA) mezclado con cantidades variables del adyuvante potencial. El suero se recoge de los ratones dos semanas después y se ensaya mediante ELISA para determinar los anticuerpos anti-BSA.

"QS-21" indica la mezcla de los componentes isómeros QS-21-V1 y QS-21-V2 que aparecen como un único pico en una HPLC en fase inversa sobre Vydac C4 (tamaño de partícula 5 \mum, poro 300 \ring{A}, DI 4,6 mm x L 25 cm) en ácido acético 40 mM en metanol/agua (58/42, v/v). Las fracciones de los componentes se indican específicamente como QS-21-V1 y QS-21-V2 cuando se describen experimentos realizados sobre los componentes después purificados.

La expresión "sustancialmente puro" significa sustancialmente exento de los compuestos que normalmente aparecen asociados con la saponina en su estado natural y que muestran una respuesta cromatográfica, unos perfiles de elución y una actividad biológica constantes y reproducibles. La expresión "sustancialmente puro" no pretende excluir las mezclas artificiales o sintéticas de la saponina con otros compuestos.

La saponina QS-7 sustancialmente pura, también denominada QA-7 en la patente de EEUU nº 5.057.540, se caracteriza porque tiene actividad adyuvante inmunológica, contiene aproximadamente 35% de carbohidratos (según se ensaya con antrona) por peso seco, tiene una absorción UV máxima de 205-210 nm, un tiempo de retención de aproximadamente 9-10 minutos en una RP-HPLC sobre una columna Vydac C_{4} que tiene un tamaño de partícula de 5 \mum, un poro de 300 \ring{A}, DI 4,6 mm x L 25 cm en un disolvente de ácido acético 40 mM en metanol/agua (58/42, v/v) con un caudal de 1 ml/min, eluyendo con metanol al 52-53% de una columna Vydac C_{4} que tiene un tamaño de partícula de 5 \mum, un poro de 300 \ring{A}, DI 10 mm x L 25 cm en un disolvente de ácido acético 40 mM con un gradiente de elución de metanol del 50% al 80%, tiene una concentración micelar crítica de aproximadamente 0,06% (p/v) en agua y 0,07% (p/v) en disolución salina tamponada con fosfato, no produce hemolisis detectable en eritrocitos de oveja a concentraciones de 200 \mug/ml o menores, y contiene los restos monosacárido ramnosa terminal, xilosa terminal, glucosa terminal, galactosa terminal, 3-xilosa, 3,4-ramnosa, 2,3-fucosa y ácido 2,3-glucurónico, y apiosa (el enlace no está determinado).

La saponina QS-17 sustancialmente pura, también denominada QA-17 en la patente de EEUU nº 5.057.540, se caracteriza porque tiene actividad adyuvante inmunológica, contiene aproximadamente 29% de carbohidratos (según se ensaya con antrona) por peso seco, tiene una absorción UV máxima de 205-210 nm, un tiempo de retención de aproximadamente 35 minutos en una RP-HPLC sobre una columna Vydac C_{4} que tiene un tamaño de partícula de 5 \mum, un poro de 300 \ring{A}, DI 4,6 mm x L 25 cm en un disolvente de ácido acético 40 mM en metanol/agua (58/42, v/v) con un caudal de 1 ml/min, eluyendo con metanol al 63-64% de una columna Vydac C_{4} que tiene un tamaño de partícula de 5 \mum, un poro de 300 \ring{A}, DI 10 mm x L 25 cm en un disolvente de ácido acético 40 mM con un gradiente de elución de metanol del 50% al 80%, tiene una concentración micelar crítica de aproximadamente 0,06% (p/v) en agua y 0,03% (p/v) en disolución salina tamponada con fosfato, produce hemolisis de eritrocitos de oveja a 200 \mug/ml o mayor, y contiene los restos monosacárido ramnosa terminal, xilosa terminal, 2-fucosa, se caracteriza porque tiene actividad adyuvante inmunológica, contiene aproximadamente 35% de carbohidratos (según se ensaya con antrona) por peso seco, tiene una absorción UV máxima de 205-210 nm, un tiempo de retención de aproximadamente 9-10 minutos en una RP-HPLC sobre una columna Vydac C_{4} que tiene un tamaño de partícula de 5 \mum, un poro de 300 \ring{A}, DI 4,6 mm x L 25 cm en un disolvente de ácido acético 40 mM en metanol/agua (58/42, v/v) con un caudal de 1 ml/min, eluyendo con metanol al 52-53% de una columna Vydac C_{4} que tiene un tamaño de partícula de 5 \mum, un poro de 300 \ring{A}, DI 10 mm x L 25 cm en un disolvente de ácido acético 40 mM con un gradiente de elución de metanol del 50% al 80%, tiene una concentración micelar crítica de aproximadamente 0,06% en agua y 0,07% en disolución salina tamponada con fosfato, no produce hemolisis detectable en eritrocitos de oveja a concentraciones de 200 \mug/ml o menores, y contiene los restos monosacárido ramnosa terminal, xilosa terminal, 2-fucosa, 3-xilosa, 3,4-ramnosa, ácido 2,3-glucurónico, glucosa terminal, 2-arabinosa, galactosa terminal, y apiosa (el enlace no está determinado).

La saponina QS-18 sustancialmente pura, también denominada QA-18 en la patente de EEUU nº 5.057.540, se caracteriza porque tiene actividad adyuvante inmunológica, contiene aproximadamente 25-26% de carbohidratos (según se ensaya con antrona) por peso seco, tiene una absorción UV máxima de 205-210 nm, un tiempo de retención de aproximadamente 38 minutos en una RP-HPLC sobre una columna Vydac C_{4} que tiene un tamaño de partícula de 5 \mum, un poro de 300 \ring{A}, DI 4,6 mm x L 25 cm en un disolvente de ácido acético 40 mM en metanol/agua (58/42, v/v) con un caudal de 1 ml/min, eluyendo con metanol al 64-65% de una columna Vydac C_{4} que tiene un tamaño de partícula de 5 \mum, un poro de 300 \ring{A}, DI 10 mm x L 25 cm en un disolvente de ácido acético 40 mM con un gradiente de elución de metanol del 50% al 80%, tiene una concentración micelar crítica de aproximadamente 0,04% (p/v) en agua y 0,02% (p/v) en disolución salina tamponada con fosfato, produce hemolisis de eritrocitos de oveja a 25 \mug/ml o mayor, y contiene los restos monosacárido arabinosa terminal, apiosa terminal, xilosa terminal, glucosa terminal, galactosa terminal, 2-fucosa, 3-xilosa, 3,4-ramnosa, y ácido 2,3-glucurónico.

La saponina QS-21 sustancialmente pura, también denominada QA-21 en la patente de EEUU nº 5.057.540, se caracteriza porque tiene actividad adyuvante inmunológica, contiene aproximadamente 22% de carbohidratos (según se ensaya con antrona) por peso seco, tiene una absorción UV máxima de 205-210 nm, un tiempo de retención de aproximadamente 51 minutos en una RP-HPLC sobre una columna Vydac C_{4} que tiene un tamaño de partícula de 5 \mum, un poro de 300 \ring{A}, DI 4,6 mm x L 25 cm en un disolvente de ácido acético 40 mM en metanol/agua (58/42, v/v) con un caudal de 1 ml/min, eluyendo con metanol al 69-70% de una columna Vydac C_{4} que tiene un tamaño de partícula de 5 \mum, un poro de 300 \ring{A}, DI 10 mm x L 25 cm en un disolvente de ácido acético 40 mM con un gradiente de elución de metanol del 50% al 80%, tiene una concentración micelar crítica de aproximadamente 0,03% (p/v) en agua y 0,02% (p/v) en disolución salina tamponada con fosfato, produce hemolisis de eritrocitos de oveja a 25 \mug/ml o mayor. Las fracciones de los componentes, las saponinas QS-21-V1 y QS-21-V2 sustancialmente puras, tiene el mismo peso molecular e idénticos espectros mediante FAB-MS. Sólo se diferencian en que la QS-21-V1 tiene una apiosa terminal, que es xilosa en QS-21-V2 (que, por tanto, tiene dos xilosas terminales y no tiene apiosa). Los dos componentes contienen también los restos monosacárido arabinosa terminal, apiosa terminal, xilosa terminal, 4-ramnosa, galactosa terminal, 2-fucosa, 3-xilosa, y ácido 2,3-glucurónico.

En una realización preferida, el adyuvante es QS-21.

La invención también incluye formas impuras de los adyuvantes de saponina. Por ejemplo, una realización preferida es el adyuvante de saponina heterogéneo conocido como "Quil A". Las preparaciones comerciales de Quil A están disponibles como Superfos (Vedbaek, Dinamarca) y se han aislado a partir de la corteza del árbol sudamericano Quillaja saponaria Molina. Quil A se caracteriza químicamente como restos carbohidrato con enlace glicosídico al triterpenoide ácido quilaico. Quil A posee actividad adyuvante inmunológica y se separa en 20 picos discretos mediante una RP-HPLC sobre una columna Vydac C_{4} que tiene un tamaño de partícula de 5 \mum, un poro de 300 \ring{A}, DI 4,6 mm x L 25 cm en un disolvente de ácido acético 40 mM en metanol/agua (patente de EEUU nº 5.057.540).

Una \beta-ciclodextrina preferida es una hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, que reduce la lisis de eritrocitos por QS-21 in vitro.

La expresión "adyuvante inmunológico", tal como se emplea en la presente, se refiere a compuestos que cuando se administran a un individuo o se ensayan in vitro aumentan la respuesta inmunológica a un antígeno en el individuo o el sistema de ensayo al cual se administra dicho antígeno. Preferiblemente, estos individuos son seres humanos, aunque la invención no pretende ser tan limitante. Cualquier animal que pueda experimentar los efectos beneficiosos de las vacunas de la invención está dentro del alcance de los animales que pueden tratarse según la invención reivindicada. Algunos antígenos son muy poco inmunogénicos cuando se administran por sí solos o son tóxicos para el individuo cuando provocan respuestas inmunológicas en dicho individuo. Un adyuvante inmunológico puede potenciar la respuesta inmunológica del individuo al antígeno haciendo que el antígeno sea mucho más inmunogénico. El efecto adyuvante también puede disminuir la dosis de dicho antígeno necesaria para lograr una respuesta inmunológica en dicho individuo.

Las saponinas de la presente invención pueden utilizarse para potenciar la respuesta inmunológica a cualquier antígeno. Los antígenos típicos adecuados para las composiciones de la presente invención que provocan una respuesta inmunológica incluyen antígenos derivados de uno cualquiera de los siguientes: virus, como el virus de la gripe, el virus de la leucemia felina, el virus de la inmunodeficiencia felina, VIH-1, VIH-2, el virus de la rabia, el virus del sarampión, el virus de la hepatitis B, o el virus de la enfermedad de pezuña y boca; bacterias, como la bacteria del ántrax, la difteria, la enfermedad de Lyme o la tuberculosis; o protozoos, como Babeosis bovis o Plasmodium. Los antígenos pueden ser proteínas, péptidos, polisacáridos, lípidos o ácidos nucleicos que codifiquen la proteína o el péptido. Las proteínas, los péptidos, los lípidos o los ácidos nucleicos pueden purificarse a partir de una fuente natural, pueden sintetizarse mediante una síntesis en fase sólida, o pueden obtenerse mediante la genética
recombinante.

La administración de los compuestos útiles en el método de la presente invención puede ser por vía parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intranasal, oral o cualquier otro medio adecuado. La dosificación administrada puede depender de la edad, el peso, la especie, el tipo de tratamiento concurrente, si existe, la vía de administración y la naturaleza del antígeno administrado. En general, la saponina y el antígeno pueden administrarse a una dosificación de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1,0 mg/kg de adyuvante de saponina o antígeno por peso del individuo. Tras la dosis inicial se puede administrar una dosificación de refuerzo después de un periodo de aproximadamente cuatro semanas para potenciar la respuesta inmunogénica. También pueden administrarse más dosificaciones de refuerzo.

El compuesto eficaz útil en el método de la presente invención puede emplearse en formas como cápsulas, disoluciones, suspensiones o elixires líquidos para la administración oral, o en formas líquidas estériles, como disoluciones o suspensiones. La vacuna de la presente invención puede administrarse por vía parenteral, intranasal u oral.

Otra realización preferida es un método para reducir el efecto lítico in vitro de una composición adyuvante inmunológica, que comprende administrar a un individuo una cantidad eficaz de QS-21 y una \beta-ciclodextrina. Una \beta-ciclodextrina preferida es la encapsina, una hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, que reduce la lisis de eritrocitos por QS-21 in vitro.

Otros métodos preferidos dentro del alcance de la invención incluyen un método para mantener la máxima actividad adyuvante de la QS-21, que comprende administrar a un individuo una cantidad eficaz de QS-21 y una \beta-ciclodextrina, y un método para mejorar la tolerancia al dolor asociado con el adyuvante de saponina en un individuo al cual se le administra, que comprende administrar una cantidad eficaz de QS-21 y una \beta-ciclodextrina.

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Ejemplos

Se evaluó una diversidad de excipientes en combinación con QS-21 como nuevas composiciones. Éstos incluyen diversos tensioactivos no iónicos (Triton X-100, polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60 y polisorbato 80), polivinilpirrolidona (Plasdone C15), albúmina de suero humana, hidróxido de aluminio, agentes con acción anestésica (alcohol bencílico) y diversas ciclodextrinas no modificadas y derivatizadas (hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, hidroxipropil-\gamma-ciclodextrina, metil-\beta-ciclodextrina). Se evaluaron las formulaciones finales para determinar su capacidad para reducir el efecto lítico de la QS-21, para mejorar la tolerancia al dolor asociado al adyuvante QS-21 en seres humanos, para estabilizar la QS-21 en una disolución acuosa y/o para mantener la máxima potencia adyuvante con relación a una formulación control de QS-21 en PBS.

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Ejemplo 1

Composiciones que reducen el efecto lítico de QS-21

Se empleó un sencillo ensayo in vitro para seleccionar excipientes para reducir el efecto lítico de la QS-21. El efecto lítico de la QS-21 puede determinarse en un ensayo de hemolisis de eritrocitos de oveja. Brevemente, se preparan diversas diluciones en dos veces de QS-21 en un excipiente concreto en una placa de microvaloración de fondo redondo (100 \mul/pocillo). Todas las placas contenían pocillos control que contienen excipiente pero no QS-21. La concentración de QS-21 varía de 1,56 a 200 \mug/ml. Se añade un volumen total de 25 \mul de eritrocitos de oveja (lavados con PBS) a cada pocillo, se mezcla con la disolución de QS-21/excipiente, y se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Al final de la incubación, la placa de fondo redondo se centrífuga a 2000 rpm durante 5 minutos para sedimentar las células que no se han lisado. Se traslada un volumen total de 75 \mul del sobrenadante (que contiene la hemoglobina liberada) al pocillo equivalente de una placa de 96 pocillos de fondo plano. La placa de fondo plano se centrífuga a 2000 rpm durante 5 minutos para romper las burbujas de aire. Se hace una lectura de la absorbancia a 570 nm en un lector de placas de microvaloración. La absorbancia a 570 nm se representa gráficamente en el eje de ordenadas frente a la concentración de QS-21 en el eje de abscisas. La absorbancia de la hemoglobina en el sobrenadante de un pocillo en que no se observó un sedimento de células intactas se define como la hemólisis máxima. El índice hemolítico de QS-21 se define como la concentración de QS-21 que produce una absorbancia equivalente a 50% de la máxima absorbancia. Se espera que un excipiente que reduzca el efecto lítico de QS-21 aumente el índice hemolítico.

La tabla 1 lista los índices hemolíticos de QS-21 en diversos excipientes. Todos los excipientes se ensayaron en ausencia de QS-21. En ausencia de QS-21 no se advirtió hemolisis, lo cual indica que las formulaciones de excipientes eran isotónicas. Los excipientes que demostraron ser eficaces para minimizar el efecto lítico (aumento del índice hemolítico) de QS-21 fueron la hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, el hidróxido de aluminio y el polisorbato 80 en disolución salina.

TABLA 1

1

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Ejemplo 2

Composiciones que reducen los efectos líticos de otras saponinas

Se sabe que otros adyuvantes de saponina también son hemolíticos aunque en un grado diferente a la QS-21. Estas saponinas incluyen QS-7, QS-17 y QS-18 sustancialmente puras. Además, adyuvantes de saponina heterogéneos, como Quil A, también son hemolíticos. Un ejemplo del efecto del polisorbato 80 e hidroxipropil-\beta-ciclodextrina sobre los índices hemolíticos de la QS-7 sustancialmente pura y Quil A heterogénea se muestra en la tabla 2. Se demostró que la hidroxipropil-\beta-ciclodextrina era eficaz para reducir el efecto lítico (aumento del índice hemolítico) de la QS-7. Se demostró que el polisorbato 80 y la hidroxipropil-\beta-ciclodextrina eran eficaces para minimizar el efecto lítico (aumento del índice hemolítico) del Quil A.

TABLA 2

3

Ejemplo 3

Composiciones que estabilizan la QS-21

La QS-21 es una saponina triterpénica bidesmódica acilada. Tiene un éster de ácido graso unido a los restos hidroxilo de la fucosa. En una disolución acuosa, este éster de ácido graso migra entre dos grupos hidroxilo vecinales adyacentes (fucosa 3, 4) para formar dos isómeros de equilibrio (Jacobsen, N.E., Fairbrother, W.J., et al., 1996, Carbohydrate Research, 280:1-14). El isómero predominante está acilado en fucosa 4 y el isómero secundario está acilado en fucosa 3. Este enlace éster es el enlace más lábil de la QS-21 y se hidroliza en condiciones alcalinas para formar una saponina desacilada y un dominio de ácido graso-arabinosa. La saponina desacilada y el dominio de ácido graso son ambos inactivos como adyuvantes inmunológicos (Kensil, C.R., et al., 1996, en: Saponins Used in Traditional and Modern Medicine, Waller y Yamaski, eds., Plenum Press, NY. 165-172). Diversas condiciones afectan a la estabilidad de este enlace éster (Cleland, J.L., et al., 1996, J. Pharmaceutical Sciences, 85:22-28). Además, la forma monomérica de la QS-21 es más susceptible a la hidrólisis que la forma micelar.

Los ejemplos de caducidad de la QS-21 se muestran en la tabla 3. La caducidad acuosa para una disolución de QS-21 50 \mug/ml a pH 7,0 a 4ºC demostró ser sólo de 94 días o aproximadamente 3 meses. Esto es un ejemplo de una formulación de vacuna clínica típica que contiene el adyuvante QS-21 (que consiste en QS-21 a una concentración de 50-200 \mug/ml en un tampón a pH fisiológico (pH 7,0-7,5)). Por tanto, en tampones sencillos y disoluciones salinas a baja concentración, el producto de QS-21 no mantiene un perfil de estabilidad deseable. Sin embargo, puede lograrse alguna mejora en la estabilidad aumentando la concentración del producto de QS-21. Por ejemplo, la caducidad de una disolución de QS-21 500 \mug/ml a pH 7,0 a 4ºC demostró ser de 717 días o 23,9 meses. Pero una disolución concentrada de QS-21 no es necesariamente un método práctico de administrar una dosis pequeña de adyuvante. Por ejemplo, la administración de 25 \mug de una disolución 500 \mug/ml requeriría la retirada con jeringa de 0,05 ml de la dosis. Además, puede lograrse mejorar algo la estabilidad mediante el uso de un pH menor, es decir, a pH 6,0. Sin embargo, un pH sustancialmente menor que el intervalo de pH fisiológico puede no ser bien tolerado ni ser compatible con el antígeno.

TABLA 3

4

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Otra manera de evaluar la estabilidad de la QS-21 en una disolución acuosa es ensayar la disolución mediante HPLC en un ensayo de estabilidad acelerado a 37ºC. Aunque ésta no es la temperatura utilizada para la conservación de vacunas (4ºC), se espera que este ensayo a 37ºC demuestre el poder estabilizante relativo de un excipiente dado. Por ejemplo, se espera que un excipiente que extienda el valor de t_{90} en dos veces a 37ºC también extienda el valor de t_{90} en dos veces a 4ºC.

De manera específica, se preparó la QS-21 (100 \mug/ml) en diversos excipientes en PBS a pH 7,0. Las disoluciones se incubaron a 37ºC durante 7 días. Al final de los 7 días las disoluciones se ensayaron mediante HPLC en fase inversa para determinar el grado de degradación. Los datos se representaron gráficamente como log (fracción QS-21 t=7/QS-21 t=0 días) frente al tiempo en el eje de abscisas. El tiempo hasta una degradación de 10% (t_{90}) se extrapoló a partir de esta gráfica.

La tabla 4 muestra los valores de t_{90} de QS-21 en diversos excipientes. La estabilización de la QS-21 se muestra mediante un aumento en t_{90}. Los excipientes que estabilizan la QS-21 en al menos dos veces son polisorbato 20, polisorbato 80, la saponina QS-7 de Quillaja nativa, y la desacilsaponina que se produce por la hidrólisis alcalina de la QS-21 (DS-1).

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TABLA 4

5

Además se evaluó el alcohol bencílico al 0,9% y Plasdone C15 para determinar su capacidad para estabilizar QS-21 (tabla 5). Todas las concentraciones de QS-21 y las condiciones de incubación fueron equivalentes en este experimento excepto que la formulación de QS-21 se preparó en PBS de Dulbecco (sin calcio ni magnesio) a pH 7,5. Tal como se esperaba, el pH mayor produjo una degradación más rápida de la QS-21 en PBS. Sin embargo, el Plasdone C15 estabilizó la QS-21.

TABLA 5

7

Ejemplo 4

Potencia adyuvante de las composiciones

Las figuras 1A y 1B muestran el efecto del polisorbato 40, del polisorbato 60, del polisorbato 80 y de la metil-\beta-ciclodextrina sobre la respuesta inmunológica de ratones Balb/c frente a OVA más diversas dosis de QS-21. Ratones hembra (10/grupo, 8-10 semanas de edad en la primera inmunización) se inmunizaron por vía subcutánea con 5 \mug de OVA y la dosis indicada de QS-21 en PBS sólo o en excipiente 2 mg/ml en PBS. Se administró una dosis de refuerzo mediante la misma vía en la semana 2. Se recogió el suero en la semana 4 para un análisis EIA de la respuesta anti-OVA. Los ratones se analizaron para descubrir IgG2a específica de OVA mediante un análisis EIA convencional (Kensil, C.R., et al., 1993, Vaccine Research, 2:273-281). La QS-21 era activa en todos los excipientes dentro del valor umbral en dos veces determinado en PBS. Se alcanzó el mismo nivel máximo de respuesta de anticuerpos a la dosis óptima de adyuvante (de forma típica 10 \mug y superior).

La figura 2 muestra el efecto de los excipientes sobre la respuesta de anticuerpos contra un antígeno de polisacárido independiente de T. Ratones Balb/c se inmunizaron por vía subcutánea con una vacuna de polisacáridos de S. pneumonia 23-valente comercial (Pnu-Imune, 0,5 \mug/serotipo) y diferentes dosis de QS-21 en PBS, en 4 mg/ml de polisorbato 80 en PBS, o en hidroxipropil-\beta-ciclodextrina 16 mg/ml en PBS. Se determinó la anti-IgG de tipo 14 mediante EIA en el suero recogido en el día 7 después de una única inmunización. Ni el polisorbato 80 ni la hidroxipropil-\beta-ciclodextrina en la formulación redujeron la potencia de la vacuna para estimular una respuesta de IgG3 específica del serotipo de polisacáridos de tipo 14.

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Ejemplo 5

Estudios clínicos de composiciones - ensayo 1

Se administraron diversas composiciones de QS-21 a pacientes para ensayar la tolerancia al dolor de las composiciones. Se reclutaron quince voluntarios para recibir cuatro inyecciones intramusculares, administrándose cada inyección en intervalos de una semana. El estudio se realizó como un estudio doble ciego aleatorizado. Tres de las formulaciones contenían 50 \mug de QS-21 en PBS de Dulbecco (sin calcio ni magnesio), en polisorbato 80 4 mg/ml en PBS, o en hidróxido de aluminio 1 mg/ml en disolución salina. La cuarta formulación era un control de PBS sin QS-21. Se pidió a los voluntarios que puntuasen el dolor inmediato en los primeros cinco minutos después de la inyección sobre una escala de 0 a 10 (0 = sin dolor, 1-3 = dolor suave, 4-7 = dolor moderado, 8-10 = dolor fuerte). Los resultados se muestran en la figura 3. Las puntuaciones acumuladas representadas en la figura 3 de la tolerancia al dolor de los pacientes se representan en la figura 4 como puntuaciones individuales. La formulación de QS-21 que contenía polisorbato 80 4 mg/ml produjo una mejora en la tolerancia al dolor comparado con QS-21 en PBS. La puntuación mayor para esta formulación concreta se puntuó como 5.

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Ejemplo 6

Estudios clínicos de composiciones - ensayo 2

Se administraron diversas otras composiciones de QS-21 a pacientes para ensayar la tolerancia al dolor de las composiciones. Se reclutaron quince voluntarios para recibir cuatro inyecciones intramusculares, administrándose cada inyección en intervalos de una semana. El estudio se realizó como un estudio doble ciego aleatorizado. Los excipientes evaluados fueron alcohol bencílico, hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, y una dosis mayor de polisorbato 80 que ha demostrado ser más eficaz que polisorbato 80 4 mg/ml para reducir la lisis de eritrocitos por QS-21 in vitro. Las cinco formulaciones ensayadas eran (1) hidróxido de aluminio 1 mg/ml, que actúa como control placebo; (2) 50 \mug de QS-21 en alcohol bencílico al 0,72% en disolución salina; (3) 50 \mug de QS-21 en hidroxipropil-\beta-ciclodextrina 30 mg/ml (encapsina, Janssen Biotech N.V., Olen, Bélgica); (4) 50 \mug de QS-21 en polisorbato 80 8 mg/ml; y (5) 50 \mug de QS-21 en PBS (PBS de Dulbecco sin calcio ni magnesio), que actúa como una formulación de control positivo. Se pidió a los voluntarios que puntuasen el dolor inmediato en los primeros cinco minutos después de la inyección sobre una escala de 0 a 10 (0 = sin dolor, 1-3 = dolor suave, 4-7 = dolor moderado, 8-10 = dolor fuerte). Los resultados se muestran en la figura 5. Las puntuaciones acumuladas representadas en la figura 5 de la tolerancia al dolor de los pacientes se representan en la figura 6 como puntuaciones individuales. Se demostró que todos los excipientes reducían las puntuaciones de dolor media y mediana con QS-21 en PBS. La puntuación individual mayor para la formulación de QS-21/encapsina se puntuó como 5, superando a la formulación de QS-21/polisorbato 80, que fue puntuada con un 6 y con dos 5.

Claims (10)

1. Una composición que comprende a) un antígeno o un ácido nucleico que codifica un antígeno peptídico o un antígeno proteico, b) un adyuvante de saponina, y c) una \beta-ciclodextrina.

2. La composición según la reivindicación 1, en la que el adyuvante de saponina es un adyuvante de saponina sustancialmente puro.

3. La composición según la reivindicación 2, en la que el adyuvante de saponina sustancialmente puro es QS-7 o QS-21.

4. La composición según la reivindicación 1, en la que el adyuvante de saponina es Quil A.

5. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el antígeno es un péptido, una proteína, un polisacárido o un lípido.

6. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la \beta-ciclodextrina es la hidroxipropil-\beta-ciclodextrina.

7. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la \beta-ciclodextrina es la metil-\beta-ciclodextrina.

8. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso como medicamento.

9. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso para potenciar una respuesta inmunológica en un sujeto.

10. El uso según la reivindicación 9, en el que el sujeto es un ser humano.