ES2328687T3 - Metodo de producion de peptidos acilados. - Google Patents
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Abstract
Método para la producción de un péptido N-acilado, dicho método incluyendo las etapas: **(Ver fórmula)** a) reaccionar el péptido que tiene al menos un grupo amino libre con un agente acilante de la fórmula general I n es 0-8; R 1 es COOR 4 ; R 2 es una fracción lipofílica; R 3 junto con el grupo carboxilo al que R 3 está unido designan un éster reactivo o un éster de N-hidroxi imida reactivo; y R 4 es seleccionado de hidrógeno, C 1-12-alquilo y bencilo, bajo condiciones básicas en una mezcla acuosa; b) si R 4 no es hidrógeno, saponificar el grupo éster peptídico acilado (COOR 4 ) bajo condiciones básicas; c) aislar el péptido N-acilado, caracterizado por dicha mezcla acuosa en la fase a) conteniendo menos del 8% p/p solvente aprótico polar.
Description
Método de producción de péptidos acilados.
La presente invención se refiere a métodos para
acilar péptidos y proteínas. Más específicamente, la invención se
refiere a un método para introducir uno o más grupos acilo en un
péptido o una proteína.
Un gran número de péptidos han sido aprobados
para el uso en la práctica médica, y los péptidos pueden ser
producidos en células huéspedes adecuadas por tecnología del ADN
recombinante o pueden ser producidos sintéticamente por tecnología
de síntesis peptídica bien establecida. No obstante, los péptidos
nativos al igual que sus análogos tienden a mostrar índices altos
de aclaramiento que son inaceptables para muchas indicaciones
clínicas donde una alta concentración de plasma del péptido es
requerida sobre un periodo temporal prolongado. Ejemplos de
péptidos que en su forma nativa tienen un alto aclaramiento son:
ACTH, factor liberador de corticotropina, angiotensina,
calcitonina, insulina, glucagón, péptido-1 de tipo
glucagón (GLP-1), péptido-2 de tipo
glucagón (GLP-2), factor-1 de
crecimiento de tipo insulina, factor-2 de
crecimiento de tipo insulina, péptido gástrico inhibitorio, factor
liberador de la hormona del crecimiento, péptido activador de
adenilato-ciclasa pituitaria, secretina,
enterogastrina, somatostatina, somatotropina, somatomedina, hormona
paratiroidea, trombopoyetina, eritropoyetina, factores de
liberación hipotalámica, prolactina, hormonas estimuladoras de la
tiroides, endorfinas, encefalinas, vasopresina, oxitocina, opioides
y sus análogos, superóxido-dismutasa, interferón,
asparaginasa, arginasa, arginina desaminasa,
adenosina-desaminasa y ribonucleasa.
Una variedad de derivaciones de péptidos y
análogos peptídicos ha sido encontrada para influir en el nivel de
aclaramiento de los péptidos en una dirección favorable. Una tal
derivatización es la introducción de un grupo acilo lipofílico en
el péptido terapéutico provocando un perfil deseable prolongado de
acción con respecto al péptido no acilado. Por lo tanto, la
administración menos frecuente de la proteína terapéutica mejora la
adaptabilidad de pacientes a la terapia prescrita, y reduce la
cantidad de péptidos que debe ser administrada. Esto ha sido
descrito y demostrado en WO98/08871, que, entre otras cosas, expone
la acilación de GLP-1 y análogos del mismo, en
WO98/08872, que, entre otras cosas, expone la acilación de
GLP-2 y análogos del mismo, y WO99/43708, que,
entre otras cosas, expone la acilación de exendina y sus análogos.
Se demostró que los separadores mono- o dipeptídicos tales como el
ácido aspártico y ácido glutámico, entre el péptido y el grupo acilo
eran deseables. Separadores incluyendo un grupo de ácido
carboxílico libre deben ser protegidos antes de la acilación y
posteriormente desprotegidos.
WO 98 02460 y EP 1227107 revelan la acilación de
grupos \varepsilon-amino de insulina humana y WO
95 07931 y US 3 950 517 revelan acilaciones en varios aminoácidos
en insulinas. WO00/55119 y US 6 451 974 revelan un método para
acilar péptidos (p. ej. GLP-1) y agentes acilantes
nuevos en p. ej. una mezcla de solvente aprótico polar y agua donde
la proporción entre el solvente aprótico polar y el agua es de
entre 1:10 y 10:1.
Kanji Meguro et al. revelan la síntesis
de derivados de ácido 4-oxazolealcanoico tal como
varios
3-acil-3-acilaminopropionatos
(Chem. Pharm. Bull. Vol. 34, No.7 (1986) págs.
2840-2851) y J. F. Riordan y B. L. Vallee revelan
algunos métodos de acetilación comúnmente usados (Meth. Enzym., Vol.
25, 1972, páginas 494-499).
De tal manera que los péptidos terapéutico sean
económicamente viables, el coste de producción de los péptidos al
igual que la dosificación terapéutica del péptido son cruciales. Un
coste mayor durante la producción de péptidos terapéuticos lo
representan las fases de purificación requeridas para separar la
proteína meta de impurezas que están cercanamente relacionadas con
la proteína meta, p. ej. isómeros, formas desamido etc. Estas fases
de purificación son normalmente realizadas por cromatografía que
implica matrices de cromatografía caras y solventes al igual que un
rendimiento global reducido.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar un método eficaz y económico para la introducción de
grupos lipofílicos en péptidos mediante separadores de ácido
\alpha-amino-\alpha,\omega-dicarboxílico.
El método es más específico, y por lo tanto resulta en rendimientos
más altos y formación reducida de impurezas cercanamente
relacionadas. Se consigue una reducción significante del coste de
producción de los péptidos acilados. Péptidos acilados menos caros
son altamente deseables para maximizar el número de pacientes para
quienes el tratamiento está disponible al igual que para aprovechar
las ventajas de vías de entrega alternativas que tienen
biodisponibilidad inferior que la inyección subcutánea, p. ej.
entrega transdérmica y pulmonar.
\newpage
La presente invención proporciona un método para
aclar uno o más grupos amino de un péptido o proteína, el método
incluyendo las etapas:
a) reaccionar el péptido que tiene al menos un
grupo amino libre con un agente acilante de la fórmula general
I
donde
n es 0-8;
R^{1} es COOR^{4};
R^{2} es una fracción lipofílica;
R^{3} junto con el grupo carboxilo al que
R^{3} está unido designa un éster reactivo o un éster de
N-hidroxi imida reactivo; y
R^{4} es seleccionado de hidrógeno,
C_{1-12}-alquilo y bencilo, bajo
condiciones básicas en una mezcla acuosa;
b) si R^{4} no es hidrógeno, saponificar el
grupo éster peptídico acilado (COOR^{4}) bajo condiciones
básicas;
c) aislar el péptido
N-acilado,
caracterizado por dicha mezcla acuosa en la fase
a) conteniendo menos del 8% en peso de solvente aprótico polar.
En una forma de realización del método, dicha
reacción en la fase a) se desarrolla en una mezcla acuosa que
contiene menos del 5% p/p de solvente aprótico polar y
preferiblemente menos del 3% p/p de solvente aprótico polar.
En otra forma de realización del método, el
agente acilante se añade a la mezcla reactiva como un sólido.
En otra forma de realización del método, el
agente acilante se añade a la mezcla reactiva como una solución en
un solvente aprótico polar que es estabilizada añadiendo un
ácido.
La presente invención es útil para la
introducción de grupos acilo lipofílicos en cualquier péptido (o
proteína) para reducir el nivel de aclaramiento in vivo.
Ejemplos de tales péptidos y proteínas son ACTH, factor liberador de
corticotropina, angiotensina, calcitonina, exendina y sus análogos,
insulina y sus análogos, glucagón y sus análogos,
péptido-1 de tipo glucagón y sus análogos,
péptido-2 de tipo glucagón y sus análogos,
factor-1 de crecimiento de tipo insulina,
factor-2 de crecimiento de tipo insulina, péptido
gástrico inhibitorio, factor liberador de la hormona del
crecimiento, péptido activador de adenilato-ciclasa
pituitaria, secretina, enterogastrina, somatostatina,
somatotropina, somatomedina, hormona paratiroidea, trombopoyetina,
eritropoyetina, factores de liberación hipotalámica, prolactina,
hormonas estimuladoras de la tiroides, endorfinas, encefalinas,
vasopresina, oxitocina, opiodes y sus análogos,
superóxido-dismutasa, interferón, asparaginasa,
arginasa, arginina desaminasa, adenosina-desaminasa
y ribonucleasa.
Debe ser entendido que el péptido (o proteína)
debería llevar al menos un grupo amino libre, tal grupo amino
siendo el grupo amino N-terminal o un grupo amino
de cadena lateral. Los péptidos o proteína pueden comprender
aminoácidos que no son codificados por el código genético, tales
como D-aminoácidos,
3-hidroxiprolina, ornitina y pentilglicina.
Particularmente interesantes son grupos amino de residuos
aminoácidos de lisina y ornitina. El método es particularmente
relevante para la N-acilación del grupo
E-amino de residuos de lisina. Debería también ser
entendido que el péptido o proteína en cuestión puede comprender
dos o más grupos amino pendientes que todos pueden ser
N-acilados según la presente invención.
La presente invención es especialmente adecuada
para la acilación de GLP-1 y sus análogos. Ejemplos
de GLP-1 y análogos que pueden ser
N-acilados según la presente invención son
GLP-1 y análogos truncados, tales como
Arg^{26}-GLP-1(7-37);
Arg^{34}-GLP-1(7-37);
Lys^{36}-GLP-1(7-37);
Arg^{26,34}Lys^{36}-GLP-1(7-37);
Arg^{26,34}Lys^{38}GLP-1(7-38);
Arg^{26,34}Lys^{39}-GLP-1(7-39);
Arg^{26,34}Lys^{40}-GLP-1(7-40);
Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-37);
Arg^{26}Lys^{39}-GLP-1(7-39);
Arg^{34}
Lys^{40}-GLP-1(7-40); Arg^{26,34}Lys^{36,39}-GLP-1(7-39); Arg^{26,34}Lys^{36,40}-GLP-1(7-40); Gly^{8}Arg^{26}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{34}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{26,34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{26,34}Lys^{39}-GLP-1(7-39); Gly^{8}Arg^{26,34} Lys^{40}-GLP-1(7-40); Gly^{8}Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Lys^{36}-GLP-1(7-37); Arg^{26,34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Arg^{26,34}-GLP-1(7-37); Arg^{26,34}Lys^{40}-GLP-1(7-37); Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}His^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8} His^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}His^{22}-GLP-1(7-37); His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}-GLP-1(7-37); Val^{8}-GLP-1(7-37); Met^{8}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}
Asp^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}Lys^{22}
His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}
Lys^{22} His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8} Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Asp^{22} His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}
Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Arg^{26}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{34}-GLP-1(7-36)-amida; Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26,34}Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26,34}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26,34}Lys^{40}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}His^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8} His^{22}-GLP-1(7-36)-amida; His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}
His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Asp^{22} His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida;
Met^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; cada uno de estos análogos de GLP-1 y análogos truncados constituye formas de realización alternativas de la presente invención.
Lys^{40}-GLP-1(7-40); Arg^{26,34}Lys^{36,39}-GLP-1(7-39); Arg^{26,34}Lys^{36,40}-GLP-1(7-40); Gly^{8}Arg^{26}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{34}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{26,34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{26,34}Lys^{39}-GLP-1(7-39); Gly^{8}Arg^{26,34} Lys^{40}-GLP-1(7-40); Gly^{8}Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Lys^{36}-GLP-1(7-37); Arg^{26,34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Arg^{26,34}-GLP-1(7-37); Arg^{26,34}Lys^{40}-GLP-1(7-37); Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}His^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8} His^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}His^{22}-GLP-1(7-37); His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}-GLP-1(7-37); Val^{8}-GLP-1(7-37); Met^{8}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}
Asp^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}Lys^{22}
His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}
Lys^{22} His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8} Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Asp^{22} His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}
Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Arg^{26}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{34}-GLP-1(7-36)-amida; Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26,34}Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26,34}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26,34}Lys^{40}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}His^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8} His^{22}-GLP-1(7-36)-amida; His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}
His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Asp^{22} His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida;
Met^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; cada uno de estos análogos de GLP-1 y análogos truncados constituye formas de realización alternativas de la presente invención.
La presente invención es también especialmente
adecuada para la acilación de GLP-2 y sus análogos.
Ejemplos de GLP-2 y análogos que pueden ser
N-acilados según la presente invención son análogos
de GLP-2 y análogos truncados, tales como
Lys^{20}GLP-2(1-33);
Lys^{20}Arg^{30}GLP-2(1-33);
Arg^{30}Lys^{34}GLP-2(1-34);
Arg^{30}Lys^{35}GLP-2(1-35);
Arg^{30,35}Lys^{20}GLP-2(1-35);
y Arg^{35}GLP-2(1-35).
Cada uno de estos análogos de GLP-2 y análogos
truncados constituye formas de realización alternativas de la
presente invención.
La presente invención es también especialmente
adecuada para la acilación de exendina-3 y
exendina-4 y sus análogos. Ejemplos de análogos de
exendina que pueden ser N-acilados según la presente
invención están descritos en p. ej. WO99/43708. Cada uno de estos
análogos de exendina y análogos truncados constituye formas de
realización alternativas de la presente invención.
La presente invención es también particularmente
adecuada para la acilación de insulina y sus análogos. Ejemplos de
insulina y sus análogos que pueden ser N-acilados
según la presente invención son insulina humana e insulina
des(B30)-humana.
En otra forma de realización de la presente
invención la N-acilación se desarrolla en el grupo
\varepsilon-amino de residuos de lisina.
En el método según la invención, un péptido (o
proteína) que tiene al menos un grupo amino libre es reaccionado
con un agente acilante de la fórmula general I
El número entero n en la fórmula I es
preferiblemente 0-8, en particular
0-6 correspondiendo, p. ej., a ácido aspártico,
ácido glutámico, etc. Preferiblemente, n es 0-4 tal
como 0-2, p. ej. 0 (ácido aspártico) o 1(ácido
glutámico). Cada uno de estos números enteros y rangos constituye
formas de realización alternativas de la presente invención.
\global\parskip0.900000\baselineskip
R^{1} en la fórmula I representa un grupo de
ácido libre (COOH) o un grupo éster (COOR^{4}). En los casos
donde R^{1} es un grupo éster, R^{4} es seleccionado de grupos
que pueden ser eliminados (como los alcoholes correspondientes) por
hidrólisis bajo condiciones básicas. Ejemplos de grupos de este tipo
son C_{1-12}-alquilo, p. ej.
metilo, etilo, prop-1-ilo,
prop-2-ilo,
but-1-ilo,
but-2-ilo, 2
metil-prop-1-ilo,
2-metil-prop-2-ilo
(terc-butilo),
hex-1-ilo, etc., y bencilo. Cada uno
de estos grupos constituye formas de realización alternativas de la
presente invención.
R^{2} en la fórmula I representa la fracción
lipofílica para ser incorporada en el péptido o proteína. Tal
fracción lipofílica es normalmente seleccionada de
C_{3-39}-alquilo,
C_{3-39}-alquenilo,
C_{3-39}-alcadienilo y residuos
esteroidales. Ejemplos específicos de
C_{3-39}-alquilo son heptilo,
nonilo, undecanilo, tridecanilo, pentadecanilo, heptadecanilo, y
nonadecanilo. Cada una de estas fracciones lipofílicas constituye
formas de realización alternativas de la presente invención.
El sustituyente lipofílico o fracción se
caracteriza por tener una solubilidad en agua a 20ºC en el rango de
aproximadamente 0,1 mg/100 ml de agua a aproximadamente 250 mg/100
ml de agua, preferible en el rango de aproximadamente 0,3 mg/100 ml
de agua a aproximadamente 75 mg/100 ml de agua. Por ejemplo, ácido
octanoico (C8) tiene una solubilidad en agua a 20ºC de 68 mg/100
ml, ácido decanóico (C10) tiene una solubilidad en agua a 20ºC de 15
mg/100 ml, y ácido octadecanoico (C18) tiene una solubilidad en agua
a 20ºC de 0.3 mg/100 ml. Cada uno de estos rangos de sustituyente
lipofílico constituye formas de realización alternativas de la
presente invención.
Los términos,
"C_{3-39}-alquilo",
"C_{3-39}-alquenilo" y
"C_{3-39}-alcadienilo" se
destinan a cubrir radicales de hidrocarburos de cadena lineal y
ramificada, preferiblemente de cadena lineal, saturada,
monoinsaturada y di-insaturada, respectivamente, de
3-39 átomos de carbono. Ejemplos específicos de
C_{3-39}-alquilo son heptilo,
nonilo, undecanilo, tridecanilo, pentadecanilo, heptadecanilo, y
nonadecanilo.
Cuando se usa en la presente, el término
"residuo esteroidal" se destina a significar un grupo
lipofílico que con el grupo carbonilo al que R^{2} está unido es
derivado de un ácido carboxílico esteroide, es decir un
C_{16-36} hidrocarburo tri-, tetra y
pentacíclico, totalmente saturado o parcialmente insaturado.
Ejemplos de grupos de este tipo R^{2}-C(=O)- son
litocoloilo, desoxicoloilo, y coloilo.
Entre los grupos lipofílicos mencionados arriba,
C_{7-25}-alquilo,
C_{7-25}-alquenilo,
C_{7-25}-alcadienilo y residuos
esteroidales son especialmente pertinentes. Ejemplos
particularmente interesantes son heptilo, nonilo, undecanilo,
tridecanilo, pentadecanilo, heptadecanilo, nonadecanilo,
litocoloilo, desoxicoloilo, y coloilo. Cada uno de estos grupos
lipofílicos constituye formas de realización alternativas de la
presente invención.
R^{3} en la fórmula I junto con el grupo
carboxilo al que R^{3} está unido designa un éster reactivo o un
éster de N-hidroxi imida reactivo. Cada uno de
estos ésteres constituye formas de realización alternativas de la
presente invención. Ésteres reactivos y ésteres de
N-hidroxi imida reactivos son bien conocidos en la
técnica de la química orgánica (especialmente en química peptídica)
como grupos funcionales que son usados en acilación de grupos
amino, tio e hidroxi. Dentro del contexto de la presente invención,
el término "éster reactivo o un éster de
N-hidroxi imida reactivo" se destina a significar
una forma funcionalizada de éster de un grupo de ácido carboxílico
adecuado para acilar una amina, preferiblemente una amina primaria.
Debería, así, ser entendido, que se prefiere la selectividad para
acilación de aminas primarias antes que la acilación de grupos
hidroxi y tio. Ésteres de N-hidroxi imida reactivos
son especialmente preferidos.
Ejemplos de ésteres reactivos son ésteres de
1-hidroxibenzotriazola y derivados. Varios
reactivos altamente eficaces, p. ej. tetrafluoroborato de
2-(1H-benzotriazol-1il)-1,1,3,3,-tetrametiluronio,
para la formación de estos ésteres activados de ácidos carboxilicos
son conocidos. Estos ésteres reactivos son normalmente formados
in situ en presencia de una base, p. ej. una base orgánica
tal como una trialquilamina.
Ejemplos de la parte de imida de ésteres de
N-hidroxi imida reactivos son aquellos
específicamente descritos en EP 0511600 A2, página 3 a página 7.
Ejemplos especialmente interesantes de partes de imida entre estos
son succinimida, ftalimida, etc. cada una de estas partes de imida
constituye formas de realización alternativas de la presente
invención.
Los ésteres de N-hidroxi imida
reactivos de la fórmula I pueden ser preparados como se describe en
WO00/55119 y WO98/02460.
En el caso de que el reactivo acilante de la
fórmula I deba ser usado como el ácido
\alpha-carboxílico libre (R^{4} = hidrógeno), un
compuesto de la fórmula I donde R^{4} es un grupo que puede ser
eliminado selectivamente es convertido al compuesto correspondiente
donde R^{4} es hidrógeno. El grupo de protección de ácido
carboxílico puede ser un grupo bencilo que puede ser eliminado por
hidrogenación catalítica o un grupo alilo que puede ser eliminado
selectivamente. Un grupo de protección de bencilo puede ser
eliminado por hidrogenación catalítica en un solvente aprótico
polar, p. ej. en acetona, a la temperatura ambiente usando
paladio-en-carbono e hidrógeno. La
reacción puede ser realizada en un vaso cerrado con una atmósfera
de hidrógeno (normalmente 0,1-10 atm) bajo
agitación vigorosa. La reacción es normalmente completada en
0,5-12 horas dependiendo de la calidad del
catalizador de paladio. Se aplica tratamiento final
convencional.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La reacción entre el agente acilante de la
fórmula I y el péptido o proteína es realizada bajo condiciones
básicas en una solución acuosa que contiene menos del 8% en peso de
un solvente aprótico polar.
En una forma de realización de la invención la
reacción en la fase a) es realizada en una solución acuosa que
contiene del 1% p/p al 8% p/p de un solvente aprótico polar.
El agente acilante de la fórmula I es
normalmente usado en un ligero exceso con respecto al número de
grupos amino del péptido que deben ser acilados. La proporción es
normalmente 1:1 a 1:20 con un exceso del agente acilante,
preferiblemente 1: 1.2 a 1:5, teniendo en cuenta el número de grupos
amino en el péptido. El agente acilante puede ser añadido a la
mezcla reactiva como un sólido o puede ser añadido a la mezcla
reactiva como una solución. Cuando el agente acilante se añade como
una solución se disuelve en un solvente aprótico polar y
preferiblemente se estabiliza añadiendo un ácido. Normalmente, el
ácido para la estabilización es un ácido mineral, p. ej. ácido
sulfúrico.
Debe ser entendido que el péptido puede ser
completamente N-acilado o sólo parcialmente
N-acilado dependiendo de la cantidad de agente
acilante usado y de las condiciones de reacción. Se prefiere que la
N-acilación sea sustancialmente
estoiquiométrica.
Los solventes apróticos polares son solventes
con constantes dieléctricas moderadamente altas que no contienen
hidrógeno acídico (véase p. ej. Morrison y Boid, Organic Chemistry,
5t ed. p 229). Normalmente, el solvente aprótico polar es
seleccionado de tetrahidrofurano anhidro (THF), dimetilformamida
anhidro (DMF), acetona, diclorometano, dimetilsulfóxido (DMSO),
dioxano, dimetilacetamida, y
N-metil-2-pirrolidona
y sus mezclas derivadas, entre que dimetilformamida,
dimetilsulfóxido, dimetilacetamida y
N-metil-2-pirrolidona
son preferidas y
N-metil-2-pirrolidona
es especialmente preferida.
La temperatura es normalmente mantenida en el
rango de -10-50ºC.
Es importante que el valor de pH de la mezcla de
solvente está en el rango de 7-14, tal como
9-13, preferiblemente en el rango de
10-12, de manera que la reacción se desarrolle
fácilmente. El resultado respecto al rendimiento y pureza es
normalmente óptimo cuando el valor de pH de la mezcla de solvente
está en la gama de 10-12. El valor de pH deseado es
obtenido por adición de hidróxidos metálicos alcalinos, p. ej.
hidróxido sódico e hidróxido potásico, y/o bases orgánicas tales
como trialquilaminas (p. ej. trietilamina,
N,N-diisopropiletilamina, etc.). Puede también ser
ventajoso añadir un tampón que sea conveniente para tener el pH
cerca del valor inicial antes de que comience la reacción. Ejemplos
de tampón que pueden ser usados para este propósito son el tampón
fosfato, tampón borato y similares.
Como un ejemplo típico, la reacción en la fase
(a) es realizada usando la proteína y el agente acilante de la
fórmula I en una proporción molar 1:1 a 1:5. El péptido es
normalmente predisuelto en agua a -10-30ºC tal como
0-25ºC y el pH es ajustado al nivel deseado usando
un hidróxido metálico alcalino (p. ej. hidróxido sódico o hidróxido
de potasio). El valor de pH puede ser adicionalmente ajustado
usando ácidos, p. ej. ácido acético, y bases, p. ej.
trialquilamina, pero la temperatura está preferiblemente dentro del
rango anterior. De forma alternativa el péptido es predisuelto
directamente en una solución acuosa de una cantidad apropiada del
ácido o base pertinente. El agente acilante es posteriormente
añadido como un sólido o como una solución en un solvente aprótico
polar. La reacción es normalmente dejada desarrollarse hasta la
finalización (puede ser vigilada por HPLC) que es normalmente
obtenida en 0,2-4 horas, tal como
0,2-1 hora, antes de la adición de agua y ácido, p.
ej. ácido acético, a pH 6.5-9.0. El producto es
normalmente aislado y purificado por HPLC, o es precipitado por pH
isoeléctrico, o es hidrolizado (fase (b)) antes de la
purificación.
Cuando se usa un agente acilante de la fórmula I
donde R^{4} es hidrógeno, el péptido o proteína
N-acilado que lleva las fracciones lipofilicas y
grupos libres carboxílicos se obtiene directamente. Así, la variante
donde R^{4} es hidrógeno representa una forma de realización
preferida del método de la presente invención.
De forma alternativa, es decir cuando el grupo
R^{4} es C_{1-12}-alquilo o
bencilo, el éster peptídico N-acilado (o éster de
proteína) es saponificado bajo condiciones básicas para obtener el
péptido N-acilado o proteína
N-acilada. La saponificación es normalmente
realizada en una solución 0,01-4,0 M de un
hidróxido de metal alcalino, p. ej. hidróxido sódico o potásico. El
pH de la solución es normalmente 10-14. La reacción
es normalmente dejada que se desarrolle durante
0.1-12 horas, preferiblemente durante
0.5-4 horas, a 0-40ºC tal como a
aproximadamente la temperatura ambiente. Después de la reacción, el
producto es purificado, p. ej. por precipitación a pH isoeléctrico
y/o por HPLC preparatoria. Así, la variante donde R^{4} es
C_{1-12}-alquilo o bencilo
representa otra forma de realización preferida del método de la
presente invención.
En una forma de realización del método, el
agente acilante se añade a la mezcla reactiva como un sólido.
En una forma de realización del método, dicha
reacción en la fase a) se desarrolla en una mezcla acuosa que
contiene del 0% en peso al 8% en peso de solvente aprótico polar,
preferiblemente del 0% en peso al 5% en peso solvente aprótico
polar e incluso más preferible del 0% en peso al 3% en peso de
solvente aprótico polar.
\newpage
En otra forma de realización del método, dicha
reacción en la fase a) se desarrolla en presencia de un solvente
aprótico polar, y dicho solvente aprótico polar es seleccionado del
grupo que consiste en
N-metil-2-pirrolidona,
tetrahidrofurano y dimetilsulfóxido.
En otra forma de realización del método, todo el
solvente aprótico orgánico es añadido a la mezcla reactiva como un
solvente para el agente acilante.
En otra forma de realización del método, el
agente acilante es añadido a la mezcla reactiva como una solución
que es estabilizada añadiendo un ácido.
En otra forma de realización del método, dicho
ácido se añade al solvente aprótico polar en una concentración del
0,01% p/p al 1% p/p, preferiblemente en una concentración del 0,05%
p/p al 0,5% p/p.
En otra forma de realización del método, dicho
ácido es seleccionado del grupo que consiste en ácido sulfúrico,
ácido metanosulfónico y ácido trifluoroacético.
En otra forma de realización del método, la
reacción en la fase a) se desarrolla en la ausencia de un solvente
aprótico polar.
En otra forma de realización del método, R^{4}
en la fórmula I es hidrógeno.
En otra forma de realización del método, R^{4}
es seleccionado de C_{1-8}-alquilo
y bencilo.
En otra forma de realización del método, R^{3}
con el grupo carboxilo al que R^{3} está unido designa un éster
de N-hidroxi imida reactivo.
En otra forma de realización del método, el
éster peptídico acilado es saponificado a un valor de pH en la gama
de 10-14, preferiblemente en el rango de pH de
9-13.
En otra forma de realización del método, el
éster peptídico acilado es saponificado a un valor de pH en la gama
de 9-14, tal como en el rango de pH de
10-13.
En otra forma de realización del método, el pH
de la mezcla reactiva en la fase a) es de pH 9 a pH 13,
preferiblemente de pH 10 a pH 12, o más preferible de pH 11.0 a pH
11.5.
En otra forma de realización del método, la
mezcla reactiva en la fase a) comprende un tampón que es
conveniente para mantener un pH sustancialmente constante durante
la reacción. En una forma de realización del método dicho tampón es
un tampón fosfato, un tampón borato o una mezcla de estos.
En otra forma de realización del método, la
temperatura de la mezcla reactiva en la fase a) está en el rango de
0-50ºC, preferiblemente en el rango de
5-40ºC y más preferible en el rango de
10-30ºC.
En otra forma de realización del método, R^{2}
es seleccionado de
C_{3-39}-alquilo,
C_{3-39}-alquenilo,
C_{3-39}-alcadienilo y residuos
esteroidales.
En otra forma de realización del método,
R^{2}-C(=O)- es seleccionado del grupo que
consiste en litocoloilo y hexadecanoilo.
En otra forma de realización del método, dicho
péptido usado como materia prima para la fase a) tiene una pureza
del péptido de al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 93%,
al menos el 95%, o al menos el 97% según está determinado por
RP-HPLC.
En otra forma de realización del método, dicho
péptido es seleccionado del grupo que consiste en
GLP-1, exendina-4,
GLP-2, glucagón, insulina, sus análogos y derivados
de cualquiera de los precedentes.
En otra forma de realización del método, dicho
péptido es un agonista de GLP-1.
En otra forma de realización del método, dicho
péptido es seleccionado del grupo que consiste en
exendina-3, exendina-4;
Arg^{34}-GLP-1(7-37),
Gly^{8}-GLP-1(7-36)-amida,
Gly^{8}-GLP-1(7-37),
Val^{8}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-37),
insulina des(B30)humana y sus derivados.
En otra forma de realización del método, dicho
péptido es seleccionado del grupo que consiste en que consiste en
Val^{8}Trp^{19}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1
(7-37),
Val^{8}Tyr^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Leu^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Tyr^{18}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}Ile^{33}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Ile^{33}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1(7-37)
y sus análogos.
En aún otra forma de realización del método,
dicho péptido es seleccionado de
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2
(ZP-10) y sus análogos.
En otra forma de realización del método, dicho
péptido no es un péptido de insulina, es decir no es insulina o un
derivado análogo. En otra forma de realización del método, dicho
péptido comprende sólo una cadena polipeptidica. En otra forma de
realización del método, dicho péptido comprende dos cadenas
polipeptídicas que son conectadas de manera covalente al menos por
un enlace de disulfuro.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
del método de acilación para la preparación de un derivado
peptídico seleccionado del grupo que consiste en Arg^{34},
Lys^{26}(N^{\varepsilon}-(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoyl)))-GLP-1(7-37)
e insulina Lys^{B29} (NE-tetradecanoil)
des(B30) humana e insulina
Lys^{B29}(N^{\varepsilon}[N^{\alpha}-litocoloil-Glu-OH])
des(B30) humana.
La preparación de los reactivos de acilación se
hace como se describe en WO 00/55119.
En los ejemplos, la purificación final del
producto se obtuvo por cromatografía en columna.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg-^{34}GLP-1(7-37)
fue expresado en levadura (S. cerevisiae) por tecnología del
ADN recombinante convencional, p. ej. como se describe en WO
98/08871.
Arg^{34}GLP-1(7-37) en el
caldo de fermentación fue luego purificado por cromatografía en
fase inversa convencional y posteriormente precipitado en el pH
isoeléctrico del péptido, es decir a pH 5.4. El precipitado fue
aislado por centrifugado y congelado.
Arg^{34}-GLP-1^{7-37}
(1,47 g de material de péptido de isoprecipitado congelado, aprox.
0,10 mmol) fue disuelto en 0,1 mol/kg trietilamina (23 ml) a
10-15ºC. El pH de la solución fue 11.6. Éster de
\gamma-N-hidroxisuccinimida de
ácido N-hexadecanoilglutámico (63,7 mg, 0,13 mmol)
fue añadido. Después de 20 minutos a la temperatura ambiente se
añadió agua (42 ml), y el pH fue ajustado a 8.0 por adición de 1,0
M de ácido acético.
Rendimiento: por RP-HPLC
analítico se mostró que la mezcla reactiva contenía un 84% (por
área) de
Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}
y 0,5% (por área) de
Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\alpha-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1(7-37)
fue expresado en levadura (S. cerevisiae) por tecnología del
ADN recombinante convencional, p. ej. como se describe en WO
98/08871.
Arg^{34}GLP-1(7-37) en el
caldo de fermentación fue luego purificado por cromatografía en
fase inversa convencional y posteriormente precipitado en el pH
isoeléctrico del péptido, es decir a pH 5.4. El precipitado fue
aislado por centrifugado y congelado.
Arg^{34}-GLP-1^{7-37}
(1,57 g de material de péptido de isoprecipitado congelado, aprox.
0,14 mmol) fue disuelto en 0,1 mol/kg de trietilamina (23 ml) a
10-15ºC. El pH de la solución fue ajustado a 11.5
por la adición de trietilamina. 1,7 ml de éster de
\gamma-N-hidroxisuccinimida de
ácido N-hexadecanoilglutámico (92.1 mg, 0.19 mmol)
disuelto en
N-metil-2-pirrolidona
fue añadido conteniendo un 0,105% p/p de H_{2}SO_{4} 1 M.
Después de 20 minutos a la temperatura ambiente se añadió agua (42
ml), y el pH fue ajustado a 8.0 por adición de 1,0 M de ácido
acético.
Rendimiento: por RP-HPLC
analítica se mostró que la mezcla reactiva contenía un 83% (por
área) de
Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}
y 0.4% (por área) de
Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\alpha-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1(7-37)
fue expresado en levadura (S. cerevisiae) por tecnología del
ADN recombinante convencional, p. ej. como se describe en WO
98/08871.
Arg^{34}GLP-1(7-37) en el
caldo de fermentación fue luego purificado por cromatografía en
fase inversa convencional y posteriormente precipitado en el pH
isoeléctrico del péptido, es decir a pH 5.4. El precipitado fue
aislado por centrifugado y congelado.
Arg^{34}-GLP-1^{7-37}
(1,53 g de material peptídico isoprecipitado congelado, aprox. 0,13
mmol) fue disuelto en 0,05 mol/kg de trietilamina (25 ml) a la
temperatura ambiente. El pH de la solución fue 10.9. 1,8 ml de
éster de
\gamma-N-hidroxisuccinimida de
ácido N-hexadecanoilglutámico (94,2 mg, 0,19 mmol)
disuelto fue añadido en
N-metil-2-pirrolidona
sin H_{2}SO_{4}. Después de 30 minutos a la temperatura
ambiente se añadió agua (48 ml), y el pH fue ajustado a 8.0 por
adición de 1,0 M de ácido acético.
Rendimiento: por RP-HPLC
analítica se mostró que la mezcla reactiva contenía un 75% (por
área) de
Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}
y 4.0% (por área) de
Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\alpha-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura (S. cerevisiae) por tecnología del
ADN recombinante convencional, p. ej. como se describe en WO
98/08871. Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
en el caldo de fermentación fue luego purificado por cromatografía
en fase inversa convencional y posteriormente precipitado en el pH
isoeléctrico del péptido, es decir a pH 5.4. El precipitado fue
aislado por centrifugado y congelado.
Arg^{34}-GLP-1^{7-37}
(1,57 g de material peptídico isoprecipitado congelado, aprox. 0,14
mmol) fue disuelto en 0,1 mol/kg de trietilamina (23 ml) a
10-15ºC.
N-metil-2-pirrolidona
(6.8 ml) fue añadido y el pH de la solución fue ajustado a 11.5 por
la adición de trietilamina. Luego éster de
\gamma-N-hidroxisuccinimida de
ácido N-hexadecanoilglutámico (92.1 mg, 0.19 mmol)
disuelto fue añadido en 1,7 ml de
N-metil-2-pirrolidona
conteniendo 0,105% p/p de H_{2}SO_{4} 1 M. Después de 20 minutos
a la temperatura ambiente agua (54 ml) fue añadido, y el pH fue
ajustado a 8.0 por adición de 1,0 M de ácido acético.
Rendimiento: por RP-HPLC
analítico se mostró que la mezcla reactiva contenía un 87% (por
área) de
Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}
y 0.5% (por área) de
Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\alpha-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1(7-37)
fue expresado en levadura (S. cerevisiae) por tecnología del
ADN recombinante convencional, p. ej. como se describe en WO
98/08871.
Arg^{34}GLP-1(7-37) en el
caldo de fermentación fue luego purificado por cromatografía en
fase inversa convencional y posteriormente precipitado en el pH
isoeléctrico del péptido, es decir a pH 5.4. El precipitado fue
aislado por centrifugado y congelado.
Arg^{34}-GLP-1^{7-37}
(1,51 g de material peptídico isoprecipitado congelado, aprox. 0,13
mmol) fue disuelto en 0,1 mol/kg de trietilamina (20 ml) y
N-metil-2-pirrolidona
(100 ml) a 10-15ºC. Luego éster de
N-hidroxisuccinimida de ácido
\gamma-N-hexadecanoilglutámico (74
mg, 0.15 mmol) disuelto fue añadido en 1,4 ml de
N-metil-2-pirrolidona
conteniendo 0,105%p/p de H_{2}SO_{4} 1 M. Después de 45 minutos
a la temperatura ambiente se añadió agua (206 ml), y el pH fue
ajustado a 8 por adición de 1.0 M de ácido acético.
Rendimiento: por RP-HPLC
analítica se mostró que la mezcla reactiva contenía un 57% (por
área) de
Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}
y 14% (por área) de
Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}.
\vskip1.000000\baselineskip
En la tabla 1 las condiciones experimentales
usadas para acilar
Arg^{34}-GLP-1^{7-37}
en los experimentos de ejemplo 1-5 están resumidas
y los contenidos resultantes de la impureza
Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\alpha-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}
(abreviado \alpha-glu) están catalogados. Sin la
adición de H_{2}SO_{4} como estabilizador está claro que
concentraciones inferiores de solvente aprótico polar son eficaces
para reducir la cantidad de la impureza
\alpha-glu. Cuando se añade el estabilizador, la
formación de cantidades significantes de la impureza
\alpha-glu empieza a concentraciones
significativamente más altas de solvente aprótico polar, es decir
sobre la concentración 28% p/p.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Insulina des(B30)-humana
cristalizada de sodio (1,74 g de material de péptido congelado
aislado por precipitación isoeléctrica, aprox. 0,088 mmol) fue
disuelta en 0,1 mol/kg de trietilamina (10,85 ml) a la temperatura
ambiente. El pH de la solución fue 10.9. Luego,
(2S)-5-[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]-2-{[(3a,5b)-3-hidroxi-9-meil-24-oxocolan-24-il]amino}-5-oxopentanoato
de metilo (55,1 mg, 0,089 mmol) disuelto fue añadido en
N-metil-2-pirrolidona
(1,25 ml). Después de 30 minutos a la temperatura ambiente se
añadió agua (5ºC, 85 ml).
Rendimiento: por RP-HPLC
analítica se mostró que la mezcla reactiva contenía el 34% (por
área) de insulina
N\varepsilon-(litocoloil-\gamma-glutamil)-Lys^{B29}-des(B30)-humana.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura (S. cerevisiae) por tecnología del
ADN recombinante convencional, p. ej. como se describe en WO
98/08871. Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
en el caldo de fermentación fue luego purificado por cromatografía
en fase inversa convencional y posteriormente precipitado en el pH
isoeléctrico del péptido, es decir a pH 5.4. El precipitado fue
aislado por centrifugado y congelado.
El precipitado isoeléctrico que contiene
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} (5,70 g
de material peptídico precipitado congelado, aprox. 0,38 mmol) fue
disuelto en 0,1 M de solución de disodio hidrogenofosfato dihidrato
(170 ml, pH ajustada a 11.35 con 1 M de NaOH) a 15ºC. El pH de la
solución fue reajustado a 11.4 por la adición de 1 M de NaOH. 3 ml
de éster de
\gamma-N-hidroxisuccinimida de
ácido N-hexadecanoilglutámico (248.1 mg, 0.51 mmol)
disuelto en N-metil-pirrolidona
conteniendo 0,105% p/p de H_{2}SO_{4} 1 M fue añadido gota a
gota durante 8 min.
Muestras fueron extraídas durante 21,5 horas de
reacción a 15ºC y se añadió 0,1 M de solución de sodio
dihidrogenofosfato dihidrato conteniendo 1 mg/ml glicina, pH 7.5.
La mezcla reactiva final fue diluida con agua (300 ml) y el pH fue
ajustado a 8.0 por adición de ácido glacial.
Rendimiento: por RP-HPLC
analítica se mostró que la mezcla reactiva contenía un
78-80% (por área) de
Arg^{34}
Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37} y 0.24-1.67% (por área) de Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}.
Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37} y 0.24-1.67% (por área) de Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
\bullet WO 9808871 A [0003] [0062] [0064]
[0067] [0069] [0071] [0076]
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Claims (27)
1. Método para la producción de un péptido
N-acilado, dicho método incluyendo las etapas:
a) reaccionar el péptido que tiene al menos un
grupo amino libre con un agente acilante de la fórmula general
I
donde
n es 0-8;
R^{1} es COOR^{4};
R^{2} es una fracción lipofílica;
R^{3} junto con el grupo carboxilo al que
R^{3} está unido designan un éster reactivo o un éster de
N-hidroxi imida reactivo; y
R^{4} es seleccionado de hidrógeno,
C_{1-12}-alquilo y bencilo, bajo
condiciones básicas en una mezcla acuosa;
b) si R^{4} no es hidrógeno, saponificar el
grupo éster peptídico acilado (COOR^{4}) bajo condiciones
básicas;
c) aislar el péptido
N-acilado,
caracterizado por dicha mezcla acuosa en
la fase a) conteniendo menos del 8% p/p solvente aprótico
polar.
2. Método según la reivindicación 1, donde dicha
reacción en la fase a) se desarrolla en una mezcla acuosa que
contiene menos del 5% p/p de solvente aprótico polar,
preferiblemente menos del 3% p/p de solvente aprótico polar.
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, donde el agente acilante se
añade a la mezcla reactiva como un sólido.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, donde dicha reacción en la
fase a) se desarrolla en presencia de un solvente aprótico polar, y
dicho solvente aprótico polar es seleccionado del grupo que
consiste en
N-metil-2-pirrolidona,
tetrahidrofurano y dimetilsulfóxido.
5. Método según la reivindicación 4, donde todo
el solvente aprótico orgánico es añadido a la mezcla reactiva como
un solvente para el agente acilante.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 4-5, donde el agente acilante es
añadido a la mezcla reactiva como una solución que es estabilizada
añadiendo un ácido.
7. Método según la reivindicación 6, donde dicho
ácido se añade al solvente aprótico polar en una concentración del
0,01% p/p al 1% p/p, preferiblemente en una concentración del 0,05%
p/p al 0,5% p/p.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 6-7, donde dicho ácido es
seleccionado del grupo que consiste en ácido sulfúrico, ácido
metanosulfónico y ácido trifluoroacético.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde la reacción en la fase
a) se desarrolla en la ausencia de un solvente aprótico polar.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, donde R^{4} es
hidrógeno.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, donde R^{4} es seleccionado
de C_{1-8} alquilo y bencilo.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, donde R^{3} junto con el
grupo carboxilo al que R^{3} está unido designan un éster de
N-hidroxi imida reactivo.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, donde el éster peptídico
acilado es saponificado a un valor de pH en la gama de
10-14, preferiblemente en el rango de pH de
9-13.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-13, donde el pH de la mezcla
reactiva en la fase a) es de pH 9 a pH 13, preferiblemente de pH 10
a pH 12, o más preferible de pH 11.0 a pH 11.5.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-14, donde la temperatura de la
mezcla reactiva en la fase a) está comprendida en el rango de
0-50ºC, preferiblemente en el rango de
5-40ºC y más preferible en el rango de
10-30ºC.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde R^{2} es seleccionado de
C_{3-39}-alquilo,
C_{3-39}-alquenilo,
C_{3-39}-alcadienilo y residuos
esteroidales.
17. Método según la reivindicación 16, donde
R^{2}-C(=O)- es seleccionado del grupo que
consiste en litocoloilo y hexadecanoilo.
18. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho péptido usado como
materia prima para la fase a) tiene una pureza del péptido de al
menos 80%, al menos 90%, al menos 93%, al menos 95%, o al menos 97%
según está determinado por RP-HPLC.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho péptido es seleccionado
del grupo que consiste en GLP-1,
exendina-4, GLP-2, glucagón e
insulina.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-18, donde dicho péptido es un
análogo de GLP-1 que es seleccionado del grupo que
consiste en:
Arg^{26}-GLP-1(7-37);
Arg^{34}-GLP-1(7-37);
Lys^{36}-GLP-1(7-37);
Arg^{26,34}Lys^{36}-GLID-1(7-37);
Arg^{26,34}Lys^{38}GLP-1(7-38);
Arg^{26,34}Lys^{39}-GLP-1(7-39);
Arg^{26,34}Lys^{40}-GLP-1(7-40);
Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-37);
Arg^{26}Lys^{39}-GLP-1(7-39);
Arg^{34}Lys^{40}-GLP-1(7-40);
Arg^{26,34}Lys^{36,39}-GLP-1(7-39);
Arg^{26,34}Lys^{36,40}-GLP-1(7-40);
Gly^{8}Arg^{26}-GLP-1(7-37);
Gly^{8}Arg^{34}-GLP-1(7-37);
Gly^{8}Lys^{36}-GLP-1(7-37);
Gly^{8}Arg^{26,34}Lys^{36}-GLP-1
(7-37);
Gly^{8}
Arg^{26,34}Lys^{39}-GLP-1(7-39); Gly^{8}Arg^{26,34}Lys^{40}-GLP-1(7-40); Gly^{8}Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Lys^{36}-GLP-1(7-37); Arg^{26,34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Arg^{26,34}-GLP-1(7-37); Arg^{26,34}Lys^{40}-GLP-1(7-37); Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}His^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}His^{22}-GLP-1(7-37); His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}-GLP-1(7-37); Val^{8}-GLP-1(7-37); Met^{8}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}His^{22}
His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}Asp^{22}His^{3}-GLP-1(7-37); Met^{8}Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Arg^{26}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{34}-GLP-1(7-36)-amida; Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26,34}Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26,34}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26,34}Lys^{40}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}
Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Asp^{22}-GLP-1 (7-36)-amida; Gly^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Lys^{22}GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}
Lys^{22}-GIP-1(7-36)-amida; Met^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Arg^{22}-GIP-1(7-36)-amida; Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}His^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}His^{22}-GIP-1(7-36)-amida; Met^{8}His^{22}-GLP-1(7-36)-amida; His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Asp^{22}His^{8}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Gly^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; y Met^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida.
Arg^{26,34}Lys^{39}-GLP-1(7-39); Gly^{8}Arg^{26,34}Lys^{40}-GLP-1(7-40); Gly^{8}Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Lys^{36}-GLP-1(7-37); Arg^{26,34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Arg^{26,34}-GLP-1(7-37); Arg^{26,34}Lys^{40}-GLP-1(7-37); Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}His^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}His^{22}-GLP-1(7-37); His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}-GLP-1(7-37); Val^{8}-GLP-1(7-37); Met^{8}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37); Met^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37); Val^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}His^{22}
His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}His^{37}-GLP-1(7-37); Met^{8}His^{37}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Val^{8}Asp^{22}His^{3}-GLP-1(7-37); Met^{8}Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-37); Arg^{26}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{34}-GLP-1(7-36)-amida; Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26,34}Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26,34}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26,34}Lys^{40}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}
Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Asp^{22}-GLP-1 (7-36)-amida; Gly^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Lys^{22}GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}
Lys^{22}-GIP-1(7-36)-amida; Met^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Arg^{22}-GIP-1(7-36)-amida; Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}His^{22}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}His^{22}-GIP-1(7-36)-amida; Met^{8}His^{22}-GLP-1(7-36)-amida; His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Asp^{22}His^{8}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Asp^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Gly^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Met^{8}Lys^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Gly^{8}Arg^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; Val^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida; y Met^{8}His^{22}His^{37}-GLP-1(7-36)-amida.
21. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-18, donde dicho péptido es un
análogo de GLP-2 que es seleccionado del grupo que
consiste en:
Lys^{20}GLP-2(1-33);
Lys^{20}Arg^{30}GLP-2(1-33);
Arg^{30}Lys^{34}GLP-2(1-34);
Arg^{30}Lys^{35}
GLP-2(1-35); Arg^{30,35}Lys^{20}GLP-2(1-35); y Arg^{35}GLP-2(1-35).
GLP-2(1-35); Arg^{30,35}Lys^{20}GLP-2(1-35); y Arg^{35}GLP-2(1-35).
22. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-18, donde dicho péptido es un
análogo de insulina que es insulina
des(B30)-humana.
23. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho péptido es un agonista de
GLP-1.
\newpage
24. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho péptido es seleccionado
del grupo que consiste en exendina-3,
exendina-4;
Arg^{34}-GLP-1(7-37),
Gly^{8}-GLP-1(7-36)-amida,
Gly^{8}-GLP-1(7-37),
Val^{8}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Asp^{22}
-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-37),
e insulina des(B30)humana.
25. Método según la reivindicación 19, donde
dicho péptido es
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPS
SGAPPSKKKKKK-NH2 (ZP-10).
SGAPPSKKKKKK-NH2 (ZP-10).
26. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-14, donde la mezcla reactiva en
la fase a) comprende un tampón que es conveniente para mantener un
pH sustancialmente constante durante la reacción.
27. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho péptido no es un péptido
de insulina.
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