ES2328717T3 - Peptido antagonista de interleuquina-15. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se relaciona con la rama de la farmacologíamolecular en particular con un péptido perteneciente a la secuencia de la Interleucina-15 (IL-15), que es capaz de inhibir la actividad biológica de esta molécula; análogos o miméticos de dichopéptido. En la presente invención se muestra que el péptido al unirse a la subunidad alfa del receptor (IL-15R ) inhibe la proliferación de células T inducida por la IL-15 y la apoptosis mediadapor TNF . La invención se relaciona además con el uso del péptidoen el tratamiento de patologías donde la expresión anormal de laIL-15 o IL-15R esta relacionada con el curso de la enfermedad.
Description
Péptido antagonista de
interleuquina-15.
La presente invención se refiere a la rama de la
farmacología molecular, de forma particular a un péptido de
interleuquina-15 (IL-15) que
perjudica la unión de IL-15 a la subunidad alfa del
receptor; por tanto se podría usar para el tratamiento de
enfermedades asociadas con expresión aberrada de
IL-15 o IL-15R\alpha.
La citoquina conocida como IL-15
es una glicoproteína de 14 a 15 kDa identificada simultáneamente por
dos grupos de autores como un factor de activación de células T
(Grabstein, K.H. y col., Science 1994, 264, 965; Burton, J.D. y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 1994, 91, 4935). El ARNm de
IL-15 es ampliamente expresado en diferentes
células y tejidos, no obstante, es difícil de encontrar la proteína
en estas células o en el sobrenadante de células debido a un fuerte
control post-transcripcional de su expresión a nivel
translacional y el tráfico intracelular (Bamford RN, y col., J.
Immunol. 1998, 160: 4418-4426; Kurys G, y col., J.
Biol. Chem. 2000, 275: 30653-30659). Además se ha
mostrado que IL-15 puede existir en una forma activa
como una proteína de membrana (Musso y col., Blood 1999, volumen
93, nº 10 (15 de Mayo): páginas 3531 a 3539) y recientemente se
observó que puede funcionar bien como ligando o bien como receptor
(Budalgian y col., JBC 2004, volumen 279, nº 40: páginas 42192 a
42201) induciendo a través de esta ruta la secreción de citoquinas
pro-inflamatorias.
Se ha asociado un alto nivel de expresión de la
proteína soluble a la patogénesis de enfermedades
auto-inmunes e inflamatorias. La
IL-15 se ha detectado en varias enfermedades,
incluyendo enfermedad de Crohn (Kirman I., 1996, Am. J.
Gastroenterol. 91, 1789), psoriasis (Rückert R. 2000, 165:
2240-2250), leucemias (Yamada Y. 1999, Leukemia and
Lymphoma, 35(1-2): 37-45 y
artritis reumatoide (RA) (McInnes I.B. 1998, Immunology Today, 19,
75-79). La unión del ligando al receptor de células
T induce la expresión de IL-15R\alpha y la
expresión de varios antígenos de activación tales como CD69, CD25 y
TNFRII. También IL-15 es un quimioatractor para los
linfocitos T de sangre humana (Wilkinson 1995, J. Exp. Med. 181,
1255-1259). Todos estos datos sugieren que la
IL-15 expresada por células que presentan antígeno
podría ser de importancia en la activación temprana de células T en
el sitio de inflamación.
McInnes y col., encontraron anormalidades en la
expresión de IL-15 en esta enfermedad, alta
concentración de IL-15 en el fluido sinovial y su
expresión en células sinoviales de membrana. Estos autores
sugirieron que la IL-15 precede al TNF\alpha en
la cascada de citoquina, proponiendo un mecanismo dependiente del
contacto celular, donde células T activadas por
IL-15 inducen la síntesis de TNF\alpha por
macrófagos. Además se propone que IL-15 actúa como
un factor importante en la migración de células T al fluido sinovial
(McInnes, 1997, Nat Med, 3: 189-195).
Ziolkowska y col., describieron que
IL-15 induce la expresión de IL-17
en articulaciones de pacientes de RA, ya se conoce que esta
citoquina estimula la liberación mediante sinoviocitos de diversos
mediadores inflamatorios tales como IL-6,
IL-8, GM-CSF y prostaglandina E2, lo
que sugiere un importante papel para IL-15 en la
patogénesis de RA (Ziolkowska y col 2000, J. Immunol, 164: 2832 a
2838).
El reclutamiento y activación de células T puede
tener lugar como una consecuencia de la síntesis local de
IL-15 y tal activación no específica podría traer
como consecuencia una inflamación continua. Todo esto sugiere que
la inhibición de IL-15 podría tener un potencial
terapéutico en el tratamiento de la enfermedad así como también de
otras enfermedades auto-inmunes e inflamatorias.
Los efectos biológicos de IL-15
son mediados por su unión a un receptor de membrana celular
constituido por tres subunidades \alpha, \beta y \gamma. El
IL-15R\alpha es una subunidad específica de esta
citoquina a la que está unida con una afinidad muy fuerte Kd
10^{-11}, y puede encontrarse como un receptor de membrana o en
una forma soluble (Budagian V. y col., JBC2004, 279, 39:
40368-40375; Mortier y col., The Journal of
Immunology, 2004, 173: 1681-1688).
Las subunidades \beta y \gamma son
compartidas con IL-2, una citoquina con una gran
homología estructural con IL-15. Se ha descrito
previamente que Asp56 en la molécula de IL-15 es
importante en la unión a la subunidad \beta del receptor y Gln156
es importante en la unión a la subunidad \gamma del receptor.
Las muteínas se comportan como moléculas
antagonistas de IL-15 unidas a la subunidad \alpha
del receptor y dificultan la transducción de señal mediante
subunidades \beta y \gamma. Los anticuerpos que reconocen estos
aminoácidos también actúan como antagonistas de
IL-15 (documentos US 6177079, US 6168783, US
6013480, US 6001973, US 9706931, WO 9741232).
Ruchatz y col. (Ruchatz H. 1998, J. Immunol.
160:5654 a 5660) generaron un fragmento soluble de la subunidad
\alpha del receptor murino (IL-15R\alpha) y
demostraron que la inyección de este fragmento inhibía la artritis
inducida por colágeno (CIA) en ratones DBA/1.
Genmab Company es propietaria de la patente de
anticuerpos humanos específicos frente a IL-15,
documento WO 03017935, donde se describen 4 anticuerpos y 2 de
ellos, 146B7 y 146H5, se unen a IL-15 en la región
de interacción de la subunidad \gamma del receptor e inhiben la
proliferación de células inducida por IL-15 en la
línea celular CTLL2 y en PBMC (células mononucleares sanguíneas
periféricas), y anticuerpos 404A8 y 404E4 que no inhiben la
proliferación. El anticuerpo 146B7 (Amgen) con el nombre AMG714 se
encuentra en Rheumatoid Arthritis Clinical Trials Phase II.
Recientemente se identificaron dos secuencias de
unión de la IL-15 a la subunidad \alpha del
receptor, desde el aminoácido 44 al 52 y desde el aminoácido 64 al
68 (Bernard y col., JBC 2004, 279 (23),
24313-24322). Estos autores describieron muteínas
que pueden actuar bien como agonista o bien como antagonista de
IL-15.
Hasta ahora no se ha descrito péptido
antagonista de IL-15 alguno. El uso de un péptido de
longitud corta (10 aa) como un antagonista de IL-15
tiene la ventaja de bloquear de forma selectiva la unión de
IL-15 a la subunidad \alpha del receptor y mediar
o alterar los efectos de IL-15 debido a la
interacción con el receptor de IL-15. Por ejemplo,
como se describe en la presente invención, el péptido denominado Sec
nº 1 ocupa una región de 10 aminoácidos de IL-15
que se ha identificado como la región de interacción con la
subunidad \alpha del receptor (figura 1). Tal péptido se une a la
proteína de fusión IL-15R\alpha-Fc
en ensayo ELISA y en ensayo de resina Tentagel (figura 2), inhibe
la proliferación de línea celular CTLL-2 dependiente
de IL-15 (figuras 3a y 3b) y protege de apoptosis
inducida por TNF\alpha (figura 4), este efecto es mediado por la
unión de IL-15 a la cadena \alpha del receptor.
Este último efecto permite su uso en enfermedades en las que es
necesario inhibir el proceso apoptótico. Igualmente, la unión de
este péptido a la cadena \alpha soluble como se describe en la
presente invención puede inhibir la señalización inversa mediada por
IL-15 asociada a membrana (Buldalgian y col., JBC
2004, volumen 274, nº 40: páginas 42192-42201).
De forma particular, esta invención se refiere a
la identificación de una región de IL-15 que es
capaz de unirse a la subunidad IL-15R\alpha. El
péptido que comprende esta región aquí denominado Sec nº 1 se
sintetizó químicamente y presenta capacidad de unión a
IL-15R\alpha-Fc (figura 2), inhibe
la proliferación de CTLL2 inducida por IL-15 y
protege de la fragmentación de ADN inducida por TNF\alpha (figura
4).
Igualmente esta invención también incluye el uso
del péptido anteriormente citado, solo o en combinación con
cualquier otra molécula apropiada, por ejemplo, fármacos esteroideos
anti-inflamatorios (corticoestorides), fármacos
modificadores de enfermedad (metotrexato) u otro antagonista de
citoquinas usados en tratamiento de artritis reumatoide y uso de
este péptido para inhibir la unión de IL-15 a la
subunidad \alpha del receptor bien en formas solubles o bien en
formas asociadas a membrana.
El péptido de la presente invención presenta una
estructura lineal y se caracteriza principalmente por su capacidad
de antagonizar IL-15. Por otro lado el efecto in
vitro producido por el péptido de la presente invención se
demuestra con un ensayo de proliferación de células
CTLL-2 y con el ensayo de inhibición de apoptosis
inducida por TNF\alpha.
Para la definición del péptido descrito se usó
una técnica de mapeo en un filtro de celulosa que contiene
secuencia completa de IL-15 en péptidos
consecutivos de 10 aa con 5 aminoácidos de solapamiento.
En la presente invención el péptido Sec nº 1 se
sintetizó químicamente mediante técnica de fase sólida, se purificó
mediante HPLC, se analizó por espectrometría de masas y finalmente
se evaluó en lo que respecta a su efecto sobre la actividad de
IL-15.
Los resultados mostrados en la presente
invención indican que la región identificada y sintetizada como un
péptido de 10 aa (Sec nº 1) corresponde a una región de
IL-15 que interacciona con la subunidad \alpha del
receptor y por tanto interfiere con la unión de
IL-15 a su receptor inhibiendo la actividad de
proliferación de células T inducida por IL-15. El
péptido (Sec nº 1) que comprende aminoácidos de
IL-15 que interaccionan con
IL-15R\alpha imita el efecto de protección de
IL-15 de la apoptosis inducida por TNF\alpha, que
es mediada por unión de IL-15 a
IL-15R\alpha (Bulfone-Paus y col.,
The FASEB Journal, 1999, septiembre volumen 13).
Los resultados aquí obtenidos sugieren su uso
como una herramienta terapéutica en el tratamiento de enfermedades
asociadas con alta expresión de IL-15 anteriormente
citadas, donde está justificado el uso de antagonistas de
IL-15 y en aquellas patologías donde se necesita un
efecto de protección frente a apoptosis así como también en
patologías asociadas con la alta expresión de
IL-15R\alpha soluble. Igualmente los anticuerpos
que reconocen una región comprendida en Sec nº 1 en
IL-15 inhibirán la unión de IL-15 a
IL-15R\alpha y mostrarán un actividad antagonista
de IL-15 mediante inhibición de la unión de las
moléculas a dicha subunidad del receptor, por esta razón se podría
usar un péptido acoplado a una molécula vehículo o conjugado químico
MAP (péptido antigénico múltiple) para la obtención de anticuerpos
antagonistas de IL-15. La ayuda de la presente
invención se aplica también a ADN que codifica péptidos
anteriormente citados. Se puede usar también un vector que contiene
una secuencia de ADN que codifica el péptido de la presente
invención como una alternativa para la expresión de la secuencia de
péptido.
El péptido aquí descrito se puede usar en
combinación con otros agentes anti-inflamatorios e
inmunosupresores u otros antagonistas de citoquinas usados en
artritis reumatoides, psoriasis, enfermedad de Crohn, etc. El
péptido descrito se puede incluir en vacunas terapéuticas para
elucidar una respuesta humoral anti-IL15.
La presente invención consiste en la
identificación de una secuencia de IL-15 (Sec nº 1)
que interacciona con la subunidad \alpha del receptor. Tal
secuencia sintetizada como un péptido de 10 aminoácidos lineal
muestra la capacidad antagonista de IL-15 que
implica la inducción de proliferación de células T y un efecto
agonista que implica la protección frente a apoptosis inducida por
TNF\alpha.
Figura
1
IL-15R\alpha-Fc
reconoce el péptido 8 que corresponde a la Sec nº 1 y a un péptido 7
de menor extensión.
Figura
2
Se observó un desarrollo de color en esferas que
contienen péptido Sec nº 1 incubado con
IL-15R\alpha-Fc (R&D) a
5 \mug/ml.
5 \mug/ml.
- 2a)
- incubación de resina que contiene a) péptido no relacionado o b) resina que contiene péptido Sec nº 1 incubada con 15R\alpha-Fc (R&D).
- 2b)
- incubación de resina que contiene péptido Sec nº 1 con 15R\alpha-Fc (R&D) (a) o péptido Sec nº 1, IL 15R\alpha-Fc (R&D) en presencia de exceso de IL-15 (b).
Figura
3
- 3a)
- ensayo de CTLL-2 a diferentes concentraciones de IL-15 y una concentración de péptido fija de 260 \muM
- 3b)
- ensayo de CTLL-2 a concentraciones de péptido Sec nº 1 diferentes y una concentración de IL-15 fija de 300 pg/ml.
Figura
4
Se incubaron células con TNF\alpha (100 ng/ml)
solas o en combinación con péptido Sec nº 1 (260 \muM)
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar las realizaciones de la presente invención.
Ejemplo
1
Para identificar regiones de
IL-15 implicadas en la unión de
IL-15R\alpha se usó el enfoque de síntesis de
péptido por manchas como describieron previamente Frank y col. Se
llevó a cabo la derivación de papel Whatman 540 esterificando el
primer componente de anclaje,
Fmoc-\beta-Ala-OH,
usando N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) y
N-metilimidazol (NMI) en
N,N-dimetilformamida (DMF) seca. La disposición de
manchas en la membrana de celulosa se definió anclando el
Fmoc-\beta-Ala-OH
en las posiciones previamente marcadas, de acuerdo con el número
requerido de péptidos 10-méricos (22 péptidos, que
solapan en 5 residuos, 114 aminoácidos de secuencia de
IL-15). Además, se sintetizó un péptido de 10
aminoácidos no relacionados en la mancha 23 y también sobre la
mancha 24 se ancló únicamente
Fmoc-\beta-Ala-OH,
ambos como controles. Para el ensamblaje de todas estas moléculas
se usó la química de Fmoc-/tBu convencional. Después del ciclo final
de síntesis se desprotegieron el término N y las cadenas laterales
de todos los péptidos.
Se humedeció hoja de celulosa en etanol para
evitar posibles interacciones hidrófobas entre los péptidos sobre
la misma. Se intercambió etanol con solución salina tamponada con
Tris (TBS) (NaCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 7,6) mediante lavado
secuencial. Se bloqueó la unión no específica mediante incubación de
membrana durante la noche en 10 ml de tampón de bloqueo TBS (leche
en polvo al 5% en TBS). Se incubó subsiguientemente la hoja durante
3 horas con receptor \alpha de IL-15, se diluyó en
10 ml de tampón de muestra T-TBS (leche en polvo al
5%, 0,5% de Tween-20 en TBS). Para el suero se usó
dilución 1:50. Se preparó el receptor IL-15\alpha
a 5 \mug/ml, en la misma solución tampón. Se lavó hoja de celulosa
cuatro veces con tampón T-TBS. Luego se añadió un
conjugado de fosfatasa alcalina anti-IgG (específico
de Fc) (Sigma), diluido en tampón de muestra T-TBS,
durante 1 hora (dilución 1:25000 para la anti-IgG
humana en ensayo de receptor \alpha de IL-15. Se
lavó la hoja de celulosa cuatro veces de nuevo, con
T-TBS y se consiguió la detección de unión de
péptido incubando la membrana con 0,5 mg/ml de fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
(BCIP) (Sigma) en tampón sustrato (NaCl 100 mM, MgCl_{2} 2 mM,
Tris 100 mM, pH 8,9). Las manchas positivas desarrollaron un color
azul/violeta. Lavando con PBS se detuvo la tinción. Finalmente se
regeneró la hoja de celulosa para otros ensayos como se describió
previamente (Frank, R. (1992) Tetrahedron 48, 9217). Se observó el
reconocimiento de dos péptidos, 8 y 7. Como control experimental se
incubó la membrana con un anticuerpo monoclonal humanizado que
contiene la región Fc de la IgG1 humana. En este caso no se observó
reconocimiento de péptido alguno sobre la membrana.
Se lavó la resina
NH_{2}-Tentagel-S (0,24 mmol/g)
varias veces con diclorometano (DCM) y metanol. Luego se incubó en
una solución de ácido trifluoroacético (TFA) al 30% durante 10
minutos; se lavó varias veces con DCM y se incubó en
di-isopropiletilamina (DIEA) al 5% en DCM durante 1
minuto. Este procedimiento activó los grupos NH_{2} para la
síntesis. Después se lavó con DCM y se incubó en
di-metilformamida (DMF) durante 5 minutos para
sintetizar el péptido. Se usó la estrategia de Fmoc/tBu de síntesis
convencional. Las reacciones de acoplamiento fueron seguidas de
ensayo con ninhidrina. Una vez se completó la secuencia de péptido
Sec nº 1 se desprotegieron las cadenas laterales de aminoácidos,
dejándolas ancladas por su terminal C a la resina.
Se lavaron varias veces esferas de resina con
péptido anclado con solución salina (PBS). Se bloquearon las
interacciones no específicas con BSA (1%) en PBS durante 1 hora a
temperatura ambiente. Entonces, se incubaron estas con proteína de
fusión IL-15R\alpha-Fc (R&D
147-IR) a 5 \mug/ml en BSA (1% / PBS) durante 16
horas a 4ºC. Luego se lavaron las esferas en PBS tres veces durante
5 minutos con agitación y luego se incubaron con conjugado de
anti-Fc de IgG humana-fosfatasa
diluido 1:25000 en BSA (1% / PBS) durante tres horas a temperatura
ambiente. Se lavaron de forma extensiva con una solución salina
(TBS/Tween-20, 1%) y se incubaron con BCIP (0,45
mg/ml) en solución de sustrato (Tris 100 mM, pH 8,9; NaCl 100 mM;
MgCl2 2 mM) durante aproximadamente 30 minutos. Estas se lavaron
cuatro veces con PBS para detener la reacción. Se observó únicamente
un color azul intenso cuando se incubó la resina que contiene
péptido Sec nº 1 con la proteína
IL-15R\alpha-Fc y no cuando se
incubó una resina que contiene un péptido no relacionado con
IL-15R\alpha-Fc. En ese caso el
sustrato cromógeno no precipita y no desarrolla color. Igualmente no
se observó color en presencia de un exceso de IL-15
humana.
Se sintetizaron los péptidos por estrategia
Fmoc/tBu, usando resina Fmoc-AM-MBHA
a 0,54 mmol/g y protocolos de síntesis con agitación mecánica.
Después del tratamiento con TFA se liofilizó el péptido y se ensayó
mediante HPLC-EM.
La línea celular dependiente de citoquina
CTLL-2 prolifera en presencia de
IL-15. Las moléculas unidas a IL-15
que deterioran la transducción de señal dependiente del receptor
inhibirían esta proliferación de línea celular.
Para evaluar la capacidad de neutralización del
péptido de la presente invención se prepararon diluciones en serie
del mismo en placas de 96 pocillos (Costar, EEUU) en volumen de 25
\mul de medio RPMI (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al
10% (Gibco). Previamente se añadieron células CTLL-2
lavadas hasta 5 x 10^{3} células/pocillo y se incubó durante 30
minutos. Luego se añadieron a cada pocillo 300 pg de
IL-15. Se incubó la placa durante 72 horas con 5%
de CO_{2} y 37ºC. Se muestran los resultados en la figura 3b. Se
observa que el péptido designado como Sec nº 1 inhibió la
proliferación inducida por IL-15 con una CI_{50}
de 130 \muM. Para medir la proliferación de MTT se usó tinción
mitocondrial (Cosman y col. 1984, Nature, 312:
768-771). Se ha evaluado también el efecto
antagonista de 260 \muM de este péptido a diferentes
concentraciones de IL-15 (figura 3a). El efecto
inhibitorio del péptido fue dependiente de las dosis de
IL-15.
El ensayo de fragmentación de ADN permite
determinar la cantidad de ADN que se degrada tras tratamiento de
células con TNF-alfa. El ADN de la célula es marcado
radioactivamente mediante crecimiento de las células en presencia
de 3H-timidina de modo que se incorpora
3H-timidina radioactiva al ADN. Después de 24 horas
se trataron las células con tripsina/EDTA, se lavó y se sembró a
5000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Luego se
incubaron las células marcadas con TNF\alpha (100 ng/ml),
IL-15 (100 ng/ml), péptidos (260 \muM) o
combinaciones de TNF\alpha con diferentes péptidos.
Durante esta incubación el agente añadido (por
ejemplo, TNF\alpha induce a las células a morir por apoptosis y
en consecuencia la fragmentación del ADN mientras que el ADN de
células no tratadas se mantiene intacto). Después de 24 horas se
cosecharon las células: durante la cosecha se arrastraron las
células de los pocillos de la placa de 96 pocillos con agua
bidestilada: las células y orgánulos se rompen y el ADN de la célula
queda libre. Se pasan los fragmentos celulares y ADN a través de
una membrana filtrante (fibra de vidrio). Sólo las partículas
menores de 1,5 \mum pueden atravesar el filtro. De esto modo el
ADN intacto (con una longitud de fragmento en el intervalo de
milímetros o incluso centímetros) no será capaz de atravesar el
filtro pero se recogerá en la membrana filtrante. El ADN que se
escindió/degradó en fragmentos de aproximadamente 5000 bp o
inferior será suficientemente pequeño para atravesar los poros del
filtro y no se recogerá en el filtro. La membrana filtrante se secó
y se recuenta la cantidad de radioactividad (que corresponde a la
cantidad de ADN intacto) en un contador de centelleos. Se calculó
el porcentaje de fragmentación de ADN mediante comparación de la
radioactividad contada (conteos por minuto = cpm) de células que no
se trataron con el cpm en células que se trataron con agente. Como
resultado se observó que el péptido Sec nº 1 protegió de la
apoptosis inducida por TNF.
Se obtuvieron anticuerpos monoclonales tal como
lo describieron Georges Kohler y Cesar Millstein (Nature, 256:
495-497, 1975). Se usaron el péptido Sec nº 1
conjugado con KLH o un conjugado químico que contiene 4 moléculas
de este péptido para anticuerpos monoclonales producidos que se unen
e inhiben la actividad de IL-15.
Se inmunizaron ratones por vía subcutánea con un
péptido conjugado que se preparó para inyección mediante
emulsificación con adyuvante de Freund en cantidad de 10 a 100
\mug, seguido de inmunizaciones por vía subcutánea cada semana
con péptido en adyuvante de Freund incompleto. La respuesta inmune a
IL-15 se controló mediante ELISA. Se reforzaron
ratones con suficientes títulos de
anti-inmunoglobulina IL-15 por vía
intravenosa 3 días antes del sacrificio y la extirpación del bazo.
Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales para
IL-15 se usa el protocolo indicado publicado en
Nature, 256: 495-497, 1975. Se tamizaron los
hibridomas resultantes para la producción de anticuerpos
específicos para IL-15 o péptido mediante ELISA y
mediante efecto inhibitorio en la actividad de
IL-15 en el ensayo de CTLL-2. Se
inocularon los clones positivos en la cavidad peritoneal de ratones
singénicos para producir ascitis y se purificó el anticuerpo
monoclonal resultante mediante precipitación de sulfato de amonio y
cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a la
proteína A de Staphylococcus aureus.
Se evaluaron tres grupos en un esquema de
inmunización de monos, inmunizados con un péptido conjugado con una
proteína vehículo, péptido conjugado químicamente como un tetrámero
(MAP); y placebo. Se administraron las proteínas en cantidades de
100 \mug a 200 \mug por inoculación en adyuvante de Freund. Se
realizó la segunda inmunización un mes después y se realizó la
tercera inmunización dos meses después. Se extrajo sangre dos
semanas tras la segunda y tercera inmunización para evaluar el nivel
de anticuerpos anti-IL15 en el suero de monos. La
capacidad de neutralización de anticuerpos presentes en suero de
monos se ensayó mediante ensayo con CTLL-2 en
presencia de 300 pg de IL-15.
El péptido Sec nº 1 inhibe de forma selectiva la
unión de IL-15 a IL-15R\alpha.
El péptido Sec nº 1 antagoniza el efecto de
proliferación inducido por IL-15 en células T
(células CTLL-2) y además, es un agonista del
efecto protector de apoptosis de IL-15 en células
sensibles a apoptosis inducida por TNF\alpha.
<110> Center of Genetic Engineering and
Biotechnology
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Péptido antagonista de
IL-15
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<170> PatentIn ver. 2.1
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético que se une a la cadena de
IL-15R\alpha
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (13)
1. Péptido antagonista de la actividad de
IL-15 caracterizado porque consiste en una
secuencia de aminoácidos como se establece en la Sec ID nº 1.
2. Péptido de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado por su unión a la subunidad celular
IL-15R\alpha o su fracción soluble.
3. Péptido de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado por su inhibición de la actividad biológica de
IL-15 dependiente de IL-15R\alpha
de acuerdo con la reivindicación 2.
4. Péptido de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por ser un componente
activo de la formulación farmacéutica capaz de inhibir la actividad
biológica de IL-15 dependiente de
IL-15R\alpha celular.
5. Péptido de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se obtiene
mediante manipulación genética o mediante síntesis química.
6. Cadena de ácido nucleico caracterizada
porque codifica un péptido de la reivindicación 1.
7. Cadena de ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 6 como parte de un vector de expresión.
8. Formulación farmacéutica caracterizada
porque es una formulación terapéutica capaz de inhibir la actividad
biológica de IL-15 dependiente de
IL-15R\alpha y porque contiene un péptido de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, sola,
conjugada o combinada.
9. Formulación farmacéutica caracterizada
porque es una formulación terapéutica capaz de inhibir la actividad
biológica de IL-15 dependiente de
IL-15R\alpha celular y porque contiene una cadena
de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.
10. Formulación de vacuna caracterizada
porque es una vacuna terapéutica que contiene un péptido de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y es capaz de
elucidar una respuesta inhibitoria de la actividad biológica de
IL-15 dependiente de IL-15R\alpha
celular.
11. Uso de un péptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de artritis reumatoide, enfermedad
de Crohn o psoriasis.
12. Anticuerpo monoclonal que reconoce el
péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
5.
13. Uso del anticuerpo monoclonal de acuerdo con
la reivindicación 12 para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de artritis reumatoide, enfermedad de Crohn y
psoriasis.
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