BRPI0515403B1

BRPI0515403B1 - Formulação farmacêutica capaz de inibir a atividade biológica da il-15, e, formulação de vacina

Info

Publication number: BRPI0515403B1
Application number: BRPI0515403-0A
Authority: BR
Inventors: Alicia Santos Savio; Ania Cabrales Rico; Osvaldo Reyes Acosta; Haydee Gerónimo Pérez; Celia Aurora Arrieta Agüero; Silvio Ernesto Perea Rodríguez
Original assignee: Centro De Ingeniería Genética Y Biotecnología
Priority date: 2004-09-17
Filing date: 2005-09-16
Publication date: 2019-03-26
Also published as: JP2008512994A; AU2005284529B2; AR051924A1; CA2579798A1; DE602005015131D1; US7736638B2; WO2006029578A1; CA2579798C; CN101120015A; KR101254113B1; JP4750795B2; AU2005284529A1; US20090136511A1; CN101120015B; MX2007002996A; RU2396276C2; BRPI0515403A; RU2007114288A; ATE434623T1; BRPI0515403B8

Abstract

peptídeo, corrente de ácido nucleico, formulação farmacêutica, formulação de vacina, anticorpo monoclonal e usos do peptídeo e do anticorpo monoclonal a presente invenção se relaciona com o ramo da farmacologia molecular e em particular com um peptídeo pertencente à seqüência da interleucina- 15 (il- 15), que é capaz de inibir a atividade biológica desta molécula; análogos ou miméticos do dito peptídeo. na presente invenção mostra-se que o peptídeo ao unir-se à subunidade alfa do receptor (il- 15r) inibe a proliferação de células t induzida pela il- 15 e a apoptose mediada por tnf. a invenção se relaciona além disso com o uso do peptídeo no tratamento de patologias onde a expressão anormal da il-15 ou il-15r está relacionada com o curso da doença.

Description

“FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA CAPAZ DE INIBIR A ATIVIDADE BIOLÓGICA DA IL-15, E, FORMULAÇÃO DE VACINA”

Campo da técnica

A presente invenção se relaciona com o ramo da farmacologia molecular e em particular se refere a um peptídeo da interleucina-15 (IL-15), que impede a união da citocina à subunidade alfa do receptor, o que pode ser útil para o tratamento de doenças relacionadas com a expressão anormal da IL-15 ou da IL-15Ra em curso da doença.

Técnica anterior

A citocina conhecida como IL-15 é uma glicoproteína de ΜΙ 5 kDa, que foi identificada simultaneamente por dois grupos, como um fator que ativa células T (Grabstein, K.H. et al., Science 1994, 264, 965 e Burton, J.D.et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 1994, 91 , 4935). O RNAm da IL-15 está presente numa ampla variedade de células e tecidos, porém a proteína é raramente encontrada no sobrenadante de cultivo destas células que expressam o transcrito já que existe um forte controle pós-transcricional de sua expressão ao nível da tradução e o tráfego intracelular (Bamford RN. Y col, J. Immunol 1998, 160: 4418-4426), (Kurys G, Y col, J Biol Chem 2000, 275 : 30653-30659). Além disso descreveu-se que a IL-15 pode existir em forma ativa como uma proteína de membrana (Musso Y col. Blood,Vol 93, No 10 (May 15), 1999: pp 3531-3539) e mais recentemente observou-se que pode funcionar como ligando ou como receptor (Budalgian Y col, JBC, Jul 28 manuscrito em impressão) e induzir por esta via a secreção de citocinas proinflamatórias.

Altos níveis de expressão da proteína solúvel foram encontrados associados a patogênese de doenças autoimunes e inflamatórias. A IL-15 foi detectada no curso de várias doenças incluindo a doença de

Petição 870190000402, de 03/01/2019, pág. 9/13

Crohrfs (Kirman L, 1996, Am. J. Gastroenterol. 91, 1789), Psoríase (Rückert R. 2000, 165: 2240-2250), Leucemias (Yamada E. 1999, Leukemia and Limphoma, 35(1-2): 37-45 e Artrite reumatóide (AR), (Mclnnes LB. 1998, Immunology Today, 19, 75-79). A união da IL-15 ao receptor de células T 5 induz a expressão de vários antígenos de ativação e moléculas de adesão como CD69, CD25, e TNFRII, ICAM-1 e LAF-1. A IL-15 também atua como um potente quimiotático de células T (Wilkinson 1995, J. Exp. Med. 181, 1255-1259). Tudo isto sugere que a IL-15 expressada por células apresentadoras de antígeno possa ser importante na ativação temporã de

células T no lugar da inflamação. Mclnnes e col encontraram anormalidades na expressão da IL-15 em AR altas concentrações no fluido sinovial e a expressão da citocina em células da membrana sinovial. Eles sugeriram que a IL-15 precede ao TNFa na cascata de citocinas, propondo um mecanismo dependente do contato celular no qual células T ativadas por IL-15 induzem a síntese de TNFa por macrófagos. Propõe-se além disso, que a IL-15 atua como um fator importante na migração de células T para o fluido sinovial. Mclnnes, 1997, NatMed, 3: 189-195).

Ziolkowska e col. informaram que a IL-15 induz a expressão

de IL-17 na articulação de pacientes com AR e sabe-se que esta citocina estimula a libertação por sinoviócitos de mediadores da inflamação como IL6, IL-8, GM-CSF, e prostaglandina E2 sugerindo um papel importante a IL-15 na patogênese da AR. (Ziolkowska e col 2000, J Immunol, 164: 2832-2838).

O recrutamento e ativação de células T sinoviais pode ocorrer como conseqüência da síntese local de IL-15 e tal ativação não específica pode trazer como resultado a perpetuação da inflamação. Tudo isso sugere que a ação de um antagonista da IL-15 possa ter um potencial terapêutico no tratamento desta e outras doenças autoimunes e inflamatórias.

Os efeitos biológicos da IL-15 são mediados através da união a um receptor na membrana celular composto por três subunidades α,β, e γ A

IL-15Ro» é uma subunidade específica para esta citocina a qual se une com muito alta afinidade Kd IO’¹¹ e pode encontrar-se como receptor de membrana ou em forma solúvel (Budagian V. e col. 2004, JBC, em impressão e Mortier e col. The Joumal of Immunology, 2004, 173: 1681-1688.). A subunidade β e 5 γ do receptor é compartilhada com a IL-2, citocina com a qual a IL-15 apresenta uma alta homologia estrutural. Descreveu-se previamente que o Aspártico 56 da molécula de IL-15 é importante na união à subunidade β do receptor e que a Glutamina 156 é importante na união à subunidade γ do receptor. Muteínas destes aminoácidos se comportam como moléculas

antagonistas da IL-15 que se unem à subunidade a do receptor e impedem a tradução de sinal através das subunidades β e γ. Anticorpos que reconhecem estes aminoácidos também atuam como antagonistas da IL-15. (US6177079,

US6168783, US6013480, US6001973, US9706931, WO9741232).

Ruchatz e col. (Ruchatz H. 1998, J. Immunol. 160 : 565415 5660) geraram um fragmento solúvel da subunidade alfa do receptor murino (IL-15Ra) e demonstraram que a administração deste fragmento inibe a artrite induzida por colágeno em ratos DBA/1.

A companhia Genmab possui a patente de anticorpos humanos

específicos para IL-15, WO 03017935, onde descreve 4 anticorpos, 2 deles o

146B7 e ο 146H5 se unem à IL-15 na região que interage com a subunidade γ do receptor e inibem a proliferação celular induzida por IL-15 da linhagem

CTLL-2 e em PBMC (células mononucleares de sangue periférico), e os anticorpos 404A8 e 404E4 que não inibem a proliferação. Destes anticorpos o

146B7, encontra-se em Fase clínica II em AR pela companhia Amgen com a denominação AMG714.

Recentemente identificou-se duas seqüências da IL-15 de união à subunidade a do receptor, desde o aminoácido 44 ao 52 e desde o aminoácido 64 ao 68, por Bemard e colaboradores, JBC 2004, 279 (23), 24313-24322 e eles descrevem muteínas que podem atuar como agonistas ou

·· · ♦ · • · · antagonistas da IL-15,

Até hoje não se descreveu peptídeos antagonistas da IL-15. A aplicação de um peptídeo de pequeno tamanho (10 aa) como antagonista de IL-15 tem a vantagem de bloquear seletivamente a união da IL-15 à 5 subunidade a do receptor e mediar ou impedir os efeitos da IL-15 devidos à interação com dita subunidade receptora. Por exemplo como se descreve na presente invenção o peptídeo identificado como Sec. No.l constitui uma região de 10 aminoácidos da IL-15 que se identifica como a região que interage com a subunidade a do receptor. Dito peptídeo se une à proteína de

fusão IL-15Ra-Fc (Fig 2), inibe a proliferação da linhagem CTLL-2 dependente de IL-15 (Fig 3a e 3b) e protege da apoptose induzida por TNFa (Fig 4), efeito mediado pela união de IL-15 na cadência a do receptor. Este último efeito permite seu uso em doenças onde se precisa inibir o processo de apoptose ao mimificar a atividade de IL-15 de proteger da apoptose.

Igualmente, este peptídeo ao unir-se à corrente alfa solúvel como se descreve na presente invenção podería inibir o efeito de sinalização inversa através da

IL-15 de membrana referido em JBC, 2004 Budalgian e col, Jul 28

manuscrito em impressão.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Particularmente a invenção se refere à identificação de uma região da IL-15 capaz de unir-se à subunidade receptora IL-15Ra. O peptídeo que compreende a dita região identificada aqui como Sec. No. 1 foi sintetizado quimicamente e mostra capacidade de união à IL-15 Ra-Fc (Fig 2), inibe a proliferação em CTLL-2 induzida por IL-15 (Fig 3) e protege da 25 fragmentação do DNA induzida por TNFa (Fig 4).

A invenção também inclui qualquer variante homóloga ou mimética do peptídeo anterior, que tenha sido obtida por via sintética ou recombinante, bem como qualquer formulação que o contenha.

A invenção igualmente contempla o uso do mencionado // peptídeo, sozinho ou em combinação com alguma outra molécula apropriada, como, por exemplo, drogas esteroidais antiinflamatórias (exemplo, corticosteróides), drogas modificadoras do curso da doença (ex: metotrexato) ou antagonistas de outras citocinas, usadas no tratamento da artrite 5 reumatóide e o uso do peptídeo para inibir a união da IL-15 à subunidade alfa do receptor membranário e solúvel.

O peptídeo da invenção tem uma estrutura linear e se caracteriza fundamentalmente por sua capacidade antagonista da IL-15. Por outro lado, demonstra-se o efeito in vitro que produz o peptídeo objeto da 10 presente invenção em um ensaio celular de proliferação em células CTLL-2, e em um ensaio de inibição de apoptose induzida por TNFcv.

Para a definição do peptídeo descrito se uso a técnica de mapeamento em filtro de celulose que contém a seqüência da IL-15 humana empeptídeos seqüenciais de 10 aminoácidos sobrepostos em 5 aminoácidos.

Na invenção o peptídeo Sec. No. 1, foi sintetizado quimicamente pelo método de fase sólida, foi purificado por HPLC, analisado por espectrometria de massas e finalmente avaliado quanto a sua efetividade sobre a atividade da IL-15.

Os resultados mostrados na presente invenção indicam que a região identificada e sintetizada como um peptídeo de 10 aminoácidos (Sec.

No.l) corresponde com a região da IL-15 que interage com a subunidade receptora a e portanto interfere com a união de IL-15 ao receptor inibindo a atividade da IL-15 de induzir a proliferação de células T.

O peptídeo (Sec. No.l) correspondente aos aminoácidos que interagem com IL-15Ra de IL-15 mimifica o efeito da IL-15 de proteger da apoptose induzida por TNFo, que é mediado por união da IL-15 à IL-15Ra (Bulfone-Paus e col. The FASEB Joumal, 1999, September Vol. 13).

Os resultados obtidos sugerem seu emprego como ferramenta terapêutica no tratamento de doenças relacionadas com uma sobre-expressão • · « da IL-15 como as mencionadas anteriormente, nas quais se justifica o emprego de antagonistas da IL-15 e naquelas patologias onde se necessita do efeito protetor de apoptose, bem como em patologias relacionadas com a expressão de IL-15Ra solúvel. Igualmente anticorpos que reconheçam a 5 região compreendida pela seqüência Sec. No.l, na IL-15 inibirão a união da

IL-15 à IL-15Ra e mostraram atividade antagonista da IL-15 inibindo a união da molécula a dita subunidade receptora pelo que o peptídeo acoplado a uma molécula portadora ou conjugados químicos do peptídeo (MAP, multiantigenic peptide) pode ser empregado na obtenção de anticorpos

antagonistas da IL-15.

O objeto desta invenção é extensivo também ao DNA que codifica para o peptídeo descrito aqui. Um vetor que contenha a seqüência de

DNA que codifica para o peptídeo da presente invenção pode também ser usado como alternativa para a expressão da seqüência peptídica.

O peptídeo descrito pode ser utilizado em combinação com outros agentes antiinflamatórios, imunossupressores ou antagonistas de outras citocinas usados no tratamento da AR, Psoríase e na doença de Chron, entre outras.

O peptídeo descrito pode ser utilizado na composição de vacinas terapêuticas para gerar uma resposta humoral anti IL-15.

Essência da invenção.

A presente invenção consiste na identificação de uma seqüência da IL-15, (Sec. No.l), que interage com a subunidade a do receptor. A dita seqüência sintetizada como um peptídeo linear de 10 25 aminoácidos mostra a capacidade antagonista da IL-15 com respeito à indução da proliferação de células T e efeito agonista quanto à proteção da apoptose por TNF alfa.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:

Figura 1: Mapeamento em filtro de papel da IL-15R. Observa-

se o reconhecimento do peptídeo 8 correspondente a Sec No 1 e em menor extensão do peptídeo 7 pela molécula IL-15Ra-Fc

Figura 2: Ensaio colorimétrico em pérolas Tentagel S, observa-se desenvolvimento de cor nas pérolas que contêm o peptídeo Sec No 5 1 incubando com a IL- 15Ra-Fc (R&D) a 5ug/ML

2a) Incubação da resina que contém um peptídeo não relacionado (a) e o peptídeo Sec No 1 (b) com 15Ra-Fc (R&D)

2b) Incubação da resina que contém peptídeo Sec No 1 com

15Ra-Fc (R&D) (a) e com 15Ra-Fc (R&D) em presença de um excesso de

Figura 3: Ensaio de proliferação em CTLL-2 com IL-15 humana de R&D, atividade especifica de 10⁸ Ul/mg

3a) Ensaio CTLL-2 a diferentes concentrações de IL-15 e uma concentração fixa de peptídeos 260μΜ.

3b) Ensaio CTLL-2 a diferentes concentrações de peptídeo 8 (Sec. ID No 1) e uma concentração fixa de IL-15 de 300 pg/ML

Figura 4: Ensaio de indução de apoptose em células L929, incubando com 100 ng/ML de TNFcv sozinho ou em combinação com 260μΜ

de peptídeo.

EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO

A presente invenção se explica através dos seguintes exemplos de realização:

Exemplo 1: A. Identificação da região de união à IL-15Ra. Mapeamento em filtro de papel de IL-15Ra.

Síntese dos peptídeos decaméricos correspondentes à seqüência aminoácida da IL-15 sobre suporte de celulose.

Utilizou-se a estratégia de Síntese Múltipla em Fase Sólida sobre Suporte de Celulose descrita anteriormente por Frank et al. A derivatização do papel Whatman 540 foi realizada esterificando o espaçador

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Fmoc-0-Ala-OH com o emprego de Ν,Ν’-Diisopropilcarbodiimida (DIC) e N-metilimidazol (NM1), em Ν,Ν-diimetilformamida (DMF) anidra. A localização das manchas sobre a membrana de celulose foi definida com a ancoragem deste próprio aminoácido nas posições previamente marcadas, de 5 acordo com o número de peptídeos requeridos para mapear a proteína 22 peptídeos de 10 aminoácidos que se sobrepõem em 5 aminoácidos.

Além disso sintetizou-se um peptídeo não relacionado de 10 aminoácidos na mancha #23, e deixou-se a mancha #24 somente com o espaçador, à maneira de controle nos experimentos. Para a síntese utilizou-se

o procedimento Fmoc-/tBu padrão. Ao concluir o último ciclo de síntese, desprotegeu-se o N-terminal e as cadeias laterais de todos os peptídeos.

Ensaio biológico sobre a membrana de celulose para a IL-15Rol

A membrana foi lavada com etanol para prevenir as possíveis interações hidrofóbicas entre os peptídeos. Posteriormente lavou-se três vezes com solução salina de Tris (TBS) (10 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl); e a união não específica foi bloqueada incubando durante a noite em 10 mL de tampão de bloqueio 5% de leite, em TBS. A membrana foi incubada 3 horas com a IL-15Ra-Fc, diluída em 10 mL de tampão de amostra T-TBS (5% de

leite, 0,5% Tween-20, em TBS). A proteína de fusão IL-15Ra-Fc foi incubada a uma concentração de 5 gg/mL na mesma solução tampão. A membrana foi lavada quatro vezes com solução de lavagens. Depois foi incubada com o conjugado anti FcIgG humana -Fosfatase alcalina, a uma diluição de 1 em 25000 em tampão de amostra, por espaço de 1 hora. A membrana foi lavada novamente com solução de lavagens 4 vezes por 5 minutos. A detecção foi levada a cabo incubando com 5-Bromo, 4-Cloro, 3-Indolil Fosfato (BCIP), a uma concentração de 0.5 mg/mL em tampão substrato (100 mM Tris, pH 8,9; 100 mM NaCl; 2 mM MgCl₂). As manchas positivas se tingiram de cor azul com diferentes tons de intensidade, de acordo com o grau de interação dos peptídeos. Na incubação com IL-15Ra-Fc (IgGI humana) observou-se

reconhecimento do peptídeo 8 e em menor intensidade do peptídeo 7. Detevese a reação lavando com solução salina PBS.

A membrana de celulose foi regenerada finalmente para poder utilizá-la em ensaios posteriores como se descreveu previamente. Como 5 experimentos controles realizou-se a incubação com um anticorpo humanizado que contém a região Fc da IgGl humana, e em nenhum caso houve reconhecimento dos peptídeos da membrana. (Frank, R, (1992) Tetrahedron 48, 9217-9232).

Ensaio colorimétrico em pérolas que demonstra a união do

peptídeo aIL-15Ra

Síntese do peptídeo #8 do mapeamento da IL-15, sobre a resina NH₂-Tentagel- S.

A resina NH₂-Tentagel-S (0.24 mmol/g) foi lavada com Diclorometano (DCM) e Metanol várias vezes. Depois manteve-se a mesma em uma solução de ácido trifluoracético (TFA) a 30% em DCM por 10 minutos; lavou-se com DCM várias vezes; e deixou-se em

Diisopropiletilamina (DIEA) a 5% em DCM por 1 minuto. Com este procedimento se ativaram os grupos NH₂ para a síntese. Posteriormente se

lavou com DCM e se deixou em Dimetilformamida (DMF) anidra por 5 minutos, para proceder a síntese do peptídeo. A estratégia de síntese utilizada foi a Fmoc/tBu convencional. As reações de acoplamento se seguiram pela prova de Ninidrina. Ao completar-se a seqüência do peptídeo Sec. No.l, se desprotegeram as cadeias laterais dos aminoácidos, ficando este ancorado à resina pelo extremo C- terminal.

Ensaio sobre pérolas.

As pérolas de resina com o peptídeo ancorado foram lavadas várias vezes com solução salina (PBS IX). A interação não específica foi bloqueada com BS A a 1% em PBS, durante uma hora a temperatura ambiente. Depois foram incubadas por toda uma noite a 4°C com a proteína ή(ο de fusão IL-15Ra-Fc (R&D 147-IR), em BS A a 1% em PBS, a uma concentração de 5 /zg/mL. Posteriormente foram lavadas com PBS 3 vezes por 5 minutos, com agitação; e foram incubadas com o conjugado anti-Fc IgG humano-fosfatase, diluído 1:25000 em BSA a 1% em PBS, por 3 horas a 5 temperatura ambiente. Foram lavadas exaustivamente com uma solução salina de Tris (TBS/Tween-20 a 1%), e foram incubadas com BCIP (0.45 mg/mL) em solução substrato (100 MM Tris, PH 8.9; 100 MM NaCI; 2 mM MgC12) aproximadamente 30 minutos. Para deter a reação lavou-se com PBS quatro vezes. Observa-se uma cor azul intensa como resultado do experimento de

incubação da resina que contém o peptídeo Sec. No.l incubado com a proteína IL-15Ra-Fc e não assim no caso da resina que contém um peptídeo não relacionado incubado com IL-15RO, onde o substrato cromogêneo não precipita, e portanto não há tingimento. Igualmente não se observa tingimento na resina que contém o peptídeo Sec. No.l incubado com a proteína IL-15Ra15 Fc em presença de um excesso de IL-15 humana.

Síntese de peptídeos

Os peptídeos foram sintetizados pela estratégia Fmoc/tBu em seringas. Utilizou-se a resina Fmoc-AM-MBHA (0,54 mmol/g) e seguiu-se o

protocolo de síntese com agitação mecânica. Depois do tratamento com TFA, o peptídeo foi liofilizado e caracterizado por HPLC e espectrometria de massa.

Exemplo 2: Efeito dos peptídeos descritos sobre a proliferação da linhagem CTLL-2

A linhagem CTLL-2 dependente de citocinas, prolifera em 25 presença de IL-15. Moléculas que se unam à IL-15 e impeçam a tradução de sinal através de receptor inibem a proliferação desta linha.

Para avaliar a capacidade neutralizante dos peptídeos da presente invenção se realizaram diluições seriadas dos mesmos em placas de cultivo de 96 cavidades (Costar, USA) em um volume de 25 /zL de meio

RPMI(Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco), adicionaram-se as células CTLL-2 previamente lavadas a 5 x 10³ células por cavidade e permitiu-se a encubaçao por 30 min, depois uma quantidade saturante de IL-15 de 300 pg/mL foi adicionada a cada cavidade.

Avaliou-se também a capacidade antagonistas dos peptídeos variando a concentração de IL-15 a uma concentração fixa de peptídeo de 260 uM. Foi incubou por 72 h a 37°C e 5% de CO2 . Para medir a proliferação se usou o tingimento mitocondrial MTT (Cosman e col 1984, Nature, 312: 768771). Observou-se que o peptídeo referido como Sec. No.l inibe a

proliferação por IL-15 com uma IC₅o de 130 μΜ a 300 pg/ML de IL-15.

Exemplo 3: Indução de apoptose em L929

As células L929 em fase exponencial de crescimento foram marcadas com Timidita H3, por 24 horas. Trata-se come tripsina e semeia-se a 5000 células por cavidade em placas de 96 cavidades. Trata-se com 100 ng/mL de TNFa, com IL-15 a 100 ng/mL ou com os peptídeos a uma concentração de 260μΜ ou diluições seriadas do peptídeo. Às 24 horas de incubação. Retira-se o sobrenadante e se adiciona 50 pL de Tripsina/EDTA até que as células se desprendam e se restitui o sobrenadante à cavidade

correspondente. Coleta-se num coletor em uma membrana de filtro. Neste processo os fragmentos de DNA, partículas menores de 1.5 μΜ (DNA de

5000 pb ou menos) passam através da membrana de filtro. Realiza-se o cálculo de radiatividade em um contador beta e se calcula a fragmentação do DNA. Observou-se proteção da apoptose induzida por TNFa a 100 ng/ML em presença do peptídeo Sec.No.l

Exemplo 4: Preparação de anticorpos monoclonais

Os AcM reportados na presente invenção foram obtidos acordo com os princípios originalmente descritos por Georges Kohler e Cesar

Milstein (Nature, 256:495-497, 1975). Uma preparação do peptídeo Sec No 1 acoplado a KLH ou como um conjugado químico que contém 4 moléculas do

peptídeo foi empregado para gerar anticorpos monoclonais que se unem à IL15 e inibem sua atividade.

Imunizou-se ratos Balb/c utilizando como imunogene peptídeo conjugado e emulsionado com adjuvante completo de Freund em quantidades 5 de 10 a 100 microgramas por via subcutânea, aos 15 dias se repetiu a imunização preparando o imunogene em adjuvante incompleto de Freund e se pré-imunizou periodicamente cada 15 dias e se avaliou a presença de anticorpos anti IL-15 mediante ensaio ELISA. Aos animais positivos lhes foi administrado o antígeno por via intravenosa em solução salina e três dias

depois eles foram sacrificados para extrair os esplenócitos e se seguiu o procedimento de obtenção de hibridomas referido anteriormente. Os hibridomas secretores foram selecionados mediante um ensaio ELISA avaliando o reconhecimento da IL-15 humana e por inibir a atividade proliferativa da IL-15 na linha CTLL-2.

Os clones positivos forma inoculados na cavidade peritoneal de ratos singênicos para produzir ascite e o anticorpo monoclonal resultante foi purificado por precipitação com sulfato de amônia e cromatografía de afinidade baseada na união do anticorpo a Proteína A de Staphylococcus aureus.

Φ 20

Exemplo 5: Avaliação do peptídeo Sec No 1 na geração de anticorpos neutralizantes em macacos macacus irus.

Realizou-se um esquema de imunização em macacos macacus irus onde se avaliaram 3 grupos, os imunizados com peptídeo conjugado a um portador, os imunizados com peptídeos conjugados quimicamente como 25 tetrâmero (MAP) e placebos. Ministraram-se em quantidades de 100 jug-200 /ig por inoculação em adjuvante. No mês se realizou uma segunda imunização e passados dois meses se realizou uma terceira imunização. Realizaram-se extrações de sangue uma semana depois da segunda e da terceira imunização para avaliar o nível de anticorpos anti IL-15 presente no soro dos macacos. A

avaliação da atividade neutralizante do soro se realizou segundo o ensaio CTLL-2 descrito no exemplo 2 mas realizando diluições seriadas do soro e uma concentração fixa de 300 pg/ML de IL-15.

Vantagens da solução proposta

O peptídeo Sec No. 1 inibe seletivamente a união à subunidade a do receptor.

O peptídeo Sec No. 1 antagoniza o efeito de indução da proliferação por IL-15 em células T e tem, além disso, um efeito agonista de IL-15 em células susceptíveis à apoptose por TNF alfa.

Claims

1. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de ser uma formulação terapêutica capaz de inibir a atividade biológica da IL-15 dependente da subunidade alfa do receptor celular da interleucina-15 e

5 contém um peptídeo que consiste de uma sequência de aminoácidos descrita como SEQ ID No. 1, só, conjugado ou misturado.

2. Formulação de vacina, caracterizada pelo fato de ser uma vacina terapêutica que contém um peptídeo que consiste de uma sequência de aminoácidos descrita como SEQ ID No. 1, e que é capaz de gerar uma

10 resposta inibidora da atividade biológica da IL-15 dependente da subunidade alfa do receptor celular da interleucina-15.