ES2328796T3

ES2328796T3 - Interaccion tsg101-gag y uso de la misma.

Info

Publication number: ES2328796T3
Application number: ES02726648T
Authority: ES
Inventors: Daniel Albert Wettstein; Scott Morham; Kenton Zavitz
Original assignee: Myriad Genetics Inc
Current assignee: Myriad Genetics Inc
Priority date: 2001-03-14
Filing date: 2002-03-14
Publication date: 2009-11-18
Anticipated expiration: 2022-03-14
Also published as: EP1377165B1; CA2441071A1; EP1377165A2; AU2002257067A1; EP1377165A4; DE60232785D1; CA2441071C; WO2002072790A2; ATE434936T1; JP2004533815A; WO2002072790A3; JP2009269918A

Abstract

Un complejo proteico que comprende una primera proteína que interacciona con una segunda proteína, donde (a) la primera proteína es (i) un fragmento de Tsg101 que comprende el dominio UEV, (ii) un homólogo de Tsg101 que comprende un dominio UEV y tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 75% a la siguiente secuencia de aminoácidos: y que puede interaccionar con GAGp6 de VIH; (iii) un fragmento de (ii) que comprende el dominio UEV y que puede interacionar con GAGp6 de VIH; o (iv) una proteína de fusión que contiene (i), (ii) o (iii), y (b) la segunda proteína es (1) un polipéptido GAG de VIH, (2) un homólogo de (1) que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 75% a la siguiente secuencia de aminoácidos: y que puede interaccionar con Tsg101, (3) un fragmento de (1) o (2) que puede interaccionar con Tsg101, (4) un polipéptido GAG de retrovirus que puede interaccionar con Tsg101, (5) un fragmento de (4) que contiene un motivo de dominio tardío P(T/S)AP, o (6) una proteína de fusión que contiene uno cualquiera de (1) a (5).

Description

Interacción Tsg101-GAG y uso de la misma.

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente a interacciones proteína-proteína, y al uso de las mismas en la selección de fármacos y el tratamiento de enfermedades.

Antecedentes de la invención

En contraste con la visión tradicional de la función proteica, que se centra en la acción de una única molécula de proteína, una vista expandida moderna de la función proteica define una proteína como un elemento en una red de interacción. Véase Eisenberg et al., Nature, 405:823-826 (2000). Es decir, una comprensión completa de las funciones de una proteína requerirá el conocimiento no sólo de las características de la propia proteína, sino también de sus interacciones o conexiones con otras proteínas en la misma red de interacción. En esencia, las interacciones proteína-proteína forman la base de casi todos los procesos biológicos, y cada proceso biológico se compone de una red de proteínas que interaccionan. Por ejemplo, las estructuras celulares tales como citoesqueletos, poros nucleares, centrosomas y cinetocoros están formadas por interacciones complejas entre una multitud de proteínas. Muchas reacciones enzimáticas están asociadas a grandes complejos proteicos formados por interacciones entre enzimas, sustratos de proteínas y moduladores de proteínas. Además, las interacciones proteína-proteína también son parte de los mecanismos de transducción de señales y otras funciones celulares básicas tales como replicación, transcripción y traducción del ADN. Por ejemplo, el complejo procedimiento de iniciación de la transcripción requiere generalmente interacciones proteína-proteína entre numerosos factores de transcripción, ARN polimerasa y otras proteínas. Véase por ejemplo, Tjian y Maniatis, Cell, 77:5-8 (1994).

Debido a que la mayoría de las proteínas funcionan a través de sus interacciones con otras proteínas, si una proteína de prueba interacciona con una proteína conocida, puede predecirse razonablemente que la proteína de prueba está asociada a las funciones de la proteína conocida, por ejemplo, en la misma estructura celular o el mismo proceso celular que la proteína conocida. Así, los componentes de interacción pueden proporcionar un entendimiento inmediato y fiable sobre las funciones de las proteínas que interaccionan. Identificando las proteínas que interaccionan, puede lograrse un mejor entendimiento de las rutas patológicas y los procesos celulares que dan como resultado enfermedades, y pueden identificarse importantes reguladores y posibles dianas para fármacos en las rutas patológicas.

Ha habido mucho interés sobre las interacciones proteína-proteína en el campo de la proteómica. Se han usado varios enfoques bioquímicos para identificar proteínas que interaccionan. Estos enfoques emplean generalmente las afinidades entre las proteínas que interaccionan para aislar proteínas en estado unido. Los ejemplos de tales métodos incluyen coinmunoprecipitación y copurificación, combinados opcionalmente con reticulación para estabilizar la unión. Pueden caracterizarse las identidades de los componentes proteicos que interaccionan aislados mediante, por ejemplo, espectrometría de masas. Véase por ejemplo, Rout et al., J. Cell. Biol., 148:635-651 (2000); Houry et al., Nature, 402:147-154 (1999); Winter et al., Curr. Biol., 7:517-529 (1997). Un enfoque popular útil en la selección a gran escala es el método de exposición en fago, en el que se preparan partículas de bacteriófagos filamentosos mediante tecnologías de ADN recombinante para expresar un péptido o proteína de interés fusionado con una proteína de la cápside o de la cubierta del bacteriófago. Puede expresarse una biblioteca completa de péptidos o proteínas de interés y puede usarse una proteína cebo para examinar la biblioteca para identificar péptidos o proteínas que pueden unirse a la proteína cebo. Véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses números 5.223.409; 5.403.484; 5.571.698; y 5.837.500. Notablemente, el método de exposición en fago sólo identifica aquellas proteínas que pueden interaccionar en un entorno in vitro, mientras que los métodos de coinmunoprecipitación y copurificación no son adecuados para una selección de alto rendimiento.

El sistema de doble híbrido en levadura es un método genético que supera ciertos defectos de los enfoques anteriores. El sistema de doble híbrido en levadura ha demostrado ser un método poderoso para el descubrimiento de interacciones proteicas específicas in vivo. Véase en general, Bartel y Fields, eds., The Yeast Two Hybrid System, Oxford University Press, Nueva York, NY, 1997. La técnica de doble híbrido en levadura se basa en el hecho de que el dominio de unión a ADN y el dominio de activación transcripcional de un activador transcripcional contenido en diferentes proteínas de fusión pueden activar aún la transcripción génica cuando se ponen próximos entre sí. En un sistema de doble híbrido en levadura, se expresan dos proteínas de fusión en células de levadura. Una tiene un dominio de unión a ADN de un activador transcripcional fusionado con una proteína de prueba. Por otro lado, la otra incluye un dominio de activación transcripcional del activador transcripcional fusionado con otra proteína de prueba. Si las dos proteínas de prueba interaccionan entre sí in vivo, los dos dominios del activador transcripcional se ponen en contacto, reconstituyendo el activador transcripcional y activando un gen indicador controlado por el activador transcripcional Véase, por ejemplo, la patente estadounidense número 5.283.173.

Debido a su simplicidad, eficacia y fiabilidad, el sistema de doble híbrido en levadura ha conseguido una popularidad enorme en muchas áreas de investigación. Además, las células de levadura son células eucariotas. Las interacciones entre proteínas de mamíferos detectadas en el sistema de doble híbrido en levadura son interacciones auténticas que se producen en las células de mamíferos en condiciones fisiológicas. Como una cuestión de hecho, se han identificado numerosas interacciones proteína-proteína de mamíferos usando el sistema de doble híbrido en levadura. Las proteínas identificadas han contribuido significativamente a la comprensión de muchas rutas de transducción de señales y otros procesos biológicos. Por ejemplo, el sistema de doble híbrido en levadura se ha empleado satisfactoriamente en la identificación de un gran número de reguladores novedosos del ciclo celular de mamíferos que son importantes en las complejas regulaciones del ciclo celular. Usando proteínas conocidas que son importantes en la regulación del ciclo celular como cebos, se identificaron otras proteínas implicadas en el control del ciclo celular en virtud de su capacidad para interaccionar con los cebos. Véase en general, Hannon et al., en The Yeast Two Hybrid System, Bartel y Fields, eds., páginas 183-196, Oxford University Press, Nueva York, NY, 1997. Los ejemplos de reguladores del ciclo celular de mamíferos identificados mediante el sistema de doble híbrido en levadura incluyen inhibidores de CDK4/CDK6 (por ejemplo, p16, p15, p18 y p19), miembros de la familia Rb (por ejemplo, p130), Rb fosfatasa (por ejemplo, PP1-\alpha2), factores de transcripción de unión a Rb (por ejemplo, E2F-4 y E2F-5), inhibidores de CDK generales (por ejemplo, p21 y p27), ciclina CAK (por ejemplo, ciclina H), y CDK Thr161 fosfatasa (por ejemplo, KAP y CDI1). Véase la misma en la página 192. "[E]l enfoque de doble híbrido promete ser una herramienta útil en nuestra búsqueda actual de nuevas piezas del rompecabezas del ciclo celular". Véase la misma en la página 193.

El sistema de doble híbrido en levadura puede emplearse para identificar proteínas que interaccionan con una proteína conocida específica implicada en una ruta patológica, y por tanto, proporciona valiosos conocimientos sobre el mecanismo patológico. Las proteínas identificadas y las interacciones proteína-proteína en las que participan son posibles dianas para fármacos para su uso en la selección de nuevos fármacos para tratar la enfermedad.

La infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) provoca el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (conocido comúnmente como SIDA). El VIH es un retrovirus que infecta principalmente células T que expresan la glucoproteína CD4, es decir, células T CD4^{+}, que también se conocen como células T cooperadoras. El virus VIH se multiplica en células T cooperadoras y destruye rápidamente las células T cooperadoras del huésped, dando como resultado inmunodepresión y haciendo que el paciente afectado sea propenso a infecciones oportunistas, neoplasias y otros diversos estados patológicos. En última instancia, la infección por VIH puede provocar una disminución de las células T cooperadoras y un colapso de las defensas inmunitarias del paciente. De manera no sorprendente, los individuos infectados por VIH y los pacientes con SIDA desarrollan normalmente estados relacionados con el SIDA tales como complejo relacionado con el SIDA (ARC), linfadenopatía generalizada progresiva (PGL), demencia, paraparesia tropical, sarcoma de Kaposi, trombocitopenia purpúrea, infección por herpes, infección por citomegalovirus, linfomas relacionados con el virus de Epstein-Barr, entre otros. En cualquier caso, los virus VIH en un individuo infectado son infecciosos y pueden transmitirse a otras personas a través de transfusión sanguínea y relaciones sexuales.

Se ha dedicado mucho esfuerzo en los últimos quince años o así al desarrollo de métodos y compuestos farmacéuticos para tratar la infección por VIH y el SIDA. Los enfoques terapéuticos se han centrado en su mayor parte en un número limitado de dianas para fármacos, concretamente en la transcriptasa inversa de VIH, proteasa de VIH e integrasa de VIH. Se han desarrollado o comercializado varios inhibidores de la transcriptasa inversa y de la proteasa. Los ejemplos de inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa incluyen zidovudina, estavudina, lamivudina y ddI. Los ejemplos de inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleósidos incluyen efavirenz, delavirdina y abacavir. Además, hay varios inhibidores de la proteasa de VIH disponibles comercialmente incluyendo ritonavir, nelfinavir, indinavir y saquinavir.

Sin embargo, el VIH normalmente experimenta mutaciones activas según se multiplica. Además, hay variaciones genéticas extensas en el VIH debidas parcialmente a la alta tasa de mutación. Por tanto, surgen mutaciones de la transcriptasa inversa y proteasa de VIH con frecuencia en individuos infectados y hacen el virus resistente al inhibidor administrado a los pacientes. Se ha desarrollado un tratamiento terapia de combinación, denominado generalmente TARGA (tratamiento antirretroviral de gran actividad), en el que se administra una combinación de diferentes inhibidores anti-VIH a un paciente. Sin embargo, todavía se desarrolla con frecuencia una resistencia viral frente a los tratamientos de combinación.

Además, muchos de los compuestos anti-VIH conocidos en la técnica tienen otros graves inconvenientes. Por ejemplo, los inhibidores de la transcriptasa inversa tales como AZT y ddI son bastante tóxicos y provocan efectos secundarios graves en pacientes tratados con tales compuestos. Por tanto, aunque se ha logrado un éxito limitado en el control de la infección por VIH y el SIDA con los compuestos anti-VIH desarrollados anteriormente, existe la necesidad de enfoques terapéuticos alternativos que superen los defectos de los fármacos disponibles en la actualidad.

Sumario de la invención

Se ha descubierto que el gen de susceptibilidad tumoral humano de la proteína 101 ("Tsg101") interacciona con GAGp6 de VIH. Particularmente, la interacción entre Tsg101 y GAG de VIH es esencial para la gemación del VIH de las células huésped. Así, los complejos proteicos formados por Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH, así como Tsg101 solo, pueden usarse en ensayos de selección para seleccionar compuestos que pueden modular las funciones y actividades de Tsg101 y los complejos proteicos que contienen Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH. Los compuestos identificados pueden ser útiles en la inhibición de la propagación de lentivirus, particularmente la propagación de VIH, y en el tratamiento de la infección por VIH y el SIDA.

Por consiguiente, según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un complejo proteico aislado que comprende una primera proteína que interacciona con una segunda proteína, donde

(a) la primera proteína es

(i): un fragmento de Tsg101 que comprende el dominio UEV,

(ii): un homólogo de Tsg101 que comprende un dominio UEV y tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 75% a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de número de registro U82130 de GenBank, es decir a la siguiente secuencia de aminoácidos

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1

\quad: y que puede interaccionar con GAGp6 de VIH;

(iii): un fragmento de (ii) que comprende el dominio UEV y que puede interacionar con GAGp6 de VIH; o

(iv): una proteína de fusión que contiene (i), (ii) o (iii), y

(b) la segunda proteína es

(1): un polipéptido GAG de VIH,

(2): un homólogo de (1) que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 75% a la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 790-2292 de número de registro AF324493 de GenBank, es decir a la siguiente secuencia de aminoácidos

\hskip1.3cm

2

\quad: y que puede interaccionar con Tsg101,

\newpage

(3): un fragmento de (1) o (2) que puede interaccionar con Tsg101,

(4): un polipéptido GAG de retrovirus que puede interaccionar con Tsg101,

(5): un fragmento de (4) que tiene un motivo de dominio tardío P(T/S)AP, o

(6): una proteína de fusión que contiene uno cualquiera de (1) a (5).

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En una realización preferida, el complejo proteico aislado de la presente invención comprende: (a) una primera proteína que se selecciona del grupo que consiste en (i) un homólogo de la proteína Tsg101 que comprende un dominio UEV, que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90% a la de Tsg101 y que puede interaccionar con GAGp6 de VIH, (ii) un fragmento de la proteína Tsg101 que contiene el dominio UEV de Tsg101, y (iii) una proteína de fusión que contiene dicho homólogo de la proteína Tsg101 o dicho fragmento de la proteína Tsg101; y (b) una segunda proteína seleccionada del grupo que consiste en (1) polipéptido GAG de VIH, (2) un homólogo del polipéptido GAG de VIH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90% a la del polipéptido GAG de VIH y que puede interaccionar con Tsg101, (3) GAGp6 de VIH, (4) un homólogo de GAGp6 de VIH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90% a la del polipéptido GAGp6 de VIH y que puede interaccionar con Tsg101, (5) un fragmento de GAGp6 de VIH que puede interaccionar con Tsg101, y (6) una proteína de fusión que contiene dicho polipéptido GAG de VIH, dicho homólogo del polipéptido GAG de VIH, dicha proteína GAGp6 de VIH, dicho homólogo de GAGp6 de VIH o dicho fragmento de GAGp6 de VIH. En realizaciones específicas, el fragmento de GAGp6 de VIH tiene un tramo contiguo de al menos 10 residuos de aminoácido de una GAGp6 de VIH que se produce de forma natural, conteniendo dicho tramo contiguo un motivo de dominio tardío P(T/S)AP. Preferiblemente, el fragmento de GAGp6 de VIH contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 25-32.

En una realización más preferida, el complejo proteico aislado de la presente invención comprende una primera proteína como se ha definido anteriormente que interacciona con una segunda proteína que es un polipéptido GAG de retrovirus que puede interaccionar con Tsg101 o un fragmento de dicho polipéptido GAG de retrovirus que contiene un motivo de dominio tardío P(T/S)AP. Preferiblemente, el retrovirus es un lentivirus. Más preferiblemente, el retrovirus es un lentivirus de primates tal como un virus seleccionado del grupo que consiste en los virus VIH-1, VIH-2, VIH-3 y de inmunodeficiencia de simios. El lentivirus también puede ser un lentivirus que no es de primates seleccionado del grupo que consiste en lentivirus bovinos, lentivirus felinos, y lentivirus ovinos/caprinos. Por tanto, un complejo proteico aislado puede incluir:

(a) una primera proteína que se selecciona del grupo que consiste en

(i): un homólogo de la proteína Tsg101 que comprende un dominio UEV, que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90% a la de Tsg101 y que puede interaccionar con GAGp6 de VIH,

(ii): un fragmento de la proteína Tsg101 que contiene el dominio UEV de Tsg101 y que puede interaccionar con GAGp6 de HIV, y

(iii): una proteína de fusión que contiene dicho homólogo de la proteína Tsg101 o dicho fragmento de la proteína Tsg101; y

(b) una segunda proteína seleccionada del grupo que consiste en

(1): un polipéptido GAG de retrovirus que tiene el motivo de dominio tardío P(T/S)AP y que puede interaccionar con Tsg101,

(2): un fragmento de dicho polipéptido GAG de retrovirus, conteniendo un motivo de dominio tardío P(T/S)AP y pudiendo interaccionar dicho fragmento con Tsg101, y

(3): una proteína de fusión que contiene dicho polipéptido GAG de retrovirus o dicho fragmento del polipéptido GAG de retrovirus.

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En otra realización específica, un complejo proteico aislado puede incluir:

(a) una primera proteína que se selecciona del grupo que consiste en

(ii): un fragmento de la proteína Tsg101 que contiene el dominio UEV de Tsg101, y que puede interaccionar con GAGp6 de HIV y

(b) una segunda proteína seleccionada del grupo que consiste en

(1): un polipéptido GAG de lentivirus de primates,

(2): una proteína GAGp6 de lentivirus de primates,

(3): un fragmento de GAGp6 de lentivirus de primates que contiene un motivo de dominio tardío P(T/S)AP, y que puede interaccionar con Tsg101, y

(4): una proteína de fusión que contiene dicho polipéptido GAG de lentivirus de primates, dicha proteína GAGp6 de lentivirus de primates, o dicho fragmento de GAGp6 de lentivirus de primates.

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Aún en otro aspecto, la presente invención también proporciona un método para preparar los complejos proteicos de la presente invención. El método incluye las etapas de proporcionar la primera proteína y la segunda proteína en los complejos proteicos de la presente invención y poner en contacto dicha primera proteína con dicha segunda proteína. Además, los complejos proteicos pueden prepararse mediante aislamiento o purificación a partir de tejidos y células o producirse mediante expresión recombinante de sus elementos proteicos.

La presente descripción se refiere además a una proteína de fusión que tiene un primer polipéptido unido covalentemente a un segundo polipéptido, en el que dicho primer polipéptido es Tsg101 o un homólogo o fragmento de la misma, y en el que dicho segundo polipéptido es GAG de VIH o un homólogo o fragmento de la misma. También se describen los ácidos nucleicos que codifican para la proteína de fusión.

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona compuestos adecuados para inhibir la gemación de partícula víricas de las células huésped seleccionadas entre (a) anticuerpos inmunorreactivos con los complejos proteicos de la presente invención, y (b) ácidos nucleicos que codifican tales anticuerpos. En una realización, un anticuerpo es inmunorreactivo de forma selectiva con un complejo proteico de la presente invención. En otra realización, se proporciona un anticuerpo bifuncional que tiene dos sitios de unión a antígeno diferentes, siendo cada uno específico para un elemento proteico que interacciona diferente en un complejo proteico de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención puede adoptar diversas formas incluyendo anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv), fragmentos Fab', y fragmentos F(ab')_{2}. Preferiblemente, los anticuerpos son anticuerpos parcial o totalmente humanizados. Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse fácilmente usando procedimientos generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse bibliotecas recombinantes tales como bibliotecas de exposición en fago y bibliotecas de exposición en ribosoma para seleccionar anticuerpos con especificidades deseadas. Además, pueden usarse diversas técnicas de mutagénesis tales como mutación dirigida al sitio y diversificación de PCR en combinación con los ensayos de selección.

La presente descripción se refiere además a microchips proteicos que comprenden uno o más de los complejos proteicos de la presente invención y/o uno o más anticuerpos según la presente invención. Tales microchips proteicos pueden ser útiles en ensayos de selección de alto rendimiento a gran escala en los que participan los complejos proteicos.

Aún en otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos de selección para seleccionar moduladores de un complejo proteico de la invención. También se proporcionan métodos de selección para seleccionar moduladores de Tsg101, que se une a dicha proteína, seleccionando así un compuesto que puede inhibir la gemación viral. Los compuestos identificados en los métodos de selección de la presente invención pueden usarse en el estudio de la interacción entre Tsg101 y GAG de VIH y la comprensión del mecanismo de la propagación viral del VIH. Los compuestos seleccionados también pueden ser útiles para prevenir o mejorar enfermedades o trastornos tales como infección viral, particularmente infección por VIH y SIDA.

Por tanto, pueden examinarse compuestos de prueba en un ensayo de unión in vitro para seleccionar los compuestos que pueden unirse a un complejo proteico de la presente invención o a Tsg101. Además, pueden emplearse ensayos de disociación in vitro para seleccionar compuestos que pueden disociar los complejos proteicos identificados según la presente invención. También puede usarse un ensayo de selección in vitro para seleccionar compuestos que desencadenan o inician la formación de, o estabilizan, un complejo proteico de la presente invención. En realizaciones preferidas, se utilizan ensayos in vivo tales como ensayos de doble híbrido en levadura y diversos derivados de los mismo, preferiblemente ensayos de doble híbrido inverso, para seleccionar compuestos que interfieren en o alteran las interacciones proteína-proteína entre la primera y la segunda proteína del complejo proteico de la invención. Además, los sistemas tales como los ensayos de doble híbrido en levadura también son útiles para seleccionar compuestos que pueden desencadenar o iniciar, potenciar o estabilizar las interacciones proteína-proteína entre la primera y la segunda proteína del complejo proteico de la invención.

\newpage

Por tanto, en una realización, el método de selección incluye las etapas de poner en contacto la primera y segunda proteínas de los complejos proteicos de la presente invención en presencia de uno o más compuestos de prueba, y detectar la interacción entre dicha primera proteína y dicha segunda proteína. Preferiblemente, la primera y segunda proteínas son proteínas de fusión que tienen una etiqueta detectable. Los métodos pueden llevarse a cabo en un entorno sustancialmente libre de células o en una célula huésped, preferiblemente en células de levadura.

En una realización preferida, el método de selección incluye: (a) proporcionar en una célula huésped una primera proteína de fusión que tiene una primera proteína del complejo proteico de la invención, y una segunda proteína de fusión que tiene una segunda proteína del complejo proteico de la invención, en el que se fusiona un dominio de unión a ADN con una de la primera y segunda proteínas mientras que se fusiona un dominio de activación de la transcripción con la otra de dichas primera y segunda proteínas; (b) proporcionar en dicha célula huésped un gen indicador, en el que la transcripción del gen indicador está determinada por la interacción entre la primera proteína y la segunda proteína; (c) permitir que dichas primera y segunda proteínas de fusión interaccionen entre sí en dicha célula huésped en presencia de un compuesto de prueba; y (d) determinar la presencia o ausencia de expresión de dicho gen indicador.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula huésped que expresa una segunda proteína del complejo proteico de la invención y que comprende un primer casete de expresión que tiene un primer promotor operativamente unido a un ácido nucleico que codifica para una primera proteína del complejo proteico de la invención

En una realización preferida de la célula huésped, la segunda proteína se expresa a partir de un segundo casete de expresión que tiene un segundo promotor operativamente unido a un ácido nucleico que codifica para una segunda proteína del complejo proteico de la invención.

En una realización preferida, la segunda proteína se selecciona del grupo que consiste en

(1): polipéptido GAG de VIH,

(2): un homólogo del polipéptido GAG de VIH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90% a la del polipéptido GAG de VIH y que puede interaccionar con Tsg101,

(3): proteína GAGp6 de VIH,

(4): un homólogo de GAGp6 de VIH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90% a la del polipéptido GAGp6 de VIH y que puede interaccionar con Tsg101,

(5): un fragmento de GAGp6 de VIH que puede interaccionar con Tsg101, y

(6): una proteína de fusión que contiene dicho polipéptido GAG de VIH, dicho homólogo del polipéptido GAG de VIH, dicha proteína GAGp6 de VIH, dicho homólogo de GAGp6 de VIH o dicho fragmento de GAGp6 de VIH.

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En otra realización preferida de la célula huésped de la presente invención, uno de dichos primero y segundo ácidos nucleicos está unido a un ácido nucleico que codifica para un dominio de unión a ADN, y el otro de dichos primero y segundo ácidos nucleicos está unido a un ácido nucleico que codifica para un dominio de activación de la transcripción, mediante lo cual pueden producirse dos proteínas de fusión en dicha célula huésped. Preferiblemente, la célula huésped comprende además un gen indicador, en el que la expresión de dicho gen indicador está determinada por la interacción entre la primera proteína y la segunda proteína.

La presente invención se refiere además a un método para proporcionar un compuesto que puede interferir en una interacción entre la primera y segunda proteínas en los complejos proteicos de la presente invención, que comprende las etapas de proporcionar coordenadas atómicas que definen una estructura tridimensional de dicho complejo proteico, y diseñar o seleccionar compuestos que pueden interferir en la interacción entre dicha primera proteína y dicha segunda proteína basándose en dichas coordenadas atómicas.

Además, la presente invención también proporciona un método para seleccionar un compuesto que puede inhibir una interacción proteína-proteína entre Tsg101 y GAGp6 de VIH, que comprende:

(a) poner en contacto un compuesto de prueba con una primera proteína del complejo proteico de la invención; y

(b) determinar si dicho compuesto de prueba puede unirse a dicha proteína. En una realización preferida, el método incluye además someter a prueba un compuesto de prueba seleccionado que puede unirse a dicha proteína para determinar su capacidad para interferir en la interacción proteína-proteína entre Tsg101 y GAGp6 de VIH, y opcionalmente someter a prueba además un compuesto de prueba seleccionado que puede unirse a dicha proteína para determinar su capacidad para inhibir la gemación viral del VIH de una célula huésped infectada por VIH.

La presente invención proporciona además un método para seleccionar un compuesto que pueda inhibir una interacción proteína-proteína entre Tsg101 y la GAG retroviral que contiene un motivo P(T/S)AP. El método comprende (a) proporcionar coordenadas atómicas que definen una estructura tridimensional de una proteína seleccionada del grupo que consiste en (i) un homólogo de la proteína Tsg101 que comprende un dominio UEV, que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90% a la de Tsg101 y que puede interaccionar con GAGp6 de VIH, (ii) un fragmento de la proteína Tsg101 que contiene el dominio UEV de Tsg101, y que puede interaccionar con GAGp6 de VIH, y (iii) una proteína de fusión que contiene dicho homólogo de la proteína Tsg101 o dicho fragmento de la proteína Tsg101; y (b) diseñar o seleccionar compuestos que pueden interaccionar con dicha proteína basándose en dichas coordenadas atómicas. En una realización preferida, el método incluye además una etapa de someter a prueba un compuesto seleccionado que puede interaccionar con dicha proteína para determinar su capacidad para interferir en una interacción proteína-proteína entre Tsg101 y la GAG retroviral, particularmente GAGp6 de VIH, y opcionalmente una etapa de someter a prueba un compuesto de prueba seleccionado que pueden interaccionar con dicha proteína para determinar su capacidad para inhibir la gemación viral, particularmente la gemación viral del VIH de una célula huésped infectada por VIH.

La presente invención también proporciona métodos para inhibir la gemación de partículas de virus a partir de una célula huésped in vitro, preferiblemente en células de mamíferos, que comprende reducir la concentración de un complejo proteico que comprende Tsg101 y una GAG de VIH que contiene un motivo de dominio tardío P(T/S)AP en la célula huésped. Pueden usarse los métodos para inhibir la gemación viral del VIH de células huésped infectadas. La inhibición de la gemación viral evita que el virus se libere desde las células huésped infectadas suprimiendo de este modo la propagación viral adicional. Por consiguiente, la presente invención también engloba el uso de los compuestos definidos en (a) a (k) de la reivindicación 16, en la fabricación de una composición para el tratamiento de la infección viral, particularmente la infección por VIH, que incluye tratar y prevenir el SIDA en pacientes.

Pueden emplearse diversos métodos para reducir la concentración del complejo proteico. La concentración del complejo proteico puede reducirse interfiriendo en la interacción entre Tsg101 y la GAG retroviral (por ejemplo, GAG de VIH). Por ejemplo, pueden administrarse compuestos que pueden interferir en las interacciones entre Tsg101 y GAG de VIH a células in vitro o in vivo en un paciente. Tales compuestos pueden ser moléculas orgánicas pequeñas que pueden unirse a la proteína Tsg101, particularmente al dominio UEV de la proteína Tsg101, o a GAGp6 de VIH. También pueden ser anticuerpos inmunorreactivos con la proteína Tsg101 o GAGp6 de VIH. Preferiblemente, se usan anticuerpos que se unen al dominio UEV de la proteína Tsg101. Además, los compuestos pueden ser pequeños péptidos derivados de la proteína GAGp6 de VIH o miméticos de los mismos que pueden unirse a Tsg101, o pequeños péptidos derivados de la proteína Tsg101 o miméticos de los mismos que pueden unirse a la GAGp6 de VIH.

En otra realización, los métodos y usos incluyen inhibir la expresión de la proteína Tsg101 y/o la proteína GAG de VIH. La inhibición puede darse a nivel transcripcional, traduccional, o postraduccional. Por ejemplo, pueden administrarse compuestos antisentido y compuestos de ribozimas a células humanas in vitro o en organismos humanos.

Aún en otra realización, es útil un anticuerpo inmunorreactivo de forma selectiva con un complejo proteico que tiene Tsg101 que interacciona con la GAG retroviral (por ejemplo, GAG de VIH) mediante la administración a células in vitro o en organismos humanos para inhibir las actividades del complejo proteico y/o reducir la concentración del complejo proteico en las células o pacientes.

El método para tratar la infección por VIH y el SIDA descrito en esta memoria de los enfoques terapéuticos conocidos hasta este momento en la técnica. El método se dirige a una proteína celular de las células huésped así como a su interacción con una proteína viral. La interacción se requiere para la gemación del VIH de las células huésped infectadas. Por consiguiente, es menos probable que el VIH desarrolle resistencia viral al tratamiento usando compuestos según la presente invención.

Las anteriores y otras ventajas y características de la invención, y la forma en que se logran las mismas, resultarán más fácilmente evidentes con la consideración de la siguiente descripción detallada de la invención tomada junto con los ejemplos adjuntos, que ilustran las realizaciones preferidas y a modo de ejemplo.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama que resume las rutas propuestas para la gemación de los virus usando diferentes motivos de dominio tardío;

La figura 2 es una curva de inhibición competitiva que muestra que el péptido p6(1-14) que tiene los primeros 14 residuos de aminoácido de GAGp6 de VIH puede inhibir la interacción proteína-proteína entre GST-p6 y myc-Tsg101(1-207);

La figura 3 es un diagrama de Dixon que muestra la inhibición por p6(1-14) de la interacción entre GST-p6 y myc-Tsg101(1-207);

La figura 4 es otro diagrama de Dixon que muestra la inhibición por p6(1-14) de la interacción entre GST-p6 y myc-Tsg101(1-207).

Descripción detallada de la invención 1. Definiciones

Los términos "polipéptido", "proteína" y "péptido" se usan de forma intercambiable en el presente documento para referirse a cadenas de aminoácidos en las que los residuos de aminoácido están unidos mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados. Las cadenas de aminoácidos pueden ser de cualquier longitud superior a dos aminoácidos. A menos que se especifique lo contrario, los términos "polipéptido", "proteína" y "péptido" también engloban diversas formas modificadas de los mismos. Tales formas modificadas pueden ser formas modificadas que se producen de forma natural o formas modificadas químicamente. Los ejemplos de formas modificadas incluyen, pero no se limitan a, formas glucosiladas, formas fosforiladas, formas miristoiladas, formas palmitoiladas, formas ribosiladas, formas acetiladas, formas ubiquitinadas, etc. Las modificaciones también incluyen reticulación intramolecular y unión covalente a diversos restos tales como lípidos, flavina, biotina, polietilenglicol o derivados de los mismos, etc. Además, las modificaciones también pueden incluir ciclación, ramificación y reticulación. Además, pueden incluirse en un polipéptido aminoácidos distintos a los veinte aminoácidos convencionales codificados por genes.

El termino "fragmento de proteína" tal como se usa en el presente documento significa un polipéptido que representa una parte de una proteína. Cuando un fragmento de una proteína muestra interacciones con otra proteína o fragmento de proteína, se dice que las dos entidades interaccionan a través de dominios de interacción que están contenidos en las entidades.

Tal como se usa en el presente documento, el término "que interacciona" o "interacción" significa que dos dominios proteicos, fragmentos o proteínas completas muestran suficiente afinidad física entre sí como para acercar físicamente los dos dominios proteicos o proteínas "que interaccionan" entre sí. Un caso extremo de interacción es la formación de un enlace químico que da como resultado una proximidad continua y estable de los dos dominios. Las interacciones que sólo se basan en afinidades físicas, aunque normalmente más dinámicas que las interacciones unidas químicamente, pueden ser igualmente eficaces para ubicar conjuntamente dos proteínas. Los ejemplos de afinidades físicas y enlaces químicos incluyen pero no se limitan a, fuerzas provocadas por diferencias de carga eléctrica, hidrofobicidad, enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, fuerza iónica, uniones covalentes y combinaciones de los mismos. El estado de proximidad entre los dominios o entidades que interaccionan puede ser transitorio o permanente, reversible o irreversible. En cualquier caso, esto se opone a y es distinguible del contacto provocado por el movimiento aleatorio natural de dos entidades. Normal aunque no necesariamente, una "interacción" se muestra mediante la unión entre los dominios o entidades que interaccionan. Los ejemplos de interacciones incluyen interacciones específicas entre antígeno y anticuerpo, ligando y receptor, enzima y sustrato, y similares.

Puede determinarse una "interacción" entre dos dominios proteicos, fragmentos o proteínas completas mediante varios métodos. Por ejemplo, puede determinarse una interacción mediante ensayos funcionales tales como los sistemas de doble híbrido. Las interacciones proteína-proteína también pueden determinarse mediante diversos enfoques bioquímicos basados en la afinidad de la unión entre los dos componentes que interaccionan. Tales métodos bioquímicos conocidos generalmente en la técnica incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de afinidad de proteínas, inmunotransferencia de afinidad, inmunoprecipitación y similares. La constante de unión para dos proteínas que interaccionan, que refleja la intensidad o calidad de la interacción, también puede determinarse usando métodos conocidos en la técnica. Véase Phizicky y Fields, Microbiol. Rev., 59:94-123 (1995).

Tal como se usa en el presente documento, el término "dominio" significa una parte, segmento o región funcional de una proteína o polipéptido. "Dominio de interacción" se refiere específicamente a una parte, segmento o región de una proteína, polipéptido o fragmento de proteína que es responsable de la afinidad física de esa proteína, fragmento de proteína o dominio aislado por otra proteína, fragmento de proteína o dominio aislado.

Tal como se usa en el presente documento, el término "complejo proteico" significa una unidad compuesta que es una combinación de dos o más proteínas formada mediante la interacción entre las proteínas. Normal pero no necesariamente, un "complejo proteico" se forma mediante la unión de dos o más proteínas juntas mediante afinidades de unión no covalente específicas. Sin embargo, también pueden estar presentes enlaces covalentes entre los componentes que interaccionan. Por ejemplo, los dos componentes que interaccionan pueden reticularse covalentemente de forma que el complejo proteico se vuelve más estable.

El término "complejo proteico aislado" significa un complejo proteico presente en una composición o entorno que es diferente al que se encuentra en la naturaleza en su entorno corporal o celular original o nativo. Preferiblemente, un "complejo proteico aislado" está separado de al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 75%, lo más preferiblemente al menos el 90% de otros componentes tisulares o celulares que coexisten de forma natural. Por tanto, un "complejo proteico aislado" también puede ser un complejo proteico que existe de forma natural en una preparación artificial o una célula huésped no nativa. Un "complejo proteico aislado" también puede ser un "complejo proteico purificado", es decir, una forma sustancialmente purificada en una preparación sustancialmente homogénea, sustancialmente libre de otros componentes celulares, otros polipéptidos, materiales virales, o medio de cultivo, o cuando los componentes proteicos en el complejo proteico se sintetizan químicamente, los precursores químicos o subproductos asociados con la síntesis química. Un "complejo proteico purificado" normalmente significa una preparación que contiene preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 85%, y lo más preferiblemente al menos el 95% de un complejo proteico particular. Un "complejo proteico purificado" puede obtenerse a partir de células huésped naturales o recombinantes u otras muestras corporales mediante técnicas de purificación convencionales, o mediante síntesis química.

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Los términos "proteína híbrida", "polipéptido híbrido", "péptido híbrido", "proteína de fusión", "polipéptido de fusión" y "péptido de fusión" se usan de forma intercambiable en el presente documento para significar una proteína que no se produce de forma natural que tiene una molécula de polipéptido especificada unida covalentemente a una o más moléculas de polipéptido que no se unen de forma natural al polipéptido especificado. Por tanto, una "proteína híbrida" pueden ser dos proteínas que se producen de forma natural o fragmentos de las mismas unidas juntas mediante una unión covalente. Una "proteína híbrida" también puede ser una proteína formada mediante unión covalente de dos polipéptidos artificiales juntos. Normal pero no necesariamente, las dos o más moléculas de polipéptido se unen o "fusionan" juntas mediante un enlace peptídico que forma una cadena de polipéptido no ramificada sencilla.

Tal como se usa en el presente documento, el término "homólogo", cuando se usa en conexión con una primera proteína nativa o fragmento de la misma que se descubre, según la presente invención, que interacciona con una segunda proteína nativa o fragmento de la misma, significa un polipéptido que muestra una homología de la secuencia de aminoácidos y/o semejanza estructural a la primera proteína que interacciona nativa, o a uno de los dominios que interaccionan de la primera proteína nativa de tal forma que pueda interaccionar con la segunda proteína nativa. Normalmente, un homólogo de proteína de una proteína nativa puede tener una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 50%, preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88% o el 89%, incluso más preferiblemente al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93% o el 94%, y lo más preferiblemente el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a la proteína nativa. Ejemplos de homólogos pueden ser las proteínas ortólogas de otras especies incluyendo animales, plantas, levaduras, bacterias, y similares. Los homólogos también pueden seleccionarse mediante, por ejemplo, mutagénesis en una proteína nativa. Por ejemplo, pueden identificarse los homólogos mediante mutagénesis específica del sitio en combinación con ensayos para detectar interacciones proteína-proteína, por ejemplo, el sistema de doble híbrido en levadura descrito anteriormente, como resultará evidente para los expertos en la técnica informados de la presente invención.

Con fines de comparación de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido diferentes, una secuencia (secuencia de prueba) puede describirse como que tienen un "porcentaje idéntico a" otra secuencia (secuencia de referencia) específico en la presente descripción. Respecto a esto, cuando la longitud de la secuencia de prueba es inferior al 90% de la longitud de la secuencia de referencia, se determina el porcentaje de identidad mediante el algoritmo de Myers y Miller, Bull. Math. Biol., 51:5-37 (1989) y Myers y Miller, Comput. Appl. Biosci., 4(1):11-7 (1988). Específicamente, se determina la identidad mediante el programa ALIGN, que está disponible en http://www2.igh.cnrs.fr mantenido por IGH, Montpellier, FRANCIA. Normalmente deben usarse los parámetros por defecto. También puede usarse una forma modificada del programa ALIGN.

Cuando la longitud de la secuencia de prueba es al menos el 90% de la longitud de la secuencia de referencia, se determina el porcentaje de identidad mediante el algoritmo de Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-77 (1993), que se incorpora en diversos programas de BLAST. Específicamente, el porcentaje de identidad, se determina mediante la herramienta "secuencias BLAST 2", que está disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html. Véase Tatusova y Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174(2):247-50 (1999). Para la comparación de ADN-ADN por parejas, se usa el programa BLASTN 2.1.2 con los parámetros por defecto (apareamiento: 1; apareamiento erróneo: -2; hueco abierto: 5 penalizaciones; hueco de extensión: 2 penalizaciones; caída x de espacio: 50; esperanza: 10; y tamaño de palabra: 11, con filtro). Para la comparación de secuencias proteína-proteína por parejas, se emplea el programa BLASTP 2.1.2 usando los parámetros por defecto (matriz: BLOSUM62; hueco abierto: 11; extensión de hueco: 1; caída x: 15; esperanza: 10,0; y tamaño de palabra: 3, con filtro).

El término "derivado," cuando se usa en relación con una primera proteína nativa (o fragmento de la misma) que se descubre, según la presente invención, que interacciona con una segunda proteína nativa (o fragmento de la misma), significa una forma modificada de la primera proteína nativa preparada mediante modificación de los grupos de cadena lateras de la primera proteína nativa sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la primera proteína nativa. La forma modificada, es decir, el derivado debe poder interaccionar con la segunda proteína nativa. Los ejemplos de formas modificadas incluyen formas glucosiladas, formas fosforiladas, formas miristoiladas, formas ribosiladas, formas ubitiquinadas y similares. Los derivados también incluyen proteínas híbridas o de fusión que contienen una proteína nativa o un fragmento de la misma. Pueden prepararse derivados usando cualquier técnica conocida y someterse a prueba para determinar su interacción con la segunda proteína nativa.

El término "anticuerpo" tal como se usa en el presente documento engloba tanto anticuerpos monoclonales como policlonales que se encuentran dentro de cualquier clase de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, o derivados de las mismas. El término "anticuerpo" también incluye fragmentos de anticuerpos que incluyen, pero no se limitan a, Fab, F(ab')_{2}, y conjugados de tales fragmentos, y anticuerpos de cadena sencilla que comprenden un epítopo de reconocimiento de antígeno. Además, el término "anticuerpo" también significa anticuerpos humanizados, incluyendo anticuerpos parcial o totalmente humanizados. Puede obtenerse un anticuerpo a partir de un animal, o a partir de una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal, u obtenerse a partir de células o bibliotecas que expresan de forma recombinante un gen que codifica para un anticuerpo particular.

El término "inmunorreactivos de forma selectiva" tal como se usa en el presente documento significa que un anticuerpo es reactivo, por tanto, se une a una proteína o complejo proteico específico, pero no a otras proteínas similares o fragmentos o componentes de las mismas.

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El término "compuesto" tal como se usa en el presente documento engloba cualquier tipo de molécula orgánica o inorgánica, incluyendo pero sin limitarse a proteínas, péptidos, polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos, moléculas orgánicas pequeñas, compuestos inorgánicos, y derivados de los mismos.

A menos que se especifique lo contrario, el término "Tsg101" tal como se usa en el presente documento significa la proteína humana Tsg101. A menos que se especifique lo contrario, el término "GAG de VIH" tal como se usa en el presente documento significa la proteína GAG de VIH. A menos que se especifique lo contrario, el término "GAGp6 de VIH" tal como se usa en el presente documento significa la proteína GAGp6 de VIH.

Tal como se usa en el presente documento, el término "infección por VIH" engloba generalmente la infección de un animal huésped, particularmente un huésped humano, por la familia de retrovirus del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) incluyendo, pero sin limitarse a, VIH I, VIH II, VIH III, y similares. Por tanto, tratar la infección por VIH englobará el tratamiento de una persona que es portadora de cualquiera de la familia del VIH de retrovirus o una persona a la que se le ha diagnosticado SIDA activo, así como el tratamiento o la profilaxis de los estados relacionados con el SIDA en tales personas. Puede identificarse un portador del VIH mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede identificarse una persona como portadora del VIH basándose en que la persona es positiva para anticuerpos anti-VIH, o es positiva para VIH, o presenta síntomas de SIDA. Es decir, "tratar la infección por VIH" debe entenderse como tratar a un paciente que está en uno cualquiera de los diversos estadios de la progresión de la infección por VIH, que, por ejemplo, incluyen síndrome de infección primaria aguda (que puede ser asintomática o asociarse a una enfermedad pseudogripal con fiebre, malestar general, diarrea, y síntomas neurológicos tales como cefalea), infección asintomática (que es el periodo de latencia largo con un descenso gradual en el número de células T CD4^{+} circulantes), y SIDA (que se define por enfermedades definitorias de SIDA más graves y/o un descenso en el recuento de células CD4 circulantes por debajo de un nivel que es compatible con la función inmunitaria eficaz). Además, "tratar o prevenir la infección por VIH" también englobará tratar la supuesta infección por VIH tras una supuesta exposición pasada al VIH mediante, por ejemplo, transfusión sanguínea, intercambio de fluidos corporales, picaduras, pinchazo accidental con una aguja o exposición a la sangre del paciente durante cirugía.

El término "tratar el SIDA" significa tratar a un paciente que muestra enfermedades definitorias de SIDA más graves y/o un descenso en el recuento de células CD4 circulantes por debajo de un nivel que es compatible con la función inmunitaria eficaz. El término "tratar el SIDA" también engloba tratar estados relacionados con el SIDA, lo que significa trastornos y enfermedades secundarias o asociadas al SIDA o infección por VIH tales como complejo relacionado con el SIDA (ARC), linfadenopatía generalizada progresiva (PGL), estados positivos para anticuerpos anti-VIH, y estados positivos para VIH, estados neurológicos relacionados con el SIDA (tales como demencia o paraparesia tropical), sarcoma de Kaposi, trombocitopenia purpúrea e infecciones oportunistas asociadas tales como neumonía por Pneumocystis carinii, tuberculosis micobacteriana, candidiasis esofágica, toxoplasmosis cerebral, retinitis por CMV, encefalopatía relacionada con el VIH, síndrome de emaciación relacionado con el VIH, etc.

Por tanto, el término "prevenir el SIDA" tal como se usa en el presente documento significa prevenir en un paciente que tiene infección por VIH o se sospecha que tiene infección por VIH o está en riesgo de tener infección por VIH, el desarrollo de SIDA (que se caracteriza por enfermedades definitorias de SIDA más graves y/o un descenso en el recuento de células CD4 circulantes por debajo de un nivel que es compatible con la función inmunitaria eficaz) y/o estados relacionados con el SIDA.

2. Complejos proteicos

Se han descubierto y confirmado interacciones proteína-proteína novedosas usando sistemas de doble híbrido en levadura. En particular, se ha descubierto que Tsg101 interacciona con GAGp6 de VIH. Las regiones de unión de Tsg101 y GAGp6 de VIH descubiertas en sistemas de doble híbrido en levadura se resumen en la tabla 1.

TABLA 1 Regiones de unión de GAG de VIH y Tsg101

3

Donde GAG de VIH tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

4

y donde Tsg101 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

5

2.1. Tsg101 está implicado en la gemación viral del VIH

El gen de susceptibilidad tumoral de la proteína 101 (Tsg101) se identificó originalmente como un polipéptido de 381 aminoácidos implicado en la tumorigénesis. El Tsg101 puede ubicarse en el núcleo y en el citoplasma, dependiendo de la fase del ciclo celular. Tsg101 interacciona con estatmina, una fosfoproteína citosólica implicada en la tumorigénesis, y la sobreexpresión de un transcrito antisentido de Tsg101 en células NIH-3T3 da como resultado la transformación de las células. Véase Li y Cohen, Cell, 85(3):319-29 (1996). Además, se ha sugerido que pueden producirse defectos en Tsg101 durante la tumorigénesis y/o progresión del cáncer de mama. Li et al., Cell, 88(1):143-54 (1997). Tsg101 contiene un dominio catalítico E2 de la enzima conjugadora de ubiquitina. Recientemente, el interés se ha centrado sobre Tsg101 como un posible componente de la ruta de degradación de ubiquitina/proteasoma. Mediante búsqueda en bases de datos y comparación, se ha encontrado que el extremo N-terminal de Tsg101 contiene un dominio relacionado con E2 de las enzimas conjugadoras de ubiquitina (Ubc) aunque carece de la cisteína del sitio activo. Véase Koonin y Abagyan, Nat. Genet., 16(4):330-1 (1997). Por tanto, Tsg101 puede pertenecer a un grupo de homólogos aparentemente inactivos de las enzimas Ubc. Véase la misma. El dominio relacionado con E2 de las enzimas conjugadoras de ubiquitina (Ubc) se refiere a un dominio variante de E2 de ubiquitina (UEV).

Según la presente invención, una búsqueda de una biblioteca de bazo humano con poliproteína GAG (aa 449-500, dominio p6, o "GAGp6") de VIH-1 aisló el gen de susceptibilidad tumoral de la proteína 101 (Tsg101; aa 7-390) como componente que interacciona. El cebo de GAGp6 usado aquí contiene el motivo de dominio tardío (-PTAP-).
La poliproteína GAG de retrovirus origina un conjunto de proteínas maduras (matriz, cápside, y nucleocápside) que producen el núcleo interno del virión. Además, GAG también contiene una parte C-terminal denominada p6. En el caso del VIH1, GAGp6 contiene una secuencia denominada dominio tardío, denominada así porque se requiere para una fase tardía de la gemación viral del VIH de la superficie de la célula huésped. El dominio tardío tiene una relación funcional con la ubiquitina, porque el dominio tardío se requiere para la gemación viral, y la disminución de la reserva intracelular de ubiquitina libre produce un fenotipo tardío similar. Patnaik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(24):13069-74 (2000); Schubert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(24):13057-62 (2000); Strack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(24):13063-8 (2000). Se cree que el dominio tardío representa un sitio de acoplamiento para la maquinaria de ubiquitinación.

Tal como se conoce en la técnica, el motivo P(T/S)AP está conservado entre los dominios GAGp6 de todos los lentivirus de primates conocidos. En lentivirus que no son de primates, que carecen de un dominio GAGp6, el motivo P(T/S)AP está cerca del extremo C-terminal de la poliproteína GAG. Se ha demostrado que el motivo P(T/S)AP se requiere para un fase tardía de la gemación viral de la superficie de la célula huésped. Es crítico para la producción de partículas de lentivirus y particularmente del VIH. Véase Huang et al., J. Virol., 69:6810-6818 (1995). Específicamente, la deleción del motivo PTAP da como resultado una reducción drástica de la producción de partículas virales. Además, los virus deficientes en PTAP avanzan a través de las fases normales de la morfogénesis, pero no completan el proceso. Es más, permanecen unidos a la membrana plasmática y por tanto se vuelven no infecciosos. Es decir, el proceso de gemación viral se detiene. Véase Huang et al., J. Virol., 69:6810-6818 (1995).

Según la presente invención, se generaron distintos mutantes puntuales de GAGp6 (E6G, P7L, A9R o P10L) y se sometieron a prueba para determinar su capacidad para unirse a la proteína Tsg101. Véase el ejemplo 2 a continuación. Mientras que el péptido de GAGp6 tipo natural y el mutante de GAGp6 E6G pudieron unirse a la proteína Tsg101, cada una de las mutaciones puntuales P7L, A9R y P10L suprime la afinidad de unión de GAGp6 a Tsg101. Las mutaciones puntuales P7L, A9R y P10L alteran el motivo PTAP en el péptido GAGp6. Las mismas mutaciones en el motivo PTAP de la proteína gag GAGp6 de VIH evitan la gemación de las partículas de VIH de las células huésped. Véase Huang et al., J. Virol., 69:6810-6818 (1995). Además, tal como se muestra en el ejemplo 3 a continuación, los inventores de la presente invención descubrieron que los primeros 14 residuos de aminoácido de GAGp6 de VIH (que incluye el motivo de dominio tardío PTAP) son suficientes para unir la parte N-terminal de Tsg101 (residuos de aminoácido 1-207, que incluye el dominio UEV de Tsg101).

Tsg101 está muy implicado en la endocitosis, el tráfico intracelular de vesículas y la clasificación vacuolar de proteínas (VPS). La ruta VPS clasifica las proteínas unidas a la membrana para su degradación eventual en el lisosoma (vacuola en levaduras). Véase Lemmon y Traub, Curr. Opin. Cell. Biol., 12:457-66 (2000). Dos entradas alternativas en la ruta VPS son mediante tráfico vesicular desde el aparato de Golgi (por ejemplo, en la degradación de proteínas de membrana con plegamiento anómalo) o mediante endocitosis desde la membrana plasmática (por ejemplo, en la regulación por disminución de las proteínas de superficie como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR)). Las vesículas que transportan proteínas desde cualquier fuente pueden entrar en la ruta VPS fusionándose con endosomas. Según maduran estos endosomas, sus cargas se clasifican para degradación lisosómica mediante la formación de estructuras denominadas cuerpos multivesiculares (MVB). Los MVB se crean cuando los parches de superficie de los endosomas tardíos geman dentro del compartimento, formando vesículas pequeñas (\sim50-100 nm). Un MVB en maduración puede contener decenas o incluso cientos de estas vesículas. El MVB se fusiona entonces con el lisosoma, liberando las vesículas para la degradación en este orgánulo hidrolítico.

El fragmento presa de Tsg101 aislado en el ensayo de doble híbrido en levadura contiene el dominio variante de E2 de ubiquitina (UEV) indicando que el dominio UEV está implicado en la unión al dominio P(T/S)AP. La implicación del dominio UEV de Tsg101 concuerda con el hecho de que se requiere ubiquitina para la gemación de retrovirus y que la inhibición de proteasomas reduce el nivel de ubiquitina libre en células infectadas por VIH-1 e interfiere en la liberación y maduración de VIH-1 y VIH-2. Véase Patnaik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(24):13069-74 (2000); Schubert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(24):13057-62 (2000); Strack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(24):13063-8 (2000).

Se sabe que las cadenas cortas de Ub (de 1-3 moléculas) pueden "marcar" receptores de superficie para endocitosis y degradación en el lisosoma. Hicke, Trends Cell Biol., 9:107-112 (1999); Rotin et al., J. Membr. Biol., 176:1-17 (2000). Varias clases de proteínas que llevan el motivo P(T/S)AP son receptores de superficie que se sabe que se degradan a través de la ruta VPS o funcionan en la ruta VPS. Véase Farr et al., Biochem. J., 345(3):503-509 (2000); Staub y Rotin., Structure, 4:495-499 (1996). Aunque no se sabe si Tsg101 carece de actividad ubiquitina ligasa, se cree, basándose en el gran número de componentes que interaccionan con Tsg101 descubiertos según la presente invención, que un papel plausible para Tsg101 en la ruta de VPS es reconocer proteínas ubiquitinadas que llevan los motivos P(T/S)AP y ayudan a coordinar su incorporación en vesículas que geman dentro del MVB.

Esto es especialmente intrigante debido a que la formación del MVB es el único proceso celular conocido en el que la célula gema una vesícula fuera del citoplasma hacia otro compartimento. Esta gemación es equivalente topológicamente a la gemación viral en la que el virus gema hacia fuera del citoplasma en la membrana plasmática hacia el espacio extracelular. Por consiguiente, sin desear unirse a cualquier teoría, se cree que la unión del motivo P(T/S)AP a las poliproteínas GAG de lentivirus a la proteína celular Tsg101 permite a los lentivirus que tienen el motivo P(T/S)AP usurpar la maquinaria celular que se usa normalmente para la formación de MVB para permitir la gemación viral de la membrana plasmática. También se cree que la disminución de Tsg101 o la interferencia en la interacción entre Tsg101 y el motivo P(T/S)AP en células infectadas por lentivirus evitará la gemación lentiviral de las células.

Además, el reclutamiento de la maquinaria celular para facilitar la gemación viral parece ser un fenómeno general, y se han identificado distintos dominios tardíos en las proteínas estructurales de otros varios virus con cubierta. Véase Vogt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:12945-12947 (2000). Dos dominios tardíos bien caracterizados son el motivo "PY" (secuencia consenso: PPXY; X = cualquier aminoácido) que se encuentra en las proteínas asociadas a la membrana de ciertos virus con cubierta. Véase Craven et al., J. Virol., 73:3359-3365 (1999); Harty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:13871-13876 (2000); Harty et al., J. Virol., 73:2921-2929 (1999); y Jayakar et al., J. Virol., 74:9818-9827 (2000). La diana celular para el motivo PY es Nedd4 que también contiene un dominio ubiquitina E3 ligasa. El motivo "YL" (YXXL) se encontró en la proteína GAG del virus de la anemia infecciosa equina (VAIE). Puffer et al., J. Virol., 71:6541-6546 (1997); Puffer et al., J. Virol., 72:10218-10221 (1998). El receptor celular para el motivo "YL" parece ser la subunidad AP-50 de AP-2. Puffer et al., J. Virol., 72:10218-10221 (1998). De forma interesante, los dominios tardíos tales como el motivo P(T/S)AP, el motivo PY y el motivo YL todavía pueden funcionar cuando se mueven a diferentes posiciones dentro de las proteínas GAG retrovirales, lo que sugiere que son sitios de acoplamiento para factores celulares más que para elementos estructurales. Parent et al., J. Virol., 69:5455-5460 (1995); Yuan et al., EMBO J., 18:4700-4710 (2000). Es más, los dominios tardíos tales como el motivo P(T/S)AP, el motivo PY y el motivo YL pueden funcionar de forma intercambiable. Es decir, un motivo de dominio tardío puede usarse en lugar de otro motivo de dominio tardío sin afectar a la gemación viral. Parent et al., J. Virol., 69:5455-5460 (1995); Yuan et al., EMBO J., 18:4700-4710 (2000); Strack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:13063-13068 (2000).

Por consiguiente, aunque sin querer limitarse a ninguna teoría, se cree que tal como se muestra en la figura 1, aunque los tres motivos de dominio tardío se unen a diferentes dianas celulares, utilizan rutas celulares comunes para efectuar la gemación celular. En particular, se cree que los distintos receptores celulares para los motivos de dominio tardío viral se acoplan a etapas comunes posteriores a la clasificación vacuolar de proteínas (VPS) y la ruta MVB. Tal como se trató anteriormente, Tsg101 funciona en la ruta VPS. Otra proteína, Vps4 funciona en la ciclación de Tsg101 y el tráfico endosómico. Particularmente, los mutantes de Vps4 evitan el tráfico normal de Tsg101 e inducen la formación de endosomas altamente vacuolados, aberrantes, que son defectuosos para la clasificación y recirculación de los sustratos endocitados. Véase Babst et al, Traffic, 1:248-258 (2000).

De forma interesante, una búsqueda de una biblioteca de bazo con el gen de susceptibilidad tumoral de la proteína 101 (Tsg101) también identificó una interacción con la proteína específica de detención del crecimiento GAS7b. Además, tal como se describe en el documento de número de serie de solicitud provisional estadounidense legalmente cedida con número de serie 60/311.528, GAS7b es un componente que interacciona de la región de la cápside de la poliproteína GAG de VIH. GAS7b se expresa preferentemente en células que están entrando en el estado quiescente. La inhibición de la expresión de GAS7b en cultivos en diferenciación terminal de cerebelo murino embrionario impide el crecimiento de los axones, mientras que la sobreexpresión en cultivos celulares de neuroblastoma indiferenciado promueve drásticamente el crecimiento de estructuras similares a axones. Ju et al., Proc Natl Acad Sci 95(19):11423-8 (1998); Lazakovitch et al., Genomics 61(3):298-306 (1999). Estos hallazgos sugieren un papel de GAS7b en el control de la diferenciación celular terminal y la estructura del dominio de GAS7b sugiere que puede hacerlo regulando el citoesqueleto. Además, GAS7b también interacciona con dos reguladores diferentes de GTPasas pequeñas que controlan el citoesqueleto de actina. Las interacciones de GAS7b con la cápside de VIH y con Tsg101 (que a su vez interacciona con la proteína GAGp6 de VIH) sugiere con fuerza que estas proteínas forman un complejo multimolecular implicado en las fases tardías del ensamblaje y gemación virales.

2.2. Complejos proteicos

Tal como se trató anteriormente, el dominio UEV de la proteína Tsg101 y el motivo PTAP del GAGp6 de VIH son responsables de sus interacciones. Además, un examen de las variantes de la secuencia de aminoácidos de VIH-1 en GenBank por los inventores usando BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, herramienta de búsqueda de alineaciones locales básicas) identificó varias cepas de VIH en las que el motivo convencional PTAP estaba sustituido por variaciones del motivo, indicando que tales variaciones pueden permitir la gemación viral y que los péptidos con tales variaciones también pueden unirse a Tsg101. Las variaciones identificadas de este tipo incluyen el motivo PSAP, el motivo PIAP (Véase Zhang et al., J. Virol., 71:6662-6670 (1997); Farrar et al., J. Med. Virol., 34:104-113 (1991)) y el motivo PTTP (Véase Zhang et al., J. Virol., 71:6662-6670 (1997).

Por consiguiente, la presente invención proporciona un complejo proteico que tiene un homólogo o fragmento de Tsg101 como se ha definido anteriormente, que interacciona con el polipéptido GAG de VIH o un homólogo o fragmento del polipéptido GAG de VIH como se ha definido anteriormente. Aún en otra realización, se proporciona un complejo proteico que tiene un homólogo o fragmento de Tsg101 y un homólogo o fragmento del polipéptido GAG de VIH tal como se ha definido anteriormente. En otras palabras, uno o más de los elementos de proteína que interaccionan de un complejo proteico de la presente invención pueden ser una proteína nativa o un homólogo o fragmento de una proteína nativa. Tal como se definió en la sección 1 anterior, los homólogos de Tsg101 deben poder interaccionar con GAG de VIH (a través de la región GAGp6). Los homólogos y fragmentos de GAG de VIH son aquellos que pueden interaccionar con Tsg101. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de un homólogo es idéntica en al menos el 85%, el 90% o el 95% a la de su proteína nativa correspondiente.

Así, por ejemplo, un componente que interacciona de los complejos proteicos puede ser un homólogo de Tsg101 que comprende un dominio UEV, es idéntico en al menos 75% a la Tsg101 nativa y puede interaccionar con GAGp6 de VIH, un fragmento de Tsg101 que puede interaccionar con GAGp6 de VIH y que contiene el dominio UEV de la proteína Tsg101 (específicamente los residuos de aminoácido 1-207, los residuos de aminoácido 1-147, etc.) o una proteína de fusión que contiene (1) dicho homólogo de Tsg101 o (2) dicho fragmento de Tsg101.

El otro componente puede ser (1) un polipéptido GAG de VIH, (2) un homólogo del polipéptido GAG de VIH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 85%, el 90% o el 95% a la del polipéptido GAG de VIH y que puede interaccionar con Tsg101, (3) proteína GAGp6 de VIH, (4) un homólogo de GAGp6 de VIH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 80%, el 85%, el 90% o el 95% a la de GAGp6 de VIH y que puede interaccionar con Tsg101, (5) un fragmento de GAGp6 de VIH que puede interaccionar con Tsg101, o (6) una proteína de fusión que contiene un polipéptido GAG de VIH, un homólogo del polipéptido GAG de VIH, GAGp6 de VIH, un homólogo de GAGp6 de VIH o un fragmento de GAGp6 de VIH.

Los complejos proteicos de la presente invención contienen un polipéptido GAG de VIH como componente que interacciona. Además, se cree que los polipéptidos GAG y fragmentos de los mismos de otros retrovirus que contienen el motivo de dominio tardío P(T/S/I)(A/T)P (SEQ ID NOs:1-6) también interaccionan con Tsg101 de la misma manera que el polipéptido GAG de VIH. Por tanto, también pueden usarse en la formación de complejos proteicos con Tsg101 o un fragmento de la misma que contiene un motivo de dominio tardío P(T/S)AP. Preferiblemente, se usan polipéptidos GAG o fragmentos de los mismos de lentivirus que contienen el dominio tardío P(T/S)AP para formar complejos proteicos. Tales polipéptidos GAG o fragmentos de los mismos pueden ser de un lentivirus que no es de primates incluyendo lentivirus bovinos (por ejemplo virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB), virus de la enfermedad de Jembrana), lentivirus felinos (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) que provoca inmunodeficiencia, emaciación y encefalitis en gatos), y lentivirus ovino/caprino (por ejemplo virus de la encefalitis-artritis caprina (VEAC) que provoca anemia y emaciación en cabras, lentivirus ovino, virus Visna que provoca neumonía, emaciación, encefalitis y artritis). Preferiblemente, los polipéptidos GAG o fragmentos de los mismos son de lentivirus de primates incluyendo, pero sin limitarse a, virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), virus de la inmunodeficiencia humana tipo 2 (VIH-2), virus de la inmunodeficiencia humana tipo 3 (VIH-3) (todos los cuales provocan SIDA), y diversos virus de inmunodeficiencia del simio que infectan huéspedes tales como chimpancé, mangabey, mono verde africano, mandril, mono de L'Hoest, mono de Sykes o mono colobo blanco y negro.

Según la presente descripción, junto con los polipéptidos GAG retrovirales nativos, los componentes útiles que interaccionan con Tsg101 o un homólogo o derivado o fragmento de la misma también incluyen homólogos de los polipéptidos GAG retrovirales nativos que pueden interaccionar con Tsg101, derivados de los polipéptidos GAG nativos u homólogos que pueden interaccionar con Tsg101, fragmentos de los polipéptidos GAG que pueden interaccionar con Tsg101 (por ejemplo, un fragmento que contiene el motivo P(T/S)AP), derivados de los fragmentos del polipéptido GAG, o proteínas de fusión que contienen (1) un polipéptido GAG completo, (2) un homólogo del polipéptido GAG que puede interaccionar con Tsg101 o (3) un fragmento del polipéptido GAG que puede interaccionar
con Tsg101.

Los fragmentos Tsg101 que pueden interaccionar con GAGp6 de VIH se pueden proporcionar usando una combinación de modificar mediante ingeniería molecular un ácido nucleico que codifica para Tsg101 y un método para someter a prueba la interacción proteína-proteína. Por ejemplo, las coordenadas de la tabla 1 pueden usarse como puntos de partida y pueden generarse diversos fragmentos de Tsg101 que están dentro de las coordenadas, mediante deleciones desde cualquiera o ambos extremos de las coordenadas. Los fragmentos resultantes pueden someterse a prueba para determinar su capacidad para interaccionar con GAGp6 de VIH usando cualquier método conocido en la técnica para detectar interacciones proteína-proteína (por ejemplo, el método de doble híbrido en levadura). Asimismo, pueden identificarse fragmentos de GAG de VIH, fragmentos de GAGp6 de VIH y otros fragmentos de polipéptido GAG retroviral que pueden interaccionar con Tsg101 de forma similar.

En realizaciones específicas, el complejo proteico de la presente invención contiene un polipéptido que contiene un tramo contiguo de al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 o más residuos de aminoácido de una secuencia de GAG de VIH que se produce de forma natural. Preferiblemente, el polipéptido contiene un tramo contiguo de entre 10 y 20 residuos de aminoácido de una secuencia de GAG de VIH que se produce de forma natural. El tramo contiguo debe abarcar el motivo de dominio tardío de VIH que puede ser el motivo P(T/S)AP o una variación del mismo (por ejemplo, el motivo PIAP y el motivo PTTP). Preferiblemente, el motivo de dominio tardío en el tramo contiguo es el motivo P(T/S)AP. En otras realizaciones específicas, el complejo proteico contiene un polipéptido que contiene un tramo contiguo de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 o más residuos de aminoácido de una secuencia de polipéptido GAG que se produce de forma natural de otros retrovirus que contiene un motivo de dominio tardío P(T/S)AP. El tramo contiguo debe abarcar el motivo de dominio tardío de retrovirus. En realizaciones preferidas, tales otros retrovirus son lentivirus de primates y lentivirus que no son de primates (excepto el VAIE). En realizaciones específicas, el complejo proteico de la presente invención incluye un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de EPTAP (SEQ ID NO:7), EPSAP (SEQ ID NO:8), PTAPP (SEQ ID NO:9), PSAPP (SEQ ID NO:10), EPTAPP (SEQ ID NO:11), EPSAPP (SEQ ID NO:12), PEPTAP (SEQ ID NO:13), PEPSAP (SEQ ID NO:14), RPEPTAP (SEQ ID NO:15), RPEPSAP (SEQ ID NO:16), PEPTAPP (SEQ ID NO:17), PEPSAPP (SEQ ID NO:18), EPTAPPEE (SEQ ID NO:19), EPSAPPEE (SEQ ID NO:20), EPTAPPAE (SEQ ID NO:21), PEPTAPPEE (SEQ ID NO:22), PEPTAPPAE (SEQ ID NO:23), PEPSAPPEE (SEQ ID NO:24), RPEPTAPPEE (SEQ ID NO:25), RPEPSAPPEE (SEQ ID NO:26), RPEPTAPPAE (SEQ ID NO:27), RPEPSAPPAE (SEQ ID NO:28), LQSRPEPTAPPEE (SEQ ID NO:29), LQSRPEPSAPPEE (SEQ ID NO:30), LQSRPEPTAPPEES (SEQ ID NO:31) y LQSRPEPSAPPEES (SEQ ID NO:32).

Además, se cree que el propio motivo P(T/S)AP o PIAP o PTTP puede ser suficiente para la unión a Tsg101. Por consiguiente, también se proporciona un complejo proteico que contiene un homólogo de Tsg101 o un fragmento de Tsg101 como se ha definido anteriormente, que interacciona con un polipéptido que consiste esencialmente en el motivo P(T/S)AP o PIAP o PTTP, es decir, un polipéptido que tiene el motivo P(T/S)AP o PIAP o PTTP y unos cuantos aminoácidos flanqueantes.

En una realización específica del complejo proteico de la presente invención, se fusionan directamente juntos dos o más componentes que interaccionan (homólogos o fragmentos de Tsg101 como se han definido anteriormente y GAGp6 de VIH, u homólogos o fragmentos de las mismas como se han definido anteriormente), o se unen de forma covalente juntos a través de un ligador peptídico, formando una proteína híbrida que tiene una cadena polipeptídica sin ramificar sencilla. Por tanto, el complejo proteico puede formarse mediante interacciones "intramoleculares" entre dos partes de la proteína híbrida. De nuevo, uno o ambos de los componentes que interaccionan fusionados o unidos en esta complejo proteico pueden ser una proteína nativa o un homólogo o fragmento de una proteína nativa, como se ha definido anteriormente.

Los complejos proteicos de la presente invención también pueden estar en una forma modificada. Por ejemplo, puede unirse al complejo proteico un anticuerpo inmunorreactivo de forma selectiva con el complejo proteico. En otro ejemplo, puede incluirse un modulador que no es un anticuerpo que puede potenciar la interacción entre los componentes que interaccionan en el complejo proteico. Alternativamente, pueden reticularse los elementos proteicos en el complejo proteico con fines de estabilización. Pueden usarse diversos métodos de reticulación. Por ejemplo, puede usarse un reactivo bifuncional en la forma de R-S-S-R', en la que los grupos R y R' pueden reaccionar con ciertas cadenas laterales de aminoácidos en el complejo proteico formando uniones covalentes. Véase por ejemplo, Traut et al., en Creighton ed., Protein Function: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989; Baird et al., J. Biol. Chem., 251:6953-6962 (1976). Otros agentes de reticulación útiles incluyen, por ejemplo, reactivo de Denny-Jaffee, un resto fotoactivable heterobiofuncional que puede escindirse a través de una unión azo (Véase Denny et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:5286-5290 (1984)), y ^{125}I-{S-[N-(3-yodo-4-azidosalicil)cisteaminil]-2-tiopiridina}, un reactivo de fotoreticulación específico de cisteína (Véase Chen et al., Science, 265:90-92 (1994)).

Los complejos proteicos descritos anteriormente pueden incluir además cualquier componente adicional, por ejemplo, otras proteínas, ácidos nucleicos, moléculas lipídicas, monosacáridos o polisacáridos, iones u otras moléculas.

2.3. Métodos para preparar complejos proteicos

El complejo proteico de la presente invención puede prepararse mediante una variedad de métodos. Específicamente, puede aislarse un complejo proteico directamente a partir de una muestra de tejido animal, preferiblemente una muestra de tejido humano que contiene el complejo proteico. Alternativamente, puede purificarse un complejo proteico a partir de células huésped que expresan de forma recombinante los elementos del complejo proteico. Como resultará evidente para el experto en la técnica, puede prepararse un complejo proteico a partir de una muestra de tejido o una célula huésped recombinante mediante coimmunoprecipitación usando un anticuerpo inmunorreactivo con un componente proteico que interacciona, o preferiblemente un anticuerpo inmunorreactivo de forma selectiva con el complejo proteico como se tratará en detalle a continuación. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. La coimmunoprecipitación es un método que se usa comúnmente en la técnica para aislar o detectar proteínas unidas. En este procedimiento, se mezcla generalmente una muestra de suero o tejido o lisado celular con un anticuerpo adecuado. Se precipita el complejo proteico unido al anticuerpo y se lava. Después, se eluyen los complejos proteicos unidos.

Alternativamente, también pueden usarse cromatografía de inmunoafinidad y técnicas de inmunotransferencia para el aislamiento de los complejos proteicos a partir de muestras de tejido nativo o células huésped recombinantes usando un anticuerpo inmunorreactivo con un componente proteico con el que interacciona, o preferiblemente un anticuerpo inmunorreactivo de forma selectiva con el complejo proteico. Por ejemplo, en la cromatografía de inmunoafinidad de proteínas, el anticuerpo puede acoplarse de forma covalente o no covalente a una matriz tal como Sepharose en, por ejemplo, una columna. La muestra de tejido o lisado celular de las células recombinantes puede ponerse en contacto con el anticuerpo en la matriz. Entonces se lava la columna con una solución con bajo contenido en sales para eliminar por lavado los componentes no unidos. Los complejos proteicos que quedan retenidos en la columna deben eluirse de la columna usando una disolución de alto contenido en sales, un antígeno competitivo del anticuerpo, un disolvente caotrópico, o dodecilsulfato de sodio (SDS), o similares. En la inmunotransferencia, pueden fraccionarse muestras de proteínas en bruto a partir de una muestra de tejido o lisado de células huésped recombinantes en electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y después transferirse a, por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa. Puede identificarse la ubicación del complejo proteico en la membrana usando un anticuerpo específico, y posteriormente se aísla el complejo proteico.

En otra realización, pueden aislarse o purificarse componentes que interaccionan individuales independientemente de muestras de tejido o células recombinantes usando métodos similares a los descritos anteriormente. Los componentes proteicos que interaccionan individuales se ponen entonces en contacto entre sí en condiciones que conducen a la interacción entre ellos, formando así un complejo proteico de la presente invención. Se observa que diferentes interacciones proteína-proteína pueden requerir condiciones diferentes. Como punto de partida, por ejemplo, puede usarse un tampón que tiene Tris-HCl 20 mM, pH 7,0 y NaCl 500 mM. Pueden variarse varios parámetros diferentes incluyendo temperatura, pH, concentración de sales, agentes reductores, y similares. Puede requerirse algún grado menor de experimentación para determinar las condiciones de incubación óptimas, encontrándose esto entre las capacidades del experto en la técnica una vez haya sido informado de la presente descripción.

Aún en otra realización, el complejo proteico de la presente invención puede prepararse a partir de muestras de tejido o células huésped recombinantes u otras fuentes adecuadas mediante cromatografía de afinidad de proteínas o inmunotransferencia de afinidad. Es decir, se utiliza uno de los componentes proteicos que interaccionan para aislar el/los otro(s) componente(s) proteico(s) que interacciona(n), mediante afinidad de unión formando así complejos proteicos. Por tanto, un componente proteico que interacciona preparado mediante la purificación de muestras de tejido o mediante expresión recombinante o síntesis química puede unirse de manera covalente o no covalente a una matriz tal como Sepharose en, por ejemplo, una columna de cromatografía. La muestra de tejido o lisado celular de las células recombinantes puede ponerse en contacto con la proteína unida en la matriz. Se usa una disolución de bajo contenido en sales para eliminar por lavado los componentes no unidos, y luego se emplea una disolución de alto contenido en sales para eluir los complejos proteicos unidos en la columna. En inmunotransferencia de afinidad, pueden fraccionarse muestras de proteína en bruto de una muestra de tejido o lisado de células huésped recombinantes en una electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y entonces se transfieren a, por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa. El elemento proteico que interacciona purificado se une entonces a su(s) componente(s) proteico(s) que interacciona(n) en la membrana, formando complejos proteicos, que se aíslan entonces de la membrana.

Resultará evidente para los expertos en la técnica que puede usarse cualquier método de expresión recombinante en la presente invención para fines de expresar de manera recombinante los complejos proteicos o proteínas que interaccionan individuales. Generalmente, puede introducirse un ácido nucleico que codifica para un elemento proteico que interacciona en una célula huésped adecuada. Con el fin de formar de forma recombinante un complejo proteico en una célula huésped, deben introducirse ácidos nucleicos que codifican para dos o más elementos proteicos que interaccionan, en la célula huésped.

Normalmente, los ácidos nucleicos, preferiblemente en forma de ADN, se incorporan en un vector para formar vectores de expresión que pueden expresar el/los elemento(s) proteico(s) que interacciona(n) una vez se han introducido en una célula huésped. Pueden usarse muchos tipos de vectores para la presente invención. Los métodos para la construcción de un vector de expresión para los fines de esta invención deben ser evidentes para los expertos en la técnica informados de la presente descripción. Véase generalmente, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Cap. 13, 1988; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Cap. 3, 1986; Bitter, et al., en Métodos in Enzymology 153:516-544 (1987); The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I y II, 1982; y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989.

Generalmente, los vectores de expresión incluyen un casete de expresión que tiene un promotor operativamente unido a un ADN que codifica para un elemento proteico que interacciona. El promotor puede ser un promotor nativo, es decir, el promotor que se encuentra en las células que se producen de forma natural que es responsable de la expresión del elemento proteico que interacciona en las células. Alternativamente, el casete de expresión puede ser uno quimérico, es decir, que tiene un promotor heterólogo que no es el promotor nativo responsable de la expresión del elemento proteico que interacciona en las células que se producen de forma natural. El vector de expresión puede incluir además un origen de replicación de ADN para la replicación de los vectores en las células huésped. Preferiblemente, los vectores de expresión también incluyen un origen de replicación para la amplificación de los vectores en, por ejemplo, E. coli, y marcador(es) de selección para seleccionar y mantener solo aquellas células huésped que albergan los vectores de expresión. Adicionalmente, los casetes de expresión también contienen preferiblemente elementos inducibles, que funcionan controlando la transcripción del ADN que codifica para un elemento proteico que interacciona. También pueden incluirse operativamente otras secuencias reguladoras tales como secuencias de potenciadores transcripcionales y secuencias de regulación de la traducción (por ejemplo, secuencia de Shine-Dalgarno) en los casetes de expresión. También pueden unirse operativamente secuencias de terminación tales como las señales de poliadenilación de los genes de la hormona del crecimiento bovina, SV40, lacZ y proteína poliédrica AcMNPV al ADN que codifica para un elemento proteico que interacciona, en los casetes de expresión. También puede unirse operativamente una secuencia de codificación de una etiqueta de epítopo para la detección y/o purificación de la proteína expresada al ADN que codifica para un elemento proteico que interacciona de tal forma que se expresa una proteína de fusión. Los ejemplos de etiquetas de epítopo útiles incluyen, pero no se limitan a, hemaglutinina del virus influenza (HA), virus 5 de simio (V5), polihistidina (6xHis), c-myc, lacZ, GST, y similares. Las proteínas con etiquetas de polihistidina pueden detectarse y/o purificarse fácilmente con columnas de afinidad de Ni, mientras que los anticuerpos específicos inmunorreactivos con muchas etiquetas de epítopo están generalmente disponibles comercialmente. Los vectores de expresión también pueden contener componentes que dirijan la proteína expresada de forma extracelular o a un compartimento intracelular particular. Péptidos señal, secuencias de localización nuclear, señales de retención en el retículo endoplasmático, secuencias de localización mitocondrial, señales de miristoilación, señales de palmitoilación y secuencias transmembrana son ejemplos de componentes de vector opcionales que pueden determinar el destino de las proteínas expresadas. Cuando se desea expresar dos o más elementos proteicos que interaccionan en una única célula huésped, los fragmentos de ADN que codifican para los elementos proteicos que interaccionan pueden incorporarse en un único vector o en diferentes vectores.

Los vectores de expresión así construidos pueden introducirse en las células huésped mediante cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, mediante transformación directa de ADN, microinyección, electroporación, infección viral, lipofección, pistola génica, y similares. La expresión de los elementos proteicos que interaccionan puede ser transitoria o estable. Los vectores de expresión pueden mantenerse en las células huésped en un estado extracromosómico, es decir, como plásmidos o virus autorreplicantes. Alternativamente, los vectores de expresión pueden integrarse en los cromosomas de las células huésped mediante técnicas convencionales tales como selección de líneas celulares estables o recombinación específica del sitio. En las líneas celulares estables, al menos la parte del casete de expresión del vector de expresión se integra en un cromosoma de las células huésped.

El constructo de vector puede diseñarse para ser adecuado para la expresión en diversas células huésped, incluyendo pero sin limitarse a bacterias, células de levaduras, células vegetales, células de insectos y células de mamíferos y de seres humanos. Los métodos para preparar vectores de expresión para la expresión en diferentes células huésped deben resultar evidentes para un experto en la técnica.

Los homólogos y fragmentos de los elementos proteicos que interaccionan nativos también pueden expresarse fácilmente usando los métodos recombinantes descritos anteriormente. Por ejemplo, para expresar un fragmento de proteína, el fragmento de ADN incorporado en el vector de expresión puede seleccionarse de tal forma que sólo codifique para el fragmento de proteína. De igual forma, puede expresarse una proteína híbrida específica usando un ADN recombinante que codifica para la proteína híbrida. De forma similar, una proteína homóloga puede expresarse a partir de una secuencia de ADN que codifica para la proteína homóloga o fragmento de proteína. Una secuencia de ADN que codifica para un homólogo puede obtenerse mediante manipulación de la secuencia que codifica para la proteína nativa usando técnicas de ADN recombinante. Para este fin, puede realizarse mutagénesis dirigida al sitio o al azar usando técnicas generalmente conocidas en la técnica. Para preparar derivados de proteína, por ejemplo, puede cambiarse de forma predeterminada la secuencia de aminoácidos de un elemento proteico que interacciona nativo mediante mutagénesis de ADN dirigida al sitio para crear o eliminar secuencias consenso para, por ejemplo, la fosforilación por proteína cinasas, glucosilación, ribosilación, miristoilación, palmitoilación, y similares. Alternativamente, pueden incorporarse aminoácidos no naturales en un elemento proteico que interacciona durante la síntesis de la proteína en células huésped recombinantes. Por ejemplo, pueden incorporarse derivados de lisina fotorreactivos en un elemento proteico que interacciona durante la traducción usando un lisil-ARNt modificado. Véase, por ejemplo, Wiedmann et al., Nature, 328:830-833 (1989); Musch et al., Cell, 69:343-352 (1992). También pueden incorporarse otros derivados de aminoácido fotorreactivos de forma similar. Véase, por ejemplo, High et al., J. Biol. Chem., 368:28745-28751 (1993). De hecho, los derivados de aminoácido fotorreactivos así incorporados en un elemento proteico que interacciona pueden funcionar reticulando la proteína con su componente proteico con el que interacciona en un complejo proteico en condiciones predeterminadas.

Además, los derivados de los elementos proteicos que interaccionan nativos de la presente invención también pueden prepararse uniendo químicamente ciertos restos a las cadenas laterales de aminoácidos de las proteínas nativas.

Si se desea, los homólogos y derivados así generados pueden someterse a prueba para determinar si pueden interaccionar con sus supuestos componentes con los que interaccionan para formar complejos proteicos. Las pruebas pueden realizarse mediante, por ejemplo, el sistema de doble híbrido en levadura u otros métodos conocidos en la técnica para detectar la interacción proteína-proteína.

Una proteína híbrida tal como se describió anteriormente que tiene Tsg101 o un homólogo o fragmento de la misma unido de forma covalente mediante un enlace peptídico o un ligador peptídico a la GAG de VIH o GAGp6 de VIH, o un homólogo o fragmento de las mismas, puede expresarse de forma covalente a partir de un ácido nucleico quimérico, por ejemplo, un fragmento de ADN o ARNm que codifica para la proteína de fusión. Por consiguiente, la presente descripción también proporciona un ácido nucleico que codifica para la proteína híbrida de la presente invención. Además, también se describe un vector de expresión que tiene incorporado en su interior un ácido nucleico que codifica para la proteína híbrida de la presente invención. Los métodos para preparar tales ácidos nucleicos quiméricos y vectores de expresión que los contienen deben resultar evidentes para los expertos en la técnica informados de la presente descripción.

2.4. Microchips proteicos

Según otro aspecto, se describe un microchip o micromatriz proteico que tiene uno o más de los complejos proteicos y/o anticuerpos inmunorreactivos de forma selectiva con los complejos proteicos de la presente invención. Las micromatrices proteicas están ganando una importancia creciente tanto en investigación proteómica como en la detección basada en proteínas y el diagnóstico de enfermedades. Las micromatrices proteicas según esta realización serán útiles en una variedad de aplicaciones incluyendo, por ejemplo, selección de alto rendimiento o a gran escala para compuestos que pueden unirse a los complejos proteicos o modular las interacciones entre los elementos proteicos que interaccionan en los complejos proteicos.

La micromatriz proteica puede prepararse mediante varios métodos conocidos en la técnica. Un ejemplo de método adecuado es el descrito en MacBeath y Schreiber, Science, 289:1760-1763 (2000). Esencialmente, se tratan portaobjetos de microscopio de vidrio con un reactivo de silano que contiene aldehído (sustratos SuperAldehyde adquiridos de TeleChem International, Cupertino, California). Entonces se colocan como puntos volúmenes de nanolitros de muestras de proteínas en una solución salina tamponada con fosfato con glicerol al 40% sobre los portaobjetos tratados usando un robot de impresión por contacto de alta precisión. Tras la incubación, se sumergen los portaobjetos en un tampón que contiene albúmina sérica bovina (BSA) para extinguir los aldehídos sin reaccionar y formar una capa de BSA que funciona evitando la unión no específica de proteínas en las aplicaciones posteriores del microchip. Alternativamente, tal como se describió en MacBeath y Schreiber, pueden unirse las proteínas o complejos proteicos de la presente invención a un portaobjetos de BSA-NHS mediante uniones covalentes. Los portaobjetos de BSA-NHS se fabrican uniendo en primer lugar una capa molecular de BSA a la superficie de los portaobjetos de vidrio y después activando el BSA con carbonato de N,N'-disuccinimidilo. Como resultado, se activan los grupos amino de los residuos de lisina, aspartato y glutamato del BSA y pueden formar uniones amida o urea covalentes con muestras de proteínas colocadas como puntos en los portaobjetos. Véase MacBeath y Schreiber, Science, 289:1760-1763 (2000).

Otro ejemplo de método útil para preparare el microchip proteico es el descrito en las publicaciones PCT números WO 00/4389A2 y WO 00/04382, que están cedidas ambas a Zyomyx. En primer lugar, se cubre un sustrato o base de chip con una o más capas de una película orgánica delgada para eliminar cualquier defecto de superficie, aislar las proteínas del material de base, y garantizar una matriz de proteínas uniforme. A continuación, se disponen en forma de matriz una pluralidad de agentes de captura de proteínas (por ejemplo, anticuerpos, péptidos, etc.) y se unen a la base que está cubierta con la película delgada. Entonces pueden unirse las proteínas o complejos proteicos a los agentes de captura formando una micromatriz proteica. Los microchips proteicos se guardan en cámaras de flujo con una disolución acuosa.

La micromatriz proteica también puede prepararse mediante el método descrito en la publicación PCT número WO 99/36576 cedida a Packard Bioscience Company. Por ejemplo, se dispone en primer lugar una matriz de polímero hidrófilo tridimensional, es decir, un gel, sobre un sustrato sólido tal como un portaobjetos de vidrio. El gel de matriz de polímero puede expandirse o contraerse y contiene un agente de acoplamiento que reacciona con los grupos amina. Por tanto, las proteínas y complejos proteicos pueden ponerse en contacto con el gel de matriz en un estado poroso y acuoso expandido para permitir las reacciones entre los grupos amina de la proteína o complejos proteicos con los reactivos de acoplamiento, inmovilizando así las proteínas y complejos proteicos sobre el sustrato. A continuación, se contrae el gel para incluir las proteínas y los complejos proteicos unidos en el gel de matriz.

Alternativamente, las proteínas y complejos proteicos de la presente invención pueden incorporarse en un microchip proteico disponible comercialmente, por ejemplo, el sistema ProteinChip de Ciphergen Biosystems Inc., Palo Alto, CA. El sistema ProteinChip comprende chips de metal que tienen una superficie tratada, la cual interacciona con proteínas. Básicamente, se recubre una superficie de un chip de metal con una película de dióxido de silicio. Las moléculas de interés tales como proteínas y complejos proteicos pueden unirse entonces de forma covalente a la superficie del chip a través de un agente de acoplamiento de silano.

Los microchips proteicos también puede prepararse con otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en las patentes estadounidenses números 6.087.102, 6.139.831, 6.087.103; las publicaciones PCT números WO 99/60156, WO 99/39210, WO 00/54046, WO 00/53625, WO 99/51773, WO 99/35289, WO 97/42507, WO 01/01142, WO 00/63694, WO 00/61806, WO 99/61148, WO 99/40434.

3. Anticuerpos

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo inmunorreactivo frente a un complejo proteico de la presente invención como un compuesto adecuado para inhibir las partículas de virus de las células huésped. En una realización, el anticuerpo es inmunorreactivo de forma selectiva con un complejo proteico de la presente invención. Específicamente, la frase "inmunorreactivo de forma selectiva con un complejo proteico" tal como se usa en el presente documento significa que la inmunorreactividad del anticuerpo de la presente invención con el complejo proteico es sustancialmente superior que con los elementos que interaccionan individuales del complejo proteico, de forma que la unión del anticuerpo al complejo proteico es fácilmente distinguible de la unión del anticuerpo a los elementos proteicos que interaccionan individuales basándose en la intensidad de las afinidades de unión. Preferiblemente, la constante de unión difiere en una magnitud de al menos 2 veces, más preferiblemente al menos 5 veces, incluso más preferiblemente al menos 10 veces, y lo más preferiblemente al menos 100 veces. En una realización específica, el anticuerpo no es sustancialmente inmunorreactivo con los elementos proteicos que interaccionan del complejo proteico.

El anticuerpo de la presente invención puede prepararse fácilmente usando procedimientos generalmente conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1988. Normalmente, se usa el complejo proteico frente al cual será inmunorreactivo el anticuerpo que va a generarse como antígeno para el fin de producir una respuesta inmunitaria en un animal huésped. En una realización, el complejo proteico usado consiste en proteínas nativas. Preferiblemente, el complejo proteico incluye sólo los dominios de unión de Tsg101 y GAGp6 de VIH, respectivamente. Como resultado, una mayor parte de los anticuerpos totales pueden ser inmunorreactivos de forma selectiva con los complejos proteicos. Los dominios de unión pueden seleccionarse de, por ejemplo, los resumidos en la tabla 1. Además, también pueden emplearse diversas técnicas conocidas en la técnica para predecir epítopos para diseñar péptidos antigénicos basados en los elementos proteicos que interaccionan en un complejo proteico de la presente invención para aumentar la posibilidad de producir un anticuerpo inmunorreactivo de forma selectiva con el complejo proteico. Los programas informáticos de predicción de epítopos adecuados incluyen, por ejemplo, MacVector de International Biotechnologies, Inc. y Protean de DNAStar.

En una realización específica, se usa una proteína híbrida tal como se describió anteriormente en la sección 2 como antígeno que tiene un homólogo de Tsg101 o fragmento unido de forma covalente mediante un enlace peptídico o un ligador peptídico a GAG de VIH o GAGp6 de VIH o un homólogo o fragmento de la misma. En una realización preferida, la proteína híbrida consiste en dos dominios de unión que interaccionan seleccionados de la tabla 1, u homólogos de los mismos, unidos de manera covalente juntos mediante un enlace peptídico o una molécula
ligadora.

El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal frente a un complejo proteico de la presente invención. Para producir el anticuerpo policlonal, pueden emplearse diversos huéspedes animales, incluyendo, por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cabras, cobayas, hámsteres, etc. Puede administrarse directamente un antígeno adecuado que es un complejo proteico de la presente invención o un derivado del mismo, tal como se describió antes, directamente a un animal huésped para provocar reacciones inmunitarias. Alternativamente, puede administrarse junto con un vehículo tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina sérica bovina (BSA), ovoalbúmina, y toxoide tetánico. Opcionalmente, se conjuga el antígeno a un vehículo mediante un agente de acoplamiento tal como carbodiimida, glutaraldehído y MBS. Puede utilizarse cualquier adyuvante convencional para potenciar la respuesta inmunitaria del animal huésped frente al antígeno de complejo proteico. Los adyuvantes adecuados conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, adyuvante completo de Freund (que contiene células micobacterianas inactivadas y aceite mineral), adyuvante incompleto de Freund (que carece de los componentes celulares), sales de aluminio, MF59 de Biocine, monofosfolípido, dicorinomicolato de trehalosa (TDM) sintético y esqueleto de la pared celular (CWS) ambos de RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT, vesículas tensioactivas no iónicas (NISV) de Proteus International PLC, Cheshire, R.U., y saponinas. Puede administrarse la preparación de antígeno a un animal huésped mediante inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica o intraperitoneal, o mediante inyección en un órgano linfoide.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser monoclonales. Tales anticuerpos monoclonales pueden desarrollarse usando cualquier técnica convencional conocida en la técnica. Por ejemplo, el popular método del hibridoma descrito en Kohler y Milstein, Nature, 256:495-497 (1975) es actualmente una técnica bien desarrollada que puede usarse en la presente invención. Véase la patente estadounidense número 4.376.110. Esencialmente, pueden fusionarse linfocitos B que producen un anticuerpo policlonal frente a un complejo proteico de la presente invención con células de mieloma para generar una biblioteca de clones de hibridoma. La población de hibridomas se examina entonces para determinar la especificidad de la unión al antígeno y también para determinar la clase de inmunoglobulina (isotipo). De este modo, pueden seleccionarse clones puros de hibridoma que producen anticuerpos homogéneos específicos. Véase generalmente, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1988. Alternativamente, también pueden usarse otras técnicas conocidas en la técnica para preparar anticuerpos monoclonales, que incluyen pero no se limitan a la técnica del hibridoma de VEB, la técnica del hibridoma de células N humanas y la técnica de trioma.

Además, los anticuerpos inmunorreactivos de forma selectiva con un complejo proteico de la presente invención también pueden producirse de forma recombinante. Por ejemplo, pueden clonarse ADNc preparados mediante amplificación por PCR a partir de hibridomas o linfocitos B activados en un vector de expresión para formar una biblioteca de ADNc, que se introduce después en una célula huésped para su expresión recombinante. El ADNc que codifica para una proteína deseada específica puede aislarse entonces de la biblioteca. El ADNc aislado puede introducirse en una célula huésped adecuada para la expresión de la proteína. Por tanto, pueden usarse técnicas recombinantes para producir de forma recombinante anticuerpos nativos específicos, anticuerpos híbridos que pueden dar reacción simultánea con más de un antígeno, anticuerpos quiméricos (por ejemplo, las regiones constante y variable se derivan de fuentes diferentes), anticuerpos univalentes que comprenden un par de cadena pesada y ligera acoplado con la región Fc de una tercera cadena (pesada), proteínas Fab, y similares. Véase la patente estadounidense número 4.816.567; la publicación de patente europea 0088994; Munro, Nature, 312:597 (1984); Morrison, Science, 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques, 4:214 (1986); y Wood et al., Nature, 314:446-449 (1985). También pueden producirse de forma recombinante fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv), fragmentos Fab', y fragmentos F(ab')2 mediante los métodos descritos en, por ejemplo, la patente estadounidense número 4.946.778; Skerra & Plückthun, Science, 240:1038-1041(1988); Better et al., Science, 240:1041-1043 (1988); y Bird, et al., Science, 242:423-426 (1988).

En una realización preferida, los anticuerpos proporcionados según la presente invención son anticuerpos parcial o totalmente humanizados. Para este fin, puede usarse cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se describen anticuerpos quiméricos parcialmente humanizados que tienen las regiones V derivadas del anticuerpo monoclonal de ratón específico de tumores, pero tiene las regiones C humanas que se describen en Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1989). Además, pueden prepararse anticuerpos totalmente humanizados usando animales no humanos transgénicos. Por ejemplo, pueden producirse animales no humanos transgénicos tales como ratones transgénicos en los que se suprimen o delecionan genes de inmunoglobulina endógenos, mientras que los anticuerpos heterólogos están codificados por completo por genes de inmunoglobulina exógenos, preferiblemente genes de inmunoglobulina humanos, introducidos de forma recombinante en el genoma. Véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses números 5.530.101; 5.545.806; 6.075.181; la publicación PCT número WO 94/02602; Green et. al., Nat. Genetics, 7: 13-21 (1994); y Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994). El animal huésped no humano transgénico puede inmunizarse con antígenos adecuados tales como un complejo proteico de la presente invención o uno o más de los elementos proteicos que interaccionan del mismo para provocar una respuesta inmunitaria específica, produciendo así anticuerpos humanizados. Además, las líneas celulares que producen anticuerpos humanizados específicos también pueden derivarse de animales no humanos transgénicos inmunizados. Por ejemplo, pueden fusionarse linfocitos B maduros obtenidos a partir de un animal transgénico que produce anticuerpos humanizados con células de mieloma y pueden seleccionarse clones de hibridoma resultantes para anticuerpos humanizados específicos con especificidades de unión deseadas. Alternativamente, pueden extraerse ADNc de linfocitos B maduros y usarse en establecer una biblioteca que se examina posteriormente para determinar clones que codifican para anticuerpos humanizados con especificidades de unión deseadas.

Aún en otra realización, se proporciona un anticuerpo bifuncional que tiene dos sitios de unión a antígeno diferentes, siendo cada uno específico de un elemento proteico que interacciona diferente en un complejo proteico de la presente invención. Puede producirse el anticuerpo bifuncional usando una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden fusionarse juntos hibridomas que producen dos anticuerpos monoclonales diferentes. Uno de los dos hibridomas puede producir un anticuerpo monoclonal específico frente a un elemento proteico que interacciona de un complejo proteico de la presente invención, mientras que el otro hibridoma genera un anticuerpo monoclonal inmunorreactivo con otro elemento proteico que interacciona del complejo proteico. El nuevo hibridoma así formado produce diferentes anticuerpos que incluyen un anticuerpo bifuncional deseado, es decir, un anticuerpo inmunorreactivo frente a ambos elementos proteicos que interaccionan. El anticuerpo bifuncional puede purificarse fácilmente. Véase Milstein y Cuello, Nature, 305:537-540 (1983).

Alternativamente, también puede producirse un anticuerpo bifuncional usando agentes de reticulación heterobifuncionales para unir químicamente dos anticuerpos monoclonales diferentes, siendo cada uno inmunorreactivo con un elemento proteico que interacciona diferente de un complejo proteico. Por tanto, el agregado se unirá a dos elementos proteicos que interaccionan del complejo proteico. Véase Staerz et al, Nature, 314:628-631(1985); Perez et al, Nature, 316:354-356 (1985).

Además, también pueden producirse anticuerpos bifuncionales mediante la expresión de forma recombinante de los genes de la cadena ligera y pesada en un hibridoma que produce por sí mismo un anticuerpo monoclonal. Como resultado, se produce una mezcla de anticuerpos que incluye un anticuerpo bifuncional. Véase DeMonte et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:2941-2945 (1990); Lenz y Weidle, Gene, 87:213-218 (1990).

Preferiblemente, se produce un anticuerpo bifuncional según la presente invención mediante el método descrito en la patente estadounidense número 5.582.996. Por ejemplo, pueden proporcionarse y mezclarse juntos dos Fab diferentes. El primer Fab puede unirse a un elemento proteico que interacciona de un complejo proteico, y tiene una región constante de cadena pesada que tiene un primer dominio complementario que no está presente de forma natural en el Fab pero que puede unirse a un segundo dominio complementario. El segundo Fab puede unirse a otro elemento proteico que interacciona del complejo proteico, y tiene una región constante de cadena pesada que comprende un segundo dominio complementario que no está presente de forma natural en el Fab pero que puede unirse al primer dominio complementario. Cada uno de los dos dominios complementarios puede unirse de forma estable al otro, pero no a sí mismo. Por ejemplo, las regiones de cremallera de leucina de los oncogenes c-fos y c-jun pueden usarse como el primer y segundo dominios complementarios. Como resultado, el primer y segundo dominios complementarios interaccionan entre sí para formar una cremallera de leucina, asociando así los dos Fab diferentes en un constructo de anticuerpo único que puede unirse a dos sitios antigénicos.

También pueden usarse otros métodos adecuados conocidos en la técnica para producir anticuerpos bifuncionales, que incluyen los descritos en Holliger et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); de Kruif et al., J. Biol. Chem., 271:7630-7634 (1996); Coloma y Morrison, Nat. Biotechnol., 15:159-163 (1997); Muller et al., FEBS Lett., 422:259-264 (1998); y Muller et al., FEBS Lett., 432:45-49 (1998).

4. Ensayos de selección

Los complejos proteicos de la presente invención, Tsg101 y GAG de VIH o GAGp6 de VIH pueden usarse en ensayos de selección para seleccionar moduladores de Tsg101, GAGp6 de VIH, y complejos proteicos de la presente invención. Además, también pueden usarse homólogos y fragmentos de Tsg101, GAG de VIH, GAGp6 de VIH, como se han definido anteriormente y complejos proteicos que contienen tales homólogos y fragmentos en los ensayos de selección. Tal como se usa en el presente documento, el término "modulador" engloba cualquier compuesto que puede provocar cualquier forma de alteración de las propiedades, actividades o funciones biológicas de las proteínas o complejos proteicos, incluyendo, por ejemplo, potenciar o reducir sus actividades biológicas, aumentar o disminuir su estabilidad, alterar su afinidad o especificidad por ciertas otras moléculas biológicas, etc. Además, el término "modulador" tal como se usa en el presente documento también incluye cualquier compuesto que simplemente se une a Tsg101, GAGp6 de VIH, y/o los complejos proteicos de la presente invención. Por ejemplo, un modulador puede ser un agonista de interacción capaz de interferir en, o perturbar o disociar la interacción proteína-proteína entre Tsg101 o un homólogo de la misma y GAGp6 de VIH o un homólogo de la misma.

Asimismo, también pueden usarse otros polipéptidos GAG retrovirales que contienen el motivo de dominio tardío P(T/S)AP, o fragmentos del mismo en los ensayos de selección en lugar de GAG de VIH o GAGp6 de VIH. En otras palabras, puede usarse cualquiera de los elementos que interaccionan de los complejos proteicos proporcionados según la presente invención (por ejemplo, tal como se describe en la sección 2) en los ensayos de selección.

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El término "antagonista de interacción" tal como se usa en el presente documento significa un compuesto que interfiere en, bloquea, perturba o desestabiliza una interacción proteína-proteína; bloquea o interfiere en la formación de un complejo proteico; o desestabiliza, perturba o disocia un complejo proteico existente.

El término "agonista de interacción" tal como se usa en el presente documento significa un compuesto que desencadena, inicia, propaga, forma núcleos, o potencia de cualquier otra manera la formación de una interacción proteína-proteína; desencadena, inicia, propaga, forma núcleos o potencia de cualquier otra manera la formación de un complejo proteico; o estabiliza un complejo proteico existente.

Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos de selección para seleccionar moduladores de Tsg101 o GAGp6 de VIH o una forma mutante de las mismas, o un complejo proteico formado entre un homólogo de Tsg101 o fragmento y GAG de VIH o GAGp6 de VIH o un homólogo o fragmento de las mismas. Las dianas adecuadas en los métodos de selección de la presente invención pueden incluir cualquier realización de los complejos proteicos de la presente invención, tal como se describe en la sección 2. Preferiblemente, se usan fragmentos de proteína en la formación de los complejos proteicos. Por ejemplo, un complejo proteico diana preferido puede incluir un fragmento de la proteína Tsg101 que engloba el dominio UEV. También puede usarse, por ejemplo, GAGp6 de VIH o un fragmento de la misma en la formación de un complejo proteico diana. En una realización específica, se usa un polipéptido que incluye los primeros 14 aminoácidos de GAGp6 de VIH en la formación de un complejo proteico diana. En otra realización, se usan proteínas de fusión en las que se fusiona una etiqueta de epítopo detectable con un homólogo de Tsg101 o fragmento y/o a un polipéptido GAGp6 de VIH o un homólogo o fragmento del mismo. Los ejemplos adecuados de tale etiquetas de epítopo incluyen secuencias derivadas de, por ejemplo, hemaglutinina del virus influenza (HA), virus 5 de simio (V5), polihistidina (6xHis), c-myc, lacZ, GST, y similares.

Cuando se usa un homólogo de Tsg101 o fragmento como proteína diana en los métodos de selección de la presente invención, se incluye el dominio UEV de Tsg101 en el homólogo de Tsg101 o fragmento. Y se fusiona preferiblemente el homólogo de Tsg101 o fragmento con una etiqueta detectable tal como secuencias derivadas de, por ejemplo, hemaglutinina del virus influenza (HA), virus 5 de simio (V5), polihistidina (6xHis), c-myc, lacZ, GST, y similares. Con respecto a esto, pueden someterse a prueba los compuestos seleccionados mediante los métodos que pueden unirse al homólogo de Tsg101 o fragmento, preferiblemente el dominio UEV de la proteína Tsg101, para determinar su capacidad para inhibir o interferir en las interacciones entre Tsg101 y GAGp6 de VIH. También pueden someterse a prueba para determinar su capacidad para inhibir la gemación viral del VIH o la propagación del VIH. Los métodos adecuados para tales pruebas deben resultar aparentes para el experto en la técnica informado de la presente descripción.

Los moduladores seleccionados según los métodos de selección de la presente invención pueden ser eficaces en la modulación de las funciones o actividades de Tsg101, GAG de VIH, GAGp6 de VIH, otros polipéptidos GAG retrovirales que contienen el motivo P(T/S)AP, o los complejos proteicos de la presente invención. Por ejemplo, los compuestos que pueden unirse a los complejos proteicos pueden modular las funciones de los complejos proteicos. Adicionalmente, los compuestos que interfieren en, debilitan, disocian o perturban, o alternativamente, inician, facilitan o estabilizan la interacción proteína-proteína entre los elementos proteicos que interaccionan de los complejos proteicos también pueden ser eficaces en la modulación de las funciones o actividades de los complejos proteicos. Por tanto, pueden prepararse los compuestos identificados en los métodos de selección de la presente invención en fármacos terapéutica o profilácticamente eficaces para prevenir o mejorar enfermedades, trastornos o síntomas provocados por o asociados a los complejos proteicos o Tsg101 o GAG de VIH o GAGp6 de VIH u otros polipéptidos GAG retrovirales. Alternativamente, pueden usarse como líderes para ayudar al diseño e identificación de compuestos terapéutica o profilácticamente eficaces para enfermedades, trastornos o síntomas provocados por o asociados a los complejos proteicos de la presente invención o elementos que interaccionan de los mismos. Los complejos proteicos y/o elementos proteicos que interaccionan de los mismos según la presente invención pueden usarse en cualquiera de una variedad de técnicas de selección de fármacos. Puede realizarse la selección de fármacos según se describe en el presente documento o usando técnicas bien conocidas, tales como las descritas en las patentes estadounidenses números 5.800.998 y 5.891.628.

4.1. Compuestos de prueba

Cualquier compuesto de prueba puede examinarse en los ensayos de selección de la presente invención para seleccionar moduladores de un complejo proteico de la presente invención o elementos que interaccionan del mismo. Mediante el término "selección" o "seleccionar" moduladores se pretende englobar tanto (a) elegir compuestos de un grupo que anteriormente se desconocía que eran moduladores de un complejo proteico de la presente invención y/o un elemento que interacciona del mismo, y (b) someter a prueba compuestos que se sabe que pueden unirse, o modular las funciones y actividades de un complejo proteico de la presente invención y/o un elemento que interacciona del mismo. Ambos tipos de compuestos se denominan generalmente en el presente documento "compuestos de prueba". Los compuestos de prueba pueden incluir, a modo de ejemplo, proteínas (por ejemplo, anticuerpos, péptidos pequeños, proteínas artificiales o naturales), ácidos nucleicos, y derivados, miméticos y análogos de los mismos, y moléculas orgánicas pequeñas que tienen un peso molecular no superior a 10.000 dalton, más preferiblemente inferior a 5.000 dalton. Preferiblemente, se proporcionan los compuestos de prueba en los formatos de biblioteca conocidos en la técnica, por ejemplo, en bibliotecas sintetizadas químicamente, bibliotecas de expresión recombinante (por ejemplo, bibliotecas de exposición en fago), y bibliotecas basadas en traducción in vitro (por ejemplo, bibliotecas de exposición en ribosoma).

Por ejemplo, los ensayos de selección de la presente invención pueden usarse en los procedimientos de producción de anticuerpos descritos en la sección 3 para seleccionar anticuerpos con especificidades deseables. Pueden seleccionarse diversas formas de anticuerpos o derivados de los mismos, incluyendo pero sin limitarse a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos bifuncionales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv), fragmentos Fab', y fragmentos F(ab')_{2}, y diversas formas modificadas de anticuerpos tales como anticuerpos catalíticos, y anticuerpos conjugados a toxinas o fármacos, y similares. Los anticuerpos pueden ser de cualquier tipo tal como IgG, IgE, IgA o IgM. Se prefieren particularmente los anticuerpos humanizados. Preferiblemente, pueden proporcionarse los diversos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en bibliotecas para permitir una selección de alto rendimiento a gran escala. Por ejemplo, pueden construirse bibliotecas de expresión que expresan anticuerpos o fragmentos de anticuerpos mediante un método descrito, por ejemplo, en Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989). Los anticuerpos Fv de cadena sencilla (scFv) son de particular interés en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas. También se proporcionan métodos para proporcionar bibliotecas de anticuerpos en las patentes estadounidenses números 6.096.551; 5.844.093; 5.837.460; 5.789.208; y 5.667.988.

Los compuestos de prueba peptídicos pueden ser péptidos que tienen L-aminoácidos y/o D-aminoácidos, fosfopéptidos, y otros tipos de péptidos. Los péptidos seleccionados pueden ser de cualquier tamaño, pero preferiblemente tienen menos de aproximadamente 50 aminoácidos. Los péptidos pequeños son más fáciles de administrar en el organismo de un paciente. También pueden seleccionarse diversas formas de péptidos modificados. Al igual que los anticuerpos, los péptidos también pueden proporcionarse en, por ejemplo, bibliotecas combinatorias. Véase generalmente, Gallop et al., J. Med. Chem., 37:1233-1251 (1994). Se describen métodos para preparar bibliotecas de péptidos aleatorios, por ejemplo, en Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990). Otros métodos adecuados para construir bibliotecas de péptidos y seleccionar péptidos a partir de las mismas se describen, por ejemplo, en Scott y Smith, Science, 249:386-390 (1990); Moran et al., J. Am. Chem. Soc., 117:10787-10788 (1995) (una biblioteca de péptidos sintéticos marcados con etiqueta de forma electrónica); Stachelhaus et al., Science, 269:69-72 (1995); patentes estadounidenses números 6.156.511; 6.107.059; 6.015.561; 5.750.344; 5.834.318; 5.750.344. Por ejemplo, pueden generarse bibliotecas de exposición en fago de péptidos de secuencia al azar mediante clonación de oligonucleótidos sintéticos en el gen III o gen VIII de un fago filamentoso de E. coli. El fago así generado puede propagarse en E. coli y expresa péptidos codificados por los oligonucleótidos como proteínas de fusión en la superficie del fago. Scott y Smith, Science, 249:368-390 (1990). Alternativamente, también puede usarse el método de "péptidos en plásmidos" para formar bibliotecas de péptidos. En este método, pueden fusionarse péptidos al azar con el extremo C-terminal del represor Lac de E. coli mediante tecnologías recombinantes y expresarse a partir de un plásmido que también contiene los sitios de unión al represor Lac. Como resultado, los péptidos de fusión se unen al mismo plásmido que los
codifica.

Los compuestos no nucleotídicos, no peptídicos inorgánicos u orgánicos pequeños que tienen un peso molecular inferior a 5.000 dalton son compuestos de prueba preferidos para los ensayos de selección de la presente invención. Éstos también pueden proporcionarse en formato de biblioteca. Véase generalmente, Gordan et al. J. Med. Chem., 37:1385-1401 (1994). Por ejemplo, se proporcionan bibliotecas de benzodiazepinas en Bunin y Ellman, J. Am. Chem. Soc., 114:10997-10998 (1992). Se describe un método para construir y seleccionar bibliotecas de peptoides en Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371 (1992). Se describen métodos para la biosíntesis de policétidos novedosos en formato de biblioteca en McDaniel et al, Science, 262:1546-1550 (1993) y Kao et al., Science, 265:509-512 (1994). Se describen diversas bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas y métodos de construcción de las mismas en las patentes estadounidenses números 6.162.926 (derivados de fullereno sustituidos de manera múltiple); 6.093.798 (derivados de ácido hidroxámico); 5.962.337 (biblioteca combinatoria de 1,4-benzodiazepin-2,5-diona); 5.877.278 (síntesis de oligómeros N-substituidos); 5.866.341 (composiciones y métodos para examinar bibliotecas de fármacos); 5.792.821 (derivados de ciclodextrina polimerizables); 5.766.963 (biblioteca de hidroxipropilamina) y 5.698.685 (biblioteca combinatoria de subunidades de morfolina).

También pueden examinarse otros compuestos tales como oligonucleótidos y ácidos nucleicos peptídicos (PNA), y análogos y derivados de los mismos para seleccionar compuestos clínicamente útiles. También se conocen en la técnica bibliotecas combinatorias de oligonucleótidos. Véase Gold et al., J. Biol. Chem., 270:13581-13584 (1995).

4.2. Ensayos de selección in vitro

Los compuestos de prueba pueden examinarse en un ensayo in vitro para seleccionar los compuestos que pueden unirse a los complejos proteicos o elementos proteicos que interaccionan de los mismos según la presente invención. Para este fin, se pone en contacto un compuesto de prueba con un complejo proteico o un elemento proteico que interacciona del mismo en las condiciones y durante un tiempo suficiente como para permitir que se produzca la interacción específica entre el compuesto de prueba y los componentes diana y así la unión del compuesto a la diana formando un complejo. Posteriormente se detecta el acontecimiento de unión.

Pueden usarse diversas técnicas de selección conocidas en la técnica en la presente invención. Los complejos proteicos y los elementos proteicos que interaccionan de los mismos pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante expresión recombinante y purificación. Los complejos proteicos y/o elementos proteicos que interaccionan de los mismos (ambos se denominan "diana" más adelante en esta sección del presente documento) pueden estar libres en disolución o en extractos celulares. Puede mezclarse un compuesto de prueba con una diana formando una mezcla líquida. Puede marcarse el compuesto con un marcador detectable. Al mezclar en condiciones adecuadas, el complejo de unión que tiene el compuesto y la diana puede someterse a coinmunoprecipitación y lavarse. El compuesto del complejo precipitado puede detectarse basándose en el marcador del
compuesto.

En una realización preferida, se inmoviliza la diana en un soporte sólido o en una superficie celular. Preferiblemente, puede disponerse la diana en forma matriz para dar un microchip proteico en un método descrito en la sección 2. Por ejemplo, puede inmovilizarse una diana directamente sobre un sustrato de microchip tal como portaobjetos de vidrio o sobre placas de pocillos múltiples usando anticuerpos no neutralizantes, es decir, anticuerpos que pueden unirse a la diana pero que no afectan sustancialmente a sus actividades biológicas. Para efectuar la selección, los compuestos de prueba pueden ponerse en contacto con la diana inmovilizada para permitir que se produzca la unión para formar complejos en condiciones de ensayo de unión convencionales. O bien las dianas o bien los compuestos de prueba están marcados con un marcador detectable usando técnicas de marcaje bien conocidas. Por ejemplo, la patente estadounidense número 5.741.713 describe bibliotecas combinatorias de compuestos bioquímicos marcados con isótopos activos en RMN. Para seleccionar los compuestos de unión, puede medirse la formación de los complejos diana-compuesto de prueba o la cinética de la formación de los mismos. Cuando se examinan bibliotecas combinatorias de compuestos que no son ácidos nucleicos ni péptidos, se prefiere que se usen bibliotecas combinatorias codificadas o marcadas (o "etiquetadas") para permitir una rápida descodificación de las estructuras líder. Esto es especialmente importante debido a que, al contrario que las bibliotecas biológicas, los compuestos individuales encontrados en las bibliotecas químicas no pueden amplificarse mediante autoamplificación. Se proporcionan bibliotecas combinatorias etiquetadas en, por ejemplo, Borchardt y Still, J. Am. Chem. Soc., 116:373-374 (1994) y Moran et al., J. Am. Chem. Soc., 117:10787-10788 (1995).

Alternativamente, pueden inmovilizarse los compuestos de prueba en un soporte sólido, por ejemplo, formando una micromatriz de compuestos de prueba. La proteína o el complejo proteico diana se pone entonces en contacto con los compuestos de prueba. La diana puede estar marcada con cualquier marcador de detección adecuado. Por ejemplo, la diana puede estar marcada con isótopos radiactivos o marcadores de fluorescencia antes de que se produzca la reacción de unión. Alternativamente, tras las reacciones de unión, pueden usarse anticuerpos que son inmunorreactivos frente a la diana y que están marcados con materiales radiactivos, marcadores de fluorescencia, enzimas, o anticuerpos anti-Ig secundarios marcados para detectar cualquier diana unida seleccionando así el compuesto unido. Un ejemplo de esta realización es el método con sondas proteicas. Es decir, se usa la diana proporcionada según la presente invención como una sonda para examinar bibliotecas de expresión de proteínas o péptidos al azar. Las bibliotecas de expresión pueden ser bibliotecas de exposición en fago, bibliotecas basadas en traducción in vitro o bibliotecas de ADNc de expresión normal. Pueden inmovilizarse las bibliotecas en un soporte sólido tal como filtros de nitrocelulosa. Véase por ejemplo, Sikela y Hahn, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3038-3042 (1987). Puede marcarse la sonda con un isótopo radiactivo o un marcador de fluorescencia. Alternativamente, puede biotinilarse la sonda y detectarse con un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina. Más convenientemente puede detectarse la sonda unida con un anticuerpo.

Aún en otra realización, puede usarse en ensayos de unión competitiva un ligando conocido que puede unirse a la diana. Pueden formarse los complejos entre el ligando conocido y la diana y después ponerse en contacto con compuestos de prueba. Se mide la capacidad de un compuesto de prueba para interferir en la interacción entre la diana y el ligando conocido. Un ligando a modo de ejemplo es un anticuerpo que puede unirse específicamente a la diana. Particularmente, tal anticuerpo es especialmente útil para identificar péptidos que comparten uno o más determinantes antigénicos del complejo proteico diana o los elementos proteicos que interaccionan del mismo.

En una realización específica, un complejo proteico usado en el ensayo de selección incluye una proteína híbrida tal como se describe en la sección 2, que se forma por fusión de dos elementos proteicos que interaccionan o fragmentos o dominios de los mismos. También puede diseñarse la proteína híbrida de tal forma que contenga una etiqueta de epítopo detectable fusionada con ello. Los ejemplos adecuados de tales etiquetas de epítopo incluyen secuencias derivadas de, por ejemplo, hemaglutinina del virus influenza (HA), virus 5 de simio (V5), polihistidina (6xHis), c-myc, lacZ, GST y similares.

También pueden examinarse los compuestos de prueba en un ensayo in vitro para seleccionar antagonistas de interacción de los complejos proteicos identificados según la presente invención. Así, por ejemplo, puede ponerse en contacto un complejo proteico Tsg101-GAGp6 de VIH con un compuesto de prueba y puede detectarse la perturbación o desestabilización del complejo proteico.

El ensayo puede realizarse de formas similares a los ensayos de unión descritos anteriormente. Por ejemplo, puede detectarse la presencia o ausencia de un complejo proteico particular mediante un anticuerpo inmunorreactivo de forma selectiva con el complejo proteico. Así, tras la incubación del complejo proteico con un compuesto de prueba, puede realizarse un ensayo de inmunoprecipitación con el anticuerpo. Si el compuesto de prueba perturba el complejo proteico, entonces la cantidad del complejo proteico inmunoprecipitado en este ensayo será significativamente menor que en un ensayo control en el que no se pone en contacto el mismo complejo proteico con el compuesto de prueba. Otros diversos métodos de detección pueden ser adecuados en el ensayo de disociación, tal como resultará evidente para el experto en la técnica informado de la presente descripción. En una realización, se fija a un soporte sólido uno de los componentes que interaccionan con un marcador detectable fusionado con él. Por ejemplo, se une una proteína de fusión GST-GAGp6 a un soporte sólido. Después se pone en contacto el otro componente que interacciona con un marcador fusionado en él (por ejemplo, un fragmento de Tsg101 etiquetado con myc que contiene el dominio UEV) con el primer componente que interacciona inmovilizado en presencia de uno o más compuestos de prueba. Si se produce la unión entre los dos componentes que interaccionan, el fragmento de Tsg101 etiquetado con myc también está inmovilizado, lo que puede detectarse usando un anticuerpo anti-myc después de que la mezcla de reacción de unión se haya lavado para eliminar el fragmento de Tsg101 etiquetados con myc no unido.

4.3. Ensayos de selección in vivo

Los compuestos de prueba también pueden examinarse en ensayos in vivo para seleccionar moduladores de los complejos proteicos o elementos proteicos que interaccionan de los mismos según la presente invención. Por ejemplo, puede usarse cualquier ensayo in vivo conocido en la técnica útil en la selección de compuestos que pueden reforzar o interferir en la estabilidad de los complejos proteicos de la presente invención.

4.3.1. Ensayos de doble híbrido

En una realización preferida, se usa uno de los sistemas de doble híbrido en levadura o sus formas análogas o derivadas. Los ejemplos de sistemas de doble híbrido adecuados conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las patentes estadounidenses números 5.283.173; 5.525.490; 5.585.245; 5.637.463; 5.695.941; 5.733.726; 5.776.689; 5.885.779; 5.905.025; 6.037.136; 6.057.101; 6.114.111; y Bartel y Fields, eds., The Yeast Two-Hybrid System, Oxford University Press, Nueva York, NY, 1997.

Normalmente, en un ensayo de doble híbrido basado en transcripción clásico, se preparan dos genes quiméricos que codifican para dos proteínas de fusión: una contiene un dominio de activación de transcripción fusionado con un elemento proteico que interacciona de un complejo proteico de la presente invención o un dominio de interacción del elemento proteico que interacciona, mientras que la otra proteína de fusión incluye un dominio de unión a ADN fusionado con otro elemento proteico que interacciona del complejo proteico o un dominio de interacción del mismo. Con el fin de la conveniencia, los dos elementos proteicos que interaccionan o dominios de interacción de los mismos se denominan "proteína de fusión cebo" y "proteína de fusión presa," respectivamente. Los genes quiméricos que codifican para las proteínas de fusión se denominan "gen quimérico cebo" y "gen quimérico presa," respectivamente. Normalmente, se proporcionan un "vector cebo" y un "vector presa" para la expresión de un gen quimérico cebo y un gen quimérico presa, respectivamente.

4.3.1.1. Vectores

Pueden usarse muchos tipos de vectores en un ensayo de doble híbrido basado en transcripción. Los métodos para la construcción de vectores cebo y vectores presa deben resultar evidentes para los expertos en la técnica informados de la presente descripción. Véase generalmente, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Cap. 13, 1988; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Cap. 3, 1986; Bitter, et al., en Methods in Enzymology 153:516-544 (1987); The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I y II, 1982; y Rothstein en DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. 11, Ed. DM Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986.

Generalmente, los vectores cebo y presa incluyen un casete de expresión que tiene un promotor operativamente unido a un gen quimérico para la transcripción del gen quimérico. Los vectores también pueden incluir un origen de replicación de ADN para la replicación de los vectores en células huésped y un origen de replicación para la amplificación de los vectores en, por ejemplo, E. coli, y marcador(es) de selección para seleccionar y mantener sólo aquellas células huésped que alojan los vectores. Adicionalmente, el casete de expresión preferiblemente también contiene elementos inducibles que funcionan para controlar la expresión de un gen quimérico. Hacer la expresión de los genes quiméricos inducible y controlable es especialmente importante en el caso de que las proteínas de fusión o componentes de las mismas sean tóxicas para las células huésped. También pueden incluirse otras secuencias reguladoras tales como secuencias de potenciadores transcripcionales y secuencias de regulación de la traducción (por ejemplo, secuencia Shine-Dalgarno) en el casete de expresión. Las secuencias de terminación tales como las señales de poliadenilación de hormona del crecimiento bovina, SV40, lacZ y AcMNPV poliédrico también pueden estar operativamente unidas a un gen quimérico en el casete de expresión. También puede estar operativamente unida una secuencia que codifica para una etiqueta de epítopo para la detección y/o purificación de las proteínas de fusión al gen quimérico en el casete de expresión. Los ejemplos de etiquetas de epítopo útiles incluyen, pero no se limitan a, hemaglutinina del virus influenza (HA), virus 5 de simio (V5), polihistidina (6xHis), c-myc, lacZ, GST y similares. Las proteínas con etiquetas de polihistidina pueden detectarse y/o purificarse fácilmente con columnas de afinidad de Ni, mientras que los anticuerpos específicos frente a muchas etiquetas de epítopo están generalmente disponibles comercialmente. Los vectores pueden introducirse dentro de las células huésped mediante cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, mediante transformación de ADN directa, microinyección, electroporación, infección viral, lipofección, pistola génica y similares. Los vectores cebo y presa pueden mantenerse en las células huésped en un estado extracromosómico, es decir, como plásmidos o virus autorreplicantes. Alternativamente, pueden integrarse uno o ambos vectores en cromosomas de las células huésped mediante técnicas convencionales tales como selección de líneas celulares estables o recombinación específica de sitio.

Los ensayos in vivo de la presente invención pueden realizarse en muchas células huésped diferentes, incluyendo pero sin limitarse a bacterias, células de levadura, células vegetales, células de insectos y células de mamíferos. Un experto en la técnica reconocerá que los diseños de los vectores pueden variar con las células huésped usadas. En una realización, se realiza el ensayo en células procariotas tales como Escherichia coli, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas, Caulobacter y Rhizobium. Los orígenes de replicación adecuados para los vectores de expresión útiles en esta realización de la presente invención incluyen, por ejemplo, los orígenes de replicación ColE1, pSC101 y M13. Los ejemplos de promotores adecuados incluyen, por ejemplo, el promotor T7, el promotor lacZ y similares. Además, también son útiles los promotores inducibles en la modulación de la expresión de los genes quiméricos. Por ejemplo, el operón lac del bacteriófago lambda plac5 se conoce bien en la técnica y puede inducirse mediante la adición de IPTG al medio de crecimiento. Otros promotores inducibles conocidos útiles en un sistema de expresión en bacterias incluyen el pL del bacteriófago \lambda, el promotor trp y promotores híbridos tales como el promotor tac y similares.

Además, las secuencias marcadoras de selección para seleccionar y mantener sólo aquellas células que expresan las proteínas de fusión deseables también deben incorporarse en los vectores de expresión. Se conocen en la técnica numerosos marcadores de selección que incluyen marcadores auxótrofos y marcadores de resistencia a antibióticos y todos pueden ser útiles para los fines de esta invención. Por ejemplo, el gen bla que confiere resistencia a ampicilina es el marcador de selección más comúnmente usado en vectores de expresión de procariotas. Otros marcadores adecuados incluyen genes que confieren resistencia a neomicina, kanamicina o higromicina a las células huésped. De hecho, hay muchos vectores disponibles comercialmente de proveedores tales como Invitrogen Corp. de San Diego, Calif., Clontech Corp. de Palo Alto, Calif., BRL de Bethesda, Maryland y Promega Corp. de Madison, Wiscon. Estos vectores disponibles comercialmente, por ejemplo, pBR322, pSPORT, pBluescriptIISK, pcDNAI y pcDNAII tienen todos un sitio de clonación múltiple dentro del que pueden insertarse convenientemente los genes quiméricos de la presente invención usando técnicas recombinantes convencionales. Los vectores de expresión construidos pueden introducirse en células huésped mediante diversas técnicas de transformación o transfección generalmente conocidas
en la técnica.

En otra realización, se usan células de mamíferos como células huésped para la expresión de las proteínas de fusión y detección de interacciones proteína-proteína. Con este fin, puede usarse prácticamente cualquier célula de mamíferos incluyendo células de tejido normal, líneas celulares estables y células tumorales transformadas. Convenientemente, se usan las líneas celulares de mamíferos tales como células CHO, células Jurkat T, células NIH 3T3, células HEK-293, células CV-1, células COS-1, células HeLa, células VERO, células MDCK, células WI38 y similares. Los vectores de expresión de mamíferos se conocen bien en la técnica y muchos están disponibles comercialmente. Los ejemplos de promotores adecuados para la transcripción de los genes quiméricos en células de mamíferos incluyen promotores de transcripción viral derivados de adenovirus, virus 40 de simio (SV40) (por ejemplo, los promotores temprano y tardío de SV40), virus del sarcoma de Rous (RSV) y citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, el promotor inmediato-temprano de CMV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (por ejemplo, repetición terminal larga (LTR)), virus vaccinia (por ejemplo, el promotor 7,5K) y virus herpes simplex (VHS) (por ejemplo, el promotor de la timidina cinasa). También pueden usarse promotores inducibles. Los promotores inducibles adecuados incluyen, por ejemplo, el elemento de respuesta a tetraciclina (TRE) (véase Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), el promotor de la metalotioneina IIA, el promotor de respuesta a ecdisona y los promotores de choque térmico. Los orígenes de replicación adecuados para la replicación y mantenimiento de los vectores de expresión en células de mamíferos incluyen, por ejemplo, el origen de replicación del Epstein Barr en presencia del antígeno nuclear de Epstein Barr (véase Sugden et al., Mole. Cell. Biol., 5:410-413 (1985)) y el origen de replicación del SV40 en presencia del antígeno T de SV40 (que está presente en las células COS-1 y COS-7) (véase Margolskee et al., Mole. Cell. Biol., 8:2837 (1988)). Los marcadores de selección adecuados incluyen, pero no se limitan a, genes que confieren resistencia a neomicina, higromicina, zeocina y similares. Muchos vectores de expresión de mamíferos disponibles comercialmente pueden ser útiles para la presente invención, incluyendo, por ejemplo, pCEP4, pcADNI, pIND, pSecTag2, pVAX1, pcADN3.1 y pBI-EGFP, y pDisplay. Los vectores pueden introducirse en células de mamíferos usando cualquier técnica conocida tal como precipitación con fosfato de calcio, lipofección, electroporación y similares. El vector cebo y vector presa pueden cotransformarse en la misma célula o, alternativamente, introducirse en dos células diferentes que se fusionan juntas posteriormente mediante fusión celular u otras técnicas adecuadas.

Los vectores de expresión virales, que permiten la introducción de genes recombinantes en células mediante infección viral, también pueden usarse para la expresión de las proteínas de fusión. Los vectores de expresión virales conocidos generalmente en la técnica incluyen vectores virales basados en adenovirus, virus del papiloma bovino, virus de células madre murino (MSCV), virus MFG y retrovirus. Véase Sarver, et al., Mol. Cell. Biol., 1:486 (1981); Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3655-3659 (1984); Mackett, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:7415-7419 (1982); Mackett, et al., J. Virol., 49:857-864 (1984); Panicali, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:4927-4931 (1982); Cone & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6349-6353 (1984); Mann et al., Cell, 33:153-159 (1993); Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8392-8396 (1993); Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9146-9150 (1995); Kinsella et al., Human Gene Therapy, 7:1405-1413 (1996); Hofmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5185-5190 (1996); Choate et al., Human Gene Therapy, 7:2247 (1996); documento WO 94/19478; Hawley et al., Gene Therapy, 1:136 (1994) y Rivere et al., Genetics, 92:6733 (1995).

Generalmente, para construir un vector viral, puede unirse operativamente un gen quimérico según la presente invención a un promotor adecuado. El constructo promotor-gen quimérico se inserta entonces dentro de una región no esencial del vector viral, normalmente un genoma viral modificado. Esto da como resultado un virus recombinante viable que puede expresar la proteína de fusión codificada por el gen quimérico en células huésped infectadas. Una vez en la célula huésped, el virus recombinante normalmente se integra dentro del genoma de la célula huésped. Sin embargo, los virus de papiloma bovino recombinantes normalmente se replican y permanecen como elementos extracromosómicos.

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En otra realización, los ensayos de detección de la presente invención se realizan en sistemas de células vegetales. Los métodos para expresar proteínas exógenas en células vegetales se conocen bien en la técnica. Véase generalmente, Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, 1988; Grierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2ª Ed., Blackie, Londres, 1988. Pueden usarse todos los vectores de expresión de virus recombinantes basados en, por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor (VMCa) o el virus del mosaico del tabaco (VMT). Alternativamente, también son útiles los vectores de expresión de plásmidos recombinantes tales como vectores de plásmido Ti y vectores de plásmido Ri. Los genes quiméricos que codifican para las proteínas de fusión de la presente invención pueden clonarse convenientemente dentro de los vectores de expresión y colocarse bajo control de un promotor viral tal como los promotores de ARN de 35S y ARN de 19S del VMCa o el promotor de la proteína de la envuelta del VMT, o de un promotor de plantas, por ejemplo el promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO y promotores de choque térmico(por ejemplo, los promotores de hsp17.5-E o hsp17.3-B de semilla de soja).

Además, el ensayo in vivo de la presente invención también puede realizarse en células de insectos, por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda, usando un sistema de expresión de baculovirus. Los vectores de expresión y células huésped útiles en este sistema se conocen bien en la técnica y generalmente están disponibles de diversos proveedores comerciales. Por ejemplo, los genes quiméricos de la presente invención pueden clonarse convenientemente dentro de una región no esencial (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del vector del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) y colocado bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina). Los virus recombinantes no ocluidos así generados pueden usarse para infectar células huésped tales como células de Spodoptera frugiperda en las que se expresan los genes quiméricos. Véase la patente estadounidense número 4.215.051.

En una realización preferida de la presente invención, las proteínas de fusión se expresan en sistemas de expresión de levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris y Schizosaccharomyces pombe como células huésped. La expresión de proteínas recombinantes en levaduras es un campo muy desarrollado y las técnicas útiles a este respecto se describen en detalle en The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Vols. I y II, Cold Spring Harbor Press, 1982; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Nueva York, Wiley, 1994; y Guthrie y Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, en Methods in Enzymology, Vol. 194, 1991. Sudbery, Curr. Opin. Biotech., 7:517-524 (1996) revisa el éxito en la técnica de expresar proteínas recombinantes en diversas especies de levaduras. Además, Bartel y Fields, eds., The Yeast Two-Hybrid System, Oxford University Press, Nueva York, NY, 1997 contiene extensas discusiones sobre la expresión recombinante de proteínas de fusión en levaduras en el contexto de diversos sistemas de doble híbrido en levadura y cita numerosas referencias importantes. Estos y otros métodos conocidos en la técnica pueden usarse todos para los fines de la presente invención. La aplicación de tales métodos a la presente invención resultará evidente para un experto en la técnica informado de la presente descripción.

Generalmente, cada uno de los dos genes quiméricos se incluye en un vector de expresión separado (vector cebo y vector presa). Ambos vectores pueden cotransformarse en una única célula huésped de levadura. Tal como resultará evidente para el experto en la técnica, también es posible expresar ambos genes quiméricos a partir de un único vector. En una realización preferida, el vector cebo y el vector presa se introducen en dos células haploides de levadura de tipos de apareamiento opuestos, por ejemplo, tipo a y tipo \alpha, respectivamente. Las dos células haploides pueden aparearse en el momento deseado para formar una célula quimérica que expresa ambos genes quiméricos.

Generalmente, los vectores cebo y presa para la expresión recombinante en levaduras incluyen un origen de replicación de levaduras tal como el origen 2 \mu o la secuencia ARSH4 para la replicación y el mantenimiento de los vectores en células de levadura. Preferiblemente, los vectores también tienen un origen de replicación de bacterias (por ejemplo, ColE1) y un marcador de selección de bacterias (por ejemplo, el marcador amp^{R}, es decir, el gen bla). Opcionalmente, se incluye la secuencia centromérica CEN6 para controlar la replicación de los vectores en células de levadura. Cualquier promotor constitutivo o inducible que pueda dirigir la transcripción génica en células de levadura puede emplearse para controlar la expresión de los genes quiméricos. Tales promotores están operativamente unidos a los genes quiméricos. Los ejemplos de promotores constitutivos adecuados incluyen pero no se limitan a los promotores ADH1, PGK1, TEF2, GPD1, HIS3 y CYC1 de levaduras. Los ejemplos de promotores inducibles adecuados incluyen pero no se limitan a los promotores GAL1 (inducible por galactosa), CUP1 (inducible por Cu^{++}) y FUS1 (inducible por feromonas) de levaduras; el promotor AOX/MOX de H. polymorpha y P. Pastoris (reprimido por glucosa o etanol e inducido por metanol); promotores quiméricos tales como los que contienen los operadores LexA (inducibles por los factores de transcripción que contienen LexA); y similares. Se prefieren los promotores inducibles cuando las proteínas de fusión codificadas por los genes quiméricos son tóxicas para las células huésped. Si se desea, pueden estar operativamente unidas algunas secuencias represoras de la transcripción tales como la secuencia represora en sentido 5' (URS) del promotor SPO13 a la secuencia del promotor, por ejemplo, al extremo 5' de la región promotora. Tales secuencias represoras en sentido 5' funcionan ajustando de manera fina el nivel de expresión de los genes quiméricos.

Preferiblemente, una señal de terminación de la transcripción está operativamente unida a los genes quiméricos en los vectores. Generalmente, pueden usarse las secuencias señal de terminación de la transcripción derivadas de, por ejemplo, los genes CYC1 y ADH1.

Adicionalmente, se prefiere que el vector cebo y vector presa contengan uno o más marcadores seleccionables para la selección y el mantenimiento de sólo aquellas células de levadura que alojan un gen quimérico. Puede usarse cualquier marcador seleccionable conocido en la técnica para los fines de esta invención siempre que las células de levadura que expresan el/los gen(es) quimérico(s) puedan identificarse positivamente o seleccionadas negativamente. Los ejemplos de marcadores que pueden identificarse positivamente son los basados en ensayos de color, incluyendo el gen lacZ que codifica para la \beta-galactosidasa, el gen de la luciferasa de luciérnaga, la fosfatasa alcalina secretada, la peroxidasa de rábano, la proteína fluorescente azul (BFP) y el gen de la proteína fluorescente verde (GFP) (véase Cubitt et al., Trends Biochem. Sci., 20:448-455 (1995)). También pueden usarse otros marcadores que emiten fluorescencia, quimioluminiscencia, absorción UV, radiación infrarroja, y similares. Entre los marcadores que pueden seleccionarse están los marcadores auxótrofos que incluyen, pero no se limitan a, URA3, HIS3, TRP1, LEU2, LYS2, ADE2 y similares. Normalmente, para fines de selección auxótrofa, se cultivan las células huésped de levadura transformadas con vector cebo y/o vector presa en un medio que carece de un nutriente particular. Otros marcadores seleccionables no se basan en auxotrofismo, sino más bien en la resistencia o sensibilidad a un antibiótico u otro xenobiótico. Los ejemplos de tales marcadores incluyen pero no se limitan al gen de la cloranfenicol acetil transferasa (CAT), que confiere resistencia al cloranfenicol; el gen CAN1, que codifica para una arginina permeasa y de este modo convierte las células en sensibles a la canavanina (véase Sikorski et al., Meth. Enzymol., 194:302-318 (1991)); el gen de resistencia a kanamicina bacteriano (kan^{R}), que convierte las células eucariotas en resistentes al aminoglucósido G418 (véase Wach et al., Yeast, 10:1793-1808 (1994)); y el gen CYH2, que confiere sensibilidad a la cicloheximida (véase Sikorski et al., Meth. Enzymol., 194:302-318 (1991)). Además, el gen CUP1, que codifica para la metalotioneina y de este modo confiere resistencia al cobre, también es un marcador de selección adecuado. Cada uno de los marcadores de selección anteriores puede usarse solo o en combinación. Pueden incluirse uno o más marcadores de selección en un vector cebo o presa particular. El vector cebo y vector presa pueden tener marcadores de selección iguales o diferentes. Además, la presión de selección puede colocarse sobre las células huésped transformadas o bien antes o bien después de aparear las células de levadura haploides.

Tal como resultará evidente, los marcadores de selección usados deben suplementar las cepas huésped en las que se expresan los vectores cebo y/o presa. En otras palabras, cuando se usa un gen como gen marcador de selección, debe usarse una cepa de levadura que carece del gen marcador de selección (o que tiene una mutación en el gen correspondiente) como células huésped. Se conocen en la técnica numerosas cepas de levadura o cepas derivadas que corresponden a diversos marcadores de selección. Muchas de ellas se han desarrollado específicamente para algunos sistemas de doble híbrido en levadura. La aplicación y modificación opcional de tales cepas con respecto a la presente invención debe resultar evidente para un experto en la técnica informado de la presente descripción. Los métodos para manipular cepas de levadura genéticamente usando cruzamiento genético o mutagénesis recombinante son bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Rothstein, Meth. Enzymol., 101:202-211 (1983). A modo de ejemplo, las siguientes cepas de levadura se conocen bien en la técnica y pueden usarse en la presente invención con las modificaciones y ajustes necesarios:

cepa L40 que tiene el genotipo MATa his3\Delta200 trp1-901 leu2-3 ,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 URA3::(lexAop)8-lacZ;

cepa EGY48 que tiene el genotipo MAT\alpha trp1 his3 ura3 6ops-LEU2; y

cepa MaV103 que tiene el genotipo MAT\alpha ura3-52 leu2-3,112 trp1-901 his3\Delta200 ade2-101 gal4\Delta gal80\Delta SPAL10::URA3 GAL1::HIS3::lys2 (véase Kumar et al., J. Biol. Chem. 272:13548-13554 (1997); Vidal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10315-10320 (1996)). Tales cepas están generalmente disponibles en la comunidad investigadora y también pueden obtenerse mediante simple manipulación genética de levaduras. Véase, por ejemplo, The Yeast Two-Hybrid System, Bartel y Fields, eds., páginas 173-182, Oxford University Press, Nueva York, NY, 1997.

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Además, las siguientes cepas de levadura están disponibles comercialmente:

cepa Y190 que está disponible de Clontech, Palo Alto, California y tiene el genotipo MATa gal4 gal80 his3\Delta200 trp1-901 ade2-101 ura3-52 leu2-3, 112 URA3::GAL1-lacZ LYS2::GAL1-HIS3 cyh^{r}; y

cepa YRG-2 que está disponible de Stratagene, La Jolla, California y tiene el genotipo MAT\alpha ura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801 trp1-901 leu2-3, 112 gal4-542 gal80-538 LYS2::GAL1-HIS3 URA3::GAL1/CYC1-lacZ.

De hecho, están disponibles en kits diferentes versiones de vectores y cepas huésped diseñadas especialmente para análisis de sistemas de doble híbrido en levadura de proveedores comerciales tales como Clontech, Palo Alto, California y Stratagene, La Jolla, California, todas las cuales pueden modificarse para su uso en la presente invención.

4.3.1.2. Indicadores

Generalmente, en un ensayo de doble híbrido basado en transcripción, la interacción entre una proteína de fusión cebo y una proteína de fusión presa llevan a proximidad el dominio de unión a ADN y el dominio de activación de la transcripción formando un factor de transcripción funcional, que actúa sobre un promotor específico para dirigir la expresión de una proteína indicadora. El dominio de activación de la transcripción y el dominio de unión a ADN puede seleccionarse de diversos activadores de transcripción conocidos, por ejemplo, GAL4, GCN4, ARD1, el receptor de estrógenos humano, proteína LexA de E. coli, virus del herpes simplex VP16 (Triezenberg et al., Genes Dev. 2:718-729 (1988)), la proteína B42 de E. coli (mancha ácida, véase Gyuris et al., Cell, 75:791-803 (1993)), NF-kB p65 y similares. El gen indicador y el promotor que dirige su transcripción se incorporan normalmente en un vector indicador separado. Alternativamente, se modifican mediante ingeniería genética las células huésped para que contengan tal secuencia génica promotor-indicador en sus cromosomas. Por tanto, la interacción o carencia de interacción entre dos elementos proteicos que interaccionan de un complejo proteico puede determinarse mediante la detección o medición de los cambios en el indicador en el sistema del ensayo. Aunque los indicadores y los marcadores de selección pueden ser de tipos similares y usarse de forma similar en la presente invención, los indicadores y marcadores de selección deben seleccionarse con cuidado en un ensayo de detección particular de forma que puedan distinguirse entre sí y no interfieran en la función del otro.

Muchos tipos diferentes de indicadores son útiles en los ensayos de selección. Por ejemplo, una proteína indicadora puede ser una proteína de fusión que tiene una etiqueta de epítopo fusionada con una proteína. Las etiquetas de epítopo usadas habitualmente y disponibles comercialmente incluyen secuencias derivadas de, por ejemplo, hemaglutinina del virus influenza (HA), virus 5 de simio (V5), polihistidina (6xHis), c-myc, lacZ, GST y similares. Los anticuerpos específicos frente a estas etiquetas de epítopo generalmente están disponibles comercialmente. Por tanto, el indicador expresado puede detectarse usando un epítopo-anticuerpo específico en un inmunoensayo.

En otra realización, el indicador se selecciona de forma que pueda detectarse mediante un ensayo basado en color. Los ejemplos de tales indicadores incluyen, por ejemplo, la proteína de lacZ (\beta-galactosidasa), la proteína fluorescente verde (GFP), que puede detectarse mediante ensayos de fluorescencia y clasificarse mediante separación celular activada por flujo (FACS) (véase Cubitt et al., Trends Biochem. Sci., 20:448-455 (1995)), fosfatasa alcalina secretada, peroxidasa de rábano, la proteína fluorescente azul (BFP) y fotoproteínas de luciferasa tales como ecuorina, obelina, mnemiopsina y berovina (véase la patente estadounidense número 6.087.476).

Alternativamente, se usa un factor auxótrofo como indicador en una cepa huésped deficiente en el factor auxótrofo. Por tanto, los genes indicadores auxótrofos adecuados incluyen, pero no se limitan a, URA3, HIS3, TRP1, LEU2, LYS2, ADE2 y similares. Por ejemplo, pueden usarse células de levadura que contienen un gen URA3 mutante como células huésped (fenotipo Ura^{-}). Tales células carecen de la orotidina-5'-fosfato descarboxilasa funcional codificada por URA3, una enzima requerida por las células de levadura para la biosíntesis de uracilo. Como resultado, las células no pueden crecer en un medio que carece de uracilo. Sin embargo, la orotidina-5'-fosfato descarboxilasa de tipo natural cataliza la conversión de un compuesto no tóxico, el ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) en un producto tóxico, 5-fluorouracilo. Por tanto, las células de levadura que contienen un gen URA3 de tipo natural son sensibles al 5-FOA y no pueden crecer en un medio que contiene 5-FOA. Por tanto, cuando la interacción entre los elementos proteicos que interaccionan en las proteínas de fusión da como resultado la expresión de orotidina-5'-fosfato descarboxilasa activa, las células de levadura Ura^{-} (Foa^{R}) podrán crecer en un medio carente de uracilo (placas SC-Ura). Sin embargo, tales células no sobrevivirán en un medio que contenga 5-FOA. Así, las interacciones proteína-proteína pueden detectarse basándose en el crecimiento celular.

Adicionalmente, también pueden emplearse indicadores de resistencia a antibiótico de forma similar. A este respecto, se usan células huésped sensibles a antibióticos particulares. Los indicadores de resistencia a antibióticos incluyen, por ejemplo, el gen de la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) y el gen kan^{R}, que confiere resistencia a G418 en eucariotas y a kanamicina en procariotas.

4.3.1.3. Ensayos de selección para agonistas de interacción

El ensayo de selección de la presente invención es útil para seleccionar compuestos que pueden interferir en o perturbar o disociar la interacción proteína-proteína en los complejos proteicos de la presente invención, es decir, interacciones entre un homólogo de Tsg101 o fragmento y GAG de VIH, GAGp6 de VIH, otras GAG retrovirales que contienen un motivo del dominio tardío P(T/S)AP, o un homólogo o derivado de las mismas como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, Tsg101 y GAG de VIH desempeñan un papel en la propagación del VIH y por tanto, están implicadas en la infección por VIH y SIDA. Puede ser posible mejorar o aliviar las enfermedades o trastornos en un paciente interfiriendo en o disociando las interacciones normales entre Tsg101 y GAG de VIH. Alternativamente, si la enfermedad o trastorno está asociada con un aumento de la expresión de Tsg101 y/o GAG de VIH según la presente invención, entonces la enfermedad puede tratarse o prevenirse mediante debilitamiento o disociación de la interacción entre Tsg101 y GAG de VIH en un paciente. Además, si una enfermedad o trastorno está asociado con formas mutantes de Tsg101 y/o GAG de VIH que conducen a una interacción proteína-proteína fortalecida entre las mismas, entonces la enfermedad o trastorno puede tratarse con un compuesto que debilita o interfiere en la interacción entre las formas mutantes de Tsg101 y GAG de VIH.

En un ensayo de selección para antagonistas de interacción, Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH, por ejemplo, se usan como proteínas de prueba expresadas en forma de proteínas de fusión tal como se describió anteriormente con fines de un ensayo de doble híbrido. Las proteínas de fusión se expresan en una célula huésped y se permite que interaccionen entre sí en presencia de uno o más compuestos de prueba.

En una realización preferida, se usa un marcador contraseleccionable como indicador de manera que esté presente una señal detectable (por ejemplo, aparición de color o fluorescencia, o supervivencia celular) sólo cuando el compuesto de prueba pueda interferir en la interacción entre las dos proteínas de prueba. A este respecto, pueden emplearse los indicadores usados en diversos "sistemas de doble híbrido inversos" conocidos en la técnica. Los sistemas de doble híbrido inversos se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 5.525.490; 5.733.726; 5.885.779; Vidal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10315-10320 (1996); y Vidal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10321-10326 (1996).

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Los ejemplos de indicadores contraseleccionables útiles en un sistema de levaduras incluyen el gen URA3 (que codifica para orotidina-5'-descarboxilasa, que convierte el ácido 5-fluroorótico (5-FOA) en el metabolito tóxico 5-fluorouracilo), el gen CAN1 (que codifica para arginina permeasa, que transporta el análogo de arginina tóxico canavanina dentro de las células de levadura), el gen GAL1 (que codifica para la galactocinasa, que cataliza la conversión de 2-desoxigalactosa en 2-desoxigalactosa-1-fosfato tóxica), el gen LYS2 (que codifica para \alpha-aminoadipato reductasa, que convierte las células de levadura en incapaces para crecer en un medio que contiene \alpha-aminoadipato como única fuente de nitrógeno), el gen MET15 (que codifica para O-acetilhomoserina sulfhidrilasa, que confiere a las células de levadura sensibilidad a metilmercurio) y el gen CYH2 (que codifica para la proteína ribosómica L29, que confiere sensibilidad a cicloheximida). Además, también puede usarse cualquier agente citotóxico conocido, incluyendo proteínas citotóxicas tales como el dominio catalítico de la toxina diftérica (DTA) como indicadores contraseleccionables. Véase la patente estadounidense número 5.733.726. La DTA provoca la ADP-ribosilación del factor de elongación 2 y por tanto inhibe la síntesis de proteínas y provoca muerte celular. Otros ejemplos de agentes citotóxicos incluyen ricina, toxina Shiga y exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa.

Por ejemplo, cuando se usa el gen URA3 como gen indicador contraseleccionable, las células de levadura que contienen un gen URA3 mutante pueden usarse como células huésped (fenotipo Ura^{-} Foa^{R}) para el ensayo in vivo. Tales células carecen de orotidina-5'-fosfato descarboxilasa funcional codificada por URA3, una enzima requerida para la biosíntesis de uracilo. Como resultado, las células no pueden crecer en un medio carente de uracilo. Sin embargo, debido a la ausencia de una orotidina-5'-fosfato descarboxilasa de tipo natural, las células de levadura no pueden convertir el ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) no tóxico en un producto tóxico, 5-fluorouracilo. Por tanto, tales células de levadura son resistentes a 5-FOA y pueden crecer en un medio que contiene 5-FOA. Por tanto, por ejemplo, para seleccionar un compuesto que puede perturbar la interacción entre Tsg101 y GAGp6 de VIH, puede expresarse Tsg101 como una proteína de fusión con un dominio de unión a ADN de un activador de la transcripción adecuado mientras que GAGp6 de VIH se expresa como una proteína de fusión con un dominio de activación de la transcripción de un activador de la transcripción adecuado. En la cepa huésped, el gen URA3 indicador puede estar operativamente unido a un promotor que responde específicamente a la asociación del dominio de activación de la transcripción activación dominio y el dominio de unión a ADN. Después de que se expresen las proteínas de fusión en las células de levadura Ura^{-} Foa^{R}, puede realizarse un ensayo de selección in vivo en presencia de un compuesto de prueba cultivándose las células de levadura en un medio que contiene uracilo y 5-FOA. Si el compuesto de prueba no perturba la interacción entre Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH, se expresa el producto del gen URA3 activo, es decir, orotidina-5'-descarboxilasa, que convierte 5-FOA en 5-fluorouracilo tóxico. Como resultado, las células de levadura no pueden crecer. Por otro lado, cuando el compuesto de prueba perturba la interacción entre Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH, no se produce orotidina-5'-descarboxilasa en las células huésped de levadura. Por consiguiente, las células de levadura sobrevivirán y crecerán en el medio que contiene 5-FOA. Por tanto, los compuestos que pueden interferir en o disociar la interacción entre Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH pueden identificarse así basándose en la formación
de colonias.

Tal como resultará evidente, el ensayo de selección de la presente invención puede aplicarse en un formato apropiado para selección a gran escala. Por ejemplo, pueden emplearse tecnologías combinatorias para construir bibliotecas combinatorias de moléculas orgánicas pequeñas o péptidos pequeños. Véase generalmente, por ejemplo, Kenan et al., Trends Biochem. Sc., 19:57-64 (1994); Gallop et al., J. Med. Chem., 37:1233-1251 (1994); Gordon et al., J. Med. Chem., 37:1385-1401 (1994); Ecker et al., Biotechnology, 13:351-360 (1995). Tales bibliotecas de compuestos combinatorias pueden aplicarse al ensayo de selección de la presente invención para aislar moduladores específicos de interacciones proteína-proteína particulares. En caso de bibliotecas de péptidos al azar, los péptidos al azar pueden expresarse conjuntamente con las proteínas de fusión de la presente invención en células huésped y someterse a ensayo in vivo. Véase por ejemplo, Yang et al., Nucl. Acids Res., 23:1152-1156 (1995). Alternativamente, pueden añadirse al medio de cultivo para la captación por las células huésped.

Convenientemente, se usa el apareamiento de levaduras en un ensayo de selección in vivo. Por ejemplo, se aparean células haploides de tipo de apareamiento a que expresan una proteína de fusión tal como se describe anteriormente con células haploides del tipo de apareamiento \alpha que expresan la otra proteína de fusión. Tras el apareamiento, las células diploides se extienden en un medio adecuado para formar un césped. Pueden depositarse gotas de compuestos de prueba sobre diferentes áreas del césped. Tras cultivar el césped durante un periodo de tiempo apropiado, pueden identificarse las gotas que contienen un compuesto que puede modular la interacción entre las proteínas de prueba particulares en las proteínas de fusión mediante estimulación o inhibición de crecimiento en la proximidad de las gotas.

Los ensayos de selección de la presente invención para seleccionar compuestos que pueden modular las interacciones proteína-proteína también pueden ajustarse de manera fina mediante diversas técnicas para ajustar los umbrales o sensibilidad de las selecciones positiva y negativa. Pueden introducirse mutaciones en las proteínas indicadoras para ajustar sus actividades. También puede ajustarse la captación de compuestos de prueba por las células huésped. Por ejemplo, los mutantes de alta captación de levaduras tales como las cepas mutantes erg6 pueden facilitar la captación de la levadura de los compuestos de prueba. Véase Gaber et al., Mol. Cell. Biol., 9:3447-3456 (1989). Asimismo, también puede ajustarse de manera fina la captación de los compuestos de selección tales como 5-FOA, 2-desoxigalactosa, cicloheximida, \alpha-aminoadipato y similares.

4.4. Selección virtual y optimización de compuestos

Una vez que se han seleccionado los compuestos de prueba que pueden modular la interacción proteína-proteína entre los componentes que interaccionan de un complejo proteico de la presente invención, puede generarse un conjunto de datos que define la identidad o las características de los compuestos de prueba. El conjunto de datos puede incluir información referente a las propiedades de un compuesto de prueba seleccionado, por ejemplo, estructura química, quiralidad, peso molecular, punto de fusión, etc. Alternativamente, el conjunto de datos puede incluir simplemente los números de identificación asignados entendidos por los investigadores que realizan el ensayo de selección y/o investigadores que reciben el conjunto de datos que representan compuestos de prueba específicos. Los datos o la información pueden difundirse de una forma transmisible que pueda comunicarse o transmitirse a otros investigadores, particularmente investigadores en un país diferente. Una forma transmisible de este tipo puede variar y ser tangible o intangible. Por ejemplo, el conjunto de datos que define uno o más compuestos de prueba seleccionados puede plasmarse en textos, tablas, diagramas, estructuras moleculares, fotografías, gráficas, imágenes o cualquier otra forma visual. Los datos o la información pueden grabarse en medios tangibles tales como papel o plasmarse en formas que pueden leerse en un ordenador (por ejemplo, señales electrónicas, electromagnéticas, ópticas u otras). Los datos en una forma que puede leerse en un ordenador pueden almacenarse en un medio de almacenamiento que puede usarse en un ordenador (por ejemplo, disquetes, cintas magnéticas, discos ópticos y similares) o transmitirse directamente a través de una infraestructura de comunicación. En particular, los datos plasmados en señales electrónicas pueden transmitirse en forma de email o ponerse en un sitio web en Internet o Intranet. Además, la información o los datos sobre un compuesto de prueba seleccionado también pueden grabarse en forma de audio y transmitirse mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, líneas de cable analógicas o digitales, cables de fibra óptica, etc., mediante teléfono, facsímil, teléfono móvil sin cables, teléfono por internet y similares.

Así, la información y datos sobre un compuesto de prueba seleccionado en un ensayo de selección descrito anteriormente o mediante selección virtual tal como se discute a continuación puede producirse en cualquier parte del mundo y transmitirse a una ubicación diferente. Por ejemplo, cuando un ensayo de selección se realiza en otro país, pueden generarse y emitirse la información y los datos sobre un compuesto de prueba seleccionado en una forma transmisible tal como se describió anteriormente. Los datos y la información en forma transmisible pueden, por tanto, importarse a los EE.UU. o transmitirse a cualquier otro país, en el que pueden usarse los datos y la información en pruebas adicionales del compuesto de prueba seleccionado y/o para modificar y optimizar el compuesto de prueba seleccionado para desarrollar compuestos de partida para pruebas en ensayos clínicos.

También pueden seleccionarse los compuestos basándose en modelos estructurales de la proteína o complejo proteico diana y/o compuestos de prueba, por ejemplo, mediante selección virtual. Además, una vez que se identifica un compuesto eficaz, los análogos estructurales o miméticos de los mismos pueden producirse basándose en diseño racional de fármacos con el objetivo de mejorar la eficacia y estabilidad del fármaco, y reducir los efectos secundarios. Pueden usarse los métodos conocidos en la técnica para la selección virtual y el diseño racional de fármacos en la presente invención. Véase, por ejemplo, Hodgson et al., Bio/Technology, 9:19-21 (1991); patentes estadounidenses números 5.800.998 y 5.891.628. Un ejemplo de diseño racional de fármacos es el desarrollo de inhibidores de proteasas de VIH. Véase Erickson et al., Science, 249:527-533 (1990).

A este respecto, se obtiene la información estructural sobre la proteína o complejo proteico diana. Preferiblemente, se obtienen coordenadas atómicas que definen una estructura tridimensional de la proteína o complejo proteico diana. Por ejemplo, puede expresarse y purificarse cada uno de los pares que interaccionan. Después, se permite que los pares de proteínas que interaccionan purificados interaccionen entre sí in vitro en condiciones apropiadas. Opcionalmente, puede estabilizarse el complejo proteico que interacciona mediante reticulación u otras técnicas. El complejo que interacciona puede estudiarse usando diversas técnicas biofísicas que incluyen, por ejemplo, cristalografía por rayos X, RMN, modelado por ordenador, espectrometría de masas y similares. Los métodos para obtener tales coordenadas atómicas mediante cristalografía por rayos X, RMN y similares se conocen en la técnica y la aplicación de los mismos a la proteína o complejo proteico diana de la presente invención deben resultar evidentes para los expertos en la técnica de biología estructural. Véase Smyth y Martin, Mol. Pathol., 53:8-14 (2000); Oakley y Wilce, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 27(3):145-151 (2000); Ferentz y Wagner, Q. Rev. Biophys., 33:29-65 (2000); y Roberts, Curr. Opin. Biotechnol., 10:42-47 (1999).

Además, el entendimiento de la interacción entre las proteínas de interés en presencia o ausencia de un compuesto modulador también pueden derivarse de análisis de mutagénesis usando un sistema de doble híbrido en levadura u otros métodos para detectar la interacción proteína-proteína. A este respecto, pueden introducirse diversas mutaciones en las proteínas que interaccionan y se examina el efecto de las mutaciones sobre la interacción proteína-proteína mediante un método adecuado tal como el sistema de doble híbrido en levadura.

Pueden introducirse diversas mutaciones incluyendo sustituciones, deleciones e inserciones de aminoácido en una secuencia proteica usando tecnologías de ADN recombinante convencionales. Generalmente, es particularmente deseable descifrar los sitios de unión. Por tanto, es importante que las mutaciones introducidas sólo afecten a la interacción proteína-proteína o la interacción proteína-compuesto y provoque alteraciones estructurales mínimas. Las mutaciones se diseñan preferiblemente basándose en el conocimiento de la estructura tridimensional de las proteínas que interaccionan. Preferiblemente, se introducen las mutaciones para alterar los aminoácidos cargados o los aminoácidos hidrófobos expuestos sobre la superficie de las proteínas, ya que las interacciones iónicas y las interacciones hidrófobas están implicadas a menudo en las interacciones proteína-proteína. Alternativamente, se usa la técnica de "mutagénesis mediante alanina". Véase Wells, et al., Methods Enzymol., 202:301-306 (1991); Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4498-4502 (1991); Bennet et al., J. Biol. Chem., 266:5191-5201 (1991); Diamond et al., J. Virol., 68:863-876 (1994). Usando esta técnica, los residuos de aminoácido cargados o hidrófobos de las proteínas que interaccionan se sustituyen por alanina y se analiza el efecto sobre la interacción entre las proteínas usando por ejemplo, el sistema de doble híbrido en levadura. Por ejemplo, puede examinarse la secuencia proteica completa en una ventana de cinco aminoácidos. Cuando aparecen dos o más aminoácidos cargados o hidrófobos en una ventana, los aminoácidos cargados o hidrófobos se cambian a alanina usando técnicas de ADN recombinante convencionales. Las proteínas así mutadas se usan como "proteínas de prueba" en el ensayo de doble híbrido descrito anteriormente para examinar el efecto de las mutaciones sobre la interacción proteína-proteína. Preferiblemente, se realiza el análisis de la mutagénesis tanto en presencia como en ausencia de un compuesto modulador identificado. De esta manera, pueden identificarse los dominios o residuos de las proteínas importantes para la interacción proteína-proteína y/o la interacción entre el compuesto modulador y las proteínas. Asimismo, también pueden estudiarse las interacciones entre un compuesto seleccionado y una proteína diana (por ejemplo, Tsg101) mediante mutagénesis de la
proteína diana.

Basándose en la información estructural obtenida, se aclaran las relaciones estructurales entre las proteínas que interaccionan, entre un compuesto seleccionado y las proteínas que interaccionan, o entre un compuesto seleccionado y una proteína diana. Se revelan los restos y la estructura tridimensional del compuesto seleccionado críticos para su efecto modulador sobre la interacción de las proteínas de interés o sobre una proteína diana. Entonces los químicos farmacéuticos pueden diseñar compuestos análogos que tienen restos y estructuras similares.

Además, también puede analizarse un compuesto peptídico identificado que puede modular una interacción proteína-proteína particular o una proteína diana particular mediante la técnica de barrido de alanina (alanine scanning) y/o un ensayo de selección para determinar los dominios o residuos del péptido importantes para su efecto modulador sobre una interacción proteína-proteína particular o una proteína diana particular. El compuesto peptídico puede usarse como molécula líder para el diseño racional de moléculas orgánicas pequeñas o compuestos miméticos peptídicos. Véase Huber et al., Curr. Med. Chem., 1:13-34 (1994).

Los residuos o dominios críticos para el efecto modulador del compuesto identificado constituyen la región activa del compuesto conocida como su "farmacóforo". Una vez que se ha aclarado el farmacóforo, puede establecerse un modelo estructural mediante un proceso de modelado que puede incorporar datos de análisis por RMN, datos de difracción de rayos X, barrido de alanina, técnicas espectroscópicas y similares. Diversas técnicas que incluyen análisis por ordenador, mapeo de similitud y similares pueden usarse todas en este proceso de modelado. Véase por ejemplo, Perry et al., en OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design, págs.189-193, Alan R. Liss, Inc., 1989; Rotivinen et al., Acta Pharmaceutical Fennica, 97:159-166 (1988); Lewis et al., Proc. R. Soc. Lond., 236:125-140 (1989); McKinaly et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 29:111-122 (1989). Los sistemas de modelado molecular comerciales disponibles de Polygen Corporation, Waltham, MA, incluyen el programa CHARMm, que realiza la minimización de la energía y las funciones dinámicas moleculares, y el programa QUANTA que realiza la construcción, modelado gráfico y análisis de la estructura molecular. Tales programas permiten la construcción interactiva, visualización y modificación de moléculas. También están disponibles otros programas de modelado por ordenador de BioDesign, Inc. (Pasadena, CA.), Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario) y Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canadá).

Puede formarse un molde basándose en el modelo establecido. Entonces pueden diseñarse diversos compuestos uniendo diversos grupos o restos químicos al molde. También pueden sustituirse diversos restos del molde. Además, en caso de un compuesto líder peptídico, el péptido o miméticos del mismo pueden ciclarse, por ejemplo, uniendo entre sí el extremo N terminal y el extremo C terminal, para aumentar su estabilidad. Estos compuestos diseñados racionalmente se someten a prueba adicionalmente. De esta manera, pueden desarrollarse compuestos farmacológicamente aceptables y estables con eficacia mejorada y efectos secundarios reducidos. Los compuestos identificados según la presente invención pueden incorporarse a una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un individuo.

Además, también pueden usarse los modelos estructurales o coordenadas atómicas que definen una estructura tridimensional de la proteína o complejo proteico diana en la examinación virtual para seleccionar compuestos que pueden modular la proteína o complejo proteico diana. Se conocen generalmente en la técnica diversos métodos de examinación virtual basada en ordenador usando coordenadas atómicas. Por ejemplo, la patente estadounidense número 5.798.247 describe un método de identificación de un compuesto (específicamente, un inhibidor de la enzima conversora de interleucina) determinando las interacciones de unión entre un compuesto orgánico y los sitios de unión de una cavidad de unión dentro de la proteína diana. Los sitios de unión se definen mediante coordenadas
atómicas.

Por tanto, tal como resultará evidente para el experto en la técnica, pueden proporcionarse las coordenadas atómicas que definen una estructura tridimensional de una proteína o complejo proteico diana de la presente invención mediante cualquier método conocido en la técnica. Los compuestos pueden diseñarse o seleccionarse entonces basándose en las coordenadas atómicas.

5. Aplicaciones terapéuticas

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método in vitro donde se modula un complejo proteico que comprende Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH en células humanas. Las células humanas pueden estar en cultivos tisulares o celulares in vitro. Este método es para uso en la inhibición de la gemación de partículas de virus de una célula huésped. Se proporcionas además segundos usos médicos que aplican este principio a células humanas en un paciente.

En una realización, se reduce la concentración de un complejo proteico que tiene Tsg101 que interacciona con GAG o GAGp6 de VIH en las células. Pueden emplearse diversos métodos para reducir la concentración del complejo proteico. La concentración del complejo proteico puede reducirse interfiriendo en las interacciones entre Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH. Por ejemplo, pueden administrarse los compuestos que pueden interferir en las interacciones entre Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH a las células in vitro o in vivo en un paciente. Tales compuestos pueden ser compuestos que pueden unirse a la proteína Tsg101, particularmente al dominio UEV de la proteína Tsg101, o GAG o GAGp6 de VIH. También pueden ser anticuerpos inmunorreactivos frente a la proteína Tsg101 o GAG o GAGp6 de VIH. Preferiblemente, se usan anticuerpos que se unen al dominio UEV de la proteína Tsg101. También, los compuestos pueden ser péptidos pequeños de la proteína GAGp6 o GAG de VIH o miméticos de la misma que pueden unirse a Tsg101, o péptidos pequeños derivados de la proteína Tsg101 o miméticos de la misma que pueden unirse a GAG o GAGp6 de VIH.

En otra realización, el método para inhibir la gemación de partículas de virus incluye inhibir la expresión de la proteína Tsg101 y/o proteína GAGp6 o GAG de VIH. La inhibición puede ser a nivel transcripcional, traduccional, o post-traduccional. Por ejemplo, pueden administrarse compuestos antisentido y compuestos de ribozimas a células humanas en cultivos o en organismos humanos.

En las diversas realizaciones descritas anteriormente, se reducen o inhiben preferiblemente las concentraciones o actividades tanto de la proteína Tsg101 como de GAG o GAGp6 de VIH.

Aún en otra realización, se administra un anticuerpo inmunorreactivo de manera selectiva con un complejo proteico que tiene Tsg101 que interacciona con GAG o GAGp6 de VIH a células in vitro o en organismos humanos para inhibir las actividades del complejo proteico y/o reducir la concentración del complejo proteico en las células o el paciente.

El método in vitro que implica la modulación del complejo proteico que comprende Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH tal como se proporciona según la presente invención es para usar en la inhibición de la gemación viral del VIH de células huésped infectadas. Cuando están presentes múltiples células, por ejemplo, en cultivos celulares o en el cuerpo de un paciente, la inhibición de la gemación viral evita que el virus se libere de las células huésped infectadas suprimiendo de este modo la propagación viral adicional. Por consiguiente, la presente invención también abarca el uso de compuestos descritos en esta memoria para la preparación de una composición farmacéutica para tratar la infección por VIH y evitar SIDA en pacientes reduciendo la concentración o inhibiendo las actividades de los complejos proteicos que tienen Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH, o reduciendo la concentración o inhibiendo las actividades de Tsg101 o de GAG o GAGp6 de VIH.

Además, también pueden ser útiles los métodos que implican la modulación del complejo proteico que comprende Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH en la inhibición de la gemación de otros muchos virus, particularmente aquellos virus cuya gemación de las células huésped infectadas depende del motivo del dominio tardío P(T/S)AP. Tal como se describe anteriormente, el motivo P(T/S)AP, que es responsable de la interacción de GAGp6 de VIH con Tsg101, está conservado entre los dominios GAGp6 de todos los lentivirus conocidos de primates. En los lentivirus que no son de primates, que carecen de un dominio GAGp6, el motivo P(T/S)AP está cerca del extremo C terminal de la poliproteína GAG. Además, otros muchos retrovirus también contienen el motivo del dominio tardío P(T/S)AP en sus polipéptidos GAG, que se cree que también interaccionan con Tsg101 de la misma manera que la proteína GAGp6 de VIH.

Por consiguiente, la presente invención también proporciona el uso de compuestos descritos en esta memoria para modular un complejo proteico que contiene la proteína Tsg101 y un polipéptido GAG de retrovirus humano (distinto de VIH) o un fragmento del mismo que contiene un motivo del dominio tardío P(T/S)AP. Tales métodos moduladores pueden usarse en la inhibición de la gemación de un virus de este tipo de sus células huésped infectadas y en el tratamiento de las infecciones por un virus de este tipo en pacientes.

Además, la presente invención también abarca el uso de compuestos descritos en esta memoria para modular un complejo proteico que contiene un ortólogo de la proteína Tsg101 y un polipéptido GAG de retrovirus no humano o un fragmento del mismo que contiene un motivo del dominio tardío P(T/S)AP. Tales métodos moduladores pueden usarse en la inhibición de la gemación de tales retrovirus no humanos de sus células huésped de animal infectado y en el tratamiento de tales virus en animales.

Los ejemplos de tales retrovirus no humanos incluyen, paro no se limitan a, lentivirus de primates distintos de VIH y lentivirus que no son de primates (excepto VAIE). Tal como se conoce en la técnica, los lentivirus son un grupo de retrovirus que pueden provocar una infección latente de larga duración de células de vertebrados. Se replican en células huésped sólo cuando se activan. Los lentivirus normalmente presentan viriones envueltos. Los lentivirus que no son de primates incluyen lentivirus bovinos (por ejemplo virus de inmunodeficiencia bovina (VIB), virus de la enfermedad de Jembrana), lentivirus felinos (por ejemplo virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) que provoca inmunodeficiencia, emaciación y encefalitis en gatos), lentivirus ovinos/caprinos (por ejemplo virus de la artritis-encefalitis caprino (VAEC) que provoca anemia y emaciación en cabras, lentivirus ovino, virus Visna que provoca neumonía, emaciación, encefalitis y artritis) y lentivirus equinos (por ejemplo virus de la anemia infecciosa equina (VAIE), que infecta caballos provocando artritis y encefalitis). Los ejemplos de lentivirus de primates no humanos incluyen diversos virus de inmunodeficiencia del simio que infectan huéspedes tales como chimpancé, mangabey, mono verde africano, mandril, mono de L'Hoest, mono de Sykes, o mono colobo blanco y negro.

La modulación de un complejo proteico que contiene proteína Tsg101 y un polipéptido GAG de retrovirus humano o un fragmento del mismo que contiene un motivo del dominio tardío P(T/S)AP y la modulación de un complejo proteico que contiene un ortólogo de proteína Tsg101 y un polipéptido GAG de retrovirus no humano o un fragmento del mismo que contiene un motivo del dominio tardío P(T/S)AP deben llevarse a cabo de manera similar a los descritos anteriormente en el contexto de la modulación de un complejo proteico de Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH. Asimismo, el uso para tratar la infección por otros virus de este tipo humanos o no humanos deben ser similares al uso para tratar la infección por VIH, tal como resultará evidente para los expertos en la técnica informados de la presente descripción.

Específicamente, la concentración de los complejos proteicos puede reducirse en las células mediante diversos métodos. Por ejemplo, puede reducirse la concentración del complejo proteico interfiriendo en las interacciones entre la proteína Tsg101 y un polipéptido GAG de retrovirus humano o un fragmento del mismo que contiene un motivo del dominio tardío P(T/S)AP, o las interacciones entre un ortólogo de la proteína Tsg101 y un polipéptido GAG de retrovirus no humano o un fragmento del mismo que contiene un motivo del dominio tardío P(T/S)AP. Los compuestos que pueden interferir en las interacciones pueden administrarse a células in vitro o in vivo en un sujeto que va a tratarse. Tales compuestos pueden ser compuestos que pueden unirse a la proteína Tsg101 o al ortólogo de la proteína Tsg101, particularmente al dominio UEV de la proteína Tsg101 o al ortólogo de la proteína Tsg101. También pueden ser anticuerpos inmunorreactivos frente a la proteína Tsg101 o al ortólogo de la proteína Tsg101. Preferiblemente, se usan anticuerpos que se unen al dominio UEV de la proteína Tsg101 o el ortólogo de la proteína Tsg101. También, los compuestos pueden ser péptidos pequeños derivados de un polipéptido GAG de retrovirus, preferiblemente que incluye los residuos de aminoácido que extienden el motivo del dominio tardío P(T/S)AP. Además, pueden administrarse anticuerpos inmunorreactivos de forma selectiva frente a los complejos proteicos. En otras realizaciones, se inhibe la expresión de la proteína Tsg101 o un ortólogo de Tsg101. La inhibición puede ser a nivel transcripcional, traduccional, o post-traduccional. Por ejemplo, pueden administrarse compuestos antisentido y compuestos de ribozimas a células en cultivo o en el sujeto que va a tratarse.

Los detalles de los diversos métodos para modular los complejos proteicos o las interacciones proteína-proteína y los métodos para tratar infecciones por virus se describen a continuación. Aunque tales detalles se describen en el contexto de interacciones entre proteína Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH e infección por VIH en células humanas, los métodos análogos con respecto a las infecciones por otros virus deben resultar evidentes para los expertos en la técnica informados de la presente descripción.

5.1. Tratamiento con anticuerpos

En una realización, puede administrarse un anticuerpo a células o tejido in vitro o en un paciente. El anticuerpo administrado puede ser inmunorreactivo frente a Tsg101 o GAG o GAGp6 de VIH. Los anticuerpos adecuados pueden se monoclonales o policlonales que entran dentro de cualquier clase de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, etc. El anticuerpo adecuado para esta invención también pueden tomar la forma de diversos fragmentos de anticuerpos incluyendo, pero sin limitarse a, Fab y F(ab')_{2}, fragmentos de cadena sencilla (scFv) ("anticuerpos de cadena sencilla") y similares. En una realización, se administra un anticuerpo inmunorreactivo de forma selectiva frente al complejo proteico formado a partir de Tsg101 y GAG o GAGp6 de VIH según la presente invención a células o tejido in vitro o en un paciente. En otra realización, se administra un anticuerpo específico frente a Tsg101 a células o tejido in vitro o en un paciente. Preferiblemente, se administra un anticuerpo específico frente al dominio UEV de Tsg101 a células o tejido in vitro o en un paciente. Los métodos para preparar los anticuerpos de la presente invención deben resultar evidentes para un experto en la técnica, especialmente en vista de las discusiones de la sección 3 anterior. Los anticuerpos pueden administrarse de cualquier forma y ruta adecuada tal como se describió en la sección 6 siguiente. Preferiblemente, se administran los anticuerpos en una composición farmacéutica junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Alternativamente, pueden administrarse los anticuerpos mediante un enfoque de terapia génica. Es decir, pueden introducirse ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos, particularmente fragmentos de cadena sencilla (scFv) dentro de células o tejido in vitro o en un paciente de tal forma que los anticuerpos deseables puedan producirse mediante expresión recombinante in vivo a partir de los ácidos nucleicos. Para este fin, pueden administrarse directamente los ácidos nucleicos con secuencias reguladoras de transcripción y traducción apropiadas dentro del paciente. Alternativamente, pueden incorporarse los ácidos nucleicos dentro de un vector adecuado tal como se describe en las secciones 4 y 5.5 y administrarse dentro de células o tejido in vitro o en un paciente junto con el vector. El vector de expresión que contiene los ácidos nucleicos puede administrarse directamente a un paciente. También puede introducirse dentro de células, preferiblemente células derivadas de un paciente que va a tratarse, y posteriormente administradas dentro del paciente mediante transplante celular. Véase la sección 5.5 siguiente.

5.2. Tratamiento antisentido

En otra realización, se administran compuestos antisentido específicos de los ácidos nucleicos que codifican para uno o más elementos proteicos que interaccionan de un complejo proteico identificados en la presente invención a células o tejido in vitro o en un paciente que va a tratarse de forma terapéutica o profiláctica. Los compuestos antisentido deben inhibir específicamente la expresión de uno o más elementos proteicos que interaccionan. En realizaciones preferidas, se administran los compuestos antisentido que hibridan específicamente con un ácido nucleico de Tsg101. Tal como se conoce en la técnica, los fármacos antisentido generalmente actúan hibridando con un ácido nucleico diana particular bloqueando así la expresión génica. Los métodos para diseñar los compuestos antisentido y usar tales compuestos en el tratamiento de enfermedades se conocen bien y están bien desarrollados en la técnica. Por ejemplo, el fármaco antisentido Vitravene® (fomivirsen), un oligonucleótido de 21 bases de longitud, se ha desarrollado y comercializado satisfactoriamente por Isis Pharmaceuticals, Inc. para tratar la retinitis inducida por citomegalovirus (CMV).

Puede usarse cualquier método para diseñar y preparar compuestos antisentido para el fin de la presente invención. Véase generalmente, Sanghvi et al., eds., Antisense Reseach and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993. Normalmente, los compuestos antisentido son oligonucleótidos diseñados basándose en la secuencia de nucleótidos del ARNm o el gen de uno o más de los elementos proteicos que interaccionan de un complejo proteico particular de la presente invención. En particular, los compuestos antisentido pueden diseñarse para hibridar específicamente con una región particular de la secuencia génica o ARNm de uno o más de los elementos proteicos que interaccionan para modular (aumentar o disminuir), la replicación, transcripción, o traducción. Tal como se usa en el presente documento, el término "hibrida específicamente" o paráfrasis del mismo significa un grado suficiente de complementariedad o apareamiento entre un oligonucleótido antisentido y un ADN o ARNm diana de tal manera que se produzca entre ellos la unión estable y específica. En particular, no se requiere el 100% de complementariedad o apareamiento. La hibridación específica tiene lugar cuando se produce suficiente hibridación entre el compuesto antisentido y sus supuestos ácidos nucleicos diana en ausencia sustancial de unión no específica del compuesto antisentido a secuencias no diana en condiciones predeterminadas, por ejemplo, con fines de tratamiento in vivo, preferiblemente en condiciones fisiológicas. Preferiblemente, la hibridación específica da como resultado la interferencia en la expresión normal del ADN o ARNm diana.

Por ejemplo, puede diseñarse un oligonucleótido antisentido para hibridar específicamente con las regiones reguladoras de la replicación o transcripción de un gen diana, o las regiones reguladoras de la traducción tales como la región de iniciación de la traducción y las uniones exón/intrón, o las regiones codificantes de un ARNm diana. Preferiblemente, se usa como diana el gen de Tsg101 o el ARNm de Tsg101.

Tal como se conoce generalmente en la técnica, los oligonucleótidos usados habitualmente son oligómeros o polímeros de ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico que tienen una combinación de bases nucleosídicas que se producen de forma natural, azúcares y uniones covalentes entre bases nucleosídicas y azúcares incluyendo un grupo fosfato. Sin embargo, se observa que el término "oligonucleótidos" también abarca diversos miméticos que no se producen de forma natural y derivados, es decir, formas modificadas de los oligonucleótidos que se producen de forma natural tal como se describe a continuación. Normalmente un compuesto antisentido de la presente invención es un oligonucleótido que tiene desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 200, preferiblemente desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 30 bases nucleosídicas.

Los compuestos antisentido preferiblemente contienen esqueletos modificados o uniones internucleosídicas no naturales, incluyendo, pero sin limitarse a, esqueletos que contienen fósforo modificados y esqueletos no fosforados tales como esqueletos de morfolina; esqueletos de siloxano, sulfuro, sulfóxido, sulfona, sulfonato, sulfonamida y sulfamato; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos que contienen alquenos; esqueletos metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de amida y similares.

Los ejemplos de esqueletos que contienen fósforo modificados incluyen, pero no se limitan a fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforotioatos quirales, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de alquilo, fosfonatos de tionoalquilo, fosfinatos, fosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos y varias formas de sal de los mismos. Véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses números 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939;
5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799;
5.587.361; y 5.625.050.

Los ejemplos de esqueletos que no contienen fósforo descritos anteriormente se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 5.034.506; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046;
5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.677.437; y 5.677.439.

Otro oligonucleótido modificado útil es el ácido nucleico de péptido (PNA), en el que el esqueleto azucarado de un oligonucleótido se sustituye por un esqueleto que contiene amida, por ejemplo, un esqueleto de aminoetilglicina. Véanse las patentes estadounidenses números 5.539.082 y 5.714.331; y Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500 (1991). Los compuestos antisentido de PNA son resistentes a la digestión con ARNasa H y por tanto muestran una semivida más larga. Además, pueden hacerse diversas modificaciones en los esqueletos de PNA para dar perfiles de fármaco deseables tales como mejor estabilidad, aumento de la captación de fármaco, mayor afinidad para el ácido nucleico diana, etc.

Alternativamente, los compuestos antisentido son oligonucleótidos que contienen nucleósidos modificados, es decir, bases púricas o pirimidínicas modificadas, por ejemplo, pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-substituidas, y similares. Véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses números 3.687.808; 4.845.205; 5.130.302; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.587.469; 5.594.121;
5.596.091; 5.681.941; y 5.750.692.

Además, también pueden usarse oligonucleótidos con restos de azúcares sustituidos o modificados. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede tener uno o más restos de 2'-O-metoxietilazúcares. Véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses números 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.610.300; 5.627.0531 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920.

Otros tipos de modificaciones de oligonucleótido también son útiles incluyendo la unión de un oligonucleótido a un lípido, fosfolípido o resto de colesterol, ácido cólico, tioéter, cadena alifática, poliamina, polietilenglicol (PEG), o una proteína o péptido. Los oligonucleótidos modificados pueden mostrar un aumento de la captación en las células, una mejora en la estabilidad, es decir, resistencia a la digestión por nucleasas y otras biodegradaciones. Véanse por ejemplo, la patente estadounidense número 4.522.811; Burnham, Am. J. Hosp. Pharm., 15:210-218 (1994).

Los compuestos antisentido pueden sintetizarse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. De hecho, los compuestos antisentido pueden adaptarse por proveedores comerciales. Alternativamente, los compuestos antisentido pueden prepararse usando sintetizadores de ADN comercialmente de diversos proveedores, por ejemplo, Applied Biosystems Group de Norwalk, CT.

Los compuestos antisentido pueden formularse en una composición farmacéutica con vehículos adecuados y administrarse en células o tejido in vitro o en un paciente usando cualquier ruta de administración adecuada. Alternativamente, los compuestos antisentido también pueden usarse en un enfoque de "terapia génica". Es decir, se subclona el oligonucleótido dentro de un vector adecuado y se transforma en células humanas. El oligonucleótido antisentido se produce entonces in vivo mediante transcripción. Los métodos para la terapia génica se describen en la sección 6.3.2 siguiente.

5.3. Tratamiento con ribozimas

En otra realización, se diseña un ARN enzimático o ribozima para seleccionar como diana los ácidos nucleicos que codifica para uno o más de los elementos proteicos que interaccionan del complejo proteico de la presente invención. En realizaciones preferidas, se seleccionan como diana los ácidos nucleicos de Tsg101. Las ribozimas son moléculas de ARN, que tienen una actividad enzimática y que pueden escindir repetidamente otras moléculas de ARN separadas de forma específica de secuencia de bases nucleotídicas. Véase Kim et al., Proc. Natl. Acad. of Sci. USA, 84:8788 (1987); Haseloff y Gerlach, Nature, 334:585 (1988); y Jefferies et al., Nucleic Acid Res., 17:1371 (1989). Una ribozima tiene normalmente dos partes: una parte catalítica y una secuencia de unión que guía la unión de ribozimas a un ARN diana mediante apareamiento de bases complementarias. Una vez que se ha unido la ribozima a un ARN diana, escinde enzimáticamente el ARN diana, normalmente destruyendo su capacidad de traducción directa de una proteína codificada. Después de que una ribozima haya escindido su ARN diana, se libera de ese ARN diana y a partir de aquí puede unirse a y escindir otra diana. Es decir, una única molécula de ribozima puede unirse repetidamente a y escindir nuevas dianas. Por tanto, una ventaja del tratamiento con ribozimas es que se requiere una cantidad inferior de ARN exógeno en comparación con los tratamientos antisentido convencionales. Además, las ribozimas muestran menos afinidad por las dianas de ARNm que los oligonucleótidos antisentido basados en ADN y por tanto tienden menos a unirse a dianas erróneas.

Según la presente invención, una ribozima puede seleccionar como objetivo cualquier parte del ARNm de uno o más elementos proteicos que interaccionan incluyendo Tsg101 y GAG de VIH. Los métodos para seleccionar una secuencia diana de ribozimas y diseñar y preparar ribozimas se conocen generalmente en la técnica. Véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses números 4.987.071; 5.496.698; 5.525.468; 5.631.359; 5.646.020; 5.672.511; y 6.140.491. Por ejemplo, pueden diseñarse ribozimas adecuadas con diversas configuraciones tales como motivos en cabeza de martillo, motivos en horquilla, motivos de virus de hepatitis delta, motivos de intrón de grupo I, o motivos de ARN de ARNasa P. Véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses números 4.987.071; 5.496.698; 5.525.468; 5.631.359; 5.646.020; 5.672.511; y 6.140.491; Rossi et al., AIDS Res. Human Retrovirus 8:183 (1992); Hampel y Tritz, Biochemistry 28:4929 (1989); Hampel et al., Nucleic Acid Res., 18:299 (1990); Perrotta y Been, Biochemistry 31:16 (1992); y Guerrier-Takada et al., Cell, 35:849 (1983).

Pueden sintetizarse ribozimas mediante los mismos métodos usados para la síntesis de ARN normal. Por ejemplo, se describen tales métodos en Usman et al., J. Am. Chem. Soc., 109:7845-7854 (1987) y Scaringe et al., Nucleic Acid Res., 18:5433-5441 (1990). Pueden sintetizarse ribozimas modificadas mediante los métodos descritos en, por ejemplo, la patente estadounidense número 5.652.094; las publicaciones internacionales números WO 91/03162; WO 92/07065 y WO 93/15187; la solicitud de patente europea número 92110298.4; Perrault et al., Nature, 344:565 (1990); Pieken et al., Science, 253:314 (1991); y Usman y Cedergren, Trends in Biochem. Sci., 17:334 (1992).

Las ribozimas de la presente invención pueden administrarse a células mediante cualquier método conocido, por ejemplo, descrito en la publicación internacional número WO 94/02595. Por ejemplo, pueden administrarse directamente a células o tejido in vitro o en un paciente a través de cualquier ruta adecuada, por ejemplo, inyección intravenosa. Alternativamente, pueden administrarse en encapsulación en liposomas, mediante iontoforesis, o mediante la incorporación a otros vehículos tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables y microsferas bioadhesivas. Además, también pueden administrarse mediante un enfoque de terapia génica, usando un vector de ADN a partir del cual puede transcribirse el ARN de ribozimas directamente. Los métodos de terapia génica se describen en detalle a continuación en la sección 6.3.2.

5.4. Inhibición competitiva

La concentración y actividad en el paciente de un complejo proteico particular y los elementos proteicos que interaccionan del mismo identificados según la presente invención también pueden inhibirse mediante otros diversos métodos. Por ejemplo, pueden administrarse los compuestos identificados según los métodos descritos en la sección 4 que pueden interferir en o disociar las interacciones proteína-proteína entre los elementos proteicos que interaccionan de un complejo proteico a células o tejido in vitro o en un paciente. Los compuestos identificados en los ensayos de unión in vitro descritos en la sección 4 que se unen al complejo proteico que contiene Tsg101 o los elementos que interaccionan del mismo también pueden usarse en el tratamiento.

Además, los agentes útiles también incluyen proteínas incompletas, es decir, fragmentos de los elementos proteicos que interaccionan que pueden unirse a sus componentes de unión respectivos en un complejo proteico pero que son deficientes respecto a sus funciones celulares. Por ejemplo, pueden usarse los dominios de unión de las proteínas de los elementos que interaccionan de un complejo proteico como inhibidores competitivos de las actividades del complejo proteico. Tal como resultará evidente para los expertos en la técnica, también pueden usarse los derivados u homólogos de los dominios de unión. Los dominios de unión pueden identificarse fácilmente usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, mutagénesis en combinación con ensayos de doble híbrido en levadura. Preferiblemente, el fragmento de proteína usado es un fragmento de un elemento proteico que interacciona que tiene una longitud de menos del 90%, el 80%, más preferiblemente menos del 75%, el 65%, el 50%, o menos del 40% de la longitud completa del elemento proteico. En una realización, se administra un fragmento de proteína GAGp6 de VIH que puede unirse a Tsg101. Por ejemplo, los fragmentos de proteínas adecuados pueden incluir un polipéptido que tiene un tramo contiguo de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 20 ó 25, preferiblemente desde 4 hasta 30, 40 ó 50 aminoácidos o más de la secuencia de GAGp6 de VIH y que puede interaccionar con Tsg101. Además, los fragmentos de proteínas adecuados también pueden incluir un péptido que puede unirse a Tsg101 y que tiene una secuencia de aminoácidos de desde 4 hasta 30 aminoácidos que es idéntica en al menos el 75%, el 80%, el 82%, el 85%, el 87%, el 90%, el 95% o más a un tramo contiguo de aminoácidos de GAG o GAGp6 de VIH de la misma longitud. Alternativamente, puede administrarse un polipéptido que puede interaccionar con GAGp6 de VIH y que tiene un tramo contiguo de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 20 ó 25, preferiblemente desde 4 hasta 30, 40 ó 50 o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de Tsg101. Además, otros ejemplos de compuestos adecuados incluyen un péptido que puede unirse a GAGp6 de VIH y que tiene una secuencia de aminoácidos de desde 4 hasta 30, 40, 50 o más aminoácidos que es idéntica en al menos el 75%, el 80%, el 82%, el 85%, el 87%, el 90%, el 95% o más a un tramo contiguo de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de Tsg101 de la misma longitud. Además, los compuestos administrados también pueden ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, preferiblemente anticuerpos de cadena sencilla inmunorreactivos frente a Tsg101 o GAGp6 de VIH o complejos proteicos de la presente invención.

Los fragmentos de proteínas adecuados como inhibidores competitivos pueden administrarse a células mediante internalización celular directa, endocitosis mediada por receptor, o mediante un "transportador". Se observa que cuando las proteínas o complejos proteicos diana que van a modularse están dentro de las células, el compuesto administrado a las células in vitro o in vivo en el método de la presente invención preferiblemente se administra en las células con el fin de lograr los resultados óptimos. Por tanto, preferiblemente, el compuesto que va a administrarse se asocia con un transportador que pueda aumentar la captación del compuesto mediante células que tienen la proteína o complejo proteico diana. Tal como se usa en el presente documento, el término "transportador" se refiere a una entidad (por ejemplo, un compuesto o una composición o una estructura física formada a partir de múltiples copias de un compuesto o múltiples compuestos diferentes) que pueden facilitar la captación de un compuesto de la presente invención por las células animales, particularmente células humanas. Normalmente, la captación celular de un compuesto de la presente invención en presencia de un "transportador" es al menos el 20% superior, preferiblemente al menos el 40%, el 50%, el 75% y más preferiblemente al menos el 100% superior a la captación celular del compuesto en ausencia del "transportador".

Pueden usarse muchas moléculas y estructuras conocidas en la técnica como "transportadores". En una realización, se usa una penetratina como transportador. Por ejemplo, el homeodominio de Antennapedia, un factor de transcripción de Drosophila, puede usarse como transportador para administrar un compuesto de la presente invención. En efecto, puede usarse cualquier elemento adecuado de la clase de péptidos de penetratina para llevar un compuesto de la presente invención a las células. Las penetratinas se describen en, por ejemplo, Derossi et al., Trends Cell Biol., 8:84-87 (1998). Las penetratinas transportan moléculas unidas a las mismas a través de las membranas citoplasmáticas o membranas nucleares eficazmente de manera independiente del receptor, independiente de la energía e independiente del tipo celular. Los métodos para usar una penetratina como vehículo para administrar oligonucleótidos y polipéptidos también se describen en la patente estadounidense número 6.080.724; Pooga et al., Nat. Biotech., 16:857 (1998); y Schutze et al., J. Immunol., 157:650 (1996). La patente estadounidense número 6.080.724 define los requerimientos mínimos para un péptido de penetratina como un péptido de 16 aminoácidos siendo hidrófobos de 6 a 10 de ellos. El aminoácido en la posición 6 contando desde o bien el extremo N o bien el extremo C-terminal es triptófano, mientras que los aminoácidos en las posiciones 3 y 5 contando desde o bien el extremo N o bien el extremo C-terminal no son ambos valina. Preferiblemente, se usa la hélice 3 del homeodominio de Drosophila Antennapedia como transportador. Más preferiblemente, se emplea un péptido que tiene una secuencia de los aminoácidos 43-58 del homeodominio Antp como transportador. Además, también pueden usarse otros homólogos que se producen de forma natural de la hélice 3 del homeodominio de Drosophila Antennapedia. Por ejemplo, se ha demostrado que los homeodominios de Fushi-tarazu y Engrailed pueden transportar péptidos a células. Véase Han et al., Mol. Cells, 10:728-32 (2000). Tal como se usa en el presente documento, el término "penetratina" también abarca análogos peptoides de los péptidos de penetratina. Normalmente, los péptidos de penetratina y los análogos peptoides de los mismos están unidos de forma covalente a un compuesto que va a administrarse a células aumentando así la captación celular
del compuesto.

En otra realización, se usa la proteína tat de VIH-1 o un derivado de la misma como "transportador" unido de forma covalente a un compuesto según la presente invención. El uso de la proteína tat de VIH-1 y derivados de la misma para administrar macromoléculas a células se conoce bien en la técnica. Véase Green y Loewenstein, Cell, 55:1179 (1988); Frankel y Pabo, Cell, 55:1189 (1988); Vives et al., J. Biol. Chem., 272:16010-16017 (1997); Schwarze et al., Science, 285:1569-1572 (1999). Se sabe que la secuencia responsable de la captación celular consiste en la región sumamente básica, residuos de aminoácido 49-57. Véase por ejemplo, Vives et al., J. Biol. Chem., 272:16010-16017 (1997); Wender et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 97:13003-13008 (2000). Se cree que el dominio básico selecciona como diana componentes de la bicapa lipídica de las membranas celulares. Provoca que una proteína o ácido nucleico unido de forma covalente cruce la membrana celular rápidamente de una manera independiente del tipo celular. Se han administrado proteínas cuyo tamaño oscila desde 15 hasta 120 kD con esta tecnología en una variedad de tipos celulares tanto in vitro como in vivo. Véase Schwarze et al., Science, 285:1569-1572 (1999). Puede usarse para los fines de la presente invención cualquier péptido derivado de tat de VIH o análogo peptoide derivado del mismo que pueda transportar macromoléculas tales como péptidos. Por ejemplo, cualquier péptido de tat nativo que tenga la región sumamente básica, los residuos de aminoácido 49-57 puede usarse como transportador uniéndolo de forma covalente al compuesto que va a administrarse Además, también pueden ser transportadores útiles diversos análogos del péptido tat de los residuos de aminoácido 49-57 para los fines de esta invención. Los ejemplos de diversos de tales análogos se describen en Wender et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 97:13003-13008 (2000) incluyendo, por ejemplo, d-Tat_{49-57}, los isómeros retroinverso de l- o d-Tat_{49-57} (es decir, l-Tat_{57-49} y d-Tat_{57-49}), oligómeros de L-arginina, oligómeros de D-arginina, oligómeros de L-lisina, oligómeros de D-lisina, oligómeros de L-histina, oligómeros de D-histina, oligómeros de L-ornitina, oligómeros de D-ornitina y diversos homólogos, derivados (por ejemplo, formas modificadas con conjugados unidos a los péptidos pequeños) y análogos peptoides de los mismos.

Otros transportadores útiles conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, secuencias peptídicas cortas derivadas del factor de crecimiento de fibroblastos (véase Lin et al., J. Biol. Chem., 270:14255-14258 (1998)), Galparan (véase Pooga et al., FASEB J. 12:67-77 (1998)) y la proteína estructural VP22 de VHS-1 (véase Elliott y O'Hare, Cell, 88:223-233 (1997)).

Ya que los diversos transportadores descritos anteriormente son generalmente péptidos, pueden prepararse convenientemente proteínas de fusión mediante expresión recombinante para que contengan un péptido transportador unido de forma covalente mediante un enlace peptídico a un fragmento de proteína competitivo. Alternativamente, pueden usarse métodos convencionales para sintetizar químicamente un péptido transportador o un péptido de la presente invención o ambos.

El péptido híbrido puede administrarse a las células in vitro o a un paciente en una composición farmacéutica adecuada tal como se proporciona en la sección 5.

Además de los transportadores basados en péptidos, también pueden usarse otros diversos tipos de transportadores, que incluyen, pero no se limitan a liposomas catiónicos (véase Rui et al., J. Am. Chem. Soc., 120:11213-11218 (1998)), dendrímeros (Kono et al., Bioconjugate Chem., 10:1115-1121 (1999)), sideróforos (Ghosh et al., Chem. Biol., 3:1011-1019 (1996)), etc. En una realización específica, el compuesto según la presente invención se encapsula en liposomas para su administración a células.

Adicionalmente, cuando un compuesto para usar según la presente invención es un péptido, puede administrarse a células mediante un método de terapia génica. Es decir, puede administrarse un ácido nucleico que codifica para el péptido a células in vitro o a células in vivo en un organismo humano o animal. Cualquier método de terapia génica adecuado puede usarse para los fines de la presente invención. Se conocen bien en la técnica diversos métodos de terapia génica y se describen en la sección 6.3.2. siguiente. Recientemente se han notificado éxitos en la terapia génica. Véase por ejemplo, Kay et al., Nature Genet., 24:257-61 (2000); Cavazzana-Calvo et al., Science, 288:669 (2000); y Blaese et al., Science, 270: 475 (1995); Kantoff, et al., J. Exp. Med., 166:219 (1987).

5.5. Terapia génica

Aún en otra realización, se toma el enfoque de terapia génica para "desactivar" el gen que codifica para Tsg101, o para reducir el nivel de expresión del gen. Por ejemplo, puede sustituirse el gen con una secuencia génica diferente o una secuencia no funcional o simplemente delecionarse mediante recombinación homóloga. En otra realización de terapia génica, puede usarse el método descrito en la patente estadounidense número 5.641.670 para reducir la expresión del gen de Tsg101. Esencialmente, pueden introducirse un ADN exógeno que tiene al menos una secuencia reguladora, un exón y un sitio donador de corte y empalme en un gen endógeno que codifica para Tsg101 mediante recombinación homóloga de tal modo que la secuencia reguladora, el exón y el sitio donador de corte y empalme presentes en el constructo de ADN se llegan a estar operativamente unidos al gen endógeno. Como resultado, la expresión del gen endógeno está controlada por la secuencia reguladora recientemente introducida. Por tanto, cuando la secuencia reguladora exógena es un represor fuerte de la expresión génica, se bloquea o reduce la expresión del gen endógeno que codifica para el elemento proteico que interacciona. Véase la patente estadounidense número
5.641.670.

Se conocen bien diversos métodos de terapia génica en la técnica. Recientemente se han notificado éxitos en la terapia génica. Véase por ejemplo, Kay et al., Nature Genet., 24:257-61 (2000); Cavazzana-Calvo et al., Science, 288:669 (2000); y Blaese et al., Science, 270: 475 (1995); Kantoff, et al., J. Exp. Med. 166:219 (1987).

Puede usarse cualquier método adecuado de terapia génica para los fines de la presente invención. Generalmente, se usa un vector de terapia génica para portar los ácidos nucleicos (ácidos nucleicos exógenos) útiles en la modificación del gen de Tsg101 endógeno. El vector normalmente incluye secuencias de ácido nucleico que pueden dirigir la recombinación homóloga específica de sitio. Por ejemplo, se porta preferiblemente un ácido nucleico exógeno que codifica para una proteína Tsg101 defectuosa, por ejemplo, que no puede unirse a GAGp6 de VIH, dentro del vector de terapia génica. Alternativamente, el vector puede contener secuencias que corresponden a los dos extremos del gen de Tsg101 endógeno que pueden provocar la recombinación homóloga "inactivando" de este modo el gen de Tsg101 endógeno.

En una realización, el ácido nucleico exógeno (gen) se incorpora dentro de un vector de ADN de plásmido. Muchos vectores de expresión disponibles comercialmente pueden ser útiles para la presente invención, incluyendo, por ejemplo, pCEP4, pcDNAI, pIND, pSecTag2, pVAX1, pcDNA3.1 y pBI-EGFP, y pDisplay.

También pueden usarse diversos vectores virales. Normalmente, en un vector viral, se modifica mediante ingeniería genética el genoma viral para eliminar la capacidad de producir enfermedad, por ejemplo, la capacidad de replicarse en las células huésped. El ácido nucleico exógeno que va a introducirse dentro de un paciente puede incorporarse dentro del genoma viral modificado mediante ingeniería genética, por ejemplo, insertándolo en un gen viral que no es esencial para la infectividad viral. Es conveniente usar vectores virales ya que pueden introducirse fácilmente en las células de los tejidos por medio de infección. Una vez en la célula huésped, el virus recombinante se integra normalmente dentro del genoma de la célula huésped. En raras ocasiones, el virus recombinante también puede replicarse y permanecer como elementos extracromosómicos.

Se han desarrollado un gran número de vectores retrovirales para terapia génica. Estos incluyen vectores derivados de oncorretrovirus (por ejemplo, VLM), lentivirus (por ejemplo, VIH y VIS) y otros retrovirus. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de terapia génica basados en el virus de la leucemia murina (véase, Cepko, et al., Cell, 37:1053-1062 (1984), Cone y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:6349-6353 (1984)), virus del tumor de mama de ratón (véase, Salmons et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 159:1191-1198 (1984)), virus de la leucemia del simio gibón (véase, Miller et al., J. Virology, 65:2220-2224 (1991)), VIH, (véase Shimada et al., J. Clin. Invest., 88:1043-1047 (1991)) y retrovirus de aves (véase Cosset et al., J. Virology, 64:1070-1078 (1990)). Además, también se describen diversos vectores retrovirales en las patentes estadounidenses números 6.168.916; 6.140.111; 6.096.534; 5.985.655; 5.911.983; 4.980.286; y 4.868.116.

Se han sometido a prueba satisfactoriamente vectores de virus adenoasociado (VAA) en ensayos clínicos. Véase por ejemplo, Kay et al., Nature Genet. 24:257-61 (2000). El VAA es un virus defectuoso que se produce de forma natural que requiere otros virus tales como adenovirus o virus herpes como virus cooperadores. Véase Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immun., 158:97 (1992). Se describe un virus VAA recombinante útil como vector de terapia génica en la patente estadounidense número 6.153.436.

También pueden ser útiles los vectores adenovirales para los fines de la terapia génica según la presente invención. Por ejemplo, la patente estadounidense número 6.001.816 describe un vector adenoviral que se usa para administrar un gen de leptina por vía intravenosa a un mamífero para tratar la obesidad. También pueden usarse otros vectores adenovirales, que incluyen los descritos en las patentes estadounidenses números 6.171.855; 6.140.087; 6.063.622; 6.033.908; y 5.932.210, y Rosenfeld et al., Science, 252:431-434 (1991); y Rosenfeld et al., Cell, 68:143-155 (1992).

Otros vectores virales útiles incluyen vectores virales de la hepatitis recombinantes (véase, por ejemplo, la patente estadounidense número 5.981.274) y vectores de entomopox recombinantes (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 5.721.352 y 5.753.258). También pueden usarse vectores no tradicionales para los fines de esta invención. Por ejemplo, la publicación internacional número WO 94/18834 describe un método de administración de ADN a células de mamíferos conjugando el ADN que va a administrarse con un polielectrolito para formar un complejo. El complejo puede microinyectarse en o captarse por las células.

Los ácidos nucleicos exógenos también pueden introducirse en células mediante endocitosis mediada por receptor. Véase por ejemplo, la patente estadounidense número 6.090.619; Wu y Wu, J. Biol. Chem., 263:14621 (1988); Curiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8850 (1991). Por ejemplo, la patente estadounidense número 6.083.741 describe la introducción de un ácido nucleico exógeno dentro de células de mamíferos asociando el ácido nucleico a un resto policatiónico (por ejemplo, poli-L-lisina que tiene de 3-100 residuos de lisina), que se acopla por si mismo a un resto de unión al receptor de integrina (por ejemplo, un péptido cíclico que tiene la secuencia RGD).

Alternativamente, también pueden administrarse los ácidos nucleicos exógenos o vectores que los contienen en células mediante anfífilos. Véase por ejemplo, la patente estadounidense número 6.071.890. Normalmente, el ácido nucleico exógeno o un vector que contiene el ácido nucleico forma un complejo con el anfífilo catiónico. Las células de mamíferos puestas en contacto con el complejo pueden captar el complejo fácilmente.

Los ácidos nucleicos exógenos pueden introducirse en un paciente con fines de terapia génica mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden administrarse las secuencias génicas exógenas solas o en forma conjugada o compleja descrita anteriormente, o incorporadas dentro de vectores de ADN o virales, directamente mediante inyección en un tejido u órgano apropiado de un paciente. Alternativamente, pueden usarse catéteres o dispositivos similares para la administración en un órgano o tejido diana. Los catéteres adecuados se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 4.186.745; 5.397.307; 5.547.472; 5.674.192; y 6.129.705.

Además, los ácidos nucleicos exógenos o vectores que contienen los ácidos nucleicos pueden introducirse en células aisladas usando cualquier técnica conocida tal como precipitación con fosfato de calcio, microinyección, lipofección, electroporación, pistola génica, endocitosis mediada por receptor y similares. Pueden seleccionarse las células que expresan los ácidos nucleicos exógenos y volver a administrárselas al paciente mediante, por ejemplo, inyección o transplante celular. La cantidad de células apropiada administrada a un paciente variará con el estado del paciente y el efecto deseado, lo que puede determinarse por un experto en la técnica. Véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses números 6.054.288; 6.048.524; y 6.048.729. Preferiblemente, las células usadas son autólogas, es decir, células obtenidas a partir del paciente que va a tratarse.

6. Composiciones y formulaciones farmacéuticas

En otro aspecto de la presente invención, también se proporciona el uso de uno o más de los agentes terapéuticos proporcionados en la presente invención tal como se describe en la sección 6, para la preparación de composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, tales agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, (1) compuestos antisentido que pueden hibridar específicamente con ácidos nucleicos de Tsg101 (gen o ARNm), (2) compuestos de ribozimas específicos de ácidos nucleicos de Tsg101 (gen o ARNm), (3) anticuerpos inmunorreactivos frente a Tsg101 donde dichos anticuerpos pueden inhibir la interacción entre la primera y la segunda proteína del complejo proteico de la invención, (4) anticuerpos inmunorreactivos de forma selectiva frente a un complejo proteico de la presente invención, donde dicho anticuerpo puede inhibir la interacción proteína-proteína entre la primera y la segunda proteína del complejo proteico de la invención, (5) compuestos peptídicos pequeños tal como los descritos anteriormente (unidos opcionalmente a un transportador) que puede interaccionar con Tsg101 o un polipéptido GAG retroviral, (6) ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos o péptidos, etc. Las composiciones se preparan como una formulación farmacéutica adecuada para su administración a un paciente.

En la composición farmacéutica, un principio activo identificado según la presente invención puede estar en cualquier forma de sal farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, el término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales orgánicas o inorgánicas, relativamente no tóxicas de los compuestos de la presente invención, incluyendo las sales de adición ácidas orgánicas o inorgánicas del compuesto. Los ejemplos de tales sales incluyen, pero no se limitan a, sales de clorhidrato, sales de sulfato, sales de bisulfato, sales de borato, sales de nitrato, sales de acetato, sales de fosfato, sales de bromhidrato, sales de laurilsulfonato, sales de glucoheptonato, sales de oxalato, sales de oleato, sales de laurato, sales de estearato, sales de palmitato, sales de valerato, sales de benzoato, sales de naftilato, sales de mesilato, sales de tosilato, sales de citrato, sales de lactato, sales de maleato, sales de succinato, sales de tartrato, sales de fumarato y similares. Véase, por ejemplo, Berge, et al., J. Pharm. Sci., 66:1-19 (1977).

Para administración oral, pueden incorporarse los principios activos en una formulación que incluye vehículos farmacéuticamente aceptables tales como aglutinantes (por ejemplo, gelatina, celulosa, goma tragacanto), excipientes (por ejemplo, almidón, lactosa), lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, dióxido de silicio), agentes disgregantes (por ejemplo, alginato, Primogel y almidón de maíz) y agentes edulcorantes o aromatizantes (por ejemplo, glucosa, sacarosa, sacarina, salicilato de metilo y menta). La formulación puede administrarse por vía oral en forma de cápsulas de gelatina cerradas o comprimidos. Las cápsulas y comprimidos pueden prepararse mediante cualquier técnica convencional. Las cápsulas y comprimidos también pueden recubrirse con diversos recubrimientos conocidos en la técnica para modificar sabores, gustos, colores, y formas de las cápsulas y comprimidos. Además, también pueden incluirse vehículos líquidos tales como aceite graso en las cápsulas.

Las formulaciones orales adecuadas también pueden estar en forma de suspensión, jarabe, chicle, oblea, elixir y similares. Si se desea, también pueden incluirse agentes convencionales para modificar sabores, gustos, colores y formas de las formas especiales. Además, para la administración conveniente por sonda de alimentación enteral en pacientes que no pueden tragar, pueden disolverse los principios activos en un vehículo de aceite vegetal lipófilo aceptable tales como aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de cártamo.

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Los principios activos también pueden administrarse por vía parenteral en forma de disolución o suspensión, o en forma liofilizada que puede convertirse en forma de disolución o suspensión antes de su uso. En tales formulaciones, pueden usarse diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables tales como agua estéril y tampón salino fisiológico. Otros disolventes convencionales, tampones de pH, estabilizadores, agentes antibacterianos, tensioactivos y antioxidantes también pueden todos incluirse. Por ejemplo, los componentes útiles incluyen cloruro de sodio, tampones acetatos, citratos y fosfatos, glicerina, dextrosa, aceites fijos, metilparabenos, polietilenglicol, propilenglicol, bisulfato de sodio, alcohol bencílico, ácido ascórbico y similares. Las formulaciones parenterales pueden almacenarse en cualquier envase convencional tales como viales o ampollas.

Las vías de administración tópica incluyen aplicación nasal, bucal, mucosa, rectal, o vaginal. Para la administración tópica, pueden formularse los principios activos en lociones, cremas, pomadas, geles, polvos, pastas, pulverizadores, suspensiones, gotas y aerosoles. Por tanto, pueden incluirse uno o más agentes espesantes, humectantes y agentes estabilizantes en las formulaciones. Los ejemplos de tales agentes incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol, sorbitol, goma xantana, vaselina, cera de abejas, o aceite mineral, lanolina, escualeno y similares. Una forma especial de administración tópica es la administración mediante parche transdérmico. Los métodos para preparar parches transdérmicos se describen, por ejemplo, en Brown, et al., Annual Review of Medicine, 39:221-229 (1988).

La implantación subcutánea para la liberación sostenida de los principios activos también puede ser una vía adecuada de administración. Esto supone procedimientos quirúrgicos para implantar un principio activo en cualquier formulación adecuada dentro de un espacio subcutáneo, por ejemplo, bajo la pared abdominal anterior. Véase, por ejemplo, Wilson et al., J. Clin. Psych. 45:242-247 (1984). Pueden usarse hidrogeles como vehículo para la liberación sostenida de los principios activos. Los hidrogeles se conocen generalmente en la técnica. Normalmente se preparan mediante reticulación de polímeros biocompatibles de alto peso molecular en una red que se hincha en agua para formar un material similar a un gel. Preferiblemente, los hidrogeles son biodegradables o bioabsorbibles. Para los fines de esta invención, los geles preparados con polietilenglicoles, colágeno, o poli(ácido glicólico-co-L-láctico) pueden ser útiles. Véase, por ejemplo, Phillips et al., J. Pharmaceut. Sci. 73:1718-1720 (1984).

Los principios activos también pueden conjugarse, a un polímero de alto peso molecular no peptídico no inmunogénico para formar un conjugado de polímero. Por ejemplo, se une de forma covalente un principio activo a polietilenglicol para formar un conjugado. Normalmente, un conjugado de este tipo muestra una solubilidad, estabilidad mejoradas y una toxicidad e inmunogenicidad reducidas. Por tanto, cuando se administra a un paciente, el principio activo del conjugado puede tener una semivida más larga en el organismo y mostrar mejor eficacia. Véase generalmente, Burnham, Am. J. Hosp. Pharm., 15:210-218 (1994). Actualmente están usándose proteínas PEGiladas en tratamientos de sustitución de proteínas y para otros usos terapéuticos. Por ejemplo, el interferón PEGilado (PEG-INTRON A®) se usa en la práctica clínica para tratar la Hepatitis B. La adenosina desaminasa PEGilada (ADAGEN®) está usándose para tratar la enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave (SCIDS). La L-asparaginasa PEGilada (ONCAPSPAR®) está usándose para tratar la leucemia linfoblástica aguda (LLA). Se prefiere que la unión covalente entre el polímero y el principio activo y/o el propio polímero sea degradable de forma hidrolítica en condiciones fisiológicas. Tales conjugados conocidos como "profármacos" pueden liberar fácilmente el principio activo dentro del organismo. La liberación controlada de un principio activo también puede lograrse incorporando el principio activo en microcápsulas, nanocápsulas o hidrogeles, conocidos generalmente en la técnica.

También pueden usarse liposomas como vehículos para los principios activos de la presente invención. Los liposomas son micelas compuestas de diversos lípidos tales como colesterol, fosfolípidos, ácidos grasos y derivados de los mismos. También pueden usarse diversos lípidos modificados. Los liposomas pueden reducir la toxicidad de los principios activos y aumentar su estabilidad. Los métodos para preparar las suspensiones liposómicas que contienen los principios activos en su interior se conocen generalmente en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense número 4.522.811; Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, volumen XIV, Academic Press, Nueva York, N.Y. (1976).

También pueden administrarse los principios activos en combinación con otros principios activos que tratan o previenen de forma sinérgica los mismos síntomas o es eficaz para otra enfermedad o síntoma del paciente siempre y cuando el otro principio activo no interfiera en o afecte negativamente a los efectos de los principios activos de esta invención. Tales otros principios activos incluyen pero no se limitan a agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, antibióticos, agentes antifúngicos, agentes antitrombóticos, fármacos cardiovasculares, agentes reductores del colesterol, fármacos antitumorales, fármacos para la hipertensión y similares.

Generalmente, pueden determinarse el perfil de toxicidad y la eficacia de los agentes terapéuticos mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en modelos celulares o modelos animales, por ejemplo, los proporcionados en la sección 7. Tal como se conoce en la técnica, la DL_{50} representa la dosis letal para aproximadamente el 50% de una población sometida a prueba. La DE_{50} es un parámetro que indica la dosis terapéuticamente eficaz en aproximadamente el 50% de una población sometida a prueba. Tanto la DL_{50} como la DE_{50} pueden determinarse en modelos celulares y modelos animales. Además, también puede obtenerse la CI_{50} en modelos celulares y modelos animales, lo que representa la concentración en plasma circulante que es eficaz para lograr aproximadamente el 50% de la inhibición máxima de los síntomas de una enfermedad o trastorno. Tales datos pueden usarse en el diseño de un intervalo de dosificación para ensayos clínicos en seres humanos. Normalmente, tal como resultará evidente para los expertos en la técnica, el intervalo de dosificación para seres humanos debe diseñarse de tal modo que el intervalo esté alrededor de la DE_{50} y/o la CI_{50}, pero significativamente por debajo de la DL_{50} obtenida a partir de modelos celulares o animales. Resultará evidente para los expertos en la técnica que la cantidad terapéuticamente eficaz de cada principio activo que va a incluirse en una composición farmacéutica de la presente invención puede variar con factores que incluyen, pero no se limitan a la actividad del compuesto usado, la estabilidad del principio activo en el cuerpo del paciente, la gravedad de los estados que han de aliviarse, el peso total del paciente tratado, la vía de administración, la facilidad de absorción, distribución y excreción del principio activo por el organismo, la edad y sensibilidad del paciente que va a tratarse y similares. También puede ajustarse la cantidad de administración según cambien los diversos factores a lo largo del tiempo.

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Ejemplos 1. Sistema de doble híbrido en levadura

Los principios y métodos del sistema de doble híbrido en levadura se han descrito en detalle en The Yeast Two-Hybrid System, Bartel y Fields, eds., páginas 183-196, Oxford University Press, Nueva York, NY, 1997. Por tanto, lo siguiente es una descripción del procedimiento particular que se usó.

Se derivó el ADNc que codifica para la proteína cebo GAGp6 de VIH a partir de aislado de VIH-1 NY5/BRU. Se introdujo entonces el producto de ADNc mediante recombinación en el vector de expresión de levaduras pGBT.Q, que es un derivado cercano de pGBT.C (véase Bartel et al., Nat Genet., 12:72-77 (1996)) en el que el sitio poliligador se ha modificado para incluir sitios de secuenciación M13. Se seleccionó el nuevo constructo directamente en la cepa de levadura PNY200 por su capacidad de dirigir la síntesis de triptófano (genotipo de esta cepa: MAT\alpha trp1-901 leu2-3,112 ura3-52 his3-200 ade2 gal4\Delta gal80). En estas células de levadura, se produjo el cebo como una proteína de fusión C-terminal con el dominio de unión a ADN del factor de transcripción Gal4 (aminoácidos de 1 a 147).

Se transformaron las bibliotecas presa (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de bazo humano) en la cepa de levadura BK100 (genotipo de esta cepa: MATa trp1-901 leu2-3,112 ura3-52 his3-200 gal4\Delta gal80 LYS2::GAL-HIS3 GAL2-ADE2 met2::GAL7-lacZ) y se seleccionó por su capacidad para dirigir la síntesis de leucina. En estas células de levadura, se expresó cada ADNc como una proteína de fusión con el dominio de activación de la transcripción del factor de transcripción Gal4 (aminoácidos de 768 a 881) y una etiqueta de epítopo de hemaglutinina de 9 aminoácidos. Las células PNY200 (tipo de apareamiento MAT\alpha), que expresaban el cebo, se aparearon entonces con las células BK100 (tipo de apareamiento MATa), que expresan las proteínas presa de la biblioteca presa. Se seleccionaron las células de levadura diploides resultantes que expresan proteínas que interaccionan con la proteína cebo por su capacidad de sintetizar triptófano, leucina, histidina y adenina. Se preparó ADN a partir de cada clon, se transformó mediante electroporación en la cepa KC8 de E. coli (células electrocompententes KC8 de Clontech, número de catálogo C2023-1) y se seleccionaron las células en placas que contenían ampicilina en ausencia de o bien triptófano (selección para el plásmido cebo) o bien leucina (selección para el plásmido de la biblioteca). Se preparó ADN para ambos plásmidos y se secuenciación por el método de terminación de cadena de didesoxinucleótidos. Se confirmo la identidad del inserto cebo de ADNc y se identificó el inserto de ADNc de la biblioteca presa usando el programa BLAST para buscar en bases de datos públicas de proteínas y nucleótidos. Después, se transformaron individualmente los plásmidos de la biblioteca presa en células de levadura junto con un plásmido que dirigía la síntesis de lamina y otras 5 proteínas de prueba, respectivamente, fusionadas con el dominio de unión a ADN de Gal4. Se consideraron falsos positivos los clones que dieron una señal positiva en el ensayo de \beta-galactosidasa y se descartaron. Se transformaron los plásmidos de los clones restantes en células de levadura junto con el plásmido cebo original. Se consideraron verdaderos positivos los clones que dieron una señal positiva en el ensayo de \beta-galactosidasa.

Se usó la secuencia GAGp6 de VIH indicada en la tabla 1 en el sistema de doble híbrido en levadura descrito anteriormente. Las secuencias presa de Tsg101 aisladas se resumen en la tabla 1.

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2. Producción de anticuerpos inmunorreactivos de forma selectiva frente a los complejos proteicos

Se expresan de forma recombinante GAGp6 de VIH y el dominio UEV de Tsg101 en células huésped humanas y se aislaron y purificaron. Se forma un complejo proteico mezclando las dos proteínas que interaccionan purificadas (fragmentos). También se forma un complejo proteico mezclando Tsg101 y GAGp6 de VIH completas intactas expresadas de forma recombinante. Se usan los dos complejos proteicos como antígenos en la inmunización de un ratón. Se aísla ARNm de las células de bazo de ratón inmunizado y se sintetiza la primera cadena de ADNc basándose en el ARNm. Se amplifican los genes V_{H} y V_{K} a partir de los ADNc así sintetizados mediante PCR usando los cebadores apropiados.

Se ligan juntos los genes V_{H} y V_{K} amplificados y se subclonan en un vector fagómido para la construcción de una biblioteca de exposición en fago. Se transforman células de E. coli con las mezclas de ligación y se establece así una biblioteca de exposición en fago. Alternativamente, se subclonan los genes V_{H} y V_{K} ligados en un vector adecuado para exposición en ribosomas en los que la secuencia V_{H}-V_{K} está bajo el control de un promotor de T7. Véase Schaffitzel et al., J. Immun. Meth., 231:119-135 (1999).

Se seleccionan las bibliotecas con el complejo Tsg101-GAGp6 de VIH y Tsg101 y GAGp6 de VIH individuales. Preferiblemente se realizan varias rondas de selección. Se seleccionan y purifican los clones que corresponden a fragmentos scFv que se unen al complejo Tsg101-GAGp6 de VIH, pero no a Tsg101 y GAGp6 de VIH individuales. Se usa un único clon purificado para preparar un anticuerpo inmunorreactivo de forma selectiva frente al complejo Tsg101-GAGp6 de VIH. Después, se verifica el anticuerpo mediante un método inmunoquímico tal como RIA y ELISA.

Además, pueden seleccionarse los clones que corresponden a fragmentos scFv que se unen al complejo Tsg101-GAGp6 de VIH y también se unen a Tsg101 y/o GAGp6 de VIH. Se diversifican los genes de scFv de los clones mediante métodos de mutagénesis tales como mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, PCR propensa a error (véase Lin-Goerke et al., Biotechniques, 23:409 (1997)), análogos de dNTP (Véase Zaccolo et al., J. Mol. Biol., 255:589 (1996)) y otros métodos. Se seleccionan adicionalmente los clones diversificados en bibliotecas de exposición en fago o exposición en ribosomas. De esta manera, pueden obtenerse los fragmentos scFv inmunorreactivos de forma selectiva frente al complejo Tsg101-GAGp6 de VIH.

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3. Correlaciones entre la interacción Tsg101-GAGp6 de VIH y la gemación de VIH

Se utilizaron ensayos de doble híbrido en levadura para determinar el efecto de mutaciones de sustitución de aminoácidos en el motivo PTAP de GAGp6 de VIH sobre la interacción entre Tsg101 y GAGp6. Para preparar un constructo de dominio de activación-Tsg101 de doble híbrido en levadura, se obtuvo un fragmento de ADN que abarca la secuencia codificante de longitud completa de Tsg101 según el número de registro de GenBank U82130 mediante PCR a partir de una biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano y se clonó en los sitios EcoRI/Pst1 del plásmido parental GADpN2 del dominio de activación (LEU2, CEN4, ARS1, ADH1p-SV40NLS-GAL4 (768-881)-MCS (sitio de clonación múltiple)-PGK1t, AmpR, ColE1_ori).

Para preparar el constructo de dominio de unión a ADN-GAGp6 de VIH1 de doble híbrido en levadura, se obtuvo un fragmento de ADN correspondiente al péptido GAGp6 de VIH1 péptido derivado de la proteína GAG de la cepa VIH1.NL43 mediante PCR a partir del plásmido R9\Deltaapa que contiene NL43 y se clonó en los sitios EcoRI/Sal1 del plásmido parental pGBT.Q del dominio de unión.

Se introdujeron las siguientes mutaciones de sustitución de aminoácido mediante PCR en la secuencia de GAGp6 de VIH1 en el constructo de dominio de unión-GAGp6 de VIH1 de doble híbrido en levadura descrito anteriormente. Se verificaron las mutaciones mediante análisis de secuencia de ADN. Se resumen tales mutaciones en la tabla 2 siguiente

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TABLA 2 Mutaciones sometidas a prueba de la proteína GAGp6

6

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Para someter a prueba el efecto de las mutaciones, se cotransformaron células de levadura de la cepa Y189 adquiridas de Clontech (ura3-52 his3*200 ade2-101 trp1-901 leu2-3,112 met gal4 gal80 URA3::GAL1p-lacZ) con el constructo de dominio de activación-Tsg101 y uno de los constructos de dominio de unión-GAGp6 mutante o el constructo de dominio de unión-GAGp6 de tipo natural. Se realizaron ensayos de levantamiento con filtro para determinar la actividad \beta-Gal levantando las colonias de levadura transformadas con filtros, lisando las células de levadura mediante congelación y descongelación y poniendo en contacto las células lisadas con X-Gal. La actividad \beta-Gal positiva indica que la proteína GAGp6 de tipo natural o mutante interacciona con Tsg101. También se sometieron a prueba todos los constructos de dominios de unión para determinar la autoactivación de la actividad \beta-Gal. Los resultados se muestran en la tabla 3.

TABLA 3 Interacciones entre Tsg101 y GAGp6

7

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Por tanto, tal como se aclara en la tabla 3, las mutaciones en el motivo PTAP de GAGp6 de VIH eliminaron la interacción entre Tsg101 y GAGp6 de VIH, mientras que la mutación p6/E6G fuera del motivo PTAP no dio como resultado la eliminación de la interacción Tsg101-GAGp6.

Se cuantificaron adicionalmente las interacciones entre Tsg101 y GAGp6 de tipo natural (WT) o los mutantes PTAP de GAGp6 realizando ensayos de \beta-galactosidasa en cultivos líquidos. Se crecieron los cultivos durante toda la noche en medios sintético (- Leu, - Trp, + glucosa) en placas de 96 pocillos, se normalizaron para densidad óptica y se lisaron mediante adición de disolución de lisis/sustrato 6X en tampón Z 6X (KCl 60 mM, MgSO_{4} 6 mM, Na_{2}HPO_{4} 360 mM, NaH_{2}PO_{4} 240 mM, 6 mg/ml de CPRG, 0,12 U/ml de liticasa, NP-40 al 0,075%). Se incubaron los cultivos durante 2 h a 37ºC, se clarificaron mediante centrifugación y se midió la absorbancia óptica de cada sobrenadante (575 nm). La Tsg101 de longitud completa se unió a la p6 de tipo natural en el ensayo de cultivo líquido de doble híbrido, dando como resultado niveles elevados de actividad \beta-galactosidasa (> 300 veces por encima del basal). Se usaron tres mutantes puntuales de p6 diferentes para someter a prueba si la interacción de la unión de Tsg101 requería el motivo del dominio tardío PTAP de la p6 de VIH-1, y los tres (P7L, A9R y P10L) redujeron la actividad \beta-galactosidasa hasta niveles basales. Cada una de estas tres mutaciones puntuales también detuvo la gemación de VIH-1 en un estadio tardío (Huang et al. 1995). Estos resultados concuerdan con la hipótesis de que la interacción entre GAGp6 de VIH y la proteína celular humana Tsg101 es esencial para que se produzca la gemación viral.

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4. Ensayos de unión in vitro

Se expresó de forma recombinante una proteína de fusión con una etiqueta GST fusionada con el dominio GAGp6 de VIH-1 y se purificó mediante cromatografía. Además, se sintetizó químicamente un péptido GAGp6 que contiene los primeros 14 residuos de aminoácido ("p6(1-14)") mediante métodos de síntesis peptídica convencionales. Se purificó el péptido mediante técnicas de purificación de proteínas convencionales, por ejemplo, mediante cromatografía.

Se incubaron placas Nunc/Nalgene Maxisorp durante toda la noche a 4ºC o durante 1-2 h a temperatura ambiente en 100 \mul de una disolución de acoplamiento de proteínas que contenía GST-p6 purificado y carbonato 50 mM, pH = 9,6. Esto permitió la unión de la proteína de fusión GST-p6 a las placas. Después se vació el líquido de las placas y se rellenaron con 400 \mul/pocillo de un tampón de bloqueo (SuperBlock; Pierce-Endogen, Rockford, IL). Tras incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, se aplicaron 100 \mul de una mezcla que contenía Tsg101 etiquetada con myc de lisado de células S2 de Drosophila (residuos 1-207) y una cantidad específica del péptido p6(1-14) a los pocillos de la placa. Se dejó que reaccionara esta mezcla durante 2 horas a temperatura ambiente para formar los complejos proteína-proteína p6:Tsg101. Después se lavaron las placas 4 x 100 \mul con una disolución PBST 1x (Invitrogen; Carlsbad, CA). Tras lavar, se añadieron 100 \mul de una disolución 1 \mug/ml de anticuerpo monoclonal anti-myc (Clone 9E10; Roche Molecular Biochemicals; Indianapolis, IN) en PBST 1x a los pocillos de la placa para detectar la etiqueta de epítopo de myc en la proteína Tsg101. Después se lavaron de nuevo las placas con 4 x 100 \mul con disolución PBST 1x y se añadieron 100 \mul de disolución 1 \mug/ml de IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) (Jackson Immunoresearch Labs; West Grove, Pennsylvania) en PBST 1x a los pocillos de la placa para detectar los anticuerpos anti-myc de ratón unidos. Después se lavaron de nuevo las placas con 4 x 100 \mul con de disolución PBST 1x y se añadieron 100 \mul de sustrato fluorescente (QuantaBlu; Pierce-Endogen, Rockford, IL) a todos los pocillos. Tras 30 minutos, se añadieron 100 \mul de disolución de parada a cada pocillo para inhibir la función de la HRP. Después se leyeron las placas en un instrumento Packard Fusion a una longitud de onda excitatoria de 325 nm y una longitud de onda de emisión de 420 nm. La presencia de señales fluorescentes indica la unión de Tsg101 a la GST-p6 fija. Por el contrario, la ausencia de señales fluorescentes indica que el péptido corto que contiene PX_{1}X_{2}P puede perturbar la interacción entre Tsg101 y p6 de VIH.

Se sometieron a prueba diferentes concentraciones del péptido p6(1-14) y se trazó un gráfico de las intensidades de las señales fluorescentes obtenidas a diferentes concentraciones frente a las concentraciones de péptido. Se muestra la curva de inhibición competitiva en la figura 2. Se muestran dos diagramas de Dixon en la figura 3 y figura 4, respectivamente.

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5. Selección en levadura para identificar inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción entre GAGp6 de VIH y Tsg101

Se usa beta-galactosidasa como enzima indicadora para señalar la interacción entre los pares de proteína de doble híbrido en levadura expresados a partir de plásmidos en Saccharomyces cerevisiae. Se cultiva la cepa de levadura MY209 (ade2 his3 leu2 trp1 cyh2 ura3::GAL1p-lacZ gal4 gal80 lys2::GAL1p-HIS3) que porta los plásmidos Mp364 (LEU2 CEN4 ARS1 ADH1p-SV40NLS-GAL4 (768-881)-Tsg101 (1-390)-PGK1t AmpR ColE1_ori) y Mp206 (TRP1 CEN4 ARS ADH1p-GAL4(1-147)-VIH1_gag (448-500)-ADH1t AmpR ColE1_ori) en medios completos sintéticos que carecen de leucina y triptófano (CS -Leu -Trp) toda la noche a 30ºC. Se diluye este cultivo hasta 0,01 unidades de DO_{630}/ml usando medios de CS -Leu -Trp. Se dispone el cultivo de MY209 diluido en microplacas de 96 pocillos. Se añaden los compuestos de una biblioteca de moléculas pequeñas a las microplacas; la concentración final de los compuestos de prueba es de aproximadamente 60 \muM. Se incuban las placas de ensayo a 30ºC durante toda la noche. Al día siguiente se añade una alícuota de sustrato concentrado/tampón de lisis a cada pocillo y se incuban las placas a 37ºC durante 1-2 horas. Se añade una alícuota de disolución de parada en un momento apropiado a cada pocillo para detener la reacción de la beta-galactosidasa. Se obtiene una lectura de absorbancia para todas las microplacas para evaluar la generación de producto a partir del sustrato enzimático. La presencia de posibles inhibidores de la interacción entre p6 de VIH y Tsg101 da como resultado la inhibición de la señal de beta-galactosidasa generada por MY209. Pruebas adicionales eliminan los compuestos que reducen la expresión de beta-galactosidasa afectando al crecimiento de las células de levadura y los inhibidores no específicos que afectaron a la señal de beta-galactosidasa generada por la interacción de un par de proteínas no relacionadas.

Una vez que se consigue, es decir, se obtiene un compuesto que inhibe la interacción entre las proteínas virales y celulares, se identifica el compuesto y se somete a pruebas adicionales en las que se someten a ensayo los compuestos a varias concentraciones para determinar un valor de CI_{50}, siendo esta la concentración del compuesto a la que la señal observada en el ensayo de doble híbrido descrito en este ejemplo es el 50% de la señal observada en ausencia del inhibidor.

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<110> Myriad Genetics, Incorporated

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Wettstein, Daniel A

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Morham, Scott

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Zavitz, Kenton

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<120> INTERACCIÓN TSG101-GAG Y USO DE LA MISMA

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<130> 1907.03 WO

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<140> PCT/US02/08146

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<141> 14-03-2002

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<150> US 09/972,035

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<151> 04-10-2001

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<150> US 09/971,549

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<151> 04-10-2001

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<150> US 60/276,259

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<151> 14-03-2001

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<160> 32

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 4

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<213> Virus de inmunodeficiencia humano

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<213> Virus de inmunodeficiencia humano

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<213> Virus de inmunodeficiencia humano

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<213> Virus de inmunodeficiencia humano

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<213> Virus de inmunodeficiencia humano

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<213> Virus de inmunodeficiencia humano

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<213> Virus de inmunodeficiencia humano

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<213> Virus de inmunodeficiencia humano

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<210> 27

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<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Virus de inmunodeficiencia humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm

34

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus de inmunodeficiencia humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Virus de inmunodeficiencia humano

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 29

\hskip1cm

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Virus de inmunodeficiencia humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

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<212> PRT

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<213> Virus de inmunodeficiencia humano

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 31

\hskip1cm

38

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<210> 32

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Virus de inmunodeficiencia humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm

39

Claims

1. Un complejo proteico que comprende una primera proteína que interacciona con una segunda proteína, donde

(a) la primera proteína es

(i): un fragmento de Tsg101 que comprende el dominio UEV,

(ii): un homólogo de Tsg101 que comprende un dominio UEV y tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 75% a la siguiente secuencia de aminoácidos:

\hskip1.5cm

40

\quad: y que puede interaccionar con GAGp6 de VIH;

(iv): una proteína de fusión que contiene (i), (ii) o (iii), y

(b) la segunda proteína es

(1): un polipéptido GAG de VIH,

(2): un homólogo de (1) que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 75% a la siguiente secuencia de aminoácidos:

\hskip1.5cm

41

\hskip1.5cm

42

\quad: y que puede interaccionar con Tsg101,

\vskip1.000000\baselineskip

(3): un fragmento de (1) o (2) que puede interaccionar con Tsg101,

(4): un polipéptido GAG de retrovirus que puede interaccionar con Tsg101,

(5): un fragmento de (4) que contiene un motivo de dominio tardío P(T/S)AP, o

(6): una proteína de fusión que contiene uno cualquiera de (1) a (5).

\vskip1.000000\baselineskip

2. El complejo proteico según la reivindicación 1, en el que la primera proteína es un fragmento de Tsg101 que comprende el dominio UEV, y la segunda proteína es un polipéptido GAG de retrovirus o un fragmento de un polipéptido GAG de retrovirus que contiene un motivo de dominio tardío P(T/S)AP.

3. El complejo proteico según la reivindicación 1 ó 2, en el que el fragmento de Tsg101 comprende residuos de aminoácido 1-207 de Tsg101.

4. Un método para obtener el complejo proteico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende las etapas de:

(a): proporcionar dicha primera proteína y dicha segunda proteína;y

(b): poner en contacto dicha primera proteína con dicha segunda proteína.

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5. Un método para seleccionar moduladores de un complejo proteico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dicho método:

(a): poner en contacto dicha primera proteína con dicha segunda proteína en presencia de uno o más compuestos de prueba; y

(b): detectar la interacción entre dicha primera proteína y dicha segunda proteína.

\vskip1.000000\baselineskip

6. El método según la reivindicación 5, en el que dicha etapa de puesta en contacto se lleva a cabo in vitro.

7. El método según la reivindicación 5, en el que dicha etapa de puesta en contacto se lleva a cabo en una célula huésped.

8. Una célula huésped que expresa una segunda proteína como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y comprende un primer casete de expresión quimérica que tiene un primer promotor heterólogo operativamente unido a un primer ácido nucleico que codifica para una primera proteína como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. La célula huésped de la reivindicación 8, en la que dicha segunda proteína se expresa en la célula huésped a partir de un segundo casete de expresión quimérica que tiene un segundo promotor heterólogo operativamente unido a un segundo ácido nucleico que codifica para dicha segunda proteína.

10. Un método para proporcionar un compuesto que puede interferir en una interacción entre la primera y la segunda proteínas del complejo proteico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende:

(a): proporcionar coordenadas atómicas que definen una estructura tridimensional de dicho complejo proteico; y

(b): diseñar o seleccionar compuestos que pueden interferir en la interacción entre dicha primera proteína y dicha segunda proteína basándose en dichas coordenadas atómicas.

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11. Un método para seleccionar un compuesto que puede inhibir la gemación viral, que comprende:

(a): poner en contacto un compuesto de prueba con una primera proteína como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

(b): determinar si dicho compuesto de prueba puede unirse a dicha primera proteína.

\newpage

12. Un método para seleccionar moduladores de un complejo proteico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende:

(a): poner en contacto un compuesto de prueba con el complejo proteico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

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13. El método de la reivindicación 11 ó 12, que además comprende ensayar dicho compuesto de prueba para ver su capacidad para inhibir la gemación viral de VIH de una célula huésped infectada por VIH.

14. Un método para seleccionar un compuesto que puede inhibir una interacción proteína-proteína entre Tsg101 y GAGp6 de VIH y adecuado para inhibir la gemación de partículas de virus de células huésped, que comprende:

(a): proporcionar coordenadas atómicas que definen una estructura tridimensional de una proteína como se define en uno cualquiera de (i) a (iv) de la reivindicación 1

(b): diseñar o seleccionar compuestos que pueden interaccionar con dicha proteína basándose en dichas coordenadas atómicas

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15. Un compuesto adecuado para inhibir la gemación de partículas de virus de células huésped, seleccionado entre:

(a): un anticuerpo inmunorreactivo selectivamente con el complejo proteico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

(b): un ácido nucleico que codifica para (a).

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16. Uso de un compuesto en la fabricación de una composición para tratar la infección viral, donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en:

(a): un ácido nucleico que hibrida específicamente a un ARNm o gen de Tsg101,

(b): un fragmento de Tsg101 que comprende el dominio UEV;

(c): un homólogo de dicho fragmento de Tsg101 que comprende un dominio UEV y tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 75% a la siguiente secuencia de aminoácidos:

: 43

\quad: y que puede interaccionar con GAGp6 de VIH;

(d): un ácido nucleico que codifica para (b) o (c);

(e): un anticuerpo inmunorreactivo con Tsg101, donde dicho anticuerpo puede inhibir la interacción proteína-proteína entre la primera proteína como se define en la reivindicación 1, y la segunda proteína como se define en la reivindicación 1;

(f): un ácido nucleico que codifica para (e);

(g): un fragmento de GAG de VIH, que comprende el motivo de dominio tardío P(T/S)AP,

(h): un homólogo de dicho fragmento de GAG de VIH, que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 75% a la siguiente secuencia de aminoácidos:

\hskip1.5cm

44

(i): un ácido nucleico que codifica para (g) o (h);

(j): un anticuerpo inmunorreactivo selectivamente con el complejo proteico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho anticuerpo puede inhibir la interacción proteína-proteína entre la primera proteína como se define en la reivindicación 1 y la segunda proteína como se define en la reivindicaión 1; y

(k): un ácido nucleico que codifica para (j).

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17. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

(b): un fragmento de Tsg101 que comprende el dominio UEV;

\hskip1.5cm

45

\quad: y que puede interaccionar con GAGp6 de VIH;

(d): un ácido nucleico que codifica para (b) o (c);

(f): un ácido nucleico que codifica para (e);

(g): un fragmento de GAG de VIH, que comprende el motivo de dominio tardío P(T/S)AP;

\hskip1.5cm

46

(i): un ácido nucleico que codifica para (g) o (h);

(j): un anticuerpo inmunorreactivo selectivamente con el complejo proteico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho anticuerpo puede inhibir la interacción proteína-proteína entre la primera proteína como se define en la reivindicación 1 y la segunda proteína como se define en la reivindicación 1; y

(k): un ácido nucleico que codifica para (j)

para tratar la infección viral.

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18. El uso de la reivindicación 16 o el compuesto de la reivindicación 17, donde el compuesto es un anticuerpo inmunorreactivo con Tsg101.

19. El uso de la reivindicación 18 o el compuesto de la reivindicación 18, en el que el anticuerpo inmunorreactivo con Tsg101 se selecciona entre.

(i): anticuerpos monoclonales;

(ii): anticuerpos policlonales;

(iii): fragmentos de anticuerpo, preferiblemente fragmentos Fab o F(ab')_{2};

(iv): conjugados de los fragmentos de anticuerpos de (iii);

(v): anticuerpos de cadena sencilla; y

(vi): anticuerpos humanizados.

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20. El uso de la reivindicación 16 o el compuesto de la reivindicación 17, donde el compuesto es un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo inmunorreactivo con Tsg101.

21. El uso de la reivindicación 20 o el compuesto de la reivindicación 20, donde dicho anticuerpo es

(1): un anticuerpo monoclonal,

(2): un fragmento de anticuerpo, preferiblemente un fragmento Fab o F(ab)_{2};

(3): un anticuerpo de cadena sencilla; o

(4): un anticuerpo humanizado.

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22. El uso de la reivindicación 16 o el compuesto de la reivindicación 17, donde el compuesto es un ácido nucleico que hibrida específicamente a un mRNA o gen de Tsg101.

23. Un método para inhibir la gemación de partículas de virus de una célula huésped in vitro, que comprende reducir la concentración de un complejo proteico que tiene Tsg101 y GAG de VIH en la célula huésped.