ES2329582T3 - Procedimiento de dosificacion selectiva de multimeros de adiponectina. - Google Patents
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Abstract
Un método para cuantificar selectivamente HMW-Ad como multímero de adiponectina diana en una muestra biológica, que comprende las etapas de: (a) la reacción de la muestra que contiene adiponectina con al menos una proteasa que puede estar modificada químicamente para digerir selectivamente una adiponectina distinta de la HMW-Ad de la muestra, donde la al menos una proteasa es seleccionada del grupo que consta de Proteinasa K derivada del género Tritirachium; Proteasa P "Amano" derivada del género Aspergillus; Umamizyme derivada del género Aspergillus; y Proteasa N "Amano" derivada del género Bacillus; (b) la cuantificación inmunológica de la HMW-Ad mediante la utilización de un anticuerpo anti-adiponectina.
Description
Procedimiento de dosificación selectiva de
multímeros de adiponectina.
La presente invención se refiere a un ensayo
selectivo para determinar formas multímeras de adiponectina
(referidas de aquí en adelante como multímeros de adiponectina)
presentes en una muestra biológica.
Específicamente, la presente invención se
refiere a un método para cuantificar selectivamente
HMW-Ad como multímero de adiponectina diana.
Waki y col., J. Biol. Chem. 278,
40352-40363 (2003) describen que debe considerarse
la distribución multimérica de adiponectina en la interpretación de
los niveles plasmáticos de adiponectina, ya que una multimerización
defectuosa y/o la secreción defectuosa consiguiente pueden estar
entre las causas del fenotipo diabético o de hipoadiponectinemia en
sujetos con ciertas mutaciones.
Tsao y col., J. Biol. Chem. 278,
50810-50817 (2003) describen una función de los
enlaces disulfuro en la estructura de la adiponectina y en la
especificidad para la producción de señales.
Arita y col., Bioch. Bioph. Res. Comm. 257,
79-83 (1999) describen un sistema de ELISA para
elucidar la función fisiológica y patofisiológica de la adiponectina
en humanos.
La adiponectina es una hormona sensible a
insulina que es secretada específicamente por las células de la
grasa y está presente en la sangre a un nivel relativamente elevado
(5 a 10 \mug/ml). Los presentes inventores han descrito
previamente un efecto fisiológico de la adiponectina; concretamente,
la disminución del nivel de adiponectina es una causa de la
diabetes de tipo II tras la obesidad o una causa del trastorno del
metabolismo de azúcares o lípidos en la diabetes lipoatrófica
(Documento No-Patente 1). Se han propuesto
aplicaciones médicas de la adiponectina, incluyendo el diagnóstico
de trastornos del metabolismo de azúcares; en particular, la
monitorización del efecto terapéutico de un derivado de tiazolidina
que es un fármaco que mejora la resistencia a la insulina
(Documento Patente 1), y la dosificación de un supresor
fibrogenético hepático que utiliza el efecto de la adiponectina,
incluyendo la supresión de la activación y del crecimiento de las
células estrelladas y la supresión de la producción de la matriz
extracelular (Documento Patente 2).
La adiponectina ha sido clasificada como
perteneciente a la familia C1q (Complemento 1q) sobre la base de su
estructura, y tiene por tanto un dominio similar a colágeno, que es
un rasgo característico de la familia C1q. Se ha descrito que la
adiponectina forma multímeros basados en unidades triméricas
(Documentos No-Patentes 2 y 3).
Se ha descrito una relación entre las
estructuras de la adiponectina y su efecto fisiológico, su
actividad, etc. Tsao y col. han descrito que el efecto de
activación de NF-\kappaB se observa únicamente en
multímeros de adiponectina mayores de un trímero, pero no se
observa en un trímero ni en un dominio globular que carece del
dominio similar a colágeno. Utpal y col. han descrito que únicamente
la adiponectina de alto peso molecular disminuye significativamente
mediante la administración de insulina o glucosa, y que la
adiponectina en la cual la cisteína del dominio similar a colágeno
ha sido sustituida por serina, o que la adiponectina que ha
experimentado un tratamiento reductor, presentan un potente efecto
reductor del azúcar sanguíneo, pero no se ha observado
sustancialmente un efecto reductor del azúcar sanguíneo en
adiponectina que no ha experimentado un tratamiento reductor ni en
adiponectina globular (Documento No-Patente 4).
Sin embargo, la adiponectina empleada en estos
estudios descritos ha sido producida a través de recombinación
génica mediante la utilización de E. coli o similar. Por
tanto, el comportamiento o la acción de la adiponectina que es
producida en un organismo pueden no verse reflejados exactamente.
Además, Se sabe que el nivel de adiponectina en sangre difiere
entre los sexos. En comparación con los machos, se ha descrito que
las hembras tienen un nivel de adiponectina sanguínea
significativamente elevado (Documento No-Patente 5).
Un ensayo en el que se utilizó suero de ratón reveló que las
hembras tienen unos niveles particularmente elevados del contenido
de adiponectina de alto peso molecular (Documento
No-Patente 4).
Según se describió anteriormente, midiendo
únicamente la cantidad total de adiponectina no puede obtenerse
información suficiente sobre la relación entre las estructuras de la
adiponectina y los efectos fisiológicos o las enfermedades. Por
tanto, existe todavía la necesidad de un método para analizar
selectivamente los multímeros de adiponectina presentes en una
muestra biológica.
En un método de la técnica anterior para
analizar adiponectina, la muestra que iba a ser medida se llevaba a
ebullición en presencia de docecilsulfato de sodio (SDS) antes de la
realización del inmunoensayo (Documento Patente 3). El tratamiento
de ebullición permite la exposición de un lugar de reconocimiento de
anticuerpos de la adiponectina que estaba estereoestructuralmente
oculto, para determinar inmunológicamente la cantidad total de
adiponectina. Por tanto, este método no estaba dirigido al ensayo
selectivo de multímeros de adiponectina.
Se ha descrito un método para analizar la
adiponectina contenida en una muestra sin tratamiento
desnaturalizador con SDS y sin tratamiento desnaturalizador térmico
(Documento Patente 1. En el documento se describe que se midió la
adiponectina nativa). Sin embargo, no se hace referencia a un ensayo
selectivo y este método no puede ser empleado para un ensayo
selectivo.
[Documento Patente 1] WO 03/016906.
[Documento Patente 2]
JP-A-2002-363094.
[Documento Patente 3]
JP-A-2000-304748.
[Documento No-Patente 1]
Yamauchi, T. y col., Nat. Med., 7, 941-946,
2001.
[Documento No-Patente 2] Nakano,
Y. y col., J. Biochem., 120, 803-812, 1996.
[Documento No-Patente 3] Tsao,
T.-S. y col., J. Biol. Chem., 277, 29359-29362,
2002.
[Documento No-Patente 4] Pajvani
y col., J. Biol. Chem., 278, 9073-9085, 2003.
[Documento No Patente 5] Yamamoto, Y. y col.,
Clin. Sci., 103, 137-142, 2002.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un método,
según se define en la reivindicación 1, para analizar selectivamente
HMW-Ad como multímero de adiponectina diana
específico en una muestra biológica, y un método para evaluar de
forma precisa la relación entre una enfermedad y la adiponectina
mediante el ensayo selectivo de los multímeros de adiponectina
según se define en la reivindicación 9. El ensayo selectivo
proporciona una información tal que no puede ser obtenida mediante
la medida únicamente de la cantidad total de adiponectina.
Con el fin de resolver los problemas, los
presentes inventores han llevado a cabo extensos estudios y han
encontrado que la sangre contiene adiponectina que puede ser
clasificada en los tres tipos siguientes sobre la base del peso
molecular medido mediante cromatografía de filtración en gel; 150
kDa o más y 200 kDa o menos (principalmente cerca de 160 kDa)
(referida de aquí en adelante como LMW-Ad), más de
200 kDa y menos de 400 kDa (principalmente cerca de 260 kDa)
(referida de aquí en adelante como MMW-Ad), y 400
kDa o más y 800 kDa o menos (principalmente cerca de 450 kDa)
(referida de aquí en adelante como HMW-Ad). Los
presentes inventores han realizado estudios posteriores y
finalmente consiguieron obtener con éxito cuatro tipos de productos
multímeros de adiponectina separados y purificados a partir de
sangre humana. Estos cuatro tipos pueden ser separados mediante
electroforesis en poliacrilamida (del 2 al 15%) (de aquí en adelante
puede ser referida como "PAGE (del 2 al 15%)") bajo condiciones
no desnaturalizantes, y han sido definidos como
ULMW-Ad, LMW-Ad,
MMW-Ad y HMW-Ad, desde la movilidad
más alta a movilidad más baja. De estos cuatro tipos de
adiponectina, se encontró que LMW-Ad,
MMW-Ad y HMW-Ad correspondían a los
tres tipos anteriores de adiponectina contenidos en el suero.
Además, los presentes inventores han encontrado que
LMW-Ad es un trímero de adiponectina al cual se une
la albúmina a través de un enlace disulfuro y que, mediante la
utilización combinada de al menos un anticuerpo
anti-adiponectina y un anticuerpo
anti-albúmina, la LMW-Ad puede ser
analizada selectivamente. Además, los presentes inventores han
encontrado que, mediante el cálculo del peso molecular con
electroforesis en SDS-poliacrilamida (del 2 al 15%)
(puede ser referida de aquí en adelante como
"SDS-PAGE") después de entrecruzamiento
intramolecular, se determinó que la ULMW-Ad era un
trímero de adiponectina, se dedujo que MMW-Ad era un
hexámero o un nanómero, y se dedujo que HMW-Ad era
un multímero formado por monómeros cuyo número era el doble o más
del de los monómeros que forman la MMW-Ad.
Sobre la base de estos hallazgos, los presentes
inventores han encontrado que, mediante la reacción de una proteasa
adecuada con una muestra que contenga adiponectina, puede digerirse
la adiponectina distinta de HMW-Ad, y que la
HMW-Ad que permanece después de la digestión con la
proteasa puede ser analizada selectivamente mediante la utilización
de un anticuerpo anti-adiponectina.
Los presentes inventores han encontrado también
que la cantidad de MMW-Ad contenida en una muestra
puede ser determinada mediante el procesamiento de
ULMW-Ad y LMW-Ad con proteasa, el
cálculo de la cantidad total de HMW-Ad y
MMW-Ad que permanecen, y la resta de la cantidad de
HMW-Ad de la cantidad total de
HMW-Ad y MMW-Ad, y que la cantidad
de ULMW-Ad contenida en una muestra puede ser
determinada mediante el procesamiento de ULMW-Ad y
LMW-Ad con proteasa, el cálculo de la cantidad total
de HMW-Ad y MMW-Ad que quedan, y la
resta de la cantidad total de HMW-Ad y
MMW-Ad y la cantidad de LMW-Ad de la
cantidad total de adiponectina, que ha sido determinada
selectivamente. La presente invención ha sido llevada a cabo sobre
la base de estos hallazgos.
Por tanto, la presente invención proporciona un
método para analizar selectivamente HMW-Ad como
multímero de adiponectina diana en una muestra biológica, que
comprende una etapa de diferenciación del multímero de adiponectina
diana de los demás multímeros de adiponectina mediante la
utilización de una proteasa específica y de un anticuerpo para el
ensayo inmunológico, según está definido adicionalmente por la
reivindicación 1. Se describe también un método para analizar
adiponectina en una muestra biológica, en el que el multímero de
adiponectina derivado de sangre humana es de los cuatro tipos de
adiponectina siguientes, y uno o dos de los cuatro tipos de
adiponectina son seleccionados de la adiponectina total e
inmunoanalizados mediante la utilización de una proteasa y/o un
anticuerpo.
- (1)
- ULMW-Ad: presenta la mayor movilidad entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando adiponectina que había sido purificada a partir de suero humano o de plasma humano es sometida a electroforesis en gel de poliacrilamida (del 2 al 15%) bajo condiciones no desnaturalizantes, y tiene un peso molecular de alrededor de 100 kDa medido mediante SDS-PAGE tras entrecruzamiento intramolecular;
- (2)
- LMW-Ad: presenta la segunda movilidad más elevada, próxima a ULMW-Ad, entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando adiponectina que había sido purificada a partir de suero humano o de plasma humano es sometida a electroforesis en gel de poliacrilamida (del 2 al 15%) bajo condiciones no desnaturalizantes, tiene un peso molecular de 150 kDa aproximadamente medido mediante SDS-PAGE tras entrecruzamiento intramolecular, y se une a la albúmina a través de un enlace disulfuro;
- (3)
- MMW-Ad: presenta la tercera movilidad más elevada, próxima a LMW-Ad, entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando adiponectina que había sido purificada a partir de suero humano o de plasma humano es sometida a electroforesis en gel de poliacrilamida (del 2 al 15%) bajo condiciones no desnaturalizantes, y tiene un peso molecular de 250 kDa aproximadamente medido mediante SDS-PAGE tras entrecruzamiento intramolecular; y
- (4)
- HMW-Ad: presenta la movilidad más baja entre las cuatro bandas teñidas principales detectadas cuando adiponectina que había sido purificada a partir de suero humano o de plasma humano es sometida a electroforesis en gel de poliacrilamida (del 2 al 15%) bajo condiciones no desnaturalizantes, y tiene un peso molecular de 300 kDa o mayor medido mediante SDS-PAGE tras entrecruzamiento intramolecular.
La presente invención proporciona también un
método para evaluar una enfermedad específica o una condición
patológica de un ser humano, caracterizado porque comprende el
análisis selectivo de HMW-Ad como uno de los cuatro
tipos anteriores de adiponectina derivados de sangre humana por
diferenciación de las demás adiponectinas y el inmunoensayo
del(los) multímero(s) de adiponectina diana mediante
la utilización de una proteasa específica y de un anticuerpo, y la
obtención de información sobre la enfermedad o la condición
patológica sobre la base de los resultados del ensayo selectivo,
según está definido adicionalmente por la reivindicación 9.
La presente invención permite el ensayo
selectivo de HMW-Ad y por tanto la evaluación
precisa del efecto fisiológico de adiponectina y la evaluación de
la aparición, el diagnóstico, el desarrollo, el pronóstico y el
efecto terapéutico de enfermedades y condiciones patológicas,
especialmente de la diabetes de tipo II, de la enfermedad
arterioesclerótica, de la enfermedad renal, de la enfermedad
hepática, de la obesidad y del síndrome metabólico.
[Fig. 1] Cromatograma de filtración en gel de
los multímeros de adiponectina del Ejemplo 1.
[Fig. 2] Resultados de la tinción con CBB de
LMW-Ad, MMW-Ad o
HMW-Ad tras PAGE (del 2 al 15%), del Ejemplo 1.
[Fig. 3] Resultados de la tinción con CBB de
LMW-Ad, MMW-Ad y
HMW-Ad tras SDS-PAGE (del 2 al 15%),
del Ejemplo 2.
[Fig. 4] Resultados del análisis de
transferencia Western de la adiponectina sérica humana del Ejemplo
5.
[Fig. 5] Resultados del inmunoensayo de
LMW-Ad (adiponectina unida a albúmina) del Ejemplo
6.
[Fig. 6] Resultados de la tinción con CBB de los
productos purificados de ULMW-Ad,
LMW-Ad, MMW-Ad y
HMW-Ad derivados de humano tras PAGE (del 2 al 15%),
del Ejemplo 3.
[FIG. 7] Resultados de la tinción con CBB de los
productos purificados de ULMW-Ad,
LMW-Ad, MMW-Ad y
HMW-Ad derivados de humano que habían sido sometidos
a SDS-PAGE (del 2 al 15%) bajo condiciones no
desnaturalizantes, del Ejemplo 4.
[Fig. 8] Resultados de la transferencia Western
de los productos purificados de ULMW-Ad,
LMW-Ad, MMW-Ad y
HMW-Ad derivados de humano, que habían experimentado
entrecruzamiento intramolecular y SDS-PAGE (del 2 al
15%), del Ejemplo 4.
[Fig. 9] Resultados del inmunoensayo de
LMW-Ad (adiponectina que se une a la albúmina) del
Ejemplo 7.
[Fig. 10] Resultados del Ejemplo 13, que
muestran la especificidad de la proteinasa K sobre la digestión de
multímeros de adiponectina.
[Fig. 11] Resultados del Ejemplo 13, que
muestran la especificidad de la proteasa A "Amano" sobre la
digestión de multímeros de adiponectina.
No se impone ninguna limitación particular sobre
la muestra biológica a emplear en la presente invención, siempre
que la muestra biológica contenga un multímero de adiponectina.
Ejemplos de muestra biológica incluyen fluidos corporales (por
ejemplo, sangre, orina), extractos tisulares y sobrenadantes del
caldo de cultivo de células derivadas de tejidos obtenidas de un
mamífero tal como un humano o un animal (por ejemplo, mono, cabra,
oveja, conejo, ratón, rata, cobaya). Con el fin de evaluar de manera
precisa el efecto fisiológico de la adiponectina, o la enfermedad o
las condiciones patológicas de un paciente, se prefiere sangre
(suero, plasma) como muestra biológica. No se impone ninguna
limitación particular sobre el método para obtener la muestra,
siempre que el método no afecte de manera adversa a la adiponectina
presente en la muestra, en términos del ensayo selectivo de
adiponectina. Dependiendo de los fines de la evaluación, puede
seleccionarse un método adecuado para obtener la muestra. Por
ejemplo, puede extraerse una muestra de sangre humana a un humano en
ayunas o después de la administración de un fármaco al humano.
Ejemplos específicos del inmunoensayo de acuerdo
con la presente invención incluyen métodos conocidos tales como
ELISA (inmunoensayo enzimático), CLEIA (inmunoensayo con enzima
quimioluminiscente), RIA (radioinmunoensayo) y LTIA (inmunoensayo
turbidimétrico con látex). En el caso del ELISA, por ejemplo, puede
emplearse cualquiera de los procesos siguientes. Específicamente,
en un proceso, un anticuerpo que reconoce adiponectina es
inmovilizado en un soporte insoluble, y se utiliza un anticuerpo
marcado con un enzima que reconoce la albúmina en combinación con
el soporte. En otro proceso, un anticuerpo que reconoce un complejo
adiponectina-albúmina es inmovilizado en un soporte
insoluble, el complejo adiponectina-albúmina es
capturado mediante la utilización del soporte y se emplea un
anticuerpo marcado con un enzima que reconoce adiponectina o
albúmina en combinación con el soporte. Cada uno de los procesos de
ensayo será descrito con detalle. Un anticuerpo que reconoce
adiponectina es inmovilizado en un soporte insoluble y el soporte
es puesto en contacto y mezclado con una mezcla que contiene un
complejo adiponectina-albúmina, con el fin de
capturar de este modo el complejo
adiponectina-albúmina sobre el soporte insoluble.
Posteriormente, un anticuerpo marcado con un enzima que reconoce
albúmina es puesto en contacto y mezclado con el soporte, por lo que
se forma un complejo de 3 componentes "soporte
insoluble"-"complejo
adiponectina-albúmina"-"anticuerpo marcado con
un enzima". A continuación, el enzima que marca el anticuerpo se
hace reaccionar con un sustrato enzimático adecuado y se mide
ópticamente el cambio de la absorbancia atribuido al producto de
reacción, mediante lo cual el complejo
adiponectina-albúmina puede ser analizado
cualitativamente o cuantitativamente. En el caso de LTIA, un
anticuerpo que es capaz de unirse específicamente al complejo
adiponectina-albúmina es transportado en un soporte
insoluble y el soporte es mezclado con el complejo
adiponectina-albúmina para producir el
entrecruzamiento (agregación) del soporte insoluble a través del
complejo adiponectina-albúmina. La turbidez
resultante es medida ópticamente, por lo que el complejo
adiponectina-albúmina puede ser analizado
cualitativamente o cuantitativamente. Para una medida precisa,
cómoda y rápida del complejo adiponectina-albúmina,
se prefiere LTIA.
El soporte insoluble para ser empleado en la
presente invención puede ser un soporte insoluble orgánico que haya
sido empleado en inmunoensayos rutinarios y que pueda ser producido
industrialmente a gran escala. En el ELISA, se prefiere una
microplaca de 96 pocillos de, por ejemplo, poliestireno, que tiene
una excelente adsorbabilidad del anticuerpo y que es capaz de
mantener la actividad biológica estable durante un largo periodo de
tiempo. En LTIA, se prefieren partículas de látex de
poliestireno.
Se conocen varios métodos para transportar un
anticuerpo en tal soporte insoluble, y cualquiera de los métodos
conocidos puede ser empleado en la presente invención, según se
desee. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser transportado
(sensibilizado) mediante la adsorción física del anticuerpo sobre la
superficie de un soporte insoluble. Alternativamente, la superficie
de un soporte insoluble que tenga un grupo funcional puede ser
sensibilizada eficazmente con un anticuerpo mediante un método de
unión física o química conocido.
No se impone ninguna limitación particular sobre
las condiciones de reacción bajo las cuales el soporte insoluble
portador del anticuerpo y/o el anticuerpo marcado con un enzima
reaccionan con el complejo adiponectina-albúmina,
siempre que la reacción antígeno-anticuerpo tenga
lugar bajo las condiciones de reacción. No se impone ninguna
limitación particular sobre la mezcla de reacción que contiene el
complejo adiponectina-albúmina, siempre que la
mezcla de reacción no afecte de manera adversa a la reacción
antígeno-anticuerpo del complejo
adiponectina-albúmina. Por ejemplo, la mezcla de
reacción puede contener un componente tampón para ajustar el pH (por
ejemplo, tampón fosfato, tampón glicina, tampón Tris, tampón de
Good), cloruro de sodio, un surfactante o una sustancia similar
para prevenir reacciones no específicas y un estabilizante tal como
seroalbúmina bovina (BSA), sacarosa o un polímero polisacarídico,
según se desee. La mezcla de reacción puede contener también, además
de las sustancias anteriores que controlan la reactividad, un
polisacárido soluble en agua tal como dextrano o un aditivo tal
como un inhibidor enzimático, según sea apropiado.
El anticuerpo marcado con un enzima utilizado en
el ELISA puede ser preparado mediante un método conocido. Por
ejemplo, mediante el método de Ishikawa y col. (método de maleimida:
"Enzyme Immunoassay, 3rd Edition",
Igaku-shoin Ltd.). Un anticuerpo no tratado o un
anticuerpo que haya sido sometido a proteolisis limitada con una
proteasa adecuada para formar F(ab')_{2} o Fab' de acuerdo
con las necesidades, puede ser marcado con un enzima. Ejemplos del
enzima para marcar incluyen peroxidasa, fosfatasa alcalina,
\beta-D-galactosidasa y glucosa
oxidasa. La actividad enzimática es determinada por medio de un
sustrato y, si es necesario, de un agente para la producción de
color. Cuando se emplea peroxidasa como enzima, puede emplearse
peróxido de hidrógeno como sustrato y puede emplearse como agente
para la producción de color o-feniléndiamina,
3,3',5,5'-tetrametilbencidina, sal de amonio del
ácido
2,2'-azinodi-(3-etilbenzotiazolin
sulfónico) o una sustancia similar. Cuando el enzima es fosfatasa
alcalina, puede emplearse como sustrato
p-nitrofenilfosfato o una sustancia similar. Cuando
el enzima es
\beta-D-galactosidasa, puede
emplearse como sustrato
\beta-D-galactopiranósido o una
sustancia similar. Cuando el enzima es glucosa oxidasa, en
presencia de peroxidasa, puede emplearse
\beta-D-glucosa como sustrato de
la glucosa oxidasa y puede emplearse un agente para la producción de
color similar al empleado en el caso de la peroxidasa.
Cuando se realiza un ELISA, no se impone ninguna
limitación particular sobre el método para analizar el producto de
la reacción entre el sustrato y el enzima, sobre la base de la
actividad enzimática del anticuerpo marcado con el enzima. Por
ejemplo, cuando el enzima, el sustrato y el agente para la
producción de color son peroxidasa, peróxido de hidrógeno y
o-feniléndiamina, respectivamente, el producto de la
reacción enzimática puede ser detectado determinando la absorbancia
a 492 nm, que es la longitud de onda característica del producto de
reacción, mediante la utilización de un lector de microplacas de 96
pocillos.
No se impone ninguna limitación particular sobre
el método para determinar el grado de agregación de los soportes
insolubles en LTIA. Por ejemplo, para evaluar cualitativamente o
semicuantitativamente la agregación, el grado de agregación puede
ser determinado visualmente comparando la turbidez entre muestras
que tengan concentraciones conocidas y la muestra diana. Con el fin
de evaluar cuantitativamente la agregación, se emplea
preferiblemente una medida óptica, desde el punto de vista de la
comodidad y de la precisión. La medida óptica de la masa agregada
puede ser realizada mediante un método conocido. Ejemplos
específicos de la medida óptica que puede ser empleada en la
presente invención incluyen la denominada medida turbidimétrica (la
formación de la masa agregada es observada como un incremento de la
turbidez), la medida de la distribución del tamaño de partículas
(la formación de la masa agregada es observada como un cambio en la
distribución del tamaño de partículas o en el tamaño medio de las
partículas), y el ensayo turbidimétrico con una esfera integrante
(se mide el cambio de la radiación dispersa frontal causado por la
formación de la masa agregada mediante la utilización de una esfera
integrante, y se compara la relación entre la intensidad y la
radiación transmitida).
Se describirá a continuación un método para el
inmunoensayo selectivo de HMW-Ad. Una proteasa
adecuada se hace reaccionar con una muestra que contenga
adiponectina para digerir la adiponectina distinta de
HMW-Ad. La HMW-Ad, que permanece
después de la digestión con la proteasa, es analizada mediante la
utilización de un anticuerpo anti-adiponectina. No
se impone ninguna limitación particular sobre la proteasa de acuerdo
con la reivindicación 1 que puede ser empleada para analizar
selectivamente la HMW-Ad, siempre que la proteasa
digiera adiponectina distinta de HMW-Ad. En la
presente invención se emplean proteinasa K derivada del género
Tritirachium o las proteasas siguientes derivadas de un
microorganismo perteneciente al género Aspergillus o
Bacillus: los productos disponibles comercialmente de las
proteasas derivadas de un microorganismo perteneciente al género
Aspergillus, proteasa P "Amano" y Umamizyme (Productos
de Amano Enzyme Inc.) o los productos disponibles comercialmente de
la proteasa derivada de un microorganismo perteneciente al género
Bacillus, proteasa N "Amano" (Amano Enzyme Inc.). La
proteasa puede ser obtenida mediante la tecnología de recombinación
génica. La proteasa puede ser modificada químicamente. Las
condiciones bajo las cuales se lleva a cabo el procesamiento con la
proteasa difieren dependiendo del tipo de proteasa empleado.
Preferiblemente, el procesamiento con la proteasa se realiza en un
tampón tal como tampón fosfato, tampón Tris o tampón de Good durante
un periodo de 5 minutos a 24 horas a una temperatura de 4 a 60ºC.
La concentración de la proteasa empleada para el procesamiento es
determinada en vista de la actividad específica de la proteasa, de
la temperatura de reacción, del tiempo de reacción y de factores
similares. Típicamente, la proteasa es empleada a una concentración
dentro del rango de 0,01 a 100 U/ml o 0,01 a 100 mg/ml.
El anticuerpo que es utilizado para analizar la
HMW-Ad, que queda después del procesamiento de la
muestra biológica con la proteasa, puede ser un anticuerpo que
reconozca adiponectina. Puede producirse un anticuerpo
anti-adiponectina policlonal o monoclonal mediante
la inmunización de un animal adecuado con un método conocido, o
puede ser obtenido como un producto disponible comercialmente.
Cualquiera de estos puede ser empleado en la presente invención.
Por ejemplo, ejemplos de un anticuerpo
anti-adiponectina humana incluyen el anticuerpo de
cabra \alpha Acrp30 humana (Cosmo Bio Co., Ltd., GT), el
anticuerpo de conejo \alpha adiponectina-PoAb hu
(Cosmo Bio Co., Ltd., Chemicon), el hu Acrp30-MoAb
(Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., BD), el MoAb de ratón \alpha
Adiponectina hu (Cosmo Bio Co., Ltd., Chemicon) y el anticuerpo
monoclonal anti-ACRP30 humana (AX773, AX741, Ne,
Na, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Alternativamente, puede
emplearse un kit disponible comercialmente para determinar la
cantidad total de adiponectina, tal como el "Human Adiponectin
ELISA Kit" (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.). Puede emplearse un
método alternativo que ha sido desarrollado por los presentes
inventores (Solicitud Internacional que reivindica prioridad de la
Solicitud de Patente Japonesa Nº 2003-354715), en
el cual al menos uno de un agente reductor, un ácido o una sal del
mismo, un surfactante y una proteasa es añadido a una muestra
biológica para su reacción con adiponectina, por lo que se forman
multímeros de adiponectina de forma específica, y la adiponectina
resultante es sometida a inmunoensayo.
De acuerdo con la presente invención, cada uno
de los cuatro tipos de adiponectina humana presentes en una muestra
de sangre humana puede ser analizado selectivamente. Por tanto, la
presente invención permite la evaluación de la aparición, el
diagnóstico, el desarrollo, el pronóstico y el efecto terapéutico de
la diabetes de tipo II, de la enfermedad arterioesclerótica, de la
enfermedad renal, de la enfermedad hepática, de la obesidad y del
síndrome metabólico. Por ejemplo, la evaluación puede ser llevada a
cabo mediante la observación del cambio de las cantidades de
HMW-Ad, o la observación de la relación de al menos
dos de los parámetros siguientes: la cantidad total de
adiponectina, la cantidad de ULMW-Ad, la cantidad de
LMW-Ad, la cantidad de MMW-Ad y la
cantidad de HMW-Ad, y la comparación de los
resultados con un valor estándar. Alternativamente, la evaluación
puede ser llevada a cabo mediante la observación de un cambio en el
tiempo de estas cantidades en el mismo individuo. Alternativamente,
la evaluación puede ser realizada mediante la correlación de un
índice conocido que haya sido utilizado para una cierta enfermedad
o condición patológica (por ejemplo, la insulina en la diabetes de
tipo II o el colesterol HDL en la enfermedad arterioesclerótica,
etcétera) con las cantidades de HMW-Ad, o con la
relación de al menos dos de los parámetros siguientes: la cantidad
total de adiponectina, la cantidad de ULMW-Ad, la
cantidad de LMW-Ad, la cantidad de
MMW-Ad y la cantidad de HMW-Ad.
La presente invención será descrita a
continuación con detalle por medio de ejemplos, que no deben ser
considerados como limitantes de la invención.
Los reactivos y materiales empleados en los
Ejemplos y en los Ejemplos de Referencia son:
- a.
- líquido de lavado de la resina que se une al anticuerpo: NaHCO_{3} 0,1 M-NaOH (pH 8,3) conteniendo NaCl 0,5 M;
- b.
- eluyente de la resina que se une al anticuerpo: glicina 0,1 M-HCl (pH 2,5);
- c.
- líquido de neutralización de la resina que se une al anticuerpo: Tris 2 M-HCl (pH 8,0);
- d.
- placa de ELISA: microplaca de 96 pocillos (producto de NUNC);
- e.
- solución de sensibilización con el anticuerpo del ELISA: PBS (pH 7,4);
- f.
- tampón de ELISA: PBS (pH 7,4) conteniendo un 1% de seroalbúmina bovina y un 0,1% de Tween 20;
- g.
- kit del vector ABC (ratón): producto de Funakoshi Co., Ltd., Nº de Catálogo PK-6102;
- h.
- kit de sustrato DAB (sustrato para la producción de color de transferencia Western): producto de Funakoshi Co., Ltd., Nº de Catálogo SK-4100;
- i.
- anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana (hu Acrp30-MoAb): producto de Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., BD Transduction Laboratories, código de producto: A12820;
- j.
- anticuerpo policlonal anti-adiponectina humana de cabra (anticuerpo \alpha Acrp30 humana de cabra): Producto de Cosmo Bio Co., Ltd., GT, Nº de Catálogo 421065;
- k.
- anticuerpo anti-IgG de ratón producido en cabra marcado con HRP: Cosmo Bio Co., Ltd., producto de Capple;
- l.
- líquido de lavado del ELISA: PBS conteniendo un 0,05% de Tween 20;
- m.
- tampón de ELISA 2: PBS conteniendo un 1% de BSA y un 0,05% de Tween 20;
- n.
- anticuerpo policlonal anti-albúmina humana producido en cabra marcado con HRP (anticuerpo anti-HSA HRP-Gt): producto de PARIS; y
- o.
- HRP-Avidina: producto de PIERCE.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
1
La secuencia del dominio globular
(correspondiente a los residuos 104-247) del gen de
adiponectina de ratón (# de acceso del NCBI U37222) fue insertada
en BamHI y HindIII de un vector pQE30 que contenía una marca de
6xHis, e introducida posteriormente en E. coli. La
adiponectina globular de ratón recombinante (rMgAd) expresada en
E. coli fue purificada mediante el proceso siguiente.
Específicamente, una fracción soluble de E. coli fue añadida
a Ni-NTA agarosa (producto de QIAGEN) y se hizo que
la rMgAd se uniera durante 16 horas a 4ºC. La rMgAd fue eluida de
manera seriada con imidazol y una fracción que contenía adiponectina
fue recogida y dializada posteriormente con PBS (pH 7,4) durante
tres días. El contenido de proteínas de la rMgAd resultante fue
determinado por medio de un kit de ensayo de proteínas DC de
Bio-Rad.
Ejemplo de Referencia
2
Se mezclaron la rMgAd (50 \mug) preparada en
el Ejemplo de Referencia 1 y la misma cantidad de adyuvante
completo de Freund y se inmunizados dos conejos con la mezcla seis
veces, a intervalos de dos semanas, para producir antisuero. El
anticuerpo específico (IgG) presente en el antisuero fue purificado
mediante un método rutinario utilizando una resina con Proteína A
(anticuerpo anti-rMgAd).
Ejemplo de Referencia
3
El anticuerpo anti-rMgAd (500
mg) preparado en el Ejemplo de Referencia 2 fue unido a Sepharosa 4B
activada con CNBr (Amersham Bioscience) (50 ml), para preparar de
este modo una resina de Sepharosa 4B que se unía al anticuerpo
anti-rMgAd. Se añadió suero humano (2,5 l) a la
resina de Sepharosa 4B que se unía al anticuerpo
anti-rMgAd, y la resina fue lavada exhaustivamente
con el líquido de lavado de la resina que se une al anticuerpo. Se
aplicó el eluyente de la resina que se une al anticuerpo para
obtener una fracción de adiponectina de suero humano (mAd), y se
añadió a la fracción el líquido de neutralización de la resina que
se une al anticuerpo para su neutralización en una cantidad de 1/10
de la de la fracción. Posteriormente, la fracción neutralizada fue
aplicada a la resina de Proteína A y se recogió una fracción que
contenía componentes que no se habían adsorbido a la resina de
Proteína A como mAd purificado. El contenido de adiponectina fue
determinado mediante un "kit de ELISA para adiponectina
humana" (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).
Ejemplo de Referencia
4
El mAd purificado (20 \mug) obtenido en el
Ejemplo de Referencia 3 fue mezclado con la misma cantidad de
adyuvante completo de Freund y se inmunizaron dos ratones con la
mezcla, tres o cuatro veces, a intervalos de dos semanas. La mezcla
fue administrada de nuevo a los ratones tres días antes de la fusión
celular. Se recogieron células esplénicas de los ratones
inmunizados y se llevó a cabo la fusión celular con células de
mieloma P3U1 mediante un método rutinario utilizando polietilén
glicol. Las células fusionadas que producían el anticuerpo
monoclonal anti-adiponectina humana fueron
seleccionadas mediante un método conocido. Específicamente, se
seleccionaron mediante ELISA los pocillos que eran muy reactivos con
mAd y se realizó una dilución limitante. Las células fusionadas
seleccionadas fueron administradas intraperitonealmente a ratones
que habían sido tratados con pristano, y se recogió el líquido
ascítico como anticuerpo monoclonal
anti-adiponectina humana. La purificación del
anticuerpo específico (IgG) a partir del líquido ascítico se llevó a
cabo mediante un método de rutina utilizando la resina de Proteína
A. De este modo, se obtuvieron células fusionadas que producían once
anticuerpos monoclonales anti-adiponectina humana
así como tales anticuerpos monoclonales (números de identificación
64401 a 64411).
El mAd purificado obtenido en el Ejemplo de
Referencia 3 fue desmineralizado mediante diálisis con tampón
fosfato 20 mM (pH 7,0), adsorbido en una columna de
Gelatina-Cellulofine (Seikagaku Corporation) y
posteriormente eluido de manera seriada con tampones fosfato 20 mM
(pH 7,0) que contenían 0, 100, 200, 300 y 500 mM de NaCl. Las
fracciones del eluato resultantes, que habían sido obtenidas
mediante la utilización de los tampones con diferente concentración
de NaCl, contenían mezclas de adiponectina de diferentes pesos
moleculares. Cada una de las fracciones del eluato fue concentrada
y sometida posteriormente a cromatografía de filtración en gel
utilizando Sephacryl S-300 (peso molecular
fraccionado: 10 a 1500 kDa, tamaño medio de partícula 47 \mum,
Amersham Bioscience). En la cromatografía de filtración en gel se
empleó como eluyente tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) que contenía
NaCl 150 mM. La calibración de peso molecular de la columna de
Sephacryl S-300 había sido realizada utilizando un
kit de calibración de filtración en gel (Amersham Bioscience). En la
cromatografía, la adiponectina fue detectada por medio de un "kit
de ELISA para adiponectina humana" (Otsuka Pharmaceutical Co.,
Ltd.).
La Fig. 1 muestra el cromatograma de filtración
en gel. Las fracciones del eluato fueron divididas en tres
porciones, concretamente, 150 kDa o más y 200 kDa o menos (en su
mayoría próximas a 160 kDa), más de 200 kDa y menos de 400 kDa (en
su mayoría próximas a 260 kDa) y 400 kDa o más y 800 kDa o menos (en
su mayoría próximas a 450 kDa), para preparar de este modo
productos separados y purificados de multímeros de adiponectina. Un
primer producto de 150 kDa o más y 200 kDa o menos (en su mayoría
cerca de 160 kDa) es referido como LMW-Ad, un
segundo producto de más de 200 kDa y menos de 400 kDa (en su mayoría
cerca de 260 kDa) es referido como MMW-Ad, y un
tercer producto de 400 kDa o más y 800 kDa o menos (en su mayoría
cerca de 450 kDa) es referido como HMW-Ad.
Cada uno de los tres productos multímeros de
adiponectina anteriormente preparados separados y purificados, esto
es, LMW-Ad, MMW-Ad y
HMW-Ad fue sometido a electroforesis en gel de
poliacrilamida (concentración de poliacrilamida: del 2 a 15%)
(referido de aquí en adelante como PAGE (del 2 al 15%)) para la
separación y posteriormente a tinción de proteínas con CBB (Azul
Brillante de Coomassie). La Fig. 2 muestra los resultados de la
tinción de las proteínas sometidas a electroforesis.
En cada uno de LMW-Ad,
MMW-Ad y HMW-Ad, se observaron
bandas distintas de la banda teñida principal pero se detectaban
con una claridad considerablemente menor en comparación con la banda
principal, revelando que la separación y la purificación se habían
completado con éxito. Como los multímeros de adiponectina se forman
sobre la base de un trímero según se describió anteriormente, el
peso molecular de cada uno de LMW-Ad,
MMW-Ad y HMW-Ad, medido mediante
PAGE, no coincide necesariamente con el peso molecular medido
mediante filtración en gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada uno de los productos multímeros de
adiponectina separados y purificados obtenidos en el Ejemplo 1, fue
sometido a SDS-PAGE (del 2 al 15%) bajo condiciones
no reductoras para su separación y posteriormente a tinción de
proteínas con CBB. La Fig. 3 muestra los resultados de la tinción de
las proteínas sometidas a electroforesis.
En cada uno de LMW-Ad,
MMW-Ad y HMW-Ad, se observaba una
banda teñida clara en las proximidades de 60 kDa. Se dedujo que la
banda teñida era un dímero de adiponectina sobre la base de la
estructura descrita y del peso molecular de la adiponectina. En
LMW-Ad, además de la banda próxima a 60 kDa, se
observaba una banda teñida clara, no identificada, en las
proximidades de 90 kDa.
Una porción del gel que contenía la banda teñida
no identificada próxima a 90 kDa que había sido detectada en 1)
anterior, fue cortada y la proteína extraída por medio de un
electroeluidor Modelo 422 (producto de Bio-Rad
Laboratories, Inc.). La proteína extraída fue llevada a ebullición y
reducida utilizando una solución de procesamiento que contenía
2-mercaptoetanol y el producto fue sometido a
SDS-PAGE (del 2 al 15%) para su separación y
transferido luego a una membrana de PVDF, seguido por la tinción de
las proteínas con CBB. Se observaron dos bandas teñidas en las
proximidades de 60 kDa y 30 kDa.
Las proteínas que mostraban las bandas próximas
a 60 kDa y 30 kDa fueron analizadas en términos de la secuencia de
aminoácidos del extremo N. Se encontró que la secuencia de
aminoácidos del extremo N de la proteína de la banda próxima a 60
kDa coincidía con la secuencia de aminoácidos del extremo N de la
albúmina humana. Se encontró que la secuencia de aminoácidos del
extremo N de la proteína de la banda próxima a 30 kDa coincidía con
una porción de la secuencia de aminoácidos de la adiponectina que
comienza en el residuo de aminoácido 19º.
De los resultados anteriormente descritos, se
encontró que la proteína correspondiente a la banda próxima a 90
kDa, que es detectada cuando la LMW-Ad es sometida a
SDS-PAGE (del 2 al 15%), era un heterodímero formado
a través de enlaces disulfuro del monómero albúmina y del monómero
adiponectina. Por consiguiente, se encontró que la adiponectina
contenida en la fracción de LMW-Ad tenía una
estructura en la cual un trímero de adiponectina y albúmina estaban
unidos mediante un enlace disulfuro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó de nuevo mAd purificado de acuerdo
con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 3, se
desmineralizó mediante diálisis con tampón fosfato 20 mM (pH 7,0),
se adsorbió sobre una columna de
Gelatina-Cellulofine (Seikagaku Corporation) y
posteriormente se eluyó de manera seriada con tampones fosfato 20 mM
(pH 7,0) que contenían 0, 100, 200, y 500 mM de NaCl. Se encontró
que la fracción resultante eluida con NaCl 100 mM contenía
ULMW-Ad, LMW-Ad y
MMW-Ad, y se encontró que la fracción eluida con
NaCl 200 mM contenía MMW-Ad y
HMW-Ad. Sin embargo se encontró que la fracción
eluida con NaCl 500 mM contenía únicamente HMW-Ad.
Por tanto, la fracción del eluato con NaCl 500 mM fue empleada en
la etapa siguiente como el producto HMW-Ad separado
y purificado. Posteriormente, se preparó una resina de Sepharosa 4B
que se unía a un anticuerpo \alpha ALB humana de cabra de acuerdo
con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 3 anterior, y la
fracción eluida con NaCl 100 mM fue aplicada a la resina, para
obtener así una fracción no adsorbida y una fracción adsorbida. Se
encontró que la fracción no adsorbida contenía
ULMW-Ad y MMW-Ad, pero se encontró
que la fracción adsorbida contenía únicamente
LMW-Ad. Por tanto, la fracción adsorbida fue
empleada en la etapa siguiente como fracción LMW-Ad.
A continuación la fracción no adsorbida fue concentrada y sometida
posteriormente a cromatografía de filtración en gel utilizando
Sephacryl S-300 (peso molecular fraccionado: 10 a
1.500 kDa; tamaño medio de partícula: 47 \mum; Amersham
Bioscience), para separar de este modo ULMW-Ad y
MMW-Ad entre sí. Las fracciones resultantes fueron
empleadas en la etapa siguiente como el producto
ULMW-Ad separado y purificado y como el producto
MMW-Ad separado y purificado, respectivamente.
La separación y la purificación de este ejemplo
se llevaron a cabo sobre la base de la información obtenida en la
separación y la purificación del Ejemplo 1, aunque las condiciones
de separación y purificación fueron modificadas. Como resultado, en
este método se aisló un nuevo tipo de adiponectina (referido de aquí
en adelante como ULMW-Ad) además de los tres tipos
anteriores LMW-Ad, MMW-Ad y
HMW-Ad.
Los cuatro tipos de productos multímeros de
adiponectina separados y purificados, a saber
ULMW-Ad, LMW-Ad,
MMW-Ad y HMW-Ad, fueron separados
entre sí mediante PAGE (del 2 al 15%) bajo condiciones no
desnaturalizantes, seguido por la tinción de proteínas con CBB. La
Fig. 6 muestra los resultados de la tinción de las proteínas
sometidas a electroforesis.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada uno de los productos multímeros de
adiponectina separados y purificados obtenidos en el Ejemplo 3, fue
sometido a SDS-PAGE (del 2 al 15%) bajo condiciones
no reductoras para su separación y posteriormente a tinción de las
proteínas con CBB. La Fig. 7 muestra los resultados de la tinción de
las proteínas sometidas a electroforesis.
En cada uno de ULMW-Ad,
LMW-Ad, MMW-Ad y
HMW-Ad, se observaba una banda teñida clara en las
proximidades de 60 kDa. Se dedujo que la banda teñida era un dímero
de adiponectina sobre la base de la estructura descrita y del peso
molecular de la adiponectina. En LMW-Ad, además de
la banda próxima a 60 kDa, se observaba una banda teñida clara, no
identificada, en las proximidades de 90 kDa. En el caso de
ULMW-Ad, como se observaba una banda teñida
atribuida a un monómero además de la banda teñida atribuida a un
dímero, se dedujo que ULMW-Ad era un trímero. En La
Fig. 7, se observan dos bandas teñidas atribuidas a
LMW-Ad. Separadamente, se confirmó que las dos
bandas correspondían a adiponectina que se unía a albúmina.
Cada uno de los productos multímeros de
adiponectina separados y purificados obtenidos en el Ejemplo 3 fue
diluido en tampón fosfato 100 mM (pH 8,0) hasta una concentración de
5 aproximadamente a 10 \mug/ml aproximadamente. Un agente de
entrecruzamiento, bis(sulfosuccinimidil)suberato
(marca registrada BS^{3}: producto de PIERCE), fue diluido con
agua purificada hasta 20 mg/ml. Se mezclaron cantidades iguales del
producto diluido y del agente de entrecruzamiento diluido y se
dejaron reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, se añadió a la mezcla la misma cantidad de tampón
Tris-HCl 100 mM (pH 8,0) y la mezcla resultante se
dejó reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente. El líquido
resultante fue sometido a SDS-PAGE (del 2 al 15%)
bajo condiciones no reductoras para llevar a cabo la separación, se
transfirió a una membrana de PVDF mediante transferencia semiseca y
a continuación se inmunotiñó. Específicamente, la membrana de
transferencia fue bloqueada con PBS que contenía un 5% de leche
descremada y un 0,1% de NaN_{3}, lavada con PBS que contenía un
0,1% de Tween 20 y posteriormente se hizo reaccionar con un
anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana (hu
Acrp30-MoAb) (1 \mug/ml) durante 1 hora a
temperatura ambiente. La membrana fue lavada exhaustivamente con
PBS que contenía un 0,1% de Tween 20 y se permitió la producción de
color mediante la utilización de un kit Vector ABC (Ratón) y un kit
de sustrato DAB.
Los resultados están mostrados en la Fig. 8. La
calibración del peso molecular se llevó a cabo mediante la
utilización de un marcador de peso molecular.
ULMW-Ad proporciona una banda teñida próxima a 100
kDa aproximadamente y se identificó como un trímero sobre la base
de la estructura y del peso molecular de la adiponectina previamente
descritos. LMW-Ad proporciona una banda teñida
próxima a 150 kDa aproximadamente y se identificó como un trímero
que se unía a albúmina similar al obtenido anteriormente, sobre la
base del peso molecular. MMW-Ad proporciona una
banda teñida próxima a 250 kDa y se dedujo que era un hexámero o un
nanómero. HMW-Ad proporciona una banda teñida a un
peso molecular considerablemente elevado, y se dedujo que tenía un
peso molecular muy alto, al menos 300 kDa o superior, y que era un
12-mero o un 18-mero
aproximadamente. Sin embargo, la forma exacta de la
HMW-Ad permanece sin identificar.
Muestras de suero (0,2 \mul) obtenidas de ocho
sujetos sanos fueron sometidas a PAGE (del 2 al 15%) para la
separación, transferidas a una membrana de PVDF mediante
transferencia semiseca y posteriormente inmunoteñidas.
Específicamente, la membrana de transferencia fue bloqueada con PBS
(pH 7,4) que contenía un 5% de leche descremada y un 0,1% de
NaN_{3}, lavada con PBS (pH 7,4) que contenía un 0,1% de Tween 20
y posteriormente se hizo reaccionar durante 1 hora a temperatura
ambiente con un anticuerpo monoclonal
anti-adiponectina (hu Acrp30-MoAb;
Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., BD Transduction Laboratories) (1
\mug/ml). La membrana fue lavada exhaustivamente con PBS (pH 7,4)
que contenía un 0,1% de Tween 20 y se permitió la producción de
color mediante la utilización de un kit Vector ABC (Ratón) y un kit
de sustrato DAB (Funakoshi Co., Ltd.).
Como resultado, las bandas principales fueron
observadas en posiciones similares a las de las fracciones
LMW-Ad, MMW-Ad y
HMW-Ad preparadas en el Ejemplo 1, revelando que la
sangre contiene predominantemente estos tres tipos de adiponectina
(Fig. 4). ULMW-Ad no proporciona sustancialmente
ninguna banda teñida. Aunque la razón de este hecho no ha sido
todavía clarificada, se postula que la cantidad de
ULMW-Ad presente en la sangre es pequeña (Fig.
4).
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyó un anticuerpo policlonal
anti-adiponectina humana producido en cabra
(anticuerpo \alpha Acrp30 humana de cabra) con solución de
sensibilización de anticuerpos para ELISA hasta 1 \mug/ml y se
sensibilizó una placa de ELISA con el producto diluido. La placa
fue bloqueada con tampón de ELISA. La LMW-Ad
preparada en el Ejemplo 1 fue diluida con tampón de ELISA hasta 1,
0,1 y 0,01 \mug/ml (contenido de Ad) y posteriormente se hizo
reaccionar con la placa de ELISA durante una 1 hora a temperatura
ambiente. La placa fue lavada con tampón de ELISA. Un anticuerpo
monoclonal anti-albúmina humana líquido (Solicitud
de Patente Japonesa Dejada Abierta (kokai) Nº
2001-337092), que había sido diluido 2.000 veces con
tampón de ELISA, se hizo reaccionar con la placa de ELISA durante 1
hora a temperatura ambiente. La placa fue lavada con tampón de
ELISA. Un anticuerpo anti-IgG de ratón producido en
cabra (\alpha ratón de cabra) líquido marcado con HRP, que había
sido diluido 1.000 veces con tampón de ELISA, se hizo reaccionar
con la placa durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa fue
lavada con tampón de ELISA. Se hizo que la HRP produjera color
mediante una reacción enzimática con sustratos; esto es, TMB
(tetrametilbencidina) y peróxido de hidrógeno. Se añadió a la mezcla
de reacción ácido sulfúrico 2 N para parar la reacción. Se midió la
absorbancia a 450 nm. Los resultados de las medidas están mostrados
en la Fig. 5.
Se observó un incremento de la absorbancia
dependiente de la concentración, lo cual indica que el inmunoensayo
de sándwich estaba justificado. Por tanto, se confirma que la
LMW-Ad es adiponectina que se une a la albúmina
(adiponectina de unión a albúmina). Además, se encontró que el
método del presente ejemplo permitía el análisis selectivo de
LMW-Ad.
\vskip1.000000\baselineskip
Una placa de ELISA fue sensibilizada con un
anticuerpo monoclonal anti-adiponectina (64402) que
había sido diluido con solución de sensibilización de anticuerpos
para el ELISA hasta 5 \mug/ml. Posteriormente, la placa fue
bloqueada con tampón de ELISA que contenía un 20% de suero de cabra.
El producto LMW-Ad purificado preparado en el
Ejemplo 3 fue diluido con tampón de ELISA hasta una concentración de
0 a 20 ng/ml (contenido de Ad) y posteriormente se hizo reaccionar
con la placa durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa fue
lavada con líquido de lavado para el ELISA y posteriormente se hizo
reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo
anti-albúmina humana producido en cabra marcado con
HRP (HRP-Gt anti-HSA) que había
sido diluido 1.000 veces con tampón de ELISA. La placa fue lavada
con líquido de lavado para ELISA y posteriormente se produjo color
con el líquido para la producción de color OPD (tampón citrato 250
mM que contenía 2 mg/ml de clorhidrato de ortofeniléndiamina y un
0,02% de peróxido de hidrógeno, pH 5,0). A la placa se añadió un
líquido de parada (ácido sulfúrico 1,5 N, EDTA-2Na 1
mM) con el fin de parar la reacción y se midió la absorbancia a 492
nm. Los resultados del ensayo están mostrados en la Fig. 9.
Se observó un incremento de la absorbancia
dependiente de la concentración, lo cual indica que el inmunoensayo
de sándwich estaba justificado. Por tanto, se confirma que la
LMW-Ad es adiponectina que se une a la albúmina
(adiponectina de unión a albúmina).
Se diluyó suero humano de 100 a 800 veces con
tampón de ELISA 2 y el producto LMW-Ad purificado
preparado en el Ejemplo 3 (de 0 a 50 ng/ml) fue añadido al producto
diluido. La mezcla fue analizada con un sistema de ELISA similar al
de (1) y se determinó el porcentaje de recuperación sobre la base de
la cantidad añadida y la cantidad medida. Los resultados están
mostrados en la Tabla 1.
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\vskip1.000000\baselineskip
En todos los casos, se obtuvo un buen porcentaje
de recuperación, revelando que el presente ejemplo permite el
análisis selectivo de LMW-Ad.
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El mAd preparado en el Ejemplo de Referencia 3 y
cada proteasa disponible comercialmente fueron añadidas a tampón
fosfato 50 mM (pH 8,0) y la mezcla fue calentada durante 60 minutos
a 37ºC. El líquido de procesamiento fue sometido a PAGE (del 2 al
15%) para la separación y teñido con CBB. Así, la acción de cada
proteasa sobre cada una de las fracciones fue comparada con la del
control al cual no se había añadido proteasa (Tabla 2).
Mediante el procesamiento con proteasa bajo
cualquiera de las condiciones 1 y 2, la fracción correspondiente a
LMW-Ad desaparecía, mientras que
MMW-Ad y HMW-Ad continuaban estando
presentes. No se observó ningún producto convertido obvio. Mediante
el procesamiento con proteasa bajo cualquiera de las condiciones 3 y
4, no se observó LMW-Ad, mientras que
MMW-Ad y HMW-Ad estaban presentes.
En este caso, se observaba una nueva banda teñida atribuida a un
producto convertido derivado de LMW-Ad en una región
de bajo peso molecular. Mediante el procesamiento con proteasa bajo
cualquiera de las condiciones 5 y 6, LMW-Ad y
MMW-Ad desaparecían, mientras que
HMW-Ad continuaba estando presente. En este caso,
se observó en una región de bajo peso molecular una nueva banda
teñida atribuida a un producto convertido derivado de
LMW-Ad. Las regiones en las cuales se detectaron
mediante PAGE (del 2 al 15%) estos productos convertidos estaban
dentro del rango de 30-42 kDa; los valores exactos
pueden variar dependiendo del tipo de proteasa. Estos resultados
indican que la cantidad total de MMW-Ad y
HMW-Ad puede ser determinada mediante el
procesamiento bajo las condiciones 1 ó 2; la cantidad de únicamente
LMW-Ad o la cantidad total de
MMW-Ad y HMW-Ad pueden ser
determinadas mediante el procesamiento bajo las condiciones 3 ó 4;
y la cantidad de únicamente HMW-Ad o la cantidad
total de MMW-Ad y HMW-Ad pueden ser
determinadas mediante el procesamiento bajo las condiciones 5 ó
6.
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El mAd purificado analizado en el Ejemplo 3 y
cada proteasa disponible comercialmente (1 mg/ml) fueron añadidos a
tampón fosfato 50 mM (pH 8,0) y la mezcla resultante fue calentada
durante 30 minutos a 37ºC. El líquido de procesamiento fue sometido
a PAGE (del 2 al 15%) para la separación y teñido con CBB. Así, la
acción de cada proteasa sobre cada una de las fracciones fue
comparada con la del control al cual no se había añadido
proteasa
(Tabla 3).
(Tabla 3).
Mediante el procesamiento con proteasa bajo
cualquiera de las condiciones 7 a 9, ULMW-Ad y
LMW-Ad desaparecían, mientras que
MMW-Ad y HMW-Ad continuaban estando
presentes. En este caso, se observaron nuevas bandas teñidas
atribuidas a productos convertidos derivados de
ULMW-Ad y LMW-Ad en regiones de bajo
peso molecular. Mediante el procesamiento con proteasa bajo
cualquiera de las condiciones 10 a 12, ULMW-Ad,
LMHW-Ad y MMW-Ad desaparecían y
HMW-Ad continuaba estando presente. En este caso, se
observaron nuevas bandas teñidas en regiones de bajo peso molecular
atribuidas a productos convertidos derivados de
ULMW-Ad, LMW-Ad y
MMW-Ad. Las regiones en las cuales se detectaron
estos productos convertidos mediante PAGE (del 2 al 15%) estaban
dentro del rango de 30-40 kDa aproximadamente; los
valores exactos pueden variar dependiendo del tipo de proteasa.
Estos resultados indican que la cantidad total de
ULMW-Ad y LMW-Ad puede ser
determinada mediante el análisis selectivo con la utilización de
cualquiera de las proteasas empleadas en las condiciones de
procesamiento 7 a 9, y mediante la medida de la cantidad total de
MMW-Ad y HMW-Ad que permanecen o de
la cantidad de los nuevos productos convertidos de Ad. Además, la
cantidad de HMW-Ad que permanece o la cantidad total
de ULMW-Ad, LMW-Ad y
MMW-Ad puede ser determinada mediante el análisis
selectivo con la utilización de cualquiera de las proteasas
empleadas en las condiciones de procesamiento 10 a 12.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada uno de los productos multímeros de
adiponectina separados y purificados obtenidos en el Ejemplo 3 fue
añadido a la fracción que no era adsorbida por la resina de unión a
anticuerpos obtenida en el Ejemplo de Referencia 3 (referida de
aquí en adelante como "plasma en el que se había eliminado la
Ad") a una concentración final de alrededor de 10 \mug/ml, y
la mezcla resultante fue empleada como muestra para investigación.
Se disolvió Proteinasa K en tampón Tris-HCl 50 mM
(pH 8,0) para preparar una solución de 5-10
\mug/ml, y la solución fue empleada como solución enzimática de
pretratamiento. La solución enzimática de pretratamiento (90
\mul) fue añadida a cada una de las muestras (10 \mul) y la
mezcla se hizo reaccionar a 37ºC durante periodos predeterminados
que variaban de 10 a 30 minutos. Se añadió tampón citrato 100 mM (pH
3,0, conteniendo un 2% de SDS) (400 \mul) a cada una de las
mezclas de reacción resultantes con el fin de parar la reacción
enzimática (pretratamiento). La mezcla de reacción (20 \mul) fue
diluida con tampón de ELISA 2 (1,0 ml) y la mezcla resultante fue
empleada como muestra pretratada. La cantidad de adiponectina que
permanecía en la muestra pretratada fue determinada mediante la
utilización del sistema de ELISA para la medida de adiponectina que
será descrito más adelante.
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De manera similar a la empleada en el Ejemplo
10, cada uno de los productos multímeros de adiponectina separados
y purificados obtenidos en el Ejemplo 3 fue añadido a plasma en el
que se había eliminado la Ad a una concentración final de 10
\mug/ml aproximadamente, y la mezcla resultante fue empleada como
muestra para investigación. Se disolvió Proteasa A "Amano" en
tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) para preparar una
solución 0,6-1,0 mg/ml, y la solución fue empleada
como solución enzimática de pretratamiento. La solución enzimática
de pretratamiento
(90 \mul) fue añadida a cada una de las muestras (10 \mul) y la mezcla se hizo reaccionar a 37ºC durante periodos predeterminados que variaban de 10 a 30 minutos. Se añadió tampón citrato 100 mM (pH 3,0, conteniendo un 2% de SDS) (400 \mul) a cada una de las mezclas de reacción resultantes para parar la reacción enzimática (pretratamiento). La mezcla de reacción (20 \mul) fue diluida con tampón de ELISA 2 (1,0 ml) y la mezcla fue empleada como muestra pretratada. La cantidad de adiponectina que permanecía en la muestra pretratada fue determinada mediante la utilización del sistema de ELISA para la medida de adiponectina que será descrito más adelante.
(90 \mul) fue añadida a cada una de las muestras (10 \mul) y la mezcla se hizo reaccionar a 37ºC durante periodos predeterminados que variaban de 10 a 30 minutos. Se añadió tampón citrato 100 mM (pH 3,0, conteniendo un 2% de SDS) (400 \mul) a cada una de las mezclas de reacción resultantes para parar la reacción enzimática (pretratamiento). La mezcla de reacción (20 \mul) fue diluida con tampón de ELISA 2 (1,0 ml) y la mezcla fue empleada como muestra pretratada. La cantidad de adiponectina que permanecía en la muestra pretratada fue determinada mediante la utilización del sistema de ELISA para la medida de adiponectina que será descrito más adelante.
Los presentes inventores han desarrollado un
método (Solicitud Internacional que reivindica prioridad de la
Solicitud de Patente Japonesa Nº 2003-354715), en el
cual al menos uno de un agente reductor, un ácido o una sal del
mismo, un surfactante y una proteasa es añadido a una muestra
biológica para su reacción con adiponectina, mediante lo cual se
forman multímeros de adiponectina en una forma específica para
inmunoensayo. En el presente ejemplo, se emplearon un ácido y un
surfactante en el pretratamiento. Específicamente, se añadió tampón
citrato 100 mM (pH 3,0, conteniendo un 2% de SDS) (490 \mul) a
plasma humano o a suero humano (10 \mul) y la mezcla se agitó
exhaustivamente. La mezcla de reacción (20 \mul) fue diluida con
tampón de ELISA 2 (1,0 ml) y la mezcla fue empleada como muestra
pretratada. La cantidad de adiponectina que permanecía en la muestra
pretratada fue determinada mediante la utilización del sistema de
ELISA para la medida de adiponectina que será descrito a
continuación.
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Una placa de ELISA fue sensibilizada con un
anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana
(64405) que había sido diluido con PBS hasta 5 \mug/ml. La placa
fue bloqueada con tampón de ELISA 2. Cada una de las muestras
pretratadas preparadas en los Ejemplos 10 y 11 fue añadida a, y se
hizo reaccionar con, la placa durante 1 hora a temperatura
ambiente. La placa fue lavada con líquido de lavado para ELISA. Un
anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana
marcado con biotina (64404) que había sido diluido 2.000 veces con
tampón de ELISA 2 se hizo reaccionar con la placa durante 1 hora a
temperatura ambiente. HRP-avidina, que había sido
diluida 2.000 veces con tampón de ELISA 2, fue añadida a, y se hizo
reaccionar con, la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente.
La placa fue lavada con líquido de lavado para ELISA. Se produjo
color con un líquido para la producción de color OPD (tampón
citrato 250 mM que contenía 2 mg/ml de clorhidrato
ortofeniléndiamina y un 0,02% de peróxido de hidrógeno, pH 5,0). Se
añadió a la placa una solución de parada (ácido sulfúrico 1,5 N,
EDTA-2Na 1 mM) con el fin de parar la reacción y se
midió la absorbancia a 492 nm. Separadamente, se preparó una muestra
estándar. Específicamente, la solución enzimática de pretratamiento
(90 \mul) y tampón citrato 100 mM (pH 3,0, conteniendo un 2% de
SDS) (400 \mul) fueron mezclados y se añadió a la mezcla cada una
de las muestras (10 \mul). La muestra estándar fue también medida
mediante ELISA de manera similar a la descrita anteriormente, y el
valor de la producción de color de la muestra estándar fue definido
como el 100%. El valor de la medida obtenido de cada una de las
muestras preparadas en los Ejemplos 10 y 11 fue convertido en %. En
cada caso, se calculó el valor medio de los valores de los
porcentajes de la producción de color obtenidos. Los resultados
obtenidos con las muestras preparadas en los Ejemplos 10 y 11 están
mostrados en las Figs. 10 y 11, respectivamente.
Como es obvio a partir de los resultados
mostrados en la Fig. 10, mediante el procesamiento con proteasa
(Proteinasa K), los multímeros de Ad distintos de
HMW-Ad contenidos en el plasma son digeridos, y
puede realizarse un ensayo dirigido específicamente a
HMW-Ad. Los resultados mostrados en la Fig. 11
indican que, mediante el procesamiento con proteasa (Proteasa A
"Amano"), los multímeros de Ad distintos de
MMW-Ad y HMW-Ad contenidos en el
plasma son digeridos, por lo que la cantidad total de
MMW-Ad y HMW-Ad puede ser
determinada de una manera dirigida específicamente a
MMW-Ad y HMW-Ad. La cantidad de
MMW-Ad puede ser calculada restando la cantidad de
HMW-Ad de la cantidad total de
MMW-Ad y HMW-Ad.
Como es obvio a partir de los resultados
anteriormente descritos, la cantidad de ULMW-Ad
presente en una muestra puede ser calculada de la manera siguiente:
la muestra es pretratada de manera similar a la descrita en el
Ejemplo 12, se determina la cantidad total de adiponectina contenida
en la muestra resultante, se determina la cantidad de
LMW-Ad de manera similar a la descrita en el Ejemplo
6 ó 7, se determina la cantidad total de MMW-Ad y
HMW-Ad de manera similar a la descrita en los
Ejemplos 11 y 13, y se restan la cantidad de LMW-Ad
y la cantidad total de MMW-Ad y
HMW-Ad de la cantidad total de adiponectina. Por
tanto, los cuatro tipos de multímeros de Ad presentes en la sangre
humana pueden ser analizados selectivamente, y puede determinarse
la cantidad total de estos cuatro tipos de adiponectina.
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Se dividieron en dos grupos 298 pacientes que
padecían diabetes de tipo II pero que no habían recibido tratamiento
con insulina, concretamente un grupo con enfermedad de las arterias
coronarias (CAD) (90 pacientes que tenían una lesión orgánica
detectada mediante angiografía coronaria (CAG)) y un grupo que no
tenía enfermedad de las arterias coronarias (NCAD) (el resto, 208
pacientes). De manera similar a la descrita en los ejemplos
anteriores, se determinó el contenido de adiponectina total (T.Ad) y
se analizó cada uno de los multímeros de adiponectina de manera
selectiva. Específicamente, el contenido de T.Ad fue determinado
mediante los métodos descritos en los Ejemplos 12 y 13; el
contenido de HMW-Ad fue determinado mediante los
métodos descritos en los Ejemplos 10 y 13; y el contenido de
MMW-Ad fue calculado restando el contenido de
HMW-Ad de la cantidad total de
MMW-Ad y HMW-Ad determinada mediante
el método descrito en los Ejemplos 11 y 13. La cantidad total de
ULMW-Ad y LMW-Ad se calculó restando
la cantidad total de MMW-Ad y HMW-Ad
del contenido de T.Ad. Las cantidades obtenidas de los multímeros
fueron comparadas mediante el test t con el fin de determinar si
existía o no una diferencia significativa entre el grupo CAD y el
grupo NCAD.
Los resultados están mostrados en la Tabla 4. No
se observó diferencia significativa entre el grupo CAD y el grupo
NCAD en cuanto al contenido de T.Ad, pero se observó una diferencia
significativa en el contenido de HMW-Ad
(p<0,05). En la relación (%) del contenido de
HMW-Ad respecto al contenido de T.Ad, se observó
una diferencia significativa obvia (p<0,0001). Los resultados
revelan que, el contenido de HMW-Ad, especialmente
la relación (%) del contenido de HMW-Ad respecto al
contenido de T.Ad, puede servir como un indicador de CAD más
preciso que el contenido de T.Ad.
Los 298 pacientes empleados en el Ejemplo 14
fueron divididos en cuatro grupos sobre la base del contenido total
de adiponectina (T.Ad) y la relación del contenido de
HMW-Ad respecto al contenido de T.Ad; esto es,
HMW-Ad/T.Ad x 100% (HMW-R), mediante
la utilización de los criterios siguientes. En primer lugar, se
calculó que los valores medios de T.Ad y HMW-R eran
9,8 \mug/ml y 32%, respectivamente. Los pacientes que presentaban
valores de T.Ad y HMW-R que eran menores que los
valores medios respectivos fueron clasificados como pertenecientes
al Grupo A; los pacientes que presentaban valores de T.Ad que eran
menores que el valor medio y que presentaban valores de
HMW-R que eran iguales o mayores que el valor medio
fueron clasificados como pertenecientes al Grupo B; los pacientes
que presentaban valores de T.Ad que eran iguales o mayores que el
valor medio y que presentaban valores de HMW-R que
eran menores que el valor medio, fueron clasificados como
pertenecientes al Grupo C; y los pacientes que presentaban valores
de T.Ad y HMW-R que eran iguales o mayores que los
valores medios respectivos fueron clasificados como pertenecientes
al Grupo D. Además, los pacientes de cada grupo fueron divididos en
dos grupos en vista de los criterios de diagnóstico del síndrome
metabólico (JAMA, 285:2486, 2001) del US Adult Treatment Panel III
(ATPIII); esto es, un primer grupo formado por pacientes que
presentaban, en cualquiera de dos o más de los cinco factores de
riesgo, niveles de factores de riesgo que eran mayores que los
criterios respectivos; y un segundo grupo formado por pacientes que
presentaban, en menos de dos factores de riesgo, niveles de
factores de riesgo que eran mayores que los criterios respectivos.
Normalmente, de acuerdo con los criterios de diagnóstico del
ATPIII, un paciente que tenga, en cualquiera de tres o más factores
de riesgo, niveles de factores de riesgo mayores que los criterios
respectivos se define como un paciente que padece síndrome
metabólico. Sin embargo, en el presente ejemplo, se empleó un
criterio más severo. Los resultados están mostrados en la Tabla
5.
El test de Kruskal-Wallis reveló
que el número de factores para el criterio de diagnóstico del
síndrome metabólico tiene una correlación estadísticamente
significativa con los valores de T.Ad y HMW-R (valor
de p = 0,001). En los grupos A y C, que constaban de pacientes que
presentaban valores de HMW-R que eran menores que el
valor medio, la proporción de pacientes clasificados dentro del
grupo que presentaba dos o más elementos de criterio para el
diagnóstico del síndrome metabólico era mayor. Los resultados
indican que, en comparación con el valor de T.Ad, el valor de
HMW-R puede servir como un buen indicador del
síndrome metabólico. Esto es, los presentes inventores han
encontrado por vez primera que la medida del valor de
HMW-R y la utilización del valor de
HMW-R como índice del síndrome metabólico son
eficaces para la prevención o el pronóstico del síndrome
metabólico.
Como está claro a partir de la descripción
anterior, incluso cuando la utilización del contenido total de
adiponectina como índice de una enfermedad o de una condición
patológica no es suficiente para la evaluación de la enfermedad o
de la condición patológica, el análisis de un cierto tipo de
multímeros de Ad o de la relación de la cantidad de una cierta
fracción multimérica de Ad respecto a la cantidad total de
adiponectina, permite el pronóstico y la prevención de la
enfermedad o la evaluación de la condición patológica.
Claims (13)
1. Un método para cuantificar selectivamente
HMW-Ad como multímero de adiponectina diana en una
muestra biológica, que comprende las etapas de:
- (a)
- la reacción de la muestra que contiene adiponectina con al menos una proteasa que puede estar modificada químicamente para digerir selectivamente una adiponectina distinta de la HMW-Ad de la muestra, donde la al menos una proteasa es seleccionada del grupo que consta de Proteinasa K derivada del género Tritirachium; Proteasa P "Amano" derivada del género Aspergillus; Umamizyme derivada del género Aspergillus; y Proteasa N "Amano" derivada del género Bacillus;
- (b)
- la cuantificación inmunológica de la HMW-Ad mediante la utilización de un anticuerpo anti-adiponectina.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la al menos una proteasa es capaz de digerir
ULMW-Ad, LMW-Ad y
MMW-Ad hasta un nivel indetectable mediante
separación por PAGE (del 2 al 15%), y no es capaz de digerir
HMW-Ad hasta un nivel indetectable mediante
separación por PAGE (del 2 al 15%), cuando tal proteasa es añadida
a una solución tampón fosfato 50 mM con un pH de 8,0 que contiene
multímeros de adiponectina, seguido por incubación durante 60
minutos a 37ºC.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la proteasa es Proteinasa K.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la etapa de digestión se lleva a cabo a una temperatura de
4ºC a 60ºC.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la etapa de digestión se lleva a cabo durante un periodo
de 5 minutos a 24 horas.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la HMW-Ad es cuantificada
inmunológicamente mediante un ELISA de sándwich.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6,
en el que el ELISA de sándwich comprende:
- (i)
- el pretratamiento de la muestra con una proteasa que sea capaz de digerir ULMW-Ad, LMW-Ad y MMW-Ad hasta un nivel indetectable mediante separación por PAGE (del 2 al 15%), pero que no sea capaz de digerir HMW-Ad hasta un nivel indetectable mediante separación por PAGE (del 2 al 15%);
- (ii)
- la adición de la muestra pretratada a una placa revestida con un anticuerpo monoclonal anti-Ad y la incubación a temperatura ambiente;
- (iii)
- la adición de una solución de anticuerpo marcado con biotina y la incubación a temperatura ambiente;
- (iv)
- la adición de una solución de estreptavidina marcada con HRP y la incubación a temperatura ambiente;
- (v)
- la adición de una solución de sustrato y la incubación a temperatura ambiente;
- (vi)
- la adición de una solución de parada y
- (vii)
- la medida de la absorbancia.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la muestra biológica se obtiene de
un humano.
9. Un método para evaluar una enfermedad o una
condición patológica de un humano que es seleccionada de diabetes
de tipo II, enfermedad arterioesclerótica, enfermedad renal,
enfermedad hepática, obesidad y síndrome metabólico, que se
caracteriza porque comprende:
- (a)
- la cuantificación selectiva de la HMW-Ad derivada de sangre humana por diferenciación de las otras adiponectinas y el inmunoanálisis del(los) multímero(s) HMW-Ad mediante la utilización de
- -
- una proteasa que puede estar modificada químicamente para que digiera selectivamente una adiponectina distinta de HMW-Ad de la muestra, donde la proteasa es seleccionada del grupo que consta de Proteinasa K derivada del género Tritirachium; Proteasa P "Amano" derivada del género Aspergillus; Umamizyme derivada del género Aspergillus; y Proteasa N "Amano" derivada del género Bacillus, y
- -
- un anticuerpo, y
- (b)
- la obtención de información acerca de la enfermedad o la condición patológica sobre la base de los resultados del ensayo selectivo.
10. El método descrito en la reivindicación 9,
en el que la evaluación se lleva a cabo sobre la base de un cambio
de la cantidad de HMW-Ad.
11. El método descrito en la reivindicación 9,
en el que la evaluación se lleva a cabo mediante el cálculo de la
relación de HMW-Ad respecto a la cantidad total de
adiponectina.
12. El método descrito en la reivindicación 9,
en el que la evaluación se lleva a cabo mediante la correlación de
un índice con la cantidad de HMW-Ad o con la
relación de HMW-Ad respecto a la cantidad total de
adiponectina.
13. Un kit de partes para llevar a cabo un
método de acuerdo con la reivindicación 1, conteniendo dicho kit de
partes:
- (a)
- una proteasa que puede estar modificada químicamente para digerir de manera selectiva una adiponectina distinta de la HMW-Ad de una muestra, donde la proteasa es seleccionada del grupo que consta de Proteinasa K derivada del género Tritirachium; Proteasa P "Amano" derivada del género Aspergillus; Umamizyme derivada del género Aspergillus; y Proteasa N "Amano" derivada del género Bacillus; y
- (b)
- un anticuerpo anti-adiponectina humana que reconoce adiponectina y que está inmovilizado sobre un soporte insoluble.
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