ES2329954T3 - Alfa-amilasas modificadas que tienen alteradas las propiedades de union al calcio. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A NUEVAS ENZIMAS DE AL - AMILASAS EN LAS QUE UN NUEVO LUGAR DE ENLACE DE CALCIO ESTA MODIFICADO POR RESIDUOS MANIPULADOS QUIMICA O GENETICAMENTE ASOCIADOS A ESTE LUGAR DE ENLACE DE CALCIO. LAS NUEVAS AL - AMILASAS TIENEN CARACTERISTICAS DE PRESTACION MODIFICADA, TALES COMO PERFILES DE ACTIVIDAD, ESTABILIDAD Y PRESTACION DE HIDROLISIS DE ALMIDON CON PH REDUCIDO.
Description
\alpha-amilasas modificadas
que tienen alteradas las propiedades de unión al calcio.
La presente invención se refiere a
\alpha-amilasas que tienen alteradas las
propiedades de unión al calcio. Particularmente, la presente
invención se refiere a nuevas enzimas
\alpha-amilasas que tienen modificaciones en las
mismas, por ejemplo mutaciones puntuales, que están destinadas a
alterar la unión del calcio en un sitio de unión al calcio
previamente desconocido en la molécula. Alterando las propiedades de
unión al calcio en este sitio adicional, es posible mejorar la
estabilidad de la \alpha-amilasa modificada.
Las \alpha-amilasas
(\alpha-1,4-glucan-4-glucanohidrolasa,
EC 3.2.1.1) hidrolizan enlaces \alpha-1,4
glucosídicos internos del almidón, en gran medida de forma
aleatoria, para producir maltodextrinas de menor peso molecular. Las
\alpha-amilasas tienen un valor comercial
considerable, usándose en las etapas iniciales (licuefacción) del
procesamiento del almidón; en la producción de alcohol; como agentes
de limpieza en matrices detergentes, y en la industria textil para
el desencolado del almidón. Las \alpha-amilasas se
producen por una amplia diversidad de microorganismos que incluyen
Bacillus y Aspergillus, produciéndose las amilasas más
comerciales a partir de fuentes bacterianas tales como Bacillus
licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o
Bacillus stearothermophilus. En los últimos años, las enzimas
preferidas para uso comercial han sido las de Bacillus
licheniformis debido a su estabilidad térmica y comportamiento,
al menos a pH neutros y débilmente alcalinos.
En la patente de Estados Unidos Nº 5.322.778, se
logró la licuefacción entre pH 4,0 y 6,0 añadiendo a la suspensión
de licuefacción un antioxidante tal como bisulfito o una sal del
mismo, ácido ascórbico o una sal del mismo, ácido eritórbico o
antioxidantes fenólicos tales como hidroxianisol butilado,
hidroxitolueno butilado o \alpha-tocoferol. De
acuerdo con esta patente, debe añadirse bisulfito sódico en una
concentración superior a 5 mM.
En la patente de Estados Unidos Nº 5.180.669, se
logró la licuefacción entre un pH de 5,0 y 6,0 añadiendo ión
carbonato en exceso de la cantidad necesaria para tamponar la
solución a la suspensión de almidón molido. Debido a un efecto de
pH aumentado que se produce con la adición de ión carbonato, la
suspensión se neutraliza generalmente añadiendo una fuente de ión
hidrógeno, por ejemplo, un ácido inorgánico tal como ácido
clorhídrico o ácido sulfúrico.
En la publicación PCT Nº WO 95/10603, se
describen variantes de \alpha-amilasa que tienen
un comportamiento en el lavado de ropa o vajilla mejorado y
comprenden una mutación distinta de una sola mutación en la posición
M197 en la \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis.
En la publicación PCT Nº WO 94/02597, se
describe una \alpha-amilasa mutante que tiene una
estabilidad oxidativa mejorada en la que una o más metioninas se
reemplazan por cualquier aminoácido excepto cisteína o
metionina.
En la publicación PCT Nº WO 94/18314, se
describe una \alpha-amilasa mutante que tiene una
estabilidad oxidativa mejorada en la que uno o más restos de
metionina, triptófano, cisteína, histidina o tirosina están
sustituidos por un aminoácido no oxidable.
En la publicación PCT Nº WO 91/00353, las
características y problemas de comportamiento asociados con la
licuefacción con \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis de tipo silvestre se abordan modificando por
ingeniería genética la \alpha-amilasa para
incluir las sustituciones especificas
Ala-111-Thr,
His-133-Tyr y/o
Thr-149-lle.
Diversos investigadores han realizado estudios
que usan técnicas de ADN recombinarte para explorar qué restos son
importantes para la actividad catalítica de las amilasas y/o
explorar el efecto de la modificación de determinados aminoácidos
dentro del sitio activo de diversas amilasas y glicosilasas (Vihinen
et al., J. Biochem., vol. 107, págs. 267-272
(1990); Holm et al., Protein Engineering, vol. 3, págs.
181-191 (1990); Takase et al, Biochemica et
Biophysica Acta, vol. 1120, págs. 281-288 (1992);
Matsui et al., Febs Letters, vol. 310, págs.
216-218 (1992); Matsui et al., Biochemistry,
vol. 33, págs. 451-458 (1992); Sogaard et
al., J. Biol. Chem., vol. 268, págs. 22480-22484
(1993); Sogaard et al., Carbohydrate Polymers, vol. 21. págs.
137-146 (1993); Svensson, Plant Mol. Biol., vol. 25,
págs. 141-157 (1994); Svensson et al., J.
Biotech. vol. 29, págs. 1-37 (1993)). Los
investigadores también han estudiado qué restos son importantes para
la estabilidad térmica (Suzuki et al., J. Biol. Chem., vol.
264, págs. 18933-18938 (1989); Watanabe et
al., Eur. J. Biochem., vol. 226, págs. 277-283
(1994)); y un grupo ha usado tales métodos para introducir
mutaciones en diversos restos de histidina en una amilasa de
Bacillus licheniformis, siendo la razón que la amilasa de
Bacillus licheniformis, que se sabe que es relativamente
termoestable en comparación con otras amilasas de Bacillus
similares, tiene un exceso de histidinas y, por lo tanto, se
sugirió que remplazar una histidina podría afectar a la
termoestabilidad de la enzima. Este trabajo dio como resultado la
identificación de mutaciones estabilizantes en el resto de
histidina en la posición +133 y en el resto de alanina en la
posición +209 (Declerck et al., J. Biol. Chem., vol. 265,
págs. 15481-15488 (1990); FR 2 665
178-A1; Joyet et al., Bio/Technology, vol.
10, págs. 1579-1583 (1992)).
Se ha demostrado que las
\alpha-amilasas de diferentes organismos muestran
una estructura tridimensional similar a pesar de las diferencias
considerables en la estructura primaria. La Figura 1 ilustra la
estructura de la \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis. Aunque existirá alguna variación interespecie
entre las diversas \alpha-amilasas, se cree que
los elementos estructurales principales de la
\alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis son representativos de estructuras de
\alpha-amilasa en general (véase Brayer et
al., Protein Sci., vol. 4, págs. 1730-1742
(1995); Larson et al., J. Mol. Biol., vol. 235, págs.
1560-1584 (1994); Qian et al., J. Mol. Biol.,
vol. 231, págs. 785-799 (1993)). Por ejemplo, la
mutagénesis específica de sitio ha identificado tres carboxilatos
invariables y dos histidinas invariables (D231, E261, D328 y H104 y
H327 en la \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis), importantes para la catálisis (Svensson, Plant
Mol. Biol., vol. 25, p. 141 (1994)), y se ha propuesto un mecanismo
general (Mazuret et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., vol.
204, p. 297 (1994)). Los restos encontrados que se cree que están
implicados en la unión a calcio y cloruro se han caracterizado y se
ha descubierto que están muy conservados entre las diferentes
enzimas (véase por ejemplo, Kadziola et al., J. Mol. Biol.,
vol. 239, p. 104 (1994); Qian et al., anteriormente; Larson
et al., anteriormente; Brayer et al., anteriormente;
Machius et al., J. Mol. Biol., vol. 246, págs.
545-559 (1995); y Boel et al., Biochem., vol.
29, p. 6244 (1990)).
Además, se han encontrado homologías entre casi
todas las endo-amilasas secuenciadas hasta ahora,
que van desde plantas, mamíferos y bacterias (Nakajima et
al., Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 23, págs.
355-360 (1986); Rogers, Biochem. Biophys. Res.
Commun., vol. 128, págs. 470-476 (1985); Janecek,
Eur. J. Biochem, vol. 224, págs. 519-524 (1994)).
Existen cuatro áreas de homología particularmente elevada en
determinadas amilasas de Bacillus, como se muestra en la
Figura 5, en la que las secciones subrayadas designan las áreas de
elevada homología. También se han usado alineamientos de secuencias
para cartografiar la relación entre endoamilasas de Bacillus
(Feng et al., J. Molec. Evol., vol. 35, págs.
351-360 (1987)). Como se determinó por Holm et
al., Protein Engineering, vol. 3, nº 3, págs.
181-191 (1990) la homología de secuencia relativa
entre la amilasa de Bacillus stearothermophilus y Bacillus
licheniformis es de aproximadamente el 66% y entre amilasas de
Bacillus licheniformis y Bacillus amyloliquefaciens es
de aproximadamente el 81%. Aunque la homología de secuencia es
importante, se reconoce generalmente que la homología estructural
también es importante en la comparación de amilasas u otras
enzimas.
A pesar de las diferencias en su estructura
primaria, se han encontrado similitudes de estructura tridimensional
entre diversas \alpha-amilasas (y enzimas
amilolíticas relacionadas como ciclodextrina glicosiltransferasas y
\alpha-glucosidasas) de organismos diferentes, en
la presencia común de un barril-\alpha/\beta que
forma una parte central (dominio A), un motivo de llave griega como
un dominio C separado y al menos un dominio adicional, dominio B
(Machius et al., anteriormente). Se cree que la unión al
sustrato se localiza en una hendidura entre el
barril-\alpha/\beta y el dominio B,
comprendiendo varias cadenas \beta de longitud variable,
dependiendo de la especie (Machius et al., anteriormente).
También es común un requerimiento de calcio que se cree que
mantiene la integridad estructural. Machius describe un sitio de
unión al calcio que implica restos que corresponden a N104, D200 y
H235 procedentes de la estructura cristalina de una
\alpha-amilasa con calcio reducido de Bacillus
licheniformis. Además de la estructura para Bacillus
licheniformis, se han determinado las estructuras para
Aspergillus niger (Brady et al., Acta Crystallog. B,
vol. 47, p. 527 (1991)), páncreas de cerdo (Qian et al., J.
Mol. Biol., vol. 231, p. 758 (1993); Larson et al., J. Mol.
Biol., vol. 235, p. 1560 (1994)), y páncreas humano (Brayer et
al., Prot. Sci., vol. 4, p. 1730 (1995)).
A pesar de los avances realizados en la técnica
anterior, existe la necesidad de una
\alpha-amilasa que tenga un comportamiento
alterado, incluyendo la actividad y la estabilidad, para facilitar
su uso en la licuefacción del almidón, detergentes para lavado de
ropa y vajilla, horneado, desencolado textil y otros usos
convencionales de la amilasa. Como las amilasas disponibles en el
mercado no son aceptables en muchas condiciones debido a problemas
de estabilidad y/ o actividad, existe la necesidad de una amilasa
que tenga perfiles de comportamiento alterados, y preferiblemente
aumentados, en tales condiciones. Por ejemplo, altos niveles de
alcalinidad y oxidantes (blanqueantes) asociados con detergentes o
las condiciones extremas presentes durante la licuefacción del
almidón pueden dar como resultado tanto la desestabilización como la
ausencia de actividad de la \alpha-amilasa. Por
tanto, seria deseable que puedan lograrse características de
comportamiento alteradas tales como termoestabilidad, estabilidad a
pH, estabilidad oxidativa o estabilidad al calcio a la vez que
también se altera, mantiene o aumenta la actividad enzimática en
comparación con la enzima de tipo silvestre o precursora. De manera
similar, se sabe que muchas \alpha-amilasas
requieren la adición de ión calcio para la estabilidad. Esto es
indeseable en algunas aplicaciones debido a los costes de
procesamiento aumentados.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar una \alpha-amilasa que tenga perfiles
de comportamiento alterados, por ejemplo estabilidad al pH,
estabilidad alcalina, estabilidad oxidativa, estabilidad térmica o
actividad enzimática alteradas.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar una \alpha-amilasa que tenga
alteradas las propiedades de unión al calcio, por ejemplo, que
tenga una necesidad reducida de calcio añadido para mantener los
niveles de actividad.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar una \alpha-amilasa que tenga un
comportamiento mejorado debido una estabilidad o actividad a pH
bajo aumentada, especialmente durante la licuefacción del
almidón.
Otro objeto adicional más de la presente
invención es proporcionar una \alpha-amilasa que
tenga un comportamiento mejorado en entornos de pH o temperatura
elevados o en presencia de oxidantes o blanqueantes.
\newpage
Otro objeto adicional más de la presente
invención es proporcionar una \alpha-amilasa que
tenga un comportamiento mejorado en el desencolado u horneado
textil debido a una estabilidad o actividad alteradas.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona una \alpha-amilasa que comprende un
dominio A, un dominio C y un sitio de unión al calcio, en el que el
sitio de unión al calcio está asociado con el domino A y el dominio
C y comprende restos de ligando en el dominio A y/o en el dominio C,
en el que la \alpha-amilasa tiene una secuencia
de aminoácidos de la \alpha-amilasa madura de
Bacillus licheniformis como se muestra en la Figura 4, pero
se modifica para alterar las características del sitio de unión al
calcio y por lo tanto alterar el comportamiento de la
\alpha-amilasa sustituyendo un resto aminoacídico
en una posición correspondiente a G474.
En una realización de composición, la presente
invención comprende un ADN que codifica la
\alpha-amilasa de la invención. En una
realización de composición adicional, la presente invención
comprende un vector de expresión que incorpora un ADN que codifica
la \alpha-amilasa de acuerdo con la invención, así
como una célula hospedadora en la que se ha transformado tal ADN
y/o vector de expresión. Una realización de método comprende la
expresión de un ADN que codifica la \alpha-amilasa
de la invención o un vector de expresión que incorpora tal ADN en
una célula hospeda-
dora.
dora.
En una realización de composición adicional, la
presente invención comprende una composición de detergente de
lavado de ropa o vajilla que incorpora la
\alpha-amilasa de acuerdo con la invención. En
otra realización de la composición, la presente invención comprende
una composición desencolante textil que incorpora la
\alpha-amilasa de acuerdo con la invención. En
otra realización de composición más, la presente invención comprende
una composición de licuefacción de almidón que incorpora la
\alpha-amilasa de acuerdo con la invención. En
otra realización de composición más, la presente invención
comprende un adyuvante de horneado que comprende la
\alpha-amilasa de acuerdo con la invención.
En una realización de proceso de la presente
invención, se proporciona un método de lavado de ropa o vajilla con
una composición de detergente lavavajillas que incorpora la
\alpha-amilasa de acuerdo con la invención. En
otra realización de proceso de la presente invención, se proporciona
un método de desencolado de tejidos con una composición que
incorpora la \alpha-amilasa de acuerdo con la
invención. En otra realización de proceso más de la presente
invención, se proporciona un método de licuefacción del almidón con
una composición de licuefacción de almidón que incorpora la
\alpha-amilasa de acuerdo con la invención. En
otra realización de proceso más de la presente invención, se
proporciona un método de horneado que comprende añadir una
composición que incorpora la \alpha-amilasa de
acuerdo con la
invención.
invención.
Las \alpha-amilasas
modificadas de acuerdo con la presente invención proporcionarán
varias ventajas importantes cuando se comparan con las
\alpha-amilasas de la técnica anterior. Por
ejemplo, se encuentra una ventaja en variantes que tienen actividad
aumentada a pH bajo y elevadas temperaturas típicas de los métodos
habituales de licuefacción del almidón. Se encuentra otra ventaja
en variantes que tienen una estabilidad oxidativa y a pH elevado
aumentada que facilita su uso en detergentes. Se proporciona otra
ventaja más en variantes que tienen una estabilidad mejorada en
ausencia o baja concentración de ión calcio. Los objetos y ventajas
relacionadas de la presente invención se aclararán más en la
siguiente descripción detallada y ejemplos.
La Figura 1 ilustra la estructura de la
\alpha-amilasa de Bacillus licheniformis
mostrando el plegamiento de la cadena principal y la localización
del sitio de unión al calcio asociado con el dominio A y el dominio
B (CalA) y un segundo sitio de unión al calcio asociado con el
dominio A y el dominio C (CalB).
La Figura 2 ilustra la vista estereoscópica del
mapa de diferencia final 2fo-fc y el Fourier de
diferencia anómala Sm en el sitio de unión al calcio asociado con
el dominio A y el dominio C de \alpha-amilasa
procedente de Bacillus licheniformis.
Las Figuras 3A-C ilustran la
secuencia de ADN del gen para la \alpha-amilasa de
Bacillus licheniformis (NCIB 8061) y la secuencia de
aminoácidos deducida del producto de la traducción, como se describe
por Gray et al., J. Bacteriology, vol. 166, págs.
635-643 (1986).
La Figura 4 ilustra la secuencia de aminoácidos
de la enzima \alpha-amilasa madura de Bacillus
licheniformis.
Las Figuras 5A-B ilustran un
alineamiento de las estructuras primarias de tres
\alpha-amilasas de Bacillus. Gray et
al., J. Bacteriology, vol. 166, págs. 635-643
(1986) describen la \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis (Am-Lich); Takkinen et
al., J. Biol. Chem., vol. 258, págs. 1007-1013
(1983) describen la \alpha-amilasa de
Bacillus amyloliquefaciens (Am-Amylo)
e lhara et al., J. Biochem., vol. 98, págs.
95-103 (1985) describen la
\alpha-amilasa de Bacillus
stearothermophilus (Am-Stearo).
El término
"\alpha-amilasa" se refiere a una actividad
enzimática que escinde o hidroliza el enlace glicosídico
\alpha(1-4), por ejemplo, en polímeros de
almidón, amilopectina o amilasa. La \alpha-amilasa
como se usa en este documento incluye
\alpha-amilasas de origen natural así como
\alpha-amilasas recombinantes. Las
\alpha-amilasas de acuerdo con la presente
invención proceden de una amilasa precursora que tiene la secuencia
de aminoácidos como se muestra en la Figura. Preferiblemente, la
\alpha-amilasa precursora se produce por un
Bacillus. Más preferiblemente, la precursora se produce por
Bacillus licheniformis.
Una \alpha-amilasa
"modificada" es una \alpha-amilasa que se ha
sometido a modificación genética o química para cambiar sus
propiedades bioquímicas, estructurales o
físico-químicas. Una "modificación genética" en
\alpha-amilasa significa que se ha modificado la
secuencia de ADN que codifica una \alpha-amilasa
de origen natural o precursora para producir una secuencia de ADN
mutante que codifica la sustitución, inserción o deleción de uno o
más aminoácidos en la secuencia de \alpha-amilasa
en comparación con la \alpha-amilasa de origen
natural o una \alpha-amilasa precursora.
La expresión "vector de expresión" se
refiere a una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN
que es capaz de efectuar la expresión de dicho ADN en un hospedador
adecuado, estando generalmente unida operativamente a una secuencia
de control adecuada. Tales secuencias de control pueden incluir un
promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora
opcional para controlar tal transcripción, una secuencia que
codifica sitios de unión al ribosoma de ARNm adecuados y secuencias
que controlan la terminación de la transcripción y traducción. Un
promotor preferido es el promotor aprE de Bacillus
subtilis. El vector puede ser un plásmido, una partícula fago o
un ADN destinado a efectuar la inserción genómica, es decir, la
integración. Una vez transformado en un hospedador adecuado, el
vector puede replicarse y funcionar de forma independiente del
genoma hospedador o, en algunos casos, puede integrarse en el propio
genoma. Los términos plásmido y vector se usan a veces
indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector usada más
habitualmente en la actualidad. Sin embargo, la invención pretende
incluir otras formas de tales vectores de expresión que desempeñan
funciones equivalentes y, que son, o pasan a ser, conocidas en la
técnica, incluyendo particularmente la presentación de fagos.
Las expresiones "cepa hospedadora" o
"célula hospedadora" se refieren a un hospedador adecuado para,
por ejemplo, un vector de expresión que comprende un ADN que
codifica la \alpha-amilasa de acuerdo con la
presente invención. Las células hospedadoras útiles en la presente
invención generalmente son hospedadoras procariotas o eucariotas,
incluyendo cualquier microorganismo transformable en el que se pueda
lograr la expresión de la \alpha-amilasa de
acuerdo con la presente invención. Específicamente, son adecuadas
las cepas hospedadoras de la misma especie o género del que procede
la \alpha-amilasa, tal como una cepa de
Bacillus. Preferiblemente, se usa una cepa de
Bacillus negativa para \alpha-amilasa
(genes delecionados) y/o una cepa de Bacillus con
\alpha-amilasa y proteasa delecionadas (por
ejemplo, \DeltaamyE, \Deltaapr,
\Deltanpr). Las células hospedadoras se trasforman o se
transfectan con vectores construidos usando técnicas de ADN
recombinante. Tales células hospedadoras transformadas son capaces
de replicar vectores que codifican la
\alpha-amilasa y sus variantes (mutantes) o de
expresar la \alpha-amilasa deseada.
Los términos "licuefacción" o "licuar"
se refieren a un proceso por el cual el almidón se convierte en
dextrinas de cadena más corta y menos viscosas. Generalmente, este
proceso implica la gelatinización del almidón de manera simultánea
con o seguida de la adición de \alpha-amilasa.
La expresión "sitio de unión al calcio" se
refiere a una región dentro de la \alpha-amilasa
que es adecuada para y actúa uniendo un ión calcio en presencia de
calcio libre. Generalmente se piensa que se requiere calcio para
mantener la integridad estructural de la
\alpha-amilasa en muchas condiciones y se ha
demostrado que los restos aminoacídicos implicados en la unión al
calcio están muy conservados entre las diferentes enzimas (Machius
et al., J. Mol. Biol., vol. 246. págs.
545-559 (1995)). De acuerdo con la presente
invención, las características del sitio de unión al calcio están
alteradas en comparación con una \alpha-amilasa de
tipo silvestre o precursora para alterar el comportamiento de la
\alpha-amilasa. La alteración del sitio de unión
al calcio puede incluir disminuir o aumentar la afinidad del sitio
para unir ión calcio. Por alteración del comportamiento pretende
referirse a la estabilidad (por ejemplo, oxidativa o térmica) o a la
actividad (por ejemplo, la velocidad o eficacia con la que la
\alpha-amilasa hidroliza un sustrato de almidón)
de la enzima en sus diversas aplicaciones.
Las expresiones "restos de ligando" o
"ligando de calcio" se refieren a un resto o restos
aminoacídicos dentro de una enzima \alpha-amilasa
que forman un ligando con ión calcio unido dentro de un sitio de
unión al calcio. Con respecto al sitio de unión al calcio dentro de
la \alpha-amilasa descubierto por los
Solicitantes, se han identificado cinco ligandos aminoacídicos que
se piensa que actúan como ligandos de calcio. Los restos de ligando
de calcio comprenden restos aminoacídicos equivalentes a G300, Y302,
H406, D407 y D430 en la \alpha-amilasa de
Bacillus licheniformis. Específicamente con respecto a estos
ligandos de calcio identificados, se piensa que los oxígenos
carbonilo de G300, Y302 y H406 y las cadenas laterales de D407 y
D430 están implicados en la unión al calcio.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona una \alpha-amilasa que comprende un
dominio A, un dominio C y un sitio de unión al calcio, en la que el
sitio de unión al calcio está asociado con el dominio A y el
dominio C y comprende restos de ligando en el dominio A y/o el
dominio C, en la que la \alpha-amilasa tiene una
secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa
madura de Bacillus licheniformis como se muestra en la Figura
4, pero modificada para alterar las características del sitio de
unión al calcio y por lo tanto alterar el comportamiento de la
\alpha-amilasa sustituyendo un resto aminoacídico
en una posición que corresponde a G474.
También se proporciona una molécula de ácido
nucleico (ADN) que codifica una secuencia de aminoácidos que
comprende al menos una parte de la \alpha-amilasa
proporcionada por la presente invención, sistemas de expresión que
incorporan tal ADN incluyendo vectores y fagos, células hospedadoras
transformadas con tal ADN y cadenas antisentido de ADN
correspondientes a la molécula de ADN que codifica la secuencia de
aminoácidos. De manera similar, la presente invención incluye un
método para producir una \alpha-amilasa mediante
la expresión del ADN incorporado en un sistema de expresión que se
ha usado para transformar una célula hospedadora.
Las secuencias de ADN pueden expresarse
uniéndolas operativamente a una secuencia de control de la expresión
en un vector de expresión apropiado y empleando ese vector de
expresión para transformar un hospedador apropiado de acuerdo con
técnicas bien conocidas. En la expresión de las secuencias de ADN de
esta invención puede emplearse una amplia diversidad de
combinaciones de vectores de expresión/hospedador. Los vectores de
expresión útiles, por ejemplo, incluyen segmentos de secuencias de
ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, tales como los
diversos plásmidos y fagos conocidos útiles para este fin. Además,
en estos vectores se usa generalmente cualquiera de una amplia
diversidad de secuencias de control de la expresión. Por ejemplo,
los Solicitantes han descubierto que una secuencia de control de la
expresión preferida para transformantes de Bacillus es el
péptido señal aprE procedente de Bacillus subtilis.
Además, los sistemas de presentación en fagos son útiles para la
invención de este documento.
También son útiles en la expresión de las
secuencias de ADN de esta invención una amplia diversidad de células
hospedadoras y se contemplan en este documento. Estas hospedadoras
pueden incluir hospedadoras eucariotas y procariotas bien
conocidas, tales como cepas de E. Coli, Pseudomonas,
Bacillus, Streptomyces, diversos hongos, por ejemplo,
Trichoderma o Aspergillus, levaduras y células
animales. Preferiblemente, el hospedador expresa extracelularmente
la \alpha-amilasa de la presente invención para
facilitar la purificación y procesamiento aguas abajo. La expresión
y purificación de la \alpha-amilasa mutante de la
invención puede efectuarse a través de medios reconocidos en la
técnica para realizar tales procesos.
Las \alpha-amilasas de acuerdo
con la presente invención comprenden una secuencia de aminoácidos
que procede de la secuencia de aminoácidos de una
\alpha-amilasa precursora que tiene la secuencia
de aminoácidos de la Figura 4. Las
\alpha-amilasas precursoras incluyen
\alpha-amilasas de origen natural y
\alpha-amilasas recombinantes. La secuencia de
aminoácidos de la \alpha-amilasa mutante procede
de la secuencia de aminoácidos de la
\alpha-amilasa precursora por sustitución de uno
o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora. Tal
modificación es generalmente de la secuencia de ADN precursora que
codifica la secuencia de aminoácidos de la
\alpha-amilasa precursora en lugar de la
manipulación de la propia enzima \alpha-amilasa
precursora. En la técnica anterior se han descrito métodos para
modificar genes de \alpha-amilasa (es decir, por
mutagénesis dirigida de oligonucleótidos ) y transformar, expresar
y secretar productos enzimáticos producidos de acuerdo con el gen
mutagenizado, incluyendo la publicación PCT Nº WO95/10603 (Novo
Nordisk), publicación PCT Nº WO94/02597 (Novo Nordisk), publicación
PCT Nº WO94/18314 (Genencor International, Inc) y publicación PCT
Nº WO 91/00353 (Gist Brocades), incorporándose tales descripciones
como referencia. Los métodos adicionales adecuados para la
manipulación de la secuencia de ADN precursora incluyen métodos
descritos en este documento y en las patentes de Estados Unidos Nº
4.760.025 y 5.185.258 del mismo solicitante, incorporadas como
referencia en este documento.
A continuación se describen en términos
generales como aplicables a la mayoría de las
\alpha-amilasas los elementos estructurales
principales, incluyendo el sitio CaIB recién descubierto que se
describe en este documento, y cambios en los mismos para alterar el
comportamiento de una \alpha-amilasa. Como se
muestra en la Figura 1, se definen tres dominios principales, el
dominio A, el dominio B y el dominio C, así como dos sitios de unión
al calcio, CalA y CalB. El domino A comprende la parte central de
la molécula y se ha identificado como un barril \alpha/\beta o
TIM. El barril \alpha/\beta está constituido por una serie de
cadenas \beta paralelas que están interconectadas por
hélices-\alpha. En el extremo carboxilo de la
enzima en un lado del domino A hay una región que comprende un
barril \beta antiparalelo conocido como motivo de "llave
griega" (véase, por ejemplo Richardson et al., Advan.
Protein Chem., vol. 34, 167-339 (1981); Braden et
al., Introduction to Protein Structure, Garland Publisting
Inc., Nueva York (1981)). Este dominio se ha identificado como
domino C. En el lado opuesto del dominio A desde el dominio C (el
N-terminal) hay un dominio adicional que comprende
varias cadenas \beta de longitud variable dependiendo de las
especies, conocidas como domino B. Se ha reconocido que el dominio
B es muy variable entre las \alpha-amilasas de
especies diferentes y a menudo comprende bucles extendidos. Se cree
que la unión al sustrato se localiza en una hendidura entre el
domino A y el dominio B y que el sitio activo está adicionalmente
asociado con esta región de la molécula. El sitio de unión CalA se
localiza dentro de una hendidura separando el dominio A y el
dominio B y se piensa que proporciona estabilidad a esta región. El
sitio de unión CalB descrito en este documento se localiza en la
región en la que conectan el dominio A y el
dominio C.
dominio C.
El descubrimiento por los Solicitantes del sitio
de unión CalB en una \alpha-amilasa de
Bacillus ha permitido a los Solicitantes desarrollar una
\alpha-amilasa mutante que tiene un comportamiento
alterado, y particularmente una estabilidad alterada. Para
desarrollar adicionalmente tales mutantes, pueden aplicarse
principios generales para la estabilización de la estructura de la
proteína en la región alrededor del sitio CalB. Adicionalmente,
pueden aplicarse estrategias diseñadas específicamente para mejorar
la unión al calcio en el sitio CalB para aumentar la estabilidad de
la enzima. Preferiblemente, tales modificaciones están en un
intervalo de 15 angstroms del centro de masa del calcio unido al
sitio de unión CalB, más preferiblemente en un intervalo de 10
angstroms del centro de masa del calcio unido al sitio de unión
CalB.
En este documento se identifican restos para
deleción o sustitución en \alpha-amilasa. Por
tanto, el resto específico analizado en este documento se refiere a
un número de posición de aminoácido que hace referencia al numero
asignado en la secuencia de la \alpha-amilasa
madura de Bacillus licheniformis ilustrada en la Figura 4.
Sin embargo, la mutación de la \alpha-amilasa
madura particular de Bacillus licheniformis puede ampliarse a
las \alpha-amilasas no precursoras de Bacillus
licheniformis que contienen restos aminoacídicos en posiciones
que son equivalentes al resto particular identificado en la
\alpha-amilasa de Bacillus licheniformis.
Un resto de una \alpha-amilasa precursora es
equivalente a un resto de \alpha-amilasa de
Bacillus licheniformis si es homólogo (es decir, se
corresponde en posición para la estructura primaria o terciaria) o
análogo a un resto específico o parte de ese resto en la
\alpha-amilasa de Bacillus licheniformis
(es decir, que tiene la misma o similar capacidad funcional para
combinarse, reaccionar o interaccionar químicamente o
estructuralmente).
Para establecer la homología con la estructura
primaria, la secuencia de aminoácidos de una
\alpha-amilasa precursora se compara directamente
con la secuencia primaria de la \alpha-amilasa de
Bacillus licheniformis y particularmente con un conjunto de
restos que se sabe que son invariables en todas las
\alpha-amilasas cuyas secuencias se conocen
(véase por ejemplo, la Figura 7). También es posible determinar
restos equivalentes por análisis de la estructura terciaria de las
estructuras cristalinas descritas para la
\alpha-amilasa pancreática porcina (Buisson et
al., EMBO Journal, vol. 6, págs. 3909-3916
(1987); Qian et al., Biochemistry, vol. 33, págs.
6284-6294 (1984); Larson et al., J. Mol.
Biol., vol 235, págs., 1560-1584 (1994));
Taka-amilasa A de Aspergillus oryzae
(Matsuura et al., J. Biochem. (Tokyo), vol. 95, págs.
697-702 (1984)); y una
\alpha-amilasa ácida de A. niger (Boel
et al., Biochemistry, vol. 29 págs. 6244-6249
(1990)), siendo similares las dos estructuras anteriores, y para la
\alpha-amilasa de cebada (Vallee et al., J.
Mol. Biol., vol. 236, págs. 368-371 (1984);
Kadziola, J. Mol. Biol., vol. 239, págs. 104-121
(1994)). Aunque se han publicado algunos estudios preliminares
(Suzuki et al., J. Biochem., vol. 108, págs.
379-381 (1990); Lee et al., Arch. Biochem.
Biophys, vol. 291, págs. 255-257 (1991); Chang
et al., J. Mol. Biol., vol. 229. págs.
235-238 (1993); Mizuno et al., J. Mol. Biol.,
vol. 234, págs. 1282-1283 (1993)), sólo hay una
estructura publicada para la \alpha-amilasa de
Bacillus licheniformis (Machius et at., J. Mol. Biol. vol.
246, págs. 545-549 (1995)). Sin embargo, varios
investigadores han predicho estructuras supersecundarias comunes
entre glucanasas (MacGregor et al., Biochem. J., vol. 259,
págs. 145-152 (1989)) y dentro de
\alpha-amilasas y otras enzimas que metabolizan el
almidón (Jaspersen, J. Prot. Chem. vol. 12, págs.
791-805 (1993); MacGregor, Starke, vol. 45, págs.
232-237 (1993)); y similitudes de secuencia entre
enzimas con estructuras supersecundarias similares a las
\alpha-amilasas (Janecek, FEBS Letters, vol. 316,
págs. 23-26 (1993); Janecek et al., J. Prot.
Chem., vol. 12, págs. 509-514 (1993)). Se ha
modelado una estructura para la enzima de Bacillus
stearothermophilus sobre la de la Taka-amilasa A
(Holm et al., Protein Engineering, vol. 3, págs.
181-191 (1990)). Las cuatro regiones muy conservadas
mostradas en la Figura 7 contienen muchos restos que se cree que
son parte del sitio activo (Matsuura et al., J. Biochem.
(Tokyo), vol. 95, págs. 697-702 (1984); Buisson
et al., EMBO Journal, vol. 6, págs. 3909-3916
(1987); Vihinen et al., J. Biochem., vol. 107, págs.
267-272 (1990)) que incluyen His +105; Arg +229; Asp
+231; His +235; Glu +261 y Asp +328 según el sistema de numeración
de Bacillus licheniformis.
Los segmentos de la cadena polipeptídica de la
\alpha-amilasa que comprende el sitio de unión
CalB incluyen los restos 290-309,
339-347, 402-411,
426-436 y 472-477. Estos segmentos
polipeptídicos comprenden el sitio de unión CalB. Por consiguiente,
se esperaría que mutaciones aleatorias específicas de región en
estas regiones las produjeran variantes que modulen la estabilidad
de la \alpha-amilasa mediante la modulación de la
afinidad del calcio en este sitio.
A continuación se proporcionan estrategias
adicionales más específicas:
(1) Aumentar la entropía del desplegamiento de
la cadena principal puede introducir estabilidad en la enzima. Por
ejemplo, la introducción de restos de prolina en la posición 2 de
giros inversos en los extremos N-terminales de las
hélices \alpha y en las estructuras de bucle puede estabilizar de
manera significativa la proteína aumentando la entropía del
desplegamiento (véase, por ejemplo Watanabe et al., Eur. J.
Biochem, vol. 226, págs. 277-283 (1994)). De manera
similar, los restos de glicina no tienen carbono \beta y por tanto
tienen una libertad conformacional de la cadena principal
considerablemente mayor que muchos otros restos. Esto puede
conducir a mayor flexibilidad con resultados de estabilidad ligeros.
Esto puede conducir a elevada flexibilidad con estabilidad débil
resultante. La sustitución de glicinas en uno o más restos
equivalentes a G299, G410, G433, G474, G475 en Bacillus
licheniformis, preferiblemente con una alanina, puede reducir la
flexibilidad y mejorar la estabilidad. Adicionalmente, acortando
bucles externos puede ser posible mejorar la estabilidad. Se ha
observado que las proteínas producidas por hipertermófilos tienen
bucles externos más cortos que sus homólogas mesófilas (véase, por
ejemplo Russel et al., Current Opinions in Biotechnology,
vol. 6, págs. 370-374 (1995). La introducción de
enlaces disulfuro también puede ser eficaz para estabilizar
distintas estructuras terciarias unas con respecto a otras. La
modificación en G301 alteraría la estabilidad del segmento en
290-309 limitando o mejorando la variabilidad
conformacional de la glicina. Específicamente en este resto se
contemplan sustituciones de ácido aspártico o prolina. La
modificación en G474 por sustitución con otro resto puede aumentar
la estabilidad introduciendo un C\beta, disminuyendo de esta
manera su libertad conformacional.
(2) Disminuir las cavidades internas aumentando
la hidrofobicidad de la cadena lateral puede alterar la estabilidad
de una enzima. Reducir el número y volumen de cavidades internas
aumenta la estabilidad de la enzima maximizando las interacciones
hidrófobas y reduciendo defectos de empaquetamiento (véase, por
ejemplo, Matthews, Ann. Rev. Biochem., vol. 62, págs.
139-160 (1993); Burley et al., Science, vol.
229, págs. 23-29 (1985); Zuber. Biophys. Chem.,
vol. 29, págs. 171-179 (1988); Kellis et al.,
Nature, vol. 333, págs. 784-786 (1988)). Se sabe
que las proteínas multiméricas de termófilos a menudo tienen más
superficies de contacto subunitarias hidrófobas con mayor
complementariedad de superficie que sus homólogas mesófilas (Russel
et al., anteriormente). Los Solicitantes creen que este
principio es aplicable a superficies de contacto de dominios de
proteínas monoméricas. Las sustituciones específicas que pueden
mejorar la estabilidad aumentando la hidrofobicidad incluyen lisina
por arginina, serina por alanina y treonina por alanina (Russel
et al., anteriormente). La modificación en G301 por
sustitución por alanina o prolina puede aumentar el tamaño de la
cadena lateral dando como resultado una reducción de las cavidades,
un mejor empaquetamiento e hidrofobicidad aumentada. Además, Y302,
M304, L307, F343, L427 e I428 bordean una cavidad en la interfaz
entre el dominio A y el dominio C en la región de unión CalB. Las
sustituciones para reducir el tamaño de la cavidad, aumentar la
hidrofobicidad y mejorar la complementariedad de la superficie de
contacto dominio A-dominio C pueden mejorar la
estabilidad de la enzima. Específicamente, la modificación del
resto especifico en estas posiciones con un resto diferente
seleccionado de cualquiera de fenilalanina, triptófano, tirosina,
leucina e isoleucina puede mejorar el comportamiento. Son
sustituciones adicionales que pueden ser útiles en V409 y F403,
preferiblemente las sustituciones en V409 comprenden isoleucina o
leucina, y en F403 comprenden tirosina o triptófano.
(3) Equilibrar la carga de la estructura
secundaria rígida, es decir, hélices \alpha y giros \beta, puede
mejorar la estabilidad. Por ejemplo, neutralizar cargas positivas
parciales en un extremo N de la hélice con carga negativa en ácido
aspártico puede mejorar la estabilidad de la estructura (véase, por
ejemplo, Eriksson et al., Science, vol. 255, págs.
178-183 (1992)). De manera similar, neutralizar
cargas negativas parciales en el extremo C de la hélice con carga
positiva puede mejorar la estabilidad. Eliminar la interacción de la
carga positiva con el extremo N del péptido en giros \beta
debería ser eficaz para conferir estabilidad a la estructura
terciaria. La sustitución de H405 con un resto no cargado
positivamente podría eliminar la interacción de una carga positiva
desfavorable con el nitrógeno amida de D407 en el giro
405-408.
(4) Introducir puentes salinos y enlaces de
hidrógeno para estabilizar estructuras terciarias puede ser eficaz.
Por ejemplo, las interacciones de pares iónicos, por ejemplo, entre
ácido aspártico o ácido glutámico y lisina, arginina o histidina,
pueden introducir fuertes efectos de estabilización y pueden usarse
para unir elementos de diferente estructura terciaria con una
mejora resultante de la termoestabilidad. Además, aumentos en el
número de enlaces hidrógeno de restos cargados/restos no cargados, y
en general del número de enlaces hidrógeno, pueden mejorar la
termoestabilidad (véase, por ejemplo Tanner et al.,
Biochemistry, vol. 35, págs. 2597-2609). La
sustitución de H405 con ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico
o glutamina puede introducir un enlace hidrógeno con la amida de la
cadena principal de D407, estabilizando de esta manera el giro
405-408. La sustitución en K436 con arginina puede
mejorar el puente salino con D404 e introducir un enlace H en el
carbonilo de la cadena principal de I408.
(5) Evitar restos termolábiles en general puede
aumentar la estabilidad térmica. Por ejemplo, la asparagina y la
glutamina son susceptibles a la desamidación y la cisteína es
susceptible a la oxidación a temperatura elevada. Reducir el número
de estos restos en posiciones sensibles puede dar como resultado una
termoestabilidad mejorada (Russel et al., anteriormente). La
sustitución o deleción de Q291, Q298, N309, Q340 o N473 por
cualquier resto distinto de glutamina o cisteína puede aumentar la
estabilidad evitando un resto termolábil.
(6) Introducir un sexto ligando de la proteína
con el ión calcio puede mejorar la estabilidad del calcio unido y,
por tanto, de la enzima. La sustitución de H406 con ácido aspártico,
asparagina, ácido glutámico o glutamina puede aumentar la afinidad
del calcio.
(7) La estabilización de los ligandos
existentes para el calcio en CalB también puede mejorar la
estabilidad del calcio unido y, por tanto, de la enzima. Por
ejemplo, el M304 puede sustituirse con fenilalanina o tirosina para
introducir estabilización de cadena lateral aromática/cadena lateral
de ácido aspártico donde el oxígeno del carboxilato puede
interaccionar favorablemente con la carga positiva parcial asociada
con anillos bencilo, aumentando la estabilidad de D407 y D430. La
sustitución de H405 con fenilalanina o tirosina para introducir un
grupo hidrófobo próximo a D407, puede aumentar la estabilidad de
D407 mediante la formación de interacciones de van der Waals
favorables con átomos C-b y C-g de
la cadena lateral de D407. La sustitución de G300 con fenilalanina
puede eliminar el enlace H de la cadena lateral con Q291.
(8) Aumentar la electronegatividad de
cualquiera de los ligandos de calcio puede mejorar la unión al
calcio. Por ejemplo, la sustitución de M304 con fenilalanina o
tirosina puede aumentar la electronegatividad de D407 y D430 por
una protección mejorada del disolvente, mejorando por lo tanto la
unión al calcio.
(9) Eliminar las cargas positivas en los
alrededores del ión calcio que pueden interferir con la unión al
calcio debería mejorar de manera similar la estabilidad del sitio de
unión al calcio. Por ejemplo, sustituir H405 o H406, que están en
los alrededores inmediatos del calcio unido, puede tener carga
positiva que podría producir interacciones
carga-carga desfavorables con el ión calcio cargado
positivamente y puede tener interacciones
carga-carga opuestas con ligandos de calcio cargados
negativamente. Por lo tanto, la sustitución con un resto adecuado
no cargado positivamente puede aumentar la afinidad del calcio y la
estabilidad de la proteína.
(10) La estabilización del sitio de unión CalB
introduciendo restos cargados negativamente cerca del mismo también
pueden mejorar la unión del ión calcio en el sitio (véase, por
ejemplo, Pantoliano et al., Biochemistry, vol. 27, págs.
8311-8317 (1988); Bryan, Stability of Protein
Pharmaceuticals Part B: In vitro Pathways for Degradation
and Strategies for Protein Stabilization (Ahern & Manning,
Eds.), págs. 147-181 (1992); Fagain, Biochim.
Biophys. Acta. vol. 1252, págs. 1-14 (1995)). Por
ejemplo, la sustitución de Q291, Q298, N309, Q304, H405, H406, N473
y/o G474 con ácido aspártico o ácido glutámico cargados
negativamente aumentará la carga neta negativa en el área del
calcio y puede aumentar la afinidad del calcio y, por tanto, la
estabilidad enzimática.
Las \alpha-amilasas de acuerdo
con la presente invención pueden presentar características de
comportamiento alteradas que proporcionen resultados deseables e
inesperados que sean útiles en las diversas aplicaciones para las
que se usan habitualmente las \alpha-amilasas. Por
ejemplo, las \alpha-amilasas de acuerdo con la
presente invención que presentan características de comportamiento
alteradas a pH bajo, incluyendo termoestabilidad mejorada,
estabilidad de pH mejorada y/o estabilidad oxidativa mejorada, son
útiles en la licuefacción del almidón a pH bajo. La
termoestabilidad mejorada será útil para prolongar la vida útil de
los productos que las incorporen. Una estabilidad oxidativa
mejorada o un comportamiento mejorado son particularmente deseables
en productos de limpieza y para prolongar la vida útil de la
\alpha-amilasa en presencia de blanqueante,
perborato, percarbonato o perácidos usados en tales productos de
limpieza.
La \alpha-amilasa de la
presente invención es especialmente útil en el procesado de almidón
y particularmente en la licuefacción de almidón. Las condiciones
presentes durante los procesos de licuefacción deseables en el
mercado incluyen característicamente condiciones de pH bajo,
temperatura elevada y oxidación potencial que requieren
\alpha-amilasas que presenten un comportamiento
mejorado a pH bajo, estabilidad térmica mejorada y estabilidad
oxidativa mejorada. Por consiguiente, las
\alpha-amilasas de acuerdo con la presente
invención que son particularmente útiles en la licuefacción
presentan un comportamiento mejorado a un pH menor de
aproximadamente 6, preferiblemente menor de aproximadamente 5,5 y
más preferiblemente de entre aproximadamente 5,0 y 5,5. Además,
serán particularmente útiles las \alpha-amilasas
de acuerdo con la presente invención que presentan una estabilidad
térmica aumentada a temperaturas de entre aproximadamente
80-120ºC y preferiblemente de entre aproximadamente
100-110ºC y una estabilidad aumentada en presencia
de oxidantes. Preferiblemente, la \alpha-amilasa
de acuerdo con la presente invención que se usa en licuefacción
comprende adicionalmente una deleción o sustitución en una o más de
las posiciones M15, V128, H133, W138, N188. A209 y/o M197.
En otra realización de la presente invención se
proporcionan composiciones detergentes en forma líquida, de gel o
granular, que comprenden la \alpha-amilasa de
acuerdo con la presente invención. Tales composiciones detergentes
se beneficiarán particularmente de la adición de una
\alpha-amilasa de acuerdo con la presente
invención que tenga una estabilidad térmica aumentada para mejorar
la vida útil o una estabilidad oxidativa aumentada de manera que la
\alpha-amilasa tenga una resistencia mejorada a
compuestos blanqueantes o perácidos habitualmente presentes en
detergentes. Por tanto, la \alpha-amilasa de
acuerdo con la presente invención puede formularse ventajosamente
en detergentes conocidos en polvo, líquido o gel, que tienen un pH
de entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 12,0. Una
realización preferida de la presente invención comprende además una
deleción o sustitución en una o más de las posiciones M15, V128,
H133, W138, N188, A209 y/o M197. Las composiciones detergentes que
comprenden la \alpha-amilasa de acuerdo con la
presente invención pueden incluir adicionalmente otras enzimas tales
como endoglicosidasas, celulasas, proteasas, lipasas u otras
enzimas amilasa, por ejemplo amilasa procedente de Bacillus
stearothermophilus, como se conoce generalmente en la
técnica.
Las realizaciones de la presente invención que
comprenden una combinación de la \alpha-amilasa de
acuerdo con la presente invención con enzimas proteasas incluyen
preferiblemente proteasas oxidativamente estables tales como las
descritas en el documento U.S. Re 34.606, incorporado en este
documento por referencia, así como enzimas disponibles en el
mercado tales como DURAZYM (Novo Nordisk), MAXAPEM
(Gist-brocades) y PURAFECT® OxP (Genencor
International, Inc.). En el documento U.S. Re 34.606 se describen
métodos para fabricar tales mutantes de proteasas (proteasas
oxidativamente estables) y particularmente tales mutantes que tienen
una sustitución para la metionina en una posición equivalente a
N222 en Bacillus amyloliquefaciens.
Lo siguiente se presenta a modo de ejemplo y no
debe interpretarse como una limitación al alcance de las
reivindicaciones. Las abreviaturas usadas en este documento,
particularmente las notaciones de tres letras o de una letra para
los aminoácidos, se describen en Dale, J. W., Molecular Genetics of
Bacteria, John Wiley & Sons, (1989)
Apéndice B.
Apéndice B.
Se desarrollaron cristales en gotas colgantes de
10 \mul, a partir de Li_{2}SO_{4} 1,6-1,8 M,
CaCl_{2} 1 mM, NaCl 50 mM, tamponado a pH 6,5 con bistrispropano
200 mM. Los cristales crecieron como prismas alargados, hasta una
dimensión máxima de aproximadamente 1,5 mm, en 7-14
días. El grupo espacial es P2_{1}2_{1}2_{1}, con a = 118,3
\ring{A}, b = 119,0 \ring{A}, c = 84,9 \ring{A}. El Nº
Matthews (véase Matthews, J., Mol. Biol., vol. 33, pág. 409 (1968))
es 3,01, suponiendo 2 moléculas en la unidad asimétrica, que está
dentro del intervalo normal. Los datos se registraron usando un
sistema de placa de imagen RAXISII, montado en un generador de
rayos X de ánodo rotatorio RU-200B, que produce
radiación CuK_{\alpha} monocromada con grafito. Los datos se
procesaron y se redujeron a amplitudes usando un programa
informático distribuido con el sistema por Molecular Structures
Corp. (The Woodlands, Tejas). La información de fase se determinó
usando reemplazo isomorfo múltiple (MIR) complementado con datos de
dispersión anómala (MIRAS) y posterior modificación de densidad.
Los derivados de átomos pesados se prepararon por métodos de
inmersión convencionales, excepto por el derivado SmCl_{3}, que
se preparó por co-cristalización. Las posiciones de
los átomos pesados se localizaron usando Patterson diferenciales y
Fourier diferenciales de fase cruzada. Se obtuvieron excelentes
datos de dispersión anómala para un derivado SmCl_{3}, que se
usaron para encontrar la mano correcta, y poner todos los átomos
pesados en un origen común. Se refinaron las posiciones de los
átomos pesados y se calcularon las fases MIRAS, usando Xheavy
(Zhang et al., Acta Crystallog. A, vol. 46, pág. 377 (1990)).
Las fases se mejoraron nivelando el disolvente, con SQUASH (McRee,
J., Mol. Graph., vol. 10, pág. 44 (1992)), dando como resultado un
mapa de 3,0 \ring{A} en el que podían identificarse la mayoría de
los elementos estructurales secundarios de ambas moléculas. La
construcción de modelos, el refinado de espacio real y el cálculo
del promedio de simetría se realizaron usando Xfit (Zhang,
anteriormente). Se identificaron las posiciones de C_{\alpha} de
las cadenas \beta y hélices \alpha del dominio de barril
\alpha/\beta y el C terminal de todos los dominios \beta de
ambas moléculas. El barril TIM de la
\alpha-amilasa de Aspergillus (entrada PDB
6TAA) (Swift et al., Acta Crystallog. B, vol. 47, pág. 535
(1991)) se superpuso aproximadamente a la señal C_{\alpha} de
ambas moléculas de la unidad asimétrica y se colocaron con exactitud
usando refinado de espacio real de todo el dominio sin modificar.
Esto permitió la determinación exacta del operador de simetría
local, que se usó para calcular el promedio de simetría no
cristalográfica del mapa. Esto dio como resultado una mejora
significativa del mapa, excepto para el dominio B. En este punto, se
construyó únicamente una molécula para el mapa de simetría
promediado, generándose la segunda usando el operador de simetría
local. Se identificaron las posiciones de C_{\alpha} y la cadena
principal se construyó usando pentámeros solapantes, extraídos de
una base de datos de estructuras bien refinadas (Zhang,
anteriormente; Jones et al., EMBO, vol. 5, pág. 819 (1986)).
En el dominio B gran parte del mapa no podía interpretarse y
únicamente pudieron construirse los restos 105-116
y 133-169. Se construyeron falsas alaninas para los
restos en los que no era evidente densidad de cadena lateral. Este
modelo inicial se refinó usando un protocolo atemperado de
enfriamiento lento simulado (temperatura inicial = 3000 K), seguido
refinado convencional por mínimos cuadrados, usando Xplor (Brunger
et al., Acta Crystallog. A, vol. 45, pág. 50 (1989)) para
datos entre 15-3,0 \ring{A} (F\geq 3s), con
restricciones de simetría no cristalográfica aplicadas. Este modelo
convergía a un factor R de 0,28. Se combinaron fases MIRAS y de
modelo usando sigmaA (Read, Acta Crystallog. A, vol. 42, pág. 140
(1986)), para producir un mapa de 2,2 \ring{A}. Se construyeron
los restos que faltaban, junto con un ajuste manual considerable
del resto de la estructura, y después se refinó usando atemperado
simulado (temperatura inicial = 1000 K), usando datos de entre 8,2
y 2,2 \ring{A} (F\geq 3s). El modelo convergía a un factor R de
0,245. El refinado posterior del factor B isotrópico restringido
dio un factor R de 0,225. Se calcularon los mapas
2fo-fc y fo-fc ponderados de Sigma A
usando fases calculadas y se usaron para identificar errores y para
localizar los iones de calcio. Después de obtener datos nativos a
1,9 \ring{A}, se usaron mapas diferenciales fo-fc
y 2fo-fc para localizar los errores que quedaban e
identificar moléculas de agua ordenadas, seguido por minimización
de Powell y refinado del factor B restringido
estereoquímicamente.
El factor R del presente modelo es de 0,19,
(15-1,9 \ring{A}, F \geq 3sF). El modelo
contiene 7914 átomos no de hidrógeno e incluye 630 átomos de
oxígeno de agua y tres átomos de calcio. Esto presenta una buena
geometría, con desviaciones r.m.s. de 0,012 \ring{A} y 1,35º de
las longitudes y ángulos de enlace ideales, respectivamente. La
representación de Ramachandron de los ángulos \phi y \varphi
muestra que el resto 150 es el único resto no glicina que se desvía
significativamente de las regiones permitidas.
La \alpha-amilasa de B.
licheniformis contiene 483 restos. En el presente modelo faltan
los primeros tres restos del extremo N y el resto
C-terminal. También faltan los restos
181-195 de la molécula 1 y 181-193
de la molécula 2. En la Tabla 1 se proporcionan los datos
procedentes de este ejemplo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Una \alpha-amilasa que
comprende un dominio A, un dominio C y un sitio de unión al calcio,
en la que dicho sitio de unión al calcio está asociado con dicho
dominio A y dicho dominio C y que comprende restos de ligando en
dicho dominio A y/o dicho dominio C, en la que dicha
\alpha-amilasa tiene una secuencia de aminoácidos
de la \alpha-amilasa madura de Bacillus
licheniformis, como se muestra en la Figura 4, pero modificada
para alterar las características de dicho sitio de unión al calcio y
por lo tanto alterar el comportamiento de dicha
\alpha-amilasa sustituyendo un resto aminoacídico
en una posición correspondiente a G474.
2. La \alpha-amilasa de
acuerdo con la reivindicación 1, en la que la
\alpha-amilasa comprende adicionalmente una
sustitución o deleción en uno o más restos equivalentes a M15,
V128, H133, W138, N188, A209 y/o M197.
3. Un detergente que comprende la
\alpha-amilasa de acuerdo con la reivindicación
1.
4. Una composición de licuefacción de almidón
que comprende la \alpha-amilasa de acuerdo con la
reivindicación 1.
5. Un método para la licuefacción de almidón que
comprende la etapa de añadir a una solución acuosa de almidón una
\alpha-amilasa de acuerdo con la reivindicación 1,
e incubarla durante un tiempo adecuado y en condiciones adecuadas
para licuar la solución acuosa de almidón.
6. Un ADN que codifica la
\alpha-amilasa de acuerdo con la reivindicación
1.
7. Un vector de expresión en el que el ADN de la
reivindicación 6 está unido operativamente a una secuencia de
control de expresión que puede emplearse en la expresión de dicho
ADN.
8. Una célula hospedadora transformada con el
vector de expresión de la reivindicación 7.
9. Un método de expresión del ADN que codifica
la \alpha-amilasa que comprende un dominio A, un
dominio C y un sitio de unión al calcio, en el que dicho sitio de
unión al calcio está asociado a dicho dominio A y dicho dominio C y
que comprende restos de ligando en dicho dominio A y/o dicho dominio
C, en el que dicha \alpha-amilasa tiene una
secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa
madura de Bacillus licheniformis como se muestra en la
Figura 4, pero se modifica para alterar las características de dicho
sitio de unión al calcio y por lo tanto alterar el comportamiento
de dicha \alpha-amilasa por sustitución de un
resto aminoacídico en una posición correspondiente a G474, que
comprende las etapas de transformar una célula hospedadora y
expresar y secretar dicha \alpha-amilasa a partir
de dicha célula hospedadora.
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