ES2198617T3 - Alfa-amilasa estable a la oxidacion. - Google Patents

Alfa-amilasa estable a la oxidacion.

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Abstract

SE DESCRIBE UNA ALFA - AMILASA MUTANTE QUE ES EL PRODUCTO DE EXPRESION DE UNA SECUENCIA DE ADN MUTADA QUE CODIFICA UNA ALFA AMILASA, ESTANDO DERIVADO DICHO ADN MUTADO DE UN PRECURSOR DE ALFA - AMILASA, QUE ES UN BACILLUS ALFA - AMILASA, MEDIANTE SUSTITUCION O DELECION DE UN AMINO Y EN UNA POSICION EQUIVALENTE A M + 15 EN B. LICHENIFORMIS ALFA - AMILASA. EL MUTANTE ALFA AMILASA RESULTA ADECUADO PARA SU UTILIZACION EN COMPOSICIONES DETERGENTES Y EN PROCEDIMIENTOS PARA LA LICUACION DE ALMIDON.

Description

Alfa-amilasa estable a la oxidación.
La presente es una solicitud divisional de la Solicitud de Patente Europea nº 94909609.3 presentada el 10 de febrero de 1994.
La presente invención se refiere a nuevos mutantes de alfa-amilasa que tienen una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza, teniendo tales mutantes una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos de un precursor de alfa-amilasa, específicamente un aminoácido oxidable, ha sido sustituido con un aminoácido distinto. Las enzimas mutantes de la presente invención muestran perfiles de estabilidad/actividad alterados, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, estabilidad a la oxidación alterada, perfil de comportamiento de pH alterado, actividad específica alterada y/o termoestabilidad alterada. En una realización particular la invención proporciona alfa-amilasas de Bacillus que tienen una sustitución en un aminoácido en una posición equivalente a M+15 en la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis, y proporciona usos de estas alfa-amilasas.
Las alfa-amilasas (alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolasa, EC3.2.1.1) hidrolizan los enlaces alfa-1,4-glucosídicos internos en el almidón en gran medida al azar, para producir malto-dextrinas de peso Molecular más bajo. Las alfa-amilasas son de un valor comercial considerable, siendo usadas en los estadíos iniciales (licuefacción) del tratamiento del almidón, en la producción de alcohol, como agentes de limpieza en matrices de detergentes, y en la industria textil para el desencolado del almidón. Las alfa-amilasas son producidas por una amplia variedad de microorganismos, incluyendo Bacillus y Aspergillus, siendo producidas la mayor parte de las amilasas comerciales a partir de fuentes bacterianas tales como B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis o B. stearothermophilus. En los últimos años, las enzimas preferidas en uso comercial han sido las procedentes de B. licheniformis por su estabilidad térmica y su rendimiento, al menos para valores del pH neutros y ligeramente alcalinos.
Anteriormente se han realizado estudios, usando técnicas de DNA recombinante, para explorar cuáles son los restos importantes para la actividad catalítica de las amilasas y/o para explorar el efecto de modificar ciertos aminoácidos dentro del sitio activo de varias amilasas (Vihinen, M. et al. (1990) J. Biochem. 107: 267-272; Holm, L. et al. (1990) Protein Engineering 3: 181-191; Takase, K. et al. (1992) Biochimica et Biophysica Acta, 1120: 281-288; Matsui, I. et al. (1992) Feds Letters Vol. 310, nº3, pág. 216- 218), qué restos son importantes para la estabilidad térmica (Suzuki, Y. et al. (1989), J. Biol. Chem. 264: 18933-18938); y un grupo ha usado tales métodos para introducir mutaciones en varios restos de histidina en una amilasa de B. licheniformis; la razón para hacer sustituciones en restos de histidina era que la amilasa de B. licheniformis (que se sabe que es termoestable), comparada con otras amilasas de Bacillus similares, tiene un exceso de histidinas y, por consiguiente, se sugirió que reemplazar una histidina podría afectar a la termoestabilidad de la enzima (Declerck, N. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 15481-15488; documento FR 2 665 178-A1; Joyet, P. et al. (1992) Bio Technology 10: 1579- 1583).
Se ha encontrado que la alfa-amilasa se inactiva por el peróxido de hidrógeno y otros oxidantes a valores del pH entre 4 y 10,5, como se describe en los ejemplos en el presente texto. Comercialmente, las enzimas alfa-amilasas pueden usarse bajo condiciones drásticamente diferentes, tales como condiciones de pH tanto bajo como elevado, dependiendo de la aplicación comercial. Por ejemplo, las alfa-amilasas pueden ser usadas en la licuación del almidón, proceso que preferentemente se realiza a pH bajo (pH < 5,5). Por otra parte, las amilasas pueden ser usadas en detergentes para lavavajillas industriales o lavanderías, que frecuentemente contienen oxidantes tales como lejías o perácidos, y que se usan en condiciones mucho más alcalinas.
Para alterar la estabilidad o el perfil de actividad de enzimas amilasa bajo condiciones variables, se ha encontrado que el reemplazo, la sustitución o la eliminación selectivas de aminoácidos oxidables, tales como la metionina, el triptófano, la tirosina, la histidina o la cisteína, tienen por resultado un perfil de la enzima variante alterado en comparación con el de su precursor. Dado que las amilasas disponibles comercialmente en la actualidad no son aceptables (estables) bajo condiciones varias, existe la necesidad de una amilasa que tenga una estabilidad y/o un perfil de actividad alterados. Esta actividad alterada (a la oxidación, térmica o perfil de comportamiento al pH) pueden conseguirse manteniendo al mismo tiempo una actividad enzimática adecuada en comparación con la enzima de tipo silvestre o precursora. La característica afectada por la introducción de tales mutaciones puede ser un cambio en la estabilidad a la oxidación, manteniendo al mismo tiempo la estabilidad térmica, o viceversa. En consecuencia, la sustitución de aminoácidos oxidables por diferentes aminoácidos en la secuencia precursora de la alfa- amilasa, o la eliminación de uno o más aminoácidos oxidables, puede dar lugar a una actividad enzimática alterada a un pH distinto del que se considera óptimo para la alfa- amilasa precursora. En otras palabras, las enzimas mutantes de la presente invención pueden también tener perfiles de comportamiento al pH alterados, lo que puede ser debido a la mejora de la estabilidad a la oxidación de la enzima.
La presente invención se refiere a nuevos mutantes de alfa-amilasa que son el producto de la expresión de una secuencia de DNA mutada que codifica una alfa- amilasa, derivándose la secuencia de DNA mutada de una alfa-amilasa precursora, por la sustitución (reemplazo) de uno o más aminoácidos oxidables.
Tales alfa-amilasas mutantes, en general, se obtienen por modificación in vitro de una secuencia de DNA precursora que codifica una alfa-amilasa de origen natural o recombinante para codificar la sustitución de uno o más restos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos precursora.
En general, la sustitución o la eliminación de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos se debe al reemplazo o eliminación de uno o más restos de metionina y/o triptófano en tal secuencia. Estos restos de aminoácidos oxidables pueden ser reemplazados por cualquiera de los otros 20 aminoácidos de origen natural. Si el efecto deseado es alterar la estabilidad del precursor, el resto de aminoácido puede ser sustituido por un aminoácido no oxidable (tal como alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, glicina, isoleucina, leucina, lisina, fenilalanina, prolina, serina, treonina o valina) u otro aminoácido oxidable (tal como cisteína, metionina, triptófano, tirosina o histidina, expuestos por orden de más fácilmente oxidables a menos fácilmente oxidables). Del mismo modo, si el efecto deseado es alterar la termoestabilidad, puede sustituirse por cualquiera de los otros 20 aminoácidos naturales (es decir, la metionina puede ser sustituida por cisteína).
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una alfa-amilasa mutada elegida entre el grupo formado por:
(a)
una alfa-amilasa que es el producto de expresión de una secuencia de DNA mutada que codifica una alfa-amilasa, derivando la molécula de DNA mutada de una alfa-amilasa precursora de Bacillus licheniformis por sustitución de un aminoácido en posición M+15, y
(b)
una alfa-amilasa que es el producto de expresión de una secuencia de DNA mutada que codifica una alfa-amilasa, derivando la molécula de DNA mutada de una alfa-amilasa precursora que es una alfa-amilasa de Bacillus por sustitución de un aminoácido que corresponde en estructura primaria o bien en terciaria a M+15 en alfa-amilasa de Bacillus licheniformis.
mostrando dicha alfa-amilasa un perfil de comportamiento con el pH y/o con la temperatura alterado en comparación con la alfa-amilasa de Bacillus de tipo silvestre.
Los aminoácidos sustitutos preferidos en la posición +15 son leucina (L), treonina (T), asparagina (N), aspartato (D), serina (S), valina (V) e isoleucina (i), aunque pueden ser útiles otros aminoácidos sustitutos no especificados anteriormente. Un mutante particularmente preferido de la presente invención es M15L.
Una mutación (sustitución) en un resto de triptófano puede hacerse en combinación con mutaciones en otros restos de aminoácidos oxidables. Específicamente, puede ser ventajoso modificar por sustitución al menos un triptófano en combinación con al menos una metionina.
Los mutantes de alfa-amilasa de la presente invención, en general, muestran una estabilidad a la oxidación alterada en presencia de peróxido de hidrógeno y otros oxidantes, tales como lejías o perácidos, o, más específicamente, oxidantes más suaves tales como la cloramina-T. Las enzimas mutantes que tienen estabilidad a la oxidación mejorada pueden ser útiles para prolongar la conservabilidad en almacenamiento y la compatibilidad con lejías, perborato, percarbonato o perácido, de las amilasas usadas en productos para limpieza. Del mismo modo, una estabilidad a la oxidación reducida puede ser útil en procesos industriales que requieren una paralización rápida y eficaz de la actividad enzimática. Las enzimas mutantes de la presente invención pueden mostrar también un perfil ampliado de comportamiento con el pH, por el que mutantes tales como M15L muestran estabilidad para la licuación del amidón a pH bajo. Los mutantes de la presente invención pueden tener también una estabilidad térmica alterada por lo que el mutante puede tener una estabilidad mejorada, bien a temperatura elevada o a baja temperatura. Se ha de entender que cualquier cambio (aumento o disminución) en las características enzimáticas del mutante, en comparación con su precursor, puede ser beneficioso, dependiendo del uso final que se desee para la alfa-amilasa mutante.
Además del tratamiento del almidón y de las aplicaciones en limpieza, las alfa- amilasas variantes de la presente invención pueden ser usadas en cualquier aplicación en la que se usen amilasas conocidas; por ejemplo, pueden usarse amilasas variantes en tratamientos textiles, tratamientos de alimentos, etc. Específicamente, se contempla que una enzima variante que se desactiva fácilmente por oxidación, sería útil en un proceso en el que es deseable eliminar por completo la actividad de la amilasa al final del mismo, por ejemplo en aplicaciones de tratamiento de alimentos congelados.
Los mutantes de alfa-amilasa de la presente invención se derivan de una cepa de Bacillus tal como B. licheniformis, B. amyloliquefaciens y B. stearothermophilus, y lo más preferentemente de Bacillus licheniformis.
Hay una nueva forma de la alfa-amilasa normalmente producida por B. licheniformis. Esta nueva forma, designada como forma A4, tiene cuatro restos de alanina adicionales en el término N de la amilasa secretada (Fig. 4b). Los derivados de mutantes de la forma A4 de la alfa-amilasa están comprendidos en la presente invención. Por derivados de mutantes de la forma A4 se entiende que la presente invención comprende la alfa-amilasa de forma A4 que contiene una o más mutaciones adicionales tales como, por ejemplo, la mutación (sustitución, reemplazo o eliminación) de uno o más aminoácidos oxidables.
En una realización de composición de la presente invención, se proporcionan composiciones detergentes, líquidas, en gel o granulares, que comprenden los mutantes de alfa-amilasa descritos en el presente texto. Adicionalmente, se contempla que las composiciones de la presente invención puedan incluir un mutante de alfa-amilasa que tiene más de una mutación específica del sitio.
En otra realización de composición de la presente invención, se proporcionan composiciones útiles en el tratamiento del almidón y particularmente en la licuación del almidón. Las composiciones para licuación del almidón de la presente invención comprenden un mutante de alfa-amilasa de la presente invención. Adicionalmente, se contempla que tales composiciones pueden comprender componentes adicionales como los conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, antioxidantes, iones calcio, etc.
En un aspecto del procedimiento de la presente invención, se proporcionan métodos para licuar almidón, y en particular suspensiones de almidón granular, procedente de un proceso de molienda tanto húmeda como seca. Generalmente, en la primera etapa del proceso de degradación del almidón, la suspensión de almidón se gelatiniza calentando a una temperatura relativamente elevada (hasta aproximadamente 110ºC). Una vez gelatinizada la suspensión de almidón, se somete a licuación y a dextrinación usando una alfa-amilasa. Las condiciones para tal licuación se describen en las solicitudes de patente de EE.UU. 07/785.624 y 07/785.623, y en la patente de EE.UU. nº 5.180.669. El presente método para licuar el almidón comprende añadir a una suspensión de almidón una cantidad efectiva de una alfa-amilasa de la presente invención, sola o en combinación con excipientes adicionales tales como un antioxidante, y hacer reaccionar la suspensión durante un tiempo y a una temperatura apropiados para licuar el almidón.
Otro aspecto de la presente invención comprende además el DNA que codifica las alfa-amilasas mutantes de la presente invención (incluyendo la forma A4 mutantes de la misma) y vectores de expresión que codifican el DNA, así como células hospedadoras transformadas con tales vectores de expresión.
La invención será ahora descrita a título de ejemplo con referencia a los dibujos adjuntos.
La Fig. 1 muestra la secuencia de DNA del gen para la alfa-amilasa de B. licheniformis (INCIB8061), ID. Sec. nº31, y el producto de la traducción deducido, como se describe en Gray, G. et al. (1986) J. Bacter. 166:635-643.
La Fig. 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la enzima alfa-amilasa madura procedente de B. licheniformis (NCIB8061), ID. Sec. nº32.
La Fig. 3 muestra una alineación de estructuras primarias de alfa-amilasas de Bacillus. La amilasa de B. licheniformis (Am-Lich), ID. Sec. nº33, está descrita en Gray, G. et al. (1986) J. Bacter. 166:635-643; la amilasa de B. amyloliquefaciens (Am-Amylo), ID. Sec. nº34, está descrita por Takkinen, K. et al. (1983) J. Biol. Chem. 258:1007-1013; y la de B. stearothermophilus (Am-Stearo), ID. Sec. nº35, está descrita por Ihara, H. et al. (1985) J. Biochem. 98:95-103.
La Fig. 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante M197T de alfa- amilasa madura, ID. Sec. nº36.
La Fig. 4b muestra la secuencia de aminoácidos de la forma A4 de alfa-amilasa de B. licheniformis NCIB8061, ID Sec. nº37. La numeración es a partir del término N, empezando con las cuatro alaninas adicionales.
La Fig. 5 muestra el plásmido pA4BL en el que BLAA se refiere al gen de la alfa-amilasa de B. licheniformis, de PstI a SstI; Amp^{R} se refiere al gen resistente a la ampicilina de pBR322; y CAT se refiere al gen resistente al cloranfenicol de pC194.
La Fig. 6 muestra las uniones secuencia señal-proteína madura para B. licheniformis (ID Sec. nº38), B. subtilis (ID Sec. nº39), B. licheniformis en pA4BL (ID Sec. nº40) y B. licheniformis en pBLapr (ID Sec. nº41).
La Fig. 7a muestra la inactivación de ciertas alfa-amilasas (Spezyme® AA20, M1 5L) con H_{2}O_{2} 0,88M a pH 5,0, 25ºC.
La Fig. 8 muestra un esquema de la producción de mutantes de casete M 15X.
La Fig. 9 muestra la expresión de variantes M 15X.
La Fig. 10 muestra la actividad específica de variantes M 15X sobre el almidón soluble.
La Fig. 11 muestra la estabilidad térmica de variantes M 15X a 90ºC, pH 5,0, CaCl_{2} 5 mM, 5 minutos.
La Fig. 12 muestra la actividad específica sobre el almidón y un sustrato soluble, y el comportamiento en la licuación en chorro a pH 5,5, de variantes M15 en función del porcentaje de actividad de B. licheniformis de tipo silvestre.
La Fig. 13 muestra la inactivación de alfa-amilasa de B. licheniformis (AA20 a 0,65 mg/ml) con cloramina T a pH 8,0, en comparación con las variantes M197A (1,7 mg/ml) y M197L (1,7 mg/ml).
La Fig. 14 muestra la inactivación de alfa-amilasa de B. licheniformis (AA20 a 0,22 mg/ml) con cloramina T a pH 4,0, en comparación con las variantes M197A (4,3 mg/ml) y M197L.
La Fig. 15 muestra la reacción de alfa-amilasa de B. licheniformis (AA20 a 0,75 mg/ml) con cloramina T a pH 5,0, en comparación con variantes dobles M197T/W138F (0,64 mg/ml) y M197T/W138Y (0,60 mg/ml).
Se cree que las amilasas usadas en la licuación del almidón pueden ser sometidas a alguna forma de inactivación debido a cierta actividad presente en la suspensión de almidón (véanse las solicitudes en EE.UU. 07/785.624 y 07/785.623 y la patente de EE.UU. nº 5.180.669, expedida el 19 de enero de 1993). Además, el uso de una amilasa en presencia de oxidantes, tal como en los detergentes que contienen lejías o perácido, puede dar por resultado la inactivación parcial o completa de la amilasa. Por consiguiente, la presente invención se enfoca en alterar la sensibilidad a la oxidación de las amilasas. Las enzimas mutantes de la presente invención pueden tener también un perfil de pH alterado y/o una estabilidad térmica alterada, que pueden ser debidas a la estabilidad a la oxidación mejorada de la enzima a valores del pH bajos o altos.
Alfa-amilasa, como se usa en el presente texto, incluye amilasas de origen natural, así como amilasas recombinantes. Las amilasas preferidas en la presente invención son alfa-amilasas derivadas de B. licheniformis o B. stearothermophilus, incluyendo la forma A4 de alfa-amilasa derivada de B. licheniformis como se describe en el presente texto.
Alfa-amilasas recombinantes se refieren a una alfa-amilasa en la que se modifica la secuencia de DNA que codifica la alfa-amilasa de origen natural para producir una secuencia mutante de DNA que codifica la sustitución, la inserción o la eliminación de uno o más aminoácidos en la secuencia de alfa-amilasa. Los métodos de modificación adecuados se discuten en el presente texto y también en las patentes de EE.UU. nº4.760.025 y nº5.185.258.
Se han encontrado homologías entre casi todas las endo-amilasas secuenciadas hasta ahora, de plantas, mamíferos y bacterias (Nakajima, R.T. et al. (1986) Appl. Microbiol. Biotechnol. 23:355-360; Rogers, J.C. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 128:470-476). Hay cuatro áreas de homología particularmente alta en ciertas amilasas de Bacillus, como se muestra en la Fig. 3, en la que las secciones subrayadas designan las áreas de homología elevada. Además, han sido usados alineamientos de secuencias para cartografiar la relación entre endo-amilasas de Bacillus (Feng, D.F. y Doolittle, R.F. (1987) J. Molec. Evol. 35:351-360). La homología relativa de secuencias entre la amilasa de B. stearothermophilus y la de B. licheniformis es aproximadamente el 66%, como han determinado Holm, L. et al. (1990) Protein Engineering 3 (3) pág. 181-191. La homología de secuencias entre las amilasas de B. licheniformis y las de B. amyloliquefaciens es aproximadamente el 81%, según Holm, L. et al., supra. Aunque la homología de secuencias es importante, se reconoce de un modo general que la homología estructural es también importante para comparar amilasas u otras enzimas. Por ejemplo, se ha sugerido la homología estructural entre amilasas fúngicas y amilasa bacteriana (Bacillus), y por tanto las amilasas fúngicas están comprendidas dentro de la presente invención.
Un mutante de alfa-amilasa tiene una secuencia de aminoácidos que se deriva de la secuencia de aminoácidos de una alfa-amilasa precursora. Las alfa-amilasas precursoras incluyen alfa-amilasas de origen natural y alfa-amilasas recombinantes (como se han definido). La secuencia de aminoácidos del mutante de alfa-amilasa se deriva de la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa precursora mediante la sustitución, eliminación o inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora. Tal modificación es de la secuencia de DNA precursora que codifica la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa precursora y no la manipulación de la enzima alfa-amilasa precursora per se. Los métodos adecuados para tal manipulación de la secuencia de DNA precursora incluyen métodos descritos en el presente texto y en las patentes de EE.UU. nº4.760.025 y 5.185.258.
Los restos específicos correspondientes a las posiciones M15 y W138 de la alfa- amilasa de Bacillus licheniformis se identifican en el presente texto para sustitución o eliminación como todas las posiciones de metionina, histidina, triptófano, cisteína y tirosina. El número de la posición del aminoácido (p. ej. +197) se refiere al número asignado a la secuencia de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis madura, presentada en la Fig. 2. Sin embargo, la invención no está limitada a la mutación de esta alfa- amilasa madura en particular (B. licheniformis) sino que se extiende a alfa-amilasas precursoras que contienen restos de aminoácidos en posiciones que son equivalentes al resto identificado en particular en la alfa-amilasa de B. licheniformis. Un resto (aminoácido) de una alfa-amilasa precursora es equivalente a un resto de una alfa-amilasa de B. licheniformis si es homólogo (es decir, correspondiente en posición en estructura primaria o bien en la terciaria) o si es análogo a un resto específico o porción de ese resto en la alfa-amilasa de B. licheniformis (es decir, que tiene la misma o similar capacidad funcional para combinarse, reaccionar o interaccionar química o estructuralmente).
Para establecer homología respecto a la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una alfa-amilasa precursora se compara directamente con la secuencia primaria de alfa-amilasa de B. licheniformis, y en particular con un conjunto de restos que se sabe que son invariables para todas las alfa-amilasas para las que se conoce la secuencia, como se observa en la Fig. 3. También es posible determinar restos equivalentes por estructura terciaria; se han publicado estructuras cristalinas para alfa-amilasa pancreática porcina (Buisson, G. et al. (1987) EMBO J. 6:3909:3916); Taka-amilasa A de Aspergillus oryzae (Matsuura, Y. et al. (1984) J. Biochem. (Tokio) 95:697-702); y una alfa-amilasa ácida de A. niger (Boel, E. et al. (1990) Biochemistry 29:6244-6249), siendo similares las dos primeras estructuras. No hay estructuras publicadas para alfa-amilasas de Bacillus, aunque se predice que son estructuras super-secundarias comunes entre glucanasas (MacGregor, E. A. y Svensson, B. (1989) Biochem. J. 259:145-152) y una estructura para la enzima de B. stearothermophilus ha sido modelada sobre la de Taka-amilasa A (Holm, L. et al. (1990) Protein Engineering 3:181-191). Las cuatro regiones altamente conservadas mostradas en la Fig. 3 contienen muchos restos que se cree que son parte del sitio activo (Matsuura, Y. et al. (1984) J. Biochem. (Tokio) 95:697-702; Buisson, G. et al. (1987) EMBO J. 6:3909-3916; Vihinen, M. et al. (1990) J. Biochem. 107:267-272) incluyendo, en la numeración de licheniformis, His105, Arg229, Asp231, His235, Glu261 y Asp328.
Vector de expresión, como se usa en el presente texto, se refiere a una construcción de DNA que contiene una secuencia de DNA que está unida operativamente a una secuencia de control adecuada, capaz de efectuar la expresión de dicho DNA en un hospedador adecuado. Tales secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar tal transcripción, una secuencia que codifica sitios adecuados de unión del mRNA al ribosoma, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. Un promotor preferido es el promotor aprE de B.subtilis. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un hospedador adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma hospedador o, en algunos casos, puede integrarse en el propio genoma. En la presente memoria, plásmido y vector se usan a veces indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada en la actualidad. Sin embargo, se pretende que la invención incluya otras formas de vectores de expresión que sirven para funciones equivalentes y que son conocidas en la técnica, o van a serlo.
Las cepas (o células) hospedadoras útiles en la presente invención son generalmente hospedadores procariotas o eucariotas, e incluyen cualquier microorganismo transformable en el que pueda lograrse la expresión de la alfa-amilasa. Específicamente, son adecuadas cepas hospedadoras de la misma especie o género de los que deriva la alfa- amilasa, tal como la cepa de Bacillus. Preferentemente se usa una cepa de Bacillus alfa-amilasa negativa (genes borrados) y/o una cepa de Bacillus borrada para alfa-amilasa y proteasa, tal como la cepa de Bacillus subtilis BG2473 (\DeltaamyE, \Deltaapr, \Deltanpr). Las células hospedadoras son transformadas o transfectadas con vectores construidos usando técnicas de DNA recombinante. Tales células hospedadoras transformadas son capaces de replicar vectores que codifican la alfa-amilasa y sus variantes (mutantes) o bien de expresar la alfa- amilasa deseada.
Preferentemente los mutantes de la presente invención son secregados al medio de cultivo durante la fermentación. Cualquier secuencia señal adecuada, tal como el péptido señal aprE, puede ser usada para conseguir la secreción.
Muchos de los mutantes de alfa-amilasa de la presente invención son útiles para formular varias composiciones detergentes, en particular ciertas composiciones para limpieza de vajillas, especialmente las composiciones para limpieza que contienen oxidantes conocidos. Los mutantes de alfa-amilasa de la invención pueden ser formulados en detergentes conocidos en polvo, líquidos o en gel, que tienen un pH entre 6,5 y 12,0. Las composiciones granulares adecuadas pueden hacerse como se describió en las solicitudes de patente de EE.UU. en común 07/429.881, 07/533.721 y 07/957.973. Estas composiciones detergentes para limpieza pueden contener también otras enzimas, tales como proteasas, lipasas, celulasas, endoglicosidasas u otras amilasas conocidas, así como agentes mejoradores, estabilizantes u otros excipientes conocidos por los expertos en la técnica. Estas enzimas pueden estar presentes como co-granulados o como mezclas, o en cualquier otra manera conocida por los expertos en la técnica. Además, se contempla en la presente invención que múltiples mutantes puedan ser útiles en limpieza o en otras aplicaciones. Por ejemplo, una enzima mutante que tienen cambios tanto en +15 como en +197 puede mostrar un rendimiento mejorado útil en un producto de limpieza.
Como se describió anteriormente, los mutantes de la alfa-amilasa de la presente invención pueden ser también útiles en la licuación del almidón. La licuación del almidón, particularmente la licuación de una suspensión de almidón granular, se lleva a cabo típicamente a valores de pH próximos a la neutralidad y temperaturas elevadas. Como se describe en las solicitudes de patente de EE.UU. 07/788.624 y 07/785.623 y en la patente de EE.UU. nº 5.180.669, parece que un agente oxidante o un agente inactivador del algún tipo está también presente en los procesos de licuación típicos, que pueden afectar a la actividad de la enzima; así, en estas solicitudes de patente relacionadas, se añade un antioxidante al proceso para proteger a la enzima.
Basándose en las condiciones de un proceso de licuación preferido, como se describe en las solicitudes de patente de EE.UU. 07/788.624 y 07/785.623 y en la patente de EE.UU. nº 5.180.669, o sea condiciones como el bajo pH, la temperatura elevada y las condiciones potenciales de oxidación, los mutantes preferidos de la presente invención para su uso en procesos de licuación comprenden mutantes que muestran perfiles alterados de comportamiento con el pH (es decir, perfil de pH bajo, pH <6 y preferentemente pH <5,5), y/o estabilidad térmica alterada (es decir, alta temperatura, aproximadamente 90ºC- 110ºC), y/o estabilidad a la oxidación alterada (es decir, estabilidad a la oxidación mejorada).
Así, la presente invención enseña un método mejorado para licuar almidón, comprendiendo el método licuar una suspensión de almidón granular procedente de un proceso de molienda bien sea húmeda o seca, a un pH de aproximadamente 4 a 6, añadiendo una cantidad efectiva de un mutante de alfa-amilasa de la presente invención a la suspensión de almidón, opcionalmente añadir una cantidad efectiva de un antioxidante u otro excipiente a la suspensión, y hacer reaccionar la suspensión durante un tiempo y a una temperatura apropiados, para licuar el almidón.
Lo que sigue se presenta a título de ejemplo y no ha de considerarse como una limitación del alcance de las reivindicaciones. Las abreviaturas usadas, en particular las notaciones de tres letras o de una letra para los aminoácidos, se describen en Dale, J.W., Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley and Sons, (1989), Apéndice B.
Parte experimental Ejemplo 1 Sustituciones para los restos de metionina en la alfa-amilasa de B.licheniformis.
El gen de la alfa-amilasa (Fig. 1) fue clonado a partir de B. licheniformis NCIB8061, obtenido de la National Collection of Industrial Bacteria (Colección Nacional de Bacterias Industriales), Aberdeen, Escocia (Gray, G. et al. (1986) J. Bacteriology 166:635-643). El fragmento PstI-SstI de 1,72 kb, que codifica los tres últimos restos de la secuencia señal, la proteína madura entera y la región del terminador se subclonaron en M13MPJ8. Se añadió un terminador sintético entre los sitios BclI y SstI usando una casete de oligonucleótido sintético de la forma
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diseñada para contener el terminador transcripcional de la subtilisina de B.amyloliquefaciens (Wells et al. (1983) Nucleic Acid Research 11:7911- 7925).
La mutagénesis dirigida al sitio mediante oligonucleótidos usó esencialmente el protocolo de Zoller, M. et al. (1983) Meth. Enzymol. 100:468-500; de forma resumida, se usaron cebadores de oligonucleótido 5'-fosforilado para introducir las mutaciones deseadas en el molde de DNA monocatenario de M13 usando los oligonucleótidos listados en la Tabla I para sustituir cualquiera de las siete metioninas encontradas en la alfa-amilasa de B. licheniformis. Cada oligonucleótido mutagénico introdujo también un sitio de endonucleasa de restricción para usar como tamiz para la mutación unida.
TABLA I Oligonucleótidos mutagénicos para la sustitución de los restos de metionina en la alfa-amilasa de B.licheniformis.
1
101
TABLA I (continuación)
100
Las letras en negrilla indican cambios de base introducidos por el oligonucleótido.
Cambios de codón indicados en la forma M8A, en donde la metionina (M) en posición +8 ha sido cambiada a alanina (A).
El subrayado indica un sitio de endonucleasa de restricción introducido por el oligonucleótido.
El heteroduplex fue usado para transfectar células mutL de E. coli (Kramer et al. (1984) Cell (38:879)) y, después de purificación en placa, los clones fueron analizados por análisis de restricción de los RF1. Los positivos fueron confirmados por secuenciación didesoxi (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467) y los fragmentos PstI-SstI para cada uno subclonados en un vector de E. coli, plásmido pA4BL.
Plásmido pA4BL
Siguiendo los métodos descritos en la solicitud de patente de EE.UU. 860.468 (Power et al.), se introdujo un sitio PstI silencioso en el codón +1 (el primer aminoácido después del sitio de clivaje de señal) del gen aprE de pS168-1 (Stahl, M. L. y Ferrari, E. (1984) J. Bacter. 158:411-418). El promotor aprE y la región del péptido señal fueron después subclonados de un plásmido pJH101 (Ferrari, F.A. et al. (1983) J. Bacter. 154:1513-1515) como un fragmento HindIII-PstI, y subclonados en el plásmido JM102 derivado de pUC18 (Ferrari, E. y Hoch, J.A. (1989) Bacillus, ed. C.R. Harwood, Plenum Pub., pág. 57-72). La adición del fragmento PstI-SstI procedente de la alfa- amilasa de B. licheniformis dio pA4BL (Fig. 5) que tiene la unión resultante péptido señal aprE-amilasa como se muestra en la Fig. 6.
Transformación en B. subtilis
El pA4BL es un plásmido capaz de replicarse en E. coli e integrarse en el cromosoma de B. subtilis. Plásmidos que contienen diferentes variantes fueron transformados en B. subtilis (Anagnostopoulos, C. y Spizizen, J. (1961) J. Bacter. 81:741-746) e integrados en el cromosoma en el locus aprE mediante un mecanismo de tipo Campbell (Young, M. (1984) J. Gen. Microbiol. 130:1613-1621). La cepa de B. subtilis BG2473 era un derivado de I168 que había sido borrado en relación con la amilasa (\DeltaamyE) y dos proteasas (\Deltaapr, \Deltanpr) (Stahl, M.L. y Ferrari, E., J. Bacter. 158:411-418 y patente de EE.UU. nº5.264.366, incorporados al presente texto como referencia). Después de la transformación se introdujo la mutación sacU32(Hy) (Henner, D.J. et al. (1988) J. Bacter. 170:296-300) mediante transducción mediada por PBS-1 (Hoch, J.A. (1983) 154:1513-1515).
El análisis N-terminal de la amilasa expresada a partir de pA4BL en B. subtilis indicó que había sido procesada teniendo cuatro alaninas extra en el término N de la proteína amilasa secretada ("forma A4"). Estos restos extra no tenían un efecto perjudicial significativo sobre la actividad o la estabilidad térmica de la forma A4, y en algunas aplicaciones puede potenciar el rendimiento. En experimentos subsiguientes las formas correctamente expresadas de la amilasa licheniformis y la variante M197T fueron hechas a partir de una construcción muy similar (véase la Fig. 6). Específicamente, el extremo 5' de la construcción A4 fue subclonado en un fragmento EcoRI-SstII, a partir de pA4BL (Fig. 5) en M13BM20 (Boehringer Mannheim) con el fin de obtener un molde de cadena de codificación para el oligonucleótido mutágeno que sigue:
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Este cebador eliminó los codones para las cuatro alaninas N-terminales extra, siendo cribadas las formas correctas en cuanto a la ausencia del sitio PstI. La subclonación del fragmento EcoRI-SstII de nuevo en el vector pA4BL (Fig. 5) dio el plásmido pBLapr. La sustitución M197T pudo entonces ser movida, en un fragmento SstII-SstI, del pA4BL (M197T) al vector pBLapr complementario para dar el plásmido pBLapr (M197T). El análisis N-terminal de la amilasa expresada a partir de pBLapr en B. subtilis indicó que había sido procesada con el mismo término N encontrado en la alfa-amilasa de B. licheniformis.
Ejemplo 2 Sensibilidad a la oxidación de variantes de metionina
Una alfa-amilasa de B. licheniformis, tal como Spezyme® AA20 (comercialmente disponible de Genencor International, Inc.) se inactiva rápidamente en presencia de peróxido de hidrógeno (Fig. 7). Varias variantes de metionina fueron expresadas en cultivos de B. subtilis, en frascos en sacudidora, y los sobrenadantes crudos se purificaron mediante cortes con sulfato amónico. La amilasa fue precipitada de un sobrenadante con 20% de saturación de sulfato amónico aumentando el sulfato amónico al 70% de saturación, y después se resuspendió. Las variantes fueron después expuestas a peróxido de hidrógeno 0,88M a pH 5,0, a 25ºC. Las variantes en seis de las posiciones de metionina en la alfa-amilasa de B. licheniformis fueron aún sometidas a oxidación por peróxido mientras que la sustitución en posición +197 (M197L) mostró resistencia a la oxidación por peróxido (véase la Fig. 7). Sin embargo, análisis subsiguientes, que se describen con más detalle más adelante, indicaron que mientras que una variante puede ser susceptible a la oxidación a pH 5,0 y 25ºC, puede mostrar propiedades alteradas mejoradas bajo distintas condiciones (p. ej. licuación).
Ejemplo 3 Construcción de todas las variantes posibles en la posición 197
Todas las variantes M197 (M197X) fueron producidas en la forma A4 mediante mutagénesis de casete, como se representa en la Fig. 8:
1) Se usó mutagénesis dirigida al sitio (mediante prolongación del cebador en M13) para hacer M197A usando el oligonucleótido mutagénico que sigue:
40
que también insertó un sitio EcoRV (codones 200-201) para reemplazar el sitio ClaI (codones 201-202).
2) Después se usó el cebador LAAM12 (Tabla II) para introducir otro sitio de restricción silencioso (BstBI) sobre los codones 186-188.
3) La variante M197A resultante (BstBI+, EcoRV+) fue después subclonada (fragmento PstI-SstI) en el plásmido pA4BL, y el plásmido resultante fue digerido con BstBI y EcoRV, y el fragmento grande conteniendo el vector se aisló mediante electroelución en gel de agarosa.
4) Los cebadores sintéticos LAAM14-30 (Tabla II) fueron reasociados cada uno de ellos con el cebador común en gran medida complementario LAAM13 (Tabla II). Las casetes resultantes codificaban todos los aminoácidos de origen natural en posición +197 y fueron ligadas individualmente en el fragmento del vector preparado anteriormente.
TABLA II Oligonucleótidos sintéticos usados para mutagénesis de casete para producir variantes M197X.
2
TABLA II (continuación)
3
Las casetes fueron diseñadas para destruir el sitio EcoRV al tener lugar la ligación, y entonces los plásmidos procedentes de transformantes de E. coli fueron cribados en relación con la pérdida de este sitio único. Además, la cadena de fondo común de la casete contenía un desplazamiento del marco y codificaba un sitio NsiI, y así los transformantes derivados de esta cadena pudieron ser eliminados cribando en relación con la presencia del sitio NsiI único y no sería de esperar, en ningún caso, que condujesen a la expresión de amilasa activa.
Los positivos por análisis de restricción fueron confirmados por secuenciación y transformados en B. subtilis para expresión en cultivos en frasco en sacudidora. La actividad específica de algunos de los mutantes M197X se determinó después usando un ensayo de sustrato soluble. Los datos generados usando los métodos de ensayo que siguen se presentan más adelante en la Tabla III.
Ensayo de sustrato soluble:
Se desarrolló un ensayo de velocidad basado en un kit de ensayo de punto final suministrado por Megazyme (Aust.) Pty, Ltd.: Cada frasco de sustrato (p-nitrofenil-maltoheptaosido, BPNG7) fue disuelto en 10 ml de agua estéril, seguido por una dilución 1 a 4 en tampón para ensayo (tampón de maleato 50 mM, pH 6,7, cloruro cálcico 5 mM, Tween20 al 0,002%). Los ensayos fueron realizados añadiendo 10 \mul de amilasa a 790 \mul del sustrato en una cubeta a 25ºC. Las velocidades de hidrólisis se midieron como la velocidad de cambio de absorbencia a 410 nm, después de un retardo de 75 segundos. El ensayo era lineal hasta velocidades de 0,4 unidades de absorción/minuto.
La concentración de proteína amilasa se midió usando el ensayo Bio-Rad estándar (Bio-Rad Laboratories) basado en el método de Bradford, M. (1976) Anal. Biochem. 72:248) usando patrones de albúmina de suero bovino.
Ensayo de hidrólisis de almidón:
Se usó el método estándar para ensayar la actividad de alfa-amilasa de Spezyme® AA20. Este método se describe con detalle en el Ejemplo 1 del documento USSN 07/785.624, incorporado al presente texto como referencia. El almidón nativo forma un color azul con yodo, pero no lo hace cuando está hidrolizado en moléculas de dextrina, más cortas. El sustrato es 5 g/l de almidón Lintner soluble en tampón de fosfato, pH 6,2 (42,5 g/litro de dihidrógeno-fosfato potásico, 3,16 g/litro de hidróxido sódico). La muestra se añade a cloruro cálcico 25 mM y se mide la actividad como el tiempo necesario para que una prueba de yodo resulte negativa al incubarla a 30ºC. La actividad se expresa en liquefons por gramo o ml (LU) calculados de acuerdo con la fórmula:
LU/ml o LU/g = \frac{570}{V x t} x D
en la que LU = unidad liquefon
V = volumen de la muestra
t = tiempo de dextrinación (minutos)
D = factor de dilución = volumen de dilución/ml o g de enzima añadida
TABLA III
Alfa-amilasa Actividad específica (como % del valor
AA20) sobre:
Sustrato soluble Almidón
Spezyme® AA20 100 100
Forma A4 105 115
M15L (forma A4) 93 94
M15L 85 103
M197T (forma A4) 75 83
M197T 62 81
M197A (forma A4) 88 89
M197C 85 85
M197L (forma A4) 51 17
Ejemplo 4 Caracterización de variante M15L
La variante M15L hecha según los ejemplos anteriores no mostró una actividad de amilasa incrementada (Tabla III) y todavía se desactivaba por el peróxido de hidrógeno (Fig. 7). Sin embargo, sí que mostró un rendimiento significativamente mayor en la licuación del almidón en chorro, especialmente a bajo pH como se muestra en la Tabla IV que sigue.
La licuación del almidón se realizó típicamente usando un chorro de vapor Hydroheater M 103-M equipado con un serpentín de retardo detrás de la cámara de mezclado y una válvula de contrapresión terminal. El almidón era alimentado al chorro mediante una bomba Moyno, y el vapor era suministrado por una tubería de vapor de agua a 1.034 kN/m^{2} (10,2 at), reducida a 620,5 - 689,5 kN/m^{2}. Se instalaron sondas de temperatura justo después del chorro del Hydroheater antes de la válvula de contrapresión.
Se obtuvo suspensión de almidón de una molienda húmeda de maíz y se usó dentro de los dos días siguientes. El almidón se diluyó con agua desionizada hasta el nivel de sólidos deseado, y el pH del almidón se ajustó con NaOH al 2% o solución acuosa saturada de Na_{2}CO_{3}. Las condiciones de licuación típicas fueron:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Almidón \+ 32%-35% de sólidos\cr  Calcio \+ 40-50
ppm (30 ppm añadidas)\cr  pH \+ 5,0-6,0\cr 
Alfa-amilasa \+ 12-14 LU/g almidón
en base peso
seco\cr}
El almidón se introdujo en el chorro a aproximadamente 350 ml/min. La temperatura del chorro se mantuvo a 105ºC-107ºC. Se transfirieron muestras de almidón desde el cocedor de chorro a una segunda etapa de licuación a 95ºC y se mantuvieron durante 90 minutos.
El grado de licuación del almidón se midió inmediatamente después de la segunda etapa de licuación determinando la equivalencia de dextrosa (DE) de las muestras y analizando la presencia de almidón crudo, de acuerdo con los métodos descritos en Standard Analytical Methods of the member Companies of the Corn Refiners Association Inc., sexta edición. El almidón, cuando es tratado generalmente bajo las condiciones dadas anteriormente y a pH 6,0 dará un almidón licuado con un DE de aproximadamente 10 y sin almidón crudo. Los resultados de los pruebas de licuación del almidón usando mutantes de la presente invención se proporcionan en la Tabla IV.
TABLA IV Comportamiento de las variantes M15L (forma A4) y M15L en la licuación del almidón
pH DE después de
90 min.
Spezyme® AA20 5,9 9,9
M15L (forma A4) 5,9 10,4
Spezyme® AA20 5,2 1,2
M15L (forma A4) 5,2 2,2
Spezyme® AA20 5,9 9,3*
M15L (forma A4) 5,9 11,3*
Spezyme® AA20 5,5 3,25**
M15L (forma A4) 5,5 6,7**
Spezyme® AA20 5,2 0,7**
M15L (forma A4) 5,2 3,65**
* media de tres experimentos
** media de dos experimentos
Ejemplo 5 Construcción de variantes M15X
Siguiendo de un modo general los procedimientos descritos en el Ejemplo 3 anterior, fueron producidas todas las variantes a M15 (M15X) en B. licheniformis nativo mediante mutagénesis de casete, como se esquematiza en la Fig. 8:
1) Se usó mutagénesis dirigida al sitio (mediante prolongación del cebador en M13) para introducir sitios de restricción únicos que flanquean el codón M15 para facilitar la inserción de una casete de mutagénesis. Específicamente, se introdujeron un sitio BstB1 en los codones 11-13 y un sitio Msc1 en los codones 18-20 usando los dos oligonucleótidos que se muestran a continuación:
41
2) Después fue construido el vector para la mutagénesis de casete M15X subclonando el fragmento Sfi1-SstII procedente de la amilasa mutagenizada (BstB1+, Msc1+) en el plásmido pBLapr. El plásmido resultante fue después digerido con BstB1 y Msc1 y se aisló el fragmento grande del vector mediante electroelución en un gel de poliacrilamida.
3) Se crearon casetes de mutagénesis como con las variantes M197X. Se reasociaron oligómeros sintéticos cada uno de los cuales codifica una sustitución en el codón 15, en un cebador de fondo común. Al tener lugar la ligación apropiada de la casete al vector, el Msc1 se destruye permitiendo el cribado de transformantes positivos por la pérdida de este sitio. El cebador de fondo contiene un sitio SnaB1 único que permite que los transformantes derivados de la cadena del fondo sean eliminados mediante cribado respecto el sitio SnaB1. Este cebador contiene también un desplazamiento del marco que también eliminaría la expresión de la amilasa para los mutantes derivados de la cadena de fondo común.
Las casetes sintéticas se listan en la Tabla V y la estrategia general de la mutagénesis de casete se ilustra en la Figura 8.
TABLA V Oligonucleótidos sintéticos usados para la mutagénesis de casete para producir variantes M15X
4
El subrayado indica cambios de codón en la posición 15 de aminoácido.
En algunos casos se hicieron sustituciones conservadoras para evitar la introducción de nuevos sitios de restricción.
Ejemplo 6 Licuefacción de prueba con variantes M15X
Once variantes de alfa-amilasa con sustituciones para M15 hechas según el Ejemplo 5 fueron ensayadas en relación con su actividad, comparándola con Spezyme® AA20 (disponible comercialmente de Genencor International, IRC) en la licuefacción a pH 5,5, usando un sistema de licuefacción de prueba. El sistema de licuefacción de prueba consistía en un serpentín de acero inoxidable (0,64 cm de diámetro, aproximadamente 350 ml de volumen)equipado con un elemento mezclador estático de 17,8 cm de longitud aproximadamente a 30,5 cm del extremo anterior y una válvula de contrapresión a 207 kN/m^{2} en el extremo posterior. El serpentín, excepto para cada extremo, se sumergió en un baño de glicerina-agua dotado de elementos de calefacción controlados termostáticamente que mantenían el baño en 105-106ºC.
La suspensión de almidón conteniendo enzima, mantenida en suspensión por agitación, se introdujo en el serpentín de reacción mediante una bomba dosificadora accionada por pistón a aproximadamente 70 ml/min. El almidón se recuperó del extremo del serpentín y se pasó al espacio de retención secundario (a 95ºC durante 90 minutos). Inmediatamente después del espacio de retención secundario, se determinó el DE del almidón licuado, como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados se muestran en la Fig. 12.
Ejemplo 7 Caracterización de variantes M15X
Todas las variantes M15X fueron propagadas en Bacillus subtilis y el nivel de epresión se controló como se muestra en la Fig. 9. La amilasa se aisló y se purificó parcialmente mediante un corte con sulfato amónico al 20-70%. La actividad específica de estas variantes en el sustrato en solución se determinó según el Ejemplo 3 (Fig. 10). Muchas de las amilasas M15X tienen actividades específicas superiores a la de Spezyme® AA20. Se realizó un ensayo de estabilidad térmica a escala piloto en las variantes calentando la amilasa a 90ºC durante 5 minutos en tampón de acetato 50 mM pH 5, en presencia de CaCl_{2} 5 mM (Fig. 11). La mayoría de las variantes se comportaron tan bien como Spezyme® AA20 en este ensayo. Las variantes que mostraron una razonable estabilidad en este ensayo (se define estabilidad razonable como la estabilidad de un producto que conserva al menos aproximadamente el 60% de la estabilidad térmica del Spezyme® AA20) fueron ensayadas en relación con la actividad específica sobre el almidón y en cuanto a su comportamiento en la licuación a pH 5,5. Los más interesantes de esos mutantes se muestran en la Fig. 16. M15D, N y T, junto con L, superaron en comportamiento al Spezyme® AA20 en la licuación a pH 5,5 y tienen mayores actividades específicas tanto en los ensayos en sustrato soluble como en los de hidrólisis del almidón.
Generalmente, los autores han encontrado que sustituyendo la metionina en posición 15, se pueden proporcionar variantes con mejor comportamiento de licuación a pH bajo y/o mayor actividad específica.
Ejemplo 8 Sensibilidad a la oxidación del triptófano
La cloramina T (N-cloro-p-toluenosulfonimida sódica) es un oxidante selectivo que oxida a la metionina para dar metionina sulfóxido a pH neutro o alcalino. A pH ácido, la cloramina T modifica tanto a la metionina como al triptófano (Schechter, Y., Burstein, Y. y Patchornik, A. (1975) Biochemistry 14 (20) 4497-4503). La Fig. 17 muestra la inactivación de la alfa-amilasa de B. licheniformis con cloramina T a pH 8,0 (AA20 = 0,65 mg/ml, M197A = 1,7 mg/ml, M197L = 1,7 mg/ml). Los datos indican que, cambiando la metionina en posición 197 por leucina o alanina, puede evitarse la inactivación de la alfa-amilasa. En cambio, como se muestra en la Fig. 14, a pH 4,0 sí que tiene lugar la inactivación de la M197A y M197L, pero requiere más equivalentes de cloramina T (Fig. 18; AA20 = 0,22 mg/ml, M197A = 4,3 mg/ml, M197L = 0,53 mg/ml; acetato sódico 200 mM a pH 4,0). Esto sugiere que un resto de triptófano está también implicado en el evento de la desactivación mediada por la cloramina T. Además el cartografiado tríptico y la subsiguiente secuenciación de aminoácidos indicó que el triptófano en posición 138 se oxidaba por la cloramina T (datos no mostrados). Para probar esto, se hicieron mutantes dirigidos al sitio en el triptófano 138, como se estipula a continuación:
Preparación de mutantes dobles W138 y M197 de alfa-amilasa
Ciertas variantes de W138 (F, Y y A) se hicieron como mutantes dobles, con M197T (hecho según la descripción del Ejemplo 3). Los mutantes dobles se hicieron siguiendo los métodos descritos en los Ejemplos 1 y 3. Generalmente, se prepararon cadenas negativas individuales de DNA a partir de un clon M13MP18 de la secuencia de codificación de 1,72 kb (Pst I-Sst I) del mutante M197T de la alfa-amilasa de B. licheniformis. Se hizo mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores listados a continuación, esencialmente por el método de Zoller, M. et al. (1983), excepto que la proteína 32 de gen T4 y polimerasa T4 sustituyeron al klenow. Los cebadores contenían todos ellos sitios únicos, así como la mutación deseada, con el fin de identificar los clones con la mutación apropiada.
Triptófano 138 por fenilalanina
42
Triptófano 138 por tirosina
43
Triptófano 138 por alanina
Este cebador construye también sitios únicos aguas arriba y aguas abajo de la posición 138
44
Los mutantes fueron identificados mediante análisis de restricción y el W138F y el W138Y fueron confirmados por secuenciación del DNA. La secuencia de W133A reveló una deleción de nucleótido entre los sitios únicos BspE I y Xma I; sin embargo el resto del gen secuenció correctamente. El fragmento SstII/SstI de 1,37 kb que contiene ambas mutaciones W138X y M197T fue trasladado de M13MP18 al vector de expresión pBLapr dando por resultado pBLapr (W138F, M197T) y pBLapr (W138Y, M197T). El fragmento que contiene sitios únicos BspE I y Xma I fue clonado en pBLapr (BspE I, Xma I, M197T) ya que es útil para clonar casetes que contienen otras sustituciones de aminoácidos en posición 138.
Mutaciones simples en la posición de aminoácido 138
Siguiendo los métodos generales descritos en los ejemplos anteriores, se hicieron ciertas variantes simples de W138 (F, Y, L, H y C).
El fragmento de 1,24 kb Asp718-SstI que contiene la mutación M197T en el plásmido pBLapr (W138X, M197T) del Ejemplo 7 fue reemplazado por el fragmento de tipo silvestre con metionina en 197, dando por resultado pBLapr (W138F), pBLapr (W138Y) y pBLapr (BspE I, Xma I).
Los mutantes W138L, W138H y W138C fueron hechos ligando casetes sintéticas en el vector pBLapr (BspE I, Xma I) usando los siguientes cebadores:
Triptófano 138 por leucina
45
Triptófano 138 por histidina
46
Triptófano 138 por cisteína
47
La reacción de los dobles mutantes M197T/W138F y M197T/ W138Y con cloramina T fue comparada con el tipo silvestre (AA20 = 0,75 mg/ml, M197T/W138F = 0,64 mg/ml, M197T/ W138Y = 0,60 mg/ml; acetato sódico 50 mM a pH 5,0). Los resultados mostrados en la Fig. 19 indican que la mutagénesis del triptófano 138 ha hecho que la variante sea más resistente a la cloramina T.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: GENENCOR INTERNATIONAL, INC.
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TITULO DE LA INVENCION: Alfa-amilasa mutante
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 68
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Genencor International, Inc.
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 4 Cambridge Place, 1870 Winton Road South
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Rochester
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: NY
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAIS: EE.UU.
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CP: 14618
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disco blando
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release nº1.0, Versión nº1.25
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
(D) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Sharon C. Baldock
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 3340
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 44411/400
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELEFONO: 44 171 404 5921
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 44 171 831 1768
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº:1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº:1:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATCAAAACA TAAAAAACCG GCCTTGGCCC CGCCGGTTTT TTATTATTT TGAGCT 
\hfill
56 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº:2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº:2:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TGGGACGCTG GCGCAGTACT TTGAATGGT 
\hfill
26 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº:3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº:3:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TGATGCAGTA CTTTGAATGG TACCTGCCCA ATGA 
\hfill
34 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº:4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº:4:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATTATTTGT TGTATGCCGA TATCGACTAT GACCAT 
\hfill
36 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº:5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº:5:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGGGGAAGGA GGCCTTTACG GTAGCT 
\hfill
26 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº:6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº:6:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GCGGCTATGA CTTAAGGAAA TTGC 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº:7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº:7:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CTACGGGGAT GCATACGGGA CGA 
\hfill
23 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº:8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº:8:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CTACGGGGAT TACTACGGGA CCAAGGGAGA CTCCC 
\hfill
35 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº:9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº:9:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCGGTGGGGC CAAGCGGGCC TATGTTGGCC GGCAAA 
\hfill
36 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº:10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº:10:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CATCAGCGTC CCATTAAGAT TTGCAGCCTG CGCAGACATG TTGCT 
\hfill
45 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº:11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº11:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATTATTTGT CGTATGCCGA TATCGACTAT GACCAT 
\hfill
36 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº12:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GGGAAGTTTC GAATGAAAAC G 
\hfill
21 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº13:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº13:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GTCGGCATAT GCATATAATC ATAGTTGCCG TTTTCATT 
\hfill
38 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº14:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº14:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGA TCTATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº15:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº15:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGT TCTATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº16:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº16:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGT TTTATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº17:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº17:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGA GCTATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº18:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº18:
\vskip0.666000\baselineskip
(xii)
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGC CTTATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº19:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº19:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGA CATATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº20:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº20:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGT ACTATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº21:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº21:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGC ACTATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº22:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº22:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGT GCTATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº23:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº23:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGC AATATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº24:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº24:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGA ACTATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº25:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº25:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GCAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGA AATATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº26:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº26:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGT ATTATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº27:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº27:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGT AATATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº28:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº28:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGT GTATTGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº29:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº29:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGT GGTATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº30:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº30:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGA GATATGCCGA C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº31:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1968 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº31:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AGCTTGAAGA AGTGAAGAAG CAGAGAGGCT ATTGAATAAA TGAGTAGAAA GCGCCATATC 
\hfill
60
5
6 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº32:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 483 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº32:
7
8
800 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº33:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 511 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº33:
9
900
10
1001
1000 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº34:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 520 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº34:
11
1101
1100
12 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº35:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 548 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº35:
13
1300
14 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº36:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 483 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº36:
15
16
1600
17 
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº37:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 487 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº37:
18
19
1900 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº38:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº38:
\sa{Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Thr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe}
\sac{Ala Leu Ile Pne Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Asn Leu}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº39:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº39:
\sa{Met Arg Ser Lys Thr Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu}
\sac{Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Gly Lys}
\sac{Ser}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº40:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº40:
\sa{Met Arg Ser Lys Thr Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu}
\sac{Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Ala Ala}
\sac{Ala Ala Asn}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº41:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº41:
\sa{Met Arg Ser Lys Thr Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu}
\sac{Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Asn Leu}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº42:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº42:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CACCTAATTA AAGCTTTCAC ACATTTTCAT TTT 
\hfill
33 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº43:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº43:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CACCTAATTA AAGCTTACAC ACATTTTCAT TTT 
\hfill
33 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº44:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº44:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCGCGTAATT TCCGGAGAAC ACCTAATTAA AGCCGCAACA CATTTTCATT TTCCCGGGCG 
\hfill
60 
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGGCAG 
\hfill
66 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº45:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº45:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCGGAGAACA CCTAATTAAA GCCCTAACAC ATTTTCATTT TC 
\hfill
42 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº46
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº46:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCGGAGAACA CCTAATTAAA GCCCACACAC ATTTTCATTT TC 
\hfill
42 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº47:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº47:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCGGAGAACA CCTAATTAAA GCCTGCACAC ATTTTCATTT TC 
\hfill
42 
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº48:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº48:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATGCAGTAT TTCGAACTGG TATA 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº49:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº49:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TGCCCAATGA TGGCCAACAT TGGAAG 
\hfill
26 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº50:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº50:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT CGTCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº51:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº51:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT CGCCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº52:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº52:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT AATCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº53:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº53:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT GATCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº54:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº54:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT CACCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº55:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº55:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT AAACCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº56:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº56:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT CCGCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº57:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº57:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT TCTCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº58:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº58:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAC ACTCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº59:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº59:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT GTTCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº60:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº60:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT TGTCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº61:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº61:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT CAACCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº62:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº62:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT GAACCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº63:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº63:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT GGTCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº64:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº64:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT ATTCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº65:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº65:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT TTTCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº66:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº66:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAC TGGCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº67:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº67:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGAATGGTAT TATCCCAATG ACGG 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC. Nº68:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CORDÓN: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC. Nº68:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCGTCATTGG GACTACGTAC CATT 
\hfill
24

Claims (18)

1. Una alfa-amilasa mutante elegida entre el grupo formado por:
(a)
una alfa-amilasa que es el producto de expresión de una secuencia de DNA mutada que codifica una alfa-amilasa, derivando la molécula de DNA mutada de una alfa-amilasa precursora de Bacillus licheniformis por sustitución de un aminoácido en posición M+15, y
(b)
una alfa-amilasa que es el producto de expresión de una secuencia de DNA mutada que codifica una alfa-amilasa, derivando la molécula de DNA mutada de una alfa-amilasa precursora que es una alfa-amilasa de Bacillus por sustitución de un aminoácido que corresponde en estructura primaria o bien en terciaria a M+15 en alfa-amilasa de Bacillus licheniformis.
mostrando dicha alfa-amilasa un perfil de comportamiento con el pH y/o con la temperatura alterado en comparación con la alfa-amilasa de Bacillus de tipo silvestre;
con la condición de que el aminoácido sustituyente no sea Leu, Ile, Asn, Ser, Gln, Asp ni Glu.
2. Una alfa-amilasa mutante según la reivindicación 1ª, que comprende además otra u otras mutaciones específicas del sitio.
3. Una alfa-amilasa mutante según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el precursor es de un Bacillus elegido entre el grupo de B. licheniformis, B. stearothermophilus y B. amyloliquefaciens.
4. Una alfa-amilasa mutante según la reivindicación 3ª, en la que el precursor es alfa-amilasa de Bacillus licheniformis.
5. El DNA que codifica una alfa-amilasa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª.
6. Vectores de expresión que codifican el DNA según la reivindicación 5ª.
7. Células hospedadoras transformadas con el vector de expresión según la reivindicación 6ª.
8. Una composición detergente que comprende una alfa-amilasa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª.
9. Una composición detergente según la reivindicación 8ª, que es una composición líquida, en gel o granular.
10. Una composición detergente según las reivindicaciones 8ª o 9ª, que comprende además una o más enzimas adicionales.
11. Una composición para la licuación del almidón, que comprende una alfa-amilasa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª.
12. Una composición detergente que comprende una alfa-amilasa mutante y una o más enzimas adicionales, en la que dicha alfa-amilasa mutante se elige entre el grupo formado por:
(a)
una alfa-amilasa que es el producto de expresión de una secuencia de DNA mutada que codifica una alfa-amilasa, derivando la molécula de DNA mutada de una alfa-amilasa precursora de Bacillus licheniformis por sustitución de un aminoácido en posición M+15, y
(b)
una alfa-amilasa que es el producto de expresión de una secuencia de DNA mutada que codifica una alfa-amilasa, derivando la molécula de DNA mutada de una alfa-amilasa precursora que es una alfa-amilasa de Bacillus por sustitución de un aminoácido que corresponde en estructura primaria o bien en terciaria a M+15 en alfa-amilasa de Bacillus licheniformis.
mostrando dicha alfa-amilasa un perfil de comportamiento con el pH y/o con la temperatura alterado en comparación con la alfa-amilasa de Bacillus de tipo silvestre.
13. La composición detergente según la reivindicación 12ª, en la que dicha alfa-amilasa mutante es M15L.
14. La composición detergente según las reivindicaciones 12ª o 13ª, en la que dicha alfa-amilasa mutante comprende otra u otras mutaciones específicas del sitio.
15. Una composición detergente según una cualquiera de las reivindicaciones 12ª a 14ª, en la que dicha enzima o dichas enzimas adicionales se eligen entre el grupo consistente en amilasas, proteasas, lipasas y celulasas.
16. Un método para licuar una suspensión de almidón granular procedente de un procedimiento de molienda húmeda o seca, a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6, que comprende:
(a)
añadir una cantidad efectiva de un mutante de alfa-amilasa a la suspensión;
(b)
opcionalmente, añadir una cantidad efectiva de un antioxidante a la suspensión; y
(c)
hacer reaccionar la suspensión durante un tiempo apropiado y a una temperatura apropiada para licuar el almidón;
en el que dicho mutante de alfa-amilasa mutante se elige entre el grupo formado por:
(a)
una alfa-amilasa que es el producto de expresión de una secuencia de DNA mutada que codifica una alfa-amilasa, derivando la molécula de DNA mutada de una alfa-amilasa precursora de Bacillus licheniformis por sustitución de un aminoácido en posición M+15, y
(b)
una alfa-amilasa que es el producto de expresión de una secuencia de DNA mutada que codifica una alfa-amilasa, derivando la molécula de DNA mutada de una alfa-amilasa precursora que es una alfa-amilasa de Bacillus por sustitución de un aminoácido que corresponde en estructura primaria o bien en terciaria a M+15 en alfa-amilasa de Bacillus licheniformis.
mostrando dicha alfa-amilasa un perfil de comportamiento con el pH y/o con la temperatura alterado en comparación con la alfa-amilasa de Bacillus de tipo silvestre.
17. Una composición para licuar almidón que comprende una alfa-amilasa mutante, en la que dicha alfa-amilasa mutante se elige entre el grupo formado por:
(a)
una alfa-amilasa que es el producto de expresión de una secuencia de DNA mutada que codifica una alfa-amilasa, derivando la molécula de DNA mutada de una alfa-amilasa precursora de Bacillus licheniformis por sustitución de un aminoácido en posición M+15, y
(b)
una alfa-amilasa que es el producto de expresión de una secuencia de DNA mutada que codifica una alfa-amilasa, derivando la molécula de DNA mutada de una alfa-amilasa precursora que es una alfa-amilasa de Bacillus por sustitución de un aminoácido que corresponde en estructura primaria o bien en terciaria a M+15 en alfa-amilasa de Bacillus licheniformis.
mostrando dicha alfa-amilasa un perfil de comportamiento con el pH y/o con la temperatura alterado en comparación con la alfa-amilasa de Bacillus de tipo silvestre.
18. La composición para licuar almidón según la reivindicación 17ª, en la que dicha alfa-amilasa mutante es M15L.
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