ES2331146T3 - Procedimientos y acidos nucleicos para el analisis de la expresion genetica asociada con el pronostico de los trastornos proliferativos de las celulas prostaticas. - Google Patents
Procedimientos y acidos nucleicos para el analisis de la expresion genetica asociada con el pronostico de los trastornos proliferativos de las celulas prostaticas. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para proporcionar un pronóstico a un sujeto con un trastorno proliferativo de las células de la próstata que comprende las siguientes etapas de: a. determinar el estado de metilación del gen PITX2 y/o sus regiones reguladoras en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto; y b. determinar a partir del mismo el pronóstico de dicho sujeto por el que la hipermetilación es un indicador de mal pronóstico.
Description
Procedimientos y ácidos nucleicos para el
análisis de la expresión genética asociada con el pronóstico de los
trastornos proliferativos de las células prostáticas.
Aspectos de la presente invención se refieren a
secuencias de ADN humano que exhiben patrones de expresión
heterogéneos en pacientes con cáncer de próstata, y más
particularmente a composiciones y procedimientos nuevos para
proporcionar un pronóstico de dichos pacientes.
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Se ha proporcionado un listado de secuencias,
según las Instrucciones Administrativas de PCT Parte 8, Sección
801(a), en un disco compacto (1 de 1) como un archivo de
texto de 3,25 MB (476_0001.txt).
\vskip1.000000\baselineskip
Cáncer de próstata. El cáncer de próstata
es la neoplasia más común entre los hombres en los Estados Unidos
(200.000 casos nuevos por año), y la sexta causa principal de
muertes relacionadas con el cáncer en varones en todo el mundo
(204.000 por año). El cáncer de próstata es principalmente una
enfermedad de los ancianos, con aproximadamente 16% de los hombres
entre las edades de 60 y 79 años que tienen la enfermedad. Según
algunas estimaciones en la autopsia, el 80% de los hombres mayores
de 80 años de edad tienen alguna forma de enfermedad de la próstata
(por ejemplo, cáncer, BPH, prostatitis, etc.). La hipertrofia
benigna de la próstata está presente en aproximadamente el 50% de
los hombres de 50 o más años de edad, y en el 95% de los hombres de
75 o más años de edad. El cáncer de próstata, basado en estos
informes, a menudo no es una enfermedad por la que los hombres
mueren, sino más comúnmente con la que mueren. Pruebas recientes
sugieren que la incidencia del cáncer de próstata puede de hecho
estar disminuyendo, probablemente como resultado de un mejor
tratamiento, de una mejor cirugía y de una detección más
temprana.
temprana.
Diagnóstico del cáncer de próstata; enfoques
moleculares. Las directrices actuales para la detección del
cáncer de próstata han sido sugeridas por la American Cancer Society
y son las siguientes: a los 50 años de edad, los profesionales
sanitarios deben ofrecer una prueba en sangre para el antígeno
específico de la próstata (PSA) y realizar un examen rectal digital
(DRE). Se recomienda que las poblaciones de alto riesgo, tales como
los afroamericanos y aquellos con antecedentes familiares de
enfermedad de la próstata, comiencen la detección a los 45 años de
edad. Los hombres sin patología anormal de la próstata tienen por lo
general un nivel de PSA en sangre inferior a 4 ng/ml. Los niveles
de PSA entre 4 ng/ml y 10 ng/ml (llamada la "zona gris") tienen
una posibilidad del 25% del tener cáncer de próstata. El resultado
es que el 75% de las veces, los hombres con un DRE anormal y un PSA
en esta zona gris tienen una biopsia negativa, o aparentemente
innecesaria. Por encima de la zona gris, la probabilidad de tener
cáncer de próstata es significativa (> 67%) y aumenta incluso a
medida que aumentan los niveles de PSA. Existen numerosos
procedimientos para medir el PSA (porcentaje de PSA libre,
velocidad del PSA, densidad del PSA, etc.), y cada uno tiene una
precisión asociada para la detección de la presencia de cáncer.
Todavía, incluso con las pequeñas mejoras en la detección, y los
descensos informados en la mortalidad asociados con la detección,
la frecuencia de positivos falsos sigue siendo alta. La
especificidad reducida es el resultado en parte del PSA aumentado en
sangre asociado con la BPH y la prostatitis. También se ha estimado
que hasta el 45% de las biopsias de próstata bajo las directrices
actuales tienen resultado falso negativo, dando como resultado la
sensibilidad disminuida incluso con la
biopsia.
biopsia.
La biopsia guiada transrectal TRUS se considera
el "estándar de referencia" para diagnosticar el cáncer de
próstata. Las recomendaciones para la biopsia se basan en los
niveles anormales de PSA y/o un examen rectal digital (DRE)
anormal. Para el PSA hay una zona gris donde un elevado porcentaje
de las biopsias quizás no sean necesarias. Con todo, la capacidad
para detectar el cáncer en esta zona gris (niveles de PSA de 4,0 a
10 ng/ml) es difícil sin la biopsia. Debido a esta falta de
especificidad, el 75% de los hombres que se someten a una biopsia
no tienen cáncer. Incluso sin la biopsia, aquellos con cáncer
podrían perderse, dando como resultado el aumento en la morbilidad
y mortalidad. Desafortunadamente, los riesgos asociados con una
biopsia innecesaria también son altos.
Los marcadores moleculares ofrecerían la ventaja
de que pueden utilizarse para analizar eficazmente incluso muestras
de tejido muy pequeñas, y las muestras de tejido cuya arquitectura
no se ha mantenido. Dentro de la última década, se han estudiado
numerosos genes con respecto a la expresión diferencial entre la
hiperplasia benigna de la próstata y diferentes grados del cáncer
de próstata. Sin embargo, no se ha demostrado que un marcador único
sea suficiente para la clasificación del pronóstico de los tumores
de próstata en un escenario clínico.
Como alternativa, los enfoques basados en ARNm
de grandes dimensiones pueden, en casos particulares, proporcionar
un medio para distinguir entre diferentes tipos de tumores y
lesiones benignas y malignas. Sin embargo la aplicación de tales
enfoques como herramienta de diagnóstico rutinaria en un escenario
clínico está impedida y sustancialmente limitada por la
inestabilidad extrema del ARNm, los rápidos cambios en la expresión
que se producen después de ciertos activadores (por ejemplo,
recogida de la muestra), y, lo que es más importante, por la gran
cantidad de ARNm necesaria para el ensayo que con frecuencia no
puede obtenerse de una biopsia de rutina (véase, por ejemplo,
Lipshutz, R. J. y col., Nature Genetics 21:20-24,
1999; Bowtell, D. D. L Nature genetics supl.
21:25-32, 1999).
La metilación genética aberrante en el cáncer de
próstata se ha observado en varios genes incluidos GSTPi, AR, p16
(CDKN2a/INK4a), CD44, CDH1. La amplia hipometilación del genoma por
ejemplo del elemento repetitivo LINE-1 también se
ha asociado con la progresión del tumor (Santourlidis, S., y col.,
Prostate 39:166 - 174,
1999).
1999).
Opciones de tratamiento del cáncer de
próstata. Hay numerosas estrategias de tratamiento disponibles
para los pacientes con diagnóstico de cáncer de próstata, y la
decisión para los pacientes y los médicos es con frecuencia poco
clara. Como el cáncer de próstata puede ser una enfermedad que se
desarrolla lentamente, muchos hombres eligen el enfoque de
tratamiento llamado espera vigilada, o el tratamiento conservador.
Como insinúan los nombres, este enfoque no incluye ninguna terapia
radical destinada a curar al paciente. En su lugar, la enfermedad
se controla cuidadosamente usando pruebas de PSA y DRE. El paciente
ideal para este enfoque es uno cuyo tumor es de crecimiento lento y
no invasivo, y quien probablemente muera por otras causas antes de
que el cáncer de próstata llegue a ser problemático.
Para los pacientes más jóvenes con la enfermedad
localizada, el tratamiento curativo es más adecuado. La
prostatectomía radical se utiliza para eliminar la próstata y con
esperanzas de eliminar todas las trazas del tumor. Las márgenes
quirúrgicas, las vesículas seminales, y algunas veces los nódulos
linfáticos se prueban para controlar la presencia de cáncer, y en
cada caso la presencia de cáncer se correlaciona con reducida
supervivencia libre de enfermedad. En general, aproximadamente el
70% de los hombres permanecen libres de enfermedad diez años
después de la cirugía (Roehl, y col., 2004). La prostatectomía
radical es una cirugía importante, con efectos laterales que
incluyen pérdida de sangre, incontinencia e impotencia. Se estima
que la tasa de complicaciones intraoperatorias y postoperatorias es
inferior al 2% (Lepor, y col., 2001).
La terapia de radiación se utiliza también para
intentar curar a los pacientes con cáncer de próstata. Los
pacientes pueden elegir la radiación externa del haz o la
braquiterapia (implantes de semillas radiactivas). Las tasas de
supervivencia y los efectos laterales son similares a los de la
prostatectomía radical (D'amico, y col., 1998). Tanto para la
prostatectomía radical como para la terapia de radiación, la
probabilidad de supervivencia es altamente dependiente del estadio
y la diferenciación del tumor. Es más probable que se curen los
tumores indolentes, localizados.
La terapia hormonal se usa frecuentemente para
los pacientes cuyo cáncer se ha propagado más allá de la próstata o
para los pacientes cuyo cáncer ha recurrido después de la
prostatectomía o la terapia de radiación. Es decir, la terapia
hormonal se utiliza para controlar el cáncer pero no para curarlo.
La terapia hormonal se utiliza algunas veces conjuntamente con
otras terapias tales como la radiación o como terapia neoadyuvante
antes de la cirugía. El objetivo de la terapia hormonal es reducir
el efecto estimulador de los andrógenos en el tumor de la próstata.
La reducción de hormonas se consigue con orquiectomía, análogos de
la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH), y
antiandrógenos. Los efectos laterales de la terapia hormonal
incluyen impotencia, sofocos, fatiga y libido reducida.
Eventualmente, los tumores de la próstata se vuelven insensibles a
los andrógenos y la terapia hormonal no es más eficaz.
Una vez que el tumor se ha propagado fuera de la
cápsula y la terapia hormonal ha fracasado, puede usarse la
quimioterapia para aliviar el dolor o retardar la progresión de la
enfermedad. La respuesta a la quimioterapia es variable, y la vida
se prolonga solamente para una minoría de pacientes. Los
bisfosfonatos se utilizan para reducir la actividad osteolítica de
los tumores metastatizados a los huesos.
Estimación del pronóstico del cáncer de
próstata. El DRE, la TRUS, la biopsia y el PSA proporcionan la
información inicial del estadio en el tumor, pero las exploraciones
de IRM y TC, las exploraciones de ProstaScint y las exploraciones
de huesos se utilizan para determinar la propagación del cáncer más
allá de la cápsula prostática. Estas pruebas no se utilizan en
todos los pacientes con cáncer de próstata, sino solamente en los
que tienen alguna probabilidad de metástasis. Si puede confirmarse
las metástasis, el paciente recibirá el tratamiento diseñado para
retardar la progresión de la enfermedad. Si no se detectan
metástasis, un paciente es un candidato para los tratamientos
potencialmente curativos tales como la prostatectomía y la terapia
de radiación. Antes de la extirpación de la próstata, algunas veces
se disecan los nódulos linfáticos como prueba final para detectar
las metástasis. Si hay metástasis presente en los nodos disecados,
la cirugía puede abortarse. El análisis del tejido extirpado
quirúrgicamente durante la prostatectomía es la técnica final y el
estándar de referencia para la estadificación para los pacientes
que elijen someterse a la cirugía. Con frecuencia, el análisis de
las muestras quirúrgicas muestra que el paciente estaba
originalmente subestadificado por las pruebas de diagnóstico
(Bostwick, 1997).
Una estimación exacta del pronóstico es crucial
para la selección del tratamiento más adecuado para cada paciente.
Puesto que el cáncer de próstata confinado al órgano no conduce a la
muerte, la estimación del pronóstico es también una estimación de
la presencia o de la probabilidad del desarrollo de metástasis. Un
paciente que tiene probabilidad de desarrollar cáncer fuera de la
cápsula prostática recibirá un estudio de diagnóstico más extenso,
incluyendo exploraciones de IRM y TC, y posiblemente tratamientos
más radicales, incluyendo la cirugía y la radiación.
Una evaluación inicial del pronóstico se hace a
partir de los resultados de una prueba de PSA, un DRE y un análisis
de la biopsia. El tamaño, la localización y el procedimiento de
detección se combinan para dar una puntuación de estadio en la
escala de TNM. Los pacientes con tumores de estadios más altos y
valores de PSA elevados tienen más probabilidad de tener cáncer que
se ha propagado o que se propagará fuera de la próstata. Un
análisis histológico de la biopsia permite que un patólogo determine
la puntuación de Gleason. La puntuación de Gleason es una
composición de los dos grados más predominantes en la muestra de
tejido, y los grados pueden variar entre uno y cinco. Un grado más
alto indica desdiferenciación más extrema, y las puntuaciones
compuestas más altas se correlacionan con una mayor probabilidad de
metástasis y reducida supervivencia libre de enfermedad.
Los nomogramas del cáncer de próstata se han
desarrollado y modificado para predecir el riesgo de recurrencia
del cáncer después de la terapia primaria en base a los niveles de
PSA, al grado de Gleason y la información preoperatoria del estadio
(Kattan y col., 2003; Kattan y col., 1998; Potter y col., 2001). Los
datos se obtienen de tasas reales de supervivencia de pacientes en
cohortes de miles de pacientes en múltiples instituciones. Como con
todas las mediciones de pronóstico en el cáncer de próstata, la
estimación del riesgo de recurrencia por el nomograma es también
una estimación de la probabilidad de presencia de cáncer fuera de la
cápsula prostática. Como las características clínicas de los
cánceres que están presentando los pacientes han cambiado con el
amplio uso del PSA, los nomogramas son anticuados y no se utilizan
ampliamente. Sin embargo, el procedimiento general de integrar
Gleason, el estadio y la información de PSA sigue utilizándose.
Los pacientes con cáncer que se ha propagado a
los nódulos linfáticos o a otros sitios metastásicos se tratan con
terapias sistémicas tales como las terapias hormonales. Los
pacientes con enfermedad localizada (T1-T3) son
candidatos para los tratamientos definitivos, curativos tales como
la cirugía o la radiación. Los pacientes con enfermedad localizada
que se cree que tiene riesgo bajo son candidatos ideales para la
espera vigilada. Los que tienen riesgo intermedio son ideales para
la monoterapia tal como la cirugía o la radiación. Los que tienen
enfermedad localizada con alto riesgo deben considerarse para las
terapias multimodales o para ensayos clínicos.
Después de la cirugía, está disponible más
información del pronóstico porque la propagación del tumor puede
analizarse directamente. Durante algunas prostatectomías, los
nódulos linfáticos son disecados directamente y se confirma el
estado de los nódulos. En todas las cirugías, se controlan la
propagación del tumor a las vesículas seminales y el estado de la
margen. Los nódulos, las vesículas seminales y las márgenes
positivos indican todos un pronóstico inferior y pueden sugerir que
el paciente debe recibir tratamiento adyuvante.
Marcadores moleculares del pronóstico del
cáncer de próstata; deficiencias de los enfoques de la técnica
anterior. Como alternativa a los enfoques actuales a la
clasificación del pronóstico de los pacientes con carcinoma de
próstata se están explorando actualmente una diversidad de enfoques
moleculares. Se anticipa que el desarrollo de marcadores
moleculares adecuados tendrá ventajas significativas en términos de
precisión, rentabilidad y/o invasividad del paciente sobre los
enfoques actuales. Se ha descubierto una diversidad de marcadores
moleculares que incluyen anticuerpos monoclonales. En un estudio de
Xu y col. (ICDB/95613763) 114 casos de cáncer de próstata mostraron
que el 57% de las muestras de médula ósea tenían niveles elevados de
OVX1 (mayores que 7,2 U/ml). En otros experimentos, los niveles de
OVX1 eran aproximadamente 2 veces más altos en las muestras de
suero de pacientes con cáncer de próstata independiente de los
andrógenos que en los dependientes de los andrógenos (p inferior a
0,001), sugiriendo que los niveles séricos de OVX1 pueden ser
capaces de predecir la progresión del cáncer de próstata, ya que
esta enfermedad cuando progresa llega a ser típicamente
independiente de los andrógenos. La expresión de la proteína PSCA y
del ARNm se han correlacionado positivamente con las
características adversas del tumor, tales como el aumento del grado
patológico (diferenciación celular pobre), el empeoramiento del
estadio clínico y la independencia de los andrógenos y de manera
especulativa con la carcinogénesis de la próstata (Jpn J Clin
Oncol, 4: 414-419, 2004). Otros marcadores de
análisis prospectivos del ARNm incluyen la Hepsina. La expresión de
la Hepsina mostró diferencias significativas entre los pacientes
con riesgo más bajo (pT2, G2 y puntuación de Gleason inferior a 7) y
con riesgo más alto (pT3/4, G3 y puntuación de Gleason 7 o
superior) para la recaída (J Urol, 171:
187-191,
2004).
2004).
El gen GSTPi es el marcador de diagnóstico del
carcinoma de próstata mejor caracterizado. Zhou y col. (J Urol,
171: 2195-2198, 2004) correlacionaron recientemente
la expresión del gen GSTPi con el grado de Gleason y el volumen del
cáncer. Además, el uso del gen GSTPi como marcador para la detección
de carcinomas de próstata localizados en las zonas periféricas (es
decir, con una alta probabilidad de metástasis) también se ha
descrito en el documento US 2004146868.
Otro marcador de metilación que puede ser
adecuado para la clasificación del pronóstico de los carcinomas de
próstata es uPA. Rabbani y col. (The FASEB Journal 17:
1081-1088, 2003) han mostrado que es el promotor de
uPA está hipermetilado en las células PrEC y LNCaP sensibles a
hormonas y está hipometilado en las células PC-3
insensibles a hormonas. La desmetilación del promotor en las líneas
celulares LNCaP dio lugar al aumento del análisis del ARNm y dio
como resultado un aumento en la capacidad invasiva. Singal y col.,
analizaron la metilación de un panel de genes constituido por
glutatión s-transferasa Pi1 (GSTP1), el receptor
beta del ácido retinoico (RARB), CD44, E-cadherina
(ECAD) y la proteína de la familia de asociación ras 1 (RASSF1A) en
el cáncer de próstata. Se calculó un índice de la metilación (IM)
como el número total de genes metilados, se observó un IM más alto
en la enfermedad en estadio III comparado con el estadio II, y en
las muestras con puntuación de Gleason 7 comparado con las muestras
con puntuación de Gleason 6. Singal y col. concluyeron de este modo
que los resultados sugieren que la metilación del panel de genes
está correlacionada con las características clinicopatológicas de
mal pronóstico.
Necesidad pronunciada en la técnica.
Significativamente, sin embargo, ninguno de los marcadores
mencionados hasta ahora está suficientemente desarrollado para
proporcionar un marcador para el pronóstico de los trastornos
proliferativos de las células de la próstata que sea suficientemente
potente y/o exacto para el uso eficaz en un escenario clínico.
Aunque el diagnóstico exacto del carcinoma de
próstata es importante, la necesidad más urgente en el tratamiento
del cáncer de próstata es la información para guiar la decisión de
la planificación del tratamiento. Los líderes en el campo convienen
que muchos pacientes con enfermedad clínicamente insignificante
reciben tratamientos radicales innecesarios tales como la
prostatectomía o la terapia de radiación. Sin embargo, el veinte por
ciento de los pacientes que reciben estos tratamientos curativos
experimentan recurrencia de la enfermedad. Una prueba molecular
podría ayudar a seleccionar los pacientes para la óptima elección
del tratamiento y de este modo reducir el tratamiento por exceso o
por defecto.
Actualmente la elección de la terapia se hace en
base a la probabilidad de propagación de la enfermedad. Los
pacientes con bajo riesgo son candidatos para la espera vigilada.
Los pacientes con riesgo medio y alto deben recibir cirugía o
radiación, y los pacientes con alto riesgo son candidatos para los
tratamientos adyuvantes adicionales. La estadificación, Gleason y
el PSA se usan actualmente para estimar este riesgo, pero la
información combinada de estas pruebas insuficiente. Son muy pocos
los pacientes a quienes se recomienda la espera vigilada porque los
médicos no pueden estar seguros de qué cánceres son indolentes.
Además, muchos pacientes que reciben monoterapia experimentan una
recurrencia.
La clasificación de Gleason actualmente
desempeña un papel principal en la evaluación del pronóstico. Los
pacientes con la enfermedad localizada y puntuaciones de Gleason
altas (8-10) siempre se someten a tratamientos
radicales. Los pacientes con puntuaciones de Gleason bajas
(2-5) tienen la opción de diferir el tratamiento
curativo y optar por la espera vigilada, no obstante muchos eligen
someterse a la terapia curativa enseguida después del diagnóstico.
Para los pacientes con las puntuaciones de Gleason en el intervalo
medio, que son la mayoría de los pacientes diagnosticados
actualmente, los médicos deben usar otros indicadores de pronóstico
menos fiables para obtener más
información.
información.
Hay por consiguiente una necesidad pronunciada
en la técnica de una prueba de pronóstico nueva, eficaz, y en
particular una que pueda predecir la probabilidad que un cáncer se
haya propagado fuera de la próstata o tenga probabilidad de hacerlo
basándose en los patrones de metilación de las muestras de biopsia.
Este tipo de información es altamente valioso en los procedimientos
de diagnóstico y planificación del tratamiento. Esta información se
usará inicialmente para alcanzar la decisión de si las pruebas de
imágenes son necesarias para comprobar si hay metástasis para un
estudio de diagnóstico completo. La cirugía es innecesaria para todo
paciente cuyo cáncer ya se haya propagado, pero si un paciente no
es seleccionado a para las pruebas de imágenes, las metástasis no
se detectarán hasta la cirugía o más tarde.
Además hay una necesidad pronunciada en la
técnica de una prueba molecular de clasificación para los trastornos
proliferativos de las células de la próstata nuevo y eficaz, y en
particular uno que será adecuado para el análisis de las muestras
de biopsias para mejorar la estratificación de los pacientes en
categorías de riesgo bajo, intermedio y alto para poder seleccionar
el plan de tratamiento óptimo para cada paciente. Con una
estratificación exacta, los pacientes y los médicos pueden elegir
la espera vigilada con confianza de que hay poco riesgo de
recurrencia temprana. Esta prueba, por consiguiente, reducirá el
número de cirugías y de tratamientos de radiación innecesarios.
Además, con mejores estimaciones de qué
pacientes tienen probabilidad de recaer con la monoterapia, los
médicos pueden hacer mejor uso de los tratamientos adyuvantes
disponibles. Si un paciente elige someterse a la cirugía, la prueba
puede repetirse en muestras de la prostatectomía para verificar la
evaluación de su necesidad de terapia adyuvante. Los beneficios de
los diferentes enfoques de terapias adyuvantes se están estudiando
aún en ensayos clínicos, y una prueba molecular podría proporcionar
información valiosa para estratificar a los pacientes para este
tratamiento adicional o para ensayos clínicos. PITX2 (factor de
transcripción 2 con homeodominio de tipo pareado), también conocido
como PTX2, RlEG1 o ARP 1, codifica un miembro de la familia de la
homeocaja RIEG/PITX, que es la clase bicoide de proteínas del
homeodominio. PITX2 codifica varias transcripciones alternativas, y
las mutaciones en el gen dan lugar al trastorno autosómico dominante
síndrome de Rieger, un trastorno del desarrollo que afecta de
manera predominante al ojo (Semina y col., 1996). La proteína actúa
como factor de transcripción y está implicada en el desarrollo de
varios órganos principales. Está inducida por la vía de WNT, y
media la proliferación específica de tipo celular induciendo los
genes de la regulación del crecimiento (Kioussi y col.,
2002).
2002).
Toyota y col., (2001) encontraron
hipermetilación del gen en una gran proporción de leucemias
mieloides agudas. Varios estudios del solicitante (véase el
documento WO 2005/059172) han demostrado que la hipermetilación de
PITX2 está asociada con mal pronóstico para los pacientes con cáncer
de mama.
El marcador GPR7 está localizado en una isla de
CpG en la región promotora de un gen sin intrones en el cromosoma
10. GPR7, o receptor 7 de la proteína G, es un receptor para el
neuropéptido W y el neuropéptido B (Shimomura y col., 2002; Tanaka
y col., 2003). Se ha estudiado la expresión de GPR7 en el cerebro, y
se expresa principalmente en el cerebelo y en la corteza frontal
(O'Dowd y col., 1995). lshii y col., (2003) estudiaron el fenotipo
de los ratones que carecen de una copia funcional de GPR7. Los
ratones desarrollaron obesidad de inicio en el adulto y defectos
metabólicos tales como disminución del gasto de energía y niveles
aumentados de glucosa y de insulina en sangre. Es interesante
señalar que estos fenotipos se detectaron solamente en ratones
machos. Los ligandos de GPR7, los neuropéptidos W y B, también se
han implicado en el metabolismo y en la obesidad en estudios
separados (Samson y col., 2004; Levine y col., 2005). GPR7, que es
similar en secuencia a los receptores de opioides, puede también
tener un papel en la señalización del dolor (Zaratin y col.,
2005).
SEC. ID Nº: 63 está localizada dentro de la
región reguladora de HIST2H2BF en el cromosoma 1 en una región con
varios genes de histonas. El contenido de histonas y el estado de la
cromatina pueden tener influencia en la expresión del gen
codificado. La metilación y la expresión alterada de un gen de
histona en el cáncer de próstata podrían causar cambios de la
cromatina a lo largo del genoma que alteran la expresión genética
en modos que dan como resultado propiedades más agresivas del tumor.
No hay artículos publicados sobre la función de esta histona en
particular.
El marcador denominado SEC. ID Nº: 35 está
localizado en el cromosoma 3 secuencia abajo del gen FOXL2 (factor
de transcripción de Forkhead) y dentro o próximo a los genes
predichos o ESTs. Aunque está secuencia abajo, se anticipa que
metilación de este marcador tiene efecto en la expresión de FOXL2,
que está mutado en el síndrome de blefarofimosis, ptosis y epicanto
inverso (BPES). Este síndrome está caracterizado por anormalidades
del ojo, craneofaciales y ováricas. La metilación del marcador
puede también afectar la expresión del EST, o puede mostrarse que
el EST es un exón alternativo para el gen FOXL2.
El documento WO 01/19845 da a conocer un
procedimiento para detectar un trastorno proliferativo celular (por
ejemplo, cáncer de próstata) en un sujeto que comprende: a) poner en
contacto una muestra que contiene ácido nucleico del sujeto con un
agente que proporciona una determinación del estado de metilación de
al menos un gen o de una región reguladora asociada del gen (por
ejemplo, PITX2); y b) identificar la metilación aberrante de
regiones del gen o de la región reguladora, en el que la metilación
aberrante se identifica por ser diferente cuando se compara con las
mismas regiones del gen o de la región reguladora asociada en un
sujeto que no tiene dicho trastorno proliferativo, detectando de
esta manera un trastorno proliferativo celular en el sujeto. El
documento WO 01/19845 no da a conocer un procedimiento para
proporcionar un pronóstico de un sujeto con un trastorno
proliferativo de las células de la próstata.
El documento EP 1 379 694 da a conocer
procedimientos, sistemas y productos de un programa de ordenador
para determinar el efecto biológico y/o la actividad de fármacos,
sustancias químicas y/o composiciones farmacéuticas usando su
efecto sobre la metilación del ADN como un marcador para
su(s) efecto(s) biológico(s). Se menciona el
PITX2. El documento WO 02/070742 da a conocer un procedimiento para
desarrollar paneles de genes para objetos de diagnóstico y
terapéuticos basados en la expresión y el estado de metilación de
genes específicos. Se menciona el PITX2. Finalmente, el documento
WO 2004/035803 también da a conocer un gen de PITX2 tratado
con
bisulfito.
bisulfito.
Ninguna de las referencias anteriores da a
conocer la asociación entre el patrón de metilación de PITX2 y el
pronóstico postquirúrgico de un trastorno proliferativo de las
células de la próstata, y que la metilación del gen de PITX2 puede
usarse para proporcionar dicho pronóstico de un trastorno
proliferativo de las células de la próstata.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona procedimientos
nuevos y eficaces y ácidos nucleicos para proporcionar un
pronóstico de los trastornos proliferativos de las células de la
próstata.
La invención resuelve esta necesidad de muchos
años en la técnica proporcionando un procedimiento para proporcionar
un pronóstico a un sujeto con un trastorno proliferativo de las
células de la próstata que comprende las siguientes etapas de: a)
determinar el estado de metilación del gen PITX2 y/o de sus regiones
reguladoras en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto; y b)
determinar a partir del mismo el pronóstico de dicho sujeto por el
que la hipermetilación es un indicador de mal pronóstico.
La presente invención está generalmente limitada
al análisis de la metilación del gen PITX2 y/o de sus regiones
reguladoras. Otros aspectos de preferencia de la presente invención
están reivindicados en las reivindicaciones 2 a 7.
La presente invención proporciona un
procedimiento para establecer los parámetros genéticos y/o
epigenéticos del ADN genómico. El procedimiento tiene utilidad para
la clasificación de pronóstico mejorada de los trastornos
proliferativos de las células de la próstata, permitiendo más
específicamente la mejor identificación y diferenciación entre las
formas agresivas y no agresivas de dicho trastorno. La invención
presenta varias mejoras sustanciales sobre el estado de la técnica.
Aunque se conocen algunos ensayos de metilación para la detección
del cáncer, actualmente no hay un sistema de clasificación
molecular para la clasificación del pronóstico de los tumores.
La fuente de ADN puede ser cualquier fuente
adecuada. De preferencia, la fuente de la muestra de ADN se
selecciona del grupo constituido por células o líneas celulares,
portaobjetos histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina,
líquidos biológicos, eyaculados, orina, sangre y sus combinaciones.
De preferencia, la fuente son biopsias, líquidos corporales,
eyaculados, orina o sangre.
Específicamente, la presente invención
proporciona un procedimiento para proporcionar un pronóstico de
trastornos proliferativos de las células de la próstata, que
comprende: obtener una muestra biológica que comprende
ácido(s)
nucleico(s) genómico(s); poner en contacto el(los) ácido(s) nucleico(s), o uno de sus fragmentos, con un reactivo o un kit con una pluralidad de reactivos suficientes, para distinguir entre secuencias de dinucleótidos CpG metiladas y no metiladas dentro del gen PITX.
nucleico(s) genómico(s); poner en contacto el(los) ácido(s) nucleico(s), o uno de sus fragmentos, con un reactivo o un kit con una pluralidad de reactivos suficientes, para distinguir entre secuencias de dinucleótidos CpG metiladas y no metiladas dentro del gen PITX.
De preferencia, dicha secuencia se selecciona
del grupo constituido por SEC. ID Nº 962-965.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestra un gráfico de ROC para un
ensayo MSP de SEC. ID Nº: 19 realizado en 26 muestras congeladas de
prostatectomía radical de pacientes con recurrencia de PSA temprana,
y en 30 muestras de pacientes sin recurrencia de PSA tras al menos
48 meses.
La Figura 2 muestra un gráfico de ROC para un
ensayo MSP de SEC. ID Nº: 35 realizado en 26 muestras congeladas de
prostatectomía radical de pacientes con recurrencia de PSA temprana,
y en 30 muestras de pacientes sin recurrencia de PSA tras al menos
48 meses.
La Figura 3 muestra un gráfico de ROC para un
ensayo MSP de SEC. ID Nº: 37 realizado en 26 muestras congeladas de
prostatectomía radical de pacientes con recurrencia de PSA temprana,
y en 30 muestras de pacientes sin recurrencia de PSA tras al menos
48 meses.
La Figura 4 muestra un gráfico de ROC para un
ensayo MSP de SEC. ID Nº: 7 realizado en 26 muestras congeladas de
prostatectomía radical de pacientes con recurrencia de PSA temprana,
y en 30 muestras de pacientes sin recurrencia de PSA tras al menos
48 meses.
La Figura 5 muestra un gráfico de ROC para un
ensayo MSP de SEC. ID Nº: 63 realizado en 26 muestras congeladas de
prostatectomía radical de pacientes con recurrencia de PSA temprana,
y en 30 muestras de pacientes sin recurrencia de PSA tras al menos
48 meses.
La Figura 6 muestra un gráfico de ROC para un
ensayo MSP de SEC. ID Nº: 8 realizado en 26 muestras congeladas de
prostatectomía radical de pacientes con recurrencia de PSA temprana,
y en 30 muestras de pacientes sin recurrencia de PSA tras al menos
48 meses.
La Figura 7 muestra un gráfico de ROC para un
ensayo MSP de SEC. ID Nº: 64 realizado en 26 muestras congeladas de
prostatectomía radical de pacientes con recurrencia de PSA temprana,
y en 30 muestras de pacientes sin recurrencia de PSA tras al menos
48 meses.
La Figura 8 muestra un análisis de
electroforesis en gel en 12 muestras de ADN. Se aplicaron 200 ng por
ADN a un gel de agarosa al 0,8%. El gel se sometió durante 4 horas
a 80 voltios. El marcador de tamaño (Invitrogen, Nº:
10496-016) contiene los siguientes fragmentos:
10.000 pb, 6.000 pb.
La Figura 9 muestra los análisis ALF Express de
los productos de PCR multiplex (8plex, Set D2 mPCR) comparado con
productos de PCR únicos (Set D2 sPCR). El patrón de tamaño (carriles
1, 4) contenía fragmentos de las siguientes longitudes: 50, 100,
150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 pb. Todos los fragmentos
podían amplificarse. Se observó un producto secundario indeseado
(220 pb).
La Figura 10 muestra el rendimiento de PCR
multiplex. Carril 1: marcador de 100 pb. Carril
2-11: rendimiento de PCR multiplex de 10 muestras
de prueba, carril 12: control positivo, carril 13: control
H_{2}O.
La Figura 11 muestra las muestras de tumores
frente a linfocitos, categorizadas por la estadística de Wilcoxon.
Los valores de p corregidos por Bonferroni (superior) y las AUC
(inferior) se muestran a la derecha de la matriz de datos. Cada
columna representa una muestra; cada fila un oligonucleótido. Los
oligonucleótidos se agrupan por candidato de marcador. Los
marcadores indicados están ordenados desde la parte superior hasta
la inferior con AUC crecientes. En el lado derecho de cada marcador
se dan los valores de p de Wilcoxon corregidos por Bonferroni y el
AUC. Debajo del AUC se da la sensibilidad a una especificidad de
-0,75 entre paréntesis. Los datos de metilación están centrados y
normalizados a una desviación estándar para los oligonucleótidos
individuales. El color representa la distancia relativa del estado
de metilación de oligonucleótidos del valor promedio. El gris claro
representa CpG hipometilados dentro de un oligonucleótido mientras
que el gris oscuro indica CpG hipermetilados dentro de un
oligonu-
cleótido.
cleótido.
La Figura 12 muestra la categorización de los
marcadores Gleason alto frente a Gleason bajo. El gráfico muestra
los valores de p sin corregir del análisis estadístico de la
categoría de Wilcoxon por genes. Las líneas punteadas inferior y
superior muestran los límites de Bonferroni y FDR del 5%,
respectivamente.
La Figura 13 muestra la matriz de metilación de
Gleason alto frente a Gleason bajo de los 10 marcadores con la
mejor AUC. Las puntuaciones de Gleason se muestran encima de cada
grupo de muestras. Cada columna representa una muestra; cada fila
un oligonucleótido (1, 2 ó 3 sitios de CpG cada uno). Los
oligonucleótidos están agrupados por candidato de marcador. Los
marcadores indicados están ordenados desde la parte superior hasta
la inferior con AUC crecientes. En el lado derecho de cada marcador
se dan los valores de p de Wilcoxon corregidos por Bonferroni y el
AUC. Debajo del AUC se da la sensibilidad a una especificidad de
-0,75 entre paréntesis. Los datos de metilación están centrados y
normalizados a una desviación estándar para los oligonucleótidos
individuales. El color representa la distancia relativa del estado
de metilación de oligonucleótidos del valor promedio. El gris claro
representa CpG hipometilados dentro de un oligonucleótido mientras
que el gris oscuro indica CpG hipermetilados dentro de un
oligonucleótido.
La Figura 14 muestra la categorización de los
marcadores de recurrencia temprana frente a sin recurrencia. El
gráfico da los valores de p sin corregir del análisis estadístico de
la categoría de Wilcoxon por genes. Las líneas punteadas inferior y
superior muestran los límites de Bonferroni y FDR del 5%,
respectivamente.
La Figura 15 muestra la matriz de metilación de
recurrencia temprana frente a sin recurrencia de los 10 marcadores
con la mejor AUC. Cada columna representa una muestra; cada fila un
oligonucleótido (1, 2 ó 3 sitios de CpG cada uno). Los
oligonucleótidos están agrupados por candidato de marcador. Los
marcadores indicados están ordenados desde la parte superior hasta
la inferior con AUC crecientes. En el lado derecho de cada marcador
se dan los valores de p de Wilcoxon corregidos por Bonferroni y el
AUC. Debajo del AUC se da la sensibilidad a una especificidad de
aproximadamente 0,75 entre paréntesis. Los datos de metilación están
centrados y normalizados a una desviación estándar para los
oligonucleótidos individuales. El color representa la distancia
relativa del estado de metilación de oligonucleótidos del valor
promedio. El gris claro representa CpG hipometilados dentro de un
oligonucleótido mientras que el gris oscuro indica CpG
hipermetilados dentro de un oligonucleótido.
Para las Figuras 16-88, cada
figura muestra la secuencia de la amplificación analizada de cada
SEC. ID Nº respectiva. En cada figura, se muestra un amplificado
analizado en una serie de paneles "delimitados", donde la
primera fila (fila superior) en cada panel muestra la secuencia
genómica que se está amplificando (la fila de la secuencia
genómica), y donde los cebadores de amplificación directo e inverso
(que definen un "amplicón") se muestran en la fila del panel
(la fila que muestra los cebadores) inmediatamente debajo de la
primera fila. La fila debajo de la fila que muestra los cebadores
(o, en los paneles que no muestran un cebador, la fila debajo de la
fila que muestra la secuencia genómica) es la secuencia de la
amplificación convertida con bisulfito (la fila de la secuencia
convertida con bisulfito; en la que las posiciones de CpG están
marcadas de rojo). Las filas restantes que se muestran en algunos
paneles, muestran las secuencias de oligonucleótidos de detección
(oligos CG y TG) usados para analizar la
amplificación.
amplificación.
La Figura 16 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 14.
La Figura 17 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 15.
La Figura 18 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 16.
La Figura 19 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 17.
La Figura 20 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 18.
La Figura 21 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 19.
La Figura 22 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 20.
La Figura 23 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 21.
La Figura 24 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 22.
La Figura 25 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 23.
La Figura 26 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 24.
La Figura 27 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 25.
La Figura 28 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 26.
La Figura 29 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 27.
La Figura 30 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 28.
La Figura 31 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 29.
La Figura 32 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 30.
La Figura 33 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 31.
La Figura 34 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 32 (amplificación A).
La Figura 35 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 32 (amplificación B).
La Figura 36 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 33.
La Figura 37 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 34.
La Figura 38 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 35.
La Figura 39 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 13.
La Figura 40 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 36.
La Figura 41 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 37.
La Figura 42 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 1.
La Figura 43 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 2.
La Figura 44 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 3.
La Figura 45 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 4.
La Figura 46 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 5.
La Figura 47 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 6.
La Figura 48 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 7.
La Figura 49 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 38.
La Figura 50 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 39.
La Figura 60 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 40.
La Figura 61 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 41.
La Figura 62 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 42.
La Figura 63 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 43.
La Figura 64 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 44.
La Figura 65 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 45.
La Figura 66 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 46.
La Figura 67 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 47.
La Figura 68 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 48.
La Figura 69 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 49.
La Figura 70 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 50.
La Figura 71 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 51.
La Figura 72 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 52.
La Figura 73 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 53.
La Figura 74 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 54.
La Figura 75 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 55.
La Figura 76 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 56.
La Figura 77 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 57.
La Figura 78 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 58.
La Figura 79 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 59.
La Figura 80 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 60.
La Figura 81 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 61.
La Figura 82 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 62.
La Figura 83 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 8.
La Figura 84 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 9.
La Figura 85 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 10.
La Figura 86 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 11.
La Figura 87 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 12 (amplificado A).
La Figura 88 muestra un amplificado de la SEC.
ID Nº: 12 (amplificado A).
La Figura 89 muestra la distribución de los
tiempos de seguimiento de los pacientes según se analizó en el
Ejemplo 5. Las barras blancas representan la distribución de todos
los pacientes excluidos (sin recaída de PSA). Las barras grises
muestran la distribución del tiempo de supervivencia libre de PSA
para todos los pacientes con recaída. La frecuencia se muestra en
el eje Y y el tiempo (meses) se muestra en el eje X.
La Figura 90 muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del marcador PITX2 (A
y B) y el análisis de la curva de ROC (C) del marcador PITX2 para
diferenciar entre pacientes con cáncer de próstata según el Ejemplo
5. La proporción de pacientes libres de recurrencia se muestra en el
eje Y, el tiempo en años se muestra en el eje X.
La Figura 91 muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del marcador GPR7 (A y
B) y el análisis de la curva de ROC (C) del marcador PITX2 para
diferenciar entre pacientes con cáncer de próstata según el Ejemplo
5. La proporción de pacientes libres de recurrencia se muestra en el
eje Y, el tiempo en años se muestra en el eje X.
La Figura 92 muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del marcador SEC. ID
Nº: 63 (A y B) y el análisis de la curva de ROC (C) del marcador
PITX2 para diferenciar entre pacientes con cáncer de próstata según
el Ejemplo 5. La proporción de pacientes libres de recurrencia se
muestra en el eje Y, el tiempo en años se muestra en el eje X.
La Figura 93 muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del marcador SEC. ID
Nº: 63 (A y B) y el análisis de la curva de ROC (C) del marcador
PITX2 para diferenciar entre pacientes con cáncer de próstata según
el Ejemplo 5. La proporción de pacientes libres de recurrencia se
muestra en el eje Y, el tiempo en años se muestra en el eje X.
La Figura 94 muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del marcador ABHD9 (A
y B) y el análisis de la curva de ROC (C) del marcador PITX2 para
diferenciar entre pacientes con cáncer de próstata según el Ejemplo
5. La proporción de pacientes libres de recurrencia se muestra en el
eje Y, el tiempo en años se muestra en el eje
X.
X.
La Figura 95 muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del marcador CCND2 (A
y B) y el análisis de la curva de ROC (C) del marcador PITX2 para
diferenciar entre pacientes con cáncer de próstata según el Ejemplo
5. La proporción de pacientes libres de recurrencia se muestra en el
eje Y, el tiempo en años se muestra en el eje
X.
X.
La Figura 96 muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del rendimiento de
PITX2 en subpoblaciones basadas en el estadio según el Ejemplo
5.
La Figura 97 muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del rendimiento de
PITX2 en subpoblaciones basadas en la puntuación de Gleason según
el Ejemplo 5.
La Figura 98 muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del rendimiento de
PITX2 en subpoblaciones basadas en la puntuación del nomograma
según el Ejemplo 5.
La Figura 99 muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del rendimiento de la
SEC. ID Nº: 63 en subpoblaciones basadas en la puntuación de
Gleason alto según el Ejemplo 5.
La Figura 100 muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del rendimiento de la
SEC. ID Nº: 63 en subpoblaciones basadas en la puntuación baja del
nomograma según el Ejemplo 5.
La Figura 101 muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del rendimiento de la
SEC. ID Nº: 35 en subpoblaciones T2 según el Ejemplo 5.
La Figura 102 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como PET en las comparaciones de
recaída bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando
el ensayo de SEC. ID Nº: 19 que se muestra en la Tabla 12 según se
detalla en el Ejemplo 6.
La Figura 103 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como PET en las comparaciones de
recaída bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando
el ensayo de SEC. ID Nº: 63 que se muestra en la Tabla 12 según se
detalla en el Ejemplo 6.
La Figura 104 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como PET en las comparaciones de
recaída bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando
el ensayo de SEC. ID Nº: 35 que se muestra en la Tabla 12 según se
detalla en el Ejemplo 6.
La Figura 105 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como PET en las comparaciones de
recaída bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando
el ensayo de SEC. ID Nº: 37 que se muestra en la Tabla 12 según se
detalla en el Ejemplo 6.
La Figura 106 muestra el amplificado detectado
sólo en las muestras de PET en las comparaciones de recaída
bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando el ensayo
de SEC. ID Nº: 19 que se muestra en la Tabla 12 según se detalla en
el Ejemplo 6.
La Figura 107 muestra el amplificado detectado
sólo en las muestras de PET en las comparaciones de recaída
bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando el ensayo
de SEC. ID Nº: 63 que se muestra en la Tabla 12 según se detalla en
el Ejemplo 6.
La Figura 108 muestra el amplificado detectado
sólo en las muestras de PET en las comparaciones de recaída
bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando el ensayo
de SEC. ID Nº: 35 que se muestra en la Tabla 12 según se detalla en
el Ejemplo 6.
La Figura 109 muestra el amplificado detectado
sólo en las muestras de PET en las comparaciones de recaída
bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando el ensayo
de SEC. ID Nº: 37 que se muestra en la Tabla 12 según se detalla en
el Ejemplo 6.
La Figura 110 muestra el amplificado detectado
sólo en las muestras congeladas en las comparaciones de recaída
bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando el ensayo
de SEC. ID Nº: 19 que se muestra en la Tabla 12 según se detalla en
el Ejemplo 6.
La Figura 111 muestra el amplificado detectado
sólo en las muestras congeladas en las comparaciones de recaída
bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando el ensayo
de SEC. ID Nº: 63 que se muestra en la Tabla 12 según se detalla en
el Ejemplo 6.
La Figura 112 muestra el amplificado detectado
sólo en las muestras congeladas en las comparaciones de recaída
bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando el ensayo
de SEC. ID Nº: 35 que se muestra en la Tabla 12 según se detalla en
el Ejemplo 6.
La Figura 113 muestra el amplificado detectado
sólo en las muestras congeladas en las comparaciones de recaída
bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando el ensayo
de SEC. ID Nº: 37 que se muestra en la Tabla 12 según se detalla en
el Ejemplo 6.
La Figura 114 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como PET en las comparaciones de
Gleason alto frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº:
19 que se muestra en la Tabla 12 según se detalla en el Ejemplo
6.
La Figura 115 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como PET en las comparaciones de
Gleason alto frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº:
63 que se muestra en la Tabla 12 según se detalla en el Ejemplo
6.
La Figura 116 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como PET en las comparaciones de
Gleason alto frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº:
35 que se muestra en la Tabla 12 según se detalla en el Ejemplo
6.
La Figura 117 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como PET en las comparaciones de
Gleason alto frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº:
19 que se muestra en la Tabla 37 según se detalla en el Ejemplo
6.
La Figura 118 muestra el amplificado detectado
sólo en muestras PET en las comparaciones de Gleason alto frente a
Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº: 19 que se muestra en la
Tabla 12 según se detalla en el Ejemplo
6.
6.
La Figura 119 muestra el amplificado detectado
sólo en muestras PET en las comparaciones de Gleason alto frente a
Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº: 63 que se muestra en la
Tabla 12 según se detalla en el Ejemplo
6.
6.
La Figura 120 muestra el amplificado detectado
sólo en muestras PET en las comparaciones de Gleason alto frente a
Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº: 35 que se muestra en la
Tabla 12 según se detalla en el Ejemplo
6.
6.
La Figura 121 muestra el amplificado detectado
sólo en muestras PET en las comparaciones de Gleason alto frente a
Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº: 37 que se muestra en la
Tabla 12 según se detalla en el Ejemplo
6.
6.
La Figura 122 muestra el amplificado detectado
sólo en muestras congeladas en las comparaciones de Gleason alto
frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº: 19 que se
muestra en la Tabla 12 según se detalla en el Ejemplo 6.
La Figura 123 muestra el amplificado detectado
sólo en muestras congeladas en las comparaciones de Gleason alto
frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº: 63 que se
muestra en la Tabla 12 según se detalla en el Ejemplo 6.
La Figura 124 muestra el amplificado detectado
sólo en muestras congeladas en las comparaciones de Gleason alto
frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº: 35 que se
muestra en la Tabla 12 según se detalla en el Ejemplo 6.
La Figura 125 muestra el amplificado detectado
sólo en muestras congeladas en las comparaciones de Gleason alto
frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº: 37 que se
muestra en la Tabla 12 según se detalla en el Ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Según se utiliza en el presente documento, el
término expresión deberá considerarse que significa la transcripción
y la traducción de un gen. El nivel de expresión de un gen puede
determinarse por el análisis de cualquiera de los factores
asociados con o indicadores del nivel de transcripción y traducción
de un gen, incluidos pero no limitados al análisis de la
metilación, la pérdida de heterocigosidad (en adelante denominada
LOH), los niveles de expresión del ARN y los niveles de expresión
de proteínas.
Además la actividad del gen transcrito puede
estar afectada por variaciones genéticas tales como, pero no
limitadas a, mutaciones genéticas (que incluyen pero no se limitan a
SNPs, mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, longitudes de
repetición, reestructuraciones y otros polimorfismos).
Según se utiliza en el presente documento, el
término "pronóstico" se toma como que significa una predicción
de la progresión de la enfermedad (por ejemplo, pero no limitado a,
la regresión, la estasis y la metástasis), en particular de la
agresividad y del potencial metastásico de un tumor de próstata.
Según se utiliza en el presente documento, el
término "marcador de pronóstico" se toma como que significa un
indicador de una predicción de la progresión de la enfermedad, en
particular de la agresividad y del potencial metastásico de un
tumor de próstata.
Según se utiliza en el presente documento, el
término "clasificación del pronóstico" se toma como que
significa la clasificación de un trastorno proliferativo de las
células de la próstata según una predicción de la progresión de la
enfermedad, en particular de la agresividad y del potencial
metastásico de un tumor de próstata.
De preferencia se utiliza definir a los
pacientes con riesgo alto, bajo e intermedio de muerte o recurrencia
posterior al tratamiento que es el resultado de la heterogeneidad
inherente del proceso de la enfermedad. Según se utiliza en el
presente documento, el término "agresivo" utilizado con
respecto al tumor de la próstata se toma como que significa un
trastorno proliferativo de las células de la próstata que tiene la
capacidad biológica para propagarse rápidamente fuera de la
próstata. Los indicadores de agresividad del tumor convencionales
en la técnica incluyen, pero no se limitan a, el estadio del tumor,
el grado del tumor, el grado de Gleason, el estado de los nódulos y
la supervivencia. Según se utiliza en el presente documento, el
término "supervivencia" no deberá limitarse al significado de
supervivencia hasta la mortalidad (en el que dicha mortalidad puede
ser independiente de la causa o estar relacionada con el trastorno
proliferativo de las células de la próstata) pero puede utilizarse
en combinación con otros términos para definir los términos
clínicos, por ejemplo, pero no limitados a "supervivencia libre
de recurrencia" (en el que donde el término recurrencia incluirá
tanto la recurrencia localizada como la distante); supervivencia
libre de metástasis; supervivencia libre de enfermedad (en el que
el término enfermedad incluirá el cáncer de próstata y las
enfermedades asociadas al mismo). La extensión de dicha
supervivencia puede calcularse por referencia a un punto inicial
definido (por ejemplo, el momento del diagnóstico o del inicio del
tratamiento) y un punto final definido (por ejemplo, la muerte, la
recurrencia o la metástasis).
El término "Relación Observada/Esperada"
("relación O/E") se refiere a la frecuencia de los
dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de ADN particular, y
corresponde a [número de sitios de CpG/(número de bases C x el
número de bases G)].
El término "isla de CpG" se refiere a una
región contigua de ADN genómico que cumple el criterio de (1) tener
una frecuencia de dinucleótidos CpG que corresponde a una
"relación observada/esperada" > 0,6, y (2) tener un
"contenido de GC" >0,5. Las islas de CpG tienen comúnmente,
pero no siempre, una longitud que varía desde aproximadamente 0,2
hasta aproximadamente 1 kb, o hasta aproximadamente 2 kb.
El término "estado de metilación" o
"estatus de metilación" se refiere a la presencia o ausencia de
5-metilcitosina ("5-mCyt") en
uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de
ADN. Los estados de metilación en uno o más sitios de metilación
CpG particulares (teniendo cada uno dos secuencias de dinucleótidos
CpG CpG) dentro de una secuencia de ADN incluyen "no
metilados", "totalmente metilados" y "
hemimetilados".
El término "hemi metilación" o
"hemimetilación" se refiere al estado de metilación de un sitio
de metilación CpG palindrómico donde solamente una citosina única
en una de las dos secuencias de dinucleótidos CpG del sitio de
metilación CpG palindrómico está metilada (por ejemplo,
5'-CC^{M}GG-3' (hebra superior):
3'-GGCC-5' (hebra inferior)).
El término "AUC" según se utiliza en el
presente documento es una abreviatura para el área bajo de una
curva. En particular se refiere al área bajo una curva
característica de operación de receptor (ROC, por sus siglas en
inglés). La curva de ROC es una gráfica de la tasa de positivos
verdaderos frente a la tasa de positivos falsos para los diferentes
puntos de corte posibles de una prueba de diagnóstico. Muestra el
intercambio entre la sensibilidad y la especificidad dependiendo
del punto de corte seleccionado (cualquier aumento en la
sensibilidad vendrá acompañado por una disminución en la
especificidad). El área bajo una curva de ROC (AUC) es una medición
de la exactitud de una prueba de diagnóstico (cuanto mayor sea el
área mejor será, óptima es 1, una prueba aleatoria tendría una
curva de ROC que está sobre la diagonal con un área de 0,5; para
referencia: J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis,
Academic Press, Nueva York, 1975).
El término "hipermetilación" se refiere al
estado de metilación promedio que corresponde a una presencia
aumentada de 5-mCyt en uno o una pluralidad de
dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de ADN de una muestra de
ADN de prueba, con relación con la cantidad de
5-mCyt encontrada en los dinucleótidos CpG
correspondientes dentro de una muestra de ADN de control
normal.
El término "hipometilación" se refiere al
estado de metilación promedio que corresponde a una presencia
disminuida de 5-mCyt en uno o una pluralidad de
dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de ADN de una muestra de
ADN de prueba, con relación a la cantidad de 5 mCyt encontrada en
los dinucleótidos CpG correspondientes dentro de una muestra de ADN
de control normal.
El término "micromatriz" se refiere
ampliamente a "micromatrices de ADN", y "chip(s) de
ADN", según lo reconocido en la técnica, comprende todos los
soportes sólidos reconocidos en la técnica, y comprende todos los
procedimientos para fijar las moléculas de ácido nucleico a los
mismos o la síntesis de los ácidos nucleicos sobre los mismos.
Los "parámetros genéticos" son mutaciones y
polimorfismos de genes y secuencias adicionales requeridas además
para su regulación. Se designarán como mutaciones, en particular,
inserciones, deleciones, mutaciones puntuales, inversiones y
polimorfismos y, particularmente de preferencia, SNP (polimorfismos
de nucleótido único).
Los "parámetros epigenéticos" son, en
particular, metilaciones de citosina. Otros parámetros epigenéticos
incluyen, por ejemplo, la acetilación de histonas que, sin embargo,
no pueden analizarse directamente usando el procedimiento descrito
pero que, a su vez, se correlacionan con la metilación de ADN.
El término "reactivo de bisulfito" se
refiere a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, sulfito de
hidrógeno o combinaciones de los mismos, útiles según se da a
conocer en el presente documento para distinguir entre las
secuencias de dinucleótidos CpG metiladas y no metiladas.
\newpage
El término "ensayo de metilación" se
refiere a cualquier ensayo para determinar el estado de metilación
de una o más secuencias de dinucleótidos CpG dentro de una
secuencia de ADN.
El término "MS.AP-PCR"
(reacción en cadena de la polimerasa cebada arbitrariamente sensible
a la metilación) se refiere a la tecnología reconocida en la
técnica que permite una exploración global del genoma usando los
cebadores ricos en GC para centrarse en las regiones que muy
probablemente contienen dinucleótidos CpG, y está descrita por
Gonzalgo y col., Cancer Research 57:594-599,
1997.
El término "MethyLight^{TM}" se refiere a
la técnica de PCR en tiempo real basada en la fluorescencia
reconocida en la técnica descrita por Eads y col., Cancer Res.
59:2302-2306, 1999.
El término ensayo "HeavyMethyl^{TM}", en
la forma de realización del mismo implementada en el presente
documento, se refiere a un ensayo, en el que las sondas de bloqueo
específico de metilación (también denominadas bloqueadores en el
presente documento) que cubren las posiciones de CpG entre, o
cubiertas por los cebadores de amplificación permiten la
amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de
ácido nucleico.
El término ensayo "HeavyMethyl^{TM}
MethyLight^{TM}", en la forma de realización del mismo
implementada en el presente documento, se refiere a un ensayo
HeavyMethyl^{TM} MethyLight^{TM}, que es una variación del
ensayo MethyLight^{TM}, en el que el ensayo MethyLight^{TM} se
combina con las sondas de bloqueo específicas de metilación que
cubren las posiciones de CpG entre los cebadores de
amplificación.
El término "Ms-SNuPE"
(extensión del cebador de nucleótido único sensible a la metilación)
se refiere al ensayo reconocido en la técnica descrito por Gonzalgo
y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997.
El término "MSP" (PCR específica de
metilación) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la
técnica descrito por Herman y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
93:9821-9826, 1996, y por la Patente de EEUU Nº
5.786.146.
El término "COBRA" (ensayo de restricción
por bisulfito combinado) se refiere al ensayo de metilación
reconocido en la técnica descrito por Xiong y Laird, Nucleic Acids
Res. 25:2532-2534, 1997.
El término "MCA" (amplificación de la isla
de CpG metilada) se refiere al ensayo de metilación descrito por
Toyota y col., Cancer Res. 59:2307-2312, 1999, y en
el documento WO 00/26401 A1.
El término "hibridación" debe entenderse
como un enlace de un oligonucleótido a una secuencia complementaria
a lo largo de las líneas de los pares de bases de
Watson-Crick en el ADN de la muestra, formando una
estructura
dúplex.
dúplex.
Las "condiciones de hibridación rigurosas",
según se define en el presente documento, implica la hibridación a
68ºC en 5x SSC/5x disolución de Denhardt/SDS al 1,0%, y el lavado en
0,2x SSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente, o implica su
equivalente reconocido en la técnica (por ejemplo, las condiciones
en las que una hibridación se realice a 60ºC en un tampón 2,5 x
SSC, seguido por varias etapas de lavado a 37ºC en una concentración
baja de tampón, y permanezca estable). Las condiciones
moderadamente rigurosas, según se define en el presente documento,
implican incluir el lavado en 3 x SSC a 42ºC, o su equivalente
reconocido en la técnica. Los parámetros de concentración de sal y
la temperatura pueden variarse para alcanzar el nivel óptimo de
identidad entre la sonda y el ácido nucleico diana. Las directrices
con respecto a tales condiciones están disponibles en la técnica,
por ejemplo, por Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y col.
(eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley
and Sons, N.Y.) en la Unidad
2.10.
2.10.
Los términos "matriz SEC. ID Nº", "matriz
compuesta SEC. ID Nº" o "secuencia de matriz compuesta" se
refieren a una secuencia, hipotética o de otra manera, constituida
por una composición lineal cabeza a cola (5' a 3') de todas las
secuencias contiguas individuales de una matriz sujeto (por ejemplo,
una composición cabeza a cola de SEC. ID Nº 1-17,
en ese orden).
Los términos "nodo de matriz SEC. ID Nº",
"nodo de matriz compuesta SEC. ID Nº" o "nodo de secuencia de
matriz compuesta" se refieren a una unión entre dos secuencias
contiguas individuales cualesquiera de la "matriz SEC. ID Nº",
"matriz compuesta SEC. ID Nº" o "secuencia de matriz
compuesta".
Con referencia a las secuencias de matriz
compuesta, la frase "nucleótidos contiguos" se refiere a una
región de secuencias contiguas de cualquier secuencia contigua
individual de la matriz compuesta, pero no incluye una región de la
secuencia de matriz compuesta que incluye un "nodo", según se
definió en el presente documento anterior-
mente.
mente.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona los marcadores
genéticos moleculares que tienen utilidad nueva para proporcionar
un pronóstico de los trastornos proliferativos de las células de la
próstata. En formas de realización particulares dichos marcadores
pueden utilizarse para clasificar el tumor según la agresividad y/o
invasividad. Es particularmente de preferencia que el procedimiento
y los ácidos nucleicos según de la invención se utilicen para el
pronóstico de los trastornos proliferativos de las células de la
próstata.
El término "pronóstico" se toma como que
significa una predicción del resultado de la progresión de la
enfermedad (en el que el término progresión deberá tomarse
incluyendo también la recurrencia posterior al tratamiento). El
pronóstico puede expresarse en términos de supervivencia global del
paciente, supervivencia libre de enfermedad o de recaída, aumento
de las complicaciones relacionadas con el tumor y la velocidad de
progresión del tumor o de la metástasis, en el que una disminución
en cualquiera de dichos factores (a excepción del aumento de las
complicaciones relacionadas con el tumor y la velocidad de
progresión) en comparación con un nivel predeterminado, es un
resultado "negativo" y el aumento de los mismos es un resultado
"positivo". Una disminución en las complicaciones relacionadas
con el tumor y/o en la velocidad de progresión del tumor o de la
metástasis en comparación con un nivel predeterminado, se considera
un resultado "positivo" y el aumento de los mismos es un
resultado "negativo".
De aquí en adelante puede también hacerse
referencia al pronóstico en términos de "agresividad" en el que
se determina que un cáncer agresivo tiene riesgo alto de resultado
negativo y en el que un cáncer no agresivo tiene un riesgo bajo de
resultado negativo.
En un aspecto el marcador de pronóstico según la
presente invención se utiliza para proporcionar una estimación del
riesgo de resultado negativo. La caracterización de un cáncer de
próstata en términos de resultado predicho permite al médico
determinar el riesgo de recurrencia y/o muerte. Esto ayuda en la
selección del tratamiento ya que la reducción absoluta del riesgo
de recurrencia y muerte posterior al tratamiento, tal como la
terapia hormonal adyuvante, quimioterapia y terapia de radiación,
puede determinarse en base al resultado negativo predicho. La
reducción absoluta del riesgo atribuible al tratamiento puede
compararse posteriormente con los inconvenientes de dicho
tratamiento (por ejemplo, efectos laterales, coste) para determinar
la idoneidad de dicho tratamiento para el paciente. Por el
contrario, en el caso de un cáncer se caracteriza como no agresivo
(es decir, resultado positivo con bajo riesgo de muerte y/o
recurrencia) el paciente obtendrá poco beneficio absoluto del
tratamiento adyuvante u otro tratamiento y puede tratarse
adecuadamente por medio de la espera vigilada. En esto se basa una
gran ventaja de la presente invención. Proporcionando un medio para
determinar qué pacientes no se beneficiarán significativamente del
tratamiento, la presente invención identifica candidatos adecuados
para la espera vigilada y evita la prescripción excesiva de
terapias.
terapias.
Según el resultado predicho (es decir, el
pronóstico) de la enfermedad puede seleccionarse un tratamiento o
tratamientos adecuados. En el caso de un cáncer se caracteriza como
agresivo es particularmente de preferencia que se proporcione el
tratamiento adyuvante tal como, pero no limitado a, terapia
hormonal, quimioterapia o terapia de radiación además o en lugar de
otros tratamientos.
Los marcadores descritos en el presente
documento tienen otra utilidad en la predicción del resultado de un
paciente después del tratamiento quirúrgico. De aquí en adelante se
hará referencia a esto también como un marcador "predictivo".
La sobreexpresión de los genes según la Tabla 11 (en particular
FOXL2, SEC. ID Nº: 35, SEC. ID Nº: 63, HIST2H2BF, GPR7 y de más
preferencia PITX2), está asociada con resultado negativo de los
pacientes con cáncer de próstata. Los pacientes con resultado
positivo predicho (es decir, hipometilación o sobreexpresión)
después de dicho tratamiento tendrán por consiguiente una disminuida
reducción absoluta del riesgo de recurrencia y muerte posterior al
tratamiento con terapias adyuvantes postquirúrgicas. Los pacientes
con resultado negativo predicho (es decir, hipermetilación) después
de dicho tratamiento tendrán por consiguiente una reducción
absoluta relativamente mayor del riesgo de recurrencia y muerte
después del tratamiento adyuvante postquirúrgico. Por consiguiente,
los pacientes con un resultado negativo después de dicho tratamiento
se considerarán candidatos más adecuados para el tratamiento
adyuvante que los pacientes con un resultado positivo. Por
consiguiente, puede evitarse la prescripción excesiva de tratamiento
adyuvante en los pacientes con un resultado positivo.
La modificación con bisulfito del ADN es una
herramienta reconocida en la técnica usada para evaluar el estado
de metilación de CpG. La 5-metilcitosina es la
modificación de base covalente más frecuente en el ADN de las
células eucariotas. Tiene una función, por ejemplo, en la regulación
de la transcripción, en la impronta genética, y en la
tumorigénesis. Por consiguiente, la identificación de
5-metilcitosina como componente de la información
genética es de interés considerable. Sin embargo, las posiciones de
la 5-metilcitosina no pueden ser identificadas por
secuenciación, debido a que la 5-metilcitosina tiene
el mismo comportamiento de emparejamiento de bases que la citosina.
Por otra parte, la información epigenética que porta
5-metilcitosina se pierde totalmente durante, por
ejemplo, la amplificación por PCR.
El procedimiento usado más frecuentemente para
analizar la presencia de 5-metilcitosina del ADN se
basa en la reacción específica del bisulfito con citosina por la
que, tras la hidrólisis alcalina posterior, la citosina se
convierte en uracilo que corresponde a timina en su comportamiento
de emparejamiento de bases. Significativamente, sin embargo, la
5-metilcitosina permanece sin modificar bajo estas
condiciones. Por consiguiente, se convierte el ADN original de una
manera tal que la metilcitosina, que originalmente no se podría
distinguir de la citosina por su comportamiento de hibridación,
ahora puede detectarse como la única citosina restante usando las
técnicas biológicas moleculares convencionales reconocidas en la
técnica, por ejemplo, por la amplificación e hibridación, o
secuenciación. Todas estas técnicas se basan en las propiedades
diferenciales de emparejamientos de bases, que ahora pueden
explotarse completamente.
La técnica anterior, en términos de
sensibilidad, se define por un procedimiento que comprende incluir
el ADN a analizar en una matriz de agarosa, evitando de ese modo la
difusión y renaturalización del ADN (el bisulfito reacciona
solamente con el ADN monocatenario), y se sustituyen todas las
etapas de precipitación y purificación por diálisis rápida (Olek A,
y col., A modified and improved method for bisulfite based cytosine
methylation analysis, Nucleic Acids Res.
24:5064-5056, 1996). De esta manera es posible
analizar el estado de metilación de las células individuales,
ilustrando la utilidad y sensibilidad del procedimiento. Una
descripción de los procedimientos reconocidos en la técnica para
detectar 5-metilcitosina está proporcionada por
Rein, T., y col., Nucleic Acids Res., 26:2255,
1998.
1998.
La técnica de bisulfito, salvo algunas
excepciones (por ejemplo, Zeschnigk M, y col., Eur J Hum Genet.
5:94-98, 1997), se utiliza actualmente sólo en la
investigación. En todos los casos, los fragmentos específicos cortos
de un gen conocido son amplificados posteriormente a un tratamiento
con bisulfito, y secuenciados totalmente (Olek y Walter, Nat Genet.
1997 17:275-276, 1997), sometidos a una o más
reacciones de extensión de cebador (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids
Res., 25:2529-2531, 1997; documento WO 95/00669;
Patente de EEUU Nº 6.251.594) para analizar las posiciones de
citosina individuales, o tratados por digestión enzimática (Xiong y
Laird, Nucleic Acids Res., 25:2532-2534, 1997). La
detección por hibridación también se ha descrito en la técnica
(Olek y col., documento WO 99/28498). Además, se ha descrito el uso
de la técnica de bisulfito para la detección de metilación con
respecto a los genes individuales (Grigg y Clark, Bioessays,
16:431-436, 1994; Zeschnigk M, y col., Hum Mol
Genet, 6:387-395, 1997; Feil R, y col., Nucleic
Acids Res., 22:695, 1994; Martin V, y col., Gene,
157:261-264, 1995; documentos WO 9746705 y WO
9515373).
La presente invención proporciona el uso de la
técnica de bisulfito, en combinación con uno o más ensayos de
metilación, para la determinación del estado de metilación de las
secuencias de dinucleótidos CpG dentro de secuencias desde SEC ID
Nº: 961. Según la presente invención, la determinación del estado de
metilación de las secuencias de dinucleótidos CpG dentro de la SEC
ID Nº: 961 tiene utilidad como pronóstico.
Procedimientos del ensayo de metilación.
Se conocen diversos procedimientos de ensayo de metilación en la
técnica, y pueden utilizarse en combinación con la presente
invención. Estos ensayos permiten la determinación del estado de
metilación de uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG (por
ejemplo, islas de CpG) dentro de una secuencia de ADN. Tales
ensayos implican, entre otras técnicas, la secuenciación de ADN del
ADN tratado con bisulfito, PCR (para la amplificación específica de
secuencia), análisis de transferencia Southern, y el uso de enzimas
de restricción sensibles a la metilación.
Por ejemplo, la secuenciación genómica se ha
simplificado para el análisis de los patrones de metilación de ADN
y la distribución de 5-metilcitosina usando el
tratamiento con bisulfito (Frommer y col., Proc. Nat. Acad. Sci.
U.S.A. 89:1827-1831, 1992). Además, se utiliza la
digestión con enzimas de restricción de los productos de PCR
amplificados a partir del ADN convertido con bisulfito, por ejemplo,
el procedimiento descrito por Sadri y Hornsby (Nucl. Acids Res.
24:5058-5059, 1996), o COBRA (análisis por
restricción combinado con bisulfito) (Xiong y Laird, Nucleic Acids
Res. 25:2532-2534, 1997).
COBRA. El análisis COBRA^{TM} es un ensayo de
metilación cuantitativo útil para determinar los niveles de
metilación del ADN en los lugares genéticos específicos en
cantidades pequeñas de ADN genómico (Xiong y Laird, Nucleic Acids
Res. 25:2532-2534, 1997). En resumen, la digestión
mediante enzimas de restricción se utiliza para revelar las
diferencias entre secuencias dependientes de la metilación en los
productos de PCR del ADN tratado con bisulfito sódico. Las
diferencias entre secuencias dependientes de la metilación primero
se introducen en el ADN genómico por tratamiento con bisulfito
convencional de acuerdo con el procedimiento descrito por Frommer y
col. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:1827-1831,
1992). La amplificación por PCR del ADN convertido con bisulfito se
realiza a continuación usando los cebadores específicos para las
islas de CpG de interés, seguida por la digestión con endonucleasas
de restricción, electroforesis en gel, y la detección usando las
sondas específicas de hibridación marcadas. Los niveles de
metilación en la muestra de ADN original se representan por las
cantidades relativas del producto de PCR digerido y no digerido de
una manera linealmente cuantitativa a través de un espectro amplio
de los niveles de metilación de ADN. Además, esta técnica puede
aplicarse confiablemente al ADN obtenido de las muestras de tejido
incluido en parafina microdiseccionadas. Los reactivos típico por
ejemplo, como pueden encontrarse en un kit típico basado en COBRA)
para el análisis COBRA pueden incluir, pero no se limitan a:
cebadores de PCR para gen específico (o secuencias de ADN tratadas
con bisulfito o isla de CpG); enzima de restricción y tampón
adecuado; oligos de hibridación de genes; oligos de hibridación de
control; kit de marcación de cinasas para la sonda de oligos; y
nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión con
bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN, tampón
de sulfonación; reactivos o kit de recuperación de ADN (por
ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad);
tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de
ADN.
ADN.
De preferencia, los ensayos tales como
"MethyLight^{TM}" (una técnica de PCR en tiempo real basada
en la fluorescencia) (Eads y col., Cancer Res.
59:2302-2306, 1999), reacciones de
Ms-SNuPE (extensión con cebadores de nucleótido
único sensible a la metilación) (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids
Res. 25:2529-2531, 1997), PCR específica de
metilación ("MSP"; Herman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
93:9821-9826, 1996; Patente de EEUU Nº 5.786.146),
y amplificación de las islas de CpG metiladas ("MCA"; Toyota y
col., Cancer Res. 59:2307-2312, 1999) se usan solos
o en combinación con otro de estos procedimientos.
MethyLight^{TM}. El ensayo
MethyLight^{TM} es un ensayo cuantitativo de metilación de alto
rendimiento que utiliza la tecnología de PCR en tiempo real basada
en fluorescencia (TaqMan^{TM}) que no requiere ninguna otra
manipulación después de la etapa de PCR (Eads y col., Cancer Res.
59:2302-2306, 1999). En resumen, el proceso
MethyLight^{TM} comienza con una muestra mezclada de ADN genómico
que se convierte, en una reacción con bisulfito sódico, en una
combinación mezclada de las diferencias secuencias dependientes de
la metilación de acuerdo con los procedimientos convencionales (el
proceso del bisulfito convierte los residuos de citosina sin
metilar en uracilo). Después se realiza una PCR basada en la
fluorescencia en una reacción de PCR "no sesgada" (con
cebadores que no solapan los sitios de metilación de CpG conocidos),
o en una reacción "sesgada" (con cebadores de PCR que solapan
los dinucleótidos CpG conocidos). La distinción entre las secuencias
puede producirse tanto a nivel del proceso de amplificación como a
nivel del proceso de detección de la fluorescencia, o ambos.
El ensayo MethyLight^{TM} puede utilizarse
como una prueba cuantitativa de los patrones de metilación en la
muestra del ADN genómico, en la que la distinción de la secuencia se
produce a nivel de hibridación de sonda. En esta versión
cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación no
sesgada en presencia de una sonda fluorescente que solapa un sitio
de metilación putativo particular. Se proporciona un control no
sesgado para la cantidad de ADN de entrada por una reacción en la
que ni los cebadores, ni la sonda cubren ningún dinucleótido CpG.
Como alternativa, se logra una prueba cualitativa para la metilación
genómica sondando la combinación de PCR sesgada con cualquier
oligonucleótido de control que "no cubre" los sitios de
metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de la
"MSP2"), o con los oligonucleótidos que cubren los sitios
potenciales de metilación.
El proceso MethyLight^{TM} puede usarse con
una sonda "TaqMan®" en el proceso de amplificación. Por
ejemplo, el ADN genómico de doble hebra se trata con bisulfito
sódico y se somete a una de las dos series de reacciones de PCR
usando la sonda TaqMan®; por ejemplo, con cebadores sesgados y sonda
TaqMan® o con cebadores no sesgados y sonda TaqMan®. La sonda
TaqMan® está marcada doblemente con moléculas fluorescentes
"informadora" e "inactivadora", y se diseña para que sea
específica para una región con un contenido en CG relativamente alto
de modo que se fusiona a aproximadamente una temperatura 10ºC
superior en el ciclo de PCR que los cebadores directos o inversos.
Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca hibridada completamente
durante la etapa de hibridación/extensión de la PCR. Puesto que la
polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una hebra nueva durante la
PCR, alcanzará finalmente la sonda TaqMan® hibridada. La actividad
de endonucleasa de 5' a 3' de la polimerasa Taq después desplazará
a continuación la sonda TaqMan® digiriéndola para liberar la
molécula informadora fluorescente para la detección cuantitativa de
su ahora señal no inactivada usando un sistema de detección en
tiempo real
fluorescente.
fluorescente.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como pueden
encontrarse en un kit típico basado en MethyLight^{TM}) para el
análisis MethylLight^{TM} pueden incluir, pero no se limitan a:
cebadores de PCR para los genes específicos (o secuencia de ADN
tratado con bisulfito o isla de CpG); sondas TaqMan®; cebadores de
PCR optimizados y desoxinucleótidos; y polimerasa Taq.
Ms-SNuPE. La técnica
Ms-SNuPE es un procedimiento cuantitativo para
evaluar las diferencias de metilación en sitios de CpG específicos
basado en el tratamiento con bisulfito del ADN, seguido por la
extensión con cebador de nucleótido único (Gonzalgo y Jones,
Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997). En resumen,
el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito sódico para
convertir la citosina sin metilar en uracilo dejando al mismo
tiempo la 5-metilcitosina sin cambios. La
amplificación de la secuencia diana deseada se realiza a
continuación usando los cebadores de PCR específicos para el ADN
convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y se
utiliza como patrón para el análisis de metilación en el(los)
sitio(s) de CpG de interés. Pueden analizarse pequeñas
cantidades de ADN (por ejemplo, cortes patológicos
microdiseccionados), y se evita la utilización de las enzimas de
restricción para determinar el estado de metilación en los sitios
de CpG.
Los reactivos típicos (por ejemplo, que pueden
encontrarse en un kit típico basado en Ms-SNuPE)
para el análisis Ms-SNuPE pueden incluir, pero no
se limitan a: cebadores de PCR para el gen específico (o secuencia
de ADN tratada con bisulfito o isla de CpG); tampones de PCR y
desoxinucleótidos optimizados; kit de extracción en gel; cebadores
de control positivo; cebadores de Ms-SNuPE para el
gen específico; tampón de reacción (para la reacción de
Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados. Además, los
reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de
desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kit de
recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración,
columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de
recuperación de
ADN.
ADN.
MSP. MSP (PCR específica de metilación) permite
la evaluación del estado de metilación de virtualmente cualquier
grupo de sitios de CpG dentro de una isla de CpG, independiente del
uso de las enzimas de restricción sensibles a la metilación (Herman
y col. Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A. 93:9821-9826,
1996; Patente de EEUU Nº 5.786.146). En resumen, el ADN se modifica
mediante bisulfito sódico que convierte todas las citosinas sin
metilar en uracilo, y posteriormente se amplifica con los cebadores
específicos para ADN metilado frente a no metilado. MSP requiere
solamente cantidades pequeñas de ADN, es sensible a 0,1% de alelos
metilados de un locus dado de la isla de CpG, y puede realizarse en
el ADN extraído de muestras incluidas en parafina. Los reactivos
típicos (por ejemplo, como pueden encontrarse en un kit típico
basado en MSP) para el análisis de MSP pueden incluir, pero no se
limitan a: cebadores de PCR metilados y sin metilar para el gen
específico (o secuencia de ADN tratado con bisulfito o isla de
CpG), tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos, y sondas
específicas.
MCA. La técnica de MCA es un
procedimiento que puede usarse para seleccionar patrones alterados
de metilación en ADN genómico, y para aislar las secuencias
específicas asociadas con estos cambios (Toyota y col., el Cancer
Res. 59: 2307-2312, 1999). En resumen, se usan
enzimas de restricción con diferentes sensibilidades a la metilación
de la citosina en sus sitios de reconocimiento para digerir ADN
genómico de tumores primarios, de líneas celulares y de tejidos
normales antes de la amplificación por PCR cebada arbitrariamente.
Los fragmentos que muestran metilación diferencial se clonan y se
secuencian tras resolver los productos de PCR en geles de
poliacrilamida de alta resolución. Los fragmentos clonados se
utilizan a continuación como sondas para que análisis Southern para
confirmar la metilación diferencial de estas regiones. Los reactivos
típicos (por ejemplo, como pueden encontrarse en un kit típico
basado en MCA) para el análisis de MCA pueden incluir, pero no se
limitan a: cebadores de PCR para cebado arbitrario de ADN genómico;
tampones de PCR y nucleótidos, enzimas de restricción y tampones
adecuados; oligos o sondas de hibridación de genes; oligos o sondas
de hibridación de control.
Se determinó que las secuencias genómicas según
SEC. ID Nº: 961 sus variantes tratadas que no se presentan en la
naturaleza según SEC. ID Nº: 962-965 tienen utilidad
para proporcionar un pronóstico de los trastornos proliferativos de
las células de la próstata.
Resulta particularmente de preferencia el uso de
micromatrices. El proceso de análisis de micromatrices puede
dividirse en dos partes principales. En primer lugar está la
inmovilización de secuencias de genes conocidos en portaobjetos de
vidrio u otro soporte sólido seguido por la hibridación de ADNc
marcado fluorescentemente (que comprende las secuencias a
investigar) a los genes conocidos inmovilizados sobre el
portaobjetos de vidrio. Tras la hibridación, las matrices pueden
explorarse usando un analizador de microensayos fluorescentes. El
análisis de la intensidad de fluorescencia relativa de diferentes
genes proporciona una medida de la diferencia en la expresión
genética. Las matrices de ADN pueden generarse inmovilizando
oligonucleótidos presintetizados en portaobjetos de vidrio
preparado. En este caso, se fabrican secuencias representativas del
gen y se preparan usando procedimientos convencionales de síntesis
y purificación de oligonucleótidos. Estas secuencias genéticas
sintetizadas son complementarias a los genes de interés (de más
preferencia PITX2) y tienden a ser secuencias más cortas en el
intervalo de 25-70 nucleótidos. Como alternativa,
los oligos inmovilizados pueden sintetizarse químicamente in
situ en la superficie del portaobjetos. La síntesis de
oligonucleótidos in situ implica la adición consecutiva de
los nucleótidos adecuados a las manchas en el microensayo; las
manchas que no reciben un nucleótido se protegen durante cada etapa
del proceso usando máscaras físicas o virtuales.
En los experimentos de micromatrices de perfiles
de expresión, los moldes de ARN utilizados son representativos del
perfil de transcripción de las células o tejidos en estudio. El ARN
se aísla primero de las poblaciones de células o de los tejidos que
se compararán. Cada muestra de ARN se utiliza a continuación como
molde para generar el ADNc marcado fluorescentemente a través de
una reacción de transcripción inversa. La marcación fluorescente
del ADNc puede realizarse por medio de procedimientos de marcación
directa o marcación indirecta. Durante la marcación directa, se
incorporan nucleótidos modificados fluorescentemente (por ejemplo,
Cy®3- o Cy®5-dCTP) directamente en el ADNc durante
la transcripción inversa. Como alternativa, la marcación indirecta
puede conseguirse incorporando los nucleótidos modificados con
aminoalilo durante la síntesis del ADNc y conjugando a continuación
un colorante éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) al
ADNc modificado con aminoalilo una vez que se completa la reacción
de transcripción inversa. Como alternativa, la sonda puede estar sin
marcar, pero puede ser detectable por la unión específica con un
ligando que se marca, directa o indirectamente. Los marcadores y
los procedimientos adecuados para marcar ligandos (y sondas) son
conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, los marcadores
radiactivos que pueden incorporarse por procedimientos conocidos
(por ejemplo, traducción de mellas o fosforilación). Otros
marcadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, la biotina, los
grupos fluorescentes, los grupos quimioluminiscentes (por ejemplo,
dioxetanos, en particular dioxetanos activados), enzimas,
anticuerpos, y similares. Para realizar el análisis de la expresión
genética diferencial, el ADNc generado a partir de diferentes
muestras de ARN se marca con Cy®3. El ADNc marcado resultante se
purifica para eliminar los nucleótidos no incorporados, el
colorante libre y el ARN residual. Tras la purificación, las
muestras de ADNc marcado se hibridan a la micromatriz. La
rigurosidad de la hibridación está determinada por una serie de
factores durante la hibridación y durante el procedimiento de
lavado, incluyendo la temperatura, la fuerza iónica, el período de
tiempo y la concentración de formamida. Estos factores se describen
en, por ejemplo, Sambrook y col., (Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª ed., 1989). La micromatriz se explora tras la
hibridación usando un analizador de micromatrices fluorescentes. Las
sondas complementarias de ARN usadas en RPA se generan por
transcripción in vitro de un molde de ADN con un punto final
definido y están típicamente en el intervalo de
50-600 nucleótidos. El uso de sondas de ARN que
incluyen secuencias adicionales no homólogas al ARN diana permite
distinguir el fragmento protegido de la sonda de longitud total. Las
sondas de ARN se usan típicamente en lugar de las sondas de ADN por
la facilidad para generar sondas de ARN de hebra única y la
reproducibilidad y fiabilidad de la digestión del dúplex ARN:ARN con
RNasas (Ausubel y col., 2003), resultan de particular preferencia
las sondas con actividades altamente
específicas.
específicas.
Resulta particularmente de preferencia el uso de
micromatrices. El proceso de análisis de micromatrices puede
dividirse en dos partes principales. En primer lugar está la
inmovilización de secuencias de genes conocidos en portaobjetos de
vidrio u otro soporte sólido seguido por la hibridación de ADNc
marcado fluorescentemente (que comprende las secuencias a
investigar) a los genes conocidos inmovilizados sobre el
portaobjetos de vidrio. Tras la hibridación, las matrices pueden
explorarse usando un analizador de microensayos fluorescentes. El
análisis de la intensidad de fluorescencia relativa de diferentes
genes proporciona una medida de la diferencia en la expresión
genética. Las matrices de ADN pueden generarse inmovilizando
oligonucleótidos presintetizados en portaobjetos de vidrio
preparado. En este caso, se fabrican secuencias representativas del
gen y se preparan usando procedimientos convencionales de síntesis
y purificación de oligonucleótidos. Estas secuencias genéticas
sintetizadas son complementarias a los genes de interés (tales como
PITX2 u otros genes según la Tabla 11) y tienden a ser secuencias
más cortas en el intervalo de 25-70 nucleótidos.
Como alternativa, los oligos inmovilizados pueden sintetizarse
químicamente in situ en la superficie del portaobjetos. La
síntesis de oligonucleótidos in situ implica la adición
consecutiva de los nucleótidos adecuados a las manchas en el
microensayo; las manchas que no reciben un nucleótido se protegen
durante cada etapa del proceso usando máscaras físicas o
virtuales.
En los experimentos de micromatrices de perfiles
de expresión, los moldes de ARN utilizados son representativos del
perfil de transcripción de las células o tejidos en estudio. El ARN
se aísla primero de las poblaciones de células o de los tejidos que
se compararán. Cada muestra de ARN se utiliza a continuación como
molde para generar el ADNc marcado fluorescentemente a través de
una reacción de transcripción inversa. La marcación fluorescente
del ADNc puede realizarse por medio de procedimientos de marcación
directa o marcación indirecta. Durante la marcación directa, se
incorporan nucleótidos modificados fluorescentemente (por ejemplo,
Cy®3- o Cy®5-dCTP) directamente en el ADNc durante
la transcripción inversa. Como alternativa, la marcación indirecta
puede conseguirse incorporando los nucleótidos modificados con
aminoalilo durante la síntesis del ADNc y conjugando a continuación
un colorante éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) al
ADNc modificado con aminoalilo una vez que se completa la reacción
de transcripción inversa. Como alternativa, la sonda puede estar sin
marcar, pero puede ser detectable por la unión específica con un
ligando que se marca, directa o indirectamente. Los marcadores y
los procedimientos adecuados para marcar ligandos (y sondas) son
conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, los marcadores
radiactivos que pueden incorporarse por procedimientos conocidos
(por ejemplo, traducción de mellas o fosforilación). Otros
marcadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, la biotina, los
grupos fluorescentes, los grupos quimioluminiscentes (por ejemplo,
dioxetanos, en particular dioxetanos activados), enzimas,
anticuerpos, y similares. Para realizar el análisis de la expresión
genética diferencial, el ADNc generado a partir de diferentes
muestras de ARN se marca con Cy®3. El ADNc marcado resultante se
purifica para eliminar los nucleótidos no incorporados, el
colorante libre y el ARN residual. Tras la purificación, las
muestras de ADNc marcado se hibridan a la micromatriz. La
rigurosidad de la hibridación está determinada por una serie de
factores durante la hibridación y durante el procedimiento de
lavado, incluyendo la temperatura, la fuerza iónica, el período de
tiempo y la concentración de
formamida.
formamida.
El nivel de expresión del gen y/o de las
regiones reguladoras de PITX2 se determina por el análisis del nivel
de metilación de dicho gen y/o de sus regiones reguladoras. Resulta
de preferencia que el nivel de metilación de dichos genes,
secuencias genómicas y/o sus regiones reguladoras se determine por
medio de la determinación del estado o nivel de metilación de al
menos uno de sus dinucleótidos CpG. Es además de preferencia que el
nivel de metilación de dicho gen y/o sus regiones reguladoras se
determine por medio de la determinación del estado o nivel de
metilación de una pluralidad de sus dinucleótidos CpG. Dicho gen y/o
regiones reguladoras se seleccionan de PITX2. Dicho análisis
comprende las siguientes etapas:
- i)
- poner el ADN genómico obtenido del sujeto en contacto con al menos un reactivo, o una serie de reactivos que distinguen entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos una región diana del ADN genómico, en el que dichos dinucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótidos CpG; y
- ii)
- clasificar los trastornos proliferativos de las células de la próstata según su pronóstico según se determina a partir del estado de metilación de dichas regiones diana analizadas en i).
El ADN genómico puede aislarse por cualquier
medio convencional en la técnica, incluyendo el uso de kits
comercialmente disponibles. En resumen, cuando el ADN de interés
está encapsulado por una membrana celular la muestra biológica debe
interrumpirse y lisarse por medios enzimáticos, químicos o
mecánicos. La disolución de ADN puede a continuación limpiarse de
proteínas y otros contaminantes por ejemplo, por digestión con
proteinasa K. A continuación se recupera el ADN genómico de la
disolución. Esto puede realizarse por medio de una diversidad de
procedimientos incluyendo salado, extracción orgánica o unión de
ADN a un soporte de fase sólida. La elección del procedimiento se
verá afectada por varios factores incluyendo tiempo, coste y
cantidad de ADN requerida. De preferencia, la fuente de la muestra
de ADN se selecciona del grupo constituido por células o líneas
celulares, portaobjetos histológicos, biopsias, tejido incluido en
parafina, líquidos corporales, eyaculado, orina, sangre, y sus
combinaciones. De preferencia, la fuente es una biopsia, un líquido
corporal, eyaculado, orina o sangre. La muestra de ADN genómico se
trata a continuación de manera tal que las bases de citosina que
están sin metilar en la posición 5' se conviertan en uracilo,
timina, u otra base que sea distinta a la citosina en términos de
comportamiento de hibridación. Esto se entenderá como
"tratamiento" en el presente documento.
El tratamiento del ADN genómico descrito
anteriormente se realiza de preferencia con bisulfito (sulfito de
hidrógeno, disulfito) y posterior hidrólisis alcalina que da lugar a
la conversión de nucleobases de citosina no metiladas a uracilo u
otra base que es diferente de la citosina en términos de
comportamiento de emparejamiento de bases.
El ADN tratado se analiza a continuación para
determinar el estado de metilación de una o más secuencias del gen
diana (previo al tratamiento) asociadas con el desarrollo del
carcinoma de próstata. Resulta particularmente de preferencia que
la región diana comprenda, o hibride bajo condiciones rigurosas con
al menos 16 nucleótidos contiguos de un gen o secuencia
seleccionada del gen PITX2. Se describe además que se analizan las
secuencias de dichos genes según se describen en el listado de
secuencias que acompaña al presente documento. El procedimiento de
análisis puede seleccionarse de los conocidos en la técnica,
incluidos los que se presentan en el presente documento. Resultan
particularmente de preferencia MethyLight^{TM}, MSP^{TM} y el
uso de oligonucleótidos bloqueadores como se describirá en el
presente documento. Resulta además de preferencia que cualquier
oligonucleótido usado en tal análisis (incluidos cebadores,
oligonucleótidos bloqueadores y sondas de detección) sea
complementario inverso, idéntico, o hibride en condiciones
rigurosas o altamente rigurosas a al menos un segmento de 16 pares
de bases de longitud de las secuencias de bases de una o más de las
SEC ID Nº: 962 a la SEC ID Nº: 965 y sus secuencias
complementarias. Resulta de preferencia que cualquier
oligonucleótido usado en tal análisis (incluidos cebadores,
oligonucleótidos bloqueadores y sondas de detección) sea
complementario inverso, idéntico, o hibride en condiciones
rigurosas o altamente rigurosas a al menos un segmento de 16 pares
de bases de longitud de las secuencias de bases de una o más de las
SEC ID Nº: 962 - 965 y sus secuencias complementarias.
La metilación aberrante, del gen o secuencia
genómica según PITX2, está asociada con el pronóstico de los
trastornos proliferativos de las células de la próstata. El análisis
de la secuencia permite la clasificación del pronóstico de los
trastornos proliferativos de las células de la próstata. De más
preferencia la hipermetilación de uno o más de dicho gen o
secuencia genómica está asociada con mal pronóstico. La
hipermetilación está asociada en general con la expresión baja de
ARNm y por consiguiente de polipéptidos.
En una forma de realización el procedimiento da
a conocer el uso del gen PITX2.
En la forma de realización de más preferencia de
la invención, la detección de los trastornos proliferativos de las
células de la próstata es posible por medio del análisis del estado
de metilación de PITX2 y sus elementos promotores o reguladores.
Los procedimientos para el análisis de metilación de genes se
describen en el presente documento.
En una forma de realización el procedimiento da
a conocer el uso de uno o más genes o secuencias genómicas
seleccionadas del grupo constituido por el gen PITX2 como marcador
para proporcionar un pronóstico de los trastornos proliferativos de
las células de la próstata.
En la forma de realización de más preferencia de
la invención, la detección de los trastornos proliferativos de las
células de la próstata es posible por medio del análisis del estado
de metilación de dichos genes o secuencias genómicas y sus
elementos promotores o reguladores. Los procedimientos para el
análisis de metilación de genes se describen en el presente
documento.
La presente invención puede describirse también
en ciertas formas de realización como el uso de un kit para
proporcionar un pronóstico de un estado de un trastorno
proliferativo de las células de la próstata a través de la prueba
de una muestra biológica.
Las formas de realización particulares de la
presente invención proporcionan una nueva aplicación del análisis
de los niveles y/o patrones de metilación dentro de dichas
secuencias que permite una clasificación de pronóstico y de esta
manera mejor tratamiento de los trastornos proliferativos de las
células de la próstata. El tratamiento de los trastornos
proliferativos de las células de la próstata está directamente
relacionado con el pronóstico de la enfermedad, en particular con
la agresividad, y el procedimiento dado a conocer en el mismo
permite al médico y al paciente tomar decisiones de tratamiento
mejores y más informadas.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención describe usos nuevos para
las secuencias genómicas seleccionadas del grupo constituido por
SEC ID Nº: 961.
Un objetivo de la invención comprende el
análisis del estado de metilación de uno o más dinucleótidos CpG
dentro de al menos una de las secuencias genómicas seleccionadas del
grupo constituido por SEC ID Nº: 961 y sus secuencias
complementarias.
La invención dada a conocer da a conocer ácidos
nucleicos tratados, derivados de SEC ID Nº: 961 en la que el
tratamiento es adecuado para convertir al menos una base de citosina
no metilada de la secuencia de ADN genómico en uracilo u otra base
que sea detectablemente diferente de la citosina en términos de
hibridación. Las secuencias genómicas en cuestión pueden comprender
una, o más, posiciones de CpG metiladas consecutivas o aleatorias.
Dicho tratamiento comprende de preferencia el uso de un reactivo
seleccionado del grupo constituido por bisulfito, sulfito de
hidrógeno, disulfito, y sus combinaciones.
Las secuencias de SEC ID Nº: 962 a SEC ID Nº:
965 proporcionan versiones modificadas que no se presentan en la
naturaleza del ácido nucleico según la SEC ID Nº: 961, en las que la
modificación de cada secuencia genómica da como resultado la
síntesis de un ácido nucleico que tiene una secuencia que es única y
diferente de dicha secuencia genómica de la siguiente manera. Para
cada ADN genómico de la hebra sentido, por ejemplo, SEC ID Nº: 1,
se dan a conocer cuatro versiones convertidas. Una primera versión
en la que "C" se convierte en "T", pero "CpG"
permanece "CpG" (es decir, corresponde al caso donde, para la
secuencia genómica todos los residuos "C" de las secuencias de
dinucleótidos CpG están metilados y por consiguiente no se
convierten); una segunda versión da a conocer el complemento de la
secuencia de ADN genómico dada a conocer (es decir, la hebra
complementaria), en la que "C" se convierte en "T", pero
"CpG" permanece "CpG" (es decir, corresponde al caso
donde, todos los residuos "C" de las secuencias de
dinucleótidos CpG están metilados y por consiguiente no se
convierten). Las secuencias convertidas "metiladas en exceso"
de SEC ID Nº: 1 a SEC ID Nº: 64 y SEC ID Nº: 961 corresponden a SEC
ID Nº: 65 a SEC ID Nº: 728. Se proporciona una tercera versión
convertida químicamente de cada secuencia genómica, en la que
"C" se convierte en "T" para todos los residuos "C",
incluidos los de las secuencias de dinucleótidos "CpG" (es
decir, corresponde al caso donde, para las secuencias genómicas,
todos los residuos "C" de las secuencias de dinucleótidos CpG
están no metiladas): una versión final convertida químicamente de
cada secuencia, da a conocer el complemento de la secuencia de ADN
genómica dada a conocer (es decir, la hebra complementaria), en la
que "C" se convierte en "T" para todos los residuos
"C", incluidos los de las secuencias de dinucleótidos
"CpG" (es decir, corresponde al caso donde, para el complemento
(hebra complementaria) de cada secuencia genómica, todos los
residuos "C" de las secuencias de dinucleótidos CpG están no
metilados). Las secuencias convertidas "metiladas por defecto"
de SEC ID Nº: 1 a SEC ID Nº: 64 y SEC ID Nº: 961 corresponden a SEC
ID Nº: 65 a SEC ID Nº: 320 y SEC ID Nº: 962 a SEC ID Nº: 965.
En una forma de realización alternativa de
preferencia, tal análisis comprende el uso de un oligonucleótido u
oligómero para detectar el estado de metilación de la citosina
dentro del ADN genómico o tratado (modificado químicamente), según
SEC ID Nº: 962 a SEC ID Nº: 965. Comprendiendo dicho oligonucleótido
u oligómero una secuencia de ácido nucleico que tiene una longitud
de al menos nueve (9) nucleótidos que hibrida, bajo condiciones
moderadamente rigurosas o rigurosas (según se definió anteriormente
en el presente documento), a una secuencia de ácido nucleico
tratado según SEC ID Nº: 962 a SEC ID Nº: 965 y/o sus secuencias
complementarias.
Por consiguiente, la presente invención describe
moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, oligonucleótidos y
moléculas de ácido peptidonucleico (PNA) (oligómeros de PNA)) que
hibridan en condiciones de hibridación moderadamente rigurosas y/o
rigurosas a toda o una porción de una secuencia de las SEC ID Nº: 1
a la SEC ID Nº: 320 y SEC ID Nº: 961 a SEC ID Nº: 965, o a sus
complementos. Se describe de manera particular una molécula de
ácido nucleico que hibrida en condiciones de hibridación
moderadamente rigurosas y/o rigurosas a toda o una porción de las
secuencias SEC ID Nº: 65 a SEC ID Nº: 320 y SEC ID Nº: 962 a SEC ID
Nº: 965 pero que no es idéntica o complementaria a SEC ID Nº: 1 a
SEC ID Nº: 64 y SEC ID Nº: 961 u otro ADN genómico humano. También
se describe una molécula de ácido nucleico que hibrida en
condiciones de hibridación moderadamente rigurosas y/o rigurosas a
toda o una porción de las secuencias SEC ID Nº: 133, 134, 261, 262,
189, 190, 317, 318, 101, 102, 229, 230, 962-965
pero que no es idéntica o complementaria a las SEC ID Nº: 961, 35,
63 y 19 u a otro ADN genómico
humano.
humano.
La porción que hibrida de los ácidos nucleicos
que hibridan tiene típicamente una longitud de al menos 9, 15, 20,
25, 30 ó 35 nucleótidos. Sin embargo, las moléculas más largas
tienen la utilidad de la invención, y por consiguiente están dentro
del ámbito de la presente invención.
De preferencia, la porción que hibrida de los
ácidos nucleicos que hibridan es al menos 95%, o al menos 98%, o
100% idéntica a la secuencia, o a una porción de las secuencias SEC
ID Nº: 962 a 965 o a sus complementos.
Los ácidos nucleicos que hibridan del tipo
descrito en el presente documento pueden utilizarse, por ejemplo,
como un cebador (por ejemplo, un cebador de PCR), o una sonda o
cebador de diagnóstico y/o pronóstico. De preferencia, la
hibridación de la sonda de oligonucleótido a una muestra de ácido
nucleico se realiza en condiciones rigurosas y la sonda es 100%
idéntica a la secuencia diana. La estabilidad del dúplex o híbrido
de ácido nucleico se expresa como la temperatura de fusión o Tf,
que es la temperatura a la que una sonda se disocia de un ADN
diana. Esta temperatura de fusión se utiliza para definir las
condiciones rigurosas requeridas.
Para las secuencias diana que están relacionadas
y son sustancialmente idénticas a la secuencia correspondiente de
SEC ID Nº: 961 (tal como variantes alélicas y SNP), en lugar de
idénticos, es útil primero establecer la temperatura más baja a la
que solo se produce la hibridación homóloga con una concentración
particular de sal (por ejemplo, SSC o SSPE). A continuación,
asumiendo que el 1% de emparejamientos erróneos provoca una
disminución de 1ºC en la Tf, la temperatura del lavado final en la
reacción de hibridación por consiguiente se reduce (por ejemplo, si
se buscan las secuencias tienen >95% de identidad con la sonda,
la temperatura final de lavado disminuye en 5ºC). En la práctica,
el cambio en la Tf puede estar entre 0,5ºC y 1,5ºC por 1% de
emparejamiento erróneo.
Los ejemplos de oligonucleótidos de una longitud
X (en nucleótidos), según lo indicado por las posiciones de
polinucleótido con referencia a, por ejemplo, la SEC ID Nº: 1,
incluyen los que corresponden a las series (serie codificadora y
complementaria) de oligonucleótidos solapados consecutivamente de
una longitud X, donde los oligonucleótidos dentro de cada uno de
las series solapadas consecutivamente (que corresponden a un valor
X dado) se definen como la serie finita de oligonucleótidos Z desde
las posiciones de nucleótido:
- \quad
- n hasta (n + (X-1));
- \quad
- donde n = 1, 2, 3,...(Y-(X-1));
- \quad
- donde Y es igual a la longitud (nucleótidos o pares de bases) de SEC ID Nº: 1 (7572);
\newpage
- \quad
- donde X es igual a la longitud común (en nucleótidos) de cada oligonucleótido en la serie (por ejemplo, X=20 para una serie de 20-meros solapados consecutivamente); y
- \quad
- donde el número (Z) de oligómeros solapados consecutivamente de longitud X para una SEC ID Nº dada de longitud Y es igual a Y - (X-1). Por ejemplo Z = 7572 - 19 = 7553 para las series codificadora o complementaria de SEC ID Nº: 1, donde X = 20.
\vskip1.000000\baselineskip
De preferencia, la serie se limita a los
oligómeros que comprenden al menos un dinucleótido CpG, TpG o
CpA.
CpA.
Los ejemplos de los oligonucleótidos
20-meros incluyen la serie siguiente de oligómeros
(y la serie no codificadora complementaria a la misma), indicada
por las posiciones de polinucleótido con referencia a la SEC ID Nº:
1:
1-20,
2-21, 3-22, 4-23,
5-24,.... y
7553-7572.
De preferencia, la serie se limita a los
oligómeros que comprenden al menos un dinucleótido CpG, TpG o
CpA.
CpA.
Asimismo, los ejemplos de oligonucleótidos
25-meros de la invención incluyen la siguiente serie
de 2.256 oligómeros (y la serie no codificadora complementaria a la
misma), indicada por las posiciones del polinucleótido con
referencia a SEC ID Nº: 1:
1-25,
2-26, 3-27, 4-28,
5-29,...
7553-7572.
De preferencia, la serie se limita a los
oligómeros que comprenden al menos un dinucleótido CpG, TpG o
CpA.
CpA.
La presente invención describe, para cada una de
las SEC ID Nº: 1 a la SEC ID Nº: 320 y SEC ID Nº: 961 a SEC ID Nº:
965 (codificadora y no codificadora), series múltiples
consecutivamente solapadas de oligonucleótidos u oligonucleótidos
modificados de longitud X, donde, por ejemplo, X = 9, 10, 17, 20,
22, 23, 25, 27, 30 ó 35
nucleótidos.
nucleótidos.
Los oligonucleótidos u oligómeros constituyen
las herramientas efectivas útiles para comprobar los parámetros
genéticos y epigenéticos de las secuencias genómicas que
corresponden a la SEC. ID. Nº: 961. Las series de preferencia de
tales oligómeros o nucleótidos modificados de longitud X son las
series solapadas consecutivamente de oligómeros que corresponden a
SEC ID Nº: 1 hasta SEC ID Nº: 320 y SEC ID Nº: 961 hasta SEC ID Nº:
965 (y a sus complementos). De preferencia, dichos oligómeros
comprenden al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.
Los oligonucleótidos u oligómeros
particularmente de preferencia son aquellos en los que la citosina
de las secuencias de dinucleótido CpG (o los dinucleótidos
convertidos TpG o CpA correspondientes) está dentro del tercio
medio del oligonucleótido; es decir, donde el oligonucleótido está,
por ejemplo, a 13 bases en longitud, del CpG. El dinucleótido TpG
o CpA está ubicado dentro del quinto al noveno nucleótido desde el
extremo 5'.
Los oligonucleótidos también pueden modificarse
químicamente uniendo el oligonucleótido a uno o más restos o
conjugados para mejorar la actividad, estabilidad o detección del
oligonucleótido. Tales restos o conjugados incluyen cromóforos,
fluoróforos, lípidos tales como colesterol, ácido cólico, tioéter,
cadenas alifáticas, fosfolípidos, poliaminas, polietilenglicol
(PEG), restos de palmitilo, y otros según lo descrito en, por
ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nº 5.514.758, 5.565.552,
5.567.810, 5.574.142, 5.585.481, 5.587.371, 5.597.696 y 5.958.773.
Las sondas también pueden existir en forma de un PNA (ácido
peptidonucleico) que tiene las propiedades de emparejamiento
particularmente de preferencia. Por consiguiente, el oligonucleótido
puede incluir otros grupos anexos tales como péptidos, y puede
incluir los agentes de escisión activados por hibridación (Krol y
col., BioTechniques 6:958-976, 1988) o agentes de
intercalado (Zon, Pharm. Res. 5:539-549, 1988). Con
este fin, el oligonucleótido puede conjugarse a otra molécula, por
ejemplo, un cromóforo, fluoróforo, péptido, agente de reticulación
activado por hibridación, agente de transporte, agente de escisión
activado por hibridación, etc.
El oligonucleótido puede también comprender al
menos un resto de azúcar y/o base modificado reconocido en la
técnica, o puede comprender un esqueleto modificado o un enlace
internucleosídico no natural.
Los oligonucleótidos u oligómeros para uso en la
presente invención se utilizan típicamente en "series", que
contienen al menos un oligómero para el análisis de al menos uno de
los dinucleótidos CpG de las secuencias SEC ID Nº: 961 y sus
secuencias complementarias, o para el dinucleótido CpG, TpG o CpA
correspondiente dentro de una secuencia de ácido nucleico tratado
de acuerdo con la SEC ID Nº: 962 a la SEC ID Nº: 965 y sus
secuencias complementarias. Sin embargo, se anticipa que para los
factores económicos u otros factores, puede resultar de preferencia
analizar una selección limitada de los dinucleótidos CpG dentro de
dichas secuencias, y por consiguiente se altera el contenido de la
serie de oligonucleótidos.
Por consiguiente, en forma de realización
particulares, la presente invención describe una serie de al menos
dos (2) (oligonucleótidos y/u oligómeros de PNA) útiles para
detectar el estado de metilación de la citosina en el ADN genómico
tratado (SEC ID Nº: 962 a SEC ID Nº: 965), o en el ADN genómico (SEC
ID Nº: 961 y sus secuencias complementarias). Estas sondas permiten
el diagnóstico, y/o clasificación de los parámetros genéticos y
epigenéticos de los trastornos proliferativos celulares de la
próstata.
En formas de realización de preferencia, al
menos uno, y de preferencia todos los miembros de una serie de
oligonucleótidos están unidos a una fase sólida.
La presente invención describe una serie de al
menos dos (2) oligonucleótidos que se usan como oligonucleótidos
cebadores para amplificar las secuencias de ADN de una de las SEC ID
Nº: 1 hasta la SEC ID Nº: 320 y SEC ID Nº: 961 hasta SEC ID Nº: 965
y sus secuencias complementarias o sus segmentos.
Se anticipa que los oligonucleótidos pueden
constituir todo o una parte de una "matriz" o "chip de
ADN" (es decir, una disposición de diferentes oligonucleótidos
y/u oligómeros de PNA unidos a una fase sólida). Tal matriz de
diferentes secuencias de oligonucleótidos y/u oligómeros de PNA
puede caracterizarse, por ejemplo, porque está dispuesta sobre la
fase sólida en forma de una red rectangular o hexagonal. La
superficie de fase sólida puede estar compuesta por silicio,
vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre, níquel, plata,
u oro. También pueden utilizarse la nitrocelulosa así como los
plásticos tales como nailon, que puede existir en forma de gránulos
o también como matrices de resina. Una descripción de la técnica
anterior en la fabricación de matrices de oligómeros puede
recopilarse de una edición especial de Nature Genetic (Nature
Genetics Supplement, volumen 21, enero de 1999, y de la
bibliografía citada en la misma). Las sondas marcadas
fluorescentemente se utilizan frecuentemente para la exploración de
las matrices de ADN inmovilizadas. La unión simple de los
colorantes Cy3 y Cy5 al 5'-OH de la sonda específica
es particularmente adecuada para los marcadores fluorescentes. La
detección de la fluorescencia de las sondas hibridadas puede
realizarse, por ejemplo, mediante un microscopio confocal. Los
colorantes Cy3 y Cy5, además de muchos otros, están disponibles
comercialmente.
También se anticipa que los oligonucleótidos, o
secuencias particulares de los mismos, pueden constituir toda o
parte de una "matriz virtual" en la que los oligonucleótidos, o
secuencias particulares de los mismos, se utilizan, por ejemplo,
como "especificadores" como parte de, o combinados con una
población diferente de sondas marcadas únicas para analizar una
mezcla compleja de analitos. Tal procedimiento, por ejemplo se
describe en el documento US 2003/0013091 (Número de Serie de
Estados Unidos 09/898.743, publicado el 16 de enero de 2003). En
tales procedimientos, se generan suficientes marcadores para que
cada ácido nucleico en la mezcla compleja (es decir, cada analito)
pueda unirse exclusivamente a un marcador único y detectarse de esa
manera (cada marcador se cuenta directamente, dando como resultado
una lectura digital de cada especie molecular en la
mezcla).
mezcla).
Resulta particularmente de preferencia utilizar
los oligómeros para el pronóstico de los trastornos proliferativos
celulares de la próstata. Esto es posible por el uso de dichas
series para proporcionar un pronóstico de una muestra biológica
aislada de un paciente. Son particularmente de preferencia las
series de oligómeros que comprenden al menos dos oligonucleótidos
seleccionados de una de las siguientes series de
oligonucleótidos.
En una forma de realización del procedimiento,
esto se logra por medio del análisis del estado de metilación de al
menos una secuencia diana que comprende, o hibrida bajo condiciones
rigurosas con al menos 16 nucleótidos contiguos de un gen o
secuencia seleccionada del grupo constituido por el gen o la
secuencia genómica de
PITX2.
PITX2.
En la primera etapa, se obtiene una muestra del
tejido a analizar. La fuente puede ser cualquier fuente adecuada.
De preferencia, la fuente de la muestra de ADN se selecciona del
grupo constituido por células o líneas celulares, portaobjetos
histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina, líquidos
corporales, eyaculado, orina, sangre, y sus combinaciones. De
preferencia, la fuente es una biopsia, un líquido corporal,
eyaculado, orina o sangre.
El ADN genómico puede aislarse por cualquier
procedimiento convencional en la técnica, incluyendo el uso de kits
disponibles comercialmente. En resumen, cuando el ADN de interés
está encapsulado por una membrana celular, la muestra biológica
debe interrumpirse y lisarse por medios enzimáticos, químicos o
mecánicos. La disolución de ADN puede a continuación limpiarse de
proteínas y otros contaminantes por ejemplo por digestión con
proteinasa K. A continuación se recupera el ADN genómico de la
disolución. Esto puede realizarse por medio de una diversidad de
procedimientos incluyendo salado, extracción orgánica o unión de ADN
a un soporte de fase sólida. La elección del procedimiento se verá
afectada por varios factores incluyendo tiempo, coste y cantidad de
ADN
requerida.
requerida.
Una vez que se hayan extraído los ácidos
nucleicos, se utiliza en el ensayo el ADN genómico de doble
hebra.
La muestra de ADN genómico se trata de manera
tal que las bases de citosina que están sin metilar en la posición
5' se conviertan en uracilo, timina, u otra base que sea diferente
de la citosina en términos de comportamiento de hibridación. Esto
se entenderá como "pretratamiento" o "tratamiento" en el
presente documento.
\newpage
El tratamiento del ADN genómico descrito
anteriormente se realiza de preferencia con bisulfito (sulfito de
hidrógeno, disulfito) y posterior hidrólisis alcalina que da lugar a
la conversión de nucleobases de citosina no metiladas a uracilo u
otra base que es diferente de la citosina en términos de
comportamiento de emparejamiento de bases.
Los fragmentos de ADN tratado se amplifican,
usando las series de oligonucleótidos cebadores de acuerdo con la
presente invención, y una enzima de amplificación. La amplificación
de varios segmentos de ADN puede realizarse simultáneamente en uno
y en el mismo recipiente de reacción. Comúnmente, se realiza la
amplificación usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La serie de oligonucleótidos cebadores incluye al menos dos
oligonucleótidos cuyas secuencias son cada una complementarias
inversas, idénticas, o hibridan en condiciones rigurosas o
altamente rigurosas a al menos un segmento de 16 pares de bases de
longitud de las secuencias de bases de una de las SEC ID Nº: 962 a
la SEC ID Nº: 965 y sus secuencias complementarias.
En una forma de realización alternativa del
procedimiento, el estado de metilación de las posiciones de CpG
preseleccionadas dentro de las secuencias de ácido nucleico que
comprenden SEC ID Nº: 961 puede detectarse por medio del uso de los
oligonucleótidos cebadores específicos de metilación. Esta técnica
(MSP) se ha descrito en la Patente de EEUU Nº 6.265.171 de Herman.
El uso de los cebadores específicos del estado de metilación para
la amplificación de ADN tratado con bisulfito, permite la
diferenciación entre ácidos nucleicos metilados y no metilados. Los
pares de cebadores de MSP contienen al menos un cebador que hibrida
a un dinucleótido CpG tratado con bisulfito. Por consiguiente, la
secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleótido
CpG. Los cebadores de MSP específicos para el ADN no metilado
contienen una T en la posición de las posiciones de C en el CpG. De
preferencia, por lo tanto, es necesario que la secuencia de bases de
dichos cebadores comprenda una secuencia que tiene una longitud de
al menos 9 nucleótidos que hibridan a una secuencia de ácido
nucleico tratada de SEC ID Nº: 962-965 y a sus
secuencias complementarias, en la que la secuencia de bases de
dichos oligómeros comprende al menos un dinucleótido CpG. Otra
forma de realización de preferencia del procedimiento comprende el
uso de oligonucleótidos bloqueadores. El uso de tales
oligonucleótidos bloqueadores se ha descrito por Yu y col.,
BioTechniques 23:714-720, 1997. Los oligonucleótidos
de sonda de bloqueo hibridan al ácido nucleico tratado con
bisulfito simultáneamente con los cebadores de PCR. La amplificación
por PCR del ácido nucleico se termina en la posición 5' de la sonda
de bloqueo, de tal forma que la amplificación de un ácido nucleico
se suprime donde está presente la secuencia complementaria para la
sonda de bloqueo. Las sondas pueden diseñarse para que hibriden al
ácido nucleico tratado con bisulfito de una manera específica del
estado de metilación. Por ejemplo, para la detección de ácidos
nucleicos metilados dentro de una población de ácidos nucleicos no
metilados, la supresión de la amplificación de los ácidos nucleicos
que están sin metilar en la posición en cuestión, se realizaría
mediante el uso de sondas de bloqueo que comprenden un "CpA" o
"TpA" en la posición en cuestión, a diferencia de un
"CpG" si se desea la supresión o amplificación de ácidos
nucleicos metilados.
Para los procedimientos de PCR usando los
oligonucleótidos bloqueadores, la alteración eficaz o amplificación
mediada por polimerasa requiere que los oligonucleótidos
bloqueadores no sean alargados por la polimerasa. De preferencia,
esto se logra con el uso de los bloqueadores que son
3'-desoxioligonucleótidos, u oligonucleótidos
derivados en la posición 3' con una función diferente de un grupo
hidroxilo "libre". Por ejemplo, los oligonucleótidos con
3'-O-acetilo son representativos de
una clase de moléculas bloqueadoras de preferencia.
Además, debe prevenirse la descomposición
mediada por polimerasa de los oligonucleótidos bloqueadores. De
preferencia, tal prevención comprende el uso de una polimerasa que
carece de la actividad de
5'-3'-exonucleasa, o el uso de
oligonucleótidos bloqueadores modificados que tienen por ejemplo,
puentes de tioato en los extremos 5' de los mismos que hacen que la
molécula bloqueadora sea resistente a las nucleasas. Las
aplicaciones particulares pueden no requerir tales modificaciones
en 5' del bloqueador. Por ejemplo, si los sitios del bloqueador y
de unión del cebador están superpuestos, evitando de esta manera la
unión del cebador (por ejemplo, con exceso de bloqueador), se
prevendrá sustancialmente la degradación del oligonucleótido
bloqueador. Esto se debe a que la polimerasa no extiende el cebador
hacia, y a través (en la dirección 5'-3') del
bloqueador, un proceso que da lugar normalmente a la degradación
del oligonucleótido bloqueador hibridado.
Una forma de realización particularmente de
preferencia de bloqueador/PCR, para los objetos de la presente la
invención y según lo puesto en práctica en el presente documento,
comprende el uso de oligómeros de ácido peptidonucleico (PNA) como
oligonucleótidos bloqueadores. Tales oligómeros de PNA bloqueadores
se adaptan idealmente porque ni son descompuestos ni son extendidos
por la polimerasa.
De preferencia, por consiguiente, es necesario
que la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos bloqueadores
comprenda una secuencia que tiene una longitud de al menos 9
nucleótidos que hibrida a una secuencia de ácido nucleico tratada
de acuerdo con una de SEC ID Nº: 962 a la SEC ID Nº: 965 y sus
secuencias complementarias, en la que la secuencia de bases de
dichos oligonucleótidos comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG
o CpA. De más preferencia, es necesario que las secuencias de bases
de dichos oligonucleótidos bloqueadores comprenda una secuencia que
tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibrida a una
secuencia de ácido nucleico tratada de acuerdo con una de SEC ID
Nº: 962 - 965 y sus secuencias complementarias, en la que la
secuencia de bases de dichos oligonucleótidos comprende al menos un
dinucleótido CpG, TpG o CpA.
Los fragmentos obtenidos por medio de la
amplificación pueden llevar un marcador detectable directa o
indirectamente. Resultan de preferencia los marcadores en forma de
marcadores fluorescentes, radionúclidos, o fragmentos moleculares
desprendibles que tienen una masa típica que puede detectarse en un
espectrómetro de masas. Donde dichos marcadores son marcadores de
masas, resulta de preferencia que los amplificados marcados tengan
una sola carga neta positiva o negativa, permitiendo una mejor
detección en el espectrómetro de masas. La detección puede
realizarse y visualizarse por medio de, por ejemplo, la
espectrometría de masas de desorción/ionización de láser asistida
por matriz (MALDI) o usando la espectrometría de masas por
electrovaporización (EVI).
La espectrometría de masas de láser por
desorción/ionización asistida por matriz (MALDI-TOF)
es un desarrollo muy eficaz para el ensayo de biomoléculas (Karas y
Hillenkamp, Anal Chem, 60:2299-2301, 1988). Un
analito se incluye en una matriz de absorción de luz. La matriz es
evaporada por un pulso de láser corto transportando de esta manera
la molécula del analito en fase de vapor de una forma
desfragmentada. El analito se ioniza por colisiones con moléculas
de la matriz. Un voltaje aplicado acelera los iones en un tubo de
descarga libre de campo. Por sus diferentes masas, los iones se
aceleran a diferentes velocidades. Los iones más pequeños alcanzan
el detector más pronto que los más grandes. Las espectrometría
MALDI-TOF se adapta bien al análisis de péptidos y
proteínas. El análisis de ácidos nucleicos es un poco más difícil
(Gut y Beck, Current Innovations and Future Trends,
1:147-157, 1995). La sensibilidad con respecto al
análisis de los ácidos nucleicos es aproximadamente 100 veces menor
que para los péptidos, y disminuye desproporcionadamente con el
aumento de tamaño del fragmento. Por otra parte, para los ácidos
nucleicos que tienen una estructura con múltiples cargas negativas,
el proceso de ionización vía matriz es considerablemente menos
eficaz. En la espectrometría MALDI-TOF, la selección
de la matriz tiene una función eminentemente importante. Para la
desorción de péptidos, se ha encontrado que varias matrices
producen una cristalización muy fina. Actualmente hay varias
matrices sensibles para el ADN, sin embargo, no se ha reducido la
diferencia en la sensibilidad entre los péptidos y los ácidos
nucleicos. Esta diferencia en la sensibilidad puede reducirse, sin
embargo, modificando químicamente el ADN de una manera tal que se
vuelva más similar a un péptido. Por ejemplo, los ácidos nucleicos
de fosforotioato, en los que los fosfatos comunes de la estructura
se sustituyen con tiofosfatos, pueden convertirse a un ADN con carga
neutral usando la química de alquilación simple (Gut y Beck,
Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373, 1995). El
acoplamiento de un marcador de carga a este ADN modificado dio como
resultado un aumento en la sensibilidad de MALDI-TOF
al mismo nivel que el encontrado para los péptidos. Una ventaja
adicional del marcado con cargas es la estabilidad aumentada del
análisis contra las impurezas, que hace considerablemente más
difícil la detección de los sustratos sin modificar.
Los amplificados obtenidos durante el
procedimiento, se analizan para comprobar el estado de metilación de
los dinucleótidos CpG antes del tratamiento.
En formas de realización donde los amplificados
fueron obtenidos por medio de la amplificación por MSP, la
presencia o ausencia de un amplificado es por sí misma un indicador
del estado de metilación de las posiciones de CpG cubiertas por el
cebador, según las secuencias de bases de dicho cebador.
Los amplificados obtenidos por medio de PCR
convencional y específica de metilación, pueden analizarse además
por medio de los procedimientos basados en hibridación, tales como,
pero no limitados a, la tecnología de matriz y las tecnologías
basadas en sondas así como por medio de técnicas tales como
secuenciación y extensión dirigidas por moldes.
En una forma de realización del procedimiento,
los amplificados sintetizados hibridan posteriormente a una matriz
o a una serie de oligonucleótidos y/o sondas de PNA. En este
contexto, la hibridación se produce de la siguiente manera: la
serie de sondas usada durante la hibridación está compuesta de
preferencia por al menos 2 oligonucleótidos u oligómeros de PNA; en
el proceso, los amplificados sirven como sondas que hibridan a los
oligonucleótidos unidos previamente a una fase sólida; los
fragmentos no hibridados se eliminan posteriormente; dichos
oligonucleótidos contienen al menos una secuencia de bases que tiene
una longitud de al menos 9 nucleótidos que es complementaria
inversa o idéntica a un segmento de las secuencias de bases
especificadas en el presente listado de secuencias; y el segmento
comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.
El dinucleótido está presente en el tercio
central del oligómero. Por ejemplo, en el que el oligómero comprende
un dinucleótido CpG, dicho dinucleótido es de preferencia el quinto
a noveno nucleótido del extremo 5' de un 13-mero.
Existe un oligonucleótido para el análisis de cada dinucleótido CpG
dentro de la secuencia según SEC ID Nº: 961, y las posiciones
equivalentes dentro de SEC ID Nº: 962 a SEC ID Nº: 965. Dichos
oligonucleótidos pueden estar presentes también en la forma de
ácidos peptidonucleicos. A continuación se eliminan los amplificados
no hibridados. A continuación se detectan los amplificados
hibridados. En este contexto, se prefiere que los marcadores unidos
a los amplificados sean identificables en cada posición de la fase
sólida en la que está localizada una secuencia de
oligonucleótidos.
En aún otra forma de realización del
procedimiento, el estado de metilación genómica de las posiciones de
CpG puede comprobarse por medio de las sondas de oligonucleótidos
que están hibridadas al ADN tratado con bisulfito al mismo tiempo
con los cebadores de amplificación de PCR (en la que los cebadores
pueden ser específicos de metilación o convencionales).
Una forma de realización particularmente de
preferencia de este procedimiento es el uso de PCR cuantitativa en
tiempo real basada en la fluorescencia (Heid y col., Genome Res.
6:986-994, 1996; véase también la Patente de EEUU
Nº 6.31.393) que usa una sonda de oligonucleótido fluorescente con
doble marcador (TaqMan^{TM} PCR, usando un ABI Prism 7700
Sequence Detection System, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster
City, California). La reacción por PCR TaqMan^{TM} usa un
oligonucleótido interrogador no extensible, llamado sonda
TaqMan^{TM}, que, en las formas de realización de preferencia, se
diseña para que hibride a una secuencia rica en CpG localizada
entre los cebadores de amplificación directos o inversos. La sonda
TaqMan^{TM} además comprende un "resto informador"
fluorescente y un "resto inactivador" covalentemente unido a
los restos conectores (por ejemplo, fosforamiditas) unidos a los
nucleótidos de los oligonucleótidos TaqMan^{TM}. Para el análisis
de metilación dentro de los ácidos nucleicos posteriores al
tratamiento con bisulfito, se requiere que la sonda sea específica
de metilación, según lo descrito en la Patente de EEUU Nº 6.331.393
también conocido como el ensayo MethyLight^{TM}. Las variaciones
en la metodología de detección TaqMan^{TM} que son también
adecuadas para el uso con la invención descrita, incluyen el uso de
la tecnología de sonda dual (Lightcycler^{TM}) o cebadores de
amplificación fluorescentes (tecnología Sunrise^{TM}). Ambas
técnicas pueden adaptarse de una manera adecuada para el uso con
ADN tratado con bisulfito, y por otra parte para el análisis de
metilación dentro de los dinucleótidos CpG.
Otro procedimiento adecuado para el uso de
oligonucleótidos de sonda es para evaluar la metilación por medio
de análisis de ácidos nucleicos tratados con bisulfito. En otra
forma de realización de preferencia del procedimiento, el
procedimiento comprende el uso de la extensión de oligonucleótidos
dirigida por moldes, tal como MS-SNuPE según lo
descrito por Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res.
25:2529-2531, 1997.
En aún una forma de realización del
procedimiento, el procedimiento comprende la secuenciación y el
análisis de secuencias posterior de los amplificados generados en
la tercera etapa del procedimiento (Sanger F., y col., Proc Natl
Acad Sci U.S.A. 74:5463-5467, 1977).
\vskip1.000000\baselineskip
En la forma de realización de más preferencia
del procedimiento, los ácidos nucleicos genómicos se aíslan y
tratan según las primeras tres etapas del procedimiento descrito
anteriormente, a saber:
- a)
- obtener, de un sujeto, una muestra biológica que tiene ADN genómico del sujeto;
- b)
- extraer o aislar de otra manera el ADN genómico;
- c)
- tratar el ADN genómico de b), o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina que están sin metilar en la posición 5 de las mismas en uracilo u otra base que sea detectablemente diferente de la citosina en términos de propiedades de hibridación; y en la que
- d)
- la amplificación posterior al tratamiento en c) se realiza de una manera específica de metilación, a saber por medio de cebadores específicos de metilación u oligonucleótidos bloqueadores, y además en la que
- e)
- la detección de los amplificados se realiza por medio de una sonda de detección en tiempo real, según lo descrito anteriormente.
De preferencia, donde la amplificación posterior
de d) se realiza por medio de los cebadores específicos de
metilación, según lo descrito anteriormente, dichos cebadores
específicos de metilación comprenden una secuencia que tiene una
longitud de al menos 9 nucleótidos que hibridan a una secuencia de
ácido nucleico tratado según una de SEC ID Nº: 962 a SEC ID Nº: 965
y sus secuencias complementarias, en la que la secuencia de bases de
dichos oligómeros comprende al menos un dinucleótido CpG. De más
preferencia, donde la amplificación posterior de d) se realiza por
medio de los cebadores específicos de metilación, según lo descrito
anteriormente, dichos cebadores específicos de metilación
comprenden una secuencia que tiene una longitud de al menos 9
nucleótidos que hibridan a una secuencia de ácido nucleico tratado
según una de SEC ID Nº: 962 - 965 y sus secuencias complementarias,
en la que la secuencia de bases de dichos oligómeros comprende al
menos un dinucleótido CpG.
En una forma de realización alternativa de más
preferencia del procedimiento, la amplificación posterior de d) se
realiza en presencia de oligonucleótidos bloqueadores, como se
describió anteriormente. Dichos oligonucleótidos bloqueadores
comprenden una secuencia que tienen una longitud de al menos 9
nucleótidos que hibridan a una secuencia de ácido nucleico tratado
según una de SEC ID Nº: 961 a 965 y sus secuencias complementarias,
en la que la secuencia de bases de dichos oligómeros comprende al
menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA. De preferencia dichos
oligonucleótidos bloqueadores comprenden una secuencia que tienen
una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibridan a una secuencia
de ácido nucleico tratado según una de SEC ID Nº: 962 - 965 y sus
secuencias complementarias, en la que la secuencia de bases de
dichos oligómeros comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG o
CpA. La etapa e) del procedimiento, a saber la detección de los
amplificados específicos indicadores del estado de metilación de
una o más posiciones de CpG de acuerdo con la SEC ID Nº: 961 se
realiza por medio de los procedimientos de detección en tiempo real
según lo descrito anteriormente.
Posteriormente a la determinación del estado de
metilación del ácido nucleico genómico se deduce el pronóstico del
cáncer de próstata basándose en el estado de metilación de al menos
una secuencia de dinucleótidos CpG de SEC ID Nº: 961, o un
promedio, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de
una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG de SEC ID Nº:
961. De preferencia, dicho pronóstico está basado en el estado de
metilación de al menos una secuencia de dinucleótidos CpG de los
genes PITX2, o un promedio, o un valor que refleja un estado de
metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos
CpG de SEC ID Nº: 961. La hipometilación de dichas posiciones de
CpG está asociada con buen pronóstico, y la hipermetilación está
asociada con mal pronóstico. La hipermetilación está asociada en
general con la expresión baja de ARNm y por consiguiente de
polipéptidos. El punto de corte para determinar la hipo e
hipermetilación puede ser la mediana del nivel de metilación para
una población dada, o es de preferencia un nivel de corte
optimizado. Para el análisis de PITX2 resulta de preferencia que el
corte esté entre 20% y 10% de metilación, y de más preferencia
14,27%.
Donde los procedimientos según la presente
invención de análisis de expresión (de más preferencia por medio de
análisis de metilación), de los marcadores descritos en el presente
documento (de preferencia PITX2) se usan para determinar el
pronóstico de un cáncer de próstata, dichos procedimientos se usan
de preferencia en combinación con otras variables clínicas de
pronóstico usadas para determinar el pronóstico. De más preferencia
la puntuación de Gleason pero también incluidos la puntuación de
nomograma y el nivel de PSA (es decir que dichas variables se
tienen en consideración o se toman en cuenta). En una forma de
realización de preferencia de la invención el análisis de expresión
del pronóstico de cada uno de los marcadores PITX2 según se describe
en el presente documento se lleva a cabo en pacientes que presentan
cáncer de próstata confinado al órgano (T2). PITX2 tiene una
ventaja particular para determinar el pronóstico del cáncer de
próstata T2, mientras que es una práctica clínica habitual
considerar que todos los pacientes que presentan cáncer de próstata
T2 tienen un buen pronóstico. Según la presente invención dichos
pacientes T2 con mal pronóstico (hipermetilación) tendrían un
pronóstico más típico de pacientes que presentan cáncer de próstata
T3 (no confinado al órgano) y pueden ser tratados adecuadamente.
Además, el análisis de expresión del pronóstico de cada uno de los
marcadores PITX2 tiene más utilidad en el análisis de los pacientes
que presenta puntuación de Gleason alta (8 o superior). Se
considera de manera coherente que dichos pacientes tienen un mal
pronóstico, sin embargo por medio del procedimiento descrito en el
presente documento de análisis de expresión de PITX2 es posible por
primera vez diferenciar pacientes con puntuación de Gleason alta
con un mal pronóstico (hipermetilación) de los que tienen un buen
pronóstico. Actualmente se considera que todos los pacientes con
puntuación de Gleason alta son candidatos para tratamiento
coadyuvante posterior a la cirugía, por consiguiente el
procedimiento según la invención permite la prevención del
tratamiento excesivo de dichos
pacientes.
pacientes.
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Además, un aspecto adicional de la presente
invención es el uso de un kit que comprende, por ejemplo: un
reactivo que contiene bisulfito; una serie de oligonucleótidos
cebadores que contienen al menos dos oligonucleótidos cuyas
secuencias en que cada caso corresponden, son complementarias, o
hibridan bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas a un
segmento de 16 bases de las secuencias SEC ID Nº: 961 a 965;
oligonucleótidos y/u oligómeros de PNA; así como las instrucciones
para realizar y evaluar el procedimiento descrito. En otra forma de
realización de preferencia, dicho kit puede comprender además
reactivos convencionales para realizar un análisis de metilación
específico de posición de CpG, en el que dicho análisis comprende
una o más de las siguientes técnicas: MS-SNuPE,
MSP, MethyLight^{TM}, HeavyMethyl^{TM}, COBRA, y secuenciación
de ácidos nucleicos. Sin embargo, un kit según las líneas de la
presente invención puede también contener solo parte de los
componentes mencionados anteriormente. De preferencia, dicho kit
comprende un reactivo que contiene bisulfito; una serie de
oligonucleótidos cebadores que contienen al menos dos
oligonucleótidos cuyas secuencias en que cada caso corresponden,
son complementarias, o hibridan bajo condiciones rigurosas o
altamente rigurosas a un segmento de 16 bases de las secuencias SEC
ID Nº: 962 a 965; oligonucleótidos y/u oligómeros de PNA; así como
las instrucciones para realizar y evaluar el procedimiento descrito.
En otra forma de realización de preferencia, dicho kit puede
comprender además reactivos convencionales para realizar un análisis
de metilación específico de posición de CpG, en el que dicho
análisis comprende una o más de las siguientes técnicas:
MS-SNuPE, MSP, MethyLight^{TM},
HeavyMethyl^{TM}, COBRA, y secuenciación de ácidos nucleicos. Sin
embargo, un kit según las líneas de la presente invención puede
también contener solo parte de los componentes mencionados
anteriormente.
La invención descrita proporciona además el uso
de una composición de la materia útil para proporcionar un
pronóstico de los pacientes con cáncer de próstata. Dicha
composición comprende al menos un ácido nucleico con una longitud
de 18 pares de bases de un segmento de una secuencia de ácido
nucleico seleccionado del grupo constituido por SEC ID Nº:
962-965, y una o más sustancias tomadas del grupo
que comprende: cloruro de magnesio, dNTP, polimerasa taq, albúmina
sérica bovina, un oligómero en particular un oligonucleótido o un
oligómero de ácido péptido nucleico (PNA), comprendiendo dicho
oligómero en cada caso al menos una secuencia de bases que tiene
una longitud de al menos 9 nucleótidos que es complementaria, o
hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a un
ADN genómico pretratado según una de las SEC ID Nº:
962-965 y sus secuencias complementarias. Resulta
de preferencia que dicha composición de la materia comprenda una
disolución de tampón adecuada para la estabilización de dicho ácido
nucleico en una disolución acuosa y que permita que tenga lugar
reacciones basadas en la polimerasa dentro de dicha disolución. Los
tampones adecuados se conocen en la técnica y están
comercialmente
disponibles.
disponibles.
Mientras que la presente invención se ha
descrito específicamente según algunas de sus formas de realización
de preferencia, los siguientes Ejemplos y Tablas sirven sólo para
ilustrar la invención y no tienen la finalidad de limitar la
invención dentro de los principios y el ámbito de las amplias
interpretaciones y configuraciones equivalentes de la misma.
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Tablas
1-12
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El objetivo de la presente invención es
desarrollar marcadores genéticos que puedan identificar pacientes
con cáncer de próstata que tienen tumores agresivos con potencial
metastásico. Se decidió usar el análisis de metilación para
identificar marcadores genómicos expresados de manera
diferencial.
La investigación comenzó con una amplia etapa de
selección del genoma para descubrir marcadores nuevos. Este enfoque
utiliza procedimientos de biología molecular para la determinación
de la metilación diferencial entre grupos predefinidos de muestras
de pacientes. Las secuencias metiladas identificadas de manera
diferencial usando dichos procedimientos de selección genómica se
denominan en el presente documento marcadores de metilación de
secuencias (también denominados MeSTs). La amplia etapa de selección
del genoma identifica sitios CpG metilados de manera diferencial.
Se obtiene información adicional con respecto al área alrededor del
sitio CpG identificado por medio del análisis BLAST de la secuencia
hallada en la etapa de selección (MeSTs o marcador de metilación de
secuencias) y por medio del mapeo al genoma humano.
Tras la identificación de los candidatos por la
amplia selección del genoma, se desarrollaron ensayos MSP
MethyLight^{TM} para una subserie de candidatos promisorios. Estos ensayos se usaron para analizar la metilación en 56 muestras de prostatectomía con información de resultado clínico. Los ensayos MSP MethyLight^{TM} son sensibles y cuantitativos y se basan en la cometilación de CpG. Por consiguiente, el formato de este ensayo proporciona datos complementarios a la tecnología de matriz de ADN.
MethyLight^{TM} para una subserie de candidatos promisorios. Estos ensayos se usaron para analizar la metilación en 56 muestras de prostatectomía con información de resultado clínico. Los ensayos MSP MethyLight^{TM} son sensibles y cuantitativos y se basan en la cometilación de CpG. Por consiguiente, el formato de este ensayo proporciona datos complementarios a la tecnología de matriz de ADN.
Todos los candidatos de MeST promisorios y
algunos otros candidatos se analizaron a continuación por matriz de
metilación de oligonucleótidos usando la tecnología de chip
propiedad del solicitante según se describe a continuación con más
detalle. Este procedimiento proporciona información con respecto al
rendimiento preliminar de los genes de los MeSTs o genes candidato
si se usa una serie de muestras adecuadas. Los marcadores candidato
se seleccionarán basándose en datos obtenidos del análisis de datos
del chip. La selección se basa principalmente en la AUC del
marcador en la discriminación entre las clases deseadas.
Para completar el proceso de desarrollo, los
marcadores candidato seleccionados para el desarrollo del ensayo
del estudio del chip se probaron en ensayos de PCR en tiempo real
para más validación sobre la población diana y sobre el material de
la muestra usado para una potencial prueba de diagnóstico o de
pronóstico (tejidos incluidos en parafina).
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Ejemplo
1
Se usó ADN genómico combinado de muestras de
cáncer de próstata para la amplia selección del genoma de marcadores
asociados con la agresividad del tumor. Se aplicaron dos
procedimientos diferentes: reacción en cadena de la polimerasa
cebada arbitrariamente específica de la metilación
(MS-APPCR) (Liang y col., 1998) y amplificación de
la isla de CpG metilada (Toyota y col., 1999). Estas tecnologías
distinguen entre sitios CpG metilados y no metilados a través del
uso de enzimas sensibles a la metilación. En general, el ADN
genómico se corta con una enzima de restricción sensible a la
metilación. De preferencia se amplifican los fragmentos metilados
porque la escisión en sitios no metilados evita la amplificación de
las dianas no metiladas. Los fragmentos del marcador de secuencias
metiladas (MeST) obtenidos usando estas técnicas se secuencian y
mapean al genoma humano usando el programa BLAST en la base de
datos en Ensemble (www.ensembl.org).
La definición primaria de la agresividad del
tumor para la fase de selección se basó en la recurrencia de PSA
tras la prostatectomía radical. Se definió tumor agresivo al que
presentó recurrencia en menos de 24 meses. Se definió un tumor no
agresivo al que no presentó recurrencia tras al menos 48 meses de
seguimiento con pruebas de PSA regulares. Se combinaron cinco
muestras en cada categoría y hubo tres combinaciones por cada
categoría. La mediana del tiempo hasta la recurrencia de PSA para
los pacientes con tumores agresivos fue de 5,1 meses. La mediana
del tiempo de seguimiento para los pacientes sin recurrencia fue de
60,3 meses. Ninguno de estos pacientes recibió terapias
neoadyuvantes o adyuvantes antes de la recaída del PSA.
También incluimos otras cuatro comparaciones con
indicadores alternativos de agresividad. Se compararon muestras con
grados Gleason cuatro y cinco con muestras con grados Gleason uno,
dos y tres. Los tumores de estadio tardío (III y IV) se compararon
con los tumores con estadio temprano (I y II). Los tumores de zonas
periféricas se compararon con tumores de zonas de transición.
Finalmente, los tejidos normales adyacentes a los tumores en
pacientes con recurrencia temprana de PSA (< 2 años) se
compararon con tejidos normales adyacentes a tumores en pacientes
sin recurrencia de PSA (> 4 años de seguimiento).
El procedimiento de selección Mest usualmente da
como resultado un gran número de secuencias que representan
marcadores potenciales. Algunas de ellas son redundantes o no pueden
hacerse coincidir con el genoma. Las secuencias restantes se
seleccionan usando un procedimiento de puntuación que evalúa:
Aparición usando múltiples procedimientos.
Aparición en comparaciones de combinaciones
múltiples del mismo tipo.
Localización en la isla de CpG.
Localización en la región del promotor.
Localización cerca o dentro de la secuencia del
gen.
Asociación de los genes vecinos con el
cáncer.
Clase de gen (factor de transcripción, factor de
crecimiento, etc.).
Elemento repetitivo (puntuación negativa).
En este esquema de puntuación, una secuencia de
MeST recibe un punto por cada uno de los criterios positivos
(primeros siete criterios), y recibe una puntuación de menos 8 por
tener contenido de secuencias repetitivas mayor del 50% (puntuación
negativa). En el último caso el MeST siempre tiene puntuación
general negativa. Las Tablas 2 y 3 resumen los resultados de los
experimentos de selección de MeST.
Usando el criterio de puntuación y la
investigación basada en la bibliografía de la función potencial de
los genes, se seleccionaron 80 genes para el diseño del amplicón
del chip. Se priorizaron los MeST de las comparaciones basadas en
la recurrencia de PSA, pero se incluyeron muchos de los MeST de
otras comparaciones en la lista del diseño del amplicón.
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Ejemplo
2
Los ensayos MSP se desarrollaron en el
Taqman^{TM} 7900 para los candidatos potentes de la selección de
MeST para obtener datos tempranos sobre el rendimiento de los MeST
como marcadores de agresividad del cáncer de
próstata.
próstata.
Según se usa en el presente documento, debe
entenderse el término MSP-MethyLight como un ensayo
que comprende la amplificación de una secuencia tratada con
bisulfito por medio de cebadores específicos de metilación y la
detección de las amplificaciones resultantes por medio de
oligonucleótidos de detección MSP-MethyLight
(denominados también "sondas").
Los ensayos MSP-MethyLight se
desarrollaron para un número de MeST (véase Tabla 12). Los ensayos
se probaron en ADN metilado artificialmente y en diluciones de ADN
metilado en ADN no metilado para asegurar el rendimiento del
ensayo. Todos los ensayos fueron capaces de amplificar tan poco como
100 picogramos de ADN metilado en presencia o ausencia de 20 a 100
nanogramos de ADN no metilado. La mayoría de los ensayos fueron
cuantitativos entre 0,1 y 100% de metilación.
De los 36 ensayos, 21 se metilaron en una
combinación de ADN de tumores de próstata. Estos 21 ensayos se
probaron en primer lugar en 46 muestras del proceso de selección.
Estas 46 muestras incluían 14 prostatectomías de pacientes que
recayeron en menos de 24 meses y 18 prostatectomías de pacientes que
no recayeron tras al menos 48 meses. Además, hubo catorce pacientes
sin información de seguimiento; nueve tenían Gleason alto
(Puntuación 8-10) y 5 tenían Gleason bajo
(Puntuación 2-6). Los datos de este experimento se
usaron para elegir siete ensayos para una serie de muestras
independientes.
La segunda serie de muestras estaba constituía
por 26 muestras congeladas de prostatectomías radicales de
pacientes con recurrencia temprana de PSA, con una mediana del
tiempo hasta la recurrencia de PSA de 6 meses, y 30 muestras de
pacientes sin recurrencia de PSA tras al menos 48 meses (la mediana
del tiempo de seguimiento fue de 60 meses). Los ensayos MethyLight
se usaron para medir la cantidad de ADN metilado en cada locus
comparando el ciclo umbral (Ct) con una curva patrón de ADN
metilado. Se usó un ensayo de control para medir la cantidad total
de ADN. Todas las muestras se procesaron por triplicado en todos los
ensayos. Las secuencias de cebadores y sondas se presentan en la
Tabla 12. Se usó la relación de ADN metilado a la cantidad total de
ADN para indicar el estado de metilación de cada candidato en cada
muestra.
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Los valores de metilación para cada ensayo se
usaron para construir las curvas de ROC (Figuras 2 a 8) y calcular
la sensibilidad, especificidad y los valores de p. Los datos se
resumen en la Tabla 4. Los valores de AUC para algunos de los
candidatos sugieren que la metilación del marcador podría tener
valor pronóstico. Seis candidatos tuvieron un AUC de 0,68 o
superior. Los candidatos más potentes, SEC. ID Nº: 19 (GPR7) y SEC.
ID Nº: 35 (región genómica secuencia abajo de FOXL2), fueron
significativos por una prueba de Wilcoxon tras la corrección de
Bonferroni. Cuando se establece la especificidad al 87% para estos
dos ensayos, la sensibilidad es de aproximadamente 50% para cada
uno. (Las SEC. ID Nº se correlacionan con los nombres de los genes
en la Tabla 11).
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Ejemplo
3
En el estudio de chip, se analizó un panel de
genes compuesto por los genes candidato los MeST seleccionados en
329 muestras usando la tecnología de micromatriz del
solicitante.
La serie de muestras incluyó 329 muestras
congeladas obtenidas de prostatectomías radicales. Sólo se
utilizaron muestras con un porcentaje estimado de tumor de al menos
70%, y la mediana del porcentaje estimado de tumor (en volumen) fue
del 90%. Algunos proveedores de muestras alcanzaron porcentaje de
tumor alto extrayendo una sección del centro de la próstata
congelada que se sabía que contenía tumor o por disección del tejido
normal fuera del tumor. Los pacientes que recibieron terapia
neoadyuvante no se excluyeron del estudio. No se usó información
clínica sobre supervivencia libre de enfermedad para ningún paciente
que recibía terapia adyuvante antes de la recurrencia de la
enfermedad.
Las puntuaciones de Gleason estaban disponibles
para prácticamente todas las prostatectomías. Para algunas
muestras, también estaba disponible para el solicitante la
puntuación de Gleason de la porción del tumor proporcionada. La
serie de muestras estaba constituida por muestras que cualificaban
para una de las dos categorías extremas de Gleason (alto o bajo),
muestras de los pacientes que cualificaron para las dos categorías
de recaída (temprana o sin recaída), o muestras que entraban en
múltiples categorías (por ejemplo, Gleason alto y recurrencia
temprana). Dentro de la serie de muestras, hubo 135 muestras con
puntuaciones de Gleason bajas (1+1, 2+1, 2+2, 2+3, 3+2 y 3+3). Hubo
99 muestras con puntuaciones de Gleason altas (3+5, 5+3, 4+4, 4+5,
5+4 y 5+5). Para algunas de las muestras, estaba disponible la
información del seguimiento clínico. Sesenta y cinco pacientes
experimentaron recurrencia de PSA en menos de dos años, y 88
pacientes no tuvieron recurrencia tras al menos 4 años de
seguimiento.
Se incluyeron muestras adicionales con objeto de
control. Para controlar la calidad y la funcionalidad de los
oligos, se usaron ADN no metilados (phi-29 DNA) y
ADN metilados artificialmente (Promega). Además, se procesaron 16
muestras de ADN de linfocitos en paralelo a las muestras de
prueba.
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La matriz contenía oligos que representan 62
candidatos diferentes. Cincuenta y uno de los candidatos eran MeST.
Un MeST, SEC. ID Nº: 32, estaba representado por dos amplicones no
solapados, ambos cerca del exón uno del gen. Para todos los MeST el
amplicón se diseñó tan cerca como fue posible de la secuencia del
MeST en una región rica en CpG. Se incluyó un amplicón para el gen
del cromosoma X ELK1 para el análisis de las muestras de linfocitos
de control de varones y mujeres.
Otros genes analizados incluyeron CCND2 (Ciclina
D2 Padar y col. 2003), CD44 (Woodson y col. 2004), EDNRB1 (receptor
B de endotelina; Woodson y col. 2004; Nelson y col. 1997), GSTP1
(glutatión S-transfereasa pi; Maruyama y col.
2002), RARB (receptor del ácido retinoico, beta: Singal y col.
2004), PTGS2 (prostaglandina-endoperóxido sintasa
2; Yegnasubramanian y col. 2004), RASSF1 (dominio de asociación a
Ras familia 1; Liu y col. 2002), ESR2 (receptor 2 de estrógeno; Zhu
y col. 2004), DRG1 (proteína 1 de unión a GTP regulada por
desarrollo; Bandyopadhyay y col. 2003), y CDKN2A (p16); Halvorsen y
col 2000). DRG1 estaba representado con dos amplicones. En todos
los casos, se marcaron las áreas ricas en CpG cerca del promotor o
del exón 1. Para p16, se usó el área rica en CpG que abarca el exón
2 porque en la bibliografía se han indicado tasas de metilación
superiores (Nguyen y col.
2000).
2000).
En la Tabla 11 puede encontrarse una visión de
conjunto completa de todos los genes analizados.
\vskip1.000000\baselineskip
Desde intensidades de hibridación sin tratar
hasta tasas de metilación.
El log de la tasa de metilación
(log(CG/TG)) en cada posición de CpG se determinó según un
proyecto de preprocesamiento estandarizado:
- -
- Para cada mancha se resta la mediana de intensidad de píxel de fondo de la mediana de intensidad de pixel del primer plano. Esto da una buena estimación de las intensidades de hibridación con corrección del fondo;
- -
- Para ambos oligonucleótidos de detección CG y TG de cada posición CpG, se toma la mediana con corrección del fondo de las 4 intensidades de mancha redundantes;
- -
- Para cada chip y cada par de oligos CG/TG, se calcula la relación log (CG/TG); y
- -
- Para cada muestra, se toma la mediana de las intensidades log (CG/TG) sobre las repeticiones redundantes del chip.
Esta relación log tiene la propiedad de que el
ruido de hibridación tiene aproximadamente varianza constante sobre
la variedad total de posibles tasas de metilación (Huber y col.,
2000).
El análisis de componentes principales (PCA)
proyecta vectores de medición (por ejemplo datos de chip, perfiles
de metilación en varios sitios CpG, etc.) en un sistema de
coordinadas nuevo. El nuevo sistema de coordenadas se denomina
componentes principales. El primer componente principal extiende la
dirección de la varianza mayor de los datos. Los componentes
posteriores están ordenados por varianza decreciente y son
ortogonales y no están correlacionados unos con otros. Las
diferentes posiciones de CpG contribuyen con diferentes pesos a la
extensión de la nube de datos a lo largo de los diferentes
componentes. El PCA es una técnica no supervisada, es decir no
tiene en cuenta ninguna información del grupo o etiqueta de los
datos puntuales. (Para más detalles véase por ejemplo
Ripley,
1996)
1996)
El PCA se usa típicamente para convertir datos
de dimensión alta (en nuestro caso datos de la matriz de metilación)
en subespacios de dimensión baja para visualizar o extraer
características con varianza alta de los datos. En el presente
informe usamos proyecciones bidimensionales para el control de la
calidad estadística de los datos. Investigamos el efecto de
diferentes parámetros del proceso en los datos del chip y
descartamos que los parámetros cambiantes del proceso causaran
grandes alteraciones en los valores de medición.
Se usó una versión potente de PSA para detectar
chips con valores atípicos únicos y excluirlos del análisis
posterior (Model y col., 2002).
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Para controlar la estabilidad general del
proceso de producción de chips utilizamos procedimientos del campo
del control estadísticos multivariable de procesos (MVSPC). Nuestra
herramienta principal es el gráfico de control T^{2} que se usa
para detectar desviaciones significativas del proceso del chip de
las condiciones de trabajo normales (Model y col., 2002).
El gráfico T^{2} se construye de la siguiente
manera:
- 1.
- Ordenar los datos del chip con respecto a un parámetro del proceso (por ejemplo fecha de hibridación o robot de manchado);
- 2.
- Definir una serie de datos históricos, que describe el proceso del chip bajo condiciones normales de trabajo (por ejemplo los primeros 75 chips hibridados). En el gráfico, los datos de la serie histórica de datos se indican por medio de un símbolo especial; y
- 3.
- Computar la distancia de cada nuevo chip a la serie histórica de datos. Si la distancia de varios chips consecutivos excede un límite de control dado debe considerarse el proceso fuera de control.
Usar los gráficos T^{2} para controlar que el
proceso de producción de chips nos permite detectar y eliminar de
manera eficaz las fuentes de error más sistemáticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Nuestra tarea principal es identificar
marcadores que puedan hacer una contribución significativa a la
predicción de clases de muestras. Se detecta una contribución
significativa cuando la hipótesis nula de que un modelo de
predicción que incluye el marcador no mejora el rendimiento de
clasificación sobre un modelo sin el marcador puede rechazarse con
p < 0,05. Como aplicamos esta prueba a una serie completa de
marcadores potenciales, debemos corregir los valores de p para
pruebas múltiples. Realizamos esto aplicando la corrección
conservadora de Bonferroni, que simplemente multiplica los valores
de p de los marcadores únicos con el número de marcadores
potenciales probados. También damos los resultados con el
procedimiento menos conservador de Tasa de Detección de Falsos
(FDR) (Dudoit y col., 2002).
A lo largo de este informe un marcador (algunas
veces denominado simplemente gen o amplicón) es una región genómica
de interés (ROI). Está constituido generalmente por varias
posiciones de CpG en el área respectiva. Para probar la hipótesis
nula de que un marcador no tiene poder predictivo usamos la prueba
de sumas de categorías de Wilcoxon. Un resultado significativo de
la prueba (p < 0,05) indica un cambio entre las distribuciones
de los logaritmos del cociente de metilación respectivos, es decir
In(CG/TG). Se usó la media de todos los oligos para
cada marcador para combinar las CpG antes de generar la estadística
de Wilcoxon. Este enfoque tiene la ventaja de que favorece los
marcadores que muestran cometilación.
Un valor de p significativo para un marcador
significa que la metilación de esta ROI tiene alguna correlación
sistemática con la cuestión de interés dada por las dos clases. En
general, un valor de p significativo usando la prueba de sumas de
categorías de Wilcoxon también implica buen rendimiento de
clasificación.
El análisis de las característica operativas del
receptor (ROC) se usó para estimar que tan bien puede diferenciar
el conjunto de CpG de un marcador seleccionado entre diferentes
clases de tejidos. Una curva de ROC es un gráfico de tasa de
positivos verdaderos (sensibilidad) frente a la tasa de positivos
falsos (1 -especificidad) para un marcador sobre todos los umbrales
posibles de la prueba. El área bajo la curva (AUC) de una curva de
ROC da la probabilidad de clasificar adecuadamente una muestra
aleatoria y de esta manera puede usarse para evaluar el rendimiento
general del marcador. El AUC está relacionado con la estadística de
la prueba de Wilcoxon y la categorización comparativa de marcadores
por AUC o valores de p de Wilcoxon es equivalente. La media de
todos los oligos para cada marcador se usó para combinar las CpG
antes del análisis de ROC. Este enfoque tiene la ventaja de que
favorece los marcadores que muestran cometilación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recibieron muestras de colaboradores externos
como tejidos congelados o ADN genómico extraído. El ADN de las
muestras de tejidos se aisló en Epigenomics Berlin usando el Kit
Qiagen DNA Mini.
Primero se evaluó la calidad del ADN de todas
las muestras enviadas y extraídas por medio de mediciones
fotométricas. Se determinaron las extinciones a 260 nm y 280 nm así
como las relaciones A260/280 y se calcularon las concentraciones
resultantes. Para la mayoría de los ADN usados, se determinaron
relaciones A260/280 entre 1,6 y 1,9 que indicaron pureza
suficiente. Para algunas muestras se calcularon relaciones en el
intervalo de 1,2-1,5. Sin embargo, estos ADN se
procesaron también.
Tras las mediciones fotométricas se aplicaron
200 ng de ADN genómico a un gel de agarosa al 0,8% y se realizó la
electroforesis en gel. La Figura 8 muestra una imagen típica del
gel. No se observaron o sólo se observaron pequeños signos de
degradación, indicando una buena calidad general del ADN usado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ADN genómicos totales de todas las muestras
seleccionadas así como los ADN de control se trataron con bisulfito
convirtiendo las citosinas no metiladas en uracilo. Las citosinas
metiladas son conservadas. El tratamiento con bisulfito se realizó
usando el procedimiento de tratamiento con bisulfito dioxano de
Epigenomics. Para evitar un procesamiento conjunto de todas las
muestras con el mismo fondo biológico que da como resultado un
proceso de sesgo potencial más tarde en los datos, las muestras se
agruparon aleatoriamente en lotes de procesamiento. Se
aleatorizaron lotes de 50 muestras para la puntuación de Gleason y
el resultado de PSA. Se realizaron dos reacciones de bisulfito
independientes por muestra de ADN. Tras el tratamiento con
bisulfito, se usaron 11,25 ng de cada muestra en 8 reacciones de
PCR multiplex (mPCR) posteriores conteniendo cada una 8 pares de
cebadores.
Para controlar los resultados de la mPCR, se
realizó electroforesis en gel para todos los productos de PCR. Para
encontrar la mejor composición de los 8 pares de cebadores en una
serie de mPCR, se usó el análisis ALF, comparando una mezcla de
productos de PCR únicos con diferentes variantes de series de
mPCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la evaluación de los fragmentos
amplificados, se analizaron los productos de mPCR del ADN Promega
usando la tecnología de expresión ALF. Los resultados para los mPCR
se compararon con la mezcla de productos de PCR únicos. La Figura 9
ilustra los resultados de un PCR 8-plex. Los 64
fragmentos (ocho PCR 8-plex) seleccionados para el
estudio podían amplificarse en los experimentos realizados de mPCR.
En algunos casos se obtuvieron subproductos indeseados.
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Como se mencionó anteriormente se realizaron dos
reacciones de bisulfito independientes y PCR por muestra de ADN y
los productos de PCR obtenidos se aplicaron a un gel de agarosa al
2%. En la Figura 10 se muestra una imagen típica del gel que
ilustra el rendimiento de la mPCR para 10 muestras. La ausencia de
productos de PCR visibles implica el fallo del tratamiento de
bisulfito o la amplificación por PCR. A continuación se repitió la
PCR con dos veces la cantidad de ADN (22,5 ng). Los ADN tratados con
bisulfito que volvieron a fallar se excluyeron del estudio. Si se
obtenía sólo una sonda de hibridación (64 productos de PCR
combinados) de una muestra, se hibridaban 4 chips usando esta única
sonda. Si las sondas de dos tratamientos de bisulfito
independientes de una muestra se amplificaban satisfactoriamente,
ambas sondas se hibridaban en dos chips cada una.
\newpage
Cuatro (4) de las 331 muestras procesadas
(incluidas las muestras de control) no pudieron amplificarse, a
pesar de varios intentos. Estas muestras no se procesaron más.
\vskip1.000000\baselineskip
Nuestro análisis primario fue una comparación de
muestras con puntuaciones de Gleason altas (8-10) y
puntuaciones de Gleason bajas (2-6 sin componentes
de grado 4 ó 5). Estas clases son las categorías A y C en la Tabla
5. Para nuestra segunda comparación, usamos un grupo de muestras de
pacientes con recurrencia de PSA temprana tras la cirugía (< 2
años) y un grupo sin recurrencia (> 4 años de seguimiento). Estas
clases son A1, B1, C1 y D1 para el grupo sin recurrencia y A2, B2,
C2 y D2 para el grupo con recurrencia (véase Tabla 5). Estas dos
series de muestras (Gleason y resultado clínico) se solaparon de
alguna manera. Nuestra tercera comparación analizó sólo pacientes
con Gleason intermedio (3+4, 4+3, 2+5, 5+2, 2+4, 4+2), para
determinar si la metilación de nuestras secuencias candidato se
correlacionan con la recurrencia temprana en estos pacientes. Por
consiguiente, sólo se incluyeron las categorías B1 y B2.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar el valor diagnóstico del chip, se
incluyeron en el estudio dieciséis muestras de linfocitos. Los
tejidos de cáncer de próstata y los linfocitos se compararon usando
la estadística de sumas de categorías de Wilcoxon. En la Figura 12
se da una representación categorizada para las diez mejores
amplificaciones. Mientras que el grupo de linfocitos es de alguna
manera homogéneo, la figura muestra una mayor variabilidad para las
muestras de cáncer de próstata. Las diferencias entre los grupos son
significativas al nivel 0,05 (tras la corrección de la tasa de
descubrimientos falsos del 5%) para los amplificados de CDRN2A,
ELK1, GSTP1, RARB, PTGS2, RASSF1, ESR2, ONECUT2, BTG4, SLC35F2,
HOXB5, LIMK1, HIST1 H4J, SEC. ID Nº: 35, EPAS1, NOTCH1, SEC. ID Nº:
55, PTPRN2, Q9NP73, MX1, DOCK10, CCND2, ISL1, SNAPC2, GRN, H2AFY2,
WDFY3, FOS, FAT, Q86SP6, SLC38A1, SNRPN, GPRK5, FBN2, ARHGEF18,
RHOC, KBTBD6, NR2E1, PSD, DRG1, Q8N365, SEC. ID Nº: 44, Q96S01,
CD37, CMYA3, SEC. ID Nº: 61, Q8NCX8 y ZNF566.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó la estadística de categorías de Wilcoxon
para analizar las diferencias en los perfiles de metilación de los
pacientes clasificados como Gleason alto (puntuación
8-10) y Gleason bajo (puntuación
2-6, sin componente de grado 4 o 5). La clase
Gleason alto está constituida por 98 muestras y la clase Gleason
bajo está constituida por 135 muestras. La Figura 12 muestra los
resultados de este análisis. Para 25 amplificaciones, el valor de p
corregido por Bonferroni de la prueba de Wilcoxon está por debajo de
0,05. Para una discusión de la importancia biológica véase la
sección a continuación. La Figura 13 muestra la matriz de metilación
de los 10 mejores marcadores.
El AUC/sensibilidad/especificidad de los
amplificados de marcadores candidatos se dan en la Tabla 6.
La Figura 13 muestra la matriz de metilación de
Gleason alto frente a Gleason bajo de los 10 marcadores con mejor
AUC. Cada columna representa una muestra; cada fila un
oligonucleótido (1, 2 ó 3 sitios de CpG cada uno). Los
oligonucleótidos están agrupados por candidato de marcador. Los
marcadores indicados están ordenados desde la parte superior a la
inferior con AUC crecientes. En el lado derecho de cada marcador se
dan los valores de p de Wilcoxon corregidos por Bonferroni y el
AUC. Debajo del AUC se dan los valores de sensibilidad y una
especificidad de - 0,75 entre paréntesis. Los datos de metilación
están centrados y normalizados a una desviación estándar para
oligonucleótidos individuales.
El color representa la distancia relativa del
estado de metilación del oligonucleótido del valor medio. El gris
claro representa CpG hipometilados dentro de un oligonucleótido
mientras que el gris oscuro indica CpG hipermetilados dentro de un
oligonucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación analizamos las diferencias en los
perfiles de metilación clasificados como recurrencia temprana
(recaída de PSA en menos de 24 meses) y sin recurrencia (sin recaída
de PSA tras al menos 4 años).
Para tres (3) amplificaciones el valor de p
corregido por Bonferroni de la prueba de tasa de probabilidad (LR)
está por debajo de 0,05. Para una discusión de la importancia
biológica véase a continuación.
El AUC/sensibilidad/especificidad de las
principales amplificaciones de marcadores se dan en la Tabla 7.
\newpage
La Figura 15 muestra la matriz de metilación de
recurrencia temprana frente a sin recurrencia de los 10 marcadores
con mejor AUC. Cada columna representa una muestra; cada fila un
oligonucleótido (1, 2 ó 3 sitios de CpG cada uno). Los
oligonucleótidos están agrupados por candidato de marcador. Los
marcadores indicados están ordenados desde la parte superior a la
inferior con AUC crecientes. En el lado derecho de cada marcador se
dan los valores de p de Wilcoxon corregidos por Bonferroni y el
AUC. Debajo del AUC se dan los valores de sensibilidad y una
especificidad de - 0,75 entre paréntesis. Los datos de metilación
están centrados y normalizados a una desviación estándar para
oligonucleótidos individuales.
El color representa la distancia relativa del
estado de metilación del oligonucleótido del valor medio. El gris
claro representa CpG hipometilados dentro de un oligonucleótido
mientras que el gris oscuro indica CpG hipermetilados dentro de un
oligonucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
Finalmente, analizamos las diferencias en los
perfiles de metilación de muestras con Gleason intermedio de
pacientes clasificados como recurrencia temprana (recaída de PSA en
menos de 24 meses) y sin recurrencia (sin recaída de PSA tras al
menos 4 años). Gleason intermedio incluyó todos los pacientes con
puntuaciones 2+5, 5+2, 3+4, 4+3, 2+4, 4+2, 1+5, 5+1, y estos
pacientes son una subserie del grupo usado en la sección 6.6.2. La
mayoría eran Gleason 3+4 o 4+3. Aunque ninguna amplificación mostró
un valor de p corregido por Bonferroni inferior a 0,05, varios
marcadores mostraron AUC prometedores (véase Tabla 8). Es probable
que esta comparación tuviera baja potencia por la serie de muestras
pequeña para esta comparación.
Para una discusión de la importancia biológica
véase a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Por el diseño del estudio de chip actual, fuimos
capaces de determinar áreas dentro de los fragmentos marcadores que
estaban cometiladas. En este diseño, al menos dos pares de oligos,
cada uno conteniendo 1, 2 o 3 sitios de CpG, se incluyeron para
cada fragmento del marcador analizado. En las Figuras 16 y
siguientes pueden encontrarse detalles de los sitios de CpG
marcados en el análisis de matriz. Las pruebas de cometilación son
evidentes en las figuras de matrices categorizadas. En las figuras
de matrices categorizadas del análisis de micromatrices cada
fragmento del marcador está agrupado de manera horizontal. Puesto
que cada fragmento del marcador representa de uno a tres amplicones
y un mínimo de cuatro y hasta treinta sitios de CpG individuales,
puede determinarse extensa información con respecto al estado de
metilación del fragmento. Los cuadros gris oscuro consecutivos
dentro de la agrupación de un fragmento en una dirección vertical
indican cometilación de los oligonucleótidos (y CpG dentro de ese
oligo). Estos datos se analizarán además para las áreas más
discriminadoras dentro de un fragmento y esta información se
utilizará para el diseño del ensayo de PCR en tiempo real.
\vskip1.000000\baselineskip
En el análisis primario, una comparación de
muestras de Gleason alto y bajo, 25 marcadores cumplieron los
criterios para significación estadística usando metodología
estadística muy conservadora. Esta comparación se basa en Gleason
como un indicador alternativo de agresividad, pero se usó como el
análisis primario porque la información de Gleason estaba
disponible para prácticamente todos los tumores. Menos muestras
estaban disponibles para otros análisis, basados en el tiempo hasta
la recaída de PSA, pero incluso dos marcadores alcanzaron
significación
estadística.
estadística.
\vskip1.000000\baselineskip
El proceso de selección de MeST fue muy
satisfactorio, dando más de 400 candidatos. En los estudios de PCR
en tiempo real y de chip, los candidatos de MeST funcionaron bien.
En el estudio de PCR en tiempo real, tres MeST superaron GSTP1. En
el estudio de chip, los cinco candidatos principales en la
comparación de Gleason son todos MeST. Por consiguiente, el proceso
de selección contribuyó con marcadores candidatos valiosos para
distinguir tumores agresivos y no agresivos.
Además, los MeST de todas las comparaciones de
selección estaban representados en la lista de los principales
candidatos de puntuación. El marcador candidato principal en la
comparación de Gleason, GPR7, se descubrió en dos comparaciones de
resultado, la comparación de Gleason, y la comparación basada en el
estadio. Otro candidato principal, DOCK10, se descubrió en la
comparación basada en la zona prostática. De los marcadores
principales, sólo ABHD9 se descubrió en la comparación de tejido
normal adyacente a los tumores de pacientes en las dos categorías
de resultado. Concluimos que todas las comparaciones de la amplia
selección del genoma seleccionado dieron marcadores candidatos
importantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se eligieron muchos MeST candidatos para el
desarrollo del ensayo de PCR en tiempo real mientras se recogían
las muestras para el estudio de chip. Los ensayos se
preseleccionaron en una muestra combinada de ADN de muchas muestras
de tumores de próstata. Esta etapa permitió preseleccionar sólo los
ensayos que podían ser potencialmente informadores. Más de un
tercio de los ensayos se descartaron en esta etapa. A continuación,
los ensayos restantes se probaron en el ADN de las muestras de
selección para priorizar los ensayos. Posteriormente, en la serie
final de 56 muestras independientes, seis de los siete ensayos
priorizados funcionaron bien.
El éxito del experimento de PCR en tiempo real
sugiere que hay significativa cometilación en estos marcadores. Por
consiguiente, los ensayos de PCR en tiempo real, que requieren todos
cierto grado de cometilación, serán candidatos adecuados para una
elección de ensayo final. El experimento de PCR en tiempo real se
basó en gran medida en la cuantificación de las diferencias de
metilación: Para casi todos los ensayos, la diferencia entre el
grupo de recurrencia temprana y el grupo de no recurrencia fue una
diferencia cuantitativa de metilación. El tipo de ensayo final
necesitará capacidades cuantitativas potentes.
\vskip1.000000\baselineskip
El experimento de chip fue muy satisfactorio,
demostrando potencial marcador para muchas secuencias de candidatos.
En la comparación de muestras de Gleason alto y bajo, 25 amplicones
fueron significativamente diferentes. La gran mayoría de estos
están hipermetilados en las muestras de Gleason alto. Los tres
candidatos analizados por PCR en tiempo real estaban entre los seis
principales marcadores en esta comparación de Gleason. Por
consiguiente, hay coherencia entre los dos procedimientos de
medición de la metilación.
La comparación basada en las características de
recaída de PSA de los pacientes tuvo una cantidad inferior de
muestras. A pesar de estos números bajos, aún pudimos probar que al
menos tres (3) de nuestros marcadores candidatos pueden distinguir
significativamente pacientes que experimentan recaída temprana de
pacientes que no experimentan recaída. En general, la metilación es
más alta en los pacientes que experimentan recurrencia temprana. En
esta comparación, los tres principales candidatos en el estudio de
PCR en tiempo real eran los tres marcadores principales más
significativos en el análisis de chip. Las AUC para GPR7, SEC. ID
Nº: 35 (secuencia abajo de FOXL2) y ABHD9 fueron respectivamente
0,72, 0,72 y 0,66 en los datos de resultados clínicos del chip y
0,76, 0,75 y 0,70 respectivamente en los datos de resultados
clínicos de PCR en tiempo real.
El tratamiento para los pacientes con Gleason
alto y bajo es con frecuencia claro. Se recomendará a cualquier
paciente con Gleason alto el tratamiento agresivo, incluido el
tratamiento definitivo (cirugía o radiación) y posiblemente terapia
adyuvante. Los pacientes con Gleason bajo tienen la opción de
diferir el tratamiento definitivo. Mientras que aún hay algunas
incertidumbres para estos pacientes, las mejores opciones son
incluso menos claras para los pacientes con niveles de Gleason
intermedios. Además, la mayoría de los pacientes con diagnóstico de
cáncer de próstata actualmente tienen puntuaciones de Gleason
intermedias de 6 ó 7. Estos son los pacientes que pueden recibir
mayor ayuda por una prueba de clasificación molecular. Los
amplicones con las AUC mayores en las comparaciones basadas en los
resultados clínicos fueron GPR7 (AUC = 0,72) y SEC. ID Nº: 35 (AUC
= 0,72). Cuando se restringió esta comparación a los pacientes con
Gleason intermedio (1+5, 5+1, 2+4, 4+2, 3+4, 4+3, 2+5, 5+2), el AUC
para estos dos marcadores fue aún 0,72 o superior. Estos resultados
sugieren que un ensayo basado en la metilación proporcionará
información incluso para pacientes con puntuaciones de Gleason en
el intervalo
medio.
medio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificaron varios marcadores interesantes
por medio de los estudios de PCR en tiempo real y de chip. Uno de
los marcadores de PCR en tiempo real es el receptor acoplado a la
proteína G (GPR7; SEC. ID Nº: 19), sin embargo se sabe muy poco
sobre el producto del gen. Un segundo marcador del estudio en tiempo
real está localizado en la isla de CpG en el promotor del gen que
contiene el dominio Abhidrolasa 9 (ABHD9; SEC. ID Nº: 37). El gen
más cercano a la SEC. ID Nº: 35 es FOXL2. El MeST está en una isla
de CpG varias kilobases secuencia abajo de este gen. La SEC. ID Nº:
63 está en un área con varios genes de histona.
En el estudio de chip surgieron otros
marcadores. NOTCH1 (SEC. ID Nº: 41) controla una vía de señalización
que regula las interacciones entre células adyacentes. Muchos
laboratorios han estudiado la función de este gen en la
carcinogénesis y en la metástasis. Poco se sabe sobre muchos de los
candidatos, incluidos DOCK10 (SEC. ID Nº: 16), SEC. ID Nº: 51, que
está en el promotor de un gen llamado repetición Kelch y 6 que
contiene el dominio BTB (POZ) y SEC. ID Nº: 17, que está localizado
entre un EST y el gen 4 de traslocación de células B. Se ha
mostrado que BTG4 tiene propiedades inhibidoras del crecimiento
(Buanne y col. 2000).
PTGS2 (SEC. ID Nº: 9) es el único gen que se
mostró previamente en la bibliografía que está más metilado en los
tumores prostáticos de los pacientes que tuvieron recurrencia pronto
después de la prostatectomía (Yegnasubramanian y col. 2004). PTGS2,
conocido también como ciclooxigenasa (COX2), es otro candidato
promisorio tanto en el análisis de Gleason como en el de resultado
clínico, con AUC de 0,69 y 0,65 respectivamente. GSTP1 es el
marcador de metilación más estudiado en cáncer de próstata, y
aunque no hay datos publicados que demuestren directamente su valor
pronóstico, existen algunas pruebas de que su metilación se
correlaciona con el grado Gleason (Maruyana y col. 2002). Sin
embargo, esta correlación no se confirmó en otro estudio (Woodson y
col. 2004). En los presentes datos, la metilación de GSTP1 se
correlaciona significativamente con el grado Gleason, pero el AUC en
la comparación de resultado clínico es sólo de 0,58.
\vskip1.000000\baselineskip
Los candidatos de metilación que han surgido de
nuestra comparación de Gleason son marcadores informadores del
pronóstico. Hemos mostrado que algunos de estos candidatos que se
correlacionan con las categorías de Gleason pueden también predecir
la recaída de PSA, incluso en pacientes con puntuaciones de Gleason
intermedias. Por consiguiente es probable que nuestro análisis
basado en Gleason proporcione marcadores que proporcionen
información adicional a Gleason.
Como marcadores individuales los candidatos de
chip alcanzan una sensibilidad de 40-60% cuando se
establece la especificidad en 75%. En el estudio en tiempo real, la
sensibilidad de tres de los marcadores fue más alta, alcanzando
50-60% a una especificidad de 85%. El mejor
rendimiento en el tiempo real puede deberse a las capacidades
cuantitativas de MSP-MethyLight. Aproximadamente el
20% de los pacientes experimentaron recaídas dentro de los
5-10 años tras la cirugía. Si se establecía esto
como la prevalencia de tumores agresivos en la población de
prostatectomía radical, entonces un marcador tal como los nuestros
con un 50% de sensibilidad y 85% de especificidad tendría un valor
predictivo negativo de 0,87 y un valor predictivo positivo de 0,45%.
Por consiguiente, un marcador con este rendimiento definiría un
grupo de pacientes con sólo un 13% de probabilidad de recurrencia
tras la cirugía y un grupo de pacientes con un 45% de probabilidad
de recurrencia. El primer grupo podría controlarse sólo para el
aumento de PSA, y el segundo grupo serían candidatos para las
terapias adyuvan-
tes.
tes.
Aunque estos candidatos se han estudiado en
muestras de prostatectomía, también serán útiles para el análisis
de biopsias. Un marcador que predice resultados tras la
prostatectomía se correlaciona con la agresividad y el potencial
metastásico del tumor, y estas propiedades estarán también presentes
en la biopsia. Tras la biopsia y las pruebas de estadificación, los
pacientes optan por la espera vigilada, terapia de curación
definitiva, o una combinación de tratamientos (tales como cirugía
más radiación o ablación de andrógenos). Una prueba molecular con
valor predictivo negativo alto permitirá a más pacientes elegir la
espera vigilada. Una prueba molecular con valor predictivo positivo
suficientemente alto seleccionará una subserie de pacientes quienes
no deberán recibir radiación o cirugía sola. Por consiguiente, estos
marcadores de metilación candidatos tienen el potencial para
reducir tanto el tratamiento por defecto como por exceso del cáncer
de próstata.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El ADN genómico se analizó usando la técnica de
PCR en tiempo real tras la conversión con bisulfito.
El ensayo QM (= ensayo cuantitativo de
metilación) es un procedimiento basado en PCR en tiempo real para la
detección cuantitativa de la metilación del ADN. El principio de
ensayo se basa en la amplificación específica de la no metilación
de la región diana y una detección específica de la metilación por
hibridación competitiva de dos sondas diferentes específicas para
el estado de CG o TG, respectivamente. Para el presente estudio, se
usaron sondas TaqMan que se marcaron con dos colorantes
fluorescentes diferentes ("FAM" para las sondas específicas de
CG, "VIC" para las sondas específicas de TG) y se modificaron
además por medio de una molécula inactivadora ("TAMRA" o
"Minor Groove Binder/inactivador no fluorescente").
La evaluación de los datos sin tratar del ensayo
QM es posible con dos procedimientos diferentes:
\vskip1.000000\baselineskip
En las siguientes series de ensayos
cuantitativos de metilación se cuantifica la cantidad de ADN de la
muestra amplificado por referencia al gen GSTP1 para normalizar la
entrada de ADN. Para la estandarización, los cebadores y la sonda
para el análisis del gen GSTP1 carecen de dinucleótidos CpG de
manera que la amplificación es posible independientemente de los
niveles de metilación. Como no hay posiciones variables de
metilación, sólo es necesario un oligonucleótido de sonda.
Las reacciones se calibran por referencia a
patrones de ADN de niveles conocidos de metilación para cuantificar
los niveles de metilación dentro de la muestra. Los patrones de ADN
estaban compuestos por ADN genómico amplificado con phi29 tratado
con bisulfito (es decir no metilado), y/o ADN genómico amplificado
con phi29 tratado con la enzima Sss1 metilasa (metilando de esta
manera cada posición CpG en la muestra), que a continuación se
trata con disolución de bisulfito. Se usaron siete patrones de
referencia diferentes con 0%, (es decir ADN genómico amplificado
con phi29 solo), 5%, 10%, 25%, 50%, 75% y 100% (es decir ADN
genómico amplificado con phi29 y Sss1
solo).
solo).
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento con bisulfito se llevó a cabo
basándose en el procedimiento descrito por Olek y col. Nucleic
Acids Res. 15 de diciembre de 1996;
24(24):5064-5066, y optimizado por el volumen
de trabajo del laboratorio del solicitante.
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones se calibran por referencia a
patrones de ADN de niveles conocidos de metilación para cuantificar
los niveles de metilación dentro de la muestra. Los patrones de ADN
estaban compuestos por ADN genómico humano amplificado con phi29
tratado con bisulfito (Promega) (es decir no metilado), y/o ADN
genómico amplificado con phi29 tratado con la enzima Sss1 metilasa
(metilando de esta manera cada posición CpG en la muestra), que a
continuación se trata con disolución de bisulfito. Se usaron siete
patrones de referencia diferentes con 0%, (es decir ADN genómico
amplificado con phi29 solo), 5%, 10%, 25%, 50%, 75% y 100% (es decir
ADN genómico amplificado con phi29 y Sss1 solo). Se trataron lotes
de 2000 ng de ADN genómico humano (Promega) con bisulfito. Para
generar el MDA ADN metilado, se trataron 13 tubos de 4,5 \mug MDA
ADN (700 ng/\mul) con
Sss1.
Sss1.
\vskip1.000000\baselineskip
El diseño del ensayo GSTP1-C3 lo
hace adecuado para cuantificar los ADN de diferentes fuentes,
incluidas muestras frescas/congeladas, muestras remotas tales como
plasma o suero, y ADN obtenido de muestras de archivo tal como
material incluido en parafina. Se usaron los siguientes
oligonucleótidos para amplificar la amplificación de
control:
control:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se desarrollaron dos ensayos para el análisis
del gen PITX2 (SEC. ID Nº: 961)
Las posiciones de los cebadores, las sondas y
los dinucleótidos CpG están resaltadas.
Componentes de PCR (suministrados por
Eurogentec): tampón de MgCl_{2} 3 mM, 10x tampón, Hotstart TAQ,
dNTP 200 \muM, cada cebador 625 nM, cada sonda 200 nM.
Las posiciones de los cebadores, las sondas y
los dinucleótidos CpG están resaltadas.
Las sondas cubren tres posiciones de CpG
cometiladas.
Componentes de PCR (suministrados por
Eurogentec): tampón de MgCl_{2} 2,5 mM, 10x tampón, Hotstart TAQ,
dNTP 200 \muM, cada cebador 625 nM, cada sonda 200 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La extensión de la metilación en un locus
específico se determinó por medio de las siguientes fórmulas: Usando
intensidad de fluorescencia absoluta: tasa de metilación = 100 * I
(CG)/(I(CG)) + I(TG) (I = Intensidad de la
fluorescencia de sonda CG o sonda TG).
Usando el ciclo umbral Ct: tasa de metilación =
100*CG/(CG+TG)= 100/(1 +TG/CG)= 100/(1
+2\Lambdadelta(ct))
(asumiendo eficacia de PCR E=2; delta (Ct)= Ct
(metilado) - Ct (no metilado)).
El objetivo principal de esta fase de la
investigación era confirmar la importancia de los candidatos de
marcadores identificados previamente y optimizar los puntos de
corte de metilación. Los marcadores deberían ser adecuados para
separar pacientes sometidos a prostatectomía en dos grupos: uno con
una alta probabilidad de recurrencia de PSA y uno con una baja
probabilidad de recurrencia de PSA. Además, los marcadores deberían
proporcionar información adicional al análisis de grado de Gleason.
Los marcadores que cumplan estos criterios tendrán un papel clínico
importante en la selección de pacientes con prostatectomía para la
terapia adyuvante.
El solicitante ha identificado previamente
varios marcadores con niveles de metilación significativamente más
altos en pacientes que experimentaron recurrencia de PCA dentro de
los 24 meses de la cirugía comparados con los pacientes que no
experimentaron recurrencia de PCA (véase anteriormente Ejemplos 1 a
4). Seis de estos marcadores se transformaron a una plataforma de
tiempo real (Ensayo QM). Estos ensayos se usaron para analizar los
niveles de metilación de 612 muestras de prostatectomía incluidas en
parafina de una cohorte de pacientes con nódulos negativos de tres
instituciones.
El objetivo primario de la invención era
proporcionar marcadores que puedan diferenciar entre pacientes con
baja probabilidad de recurrencia de PSA tras la cirugía y los que
tienen una alta probabilidad de recurrencia de PSA. También se
proporciona el rendimiento de estos marcadores comparado con los
indicadores de pronóstico tradicionales tales como el grado de
Gleason y la información de estadio. Es otro objetivo de la presente
invención determinar donde son más informadores los marcadores con
relación a las evaluaciones clínicas de pronóstico actuales y por
consiguiente proporcionar formas de realización particularmente de
preferencia de uso de la presente invención. Resulta
particularmente de preferencia que una prueba molecular según la
presente invención se combine, formal o informalmente, con la
información de otras fuentes de pronóstico, en particular el grado
de
Gleason.
Gleason.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada ensayo QM se desarrolló para mejorar el
rendimiento sin alterar drásticamente las condiciones estándar para
permitir el análisis multiplex futuro. Las concentraciones de
cebadores y sondas, la concentración de MgCl_{2} y la temperatura
de hibridación se optimizaron bajo condiciones fijadas de tampón y
polimerasa. Los ensayos se diseñaron y optimizaron para asegurar el
análisis cuantitativo de metilación de cada marcador entre el 10 y
el 100 por ciento de metilación. Los productos del ensayo se
controlaron en un gel de agarosa y no se detectaron productos
indeseados. Los resultados del procedimiento de optimización se
muestran en las siguientes tablas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron muestras de tejido de
prostatectomía incluidas en parafina de 605 pacientes. Las muestras
fueron proporcionadas por el Baylor College of Medicine SPORE,
Stanford University Department of Urology, y Virginia Mason
Hospital en Seattle. Las muestras de Stanford y de Virginia Mason se
prepararon encontrando en primer lugar el bloque quirúrgico con el
mayor porcentaje de tumor, seccionando a continuación el bloque. Se
prepararon tres tubos, cada uno con tres secciones de 10
micrómetros de grosor. El procedimiento fue ligeramente diferente
en Baylor. Se retiró una parte central de tejido del tumor dentro
del bloque de prostatectomía, y a continuación se cortó esta parte
central en secciones de 10 micrómetros. Se incluyeron diez secciones
en cada uno de los tres
tubos.
tubos.
Se montó una sección adyacente en un
portaobjetos y se realizó la tinción de HyE para el análisis
histológico. Un patólogo revisó estos portaobjetos para realizar
una determinación independiente del grado de Gleason y del
porcentaje de tumor. Los resultados de Gleason se usaron para todos
los análisis en este informe. Los valores originales de Gleason del
proveedor están disponibles, pero no se usaron para el análisis por
los sesgos conocidos e hipotéticos entre los proveedores. Stanford,
por ejemplo, usa un porcentaje de Gleason 4/5 para informar el
grado, mientras que los otros dos proveedores usan el sistema
tradicional. Los valores de Gleason medidos proporcionaron una
medición independiente y uniforme.
Se encontró que unas pocas muestras no tenían
células tumorales en el portaobjetos con tinción HyE, y estos
pacientes se excluyeron del análisis. Además, encontramos unos pocos
pacientes que no tenían un nivel más bajo de PSA tras la cirugía.
Estos pacientes también se excluyeron del estudio. En total, se
incluyeron 612 pacientes en el análisis de datos.
Debido a su técnica de muestra central, el
porcentaje de tumor de las muestras proporcionadas por Baylor fue
superior al de los otros proveedores. Todos los pacientes con edades
de entre 40 y 80 años, sometidos a cirugía en las tres
instituciones durante ciertos años se incluyeron en este estudio,
con excepción de los pacientes que recibieron terapia neoadyuvante
o adyuvante (antes de la elevación del PSA) y los pacientes con
nódulos positivos en el momento de la cirugía. Para Baylor, el
período de tiempo fue 1993-1998, para Virginia Mason
fue 1996-2000, y para Stanford fue
1996-1999.
La cohorte total es similar a otras cohortes de
prostatectomía descritas en la bibliografía, tal como la cohorte
recogida por William Catalona y descrita en 2004 (Roehl y col.). Las
cohortes de pacientes de cada proveedor son similares para casi
todos los parámetros clínicos. Una excepción es el tipo de
recurrencia. Mientras que otras instituciones típicamente esperan
hasta que el PSA del paciente aumente hasta 0,2 ng/ml o más tras la
cirugía, el Standford Department of Urology trata a muchos pacientes
cuando su PSA aumenta hasta 0,05. Por consiguiente, Stanford tiene
una tasa superior de recurrencia basada en el criterio de decisión
de tratamiento y una tasa inferior de recurrencia basada en el
criterio de nivel de PSA (0,2 ng/ml). Véase sección 6.1 para un
resumen de los criterios de definición de acontecimientos. La Figura
89 proporciona un histograma de tiempos de seguimiento para la
cohorte de pacientes (se incluyen los tres proveedores). Las barras
blancas están constituidas por los pacientes que no tuvieron
recurrencia antes de ser excluidos, y las barras sombreadas están
constituidas por los pacientes que experimentaron recurrencia.
Seleccionando los pacientes que recibieron la cirugía desde 1993
hasta 2000, aseguramos que la mediana del tiempo de seguimiento de
la cohorte (66 meses) es suficientemente prolongada para tener un
número significativo de pacientes que han recaído.
Para desparafinar, las 627 muestras PET
proporcionadas se procesaron directamente en el tubo en el que
fueron enviadas por los proveedores. Se añadió un ml (Virginia
Mason y Baylor) o 1,8 ml (Stanford) de limoneno a cada tubo y se
incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos en un mezclador
térmico con agitación ocasional por medio de vórtex. Las muestras
se centrifugaron a 16.000 x g durante 5 minutos. Se eliminó el
sobrenadante de limoneno, y de no detectarse sedimento, se repitió
la centrifugación a velocidad más alta y se eliminó el limoneno
restante. Para las muestras de Stanford, el proceso para
desparafinar se repitió una vez con 1,6 ml de limoneno para
eliminar la parafina residual.
Para lisar el tejido, se añadieron 190 \mul de
tampón de lisis y 20 \mul de proteinasa K a cada muestra
desparafinada. Para las muestras de Stanford, se usaron 570 \mul
de tampón de lisis y 60 \mul de proteinasa K. Tras agitar con
vórtex, las muestras se centrifugaron brevemente y se incubaron en
un agitador térmico a 60ºC durante 40 horas. Tras la incubación, se
controlaron las muestras para asegurar que la lisis era completa, y
a continuación se inactivó la proteinasa a 95ºC durante 10 minutos.
Si las muestras lisadas no se usaban directamente para la
extracción del ADN, se almacenaban a -20ºC.
Los lisados se aleatorizaron en base al
proveedor de la muestra y a la recurrencia del PSA. El ADN se aisló
usando un kit QIAGEN DNeasy Tissue con pocas modificaciones, se
distribuyeron 400 \mul de tampón AL/E en los tubos de recogida y
se añadieron 200 \mul de lisado. Las muestras se mezclaron por
agitación durante 15 segundos.
Las mezclas lisado/tampón se aplicaron a las
columnas de placa de 96 pocillos DNeasy. Se selló la placa y se
centrifugó a 5790 x g durante 10 minutos. Las columnas se lavaron
una vez con 500 \mul de AW1 y a continuación con 500 \mul de
AW2. El ADN se eluyó con 120 \mul de tampón AE. Por consiguiente,
el volumen final del ADN extraído fue de aproximadamente 120
\mul. El ADN se almacenó a -20ºC.
\newpage
El ensayo de PCR en tiempo real de CFF se usó
para cuantificar la concentración de ADN de las muestras tras la
extracción.
Ajustamos la concentración de cada ADN genómico
de manera que estuviera presente 1 ug de ADN medido de CFF1 en 44
\mul. El tratamiento con bisulfito del ADN genómico obtenido del
tejido incluido en parafina se realizó usando un protocolo de 96
pocillos. Se colocaron cuarenta y cuatro \mul de ADN genómico (con
aproximadamente 1 \mug de ADN amplificable), 83 \mul de
disolución de bisulfito 4,9 M (pH 5,45-5,5), y 13
\mul de disolución DME con pipeta en los pocillos de la placa.
Las muestras se mezclaron minuciosamente y a continuación se
colocaron en un termociclador con el siguiente programa:
- -
- 5:00 minutos de desnaturalización de ADN a 99ºC.
- -
- 22:00 minutos de incubación a 60ºC.
- -
- 3:00 minutos de desnaturalización de ADN a 99ºC.
- -
- 1:27:00 horas de incubación a 60ºC.
- -
- 3:00 minutos de desnaturalización de ADN a 99ºC.
- -
- 2:57:00 horas de incubación a 60ºC.
- -
- Enfriamiento a 20ºC.
Tras las incubaciones, cada muestra se separó en
dos alícuotas de 70 \mul. Cada alícuota se combinó con 280 \mul
de tampón AVL/ARN vehículo preparado y 280 \mul de etanol. Se
sellaron los pocillos y las muestras se mezclaron vigorosamente
durante 15 segundos. Se incubó la placa durante 10 minutos a
temperatura ambiente. La primera alícuota se aplicó en la placa
OIAamp 96 y la placa se centrifugó durante cuatro minutos a 5790 x
g. El proceso se repitió con la segunda alícuota de manera que ambas
alícuotas se aplicaron a la misma columna de unión. Se lavaron las
columnas con 500 \mul de tampón AW1, a continuación con 500 \mul
de NaOH 0,2 M, y posteriormente con 500 \mul de tampón AW2. El
ADN se eluyó con 100 \mul de tampón de elución (Qiagen) calentado
previamente hasta 70ºC. Los bisADN se almacenaron a -20ºC.
Las muestras de ADN tratadas con bisulfito se
almacenaron en 8 placas de 96 pocillos (placa
01-08). Las muestras y los controles se combinaron
en dos placas de reacción de PCR de 384 pocillos para cada ensayo
QM. Cada placa de ensayo QM contenía las muestras de 4 placas de 96
pocillos (85 pocillos usados realmente por placa) y 1 placa de 96
pocillos con ADN patrón (7 mezclas del ADN de calibración y agua
para la reacción de PCR sin control por molde).
Las placas de ensayo QM se analizaron tres
veces.
Las placas de PCR de 384 pocillos se pipetearon
con la estación de trabajo TECAN. El programa de pipeteado
transfirió primero 10 \mul de mezcla maestra y a continuación 10
\mul del ADN respectivo en el pocillo designado. La mezcla
maestra se transfirió con pipeta a un tubo falcon y se distribuyó a
8 viales de 500 \mul con tapón de rosca para el pipeteo
automático con la estación de trabajo TECAN.
Todos los ensayos QM se realizaron en un
dispositivo de tiempo real ABI TAQMAN 7900HT (programa informático
SDS 2.2.) con un volumen de reacción de 20 \mul. Los ensayos de
PITX2 y CCND2 se realizaron con la simulación 9600, y los otros
ensayos no. Se usó una configuración automática de muestras para
transferir los nombres de muestra correctos y los colorantes
detector/informador al programa informático TAQMAN. Las condiciones
de ciclos se ajustaron manualmente y se usó ROX como colorante
pasivo de referencia. Todas las placas de PCR de 384 pocillos que
analizamos con el programa informático SDS2.2 usando la
configuración de análisis manual (configuración basal con valores
de inicio y parada y umbral manual) para producir archivos de
resultados para cada una se tratan de manera individual.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras una prostatectomía exitosa en un paciente
con enfermedad no metastásica, no deberían quedar células
prostáticas en su cuerpo y por consiguiente sus niveles de PSA
deberían caer hasta cero. Los niveles de PSA de un paciente se
miden típicamente cada 6-12 meses tras la cirugía
para asegurar que el paciente permanece libre de cáncer de
próstata. Si el PSA se vuelve detectable y aumenta hasta cierto
nivel, el médico y el paciente pueden decidir una terapia
adicional. Por consiguiente, el retorno y el aumento de los niveles
de PSA son la indicación principal de recurrencia de la
enfermedad.
Una recaída de PSA postquirúrgica está indicada
típicamente por un aumento gradual o rápido en los niveles sobre
una serie de pruebas secuenciales. Según las características
clínicas del paciente o el enfoque de la institución, los pacientes
pueden tratarse ni bien se detecta el PSA, cuando alcanza cierto
umbral, o cuando los síntomas clínicos acompañan el aumento de PSA.
La mayoría de las instituciones consideran significativo un nivel
de PSA de 0,2 ng/ml, y si el PSA de un paciente alcanza este nivel y
se confirma que aumenta en pruebas posteriores, se le ofrecerá
terapia adicional. El Stanford Department of Urology, uno de los
proveedores de muestras, considera el nivel 0,05 ng/ml como
recurrencia de PSA, y considera el tratamiento para los pacientes
cuando su PSA alcanza este nivel.
Un acontecimiento en este estudio incluye todas
las recurrencias basadas en PSA. Se ha demostrado que un nivel de
PSA de 0,2 ng/ml, confirmado en pruebas posteriores, proporciona la
mejor sensibilidad y especificidad para la detección de la
recurrencia (Freedland y col. 2003). El aumento de PSA hasta este
nivel por lo general precede a cualquier desarrollo de recurrencia
clínica; por consiguiente, casi todos los pacientes en este estudio
están libres de recurrencia clínica en el momento de la recurrencia
de PSA. Como Stanford frecuentemente trata a los pacientes con
recurrencia de PSA antes de que alcancen este punto de corte de 0,2
ng/ml, muchos de sus pacientes de recurrencia serían excluidos en
el presente estudio si el nivel de PSA de 0,2 ng/ml, fuera el único
acontecimiento considerado. Por consiguiente los pacientes de
cualquiera de las tres instituciones que reciben terapia por los
niveles de PSA también se consideran un acontecimiento en este
estudio. Para resumir, se define un acontecimiento en el presente
estudio como cualquier aumento en el PSA hasta 0,2 ng/ml (confirmado
en una prueba posterior) O una decisión de tratar al paciente
basada en el criterio de PSA.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los análisis en este informe se basan en
la evaluación de CT. Asumiendo condiciones óptimas de PCR en tiempo
real en la fase de amplificación exponencial, la concentración de
ADN metilado (C_{met}) puede determinarse por
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde
CT_{CG} significa el ciclo umbral del
informador de CG (canal FAM) y
CT_{TG} significa el ciclo umbral del
informador de TG (canal VIC).
Los umbrales de los ciclos se determinaron por
inspección visual de los gráficos de amplificación (Guía del
usuario del ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System). Los
valores para los ciclos (CT_{CG} y CT_{TG}) se calcularon con
estos umbrales por medio del programa informático ABI 7900. Cuando
la curva de amplificación no excedía el umbral, el valor del ciclo
se establecía hasta un ciclo máximo por ejemplo 50.
El paquete de programas R, versión 2.2.
(Gentleman and lhaka 1997), se usó para el análisis estadístico.
Además, usamos el paquete "survival",
versión 2.11-5
(http://cran.at.r-project.org/src/contrib/Descriptions/
survival.html), para el análisis de supervivencia. Se usó el código del propietario para la validación cruzada k veces, análisis ROC y funciones de gráficos. Cada serie de datos está representada en un objeto de datos del propietario, denominado "Matriz de datos anotados" (ADM). Este objeto de datos contiene las medidas tras realizar el control de calidad y promediar, así como las anotaciones necesarias para las muestras y ensayos.
survival.html), para el análisis de supervivencia. Se usó el código del propietario para la validación cruzada k veces, análisis ROC y funciones de gráficos. Cada serie de datos está representada en un objeto de datos del propietario, denominado "Matriz de datos anotados" (ADM). Este objeto de datos contiene las medidas tras realizar el control de calidad y promediar, así como las anotaciones necesarias para las muestras y ensayos.
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Se incluyó una serie de mezclas de
MDA-ADN metilado y MDA-ADN no
metilado, que varían desde 0 hasta 100 por ciento de metilación, por
triplicado en cada placa de PCR de QM. Estos ADN se usaron para
asegurar el rendimiento uniforme del ensayo QM en todas las placas
de PCR. Todos los ensayos mostraron capacidad cuantitativa potente
entre 10 y 100%, y algunos ensayos fueron capaces de distinguir de
manera coherente ADN 5% metilado del ADN no metilado.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras el control de calidad, se analizó cada
ensayo estadísticamente.
\vskip1.000000\baselineskip
La relación entre tiempos de supervivencia libre
de recurrencia (RFS) y las covariables se analizaron usando
Cox.
Modelos de riesgo proporcionales (Cox and Oates
1984; Harrel 2001).
El riesgo, es decir el riesgo instantáneo de una
recaída, se modela como
para el análisis de regresión de
una variable y de múltiples variables, respectivamente, donde
k es 10, m es 100, t es tiempo medido en meses tras
la cirugía, h_{0}(t) es el riesgo basal (no
especificado), x_{i} son las covariables (por ejemplo
mediciones de los ensayos) y \beta_{i} son los coeficientes de
regresión (parámetros del modelo). \beta_{i} se estimará
maximizando la probabilidad parcial del modelo de riesgo
proporcional de
Cox.
Las pruebas de tasa de probabilidad se realizan
para probar si la metilación está relacionada con el riesgo. La
diferencia entre 2Log(probabilidad) del modelo completo y del
modelo nulo tiene una distribución aproximadamente \chi^{2} con
k grados de libertad bajo la hipótesis nula \beta_{1} =
... = \beta_{k} = 0.
Los supuestos de los riesgos proporcionales se
evaluaron por residuos escalados de Schoenfeld (Thernau and
Grambsch 2000). Para el cálculo, el análisis y diagnóstico del
Modelo de riesgo proporcional de Cox se usan las funciones de R
"coxph" y "coxph.zph" del paquete "survival".
\vskip1.000000\baselineskip
Para los modelos de regresión de Cox múltiples
se usó un procedimiento por etapas (Venables and Ripley 1999;
Harrel 2001) para hallar submodelos que incluyan sólo variables
relevantes. Se logran usualmente dos efectos por medio de estos
procedimientos:
- -
- Las variables (tasas de metilación) que están básicamente no relacionadas con la variable dependiente (DFS/MFS) se excluyen ya que no añaden información relevante al modelo.
- -
- Fuera de una serie de variables muy correlacionadas, sólo se mantiene la que tiene mejor relación con la variable dependiente. La inclusión de ambos tipos de variables puede dar lugar a inestabilidades numéricas y pérdida de potencia. Además, el rendimiento del predictor puede ser bajo por el sobreajuste.
El algoritmo aplicado está dirigido a minimizar
el criterio de información de Akaike (AIC).
El AIC está relacionado con el rendimiento de un
modelo, valores más bajos prometen mejor rendimiento. Mientras que
la inclusión de otras variables siempre mejora el ajuste del modelo
e incrementa de esta manera la probabilidad, el segundo término
penaliza la estimación de los parámetros adicionales. El mejor
modelo presentará un modelo de compromiso con buen ajuste y
usualmente un número pequeño o moderado de variables. El cálculo de
la regresión por etapas con AIC se realiza con la función de R
"step".
\vskip1.000000\baselineskip
Las curvas de supervivencia se estimaron de los
datos de RFS usando el estimador de Kaplan-Meier
para supervivencia (Kaplan and Meier, 1958). Las pruebas
Log-rank (Cox and Oates 1984) se usaron para probar
las diferencias de dos curvas de supervivencia, por ejemplo
supervivencia en grupos hipermetilados frente a hipometilados.
Además, se aplicó una variante de la prueba Log-rank
denominada usualmente prueba generalizada de Wilcoxon (para una
descripción véase Hosmer and Lemeshow 1999). Para el análisis de
Kaplan-Meier se usan las funciones "survfit" y
"survdiff" del paquete "survival".
\vskip1.000000\baselineskip
Para controlar si los marcadores presentes dan
información adicional e independiente, se incluyeron otros factores
clínicos relevantes en el modelo de riesgo proporcional de Cox y se
calcularon los valores de p para los pesos de cada factor (prueba
de Wald) (Thernau y col. 2000). Para el análisis de los factores
adicionales en el modelo de riesgo proporcional de Cox, se usa la
función de R "coxph".
\vskip1.000000\baselineskip
No se realizaron correcciones para las pruebas
múltiples.
\vskip1.000000\baselineskip
Para las variables numéricas, se realizó la
estimación de densidad de núcleo con un ancho de banda variable y
de núcleo gaussiano. El ancho de banda se determina usando la regla
del pulgar de Silverman (Silverman 1986). Para el cálculo de las
densidades se usa la función de R "density".
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento para calcular la sensibilidad y
especificidad usando la fórmula de Bayes se basó en las estimaciones
de Kaplan- Meier (Heagerty y col. 2000) para las probabilidades de
supervivencia en los grupos positivo para marcador y negativo para
marcador para un tiempo dado T_{umbral}. Las curvas de ROC
se calcularon para diferentes tiempos de referencia
T_{umbral} (3 años, 4 años, 5 años, 6 años).
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Para el análisis de selección de modelo y
potencia del modelo se usó la validación cruzada k veces (Hastie y
col. 2001). La serie de observaciones se separa aleatoriamente en k
partes. A su vez, cada parte se usó como una serie de prueba,
mientras que las restantes k-1 partes constituyen la
serie de entrenamiento. Este procedimiento se repite m veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Se procesaron las 605 muestras como se describió
anteriormente. Todas las muestras se analizaron con seis ensayos QM
de marcadores con tres repeticiones. Los datos se filtraron por el
control de calidad, y se analizaron como se describió en la sección
de procedimientos. El rendimiento clínico de cada marcador se resume
a continuación y las curvas de supervivencia de
Kaplan-Meier y las curvas de ROC según las figuras
90 a 95. Los valores de p para la comparación de las curvas de
supervivencia informados en los gráficos se basan en la prueba
Log-rank común. Los resultados de usar la prueba
generalizada de Wilcoxon son esencialmente los mismos (no se
muestran los
datos).
datos).
El rendimiento de los marcadores se examinó en
primer lugar usando la mediana del nivel de metilación como punto
de corte. Puesto que este punto de corte se fijó antes de ver los
datos, los valores de p pueden usarse para evaluar el rendimiento
de los marcadores. Cualquier marcador con un valor de p
significativo usando la mediana de metilación como punto de corte
se considera validado. La mediana del nivel de metilación puede no
ser el mejor punto de corte para todos los marcadores, y para estos
marcadores la separación de pronóstico puede optimizarse más
eligiendo el punto de corte de metilación que da como resultado el
valor de p más bajo. Puesto que el punto de corte está optimizado
específicamente para el valor de p, el valor de p no puede usarse
más para indicar la significancia estadística.
Para evaluar la significancia del rendimiento
del marcador usando la mediana de metilación como punto de corte,
usamos un valor de p de 0,005 (asumiendo la corrección para 6
comparaciones). En base al valor de p (inferior a 0,008) y la
separación de acontecimientos, el candidato más potente es PITX2.
GPR7 junto con SEC. ID Nº: 35. Por consiguiente, estos dos
marcadores se consideran marcadores validados de pronóstico
postquirúrgico del cáncer de próstata. SEC. ID Nº: 63 fue no
significativo usando la mediana del nivel de metilación como punto
de corte (valores de p: 0,018 y 0,0059), pero funciona bien cuando
se optimiza el punto de corte de metilación. Véase Tabla 17 para
los resultados.
La Figura 90 A muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del marcador PITX2 de
las 585 muestras de pacientes que pasaron el filtro de control de
calidad usando el valor de corte de metilación optimizado (13,5%).
La Figura 90B muestra el análisis de supervivencia de
Kaplan-Meier del marcador PITX2 usando el valor
predefinido de mediana de metilación como punto de corte, el valor
de p fue 0,000017. La Figura 90 C muestra el análisis de la curva
de ROC del marcador PITX2 tras 5 años de seguimiento. El punto de
corte de la mediana de metilación está marcado como un triángulo, y
el punto de corte de metilación optimizado se muestra como un
diamante. El AUC fue de 0,64. La Figura 91 A muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del marcador GPR7 de
las 596 muestras de pacientes que pasaron el filtro de control de
calidad usando el valor de corte de metilación optimizado (18,06%).
La Figura 91 B muestra el análisis de supervivencia de
Kaplan-Meier de dicho marcador usando el valor
predefinido de mediana de metilación como punto de corte, el valor
de p fue 0,0016. La Figura 91 C muestra el análisis de la curva de
ROC de dicho marcador tras 5 años de seguimiento. El corte de la
mediana de la metilación está marcado como un triángulo, y el punto
de corte de metilación optimizado se muestra como un diamante. El
AUC fue de 0,64.
La Figura 92 A muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del marcador SEC. ID
Nº: 63 de las 599 muestras de pacientes que pasaron el filtro de
control de calidad usando el valor de corte de metilación optimizado
(5,79%). La Figura 92 B muestra el análisis de supervivencia de
Kaplan-Meier de dicho marcador usando el valor
predefinido de mediana de metilación como punto de corte, el valor
de p fue 0,018. La Figura 92 C muestra el análisis de la curva de
ROC de dicho marcador tras 5 años de seguimiento. El punto de corte
de la mediana de metilación está marcado como un triángulo, y el
punto de corte de metilación optimizado se muestra como un
diamante. El AUC fue de 0,60. La Figura 93 A muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del marcador de SEC.
ID Nº: 35 de 598 muestras de pacientes que pasaron el filtro de
control de calidad usando el valor de corte de metilación
optimizado (36,77%). La Figura 93B muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier de dicho marcador
usando el valor predefinido de mediana de metilación como punto de
corte, el valor de p fue 0,059. La Figura 93C muestra el análisis
de la curva de ROC de dicho marcador tras 5 años de seguimiento. El
punto de corte de la mediana de metilación está marcado como un
triángulo, y el punto de corte de metilación optimizado se muestra
como un diamante. El AUC fue de 0,61.
La Figura 94 A muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del marcador ABHD9 de
592 muestras de pacientes que pasaron el filtro de control de
calidad usando el valor de corte de metilación optimizado (28,41%).
La Figura 94B muestra el análisis de supervivencia de
Kaplan-Meier de dicho marcador usando el valor
predefinido de mediana de metilación como punto de corte, el valor
de p fue 0,018. La Figura 94 C muestra el análisis de la curva de
ROC de dicho marcador tras 5 años de seguimiento. El punto de corte
de la mediana de metilación está marcado como un triángulo, y el
punto de corte de metilación optimizado se muestra como un diamante.
El AUC fue de 0,58.
La Figura 95 A muestra el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier del marcador CCND2 de
604 muestras de pacientes que pasaron el filtro de control de
calidad usando el valor de corte de metilación optimizado (2,22%).
La Figura 95B muestra el análisis de supervivencia de
Kaplan-Meier de dicho marcador usando el valor
predefinido de mediana de metilación como punto de corte, el valor
de p fue 0,22. La Figura 95 C muestra el análisis de la curva de
ROC de dicho marcador tras 5 años de seguimiento. El punto de corte
de la mediana de metilación está marcado como un triángulo, y el
punto de corte de metilación optimizado se muestra como un diamante.
El AUC fue de 0,61.
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Varios factores de pronóstico clínico se usan
comúnmente para evaluar el cáncer de próstata. El análisis
histológico del tumor con la cuantificación del estado de
diferenciación del tumor usando el sistema de clasificación de
Gleason es un indicador de pronóstico particularmente importante en
la práctica clínica actual. El análisis continuó determinando si
los marcadores podían mejorar en análisis de Gleason subdividiendo a
los pacientes dentro de una categoría de Gleason. También
investigamos si los marcadores podían añadir información a otros
indicadores de pronóstico, tales como la estimación del riesgo por
nomograma (Han y col. 2003) y el estadio de la enfermedad.
Para estos análisis, usamos el análisis de
Kaplan-Meier para determinar si nuestros marcadores
son aún informadores en los subgrupos de población, y el análisis
de regresión de Cox para determinar si los marcadores proporcionan
información independiente de las variables clínicas de pronóstico.
La puntuación de Gleason (usando el modelo Gleason de Charite) se
dividió en tres grupos (6 o inferior, 7, y 8 hasta 10), el estadio
se dividió en dos grupos (T2/confinado al órgano y T3/no confinado
al órgano), el PSA se dividió en cuatro grupos (0 a 4 ng/ml, 4 a 10
ng/ml, 10 a 20 ng/ml, y superior a 20 ng/ml), y la estimación por
nomograma de supervivencia libre de PSA de 5 años se dividió en dos
grupos (90 a 100% t 0 a 89%).
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Con el modelo de regresión de Cox, PITX2 es un
marcador de pronóstico valioso independiente de otra información de
pronóstico clínico (Tabla 18). Es decir, la metilación de PITX2
añade más información a Gleason que el PSA o el estadio de la
enfermedad. La tasa de riesgo para PITX2 es 2,2. En el análisis de
supervivencia de subgrupos, PITX2 tiene el potencial para ser un
marcador significativo para todos los pacientes con cáncer de
próstata.
Es particularmente de interés ver la gran
separación dentro del subgrupo de pacientes con enfermedad confinada
al órgano (Figura 96). Los pacientes con enfermedad confinada al
órgano (T2) deberían curarse por la cirugía. Los que no se curan
por la cirugía deben haber dejado salir algunas células de la
próstata antes de la cirugía, y por consiguiente tenían células
tumorales con características agresivas en fases tempranas del
desarrollo. PITX2 puede separar el grupo T2 en un grupo
hipometilado con muy poca probabilidad de recurrencia
(aproximadamente 5%) y un grupo hipermetilado con un pronóstico más
similar al de los pacientes T3.
La Figura 96 muestra el análisis de
supervivencia del rendimiento de PITX2 en subpoblaciones en base al
estadio. El gráfico superior de la izquierda muestra el rendimiento
del estadio de la enfermedad como un marcador de pronóstico. El
gráfico superior de la derecha muestra el rendimiento de PITX2 en
pacientes pT2. El gráfico inferior de la izquierda muestra el
rendimiento de PITX2 en pacientes pT3.
PITX2 es también capaz de estratificar pacientes
dentro de subcategorías de Gleason. La Figura 97 muestra que el
análisis de supervivencia en pacientes con Gleason bajo (Puntuación
5 ó 6) y pacientes con Gleason alto (Puntuación 8, 9 ó 10) da como
resultado valores de p bajos. Los pacientes con puntuaciones de
Gleason altas son actualmente candidatos para ensayos clínicos en
terapias adyuvantes postquirúrgicas. Pero los valores de PITX2
sugieren que este no es un grupo uniforme. Los pacientes con PITX2
hipometilado y Gleason alto tienen 85% de probabilidad de
supervivencia libre de enfermedad a los diez años, mientras que los
pacientes con Gleason alto y PITX2 hipermetilado tienen una
probabilidad muy baja (aproximadamente 35%). Estos pacientes con
probabilidad alta de recurrencia de la enfermedad son los pacientes
que deben seleccionarse para terapia adyuvante o ensayos
clínicos.
La Figura 97 muestra el análisis de
supervivencia del rendimiento de PITX2 en subpoblaciones en base a
las categorías de puntuación de Gleason. El gráfico superior de la
izquierda muestra el rendimiento de la puntuación de Gleason como
un marcador de pronóstico. Los pacientes con Gleason 5 y 6 se marcan
con A, los pacientes con Gleason 7 se marcan con B, y los pacientes
con Gleason 8, 9 y 10 se marcan con C. El gráfico superior de la
derecha muestra el rendimiento de PITX2 en pacientes con Gleason 5 y
6. El gráfico inferior de la izquierda muestra el rendimiento de
PITX2 en pacientes con Gleason 7. El gráfico inferior de la derecha
muestra el rendimiento de PITX2 en pacientes con Gleason 8, 9 y 10.
Los nomogramas de cáncer de próstata están creados en base a
grandes cohortes de pacientes. Estos combinan matemáticamente
información del estadio, Gleason, y los niveles de PSA
preoperatorios en un indicador de pronóstico. Como muestra la Figura
98, el nomograma por sí mismo es muy potente. Pero PITX2 es capaz
de subdividir más a los pacientes.
La Figura 98 muestra el análisis de
supervivencia del rendimiento de PITX2 en subpoblaciones en base a
la estimación del riesgo por nomograma. El gráfico superior de la
izquierda muestra el rendimiento del nomograma como un marcador de
pronóstico. El gráfico superior de la derecha muestra el rendimiento
de PITX2 en pacientes con un 90% de probabilidad de supervivencia
libre de PSA a los 5 años según el nomograma. El gráfico inferior
de la izquierda muestra el rendimiento de PITX2 en pacientes con
menos del 90% de probabilidad de supervivencia libre de PSA a los 5
años según el nomograma.
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº:
63
Con el análisis de regresión de Cox, SEC. ID Nº:
63 es un marcador de pronóstico valioso independiente de otra
información de pronóstico clínico (Tabla 19). La tasa de riesgo es
de 2,9. En el análisis de supervivencia de subgrupos, SEC. ID Nº:
63 parece tener el potencial para ser un marcador significativo para
algunos subgrupos, tales como los pacientes con Gleason alto
(Figura 99) y los pacientes con mal pronóstico basado en el
nomograma (Figura 100).
La Figura 99 muestra el análisis de
supervivencia del rendimiento de SEC. ID Nº: 63 en pacientes con
puntuación de Gleason 8, 9 y 10.
La Figura 100 muestra el análisis de
supervivencia del rendimiento de SEC. ID Nº: 63 performance en
pacientes con menos del 90% de probabilidad de supervivencia libre
de PSA a los 5 años según el nomograma.
SEC. ID Nº: 35 es un marcador para algunos
subgrupos, tal como los pacientes pT2 (Figura 101).
\vskip1.000000\baselineskip
PITX2, SEC. ID Nº: 35, y GPR7 muestran todos
información de pronóstico significativa cuando se usa la mediana
del nivel de metilación como punto de corte. Estableciendo el punto
de corte de metilación aún más alto que la mediana mejora el
rendimiento de estos tres marcadores. Esto tiene el efecto de
disminuir el grupo positivo del marcador y aumentar la
especificidad de la prueba. La mediana del nivel de metilación no es
óptima para SEC. ID Nº: 63. En su lugar, un punto de corte más bajo
separa más claramente los grupos de buen y mal pronóstico para este
marcador. Los valores de corte de metilación optimizados para estos
cuatro marcadores entran todos en el intervalo para el que sus
respectivos ensayos son técnicamente adecuados.
Los pacientes cuyas muestras se analizaron en
este estudio son representativos de la población a la que estaría
dirigida una prueba de prostatectomía. Por consiguiente, es posible
especular sobre la información que podrían proporcionar estos
marcadores para futuros pacientes. PITX2, por ejemplo, tiene una
sensibilidad de aproximadamente 60% y una especificidad del 70%. En
el análisis de Kaplan-Meier en la Figura 90, el
grupo positivo del marcador tiene aproximadamente tres veces el
riesgo de recurrencia tras diez años que tiene el grupo negativo del
marcador. En la Figura 97, los pacientes con Gleason
8-10 que son positivos para PITX2 tienen un 65% de
probabilidad de recurrencia de PSA en 10 años. Por el contrario,
los pacientes con Gleason 8-10 que fueron negativos
para el marcador tuvieron sólo un 15% de probabilidad de recaída de
PSA. La adición de la información del marcador de metilación a la
estratificación de Gleason permitirá a los médicos identificar un
subgrupo de mal pronóstico que puede beneficiarse más de la terapia
adyuvante. Si estos marcadores de metilación se incorporan en el
procedimiento de selección de pacientes para ensayos clínicos de
terapia adyuvante, los médicos pueden empezar a ver una ventaja
clara a la adición de tratamientos adyuvantes tempranos para los
pacientes con mal pronóstico.
Además de añadir información a Gleason, PITX2 y
algunos de los otros marcadores pueden también estratificar
pacientes con enfermedad confinada al órgano. Los pacientes con
enfermedad que está verdaderamente confinada al órgano se curarán
por medio de la extirpación completa del órgano. Los pacientes con
enfermedad que parece estar confinada al órgano, pero que tienen
micrometástasis no detectada, no se curarán por la cirugía. Estos
dos grupos de pacientes, ambos con lesiones operables pequeñas,
tiene tumores con capacidades para mestástasis muy diferentes.
PITX2 y algunos de los otros marcadores parecen estar detectando
estas diferencias subyacentes en la agresividad básica del
tumor.
La capacidad de estos marcadores para añadir
información a los marcadores usados actualmente es esencial.
Gleason y la determinación del estadio ya proporcionan información
de pronóstico significativa, una nueva prueba que no reemplazará
sino complementará estas fuentes de información tradicionales es más
valiosa y tendrá más probabilidad de ser adoptada fácilmente en la
práctica clínica.
En el análisis de los marcadores en subgrupos de
pacientes, los marcadores con frecuencia parecieron ser más
potentes en los pacientes con mal pronóstico basado en las variables
clínicas tradicionales. Los pacientes con Gleason
8-10 y los pacientes con baja probabilidad para
supervivencia libre de PSA por nomograma son bien estratificados
por los presentes marcadores en grupos de buen y mal pronóstico.
Para una prueba de prostatectomía, estos son los pacientes diana
ideales, ya que la prueba se usará para seleccionar un grupo de
pacientes de mal pronóstico que pueden beneficiarse más de la
terapia adyuvante. Para los pacientes T3 (enfermedad no confinada
al órgano), es de preferencia el marcador SEC. ID Nº: 63. En
general, este análisis demuestra que los presentes marcadores son
especialmente adecuados para identificar pacientes de mal
pronóstico.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
En los siguientes análisis, se analizó la
metilación dentro de muestras de tejido de próstata incluidas en
parafina por medio de los ensayos que se muestran en la Tabla 12
para el análisis de SEC. ID Nº: 19, 35, 37 y 63. Esto se comparó a
continuación con la misma medición realizada en las muestras
congeladas que se describe en el Ejemplo
2.
2.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras eran muestras de prostatectomía
incluidas en parafina o tejido congelado fresco como se describe en
el Ejemplo 3. Se seccionaron las muestras, se lisó el tejido, a
continuación se extrajo el ADN y se convirtió con bisulfito.
Estaban disponibles 309 muestras incluidas en
parafina, de estas se incluyeron en el análisis todas las muestras
con al menos 1 ng de ADN por PCR, usándose entre 1 y 10 ng de ADN
por PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- 1 x Tampón A de PCR Taqman
- \quad
- dNTPs 0,25 mM
- \quad
- MgCl_{2} 3,5 mM
- \quad
- cada cebador 900 nM
- \quad
- sonda 300 nM
- \quad
- AmpliTaq Gold 1 unidad
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
- \quad
- 95ºC->10 minutos (Activación Taq)
- \quad
- Repeticiones: 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
- \quad
- 95ºC->15 segundos (Desnaturalización)
- \quad
- 63,0ºC->1 minuto (Hibridación/Extensión)
- \quad
- Repeticiones: 50.
\vskip1.000000\baselineskip
Se compararon las siguientes categorías
1. Recaída bioquímica temprana (recaída de PSA
tras la prostatectomía en menos de 24 meses) frente a sin recaía
bioquímica (sin aumento significativo del PSA durante al menos 4
años de controles de PSA tras la cirugía).
Estaban disponibles 132 muestras en el grupo sin
recaía y 59 muestras disponibles en el grupo de recaída
temprana.
2. Gleason alto (puntuación
=8-10) frente a Gleason bajo (Puntuación
=2-6 sin componentes de grado 4 ó 5) estaban
disponibles 59 muestras en el grupo Gleason alto y 64 muestras
disponibles en el grupo Gleason bajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en las Figuras 102 a
125, y se calcularon usando la prueba de Wilcoxon como se describió
anteriormente.
La Figura 102 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como en PET en las comparaciones de
recaída bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando
el ensayo de SEC. ID Nº: 19 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 103 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como en PET en las comparaciones de
recaída bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando
el ensayo de SEC. ID Nº: 63 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 104 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como en PET en las comparaciones de
recaída bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando
el ensayo de SEC. ID Nº: 35 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 105 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como en PET en las comparaciones de
recaída bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando
el ensayo de SEC. ID Nº: 37 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 106 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras PET en las comparaciones de recaída
bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando el ensayo
de SEC. ID Nº: 19 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 107 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras PET en las comparaciones de recaída
bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando el ensayo
de SEC. ID Nº: 63 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 108 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras PET en las comparaciones de recaída
bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando el ensayo
de SEC. ID Nº: 35 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 109 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras PET en las comparaciones de recaída
bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando el ensayo
de SEC. ID Nº: 37 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 110 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras congeladas en las comparaciones de
recaída bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando
el ensayo de SEC. ID Nº: 19 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 111 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras congeladas en las comparaciones de
recaída bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando
el ensayo de SEC. ID Nº: 63 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 112 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras congeladas en las comparaciones de
recaída bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando
el ensayo de SEC. ID Nº: 35 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 113 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras congeladas en las comparaciones de
recaída bioquímica temprana frente a sin recaída bioquímica usando
el ensayo de SEC. ID Nº: 37 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 114 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como en PET en las comparaciones de
Gleason alto frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº:
19 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 115 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como en PET en las comparaciones de
Gleason alto frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº:
63 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 116 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como en PET en las comparaciones de
Gleason alto frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº:
35 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 117 muestra el amplificado detectado
tanto en muestras congeladas como en PET en las comparaciones de
Gleason alto frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº:
37 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 118 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras PET en las comparaciones de Gleason alto
frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº: 19 que se
muestra en la Tabla 12.
La Figura 119 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras PET en las comparaciones de Gleason alto
frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº: 63 que se
muestra en la Tabla 12.
La Figura 120 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras PET en las comparaciones de Gleason alto
frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº: 35 que se
muestra en la Tabla 12.
La Figura 121 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras PET en las comparaciones de Gleason alto
frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº: 37 que se
muestra en la Tabla 12.
La Figura 122 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras congeladas en las comparaciones de
Gleason alto frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº:
19 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 123 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras congeladas en las comparaciones de
Gleason alto frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº:
63 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 124 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras congeladas en las comparaciones de
Gleason alto frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº:
35 que se muestra en la Tabla 12.
La Figura 125 muestra el amplificado detectado
solamente en las muestras congeladas en las comparaciones de
Gleason alto frente a Gleason bajo usando el ensayo de SEC. ID Nº:
37 que se muestra en la Tabla 12.
\newpage
\global\parskip0.940000\baselineskip
<210> 962
<211> 28536
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
<220>
<223> ADN genómico tratado químicamente
(Homo sapiens)
\vskip1.000000\baselineskip
<400> 962
\hskip0,8cm
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 963
<211> 28536
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
<220>
<223> ADN genómico tratado químicamente
(Homo sapiens)
\newpage
<400> 963
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 964
<211> 28536
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
<220>
<223> ADN genómico tratado químicamente
(Homo sapiens)
\newpage
<400> 964
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 965
<211> 28536
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
<220>
<223> ADN genómico tratado químicamente
(Homo sapiens)
\newpage
<400> 965
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
<210> 966
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
<220>
<223> ADN genómico tratado químicamente
(Homo sapiens)
\vskip1.000000\baselineskip
<400> 966
\vskip1.000000\baselineskip
| ggagtggagg aaattgagat | 20 |
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 967
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
<220>
<223> ADN genómico tratado químicamente
(Homo sapiens)
\vskip1.000000\baselineskip
<400> 967
\vskip1.000000\baselineskip
| ccacacaaca aatactcaaa ac | 22 |
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 968
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
<220>
<223> ADN genómico tratado químicamente
(Homo sapiens)
\vskip1.000000\baselineskip
<400> 968
\vskip1.000000\baselineskip
| tgggtgtttg taatttttgt tttgtgttag gtt | 33 |
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 969
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
<220>
<223> ADN genómico tratado químicamente
(Homo sapiens)
\vskip1.000000\baselineskip
<400> 969
\vskip1.000000\baselineskip
| gtaggggagg gaagtagatg tt | 22 |
\vskip1.000000\baselineskip
<210> 970
Claims (7)
1. Un procedimiento para proporcionar un
pronóstico a un sujeto con un trastorno proliferativo de las células
de la próstata que comprende las siguientes etapas de:
- a.
- determinar el estado de metilación del gen PITX2 y/o sus regiones reguladoras en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto; y
- b.
- determinar a partir del mismo el pronóstico de dicho sujeto por el que la hipermetilación es un indicador de mal pronóstico.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que se considera al menos una variable de pronóstico más
cuando se determina el pronóstico de b).
3. Un procedimiento según la reivindicación 2,
en el que dicha variable de pronóstico se selecciona del grupo
constituido por el nomograma, el nivel de PSA y la puntuación de
Gleason.
4. Un procedimiento según la reivindicación 1 ó
3, que comprende las siguientes etapas de:
- a)
- aislar el ADN genómico de una muestra biológica obtenida de un sujeto;
- b)
- tratar el ADN genómico, o uno de sus fragmentos, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina sin metilar en la posición 5 en uracilo u otra base que sea detectablemente distinta de la citosina en términos de propiedades de hibridación;
- c)
- poner en contacto el ADN genómico tratado, o su fragmento tratado, con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso una secuencia contigua de una longitud de al menos 18 nucleótidos que es complementaria, o hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a una secuencia seleccionada del grupo constituido por SEC. ID Nº: 962-965 y sus complementos, en el que el ADN tratado o uno de sus fragmentos se amplifica para producir una o más amplificaciones, o no se amplifica;
- d)
- determinar, en base a la presencia o ausencia, o a la cantidad o a una propiedad de dicha amplificación, el estado de metilación de al menos una secuencia de dinucleótidos CpG del gen PITX2 y/o sus regiones reguladoras o un promedio, o un valor que refleje un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG del gen PITX2 y/o sus regiones reguladoras; y
- e)
- determinar a partir de dicho estado de metilación el pronóstico de dicho sujeto.
5. El uso de un oligómero, que comprende una
secuencia de al menos 9 nucleótidos contiguos que es complementaria,
o hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a
una secuencia de ADN genómico tratado seleccionada del grupo
constituido por SEC. ID Nº: 962-965, y sus
secuencias complementarias para proporcionar un pronóstico de un
sujeto con un trastorno proliferativo de las células de la
próstata.
6. El uso de un kit para proporcionar un
pronóstico de un sujeto con un trastorno proliferativo de las
células de la próstata, comprendiendo dicho kit:
- -
- al menos un reactivo de bisulfito; y
- -
- al menos dos moléculas de ácido nucleico que comprenden, en cada caso una secuencia contigua de al menos 16 nucleótidos que es complementaria, o hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a una secuencia seleccionada del grupo constituido por SEC. ID Nº: 962-965, y sus complementos.
7. El uso de una composición para proporcionar
un pronóstico de un sujeto con un trastorno proliferativo de las
células de la próstata, comprendiendo dicha composición lo
siguiente:
- a)
- un ácido nucleico que comprende una secuencia con una longitud de al menos 18 bases de un segmento del ADN genómico previamente tratado químicamente según una de las secuencias tomadas del grupo constituido por SEC. ID Nº: 962-965, y sus secuencias complementarias, y
- b)
- un tampón que comprende al menos una de las siguientes sustancias: cloruro de magnesio, dNTP, polimerasa taq, un oligómero, en particular un oligonucleótido o un oligómero de ácido péptido nucleico (PNA), comprendiendo dicho oligómero en cada caso al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos contiguos que es complementaria, o hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a un ADN genómico pretratado según una de las SEC ID Nº: 962-965 y sus secuencias complementarias.
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Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6331393B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-12-18 | University Of Southern California | Process for high-throughput DNA methylation analysis |
| EA013634B1 (ru) * | 2005-04-15 | 2010-06-30 | Эпиджиномикс Аг | Способы и нуклеиновые кислоты для анализов клеточных пролиферативных нарушений |
| US10053735B2 (en) * | 2005-09-21 | 2018-08-21 | Therawis Diagnostics Gmbh | Markers for the prediction of outcome of anthracycline treatment |
| WO2007039290A2 (en) * | 2005-10-03 | 2007-04-12 | Epigenomics Ag | Methods and nucleic acids for the analysis of gene expression associated with the prognosis of cell proliferative disorders |
| WO2007039291A2 (en) * | 2005-10-03 | 2007-04-12 | Epigenomics Ag | Methods, apparatus and nomograms to determine prostate cancer progression |
| US7770717B2 (en) * | 2005-10-12 | 2010-08-10 | Scanvaegt International A/S | Device for transfer of items |
| US20090275021A1 (en) * | 2005-11-27 | 2009-11-05 | Osnat Sella-Tavor | Novel nucleotide and amino acid sequences, and assays and methods of use thereof for diagnosis |
| GB0625321D0 (en) * | 2006-12-19 | 2007-01-24 | Univ Surrey | Cancer biomarker |
| US20090062645A1 (en) * | 2007-09-03 | 2009-03-05 | Jens Fehre | Method for diagnosis and treatment of prostate cancer |
| ES2565053T3 (es) * | 2007-11-23 | 2016-03-31 | Epigenomics Ag | Métodos y ácidos nucleicos para el análisis de metilación de CpG asociada con el desarrollo de trastornos proliferativos de células de próstata |
| CA2708163A1 (en) * | 2007-12-11 | 2009-06-18 | Epigenomics Ag | Methods and nucleic acids for analyses of cell proliferative disorders |
| EP2295598A4 (en) * | 2008-05-07 | 2013-06-12 | Univ Sapporo Medical | METHOD AND KIT FOR DETECTION AND THERAPEUTIC AGAINST CANCER |
| US9315802B2 (en) | 2009-12-30 | 2016-04-19 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | RNA isolation from soluble urine fractions |
| DE102010028105A1 (de) * | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Siemens Aktiengesellschaft | Verfahren, Vorrichtung und Gerätesystem für die Therapie von Prostatakrebs |
| WO2012092490A1 (en) * | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Diagnosis of prostate cancer |
| EP2514836B1 (en) * | 2011-04-19 | 2016-06-29 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Prostate cancer markers |
| US9598735B2 (en) * | 2012-11-14 | 2017-03-21 | JBS Science Inc. | Detection of a panel of urine DNA markers for HCC screening and disease management |
| KR101467289B1 (ko) * | 2013-01-22 | 2014-12-02 | 한국원자력의학원 | Ｗｄｆｙ3를 측정하는 제제를 포함하는 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물 및 이의 용도 |
| US20150010518A1 (en) * | 2013-07-03 | 2015-01-08 | The University Of British Columbia | Nr2e1 mini-promoters |
| US10155991B2 (en) * | 2013-08-15 | 2018-12-18 | Xueliang James Xia | Biomarkers for use in colorectal cancer |
| JP6427750B2 (ja) * | 2013-10-02 | 2018-11-28 | コニカミノルタ株式会社 | Ｃｘｃｌ１、ならびにｓｍｏｘおよび／またはｉｄ１の発現量に基づく肺癌患者の予後を判定するためのデータ収集方法およびキット |
| GB2524948A (en) * | 2014-03-07 | 2015-10-14 | Oxford Gene Technology Operations Ltd | Detecting Increase or Decrease in the Amount of a Nucleic Acid having a Sequence of Interest |
| GB201404998D0 (en) * | 2014-03-20 | 2014-05-07 | Univ Birmingham | Atrial fibrillation therapy |
| EP3037545A1 (en) * | 2014-12-23 | 2016-06-29 | The Provost, Fellows, Foundation Scholars, & the other members of Board, of the College of the Holy & Undiv. Trinity of Queen Elizabeth near Dublin | A DNA-methylation test for prostate cancer |
| EP3246415A1 (en) * | 2016-05-18 | 2017-11-22 | Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Biociencias - CIC bioGUNE | Methods for the prognosis of prostate cancer |
| US20210318324A1 (en) * | 2018-07-05 | 2021-10-14 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Gene signatures for cancer characterization and methods of use |
| KR102637032B1 (ko) * | 2020-01-28 | 2024-02-15 | 주식회사 젠큐릭스 | 특정 유전자의 CpG 메틸화 변화를 이용한 방광암 진단용 조성물 및 이의 용도 |
| US11901083B1 (en) | 2021-11-30 | 2024-02-13 | Vignet Incorporated | Using genetic and phenotypic data sets for drug discovery clinical trials |
| US11705230B1 (en) | 2021-11-30 | 2023-07-18 | Vignet Incorporated | Assessing health risks using genetic, epigenetic, and phenotypic data sources |
| CN114015771A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-02-08 | 北京华诺奥美基因医学检验实验室有限公司 | 一种snrpn父源缺失的检测引物组、试剂盒及非诊断目的的检测方法 |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5585481A (en) * | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
| US5457183A (en) | 1989-03-06 | 1995-10-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hydroxylated texaphyrins |
| US5245022A (en) | 1990-08-03 | 1993-09-14 | Sterling Drug, Inc. | Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides |
| US5474796A (en) * | 1991-09-04 | 1995-12-12 | Protogene Laboratories, Inc. | Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface |
| US5565552A (en) * | 1992-01-21 | 1996-10-15 | Pharmacyclics, Inc. | Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis |
| US5574142A (en) | 1992-12-15 | 1996-11-12 | Microprobe Corporation | Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery |
| SE501439C2 (sv) | 1993-06-22 | 1995-02-13 | Pharmacia Lkb Biotech | Sätt och anordning för analys av polynukleotidsekvenser |
| EP0734436B1 (en) | 1993-11-30 | 1999-04-14 | McGILL UNIVERSITY | Inhibition of dna methyltransferase |
| US5597696A (en) * | 1994-07-18 | 1997-01-28 | Becton Dickinson And Company | Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates |
| US5514758A (en) | 1994-09-30 | 1996-05-07 | The Goodyear Tire & Rubber Company | Process for making latex for high performance masking tape |
| US6017704A (en) * | 1996-06-03 | 2000-01-25 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids |
| US5786146A (en) * | 1996-06-03 | 1998-07-28 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids |
| US6251594B1 (en) | 1997-06-09 | 2001-06-26 | Usc/Norris Comprehensive Cancer Ctr. | Cancer diagnostic method based upon DNA methylation differences |
| DE19754482A1 (de) | 1997-11-27 | 1999-07-01 | Epigenomics Gmbh | Verfahren zur Herstellung komplexer DNA-Methylierungs-Fingerabdrücke |
| US7700324B1 (en) | 1998-11-03 | 2010-04-20 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methylated CpG island amplification (MCA) |
| US5958773A (en) * | 1998-12-17 | 1999-09-28 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of AKT-1 expression |
| US6331393B1 (en) * | 1999-05-14 | 2001-12-18 | University Of Southern California | Process for high-throughput DNA methylation analysis |
| US6783933B1 (en) * | 1999-09-15 | 2004-08-31 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | CACNA1G polynucleotide, polypeptide and methods of use therefor |
| AU2002214576A1 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-22 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Genes related to development of refractory prostate cancer |
| WO2002070741A2 (en) * | 2001-03-01 | 2002-09-12 | Epigenomics Ag | Methods, systems and computer program products for determining the biological effect and/or activity of drugs, chemical substances and/or pharmaceutical compositions based on their effect on the methylation status of the dna |
| ATE429511T1 (de) * | 2001-03-01 | 2009-05-15 | Epigenomics Ag | Verfahren zur entwicklung von gensätzen zu diagnostischen und therapeutischen zwecken auf grundlage des expressions- und methylierungsstatus der gene |
| EP1410304A2 (en) * | 2001-03-26 | 2004-04-21 | Epigenomics AG | Method for epigenetic feature selection |
| US7473767B2 (en) * | 2001-07-03 | 2009-01-06 | The Institute For Systems Biology | Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures |
| EP1554407B1 (en) * | 2002-10-01 | 2009-07-29 | Epigenomics AG | Method for the treatment of breast cell proliferative disorders |
| US20060024684A1 (en) * | 2002-10-01 | 2006-02-02 | Epigenomics Ag | Prognostic markers for prediction of treatment response and/or survival of breast cell proliferative disorder patients |
| SE524468C2 (sv) * | 2002-12-09 | 2004-08-10 | Axlon Int Ab | Anordning och metod för sortering av mynt |
| US20040146868A1 (en) * | 2003-01-24 | 2004-07-29 | Epigenomics Ag | Methods and nucleic acids for the analysis of CpG dinucleotide methylation status associated with the development of peripheral zone prostate cancer |
| ES2801379T3 (es) | 2003-12-01 | 2021-01-11 | Epigenomics Ag | Métodos y ácidos nucleicos para el análisis de la expresión génica asociada con el desarrollo de trastornos proliferativos de células de próstata |
| CA2549852A1 (en) | 2003-12-11 | 2005-06-30 | Epigenomics Ag | Method and nucleic acids for the improved treatment of breast cell proliferative disorders |
| DK1826279T3 (da) * | 2006-02-28 | 2011-09-05 | Charite Universitaetsmedizin | Detektering og kvalitetskontrol af regulatoriske t-celler vha. DNA-metyleringsanalyse af FoxP3--genet |
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