ES2331303T3 - Conjugados polimericos sensibles al ph de un farmaco cancerostatico de antraciclina para terapia dirigida. - Google Patents
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Abstract
Conjugados que consisten en un portador polimérico constituido por de 30 a 3.000 unidades monoméricas unidas formando una cadena polimérica, compuesta por a. del 60 al 99% de unidades de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida b. del 1 al 25% de unidades de hidrazonas metacriloiladas de épsilon-aminoácidos o aminoácidos aromáticos terminados con una molécula de un agente cancerostático de antraciclina c. del 0,5 al 15% de unidades de aminoácidos aromáticos o épsilon-aminoácidos metacriloilados o sus sales de sodio, y d. del 0,5 al 10% de unidades de hidrazidas metacriloiladas de épsilon-aminoácidos o aminoácidos aromáticos, de fórmula general **(Ver fórmula)** estando dispuestas las unidades estructurales individuales de una manera al azar en la cadena y en la que x oscila desde 20 hasta 3.000, a es de desde 1 hasta 750, b y c son cada uno de desde 1 hasta 450, en la que X es un aminoácido elegido de la siguiente serie: ácido épsilon-aminocaproico (AKap), ácido p-aminobenzoico (AB).
Description
Conjugados poliméricos sensibles al pH de un
fármaco cancerostático de antraciclina para terapia dirigida.
La invención implica fármacos anticancerígenos
poliméricos que permiten un transporte dirigido en el organismo y
que se centran en terapia tumoral dirigida en medicina humana.
El desarrollo de nuevos fármacos y formas
farmacológicas se ha centrado recientemente cada vez más en la
utilización de sustancias poliméricas, especialmente polímeros
solubles en agua, como portadores de fármacos. Se han preparado y
estudiado varios conjugados poliméricos de fármacos cancerostáticos
y polímeros solubles, en los que el fármaco antitumoral estaba
unido al polímero mediante un enlace covalente no escindible, un
enlace iónico hidrolíticamente inestable o un enlace covalente
propenso a hidrólisis simple o enzimática. Este esfuerzo estaba
dirigido a preparar fármacos con un comportamiento farmacocinético y
farmacodinámico potenciado, permitiendo una terapia dirigida de
tumores. Los fármacos poliméricos preparados basándose en
copolímeros de HPMA forman un grupo importante. El fármaco
anticancerígeno en tales sustancias está unido a un portador de
N-(2-hidroxipropil)metacrilamida polimérico
mediante una secuencia de oligopéptido escindible enzimáticamente,
preparada como un sustrato para enzimas lisosómicas (enzimas
presentes en células de mamífero). La estructura, la síntesis y las
propiedades de tales conjugados se han descrito en una patente
[Duncan 1985]. Los resultados obtenidos en esta área hasta ahora se
han resumido claramente por Kope\check{c}ek et al
[Kope\check{c}ek et al 2000]. Los fármacos poliméricos
anteriores han sido eficaces en el tratamiento de varios tumores en
ratones y ratas. En la actualidad, dos de los conjugados
poliméricos están incluso sometiéndose a pruebas clínicas [Vasey
1999 et al, Julyan et al 1999, Thomson et al
1999]. Los resultados de tales pruebas clínicas han mostrado que un
conjugado polimérico de doxorubicina tiene una toxicidad no
específica inferior que un fármaco libre. Su cantidad máxima
permitida (CMP) es de 320 mg/m^{2} que es de 4 a 5 veces superior
a la cantidad clínica de doxorubicina libre (60-80
mg/m^{2}) normalmente usada. No se han observado efectos
significativos sobre las funciones cardiacas tras la administración
del fármaco polimérico, aunque la cantidad acumulativa individual
llegaba hasta 1680 mg/m^{2}. Todas las otras áreas de toxicidad
observadas con respecto a la administración de antibióticos de
antraciclina libres, es decir, no dirigidos, se han reducido
significativamente. Una de las desventajas de los fármacos de
conjugados poliméricos sometidos a pruebas clínicas es una
especificidad relativamente baja del efecto dado que tales
conjugados o bien no contienen ninguna unidad de direccionamiento en
absoluto, tal como PK1, o bien contienen un hidrato de carbono de
una especificidad relativamente baja (galactosamina en el conjugado
PK2 en el que está sometiéndose a prueba la capacidad de dirigir un
fármaco polimérico al hígado). Por tanto, están desarrollándose
conjugados en los que se logra el efecto específico pretendido
uniendo una molécula de direccionamiento específica (por ejemplo,
anticuerpos, así como lectina, la hormona del crecimiento,
transferrina, etc.) a la molécula
portadora.
portadora.
Otra desventaja de los conjugados sometidos a
pruebas clínicas, incluyendo los de poli(HPMA) y
doxorubicina, es el hecho de que el fármaco en su forma
farmacológicamente activa se libera sólo a partir de tales
conjugados en las células mediante una reacción enzimática que se
produce en los lisosomas. Esto significa que el fármaco es eficaz
sólo en células con una alta concentración de enzimas lisosómicas
(peptidasas). Otra desventaja es una estructura relativamente
completa del conjugado, que requiere la inclusión de una secuencia a
partir de la que se libera el fármaco mediante peptidasas,
principalmente la unión tetrapeptídica GlyPheLeuGly, lo que hace
que la síntesis sea más cara y complicada.
Los artículos proporcionan mucha información
sobre la preparación y los estudios de las propiedades de polímeros
a los que se une un fármaco cancerostático mediante un enlace
propenso a hidrólisis en un medio acuoso. Los resultados se han
resumido por Kratz [Kratz et al, 1999]. Las macromoléculas
naturales, tales como albúmina, dextranos, transferrina, alginatos
o anticuerpos, se han usado principalmente como portadores para
fármacos cancerostáticos. Se han usado en algunos casos portadores
poliméricos sintéticos, poli(etilenglicol) y poliglutaminas.
Los fármacos estaban unidos a los portadores mediante enlaces que
permitían la liberación controlada por hidrólisis del fármaco
activo tanto en el espacio extracelular como dentro de las células.
En el caso de la doxorubicina (Dox), el enlace estaba formado lo
más frecuentemente por ésteres de ácido
cis-aconitílico o era un enlace de hidrazona. Sin
embargo, las pruebas in vivo de todos los conjugados
anteriores sensibles al pH en animales no han proporcionado
resultados concluyentes. Por tanto, ninguno de los conjugados
poliméricos se han usado o se han sometido a pruebas clínicas para
el tratamiento de tumores.
Los fármacos cancerostáticos poliméricos
desarrollados por los inventores y preparados basándose en
copolímeros de HPMA y un fármaco cancerostático unido mediante un
enlace de hidrazona sensible al pH han mostrado, tanto en pruebas
in vitro como in vivo en ratones, una eficacia
antitumoral significativamente superior en relación con varias
líneas tumorales en comparación con conjugados con el fármaco unido
al portador polimérico mediante un enlace escindible
enzimáticamente a través de una unión oligopeptídica. La síntesis de
tales conjugados en comparación con los conjugados de
poli(HPMA) desarrollados anteriormente es más sencilla, menos
cara y más fácil de manejar dado que sólo puede usarse un
aminoácido como unión en vez de la secuencia oligopeptídica
degradable enzimáticamente y la unión del fármaco al polímero es una
reacción sencilla. El fármaco se libera como resultado de un cambio
de pH en el medio y por tanto la presencia de enzimas lisosómicas no
es esencial para la activación. La velocidad de tal liberación (y
por tanto la concentración citostática inmediata) es mucho más alta
en comparación con conjugados que contienen secuencias degradables
sólo mediante enzimas [Rihová et al, 2001, Etrych et
al, 2001].
La invención proporciona conjugados poliméricos
lineales y ramificados de doxorubicina, daunomicina, farmorubicina
y otros fármacos cancerostáticos de antraciclina que contienen un
grupo carbonilo con copolímeros preparados basándose en
N-(2-hidroxipropil)-metacrilamida
(HPMA) y opcionalmente con anticuerpos, sus fragmentos o
inmunoglobulina no específica (figura 3). Es característico de estos
conjugados que el portador polimérico junto con el anticuerpo
(inmunoglobulina) garantice una circulación prolongada del fármaco
polimérico en los vasos sanguíneos y su acumulación activa o pasiva
preferida posterior en el tumor. El fármaco anticancerígeno se une
al portador mediante un enlace estable en los vasos sanguíneos (a pH
de 7,4). Tras unirse el fármaco al polímero, el agente
cancerostático pierde su efecto biológico y se transporta por los
vasos sanguíneos en su forma inactiva. El fármaco citotóxico sólo
se activa intracelularmente, en los orgánulos de las células diana,
cuando el pH disminuye y el enlace entre el fármaco y el polímero se
hidroliza.
Los conjugados consisten en un portador
polimérico constituido por de 30 a 3.000 unidades monoméricas unidas
formando una cadena polimérica, estando constituido del 60 al 99%
de las mismas por unidades de
N-(2-hidroxipropil)metacrilamida, siendo del
1 al 25% de las mismas las unidades de hidrazonas metacriloiladas de
\varepsilon-aminoácidos o aminoácidos aromáticos
terminados por una molécula cancerostática de antraciclina
(preferiblemente doxorubicina); siendo del 0,5 al 15% las unidades
de aminoácidos aromáticos, \varepsilon-aminoácidos
o \alpha-aminoácidos metacriloilados o sus sales
de sodio; además, se incluye del 0,5 al 10% de unidades de
hidrazidas metacriloiladas de
\varepsilon-aminoácidos o aminoácidos
aromáticos.
Los conjugados son de fórmula general
estando dispuestas las unidades
estructurales individuales de una manera al azar en la cadena y en
la que x oscila de desde 20 hasta 3.000, a es de desde 1 hasta 750,
b y c son cada uno de desde 1 hasta
450,
en la que X es un aminoácido elegido de la
siguiente serie: ácido \varepsilon-aminocaproico
(AKap), ácido p-aminobenzoico (AB).
Aparte de las unidades anteriores, las
estructuras macromoleculares ramificadas contienen también
preferiblemente del 0,1 al 5% de unidades que forman uniones que
interconectan las cadenas poliméricas individuales formando la
estructura macromolecular ramificada, uniones que consisten en
oligopéptidos metacriloilados degradables enzimáticamente,
preferiblemente tripéptidos GlyPheGly, GlyLeuGly o tetrapéptido
GlyPheLeuGly, interconectados mediante diaminas (etilendiamina,
hexametilendiamina).
Una característica de los conjugados poliméricos
con acción antitumoral dirigida de esta invención es el enlace
entre el componente activo (citostático) y el portador polimérico a
través de un grupo hidrazona formado en la reacción entre el grupo
carbonilo de la molécula de fármaco y el grupo hidrazida del
polímero. El enlace del fármaco al portador polimérico aumenta
significativamente el peso molecular del fármaco, dando como
resultado un tiempo de circulación prolongado en la sangre y del
tiempo de retención total del componente activo en el organismo. El
enlace entre el fármaco y el polímero es relativamente estable
durante el transporte del fármaco en los vasos sanguíneos y
escindible hidrolíticamente en el entorno ligeramente ácido dentro
de las células, concretamente en orgánulos celulares caracterizados
por un pH ácido. Esto significa que el fármaco se transporta a
través de los vasos sanguíneos en su forma inactiva, unido al
polímero, y solamente se libera y activa tras su penetración en las
células tumorales diana. La activación del fármaco en las células
diana elimina los efectos secundarios de los citostáticos por lo
demás tóxicos y centra su efecto preferentemente en las células
tumorales. Un portador polimérico basado en copolímeros de HPMA es
el responsable del transporte dirigido hasta el tumor o las células
tumorales. Cuando se usa un portador de poli(HPMA) de alto
peso molecular ramificado, el fármaco polimérico se almacena en el
tejido tumoral sólido debido a direccionamiento pasivo y el efecto
de EPR (efecto de permeabilidad y retención potenciados). El
polímero puede liberarse del organismo tras la degradación
enzimática de las uniones oligopeptídicas en forma de cadenas
poliméricas más cortas, por ejemplo, mediante filtración
glomerular. En portadores que contienen anticuerpos, el anticuerpo
(inmunogloblina) se une al portador a través de un enlace hidrazona
formado en la reacción entre los grupos aldehído, incorporados en
un fragmento F_{c} del anticuerpo por oxidación con peryodato de
sodio, y los grupos hidrazona del portador. El anticuerpo
(inmunoglobulina) también puede unirse al portador polimérico usando
agentes bifuncionales. En tal caso, la molécula de anticuerpo se
modifica mediante reacción con 2 iminotiolano (introducción de
grupos -SH), se introducen grupos maleimida en el polímero haciendo
reaccionar sus grupos hidrazida con éster de succinimida de ácido
3-maleimidopropiónico y entonces se produce la
conjugación mediante adición del grupo -SH del anticuerpo al doble
enlace del grupo maleimida del polímero. De manera análoga, la
conjugación también puede iniciarse mediante otro agente
bifuncional, tal como SPDP (éster de
N-hidroxisuccinimida del ácido
3-(2-piridilditio)propiónico), que puede
usarse para conjugar un anticuerpo (inmunoglobulina) que contiene
grupos -SH directamente a los grupos hidrazida del portador
polimérico.
El conjugado con el anticuerpo (inmunoglobulina)
se acumula en los órganos/tejidos diana tanto de manera pasiva como
activa. La acumulación pasiva se facilita por el peso molecular
superior del conjugado e implica el denominado efecto de EPR, la
acumulación activa se garantiza mediante un proceso en el que el
sitio de unión del anticuerpo de direccionamiento interacciona con
receptores relevantes en la superficie de las células diana. En este
último caso, el copolímero de HPMA desempeña el papel tanto de
portador como de envuelta protectora, reduciendo significativamente
la inmunogenicidad de la glicoproteína de direccionamiento en el
conjugado.
El fármaco polimérico según esta invención puede
usarse en tres formas que difieren en su estructura detallada. La
primera estructura está representada por un conjugado polimérico
lineal con el fármaco sin el anticuerpo de direccionamiento
(inmunoglobulina) (figura 1); la segunda es tiene un peso molecular
alto y representa una estructura polimérica ramificada con uniones
oligopeptídicas biodegradables (figura 2). La tercera estructura
incluye también la molécula de direccionamiento (inmunoglobulina)
(figura 3).
La preparación de fármacos poliméricos lineales
no dirigidos se produce en una pluralidad de etapas de reacción. La
primera etapa implica la preparación del precursor I polimérico
(véase la figura 4) como un copolímero de HPMA y ésteres reactivos
metacriloilados (ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres
de N-hidroxisuccinimida, etc.) de aminoácidos u
oligopéptidos, la segunda etapa, que conduce a la preparación del
precursor II polimérico, implica la transformación hidrazinolítica
de los grupos éster terminales en hidrazidas. En la tercera etapa,
se une un agente cancerostático que contiene un grupo ceto en la
molécula a los grupos hidrazida mediante un enlace químico de
hidrazona.
Es necesario comenzar la preparación de un
fármaco polimérico ramificado a partir del precursor I polimérico
que contiene un oligopéptido degradable enzimáticamente en sus
cadenas laterales, preferiblemente GlyPheGly, GlyLeuGly,
GlyPheLeuGly o GlyLeuPheGly. La segunda etapa se inicia mediante la
ramificación ligera del polímero haciendo reaccionar el precursor I
polimérico y alquilendiamina (etilo, butilo, hexilo) y se termina
mediante la hidrozinólisis posterior con hidrato de hidrazina tal
como se describió en el caso anterior.
Pueden prepararse fármacos dirigidos con
anticuerpos (inmunoglobulina) a partir de ambos tipos de fármacos
anteriores mediante la reacción posterior con un anticuerpo
(inmunoglobulina) en cuya estructura se han introducido previamente
grupos aldehído mediante oxidación suave con KIO_{4} o NaIO_{4}
o por medio de su conjugación con el anticuerpo (inmunoglobulina)
usando agentes bifuncionales tal como se describió
anteriormente.
Esta invención puede usarse para preparar
fármacos poliméricos para el tratamiento de diversos tipos de
tumores en medicina humana.
La figura 1 muestra la estructura de un
conjugado polimérico lineal con un fármaco.
La figura 2 muestra una estructura
macromolecular ramificada de un polímero con uniones oligopeptídicas
biodegradables.
La figura 3 muestra la estructura de un
conjugado que incluye el anticuerpo de direccionamiento.
La figura 4 muestra un precursor polimérico
La figura 5 muestra los resultados de la
medición de la velocidad de liberación de doxorubicina a partir de
los conjugados de esta invención.
La figura 6 muestra el resultado de la
comparación de las actividades de inhibición in vitro de los
conjugados de esta invención unidos por medio de diversas
uniones.
La figura 7 muestra el resultado de la
comparación de las actividades de inhibición in vivo de los
conjugados de esta invención unidos por medio de diversas
uniones.
La figura 8 muestra los resultados de estudios
in vivo de las actividades antitumorales de los conjugados de
esta invención.
Se realizó la síntesis del fármaco polimérico en
cuatro etapas sintéticas. En la primera etapa, se prepararon los
monómeros, N-(2-hidroxipropil)metacrilamida
(HPMA) y ésteres de 4-nitrofenilo de un oligopéptido
o aminoácido metacriloilado
(MA-X-ONp). La segunda etapa fue la
preparación del precursor I polimérico mediante la copolimerización
por radicales de HPMA y MA-X-ONp. En
la tercera etapa, se preparó el precursor II polimérico mediante
hidrazinólisis del precursor I y en la última etapa se efectuó la
unión de Dox al precursor polimérico.
Se preparó HPMA mediante el método descrito
anteriormente [Ulbrich 2000]. Se prepararon los ésteres reactivos
metacriloilados mediante metacriloilación de un oligopéptido o
aminoácido apropiado (X = Gly, diGly, GlyLeuGly, GlyPheGly,
GlyPheLeuGly, \beta-alanina, ácido
\varepsilon-aminocaproico (AKap), ácido
p-aminobenzoico (AB), etc.) mediante reacción de
Schotten-Bauman y mediante reacción posterior del
derivado de ácido metacrílico resultante con
4-nitrofenol en presencia de
diciclohexilcarbodiimida (DCCI).
El procedimiento de preparación de los monómeros
MA-Gly-ONp,
MA-GlyGly-ONp y
MA-AB-ONp es idéntico en los tres
casos. El procedimiento preparativo para
MA-AB-ONp se describe a
continuación:
MA-AB-ONp:
Se disolvieron 0,024 moles (3,34 g) de ácido
p-aminobenzoico en un matraz de tres bocas en 15 ml
de una disolución de 0,024 moles (0,97 g) de hidróxido de sodio. Se
añadieron simultáneamente gota a gota 0,024 moles (2,55 g) de
cloruro de metacriloílo y una disolución de 0,024 moles (0,97 g) de
hidróxido de sodio disueltos en 10 ml de agua a la disolución
acuosa de la sal de sodio del aminoácido con agitación y
enfriamiento (5ºC). Durante la reacción, el pH de la mezcla de
reacción no debe superar pH 9. Se agitó la mezcla de reacción
durante 1 hora y tras su acidificación hasta pH 2 se separó por
filtración el precipitado blanco resultante sobre un vidrio
filtrante S4. Se purificó el producto mediante cristalización en una
mezcla de etanol-agua. Se preparó el éster de
4-nitrofenilo haciendo reaccionar 0,014 moles (2,85
g) de ácido
N-metacriloil-4-aminobenzoico
con 0,014 moles (1,93 g) de 4-nitrofenol en
dimetilformamida a -10ºC en presencia de 0,0153 moles (3,16 g) de
diciclohexilcarbodiimida. La reacción transcurrió durante 10 horas
tras lo cual se separó por filtración la diciclohexilurea
precipitada y se purificó el producto mediante cristalización en una
mezcla de acetona-agua. Los otros dos ésteres de
4-nitrofenilo
(MA-X-ONp) pueden prepararse de una
manera análoga.
También se prepararon los derivados
metacriloilados de GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly,
\beta-alanina y ácido
\varepsilon-aminocaproico mediante
metacriloilación de oligopéptidos o de un ácido, sin embargo, tras
la acidificación de la fase acuosa, los ácidos metacriloilados
tuvieron que extraerse en acetato de etilo y aislarse mediante
cristalización. Los ésteres reactivos apropiados (ésteres de ONp) se
preparan de manera análoga que
MA-AB-ONp excepto porque el medio de
reacción para la esterificación de
MA-GlyLeuGly-OH y
MA-GlyPheLeuGly-OH era
tetrahidrofurano.
Preparación del precursor I polimérico:
Se disolvieron 1 g de una mezcla de HPMA (95% en moles, 0,89 g) y
MA-AB-ONp (5% en moles, 0,11 g) y
0,048 g de azo-bis-isobutironitrilo
en 6,95 g de acetona y se colocó la disolución en una ampolla de
polimerización. Tras burbujearse la mezcla de polimerización con
nitrógeno, se selló la ampolla y se llevó a cabo la polimerización
a 50ºC durante 24 horas. Se separó por filtración el polímero
precipitado, se enjuagó tres veces con acetona y dietil éter y se
secó a vacío. El contenido en cadenas laterales terminadas con
grupos -ONp reactivos (la composición de copolímero) puede
controlarse mediante la composición de la carga de polimerización
(la razón de monómeros). Se usó el mismo procedimiento para preparar
todos los precursores poliméricos que diferían en la composición de
las cadenas laterales.
Preparación del precursor II polimérico:
Se preparó el copolímero
poli(HPMA-co-MA-AB-NHNH_{2})
haciendo reaccionar el precursor I polimérico con hidrato de
hidrazina. Se disolvieron 300 mg de precursor I polimérico (1,3 x
10^{-4} moles de ONp) en 2 ml de metanol y se añadió una
disolución de 69 mg de NH_{2}NH_{2}.H_{2}O en 1 ml de metanol
(1,3 x 10^{-3} moles, en exceso de 10 veces en relación con ONp)
con agitación intensa. Se dejó que la mezcla de reacción
reaccionara durante 3 horas tras lo cual se diluyó la disolución de
metanol con agua destilada hasta 30 ml y se eliminaron los
componentes de bajo peso molecular del producto usando diálisis
frente a agua destilada (2 días). Se aisló el producto final de la
disolución acuosa mediante liofilización. Se determinaron el peso
molecular (M_{w}) y la polidispersidad del polímero por medio de
cromatografía en gel equipada con un detector de dispersión de luz.
Se determinó la cantidad de grupos hidrazida mediante espectroscopía
tras la reacción de grupos hidrazida con TNBS (ácido
trinitrobencenosulfónico). Se prepararon precursores que contenían
otros aminoácidos y oligopéptidos de la misma manera. Se prepararon
también los precursores II poliméricos mediante copolimerización
por precipitación por radicales de la correspondiente
N-terc-butiloxicarbonilhidrazida
del aminoácido u oligopéptido metacriloilado
(poli(HPMA-co-MA-X-NHNH-BOC))
con HPMA en las condiciones descritas anteriormente. Tras la
eliminación del grupo protector BOC del
poli(HPMA-co-MA-X-NHNH-BOC)
con ácido trifluoroacético, se precipitaron los precursores II
poliméricos en una mezcla de acetona-dietil éter, se
disolvieron en agua, se dializaron frente a agua y se
liofilizaron.
liofilizaron.
Unión de doxorubicina al precursor
polimérico: Se disolvieron 250 mg de precursor II polimérico
(poli(HPMA-co-MA-AB-NHNH_{2})
(0,1 mmoles de NHNH_{2}) en 3 ml de metanol. Se añadió esta
disolución de polímero a 23 mg de Dox.HCl (40 \mumoles). Se
añadieron dos gotas de ácido acético a la mezcla de reacción y se
agitó la disolución no homogénea a temperatura de laboratorio (en
la oscuridad). Tras reaccionar durante 48 horas, se purificó dos
veces la disolución homogénea mediante filtración en gel para
separar Dox libre en una columna cargada con Sephadex
LH-20 en metanol. Se aisló la fracción polimérica y
se concentró en un evaporador a vacío. Volvió a precipitarse el
producto a partir de metanol en dietil éter y se secó hasta peso
constante. Se determinó el contenido en Dox y grupos hidrazida
mediante espectroscopía (\lambda 480 nm, \varepsilon 11 500 L
mol^{-1} cm^{-1}, agua) y mediante TNBS, respectivamente. Se
determinaron el <M_{w}> y la distribución del peso molecular
mediante cromatografía de líquidos (columna Superose^{TM}6
(300x10 mm), tampón acetato 0,3 M (CH_{3}COONa/CH_{3}COOH; pH
6,5; NaN_{3} 0,5 g/l), velocidad de flujo de 0,5 ml/min.,
detección mediante refractómetro diferencial, detector de
dispersión de luz (DAWN-DSP-F, Wyatt
Technology, EE.UU.) y detector UV (280 y 488 nm).
Se usó el método anterior para preparar todos
los otros conjugados poliméricos de doxorubicina.
Se disolvieron 400 mg de precursor I polimérico
que contenía las secuencias oligopeptídicas GlyPheGly; GlyLeuGly o
GlyPheLeuGly (0,19 mmoles de ONp) en 1,1 ml de DMSO. Se añadieron
105 \mul de disolución 0,2 M de 1,2-etilendiamina
en DMSO (21 \mumoles de EDA) con agitación vigorosa y se dejó que
la mezcla de reacción reaccionara a temperatura de laboratorio
durante 1 hora. Se añadió una disolución de 100 mg de hidrato de
hidrazina (2 mmoles) en 0,3 ml de DMSO mientras se agitaba
intensamente la disolución de polímero y se agitó vigorosamente la
mezcla de reacción durante otras 3 horas. Entonces se diluyó la
mezcla de reacción con agua destilada hasta 30 ml y se purificó el
producto mediante diálisis frente a agua destilada (2 días). Se
liofilizó el precursor de alto peso molecular. Se determinaron el
<M_{w}> y la distribución del peso molecular mediante
cromatografía de líquidos, se determinó el contenido en grupos
hidrazida espectroscópicamente por medio del método de TNBSA. Se
unió la doxorubicina al polímero y se caracterizó el conjugado en
las mismas condiciones descritas en el ejemplo 1.
Se preparó un copolímero que portaba grupos
hidrazida y maleimida (MI)
(poli(HPMA-co-MA-X-NHNH_{2}-co-MA-X-NHNHMI))
en sus cadenas laterales mediante modificación parcial de los
grupos hidrazida del precursor II polimérico que contenía del 10 al
15% en moles de grupos hidrazida usando éster
N-hidroxisuccinimidílico del ácido
maleimidilpropiónico (SMP). Se disolvieron 250 mg de precursor II
poli(HPMA-co-MA-diGly-NHNH_{2})
(125 \mumoles de grupos hidrazida) en 1,2 ml de DMSO y se añadió
una disolución de 16,6 mg de SMP (62,5 mmoles) en 0,6 ml de DMSO. Se
agitó la mezcla de reacción a temperatura de laboratorio durante 8
horas. Tras la purificación en una columna PD-10
(eluyente: agua destilada), se determinaron el <M_{w}> y la
distribución del peso molecular mediante cromatografía de líquidos,
se determinó la cantidad de grupos maleimida mediante la prueba de
Ellman modificada y se determinó el contenido en grupo hidrazida
residual mediante el método de TNBS. Se unió la doxorubicina a este
copolímero de la misma manera descrita en el ejemplo 1.
Introducción de grupos -SH en la molécula de
anticuerpo (inmunoglobulina): Se transfirieron 15 mg de
anticuerpos (IgG policlonal anti-timocitos) (0,1
\mumoles) en 1 ml de tampón fosfato
(Na_{2}BPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 0,05 M; NaCl 0,1 M; EDTA 0,01
M; pH 7,4) en una columna PD-10. Se disolvieron 0,67
mg de 2-iminotiolano (4 \mumoles) en 50 \mul de
DMF y se añadieron a la disolución de anticuerpos con agitación
intensa. Tras 2,5 horas de agitación a temperatura de laboratorio,
se aisló el producto mediante filtración en gel en una columna
PD-10 (tampón fosfato, pH 7,4). Se determinó el
nivel de modificación del anticuerpo (inmunoglobulina) mediante un
método que utilizaba la reacción de los grupos -SH con el reactivo
de Ellman.
Se llevó a cabo la conjugación de 60 mg de
poli(EPMA-co-MA-diGly-NHN=Dox-co-MA-X-NHNH-_{2}-co-MA-X-NHNH-MI)
que contenía doxorubicina, grupos hidrazida y maleimida con 20 mg
de anticuerpos modificados en tampón fosfato de pH 7,4 (véase
anteriormente) a temperatura de laboratorio. Se purificó el producto
final mediante filtración en gel y se caracterizó por medio de
espectroscopía UV (contenido en Dox), análisis de aminoácidos
(contenido en anticuerpos e inmunoglobulinas) y electroforesis con
Phastsystem - Pharmacia LKB (presencia de un fármaco o proteína
libres).
En la primera etapa sintética, se modificó el
precursor II polimérico con SPDP en condiciones similares en las
que se llevó a cabo la modificación del polímero con SMP en el
ejemplo 3.
Se añadió una disolución de 42 mg de
poli(HPMA-co-MA-diGly-NHN=Dox-co-MA-diGly-NHNH_{2}-co-MA-diGly-NHNH-PD)
(que contenía 3,3 \mumoles de grupos piridilditio (PD)) en 0,6 ml
de tampón a 14 mg de anticuerpos, inmunoglobulina (véase
anteriormente) modificados con grupos -SH, que contenían 0,68
\mumoles de grupos -SH disueltos en 1,7 ml de tampón fosfato
(Na_{2}HPO_{41}/NaH_{2}PO_{4} 0,05 M, NaCl 1 M; EDTA 0,01 M;
pH 7,4) mientras se agitaba. Se agitó la mezcla de reacción a
temperatura de laboratorio durante 7 horas tras lo cual se
eliminaron las partes de bajo peso molecular y cualquier polímero
no unido mediante filtración en gel. Entonces se concentró el
conjugado mediante ultrafiltración y se caracterizó de manera
similar a la descrita en el ejemplo 3.
Se prepararon estos conjugados haciendo
reaccionar anticuerpos en las moléculas en las que se habían
introducido grupos aldehído mediante oxidación suave con peryodato
de sodio, quedando grupos hidrazida tras la reacción del precursor
II polimérico con doxorubicina.
Preparación de anticuerpos oxidados: Se
transfirieron 40 mg de anticuerpos (IgG policlonal
anti-timocitos) a tampón acetato
(CH_{3}COOH/CH_{3}COONa 0,02 M; NaCl 0,15 M; pH 5) usando una
columna PD-10. Se preparó una disolución 0,1 M de
NaIO_{4} en el mismo tampón en la oscuridad. Se mezclaron las
disoluciones de anticuerpos y peryodato en una razón de 4:1 para
alcanzar las concentraciones finales de NaIO_{4} y anticuerpos de
0,02 moles/l y 9 mg/l, respectivamente. Se agitó la mezcla de
reacción a temperatura de laboratorio en la oscuridad durante 2
horas tras lo cual se añadieron 25 \mul de etilenglicol por cada
ml de la mezcla de reacción. Tras 20 minutos, se purificaron los
anticuerpos oxidados (inmunoglobulina) y se aislaron mediante
cromatografía de líquidos en una columna PD-10. Se
determinó la concentración de anticuerpos (inmunoglobulina) en la
disolución mediante espectrofotometría. Se determinó el número de
grupos aldehído mediante un método que utilizaba la reacción de
grupos aldehído con el colorante Lucifer Yellow CH.
Ejemplo de preparación de muestra de
conjugado: Se mezclaron 36,5 mg de anticuerpos oxidados en 5 ml
de tampón acetato (CH_{3}COOH/CH_{3}COONa 0,02 M; NaCl 0,15 M;
pH 5), tras enfriar hasta 15ºC, con una disolución de 73 mg de
precursor II polimérico
poli(HPMAco-MA-diGly-NHN=Dox-co-MA-diGly-NHNH_{2})
con Dox unido, disuelto en 1 ml de tampón. Se agitó la mezcla de
reacción a 15ºC en la oscuridad durante 16 horas. Tras 16 horas, se
ajustó el pH de la mezcla de reacción a pH 7,2 con NaOH 0,1 M. Se
eliminaron las partes de bajo peso molecular y el polímero no unido
del conjugado mediante filtración en gel. Entonces se concentró el
conjugado y se caracterizó de la misma manera que los otros
conjugados con anticuerpos (inmunoglobulina).
Se usaron inmunoglobulina no específica humana y
de conejo (IgG), anticuerpos policlonales
anti-timocitos (ATG), anticuerpos monoclonales
anti-Thy 1.2, anti-CD4,
anti-CD 71, anti-BCL1,
anti-CD4, anti-CD8,
anti-CD 14 y otros anticuerpos frente a antígenos
asociados a tumores (anti-TAA) para las
conjugaciones con polímeros.
Se midieron la estabilidad hidrolítica de los
conjugados y la velocidad de liberación del fármaco activo a partir
del polímero en sistemas modelo a diversos pH y temperaturas. La
figura 5 muestra los resultados de la medición de las velocidades
de liberación de la doxorubicina a partir de polímeros que diferían
en las composiciones del espaciador a un pH que imitaba al pH de la
sangre (7,4) y a un pH que imitaba el entorno del endosoma o
lisosoma (pH 5 - 6). La concentración de Dox unida (0,5
mmoles.l^{-1}) era constante en tampón acetato 0,1 M
(CH_{3}COONa/CH_{3}COOH, NaCl 0,05 M) en los experimentos. Se
incubaron las muestras a 37ºC en la oscuridad y se tomaron partes
de 0,1 ml en intervalos predefinidos y se analizaron por medio de
HPLC tras la extracción de Dox de la disolución. Los resultados
muestran que la estructura de la unión entre el fármaco y el
portador polimérico influye en la velocidad de liberación del
fármaco a partir del portador, siendo la velocidad de liberación
relativamente baja al pH de la sangre y más de diez veces superior a
un pH que imita al entorno celular. Considerando el hecho de que el
periodo de retención del fármaco en los vasos sanguíneos es
relativamente corto, el experimento confirma la relativa estabilidad
del conjugado polimérico durante el transporte y su capacidad para
liberar el fármaco activo por primera vez tras su penetración en
las células.
La capacidad de los conjugados poliméricos para
reducir la proliferación o división celular de células diana se
denomina actividad citotóxica o citostática. Se detectó la actividad
citotóxica in vitro mediante la inhibición de la
incorporación de ^{3}H-timidina a los núcleos de
las células diana [\check{R}ìhovà et al, 2000]. La
incorporación de timidina y la actividad de los conjugados son
indirectamente proporcionales. Una baja incorporación de timidina
significa una alta actividad citotóxica de las sustancias sometidas
a prueba. Se pipetearon las células de líneas tumorales
seleccionadas (línea EL4 leucémica T de ratón, BCL1 de leucemia
celular B de ratón, 38C13 de linfoma celular B de ratón, SW480 de
carcinoma colorrectal humano primario, SW620 de carcinoma
colorrectal humano metastatizante, SW620 de carcinoma colorrectal
humano modificado genéticamente mediante el gen de ratón para Thy
1.2 SW620/T) y esplenocitos de ratón estimulados mediante mitógeno
celular T, es decir concanavalina A, y linfocitos periféricos
humanos, en las cantidades de 1 x 10^{4} - 5 x 10^{5}
(dependiendo de los sistemas de células de prueba usados) en medio
de crecimiento RPMI 1640 en placas de tejidos FB de 96 pocillos
(NUNC, Dinamarca). Se llevó a cabo el cultivo posterior o bien sin
estimulación adicional (todas las líneas tumorales y linfocitos
humanos y murinos no afectados) o bien en presencia del mitógeno
celular T de concanavalina A, cuando iba a estudiarse el efecto
sobre linfocitos T normales, que proliferaban de manera intensa. La
concentración de concanavalina A en la que se cultivaron las células
era de 1,25 \mug/pocillo. Se añadieron muestras de prueba o
doxorubicina libre en concentraciones finales de
0,0016-80 \mug/ml a cada pocillo experimental de
la placa de tejidos que contenía células de prueba en un medio con o
sin concanavalina A. El volumen total del pocillo era de 250
\mul. Se sometió a prueba cada concentración en una base paralela
en una muestra y una línea de tres a cinco veces. Se incubaron las
placas de microtitulación de tejidos a 37ºC en la atmósfera de
CO_{2} al 5% durante de 24 a 72 horas. Tras completar el cultivo,
se añadió a cada pocillo 1 \muCi de
^{3}H-timidina. Tras otras cinco o seis horas
(dependiendo del sistema de pruebas), se recogieron las células
(colector de células Tomtec) sobre un filtro de fibra de vidrio
(Filtermat, Wallac), se secaron y se evaluaron para determinar la
radiactividad incorporada (MicroBeta Trilux, Wallac). La CI_{50}
para conjugados no dirigidos que contenían doxorubicina liberada
hidrolíticamente oscilaba desde 0,01 \mug de doxorubicina/ml
hasta 1,41 \mug de doxorubicina/ml dependiendo de la resistencia
(sensibilidad al tratamiento de la línea diana usada) y del tipo de
conjugado. Se confirmó que la citotoxicidad es una propiedad
exclusiva de los conjugados que contienen doxorubicina liberada
hidrolíticamente dado que un conjugado sin el fármaco no es
citotóxico.
Las pruebas in vitro han demostrado que
a) la actividad de los conjugados con un fármaco que puede liberarse
hidrolíticamente no depende de la degradabilidad enzimática del
enlace covalente entre el fármaco y la unión oligopeptítica y que
b) los conjugados en los que la unión entre la cadena polimérica
básica y el fármaco está formada sólo por ácido
\varepsilon-aminocaproico o ácido
p-aminobenzoico son igualmente eficaces que los que
contienen una unión di o tetrapeptídica.
Se llevó a cabo una prueba in vitro de
actividad citotóxica de la misma manera que se describió en el
ejemplo 7. Se seleccionaron células de la línea eritroleucémica K
562 con bajo contenido lisosómico como células diana. Se ha
demostrado que los conjugados que contienen doxorubicina liberada
hidrolíticamente son significativamente citotóxicos incluso en esta
línea en la que los conjugados con doxorubicina liberada
enzimáticamente son citotóxicos en un grado muy limitado (figura
7). Este resultado muestra que los conjugados con doxorubicina
liberada hidrolíticamente son eficaces incluso en sistemas de
células con pocos lisosomas.
Se trasplantó subcutáneamente el linfoma celular
T (EL4) a ratones de la cepa consanguínea C57BL/10. Se inyectaron
las células tumorales en la mitad inferior del lomo de animales
experimentales en la cantidad de 1 x 10^{5} células/ratón. El día
del trasplante de las células se marcó como día 0. Entonces se
administraron los conjugados poliméricos con doxorubicina liberada
hidrolíticamente por vía intraperitoneal o bien en el día 1, 3, 5, 7
y 9 (régimen protector), en el día 10, 12, 14, 16 y 18 o bien en el
día 12, 14, 16, 18 y 20 (régimen terapéutico). La dosis diaria de
doxorubicina era de 50 \mug/ratón. Los conjugados inhibieron
significativamente el crecimiento tumoral y aumentaron el número de
animales experimentales que sobrevivieron a largo plazo. Mientras
que un conjugado polimérico libre de fármaco no tuvo efectos en
absoluto y la doxorubicina clásica, es decir, no modificada tuvo un
efecto muy limitado (el periodo máximo de supervivencia de los
animales experimentales era de 40 días en contraposición a 35 días
en el grupo control), la administración de los conjugados
poliméricos con doxorubicina liberada hidrolíticamente permitió la
supervivencia a largo plazo, es decir, de más de 80 días, en el 40%
y el 20% de los ratones en el régimen protector y el régimen
terapéutico, respectivamente.
Se trasplantó por vía i.p. la BCL1 de leucemia
celular B de ratón a ratones de la cepa consanguínea Balb/c. Se
inyectaron las células tumorales en la cantidad de 5 x 10^{5}
células/ratón. El día del trasplante de las células se marcó como
el día 0. Entonces se administraron los conjugados poliméricos con
doxorubicina liberada hidrolíticamente por vía intravenosa en el
día 11, 13 y 17 (régimen terapéutico). La dosis diaria de
doxorubicina era de 100 \mug/ratón. Los conjugados sometidos a
prueba tenían una actividad antitumoral significativa. Mientras que
los ratones control no sobrevivieron más de 40 días, el 20% de los
ratones tratados con los conjugados sometidos a prueba
sobrevivieron más de 100 días y el 10% más de 140 días.
R Duncan, J.B. Lloyd, J.
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Claims (4)
1. Conjugados que consisten en un portador
polimérico constituido por de 30 a 3.000 unidades monoméricas unidas
formando una cadena polimérica, compuesta por
- a.
- del 60 al 99% de unidades de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida
- b.
- del 1 al 25% de unidades de hidrazonas metacriloiladas de \varepsilon-aminoácidos o aminoácidos aromáticos terminados con una molécula de un agente cancerostático de antraciclina
- c.
- del 0,5 al 15% de unidades de aminoácidos aromáticos o \varepsilon-aminoácidos metacriloilados o sus sales de sodio, y
- d.
- del 0,5 al 10% de unidades de hidrazidas metacriloiladas de \varepsilon-aminoácidos o aminoácidos aromáticos,
de fórmula general
estando dispuestas las unidades
estructurales individuales de una manera al azar en la cadena y en
la que x oscila desde 20 hasta 3.000, a es de desde 1 hasta 750, b
y c son cada uno de desde 1 hasta
450,
en la que X es un aminoácido elegido de la
siguiente serie: ácido \varepsilon-aminocaproico
(AKap), ácido p-aminobenzoico (AB).
2. Conjugados según la reivindicación 1, que
contienen además del 0,1 al 5% de unidades de oligopéptidos
metacriloilados degradables enzimáticamente, interconectados con
alquilendiaminas que forman un enlace bivalente entre las cadenas
poliméricas, formando así una estructura reticulada del conjugado,
en los que las unidades bivalentes que conectan las cadenas
lineales se eligen de la siguiente serie: GlyPheLeuGly, GlyLeuGly,
GlyPheGly, GlyLeuPheGly.
3. Composición farmacéutica para el tratamiento
de tumores, caracterizada porque incluye, como principio
activo, un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores.
4. Composición farmacéutica según la
reivindicación 3, diseñada para el tratamiento de tumores, tales
como tumor de mama o tumor colorrectal.
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