PL216518B1 - Polimerowe koniugaty leków przeciwnowotworowych i kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Polimerowe koniugaty leków przeciwnowotworowych i kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number
PL216518B1
PL216518B1 PL370719A PL37071902A PL216518B1 PL 216518 B1 PL216518 B1 PL 216518B1 PL 370719 A PL370719 A PL 370719A PL 37071902 A PL37071902 A PL 37071902A PL 216518 B1 PL216518 B1 PL 216518B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
amino acids
polymer
drug
units
conjugates
Prior art date
Application number
PL370719A
Other languages
English (en)
Other versions
PL370719A1 (pl
Inventor
Karel Ulbrich
Tomáš Etrych
Blanka Říhová
Markéta Jelínková
Marek Kovář
Original Assignee
Zentiva As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zentiva As filed Critical Zentiva As
Publication of PL370719A1 publication Critical patent/PL370719A1/pl
Publication of PL216518B1 publication Critical patent/PL216518B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

Wynalazek dotyczy polimerowych koniugatów leków przeciwnowotworowych i kompozycji farmaceutycznej zawierającej te koniugaty. Polimerowe leki przeciwnowotworowe umożliwiają docelowy transport w organizmie i skupiają się na ukierunkowanej terapii nowotworów w leczeniu człowieka.
Opracowanie nowych leków i nowych postaci leków ostatnio skupia się na wykorzystaniu substancji polimerowych, szczególnie polimerów rozpuszczalnych w wodzie, jako nośników leków. Wytworzono i zbadano szereg polimerowych koniugatów z leków przeciwnowotworowych i rozpuszczalnych polimerów, w których lek przeciwnowotworowy był związany z polimerem nierozszczepialnym wiązaniem kowalencyjnym, hydrolitycznie niestabilnym wiązaniem jonowym lub wiązaniem kowalencyjnym podatnym na enzymatyczną lub prostą hydrolizę. Celem tych prób było wytworzenie leków o korzystniejszych właściwościach farmakokinetycznych i farmakodynamicznych, umożliwiających ukierunkowaną terapię guzów nowotworowych. Ważną grupę tworzą leki polimerowe wytworzone na bazie kopolimerów HPMA. Lek przeciwnowotworowy w takich substancjach jest związany z nośnikiem polimerowym N-(2-hydroksypropylo)metakryloamidem za pomocą rozszczepialnej enzymatycznie sekwencji oligopeptydowej, wytworzonym jako substrat dla enzymów lizosomalnych (enzymów obecnych w komórkach ssaków). Budowę, syntezę i właściwości takich koniugatów opisano w opisie patentowym [Duncan 1985], Wyniki uzyskane w tej dziedzinie do chwili obecnej zostały w sposób zrozumiały podsumowane przez Kopaceka i innych [Kopacek i inni, 2000]. Powyższe leki polimerowe były skuteczne w leczeniu wielu nowotworów u myszy i szczurów. Obecnie dwa z koniugatów polimerowych są nawet badane klinicznie [Vasey i inni, 1999; Julyan i inni, 1999; Thomson i inni, 1999]. Wyniki takich badań klinicznych wykazały, że polimerowy koniugat doksorubicyny wykazuje mniejszą nieswoistą toksyczność, niż wolny lek. Jego maksymalna dopuszczalna ilość (MAA) wynosi 2
320 mg/m2, co jest wartością 4-5 razy wyższą, niż normalnie stosowana w klinice ilość wolnej dokso2 rubicyny (60 - 80 mg/m2). Po podaniu polimerowego leku nie obserwowano żadnego znaczącego wpływu na czynność serca, chociaż skumulowana ilość u danego osobnika osiągała maksymalnie 2
1680 mg/m2. Wszystkie inne obszary toksyczności obserwowane w połączeniu z podawaniem wolnych, czyli nieukierunkowanych antybiotyków antracyklinowych, były znacznie zmniejszone. Jedną z wad klinicznie badanych polimerowych koniugatów leków jest stosunkowo mała swoistość działania, ponieważ takie koniugaty albo wcale nie zawierają jednostki kierującej, takiej jak PK1, albo zawierają węglowodan o stosunkowo małej swoistości (galaktozamina w koniugacie PK2, dla którego obecnie badana jest zdolność do kierowania leku polimerowego do wątroby). Zatem obecnie opracowywane są koniugaty, w których swoiste działanie osiągane jest przez związanie swoistej cząstki kierującej (np. przeciwciał oraz lektyny, hormonu wzrostu, transferyny, itp.) z cząsteczką nośnika.
Kolejną wadą badanych klinicznie koniugatów, obejmujących związki poli(HPMA) i doksorubicyny jest fakt, że ten lek z takich koniugatów jest uwalniany w swojej farmakologicznie czynnej postaci w komórkach na drodze reakcji enzymatycznej, która zachodzi w lizosomach. To oznacza, że lek ten jest skuteczny wyłącznie w komórkach, w których jest duże stężenie enzymów lizosomalnych - peptydaz. Kolejną wadą jest stosunkowo złożona budowa koniugatu, wymagająca włączenia sekwencji, z której lek jest uwalniany przez peptydazy, głównie połączenia tetrapeptydowego GlyPheLeuGly, co czyni syntezę droższą i bardziej złożoną.
Publikacje dostarczają wiele informacji dotyczących wytwarzania oraz badań właściwości polimerów, z którymi lek przeciwnowotworowy jest połączony wiązaniem podatnym na hydrolizę w środowisku wodnym. Wyniki podsumował Krat z [Krat z i inni, 1999]. Najczęściej jako nośniki dla leków przeciwnowotworowych stosowano naturalne makrocząsteczki, np. albuminę, dekstrany, transferynę, alginiany lub przeciwciała. W kilku przypadkach stosowano syntetyczne nośniki polimerowe, glikol polietylenowy i poliglutaminy. Leki były związane z nośnikami wiązaniami umożliwiającymi uwalnianie czynnego leku, regulowane przez hydrolizę, zarówno w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, jak i wewnątrz komórek. W przypadku doksorubicyny (Doks) to wiązanie najczęściej tworzyły estry kwasu cis-akonitylowego lub było to wiązanie hydrazonowe. Jednakże prowadzone na zwierzętach badania in vitro powyższych koniugatów wrażliwych na pH nie dostarczyły jednoznacznych wyników. Zatem żaden z polimerowych koniugatów nie był stosowany ani badany klinicznie do leczenia nowotworu.
Opracowane i wytworzone polimerowe leki przeciwnowotworowe na bazie kopolimerów HPMA oraz lek przeciwnowotworowy połączony wrażliwym na pH wiązaniem hydrazonowym wykazały, w badaniach prowadzonych zarówno in vitro, jak i in vivo na myszach, znacznie wyższą skuteczność przeciwnowotworową w stosunku do wielu linii nowotworowych, w porównaniu z koniugatami z lekiem
PL 216 518 B1 związanym z nośnikiem polimerowym za pomocą rozszczepialnego enzymatycznie wiązania za pośrednictwem połączenia oligopeptydowego. Synteza takich koniugatów w porównaniu z opracowanymi wcześniej koniugatami poli(HMPA) jest prostsza, tańsza i łatwiejsza w realizacji, ponieważ jako połączenie może być zastosowany tylko aminokwas zamiast degradowalnej enzymatycznie sekwencji oligopeptydowej, a wiązanie leku z polimerem jest prostą reakcją. Lek jest uwalniany w wyniku zmiany pH środowiska, a zatem obecność enzymów lizosomalnych nie jest konieczna dla aktywacji. Szybkość takiego uwalniania (a zatem bezpośrednie stężenie cytostatyczne) jest znacznie większe w porównaniu z koniugatami zawierającymi sekwencje degradowalne wyłącznie enzymatycznie [Rihova i inni, 2001; Etrych i inni, 2001].
Wynalazek dotyczy liniowych i rozgałęzionych polimerowych koniugatów doksorubicyny, daunomycyny, farmorubicyny i innych antracyklinowych leków przeciwnowotworowych zawierających grupę karbonylową z kopolimerami wytworzonymi na bazie N-(2-hydroksypropylo)metakryloamidu (HPMA) i ewentualnie z przeciwciałami, ich fragmentami lub niespecyficznymi immunoglobulinami (fig. 3). Dla tych koniugatów charakterystyczne jest to, że nośnik polimerowy razem z przeciwciałem (immunoglobuliną) zapewnia dłuższy czas przebywania polimerowego leku w naczyniach krwionośnych oraz następcze korzystne bierne lub czynne gromadzenie się w nowotworze. Lek przeciwrakowy jest związany z nośnikiem wiązaniem, które jest stabilne w naczyniach krwionośnych (przy pH 7,4). Po połączeniu leku z polimerem środek przeciwnowotworowy traci swoją aktywność biologiczną i jest transportowany w naczyniach krwionośnych w postaci nieaktywnej. Lek przeciwnowotworowy ulega aktywacji wyłącznie wewnątrzkomórkowo, w organellach komórek docelowych, gdy pH spada i wiązanie między lekiem a polimerem ulega hydrolizie.
Przedmiotem wynalazku są polimerowe koniugaty leków przeciwnowotworowych, zawierające polimerowy nośnik złożony z 30 - 3000 monomerowych jednostek połączonych z utworzeniem łańcucha polimerowego, zawierające:
- 99% jednostek N-(2-hydroksypropylo)metakryloamidu;
- 25% jednostek metakryloilowanych hydrazonów ε-aminokwasów lub aminokwasów aromatycznych zakończonych cząsteczką przeciwnowotworowej antracykliny;
0,5 - 15% jednostek metakryloilowanych ε-aminokwasów lub aminokwasów aromatycznych lub ich soli sodowych, i 0,5 - 10% jednostek metakryloilowanych hydrazydów ε-aminokwasów lub aminokwasów aromatycznych, o wzorze ogólnym
w których poszczególne jednostki strukturalne są rozmieszczone w sposób losowy w łańcuchu, przy czym x wynosi od 20 - 3000, a wynosi 1 - 750, b i c wynoszą niezależnie 1 - 450, X oznacza aminokwas wybrany spośród kwasu ε-aminokapronowego (AKap) oraz kwasu p-aminobenzoesowego (AB).
PL 216 518 B1
Polimerowe koniugaty według wynalazku korzystnie zawierają dodatkowo 0,1 - 5% enzymatycznie degradowalnych jednostek metakryloilowanych oligopeptydów, połączonych alkilenodiaminami, które tworzą dwuwartościowe połączenie między łańcuchami polimerów, w ten sposób tworząc usieciowaną strukturę koniugatu, gdzie dwuwartościowe jednostki łączące liniowe łańcuchy są wybrane z grupy obejmującej następujące sekwencje: GlyPheLeuGly, GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyLeuPheGly.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów, zawierająca jako składnik czynny polimerowy koniugat określony powyżej.
Kompozycja farmaceutyczna korzystnie jest przeznaczona do leczenia nowotworów, takich jak nowotwór sutka albo nowotwór jelita grubego.
Cechą charakterystyczną polimerowych koniugatów według wynalazku wykazujących ukierunkowane działanie przeciwnowotworowe jest połączenie między czynnym składnikiem - cytostatykiem a polimerowym nośnikiem za pośrednictwem grupy hydrazonowej, utworzone w reakcji między grupą karbonylową cząsteczki leku a grupą hydrazydową polimeru. Połączenie leku z polimerowym nośnikiem znacząco zwiększa masę cząsteczkową leku, co prowadzi do wydłużenia czasu obecności leku we krwi i całkowitego czasu przebywania składnika czynnego w organizmie. Połączenie między lekiem a polimerem jest stosunkowo trwałe w czasie transportu leku w naczyniach krwionośnych i jest hydrolitycznie rozszczepialne w lekko kwaśnym środowisku wewnątrz komórek, a mianowicie w organellach komórkowych charakteryzujących się kwaśnym pH. To oznacza, że lek jest transportowany w naczyniach krwionośnych w nieaktywnej postaci, związany z polimerem, i ulega uwolnieniu i aktywacji wyłącznie po przejściu do docelowych komórek nowotworu. Aktywacja leku w docelowych komórkach eliminuje działania uboczne w innym przypadku toksycznych cytostatyków i skupia ich działanie głównie na komórkach nowotworu. Polimerowy nośnik na bazie kopolimerów HPMA jest odpowiedzialny za docelowy transport do nowotworu lub komórek nowotworu. Gdy został zastosowany rozgałęziony wielkocząsteczkowy nośnik poli (HPMA), polimerowy lek jest gromadzony w tkance litego guza nowotworowego w związku z biernym kierowaniem i efektem EPR (efektem zwiększonej przepuszczalności i retencji). Polimer może być uwalniany z organizmu po enzymatycznej degradacji wiązań oligopeptydowych w postaci krótszych łańcuchów polimerowych, np. w procesie filtracji kłębuszkowej. W nośnikach zawierających przeciwciała (immunoglobuliny) przeciwciało jest związane z nośnikiem wiązaniem hydrazonowym, utworzonym w reakcji między grupami aldehydowymi, włączonymi do fragmentu Fe przeciwciała w procesie utleniania nadjodanem sodu oraz grupami hydrazonowymi nośnika. Przeciwciało (immunoglobulina) może także być związane z polimerowym nośnikiem przy użyciu dwufunkcyjnych środków. W takim przypadku cząsteczka przeciwciała jest modyfikowana w reakcji z 2-iminotiolanem (wprowadzenie grup -SH), grupy maleimidowe są wprowadzane do polimeru w reakcji jego grup hydrazydowych z estrem hydroksysukcynoimidowym kwasu 3-maleimidopropionowego, a następnie dochodzi do sprzęgania przez addycję grupy -SH przeciwciała do podwójnego wiązania grupy meleimidowej polimeru. Analogicznie sprzęganie można zainicjować innym dwufunkcyjnym środkiem, takim jak SPDP (ester N-hydroksysukcynoimidowy kwasu 3-(2-pirydyloditio)propionowego), który może być użyty do sprzęgania przeciwciała (immunoglobuliny) zawierającego grupę -SH bezpośrednio z grupami hydrazydowymi nośnika polimerowego.
Koniugat z przeciwciałem (immunoglobuliną) gromadzi się w docelowych narządach/tkankach zarówno w sposób bierny, jak i czynny. Bierne gromadzenie zapewnia większa masa cząsteczkowa koniugatu i obejmuje tak zwany efekt EPR; czynne gromadzenie zapewnia proces, w którym miejsce wiązania celującego przeciwciała oddziałuje z odpowiednimi receptorami na powierzchni komórek docelowych. W tym ostatnim przypadku kopolimer HPMA odgrywa rolę zarówno nośnika, jak i ochronnego opakowania, znacząco zmniejszając immunogenność docelowej glikoproteiny w koniugacie.
Lek polimerowy według wynalazku może być stosowany w trzech postaciach różniących się szczegółową budową. Pierwsza struktura odpowiada liniowemu polimerowemu koniugatowi z lekiem bez kierującego przeciwciała (immunoglobuliny) (fig. 1); druga jest wielkocząsteczkowa i odpowiada rozgałęzionej strukturze polimerowej z biodegradowalnymi wiązaniami oligopeptydowymi (fig. 2). Trzecia struktura obejmuje także cząsteczkę kierującą (immunoglobulinę) (fig. 3).
Wytwarzanie nieukierunkowanych liniowych leków polimerowych zachodzi w kilku etapach. Pierwszy etap obejmuje wytworzenie polimerowego prekursora I (patrz fig. 4) jako kopolimeru HPMA i metakryloilowanych reaktywnych estrów (estrów 4-nitrofenylowych, estrów N-hydroksysukcynoimidowych itp.) aminokwasów lub oligopeptydów; drugi etap, prowadzący do wytworzenia polimerowego prekursora II, obejmuje przeprowadzenie hydrazynolityczne końcowych grup estrowych w hydrazydy.
PL 216 518 B1
W trzecim etapie środek przeciwnowotworowy zawierający w cząsteczce grupę ketonową przyłącza się do grup hydrazydowych chemicznym wiązaniem hydrazonowym.
Wytwarzanie rozgałęzionych polimerowych leków należy rozpoczynać od polimerowego prekursora I, zawierającego w swoim łańcuchu bocznym enzymatycznie degradowalny oligopeptyd, korzystnie GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyPheLeuGly lub GlyLeuPheGly. Drugi etap rozpoczyna nieznaczne rozgałęzienie polimeru w reakcji polimerowego prekursora I i alkilenodiaminy (etylowej, butylowej, heksylowej), a kończy następcza hydrazynoliza przy użyciu hydratu hydrazyny, jak opisano we wcześniejszym przypadku.
Leki kierowane przeciwciałami (immunoglobulinami) można wytworzyć zarówno z wcześniejszych rodzajów leków w następczej reakcji z przeciwciałem (immunoglobuliną) struktury, w której grupa aldehydowa została wcześniej wprowadzona przez łagodne utlenienie z użyciem KIO4 lub NaIO4 albo drogą ich sprzęgania z przeciwciałem (immunoglobuliną) przy użyciu dwufunkcyjnych środków, jak opisano powyżej.
Wynalazek można wykorzystać do wytwarzania polimerowych leków do leczenia różnych rodzajów nowotworów w leczeniu ludzi.
Opis rysunków
Fig. 1 przedstawia strukturę liniowego polimerowego koniugatu z lekiem.
Fig. 2 przedstawia rozgałęzioną makrocząsteczkową strukturę polimeru z biodegradowaInym połączeniem oligopeptydowym.
Fig. 3 przedstawia strukturę koniugatu obejmującą celujące przeciwciało.
Fig. 4 przedstawia prekursor polimerowy.
Fig. 5 przedstawia wyniki pomiarów szybkości uwalniania doksorubicyny z koniugatów według wynalazku.
Fig. 6 przedstawia wyniki porównania zahamowania aktywności koniugatów według wynalazku związanych za pomocą różnych wiązań, in vitro.
Fig. 7 przedstawia wyniki porównania zahamowania aktywności koniugatów według wynalazku związanych za pomocą różnych wiązań, in vivo.
Fig. 8 przedstawia wyniki przeprowadzonych badań in vivo aktywności przeciwnowotworowej koniugatów według wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Wytwarzanie nieukierunkowanego liniowego leku polimerowego opartego na doksorubicynie
Syntezę leku polimerowego prowadzono w czterech etapach. W pierwszym etapie wytworzono monomery, N-(2-hydroksypropyIo)metakryloamid (HPMA) i 4-nitrofenylowe estry metakryloilowanego aminokwasu lub oligopeptydu (MA-X-ONp). Drugi etap obejmował wytworzenie polimerowego prekursora I w procesie rodnikowej kopolimeryzacji HPMA i MA-X-ONp. W trzecim etapie wytworzono polimerowy prekursor II w procesie hydrazynolizy prekursora I, a ostatni etap obejmował połączenie Doks z polimerowym prekursorem.
Wytwarzanie monomerów
HPMA wytworzono sposobem opisanym wcześniej [Ulbrich 2000]. Metakryloilowane reaktywne estry wytworzono drogą metakryloilowania odpowiedniego aminokwasu lub oligopeptydu (X = Gly, diGly, GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly, β-alanina, kwas ε-aminokapronowy (AKap), kwas paraaminobenzoesowy (AB), itp.) w reakcji Schottena-Baumana a następnie reakcji otrzymanej pochodnej kwasu metakrylowego z 4-nitrofenolem w obecności dicykloheksylokarbodiimidu (DCCI).
Protokół wytwarzania 4-nitrofenylowych estrów metakryloilowanych ε-aminokwasów
Sposób wytwarzania monomerów MA-Gly-ONp, MA-GlyGly-ONp i MA-AB-ONp jest identyczny dla wszystkich trzech przypadków. Poniżej opisano sposób wytwarzania MA-AB-ONp:
MA-AB-ONp: 0,024 mola (3,34 g) kwasu p-aminobenzoesowego rozpuszczono w trójszyjnej kolbie w 15 ml 0,024 mola (0,97 g) roztworu wodorotlenku sodu. 0,024 mola (2,55 g) chlorku metakryloilu i roztwór 0,024 mola (0,97 g) wodorotlenku sodu rozpuszczonego w 10 ml wody wkroplono jednocześnie do wodnego roztworu soli sodowej aminokwasu, w trakcie ciągłego mieszania i w warunkach chłodzenia (5°C). W czasie reakcji pH mieszaniny reakcyjnej nie może przekraczać 9. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę i po jej zakwaszeniu do pH 2 otrzymany biały osad odsączono przez szklany filtr S4. Produkt oczyszczano drogą krystalizacji z mieszaniny etanol-woda.
Ester 4-nitrofenylowy wytworzono w reakcji 0,014 mola (2,85 g) kwasu N-metakryIoiIo-4-aminobenzoesowego z 0,014 mola (1,93 g) 4-nitrofenolu w dimetyloformamidzie w temperaturze -10°C, w obecności 0,0153 mola (3,16 g) dicykloheksylokarbodiimidu. Reakcję prowadzono przez 10 go6
PL 216 518 B1 dzin, po czym osad dicykloheksymocznika odsączono i produkt oczyszczono drogą krystalizacji z mieszaniny aceton-woda. Dwa pozostałe estry 4-nitrofenylu (MA-X-ONp) można wytworzyć analogicznym sposobem.
Metakryloilowane pochodne GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly, β-alaniny i kwasu ε-aminokapronowego także wytworzono drogą metakryloilacji oligopeptydów lub kwasu, jednak po zakwaszeniu wodnej fazy metakryloilowane kwasy trzeba było wyekstrahować octanem etylu i wyodrębnić drogą krystalizacji. Odpowiednie reaktywne estry (estry ONp) wytwarza się analogicznie do MA-AB-ONp, z tym że jako środowisko reakcji estryfikacji MA-GlyLeuGly-OH i MA-GlyPheLeuGly-OH stosowano tetrahydrofuran.
Wytwarzanie polimerowego prekursora I : 1 g mieszaniny HPMA (95% mol, 0,89 g) i MA-AB-ONp (5% mol, 0,11 g) i 0,048 g aza-bisizobutyronitrylu rozpuszczono w 6,95 g acetonu i roztwór umieszczono w ampułce polimeryzacyjnej. Po przepuszczeniu przez mieszaninę polimeryzacyjną azotu ampułkę szczelnie zamknięto i przez 24 godziny prowadzono polimeryzację w temperaturze 50°C. Wytrącony polimer odsączono, przemyto trzykrotnie acetonem i eterem dietylowym i wysuszono pod próżnią. Zawartość łańcuchów bocznych zakończonych reaktywnymi grupami -ONp (skład kopolimeru) można regulować poprzez skład mieszaniny polimeryzacyjnej (stosunek monomerów). Taki sam sposób zastosowano do wytworzenia wszystkich polimerowych prekursorów różniących się składem łańcuchów bocznych.
Wytwarzanie polimerowego prekursora II. Kopolimer poli-(HPMA-co-MA-AB-NHNH2) wytworzono drogą reakcji polimerowego prekursora I z hydratem hydrazyny. 300 mg polimerowego prekursora I (1,3 x 10-4 mola ONp) rozpuszczono w 2 ml metanolu i w trakcie intensywnego mieszania dodano -3 roztworu 69 mg NH2NH2 · H2O w 1 ml metanolu (1,3 x 10-3 mola, 10-krotny nadmiar w stosunku do
ONp). Mieszaninę reakcyjną pozostawiano na 3 godziny, w czasie zaszła reakcja, po czym roztwór metanolowy rozcieńczano destylowaną wodą do 30 ml i z produktu usunięto składniki małocząsteczkowe prowadząc dializę względem wody destylowanej (2 dni). Końcowy produkt wyodrębniono z wodnego roztworu drogą liofilizacji. Masę cząsteczkową (Mw) i polidyspersyjność polimeru określono metodą chromatografii żelowej z detektorem rozproszenia światła. Liczbę grup hydrazydowych określono spektroskopowo, a następnie grupy hydrazydowe poddano reakcji z TNBS (kwasem trinitrobenzenosulfonowym). Prekursory zawierające inne aminokwasy i oligopeptydy wytworzono takim samym sposobem. Polimerowe prekursory II także wytworzono drogą rodnikowej kopolimeryzacji strąceniowej odpowiedniego N-t-butylooksykarbonylohydrazydu metakryloilowanego oligopeptydu lub aminokwasu (poli(HPMA-co-MA-XNHNH-BOC)) z HPMA w takich warunkach jak opisano powyżej. Po usunięciu zabezpieczającej grupy BOC z poli(HPMA-co-MA-XNHNH-BOC) z użyciem kwasu trifluorooctowego, wytracono z mieszaniny aceton-eter dietylowy polimerowy prekursor II, rozpuszczono go w wodzie, poddano dializie względem wody i Iiofilizacji.
Łączenie doksorubicyny z prekursorem polimerowym: 250 mg polimerowego prekursora II (poli(HPMA-co-MA-AB-NHNH2)) (0,1 mmola NHNH2) rozpuszczono w 3 ml metanolu. Ten roztwór polimeru dodano do 23 mg Doks · HCl (40 μmoli). Do mieszaniny reakcyjnej dodano dwie krople kwasu octowego i niejednorodny roztwór mieszano w temperaturze laboratorium (w ciemności). Po 48 godzinach reakcji homogeniczny roztwór dwukrotnie oczyszczono drogą filtracji żelowej w celu rozdzielenia wolnej Doks w kolumnie wypełnionej Sephadex LH-20 w metanolu. Frakcję polimerową wydzielono i zatężano w wyparce próżniowej. Produkt ponownie wytrącono z metanolu eterem dietylowym i wysuszono do stałej masy. Zawartość Doks i grup hydrazydowych określono odpowiednio spektroskopowo
-1 -1 (λ 480 nm, ε 11500 l mol-1 cm-1, woda) i TNBS. <MW> i rozkład masy cząsteczkowej określono metodą chromatografii cieczowej (kolumna Superose™6 (300 x 10 mm)), bufor octanowy 0,3 M (CH3-COONa/CH3COOH; pH 6,5; 0,5 g/l NaN3), natężenie przepływu 0,5 ml/min, detekcja z użyciem refraktometru różnicowego, detektora rozproszenia światła (DAWN-DSP-F, Wyatt Technology, USA) i detektora UV (280 i 488 nm).
Powyższy sposób zastosowano do wytworzenia wszystkich innych polimerowych koniugatów doksorubicyny.
P r z y k ł a d 2
Wytwarzanie rozgałęzionych makrocząsteczkowych koniugatów
400 mg polimerowego prekursora I zawierającego sekwencje oligopeptydowe GlyPheGly, GlyLeuGly lub GlyPheLeuGly (0,19 mmola ONp) rozpuszczano w 1,1 ml DMSO. W trakcie intensywnego mieszania dodano 105 μl i 0,2 M roztworu 1,2-etylenodiaminy w DMSO (21 μmoli EDA) i mieszaninę reakcyjną pozostawiono w temperaturze laboratorium na 1 godzinę, aby mogła zajść reakcja. Dodano
PL 216 518 B1 roztworu 100 mg hydratu hydrazyny (2 mmole) w 0,3 ml DMSO w trakcie intensywnego mieszania roztworu polimeru i mieszaninę reakcyjną intensywnie mieszano przez następne 3 godziny. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono wodą destylowaną do 30 ml i produkt oczyszczono drogą dializy względem wody destylowanej (2 dni). Wielkocząsteczkowy prekursor liofilizowano. <MW> i rozkład masy cząsteczkowej określono metodą chromatografii cieczowej, zawartość grup hydrazydowych określono spektroskopowe, metodą TNBSA. Doksorubicynę połączono z polimerem i koniugat scharakteryzowano w takich samych warunkach jak opisano w przykładzie 1.
P r z y k ł a d 3
Wytwarzanie koniugatu I przeciwciała ukierunkowanego na immunoglobulinę
Kopolimer zawierający grupy hydrazydową i maleimidową (MI) (poli(HPMA-co-MA-X-NHNH2-co-MA-X-NHNH-MI)) w łańcuchach bocznych wytworzono częściowo modyfikując grupy hydrazydowe polimerowego prekursora II, zawierającego 10 - 15% mol grup hydrazydowych, przy użyciu estru N-hydroksysukcynoimidylowego kwasu maleimidylopropionowego (SMP). 250 mg prekursora II poli (HPMA-co-MA-diGly-NHNH2) (125 μmol grup hydrazydowych) rozpuszczono w 1,2 ml DMSO i dodano roztworu 16,6 mg SMP (62,5 μmola) w 0,6 ml DMSO. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze laboratorium przez 8 godzin. Po oczyszczeniu w kolumnie PD-10 (eluent: woda destylowana) określono <MW> i rozkład masy cząsteczkowej metodą chromatografii cieczowej, liczbę grup maleimidowych określono za pomocą zmodyfikowanego testu Ellmana, a zawartość resztkowych grup hydrazydowych określono metodą TNBS. Doksorubicynę połączono z tym kopolimerem w taki sam sposób jak opisano w przykładzie 1.
Wprowadzan ie grup -SH do cząsteczki przeciwciała (immunoglobuliny): 15 mg przeciwciał (poliklonalnych IgG skierowanych przeciw tymocytom) (0,1 μmola) przeniesiono do 1 ml buforu fosforanowego (0,05 M NaH2PO4/Na2HPO4; 0,1 M NaCl; 0,11 M EDTA; pH 7,4) w kolumnie PD-10. 0,67 mg 2-iminotiolanu (4 μmοIe) rozpuszczono w 50 μl DMF i dodano do roztworu intensywnie mieszanych przeciwciał. Po mieszaniu przez 2,5 godziny w temperaturze laboratoryjnej produkt wyodrębniono drogą filtracji żelowej w kolumnie PD-10 (bufor fosforanowy, pH 7,4). Poziom modyfikacji przeciwciałem (immunoglobuliną) określono metodą z wykorzystaniem reakcji grup -SH z odczynnikiem Ellmana.
Sprzęganie 60 mg poli(HPMA-co-MA-diGly-NHN=Doks-co-MA-X-NHNH2-co-MA-X-NHNH-MI) zawierającego doksorubicynę, grupy hydrazydowe i maleimidowe z 20 mg zmodyfikowanych przeciwciał przeprowadzono w buforze fosforanowym o pH 7,4 (patrz wyżej) w temperaturze laboratorium. Końcowy produkt oczyszczono drogą filtracji żelowej i scharakteryzowano metodą spektroskopii UV (zawartość Doks), analizy aminokwasowej (zawartość przeciwciał i immunoglobulin) i elektroforezy z Phastsystem - Pharmacia LKB (obecność wolnego białka lub leku).
P r z y k ł a d 4
Wytwarzanie koniugatu II przeciwciała ukierunkowanego na immunoglobulinę
W pierwszym etapie syntezy polimerowy prekursor II zmodyfikowano SPDP w podobnych warunkach do tych, w których przeprowadzono modyfikację polimeru z użyciem SMP w przykładzie 3.
Roztwór 42 mg poli(HPMA-co-MA-diGly-NHN=Doks-co-MA-diGly-NHNH2-co-MA-diGly-NHNH-PD) (zawierający 3,3 μmola grup pirydyloditio (PD)) w 0,6 ml bufora dodano do 14 mg przeciwciał, immunoglobuliny (patrz wyżej) modyfikowanej grupami -SH, zawierającej 0,68 μmola grup -SH, rozpuszczono w 1,7 ml buforu fosforanowego (0,05 M NaH2PO4/Na2HPO4; 0,1 M NaCl; 0,01 M EDTA; pH 7,4) w trakcie mieszania. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze laboratorium przez 7 godzin, a następnie składniki o małej masie cząsteczkowej i całość niezwiązanego polimeru usunięto drogą filtracji żelowej. Koniugat następnie zatężono drogą ultrafiltracji i scharakteryzowano podobnie jak opisano w przykładzie 3.
P r z y k ł a d 5
Wytwarzanie koniugatu III przeciwciała ukierunkowanego na immunoglobulinę
Powyższe koniugaty wytworzono drogą reakcji przeciwciał z cząsteczkami, do których wprowadzono grupy aldehydowe w procesie łagodnego utleniania nadjodanem sodu, z grupami hyd razyd owymi pozostającymi po reakcji polimerowego prekursora II z doksorubicyną.
Wytwarzanie utlenionych przeciwciał: 40 mg przeciwciał (poliklonalnych IgG skierowanych przeciw tymocytom) przeniesiono do bufora octanowego (0,02 M CH3COONa/CH3COOH; 0,15 M NaCl; pH 5) przy użyciu kolumny PD-10. 0,1 M roztwór NaIO4 wytworzono w tym samym buforze w ciemności. Roztwory przeciwciał i nadjodanu zmieszano w stosunku 4:1 do osiągnięcia końcowych stężeń NaIO4 i przeciwciał wynoszących odpowiednio 0,02 mola/I i 9 mg/l. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze laboratorium w ciemności przez 2 godziny, a następnie dodano 25 μl glikolu
PL 216 518 B1 etylenowego na ml mieszaniny reakcyjnej. Po 20 minutach utlenione przeciwciała (immunoglobuliny) oczyszczono i wyizolowano metodą chromatografii cieczowej w kolumnie PD-10. Stężenie przeciwciał (immunoglobulin) w roztworze określono metodą spektrofotometrii. Liczbę grup aldehydowych określono metodą wykorzystującą reakcję grup aldehydowych z barwnikiem żółcienią lucyferową CH (Lucifer Yellow).
Przykład wytwarzania próbki koniugatu: 36,5 mg utlenionych przeciwciał w 5 ml buforu octanowego (0,02 M CH3COONa/CH3COOH; 0,15 M NaCl; pH 5), po ochłodzeniu do 15°C, zmieszano z roztworem 73 mg poli(HPMA-co-MA-diGly-NHN=Doks-co-MA-diGly-NHNH2) polimerowego prekursora II ze związaną Doks, rozpuszczonego w 1 ml bufora. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 15°C w ciemności przez 16 godzin. Po 16 godzinach odczyn mieszaniny reakcyjnej doprowadzono do pH 7,2 z użyciem 0,1 M NaOH. Małocząsteczkowe części i niezwiązany polimer oddzielono od koniugatu drogą filtracji żelowej. Koniugat następnie zatężono i scharakteryzowano w taki sam sposób jak inne koniugaty z przeciwciałami (immunoglobulinami).
Do sprzęgania z polimerami użyto ludzkie i królicze niespecyficzne immunoglobuliny (IgG), poliklonalne przeciwciała przeciw tymocytom (ATG), monoklonalne przeciwciała przeciw-Thy 1,2, przeciw-CD4, przeciw-CD 71, przeciw-BCL1, przeciw-CD4, przeciw-CD8, przeciw-CD14 i inne przeciwciała przeciw antygenom związanym z nowotworami (przeciw-TAA).
P r z y k ł a d 6
Uwalnianie doksorubicyny z polimerowych koniugatów in vitro
Stabilność hydrolityczną koniugatów i szybkość uwalniania czynnego leku z polimeru mierzono w układach modelowych w różnych warunkach pH i temperatury. Na fig. 5 pokazano wyniki pomiarów szybkości uwalniania doksorubicyny z polimerów różniących się budową przestrzenną przy pH naśladującym pH krwi (7,4) i przy pH naśladującym środowisko endosomalne lub Iizosomalne (pH 5-6).
Stężenie związanej Doks (0,5 mmola · 1-1) było stałe w 0,1 M buforze octanowym (CH3COONa/CH3COOH; 0,05 M NaCl) w eksperymentach. Próbki inkubowano w temperaturze 37°C w ciemności i w określonych odstępach czasu pobierano z nich 0,1 ml porcje i analizowano metodą HPLC po ekstrakcji Doks z roztworu. Wyniki pokazują, że struktura połączenia między lekiem a nośnikiem polimerowym wpływa na szybkość uwalniania leku z nośnika; szybkość uwalniania jest stosunkowo niska przy pH krwi i ponad 10-krotnie większa przy pH naśladującym środowisko komórkowe. Biorąc pod uwagę fakt, że okres pozostawania leku w naczyniach krwionośnych jest stosunkowo krótki, eksperyment potwierdza względną stabilność polimerowego koniugatu w czasie transportu i zdolność do uwalniania czynnego leku po jego wcześniejszej penetracji do komórki.
P r z y k ł a d 7
Aktywność cytotoksyczna in vitro polimerowych koniugatów zawierających hydrolitycznie uwalnianą doksorubicynę w komórkach o prawidłowej zawartości lizosomów (fig. 6)
Zdolność polimerowych koniugatów do zmniejszania podziałów komórek lub proliferacji docelowych komórek nazywana jest działaniem cytotoksycznym lub cytostatycznym. Aktywność cytotok3 syczna wykrywano in vitro jako hamowanie wbudowania 3H-tymidyny do docelowych jąder komórkowych [Rihova i inni, 2000]. Wbudowanie tymidyny i działanie koniugatów są pośrednio proporcjonalne. Mała inkorporacja tymidyny oznacza dużą aktywność cytotoksyczn ą badanych substancji. Komórki wybranych linii nowotworowych (mysiej linii białaczkowej T-Iimfocytarnej EL4, mysiej białaczki B-Iimfocytarnej BCL1, mysiego chłoniaka B-Iimfocytarnego 38C13, ludzkiego pierwotnego raka jelita grubego i odbytnicy SW 480, dającego przerzuty ludzkiego raka jelita grubego SW 620, ludzkiego raka jelita grubego SW620 genetycznie zmodyfikowanego mysim genem dla Thy 1,2 SW620/T) oraz mysie splenocyty pobudzone mitogenem limfocytów T, np. konkanawaliną A i ludzkie limfocyty z krwi obwodowej odpipetowano w ilościach 1 x 104 - 5 x 105 (w zależności od stosowanych układów badanych komórek) w pożywce wzrostowej RPMI 1640 do 96-studzienkowych płytek tkankowych FB (NUNC, Dania). Następnie hodowle prowadzono z dalszą stymulacją lub bez dalszej stymulacji (wszystkie linie nowotworowe i niezmienione mysie i ludzkie limfocyty) lub w obecności mitogenu limfocytów T, konkanawaliny A, gdy badano wpływ na prawidłowe intensywnie proliferujące limfocyty T. Stężenie konkanawaliny A, w obecności której hodowano komórki, wynosiło 1,25 μg/studzienkę. Badane próbki lub wolną doksorubicynę w końcowym stężeniu 0,0016 - 80 μg/ml dodano do każdej studzienki eksperymentalnej płytki tkankowej zawierającej badane komórki w pożywce z koknanawaliną A lub bez niej. Całkowita objętość studzienki wynosiła 250 pl. Każde stężenie badano równolegle w jednej próbce i jednej linii 3-krotnie do 5-krotnie. Płytki do mikromianowania do hodowli tkankowej inkubowano w temperaturze 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2, przez 24 - 72 godzin. Po zaPL 216 518 B1 3 kończeniu hodowli do każdej studzienki dodano 1 μφ H-tymidyny. Po kolejnych 5 lub 6 godzinach (w zależności od badanego układu) komórki zebrano (zbieracz komórek Tomtec) na filtrze z włókien szklanych (Filtermat, Wallac), wysuszono i oceniono wbudowaną radioaktywność (MicroBeta Trilux, Wallac). Wartości IC50 dla nieukierunkowanych koniugatów zawierających hydrolitycznie uwalnianą doksorubicynę wynosiła 0,01 - 1,41 μg doksorubicyny/ml, w zależności od oporności (wrażliwości na leczenie zastosowanej docelowej linii) i rodzaju koniugatu. Potwierdzono, że cytotoksyczność jest wyłączną właściwością koniugatów zawierających hydrolitycznie uwalnianą doksorubicynę, ponieważ koniugat nie zawierający leku jest niecytotoksyczny.
Przeprowadzone in vitro badania udowodniły, że a) aktywność koniugatów z hydrolitycznie uwalnianym lekiem nie zależy od enzymatycznej degradowalności wiązania kowalencyjnego między lekiem a połączeniem oligopeptydowym, oraz że b) koniugaty, w których połączenie między podstawowym łańcuchem polimerowym a lekiem jest utworzone tylko przez kwas ε-aminokapronowy lub kwas p-aminobenzoesowy, są równie skuteczne jak związki zawierające połączenie di- lub tetrapeptydowe.
P r z y k ł a d 8
Aktywność cytotoksyczna in vitro polimerowych koniugatów zawierających hydrolitycznie uwalnianą doksorubicynę w komórkach o niskiej zawartości lizosomów
Przeprowadzono badanie aktywności cytotoksycznej in vitro w taki sam sposób jak opisano w przykładzie 7. Komórki erytroleukemicznej linii komórkowej K 562 o niskiej zawartości lizosomów wybrano jako komórki docelowe. Udowodniono, że koniugaty zawierające hydrolitycznie uwalnianą doksorubicynę są znacząco cytotoksyczne nawet wobec tej linii komórkowej, w której koniugaty z enzymatycznie uwalnianą doksorubicyną są cytotoksyczne w bardzo ograniczonym stopniu (fig. 7). Ten wynik pokazuje, że koniugaty z hydrolitycznie uwalnianą doksorubicyną są skuteczne nawet wobec układów komórek ubogich w lizosomy.
P r z y k ł a d 9
Przeciwnowotworowa aktywność polimerowych koniugatów zawierających hydrolitycznie uwalnianą doksorubicynę in vivo (fig. 8)
Myszom ze szczepu wsobnego C57BL/10 podskórnie przeszczepiono chłoniaka T-Iimfocytarnego (EL4). Komórki nowotworowe wstrzyknięto w dolną połowę grzbietu zwierząt eksperymentalnych 5 w ilości 1 x 105 komórek/myszę. Przeszczepienie komórek określono jako dzień 0. Następnie podano polimerowe koniugaty hydrolitycznie uwalniające doksorubicynę dootrzewnowe, albo w dniu 1, 3, 5, 7 i 9 (schemat ochronny), w dniu 10, 12, 14, 16 i 18 lub w dniu 12, 14, 16, 18 i 20 (schemat terapeutyczny). Dzienne dawki doksorubicyny wynosiły 50 μg/mysz. Koniugaty znacznie hamowały rozrost nowotworu i zwiększały liczbę zwierząt eksperymentalnych, które przeżyły w długotrwałej obserwacji. Podczas gdy polimerowy koniugat wolny od leku nie wywierał żadnego działania, a klasyczna, czyli niemodyfikowana doksorubicyna, wywierała bardzo ograniczone działanie (maksymalny okres przeżycia eksperymentalnych zwierząt wynosił 40 dni, w porównaniu z 35 dniami w grupie kontrolnej), podanie polimerowych koniugatów hydrolitycznie uwalniających doksorubicynę umożliwiło dłuższe przeżycie, czyli dłuższe niż 80 dni u 40% i 20% myszy odpowiednio w schemacie ochronnym i terapeutycznym.
Myszom z wsobnego szczepu Balb/c dootrzewnowo przeszczepiono mysią białaczkę B-Iim5 focytarną BCL1. Komórki nowotworowe wstrzyknięto w ilości 5 x 105 komórek/mysz. Dzień przeszczepienia komórek oznaczono jako dzień 0. Następnie podawano dożylnie polimerowe koniugaty hydrolitycznie uwalniające doksorubicynę w dniu 11, 13 i 17 (schemat terapeutyczny). Dzienna dawka doksorubicyny wynosiła 100 μg/mysz. Badane koniugaty wykazywały znaczącą aktywność przeciwnowotworową. Podczas gdy kontrolne myszy przeżywały nie dłużej, niż 40 dni, 20% myszy leczonych badanymi koniugatami przeżyło dłużej niż 100 dni, a 10% dłużej niż 140 dni.
Bibliografia
R. Duncan, J. B. Lloyd, J. Kopacek, P. Rejmanovά, J. Strohalm, K. Ulbrich, B. Rihovά, V. Chytry: Synthetic Polymeric Drugs. Czechy PV 0095/85, Australia 589587, Kanada 130053, Dania 164485, Europa 0187547, Stany Zjednoczone Ameryki 5037883, Japonia 000137/86.
K. Ulbrich, V. Śubr, J. Strohalm, D. Plocovά, M. Jelinkovά, B. Rihovά, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Synthesis and Physico-chemical Characterisation. J. Controlled Rel. 64, 63-79 (2000).
Vasey P. A., Kaye S. B., Morrison R., Twelves C., Wilson P., Duncan R., Thomson A. H., Murray L. S., Hilditch T. E., Murray T., Burtles S., Fraier D., Frigerio E., Cassidy J.: Phase I clinical and
PL 216 518 B1 pharmacokinetic study of PK1 [N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymer doxorubidin]: first member of a new class of chemotherapeutic agents-drug polymer conjugates, Clinical Cancer Research 5, 83-94 (1999).
Julyan P. J., Seymour L. W., Ferry D. R., Daryani S., Boivin CH. M., Doran J., David M., Anderson D., Christodoulou CH., Young A. M., Hesslewood S., Kerr D. J.: Preliminary clinical study of the distribution of HPMA copolymers bearing doxorubicin and gaIactosamine, J. Control. Rel. 57, 281-290 (1999).
Thomson A. H., Vasey P. A., Murray L. S., Cassidy J., Fraier D., Frigerio E., Twleves C.: Population pharmacokinetics in phase I drug development: a phase I study of PK1 in patients with solid tumors, Br. J. Cancer. 81, 99-107 (1999).
J. Kopacek, P. Kopa6kovά, T. Minko, Z. Lu, HPMA Copolymer-Anticancer Drug Conjugates: Design, Activity, and Mechanism of Action. Europ. J. Pharm. Biopharm. 50, 61-81 (2000).
F. Kratz, U. Beyer, H. T. Schutte, Drug-Polymer Conjugates Containing Acid-Cleavable Bonds. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carriers Systems, 16 (3), 245-288 (1999).
B. Rihovά, T. Etrych, M. Pechar, M. Jelίnkovά, M. w Śt'astny, O. Hovorka, M. Kovάr, K. Ulbrich, Doxorubicin Bound to a HPMA Copolymer Carrier Through Hydrazone Bond is Effective also in a Cancer Cell Line with a Limited Content of Lysosomes. J. Controlled Release 74, 225-232 (2001).
Tomάś Etrych, Marketa Jelίnkovά, Blanka Rihovά, Karel Ulbrich, New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH sensitive linkage. Synthesis, in vitro and in vivo biological properties. J. Controlled Rel. 73, 89-102 (2001).

Claims (1)

1. Polimerowe koniugaty leków przeciwnowotworowych, zawierające polimerowy nośnik złożony z 30 - 3000 monomerowych jednostek połączonych z utworzeniem łańcucha polimerowego, zawierające:
a. 60 - 99% jednostek N-(2-hydroksypropylo)metakryloamidu;
b. 1 - 25% jednostek metakryloilowanych hydrazonów ε-aminokwasów lub aminokwasów aromatycznych zakończonych cząsteczką przeciwnowotworowej antracykliny;
c. 0,5 - 15% jednostek metakryloilowanych ε-aminokwasów lub aminokwasów aromatycznych lub ich soli sodowych, i
d. 0,5 - 10% jednostek metakryloilowanych hydrazydów ε-aminokwasów lub aminokwasów aromatycznych.
PL370719A 2001-12-20 2002-12-20 Polimerowe koniugaty leków przeciwnowotworowych i kompozycja farmaceutyczna PL216518B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20014653A CZ293787B6 (cs) 2001-12-20 2001-12-20 pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL370719A1 PL370719A1 (pl) 2005-05-30
PL216518B1 true PL216518B1 (pl) 2014-04-30

Family

ID=5473644

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL370719A PL216518B1 (pl) 2001-12-20 2002-12-20 Polimerowe koniugaty leków przeciwnowotworowych i kompozycja farmaceutyczna

Country Status (18)

Country Link
US (1) US7919076B2 (pl)
EP (2) EP1782833A3 (pl)
JP (1) JP4718117B2 (pl)
KR (1) KR20040076874A (pl)
AT (1) ATE439864T1 (pl)
AU (1) AU2002366715A1 (pl)
CA (1) CA2470976A1 (pl)
CZ (1) CZ293787B6 (pl)
DE (1) DE60233434D1 (pl)
DK (1) DK1463529T5 (pl)
EA (1) EA007353B1 (pl)
ES (1) ES2331303T3 (pl)
HU (1) HUP0500541A3 (pl)
PL (1) PL216518B1 (pl)
PT (1) PT1463529E (pl)
SI (1) SI1463529T1 (pl)
SK (1) SK2912004A3 (pl)
WO (1) WO2003053473A2 (pl)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ294996B6 (cs) * 2003-07-16 2005-04-13 Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr Reaktivní polymery a kopolymery na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, způsob jejich přípravy a jejich použití pro syntézu polymerních léčiv, pro modifikaci biologicky aktivních proteinů a přípravu systémů pro dopravu genů
WO2006020719A2 (en) 2004-08-11 2006-02-23 Arqule, Inc. Aminoacid conjugates of beta - lapachone for tumor targeting
US8614228B2 (en) 2004-08-11 2013-12-24 Arqule, Inc. Quinone prodrug compositions and methods of use
CZ297827B6 (cs) * 2005-09-05 2007-04-04 Zentiva, A. S. Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva
CZ2006207A3 (cs) * 2006-03-28 2008-01-16 Zentiva, A. S. Micelární nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou
US9340651B2 (en) * 2006-08-09 2016-05-17 Sumitomo Bakelite Company Limited Sugar chain-capturing substance and use thereof
CZ2006505A3 (cs) * 2006-08-09 2008-04-09 Zentiva, A. S. Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy
CZ2006592A3 (cs) * 2006-09-18 2008-03-19 Zentiva, A. S. Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby
BRPI0810717A2 (pt) 2007-04-30 2016-05-24 Arqule Inc sulfonato hidroxi de composto de quinona e seus usos
CZ301288B6 (cs) * 2008-10-23 2009-12-30 Zentiva, A. S Polymerní prípravek se synergickým úcinkem pri lécbe nádorových onemocnení
CZ302830B6 (cs) * 2009-12-15 2011-11-30 Ústav makromolekulární chemie AV CR, v.v.i. Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru
EP3069715A1 (en) 2015-03-20 2016-09-21 Salmon Pharma GmbH Immediate release dosage forms of Atomoxetine
US11801307B2 (en) 2016-10-14 2023-10-31 University Of Utah Research Foundation Antibody-polymer-drug conjugates
JP2022529183A (ja) * 2019-04-17 2022-06-17 アヴィディア テクノロジーズ， インコーポレイテッド リガンド提示および／または薬物送達のためのスターポリマーを製造する組成物および方法
CZ309828B6 (cs) * 2019-10-09 2023-11-15 I.T.A.-Intertact S.R.O. Fluorescenční polymer, fluorescenční sonda a konjugační sada pro pokročilé funkční analýzy buněk v hematologii, imunologii a mikrobiologii, způsob jejich přípravy a jejich použití
EP4051320A1 (en) 2019-10-30 2022-09-07 CIS Pharma AG Biocompatible polymeric drug carriers for delivering active agents

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8500209D0 (en) * 1985-01-04 1985-02-13 Ceskoslovenska Akademie Ved Synthetic polymeric drugs

Also Published As

Publication number Publication date
EP1463529B9 (en) 2011-03-23
EP1463529A2 (en) 2004-10-06
CA2470976A1 (en) 2003-07-03
JP2005519044A (ja) 2005-06-30
SK2912004A3 (en) 2004-12-01
JP4718117B2 (ja) 2011-07-06
EP1782833A3 (en) 2008-03-19
DK1463529T3 (da) 2009-10-19
HUP0500541A3 (en) 2011-08-29
ES2331303T9 (es) 2011-08-18
CZ293787B6 (cs) 2004-07-14
KR20040076874A (ko) 2004-09-03
PT1463529E (pt) 2009-11-03
EA007353B1 (ru) 2006-10-27
EP1782833A2 (en) 2007-05-09
DK1463529T5 (da) 2011-06-27
WO2003053473A2 (en) 2003-07-03
SI1463529T1 (sl) 2010-01-29
ATE439864T1 (de) 2009-09-15
US7919076B2 (en) 2011-04-05
DE60233434D1 (de) 2009-10-01
AU2002366715A8 (en) 2003-07-09
PL370719A1 (pl) 2005-05-30
EP1463529B1 (en) 2009-08-19
ES2331303T3 (es) 2009-12-29
HUP0500541A2 (hu) 2005-09-28
WO2003053473A3 (en) 2004-04-29
US20060057099A1 (en) 2006-03-16
AU2002366715A1 (en) 2003-07-09
CZ20014653A3 (cs) 2003-08-13
EA200400802A1 (ru) 2005-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ulbrich et al. Antibody-targeted polymer–doxorubicin conjugates with pH-controlled activation
Ulbrich et al. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity
Etrych et al. New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH-sensitive linkage: synthesis and preliminary in vitro and in vivo biological properties
Etrych et al. Conjugates of doxorubicin with graft HPMA copolymers for passive tumor targeting
Etrych et al. Biodegradable star HPMA polymer conjugates of doxorubicin for passive tumor targeting
EP1463529B9 (en) Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy
Etrych et al. Star-shaped immunoglobulin-containing HPMA-based conjugates with doxorubicin for cancer therapy
US20110014151A1 (en) Macromolecule conjugate
US8603990B2 (en) Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation
AU4094300A (en) Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers
Sirova et al. Preclinical evaluation of linear HPMA-doxorubicin conjugates with pH-sensitive drug release: efficacy, safety, and immunomodulating activity in murine model
Etrych et al. HPMA copolymer conjugates with reduced anti-CD20 antibody for cell-specific drug targeting. I. Synthesis and in vitro evaluation of binding efficacy and cytostatic activity
Duncan N-(2-Hydroxypropyl) methacrylamide copolymer conjugates
CZ2009844A3 (cs) Dendritické vysokomolekulární polymerní nosice léciv a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru
CZ303072B6 (cs) Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika
Pechar et al. Poly (ethylene glycol)-doxorubicin conjugates with pH-controlled activation
CZ20031950A3 (cs) Reaktivní polymery a kopolymery na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, způsob jejich přípravy a jejich použití pro syntézu polymerních léčiv, pro modifikaci biologicky aktivních proteinů a přípravu systémů pro dopravu genů
Chytil et al. Structural design and synthesis of polymer prodrugs
CZ2003605A3 (en) pH sensitive polymeric conjugates of anthracycline cancerostatic for targeted therapy
Hoes et al. Design of soluble conjugates of biodegradable polymeric carriers and adriamycin
Etrych et al. Micellar and Antibody‐Targeted Polymer Therapeutics
SK9785A3 (en) Polymeric remedy and preparation method thereof
Rihova et al. HPMA-Anticancer Drug Conjugates
DUNCAN Centre for Polymer Therapeutics, Welsh School of Pharmacy, Cardiff University, Cardiff, UK
AU2004201277A1 (en) Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20131220