ES2332008T3

ES2332008T3 - Medios cromatograficos.

Info

Publication number: ES2332008T3
Application number: ES05854430T
Authority: ES
Inventors: Nandu Deorkar; Robert C. Buss; Joseph M. Mladosich; Paul A. Bouis
Original assignee: Mallinckrodt Baker Inc
Current assignee: Avantor Performance Materials LLC
Priority date: 2005-01-25
Filing date: 2005-12-16
Publication date: 2010-01-22
Anticipated expiration: 2025-12-16
Also published as: PT1841527E; TW200637876A; CA2595735A1; JP2008528966A; AU2005325711B2; KR101279305B1; CN101146609B; EP1841527A2; TWI398453B; US20140194543A1; MX2007008832A; KR20070102685A; EP1841527B1; WO2006081002A2; US20080203029A1; CA2595735C; IL184761A; DK1841527T3; BRPI0519950B1; NZ556639A

Abstract

Medios cromatográficos que comprenden partículas de resinas polímeras derivadas con polietilenimina en la superficie del polímero y funcionalizadas mediante la reacción de un reactivo de funcionalización con grupos aminos terminales de la polietilenimina en la superficie de la resina polímera, en los que el reactivo de funcionalización se selecciona entre el grupo que consiste en: anhídridos de ácidos, agentes de sulfonación, cloruros de alquilo, anhídridos alquílicos y cloruros de alquilo que contienen una funcionalidad de amonio cuaternario y sus mezclas.

Description

Medios cromatográficos.

Campo de la invención

La invención se refiere a la preparación y el uso de nuevos medios cromatográficos, preferentemente medios cromatográficos polímeros de modo mixto para la separación y purificación de diversas biomoléculas como péptidos, proteínas y antibióticos. Más particularmente, la presente invención describe nuevos medios cromatográficos preferentemente intercambiadores aniónicos mixtos, intercambiadores de aniones-cationes mixtos e intercambiadores hidrófobos. Los medios cromatográficos se preparan mediante la modificación de polímeros con polietilenimina y su funcionalización. Se ha descubierto inesperadamente que estos medios polímeros de modo mixto ofrecen una capacidad de separación y capacidad de unión a proteínas mejoradas.

Antecedentes de la invención

El análisis de mezclas de proteínas mediante medios de cromatografía de intercambio iónico está bien documentado, como por medio de Pete Gagnon, "Purification Tools for Monoclonal Antibodies", Validated Biosystems, Inc., (1996). Más recientemente, el desarrollo de fármacos basados en proteínas y vacunas ha aumentado la necesidad de una purificación a mayor escala de las mezclas de proteínas. Es altamente deseable que los medios cromatográficos de intercambio iónico puedan ser utilizados en este campo.

Una forma de preparar estos materiales de medios cromatográficos, particularmente intercambiadores aniónicos que contienen una funcionalidad de amina primaria y secundaria, es mediante el revestimiento interno de materiales de sílice porosa con polietilenimina (PEI). Por ejemplo, el revestimiento de la superficie interna de partículas de sílice con polietilenimina seguido de inmovilización a través de una reticulación ha sido descrito por Alpert and Regnier, J. Chromatogr. 185, 375-392 (1979) y el uso de materiales preparados de esta forma para la separación cromatográfica de oligonucleótidos sintéticos ha sido descrito por Lawson et al., Anal. Biochem. 133, 85-93 (1983).

Análogamente, la preparación de partículas de sílice porosa revestidas con PEI o partículas de vidrio poroso controladas obtenidas mediante el enlace covalente de polietileniminopropil-trimetoxi-silano ha sido descrita en el documento US 4.540.486 de JT Baker Chemical Co. La misma patente describe la formación de resinas cromatográficas que tienen una funcionalidad mixta de base débil/ácido débil mediante la reacción de sílice revestida con PEI con anhídridos carboxílicos cíclicos. Se ha mostrado que estos materiales, cuanto son usados en una columna cromatográfica, pueden separar mezclas de citocromo C, glicoproteína ácida alfa-1, ovalbúmina y beta-lactoglobulina (medios de bases débiles) o ovalbúmina, citocromo C, hemoglobina y lisozima (medios mixtos de base débil/ácido débil). La eficacia de la sílice porosa derivada con PEI, o su versión carboxilada en la purificación de inmunoglobulina G ha sido demostrada también el documento US 4.606.825 de la empresa JT Baker Chemical Co.

La forma acilada de la sílice revestida con PEI anteriormente descrita puede ser adicionalmente convertida en unos medios de funcionalidad mixta de ácido débil/ácido fuerte mediante la introducción de grupos sulfónicos, como se describe en el documento US 4.721.573 de la empresa JT Baker Chemical Co. Una columna rellena de estos medios sulfonados permite la separación de una mezcla de citocromo C, hemoglobina lisozima y ovalbúmina, así como la separación de los componentes proteicos de un medio de cultivo de hibridomas.

Las partículas de sílice a las que se ha enlazado covalentemente PEI pueden ser convertidas también en medios cromatográficos hidrófobos mediante reacción con cloruros de monoacilo o anhídridos carboxílicos lineales en los que el grupo acilo puede ser una cadena hidrocarbonada lineal, un grupo fenilo o un grupo fenilo sustituido. Unos medios cromatográficos de fase de base débil/inversa basados en sílice preparados de esta forma, usando cloruro de butirilo, separa citocromo C, mioglobina, lisozima ovalbúmina y alfa-quimotripsínogeno, como se describe en el documento US 4.551.245 de JT Baker Chemical Co.

Han sido descritos gránulos de agarosa que portan grupos de intercambio iónico al final de un brazo de poli(alcohol vinílico) (PVA) en el documento WO 98/58732 de Amersham. Sin embargo, al contrario que la presente invención, los brazos separadores de PVA no contribuyen a ninguna capacidad de intercambio iónico en el producto ni proporcionan por sí mismas ninguna de las funcionalidades en un producto de modo mixto.

Una de las principales desventajas de los rellenos cromatográficos basados en sílice es su falta de estabilidad a un pH elevado. Esto es particularmente cierto para aplicaciones que incluyen la purificación de fármacos, ya que el tratamiento de la instalación con hidróxido de sodio 1 N es una práctica de esterilización común.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona medios cromatográficos que son capaces de minimizar o evitar esta falta de estabilidad a pH elevado. Los medios cromatográficos de la invención se exponen en la reivindicación 1. La invención proporciona también medios cromatográficos de modo mixto. Se ha descubierto que una forma posible de evitar este problema de inestabilidad es usar rellenos cromatográficos basados en un soporte polímero derivado sobre la superficie del polímero (es decir, no reticulado) con PEI, y estos medio derivados en la superficie según la invención, pueden ser adicionalmente funcionalizados mediante la reacción de un reactivo de funcionalización con los grupos aminos terminales de la polietilenimina en la superficie de la resina polímera, como se expone en la reivindicación 1. De acuerdo con esta invención, se pueden proporcionar preferentemente medios de modo mixto como, por ejemplo, medios con sitios de intercambio de aminas mixtas primarias, secundarias y terciarias, medios con sitios de intercambio de aniones débiles y cationes débiles, medios con sitios de intercambio de cationes débiles y cationes fuertes, medios con sitios de intercambio de aniones débiles e hidrófobos (fase inversa) y medios con anión débil y anión fuerte. Además de ello, se descubrió inesperadamente que estos derivados polímeros mediante derivación con polietilenimina y funcionalizados y los medios cromatográficos basados en los mismos proporcionan características de separación diferentes y únicas. En un aspecto de la presente invención, se proporcionan medios cromatográficos polímeros para bioseparaciones. Esta invención difiere de los medios cromatográficos polímeros actuales en el método de preparación y las características de los medios, ya que estos medios cromatográficos actuales son intercambiadores iónicos simples. También, los medios de la presente invención difieren de los medios actuales basados en sílice en términos del método de preparación, composición, uso y rendimiento. Sorprendentemente, los medios polímeros de modo mixto preparados según esta invención tienen capacidades mejoradas de separación y enlace.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se ilustra, pero sin limitación, por medio de los dibujos que se acompañan, en los cuales:

La Figura 1 (ilustrativa) es un gráfico del perfil de elusión, registrado mediante un detector UV, de la separación de proteínas usando medios preparados según el ejemplo preparativo 1 y medios de sílice y PEI según el procedimiento del ejemplo 34;

La figura 2 es un gráfico del perfil de elusión, registrado mediante un detector UV de la separación de proteínas usando medios preparados según el ejemplo 9 y medios de sílice de modo mixto según el procedimiento del ejemplo 35;

Las figuras 3a y 3b son gráficos del perfil de elución, registrado mediante un detector UV, de la separación de proteínas usando medios preparados según el ejemplo 19 y medios de sílice según el procedimiento del ejemplo 37;

La Figura 4 es un gráfico del perfil de elución, registrado mediante un detector UV, de la separación de proteínas usando medios preparados según el ejemplo 20 según el procedimiento del ejemplo 38;

La Figura 5 es un gráfico del perfil de elución, registrado mediante un detector UV, de la separación de productos usando medios preparados según el ejemplo 22 y según el procedimiento del ejemplo 39;

La Figura 6 es un gráfico del perfil de elución, registrado mediante un detector UV, de la separación de proteínas usando medios preparados según el ejemplo 23 y según el procedimiento del ejemplo 40;

La Figura 7 es un gráfico de la estabilidad ácida de medios preparados según el ejemplo 7, determinados según el procedimiento del ejemplo 41; y

La Figura 8 es un gráfico de la estabilidad básica de medios preparados según el ejemplo 7, determinados según el procedimiento del ejemplo 42.

Descripción detallada de la invención

Esta invención se refiere a medios cromatográficos y la preparación y uso de nuevos medios cromatográficos polímero y, preferentemente, medios cromatográficos polímeros de modo mixto. De acuerdo con la presente invención, los medios polímeros se preparan usando partículas polímeras derivadas con polietilenimina y funcionalizadas con reactantes apropiados, como se expone en la reivindicación 1.

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Los materiales polímeros usados para la separación cromatográfica de proteínas tendrán preferentemente ciertas propiedades, como

1) los tamaños de poros son suficientemente grandes para permitir una difusión rápida de moléculas grandes como proteínas dentro y fuera de las partículas de resina;

2) las interacciones entre las proteínas y el polímero no funcionalizado deben ser débiles para evitar "interacciones no específicas" y permitir la recuperación de la proteína deseada con rendimientos elevados;

3) las partículas de resina deben ser rígidas para evitar la compresión y pérdida de caudal bajo la presión encontrada en las operaciones cromatográficas; y

4) la resina debe ser químicamente estable bajo todas las condiciones encontradas en el procedimiento de separación.

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Las partículas de resina polímera que van a ser derivadas en la superficie con polietilenimina pueden ser cualesquiera partículas de resina polímera adecuada capaces de ser derivadas con polietilenimina y que, cuando sean funcionalizadas como se expone en la reivindicación 1, sean útiles como medios de separación cromatográfica. Ejemplos de partícula de resina polímera adecuada para una derivación con polietilenimina de acuerdo con esta invención incluyen, pero sin limitación, celulosa, agarosa, poliestirenos epoxidizados o halogenados, poliacrilatos o polimetacrilatos epoxidizados o halogenados y polidivinilbencenos epoxidizados o halogenados. Por ejemplo, los poli(met)acrilatos porosos, resinas altamente reticuladas basadas en monómeros (met)acrílicos que portan múltiples enlaces doble polimerizables, como dimetacrilato de etilenglicol (documento US 4.118.347 de Showa Denko), trimetacrilato de pentaeritritol (documento US 4.256.842 de Toyo Soda), trimetacrilato de trimetilol-propano (documento US 4.582.860 de Rohm and Haas) o dimetacrilato de glicerol (documento US 2.254.634 de Mitsubishl) preparados en presencia de un agente formador de poros, han mostrado que proporcionan materiales con las propiedades deseadas. Además de ello, la adición de monómeros funcionales a la mezcla de polimerización suministra un producto final con grupos funcionales a los que se pueden unir otras moléculas a través de la formación de enlaces covalentes. Ejemplos de estos monómeros son metacrilato de glicerol (grupos -OH) (documento US 2.254.634 de Mitsubishi, 1993), metacrilato de dimetilaminoetilo (aminas terciarias) o metacrilato de glicidilo (documento US 4.118.347 de Showa Denko, US 4,256,842 de Toyo Soda y documento US 4,582,860 de Rohm and Haas). Los reactivos de funcionalización para la reacción con las partículas de resina polímera derivada en la superficie con PEI son anhídridos como anhídridos carboxílicos cíclicos como anhídridos glutárico y succínico, anhídridos carboxílicos insaturados como anhídrido maleico, agentes de sulfonación como disulfitos, como meta-bisulfito de sodio, cloruros o anhídridos de alquilo como cloruro de butilo y anhídrido acético o butírico y cloruros de alquilo que contienen una funcionalidad de amonio cuaternario como cloruro de (3-cloro-2-hidroxipropil)-trimetilamonio y mezcla de estos reactivos de funcionalización.

En una realización de esta invención, se prepara un intercambiador aniónico con sitios de aminas primarias, secundarias y terciarias, haciendo reaccionar polietilenimina con un soporte polímero que porta grupo epoxi o halo como grupos cloro, bromo o yodo. Este soporte polímero puede ser cualquier resina de polímero sintético o polímero natural adecuado como poli(met)acrilato, celulosa, poliestireno-divinilbenceno y agarosa. Ejemplos de estas resinas disponibles en el comercio son Tosoh Biosciences Toyopearl AF-epoxy 850M, Sepharose 6B activada con epoxi. Estos materiales se pueden hacer reaccionar con uno de los grupos aminos terminales de la polietilenimina de diversos pesos moleculares a través de la formación de grupos alfa-hidroxi-amino químicamente estables. Algunas propiedades de los materiales preparados de esa manera, según los siguientes ejemplos preparativos 1 a 5, se resumen en la Tabla 1.

En una segunda realización, se preparan medios de modo mixto con sitios de intercambio de aniones débiles y cationes débiles haciendo reaccionar gránulos polímeros funcionalizados con PEI con anhídridos de ácidos carboxílicos cíclicos, como anhídrido glutárico o succínico en los siguientes ejemplos 6 a 10.

En una tercera realización, se prepararon medios de modo mixto que tenían sitios de aniones débiles, cationes débiles y cationes fuertes haciendo reaccionar el polímero derivado con PEI con un anhídrido de ácido carboxílico insaturado seguido de una sulfonación, como se describe en los ejemplos 11 a 3.

En una cuarta realización, se prepararon medios de modo mixto que tenían sitios de aniones débiles e hidrófobos (fase inversa) haciendo reaccionar el polímero derivado con PEI con un cloruro de alquilo (ejemplos 14 a 18) o anhídridos de ácidos monobásicos (Ejemplos 19 a 24). Las reacciones con cloruro de butilo se realizaron durante 2 h a temperatura ambiente usando tolueno o dioxano como disolvente. Se usó trietilamina para depurar el ácido clorhídrico producido como subproducto de la reacción.

En una quinta realización, se obtienen medios de modo mixto mediante la reacción de resina revestida con PEI con anhídrido butírico realizada en 1-metoxi-2-propanol durante 3 h a 60ºC, como se expone en los siguientes ejemplos 20-22.

Se pueden preparar resinas de modo mixto de base débil/fase inversa en las que el resto hidrófobo es un grupo metilo o una combinación de grupos metilo y butilo usando anhídrido acético o la adición secuencial de anhídrido butírico y acético, como se muestra en el Ejemplo 24 (anhídrido acético) o en los ejemplos 20 y 23 (anhídridos mixtos), respectivamente. De este modo, es posible variar y seleccionar la hidrofobicidad apropiada usando uno o una combinación de reactivos.

En una sexta realización, se prepararon medios de modo mixto que tenían sitios de aniones débiles aniones fuertes (amonio cuaternario) haciendo reaccionar el polímero derivado con PEI con cloruros de alquilo que contenían una funcionalidad de amonio cuaternario terminal. Más particularmente, el polímero derivado con PEI se hace reaccionar con cloruro de 3-cloro-2-hidroxipropil)trimetilamonio en hidróxido de sodio acuoso a 71-80ºC, como se muestra en los siguientes ejemplos 25 a 30.

De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto inesperadamente que estos medios cromatográficos polímeros de modo mixto ofrecen una capacidad de separación mejorada así como una capacidad y estabilidad elevadas. Por ejemplo, el medio de intercambio aniónico polímero de modo mixto puede separar lisozima, inmunoglobulina G, albúmina de suero bovino, beta-lactoglobulina A y beta-lactoglobulina B mientras que los medios basados en PEI-sílice no pueden separar todas estas proteínas, como se muestra en la figura 1. Los medios de intercambio catiónico de modo mixto pueden separar BSA, IgG, citocromo C y lisozima de forma eficaz, como se muestra en la figura 2, mientras que los medios de sílice de modo mixto no pueden separar todas estas proteínas.

Ejemplos Ejemplo 1

(Preparativo)

Se colocan 12 g de polímero de metacrilato que porta grupos epoxi con un tamaño medio de partículas de 35 micrómetros de diámetro y 250 ml de dioxano en un matraz de fondo redondo de 1 l equipado con un embudo, agitador, condensador de reflujo y entrada para nitrógeno a presión positiva durante 30 minutos, para permitir que la resina se hinche. Se añaden 20 g de polietilenimina (PEI) peso molecular medio de 600 daltones) y el embudo de aclara con 150 ml adicionales de dioxano. La mezcla agitada se lleva a reflujo durante una noche. Después de dejar la mezcla enfriar, la mezcla se transfiere a un matraz de filtración, se escurre, se lava una vez con dioxano, tres veces con metanol y se seca bajo vacío a 60ºC. Análisis elemental: 57,8% C, 7,4% H y 5,6% N.

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Ejemplo 2

(Preparativo)

Se colocan 5 g de polímero de metacrilato que porta grupos epoxi y 150 ml de dioxano en un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con un agitador y condensador a reflujo. Se añaden 30 g de PEI (peso molecular medio 1200 daltones) y la mezcla se lleva a reflujo durante una noche. Después de dejar enfriar, la mezcla se transfiere a un matraz de filtración, se escurre, se lava dos veces con dioxano, tres veces con metanol y se seca. Análisis elemental: 55,7% C, 7,8% H, 5,5% N.

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Ejemplo 3

(Preparativo)

Se colocan 5 g de polímero de metacrilato que porta grupos epoxi y 150 ml de una mezcla 50/50 de dioxano y agua en un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con un agitador y reflujo. Se añaden 30 g de PEI (peso molecular medio 1200 daltones) y la mezcla se lleva a reflujo durante una noche (89ºC). Después de dejar enfriar, la mezcla se transfiere a un matraz de filtración, se escurre, se lava dos veces con dioxano, tres veces con metanol y se seca. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 57,5% C, 7,4% H, 2,5% N.

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Ejemplo 4

(Preparativo)

Se colocan 5 g de polímero de metacrilato que porta grupos epoxi y 100 ml de una solución al 30% p de PEI de peso molecular medio de 10.000 daltones en un matraz de fondo redondo de 250 ml equipado con un agitador, entrada para nitrógeno y condensador a reflujo y la mezcla agitada se lleva a reflujo durante una noche. Después de dejar enfriar, la mezcla se transfiere a un matraz de filtración, se escurre, se lava tres veces con agua a 60ºC, tres veces con metanol y se seca durante una noche en una estufa a vacío a 60ºC. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 56,5% C, 7,8% H, 6,4% N.

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Ejemplo 5

(Preparativo)

Se colocan 5 g de resina metacrílica que porta grupos epoxi y 100 ml de una solución al 30% p de PEI de peso molecular medio de 10.00 daltones en agua en un matraz de fondo redondo de 250 ml equipado con un agitador y condensador a reflujo y la mezcla agitada se lleva a reflujo durante 17 ½ h. Después de dejar enfriar, la mezcla se transfiere a un matraz de filtración, se escurre, se lava tres veces con agua, tres veces con metanol y se seca durante una noche en una estufa a vacío a 60ªC. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 56,9%C, 7,5%H, 3,2%N. Como indican los resultados de la Tabla 1, la presencia de agua en el sistema tiene un efecto perjudicial sobre la incorporación de nitrógeno, mientras se obtienen contenidos similares de nitrógeno cuando se hace reaccionar PEI de peso molecular diverso con la resina en dioxano seco (aunque a una relación de PEI a polímero inferior a la del ejemplo 1).

TABLA 1 Efecto del disolvente y peso molecular de PEI sobre la incorporación de nitrógeno

1

Como indica finalmente los resultados en la Tabla 1, las reacciones realizadas en dioxano puro, al contrario que las de una mezcla de dioxano/agua o agua pura, proporcionan un mayor grado de funcionalización, como lo indica el contenido de nitrógeno del producto final. Cuando se usa dioxano puro como disolvente (primera fila de la Tabla 1), no parece que haya un nivel significativamente mayor de introducción de nitrógeno cuando el peso molecular de PEI es aumentado de 600 a 10.000 daltones.

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Ejemplo 6

SE lavan 30 g de polímero de PEI preparado como en el ejemplo 1 con dos veces su volumen de etanol al 100% y dos veces su volumen de 1-metoxi-2-propanol para separar cualquier humedad residual. El polímero se pone seguidamente en suspensión en 450 ml de 1-metoxi-2-propanol, se transfiere a un matraz equipado con un agitador elevado, condensador a reflujo y entrada para nitrógeno a presión positiva y se calienta a 60ºC. Después de añadir una solución de 19,43 g de anhídrido glutárico al 95% (1 eq, basado en el contenido de nitrógeno de la resina de PEI), la temperatura se mantiene a 60 \pm 2ºC durante 2 ½ h. La mezcla de reacción se transfiere seguidamente a un matraz de filtración, se escurre y el sólido residual se lava una vez con 100 ml de 1-metoxi-2-propanol, dos veces con 100 ml de metanol y dos veces con 100 ml de solución de almacenamiento (etanol: agua 20:80 v/v o acetato de sodio 100 mM, pH 4,5, con alcohol bencílico al 2%). El producto se almacenó en la respectiva solución de almacenamiento para la caracterización y separación cromatográfica de proteínas. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: %C= 55,1, %N= 4,6.

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Ejemplo 7

Se calientan 73,7 g de polímero revestido preparado como en el ejemplo 1, 225 ml de 1-metoxi-2-propanol y 14,4 g de anhídrido succínico a 60 \pm 2ºC y se mantiene a esa temperatura durante 2 ½ h. La mezcla de reacción se transfiere seguidamente a un matraz de filtración, se escurre y el sólido residual se lava una vez con 100 ml de 1-metoxi-2-propanol, dos veces con 100 ml de metanol y 2 veces con 100 ml de solución tamponante de almacenamiento como se describe en el ejemplo 5. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 53,08% C, 7,13% H y 4,86% N.

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Ejemplo 8

La reacción se realizó como en el ejemplo 7 con la excepción de que el contenido de anhídrido succínico es de 17,34 g. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 53,18% C, 7,97% H y 5,18% N.

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Ejemplo 9

Se lavan 11 g de polímero revestido con PEI preparado como en el Ejemplo 1 con dos veces su volumen de etanol al 100% y dos veces su volumen de dioxano para separar cualquier humedad residual. La resina se pone seguidamente en suspensión en aproximadamente 200 ml de dioxano, se transfiere a un matraz de tres bocas equipado con tubo de entrada para nitrógeno y calentado a 50-60ºC. Después de una hora se añaden 7 g de anhídrido glutárico y la temperatura se mantiene a 60 \pm 2ºC durante 2 ½ h. La mezcla de reacción se transfiere seguidamente a un matraz de filtración, se seca y el sólido residual se lava tres veces con dioxano, tres veces con metanol y se seca bajo vacío. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 56,64% C, 7,54% H y 4,36% N.

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Ejemplo 10

La reacción se realizó como en el ejemplo 9 con la excepción de que se usaron 10 g de polímero de PEI preparado según el ejemplo 1 y 6,6 g de anhídrido succínico. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 54,46% C, 7,96% H y 4,6% N.

TABLA 2 Preparación de medios con sitios de intercambio de aniones débiles y cationes débiles

2

: 1-M-2-P= 1-metoxi-2-propanol

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Ejemplo 11

Se colocan 86,5 g de polímero de PEI preparado según el ejemplo 1 y 865 ml de metoxi-2-propanol en un matraz de fondo redondo de 2 litros equipado con un agitador y condensador a reflujo y se agitan durante 30 minutos.

Se añaden 23,7 g de anhídrido maleico y la mezcla se agita durante 2,5 h a 60ºC. Después de dejar la mezcla enfriar, la mezcla se transfiere a un matraz de filtración, se escurre y se lava una vez con metoxi-2-propanol, tres veces con agua y tres veces con metanol. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: %C= 55,6, %N= 4,9, %H= 7,1, %S= 0.

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Ejemplo 12

Se calientan 86,5 g de una resina maleada como en el ejemplo 11 en 900 ml de hidróxido de sodio 0,01 N en presencia de 190 g de meta-bisulfito de sodio durante 6 h a 80 \pm 2ºC. Después de dejar la mezcla de reacción enfriar, la mezcla se transfiere a un matraz de filtración, se escurre, se lava una vez con metoxi-2-propanol, tres veces con agua, tres veces con metanol y se almacena en tampón de almacenamiento para un uso adicional. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: %C= 49,8, %N= 4,6, %H = 6,8, %S= 2,1.

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Ejemplo 13

La reacción se realizó como en el ejemplo 12 con la excepción de que la reacción se llevó a cabo durante 20 h a 80 \pm 2ºC. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: %C = 50,2, %N = 4,5, %H = 6,8, %S = 2,1.

Una comparación del contenido de azufre de las muestras obtenida después de 8 h de reacción (3,8%S, ejemplo 12) y 20 h de reacción (3,40 S, ejemplo 13) indica que la reacción está completada después de 8 h.

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Ejemplo 14

Se prepararon 30 g funcionalizados con PEI según el ejemplo 1 y se lavan dos veces con 120 ml de etanol al 100% y dos veces con 120 ml de tolueno para separar la humedad residual. Seguidamente el material se pone en suspensión en 300 ml de tolueno, se añadieron 9,29 g de cloruro de butirilo (1 eq, basado en el contenido de nitrógeno de la resina) y 9,24 g de trietilamina y la reacción se dejó continuar durante 2 h a 25 +/-2ºC. La resina se transfirió seguidamente a un matraz de filtración y se lavó con 300 ml de tolueno, 300 ml de metanol, dos veces con 300 ml de agua DI (desionizada), tres veces con 300 ml de metanol y dos veces con 300 ml de tampón de almacenamiento a pH 5 (acetato de sodio 10 mm pH 4,5). Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 53,7% C, 7,5% H y 5,6% N.

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Ejemplo 15

La reacción se realizó como en el ejemplo 14 con la excepción de que el disolvente es de 450 ml de dioxano. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 54,7% C, 8,0% H y 5,5% N.

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Ejemplo 16

La reacción se realizó como en el ejemplo 14, con la excepción de que se utilizaron 13,3 g de cloruro de butirilo y 13,2 g de trietilamina. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 53,6% C, 7,9% H y 4,5% N.

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Ejemplo 17

La reacción se realizó como en el ejemplo 14, con la excepción de que se usaron 19 g de cloruro de butirilo y 18 g de trietilamina. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 55,4% C, 7,8% H y 4,2% N.

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Ejemplo 18

La reacción se realizó como en el ejemplo 14, con la excepción de que se usaron 25,3 g de cloruro de butirilo y 24 g de trietilamina. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 55,0% C, 7,9% H y 4,5% N.

Algunos de los resultados obtenidos usando tolueno como disolvente se resumen en la Tabla 3.

TABLA 3 Reacción de resina revestida con PEI con cloruro de butirilo en tolueno (2 h a TA (temperatura ambiente))

3

Como indican los resultados de la Tabla 3, las cantidades crecientes de reactivo dan lugar a un nivel aumentado de funcionalización (indicado por la correspondiente disminución del contenido de nitrógeno del producto).

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Ejemplo 19

60 g de polímero funcionalizado preparado como en el Ejemplo 1 e hinchado en 200 ml de 1-metoxi-2-propanol, 600 ml de 1-metoxi-2-propanol, 56,3 g de anhídrido butírico (exceso en moles de 1,5) y 36 g de trietilamina se hacen reaccionar durante 3 h a 60+/-2ºC. La mezcla de reacción se transfiere a un matraz de filtración, se escurre, se lava una vez con 500 ml de 1-metoxi-2-propanol, una vez con 500 ml de metanol, dos veces con 500 ml de agua DI y dos veces con 500 ml de tampón de almacenamiento. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 54,6% C, 7,9% H y 4,8% N.

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Ejemplo 20

Se hacen reaccionar 60 g de polímero funcionalizado con PEI preparado como en el Ejemplo 1 e hinchado en 200 ml de 1-metoxi-2-propanol, 600 ml de 1-metoxi-2-propanol, 6,2 g de anhídrido butírico y 4,0 g de trietilamina durante 3 h a 60+/-2ºC. En ese momento se añadieron 24,2 g de anhídrido acético y la reacción se dejó continuar a la misma temperatura durante 3 h adicionales. La mezcla de reacción se transfiere a un matraz de filtración, se escurre, se lava una vez con 500 ml de 1-metoxi-2-propanol, una vez con 500 ml de metanol, dos veces con 500 ml de agua DI y dos veces con 500 ml de tampón de almacenamiento. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 53,7% C, 7,7% H y 4,7% N.

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Ejemplo 21

La reacción se realizó como en el ejemplo 19, con la excepción de que se usaron 6,26 g de anhídrido butírico y 4,0 g de trietilamina. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 53,7% C, 7,9% H y 4,8% N.

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Ejemplo 22

La reacción se realizó como en el ejemplo 19, con la excepción de que se usan 1,52 g de de anhídrido butírico y 1,0 g de trietilamina. Un análisis elemental del producto final es de: 54,6% C, 8,3% H y 5,0% N.

Algunos de los resultados se resumen en la Tabla 4.

TABLA 4 Reacción de resina revestida con PEI con anhídrido butírico en 1-metoxi-2-propanol (3 h a 60ºC)

4

Una comparación de los resultados de las Tablas 3 y 4 muestra que se pueden conseguir niveles de sustituciones similares a los obtenidos con cloruro de butirilo con anhídrido butírico, usando cantidades estequiométricas considerablemente inferiores de reactivo.

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Ejemplo 23

La reacción se realizó como en el ejemplo 20, con la excepción de que se usan 1,52 g de de anhídrido butírico y 1,0 g de trietilamina y 10,7 g anhídrido acético. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 55,4% C, 7,9% H y 4,9% N.

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Ejemplo 24

Se hacen reaccionar 60 g de polímero funcionalizado con PEI preparado como en el Ejemplo 1 e hinchado en 20 ml de 1-metoxi-2-propanol, 500 ml de 1-metoxi-2-propanol y 14,07 g de anhídrido acético durante 6 h a 60+/-2ºC. La mezcla de reacción se transfiere a un matraz de filtración, se escurre, se lava una vez con 500 ml de 1-metoxi-2-propanol, dos veces con 500 ml de NaOH 0,1 N, dos veces con agua DI y dos veces con 500 ml de tampón de almacenamiento. Un análisis elemental indica que el producto final contiene: 53,8% C, 7,5% H y 5,3% N.

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Ejemplo 25

Se hacen reaccionar 80 g de polímero funcionalizado con PEI preparado como en el Ejemplo 1 durante 8 h a 80ºC con 59 g de una solución al 60% de cloruro de (3-cloro-2-hidroxipropil)trimetil-aminio en 500 ml de hidróxido de sodio 0,5 N. La mezcla de reacción se transfiere a un matraz de filtración y se lava dos veces con hidróxido de sodio 0,1 N, dos veces con agua DI y una vez con tampón de almacenamiento. Después de lavar y secar, la resina tiene el siguiente análisis elemental: 54,2% C, 8,4% H y 5,9% N.

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Ejemplo 26

La reacción se realizó como en el ejemplo 25, con la excepción de que las solución de hidróxido de sodio era 0,05 N. Después de lavar y secar, la resina tenía el siguiente análisis elemental: 51,9% C, 7,6% H y 5,3% N.

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Ejemplo 27

La reacción se realizó como en el ejemplo 25, con la excepción de que la reacción se continúo durante 16 h. Después de lavar y secar, la resina tiene el siguiente análisis elemental: 53,4% C, 8,4% H y 5,7% N.

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Ejemplo 28

La reacción se realizó como en el ejemplo 26, con la excepción de que la reacción se continúo durante 16 h. Después de lavar y secar, la resina tiene el siguiente análisis elemental: 52,8% C, 8,1% H y 5,7% N.

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Ejemplo 29

La reacción se realizó como en el ejemplo 25, con la excepción de que la relación de solución al 60% de cloruro de (3-cloro-2-hidroxipropil)-trimetil-amonio respecto a resina es de 0,4 en lugar de 0,73. Después de lavar y secar, la resina tiene el siguiente análisis elemental: 53,72% C, 7,32% H y 6,04% N.

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Ejemplo 30

La reacción se realizó como en el ejemplo 25, con la excepción de que la relación de solución al 60% de cloruro de (3-cloro-2-hidroxipropil)trimetil-amonio a resina es de 1,2 en lugar de 0,73. Después de lavar y secar, la resina tiene el siguiente análisis elemental: 53,71% C, 7,32% H y 6,04% N.

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TABLA 5 Reacción de resina revestida con PEI con cloruro de (3-cloro-2-hidroxipropil)-trimetilamonio

5

Ejemplo 31

(Preparativo)

Se hacen reaccionar 160 g de polímero funcionalizado con PEI preparado según el Ejemplo 1 durante 5 horas a 40ºC con 111,8 g de formaldehído, 400 ml de acetonitrilo y 25,9 g de cianoborohidruro de sodio. Después de la reacción, el polímero se lavó con 480 ml de acetonitrilo, 480 ml de agua DI y tres veces con 480 ml de metanol y se almacenó en tapón de almacenamiento para un uso adicional. (Análisis elemental %C= 55,2%, %N= 5,8).

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Ejemplo 32

Se introdujeron 25 mg de polímero preparado según el Ejemplo 31 y 200 ml de acetonitrilo en un autoclave (reactor a presión dispuesto sobre plataforma Parr series 4500 con controlador de la temperatura Parr 4840). Mientras se agitaba el polímero a 120 rpm, se introdujo cloruro de metilo gaseoso y se sometió a una presión de 4,14 bares. La reacción se continúo durante 25 horas a 80ºC. Después de la reacción, el producto se lavó con 60 ml de acetonitrilo, 120 ml de hidróxido de sodio 0,1 N, 120 ml de agua DI, 240 ml de tampón de almacenamiento y se almacenó en tampón de almacenamiento.

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Ejemplo 33

Se mezclaron 71 g de polímero modificado con PEI preparado según el ejemplo 1 con 500 ml de hidróxido de sodio 0,5 N y se hicieron reaccionar con 49 g de cloruro de 3-(dimetilamino)propilo mientras se agitaba a 50-100 rpm a 80ºC durante 8 horas. Después de la reacción, el producto se lavó dos veces con 500 ml de hidróxido de sodio, dos veces con 500 ml de agua DI, dos veces con 500 ml de tampón de almacenamiento y se almacenó en el tampón para un uso adicional. Análisis elemental: %C: 55,4, %N: 6,2.

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Ejemplo 34 Separación cromatográfica de proteínas (ilustrativa)

Un medio cromatográfico preparado como en el ejemplo 1 y medio de sílice con PEI de la empresa JT Baker (número de producto 7264, lote N16084) se introdujeron como relleno en una columna cromatográfica de 4,6 x 10 mm. Se inyectaron en la columna 200 microlitros de una solución de 1 mg/ml de lisozima, 2 mg/ml de inmunoglobulina G de conejo, 2 mg/ml de albúmina de suero bovino y 2 mg/ml de cada una de beta-lactoglobulina A y B en un tampón de acetato de sodio 20 mM a pH 6,2 y se eluyó usando un caudal de 1 ml/minuto y un gradiente de 30 minutos de 100% de tampón de acetato de sodio 20 mM a pH 6,2 hasta tampón de acetato de sodio 1,0 M al 100% a pH 6,2. La elusión de las proteínas se registra mediante un detector UV a 280 nm (figura 1).

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Ejemplo 35 Separación cromatográfica de proteínas

Un medio cromatográfico preparado como en el ejemplo 9 se introduce como relleno en una columna cromatográfica de 4,6 x 100 mm. Se inyectan en la columna 200 microlitros de una solución de 4 mg/ml de BSA, 2 mg/ml de IgG de conejo, 2 mg/ml de citocromo-c y 2 mg/ml de solución de lisozima en tampón de acetato de sodio 20 mm a pH 6,2 y se eluye usando un caudal de 1 ml/minuto y una gradiente durante 40 minutos de 100% de tampón de acetato de sodio 20 mM a pH 6,2 hasta 100% del mismo eluyente pero que contiene 1 mol por litro de acetato de sodio, pH 6,2. La elución de las proteínas mediante el medio de este ejemplo y para un medio comparativo de modo mixto basado en sílice (producto de JT Baker nº 7269) se registra mediante un detector UV a 280 nm (figura 2).

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Ejemplo 36 Comparación de capacidad

Se midió y se comparó la capacidad de medios cromatográficos preparados según el Ejemplo 9 y productos basados en sílice. Una columna (4,6 mm x 50 mm) se relleno con los medios. Se aplicó a la columna una solución de IgG (1 mg/ml) en acetato de sodio 20 mM a pH 5,6, 6,2 y 6,9 a una velocidad lineal variable (cm/h). El progreso se determinó verificando la UV a 280 nm. La capacidad de progreso de los medios en la columna se determinó a un progreso de 10% (Tabla 7).

TABLA 7 Capacidad de progreso de medios de modo mixto y medios de sílice

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6

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Ejemplo 37

Medios cromatográficos según el Ejemplo 19 y medios de sílice (producto de JT Baker nº 7285) se introdujeron como relleno en una columna de 7,75 mm x 100 mm. Se inyectó una solución de 200 \mul de solución de 2 mg/ml de citocromo C, ribonucleasa, lisozima y ovalbúmina en fosfato de sodio 25 mM, pH 7,0 + sulfato de amonio 1,7 M. La proteína se eluyó de la columna mediante un gradiente lineal de 100% de fosfato de sodio 25 mM + sulfato de amonio 1,7 M hasta 100% de fosfato de sodio 25 mM, pH 7,0. El perfil de elución se verificó mediante UV a 280 nm (figura 3A y 3B).

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Ejemplo 38

Medios cromatográficos preparados según el Ejemplo 20 se introdujeron como relleno en una columna de 7,75 mm x 100 mm. Se inyectaron 200 \mul de solución de 2 mg/ml de citocromo C, ribonucleasa, lisozima y ovalbúmina en fosfato de sodio 25 mM, pH 7,0 + sulfato de amonio 1,7 M. La proteína se eluyó de la columna mediante un gradiente lineal de 60 minutos de 100% de fosfato de sodio 25 mM + sulfato de amonio 1,7 M hasta 100% de fosfato de sodio 25 mM, pH 7,0. El perfil de elución se verificó mediante UV a 280 nm (figura 4).

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Ejemplo 39

Medios cromatográficos preparados según el Ejemplo 22 se introdujeron como relleno en una columna de 7,75 mm x 100 mm. Se inyectaron 200 \mul de solución de 2 mg/ml de citocromo C, ribonucleasa, lisozima y ovalbúmina en fosfato de sodio 25 mM, pH 7,0 + sulfato de amonio 1,7 M. La proteína se eluyó de la columna mediante un gradiente lineal de 60 minutos de 100% de fosfato de sodio 25 mM + sulfato de amonio 1,7 M hasta 100% de fosfato de sodio 25 mM, pH 7,0. El perfil de elución se verificó mediante UV a 280 nm (figura 5).

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Ejemplo 40

Medios cromatográficos preparados según el Ejemplo 23 se introdujeron como relleno en una columna de 7,75 mm x 100 mm. Se inyectaron 200 \mul de solución de 2 mg/ml de citocromo C, ribonucleasa, lisozima y ovalbúmina en fosfato de sodio 25 mM, pH 7,0 + sulfato de amonio 1,7 M. La proteína se eluyó de la columna mediante un gradiente lineal de 60 minutos de 100% de fosfato de sodio 25 mM + sulfato de amonio 1,7 M hasta 100% de fosfato de sodio 25 mM, pH 7,0. El perfil de elución se verificó mediante UV a 280 nm (figura 6).

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Ejemplo 41

Los medios polímeros preparados según el Ejemplo 7 se introdujeron como relleno en una columna de 10 cm x 10 cm. En primer lugar la columna se equilibró haciendo pasar un volumen de 10 columnas de tampón A (MES 0,05 M, pH 5,6). Después de equilibrar se inyectaron 0,5 ml de solución de proteína que contenía globulina de conejo (0,5 mg/ml) y lisozima (0,25 mg/ml). Las proteínas se eluyeron de la columna realizando un gradiente lineal de 40 minutos de 100% de Tampón A hasta 100% de tampón B (Cloruro de sodio 1 M en tampón A). Después de la realización de la separación de la primera proteína, la columna se lavó haciendo circular 500 ml de ácido fosfórico 10 mM a 1 ml/minuto durante 48 horas. Después de lavar se llevó a cabo la separación de proteínas nuevamente para determinar la estabilidad ácida de la columna (figura 7). Estos datos indican la excelente estabilidad de los medios polímeros de modo mixto bajo condiciones ácidas, ya que no hubo cambios en el tiempo de retención de IgG y lisozima antes y después de lavar la columna con ácido fosfórico durante 48 horas.

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Ejemplo 42

Los medios polímeros preparados según el ejemplo 7 se introdujeron como relleno en una columna de 10 cm x 10 cm. En primer lugar la columna se equilibró haciendo pasar un volumen de 10 columnas de tampón A (MES 0,05 M, pH 5,6). Después de equilibrar, se inyectaron 0,5 ml de solución de proteínas que contenía globulina de conejo (0,5 mg/ml) y lisozima (0,25 mg/ml). Las proteínas se eluyeron de la columna llevando a cabo un gradiente lineal de 40 minutos de 100% de tampón A a 100% de tampón B (cloruro de sodio 1 M en tampón A). Después de la realización de la primera separación de proteínas, la columna se lavó haciendo circular 500 ml de hidróxido de sodio 0,1 M a 1 ml/minuto durante 24 y 48 horas. Después de lavar se llevó a cabo la separación de proteínas nuevamente para determinar la estabilidad básica de la columna (figura 8). Estos datos indican la excelente estabilidad de los medios polímeros de modo mixto bajo condiciones básicas, ya que no hubo cambios en el tiempo de retención de IgG y lisozima antes y después de lavar la columna con hidróxido de sodio durante 48 horas.

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Ejemplo 43

Se midió la capacidad de los medios cromatográficos preparados según los ejemplos 1, 25, 26, 27, 28, 29, 30 y 32 y se compararon. Se rellenó una columna (4,6 mm x 50 mm) con los medios. Se aplicó a la columna una solución de BSA (1 mg/ml) en CAPS 20 mM (ácido 3-[ciclohexilamino]-1-propano-sulfónico), pH 11, a la columna a un caudal de 1 ml/minuto. El progreso se determinó verificando la UV a 280 nm. La capacidad de progreso de los medios en la columna se determinó a un progreso de 10%. Después de introducir BSA en las columnas, las columnas se lavaron con tampón de CAPS y seguidamente el BSA adsorbido se eluyó usando cloruro de sodio 1 N para calcular la capacidad de saturación (Tabla 8).

TABLA 8 Comparación de la capacidad

8

La invención ha sido descrita en la presente memoria descriptiva con referencia a sus realizaciones específicas. Debe apreciarse que se pueden hacer cambios, modificaciones y variaciones sin apartarse del alcance de las reivindicaciones. Consecuentemente, está previsto abarcar todos estos cambios, modificaciones y variaciones que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anejas.

Claims

1. Medios cromatográficos que comprenden partículas de resinas polímeras derivadas con polietilenimina en la superficie del polímero y funcionalizadas mediante la reacción de un reactivo de funcionalización con grupos aminos terminales de la polietilenimina en la superficie de la resina polímera, en los que el reactivo de funcionalización se selecciona entre el grupo que consiste en: anhídridos de ácidos, agentes de sulfonación, cloruros de alquilo, anhídridos alquílicos y cloruros de alquilo que contienen una funcionalidad de amonio cuaternario y sus mezclas.

2. Medios cromatográficos según la reivindicación 1, en los que el reactivo de funcionalización se selecciona entre el grupo que consiste en anhídridos carboxílicos cíclicos, anhídridos carboxílicos insaturados, bisulfitos, cloruros de alquilo, anhídridos alquílicos, cloruros de alquilo que contienen una funcionalidad de amonio cuaternario y sus mezclas.

3. Medios cromatográficos según la reivindicación 2, en los que el reactivo de funcionalización se selecciona entre el grupo que consiste en: anhídrido glutárico, anhídrido succínico, anhídrido maleico, meta-bisulfito de sodio, cloruro de butirilo, anhídrido acético, anhídrido butírico, cloruro de (3-cloro-2-hidroxipropil)trimetilamonio y sus mezclas.

4. Medios cromatográficos según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que los medios están en modo mixto.

5. Medios cromatográficos según la reivindicación 4, en que los medios de modo mixto se seleccionan entre el grupo que consiste en medios con sitios de intercambio mixtos de aminas primarias, secundarias y terciarias, medios con sitios de intercambio de aniones débiles y cationes débiles, medios con sitios de intercambio de cationes débiles y cationes fuertes, medios con sitios de intercambio de aniones débiles e hidrófobos (fase inversa) y medios con sitios de intercambio de aniones débiles y aniones fuertes.

6. Una columna para cromatografía, que está rellena con medios cromatográficos según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

7. Un procedimiento para la separación de componentes de una solución, que comprende hacer pasar la solución a través de una columna de cromatografía según la reivindicación 6 y eluir los componentes de la solución.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que la solución es una solución que contiene proteínas.