ES2332924T3

ES2332924T3 - Proteinas de fusion fc-interferon-beta.

Info

Publication number: ES2332924T3
Application number: ES05766761T
Authority: ES
Inventors: Stephen D. Gillies; Nigel John Watkins; Matthew Paul Baker; Kin-Ming Lo
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2004-06-28
Filing date: 2005-06-28
Publication date: 2010-02-15
Anticipated expiration: 2025-06-28
Also published as: AU2005256519B2; US20140005361A1; CA2572015C; WO2006000448A2; WO2006000448A3; US20060228332A1; EP1761559A2; US7670595B2; ATE443720T1; JP2008508862A; CA2572015A1; EP1761559B1; US8557232B2; JP4808709B2; US20090191154A1; AU2005256519A1; DE602005016799D1

Abstract

Una proteína de fusión Fc-interferón-ß con plegamiento mejorado y agregación reducida que comprende: (i) una región de Fc de inmunoglobulina; y (ii) una proteína de interferón ligada por unión de péptido o una secuencia ligadora de péptido al terminal carboxi de la región Fc de inmunoglobulina, en donde la proteína interferón comprende sustituciones de aminoácido comparado con la secuencia de interferón madura natural en las posiciones 17 y 50 y 131 y 140, o 17 y 57 y 131 y 140.

Description

Proteínas de fusión Fc-interferón-\beta.

Campo de la invención

La invención se relaciona con Proteínas de fusión Fc. Más específicamente, la invención se relaciona con expresión de alto nivel y secreción de Proteínas de fusión Fc-interferón-beta y formas variantes de las mismas, y métodos para elaborar y utilizar tales proteínas.

Antecedente de la invención

Los interferones son polipéptidos de cadena sencilla secretados por la mayoría de células de animal en respuesta a una variedad de estímulos, que incluyen virus, mitógenos y citoquinas. Los interferones participan en la regulación de las funciones celulares y median los efectos inmunomoduladores, antiproliferativos, y antivíricos. Así, ellos son de gran interés terapéuticamente. Los interferones nativos se dividen en tres tipos principales, con base en los tipos de células de las cuales existen principalmente derivados, a saber, interferón-\beta (de leucocitos), interferón-\beta (de fibroblastos), interferón-\beta (de células inmunes). Interferón-\beta (IFN-\beta) que exhibe varias actividades inmunológicas y biológicas y como un resultado tiene aplicaciones potenciales en inmunoterapia, terapias antineoplásicas, anticáncer y antivíricas. Se han conducido y se conducen numerosas investigaciones y ensayos clínicos con base en propiedades anticáncer y antivíricas tipo intacto y IFN-\beta recombinante. También se han conducido ensayos clínicos utilizando IFN-\beta recombinante en el tratamiento de esclerosis múltiple.

La mayoría de las citoquinas, que incluyen IFN-\beta nativo, tienen vidas útiles circulantes relativamente cortas. Posteriormente, con el fin de que el IFN-\beta sea efectivo como un agente terapéutico, se puede administrar en dosis altas y frecuentes a un paciente; sin embargo, esto frecuentemente conduce a efectos colaterales tóxicos. Por lo tanto, es altamente deseable producir formas de IFN-\beta que han prolongado las vidas útiles circulantes comparado con la citoquina nativa. Adicionalmente, para propósitos de producción es útil producir formas de IFN-\beta que son fáciles de expresar y purificar en grandes cantidades.

El IFN-\beta humano (huIFN-\beta) es una glucoproteína de 166 aminoácidos y tiene una estructura de manojo de cuatro hélices. El huIFN-\beta recombinante se puede producir comúnmente para uso como un terapéutico en un sistema de expresión de mamífero o procariótico. Sin embargo, cuando las proteínas que se secretan normalmente, tal como huIFN-\beta, en un ambiente de mamífero se producen en un procariote, necesita ser dirigido el efecto de la expresión procariótica en el plegamiento de proteína y en modificaciones post-traduccionales potenciales. Por ejemplo, en células de mamífero, la mayoría de las proteínas destinadas para el ambiente extracelular se pliegan en el ambiente oxidado del retículo endoplásmico (ER), que promueve la formación correcta de enlaces disulfuro. En contraste, el ambiente de reducción de citosol procariótico interfiere con la formación de enlaces cisteína. Adicionalmente, las proteínas expresadas en sistemas procarióticos carecen de algunas modificaciones post-transduccionales, tal como glucosilación ligada a N, que ayudan de forma similar en el plegado correcto de la proteína, incrementa la estabilidad de la proteína plegada, y reduce la inmunogenicidad de la proteína administrada.

Por ejemplo, cuando el IFN-\beta de tipo intacto se expresa en un sistema de expresión procariótico, este no se pliega apropiadamente y forma agregados. Esto se puede superar al mutar la cisteína libre en la posición 17 de la proteína IFN-\beta madura a, por ejemplo, una serina. Esta cisteína en la posición 17 no se involucra en una unión disulfuro. Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,737,462. En contraste, cuando el IFN-\beta tipo intacto se produce en un sistema de expresión eucariótico, cuando el ambiente es apropiado para el plegado correcto de la proteína IFN-\beta, no se observan plegado impropio ni agregación. Debido a que la proteína IFN-\beta parece plegar apropiadamente y no agregar cuando se expresa en un sistema de expresión eucariótico, esto sugiere que la glucosilación juega un papel importante en plegado propio de la proteína IFN-\beta. El IFN-\beta recombinante se produce en un sistema de expresión eucariótico que experimenta glucosilación, aunque no puede tener el patrón de glucosilación preciso del IFN-\beta nativo''. Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,795,779. Aunque la glucosilación de IFN-\beta no parece ser esencial para su actividad biológica, la actividad específica del IFN-\beta glucosilado en bioensayos es mayor que la de la forma no glucosilada. De hecho, el IFN-\beta producido en un sistema de expresión eucariótico, tal como un sistema de expresión de mamífero, no se agrega sustancialmente, pero forma agregados cuando se remueve el grupo funcional glicano. Por lo tanto, la forma glucosilada de IFN-\beta es deseable para uso terapéutico ya que sus propiedades biofísicas son más cercanas que aquellas de la proteína nativa de la forma no glucosilada.

Otra posibilidad para mejorar las propiedades biológicas de IFN-\beta es reducir o eliminar la inmunogenicidad: la WO 02/74783 describe una proteína de fusión Fc-IFN\beta, en donde la porción IFN-\beta se modifica en las posiciones 50, 57 y 130 y muestra una respuesta inmune reducida.

Adicionalmente, se ha encontrado que ligar una proteína de interés "X" a un dominio Fc de inmunoglobulina "Fc" para crear una proteína de fusión Fc-X ("inmunofusina") generalmente tiene el efecto de incrementar la producción de proteína significativamente. Esto se considera que ocurre, en parte, debido a que el grupo funcional Fc de la proteína de fusión, comúnmente denominado como el casete de expresión, se diseña para secreción eficiente de la proteína de fusión, y en parte debido a que se producen las proteínas y se secreten de células de mamífero que son normalmente activas para secreción. Una ventaja adicional de crear Proteínas de fusión Fc-X es que las inmunofusinas resultantes exhiben una vida media circulante incrementada cuando se compara con las proteínas libres de interés, que puede ser una ventaja terapéutica significativa.

Existe, por lo tanto, una necesidad en la técnica de inmunofusinas biológicamente activas que incluyen un grupo funcional Fc fusionado a un grupo funcional IFN-\beta optimizado por tener propiedades biofísicas que son cercanas a aquellas del IFN-\beta nativo.

Resumen de la invención

La invención proporciona métodos y composiciones para expresar proteínas de fusión Fc-IFN-\beta biológicamente activas, solubles y variantes de las mismas (Fc-IFN-\beta^{sol}), Las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} de la invención demuestran propiedades biológicas mejoradas sobre las proteínas Fc-IFN-\beta no alteradas tal como solubilidad incrementada, vida media circulante prolongada, actividad biológica mejorada, e inmunogenicidad reducida.

Para mejorar la vida útil circulante de IFN-\beta, la invención proporciona una proteína de fusión que incluye una proteína de fusión Fc-IFN-\beta que incluye una región de Fc de inmunoglobulina y una proteína IFN-\beta ligada al terminal carboxi de la región Fc de inmunoglobulina. Para mejorar el plegamiento y para reducir la agregación, la proteína IFN-\beta incluye sustituciones de aminoácido en las posiciones 17, 50 o 57, 130, 131, 136, y 140, que corresponden a interferón-\beta maduro natural.

En una realización, las sustituciones de alteración de aminoácido serina, alanina, valina o metionina en lugar de cisteína en la posición 17. En otra realización, las sustituciones de alteración de aminoácido histidina en lugar de fenilalanina en la posición 50. En todavía otra realización, las sustituciones de alteración de aminoácido alanina en lugar de leucina en la posición 57, mientras que en una realización adicional, las sustituciones de alteración de aminoácido alanina en lugar de leucina en la posición 130. Una realización adicional permite una alteración de aminoácido que sustituye alanina en lugar de histidina en la posición 131, mientras que una realización adicional contempla que sustituye alanina en lugar de lisina en la posición 136. En todavía otra realización, las sustituciones de alteración de aminoácido alanina o treonina en lugar de histidina en la posición 140.

La región Fc de inmunoglobulina puede incluir una región de pivote de inmunoglobulina y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En una realización, la región Fc se deriva de IgG4, mientras que en otra ésta se deriva de IgG1, y en todavía otra ésta se deriva de IgG2. En otra realización, la región Fc se deriva de IgG4 pero incluye una región de pivote de IgG1. En todavía otra realización, la región Fc se deriva de IgG2 pero incluye una región de pivote derivada de IgG1. Cuando la región Fc incluye un dominio CH, la lisina de terminal C de la región Fc de inmunoglobulina se puede reemplazar por un residuo alanina. En una realización adicional, se muta un residuo cisteína de la región de pivote.

La invención proporciona diferentes métodos para unir el grupo funcional Fc y el grupo funcional IFN-\beta para crear las proteínas de fusión de acuerdo con la invención. Por ejemplo, en una realización la región Fc de inmunoglobulina y la proteína interferón se fusionan mediante a una unión de péptido. En otra realización, la región Fc de inmunoglobulina y la proteína interferón se conectan por una secuencia ligadora de péptido para facilitar el plegamiento de la proteína. La secuencia ligadora preferiblemente se compone de residuos serina y glicina. Por ejemplo, en una realización, la secuencia ligadora de péptido es Giy4SerGly4SerGly3SerGly (SEQ ID NO:1).

En una realización, la proteína de fusión Fc-interferón-\beta incluye sustituciones de aminoácido en las posiciones 17, 50, 131, y 140 para mejorar el plegamiento y reduce agregación. En una realización específica, las alteraciones de aminoácido son serina sustituida en lugar de cisteína en la posición 17, histidina sustituida en lugar de fenilalanina en la posición 50, alanina sustituida en lugar de histidina en la posición 131, y treonina o alanina sustituida en lugar de histidina en la posición 140. En ciertas realizaciones, la región Fc incluye IgG1, IgG2, o IgG4. La proteína de fusión también puede incluir una secuencia ligadora de polipéptido que conecta la proteína interferón y la región Fc de inmunoglobulina. En una realización, se muta un residuo cisteína de la región de pivote.

En otra realización, la proteína de fusión Fc-interferón-\beta incluye sustituciones de aminoácido en las posiciones 17, 57, 131, y 140, que mejoran el plegamiento y reducen la agregación de la proteína de fusión expresada. En una realización específica, las alteraciones de aminoácido son serina sustituida en lugar de cisteína en la posición 17, alanina sustituida en lugar de leucina en la posición 57, alanina sustituida en lugar de histidina en la posición 131, y treonina o alanina sustituida en lugar de histidina en la posición 140. En ciertas realizaciones, la región Fc incluye IgG1, IgG2, o IgG4. En otra realización, la proteína de fusión también puede incluir una secuencia ligadora de polipéptido que conecta la proteína interferón y la región Fc de inmunoglobulina. En una realización adicional, se muta un residuo cisteína de la región de pivote.

La invención también proporciona métodos para codificar y expresar las proteínas de fusión de la invención. Por ejemplo, un aspecto de la invención se relaciona con moléculas de ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas de fusión Fc-interferón\beta anteriormente mencionadas, mientras que en otro aspecto, la invención se relaciona con células que contienen un ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas de fusión Fc-interferón\beta anteriormente mencionadas. En un aspecto adicional, las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden incorporar en asociación operativa en un vector de expresión replicable que luego se puede introducir, por ejemplo, mediante transfección, en una célula anfitriona de mamífero competente produce la proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} de inmunoglobulina. El vector incluye una molécula de ácido nucleico que codifica una cualquiera de las proteínas de fusión Fc-interferón\beta anteriormente mencionadas. La invención también abarca un vector de expresión replicable para transfectar una célula de mamífero. El vector incluye una molécula de ácido nucleico que codifica una cualquiera de las proteínas de fusión Fc-interferón\beta anteriormente mencionadas.

En otro aspecto, la invención se relaciona con métodos para estabilizar Las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta. En una realización, el método incluye la etapa de elaborar cualquiera de las proteínas de fusión Fc-interferón\beta anteriormente mencionadas. En una realización adicional, estabilizar incluye incrementar la vida útil circulante de la proteína de fusión Fc-interferón relacionado con una proteína de fusión Fc-interferón no alterada. En todavía otra realización, estabilizar incluye reducir la agregación de la proteína de fusión Fc-interferón relacionada con una proteína de fusión Fc-interferón no alterada, mientras que en una realización adicional, estabilizar incluye incrementar la actividad biológica de la proteína de fusión Fc-interferón relacionada con una proteína de fusión Fc-interferón no alterada.

Un aspecto adicional de la invención se relaciona con métodos para tratar un paciente para una afección aliviada por la administración de interferón-\beta. En una realización, el tratamiento incluye administrar una cantidad efectiva de cualquiera de las proteínas de fusión interferón-\beta mencionadas anteriormente a un mamífero que tiene la afección. En otra realización, el método incluye administrar un ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas de fusión interferón-\beta mencionadas anteriormente a un mamífero que tiene la afección, mientras que en todavía otra realización, el método incluye administrar una célula que codifica cualquiera de las proteínas de fusión interferón-\beta mencionadas anteriormente a un mamífero que tiene la afección. El resumen de la invención se relaciona con la siguiente materia objeto:

-: Una proteína de fusión Fc-interferón-\beta con plegamiento mejorado y agregación reducida que comprende:(i) una región de Fc de inmunoglobulina; y (ii) una proteína de interferón ligada por unión de péptido o una secuencia ligadora de péptido al terminal carboxi de la región Fc de inmunoglobulina, en donde la proteína interferón comprende sustituciones de aminoácido comparado con la secuencia de interferón madura natural en las posiciones 17 y 50 y 131 y 140, o 17 y 57 y 131 y 140.

-: Una proteína de fusión respectiva, que tiene las siguientes sustituciones de aminoácido dentro de la proteína interferón: C17S y F50H y H131A y H140T o A, o C17S y L57A y H131A y H140T o A.

-: Una proteína de fusión respectiva, en donde la región Fc de inmunoglobulina comprende una región de pivote de inmunoglobulina y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.

-: Una proteína de fusión respectiva, en donde la región Fc de inmunoglobulina se deriva de IgG4, IgG2 o IgG1.

-: Una proteína de fusión respectiva, en donde la región Fc de inmunoglobulina se deriva de IgG4 y comprende adicionalmente una región de pivote de inmunoglobulina derivada de IgG1, por el que preferiblemente un residuo cisteína de la región de pivote se ha mutado.

-: Una proteína de fusión respectiva, en donde la región Fc de inmunoglobulina se deriva de IgG1, y un residuo alanina se sustituye en lugar de la lisina de terminal C de la región Fc de inmunoglobulina.

-: Una proteína de fusión respectiva, en donde la región Fc de inmunoglobulina se deriva de IgG2 y comprende adicionalmente una región de pivote de inmunoglobulina derivada de IgGI, por el que preferiblemente un residuo cisteína de la región de pivote se ha mutado.

-: Una proteína de fusión respectiva, en donde un residuo alanina se sustituye adicionalmente en lugar de la lisina de terminal C de la región Fc de inmunoglobulina.

-: Una proteína de fusión respectiva, en donde la secuencia ligadora de péptido es Gly4SerGly4SerGly3SerGly.

-: Una molécula de ácido nucleico que codifica una cualquiera de las proteínas de fusión Fc-interferón-\beta de acuerdo con la invención.

-: Un vector de expresión replicable para transfectar una célula de mamífero que comprende dicho ácido nucleico.

-: Una célula de mamífero, seleccionada del grupo que consiste de células de hibridoma inmortal, células de mieloma NS/0, células 293, células de ovario de hámster Chino, células HeLa y Células COS, dicha célula de mamífero contiene dicho vector de expresión.

-: Un método para estabilizar una proteína de fusión Fc-interferón-\beta que comprende expresar una proteína de fusión Fc-interferón-\beta respectiva en una célula de mamífero como se especifica, en donde estabilizar comprende (i) incrementar la vida útil circulante de la proteína de fusión Fc-interferón-\beta relacionada con una proteína de fusión Fc-interferón-\beta no alterada, o (ii) reducir la agregación de la proteína de fusión Fc-interferón-\beta relacionada con una proteína de fusión Fc-interferón-\beta no alterada, o (iii) incrementar la actividad biológica de la proteína de fusión Fc-interferón-\beta relacionada con una proteína de fusión Fc-interferón-\beta no alterada.

-: El uso de una proteína de fusión Fc-interferón-\beta como se especifica para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple, leucemia mieloide, mieloma múltiple, Enfermedad de Hodgkin, carcinoma de célula basal, displasia cervical, osteosarcoma, hepatitis vírica, herpes zóster y herpes genital, virus papiloma, encefalitis vírica y neumonía citomegalovirus.

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Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A-1C son ilustraciones esquemáticas de ejemplos no limitantes de las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} construidas de acuerdo con la invención.

Figura 2 es una fotografía de un gel SDS-PAGE que muestra los patrones de migración de las proteínas de fusión HuFc-\beta4-IFN-\beta y HuFc-\beta4h-IFN-\beta sin la mutación C175 y las proteínas de fusión HuFc-\beta4h-IFN-\beta(C17S) en ambos reducen y no reducen los ambientes químicos.

Figura 3 es la secuencia de aminoácido para IFN-\beta maduro (SEQ ID NO:2).

Figura 4 es la secuencia de aminoácido para el IFN-\beta humano maduro (C17S) (SEQ ID NO:3).

Figura 5 es la secuencia de aminoácido para Fc-IFN-\beta^{sol} humano (C17S) del isotipo \beta4 con un pivote \beta1 modificado (Fc\beta4h-IFN-\beta^{sol}) (SEQ ID NO:4).

Figura 6 es la secuencia de aminoácido para Fc-(ligador)-IFN-\beta humano, partiendo con el dominio CH3 del isotipo Fc\beta4 (SEQ ID NO:5).

Figura 7 es la secuencia de aminoácido para el Fc-(ligador)-IFN-\beta^{sol}(C17S) humano, partiendo con el dominio CH3 del isotipo Fc\beta4 (SEQ ID NO:6).

Figura 8 es la secuencia de aminoácido para el Fc-(ligador)-IFN-\beta^{sol}(C17S L57A H131A H140T) humano partiendo con el dominio CH3 del isotipo Fc\beta4 (SEQ ID NO:7).

Figura 9 es la secuencia de aminoácido para el Fc-(ligador)-IFN-\beta^{sol}(C17S L57A H131A H140A) humano partiendo con el dominio CH3 del isotipo Fc\beta4 (SEQ ID NO:8).

Figura 10 es la secuencia de aminoácido para el Fc-(ligador)-IFN-\beta^{sol}(C17S F50A H131A, H140A) humano, partiendo con el dominio CH3 del isotipo Fc\beta4 (SEQ ID NO:9).

Figura 11 es la secuencia de aminoácido para Fc-(ligador)-IFN-\beta^{sol}(C17S F50A H131A H140T) humano, partiendo con el dominio CH3 del isotipo Fc\beta4 (SEQ ID NO:10).

Figura 12 es la secuencia de aminoácido para IFN-\beta maduro de ratón (SEQ ID NO:11).

Figura 13 es la secuencia de aminoácido para IFN-\beta maduro de ratón (C17S) (SEQ ID NO:12).

Figura 14 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la realización de la proteína de fusión huFc\beta4h-IFN-\beta^{sol} (C17S) (isotipo \beta4 con pivote \beta1 modificado en donde la primera cisteína del pivote \beta1 se reemplaza por una serina), partiendo de la región de pivote (SEQ ID NO:13).

Figuras 15-1 a 15-3 muestran la secuencia de ácido nucleico linearizada del los vectores pdCs que contienen huFc\beta4h-(ligador)-IFN-\beta^{sol}(C17S) (isotipo \beta4 con pivote \beta1 modificado en donde la primera cisteína del pivote \beta1 se reemplaza por una serina), en donde la región Fc y el grupo funcional IFN-\beta se adhieren por vía de un polipéptido ligador (SEQ ID NO:14).

Figura 16 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la realización de la proteína de fusión Hufc-\beta4h-(ligador)-IFN-\beta^{sol}(C175) (isotipo \beta4 con pivote \beta1 modificado en donde la primera cisteína del pivote \beta1 se reemplaza por una serina), partiendo de la región de pivote, en donde la región Fc y el grupo funcional IFN-\beta se adhieren por vía de un polipéptido ligador (SEQ ID NO:15).

Figuras 17-1 a 17-3 muestran la secuencia de ácido nucleico linearizada de los vectores pdCs que contienen huFc\beta4h-(ligador)-IFN-\beta^{sol}(C17S L57A H131A H140A) (isotipo \beta4 con pivote \beta1 modificado en donde la primera cisteína del pivote \beta1 se reemplaza por una serina), en donde la región Fc y el grupo funcional IFN-\beta se adhieren por vía de un polipéptido ligador (SEQ ID NO:16).

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Figura 18 es la secuencia de ácido nucleico de huFc\beta4h-(ligador)-IFN-\beta^{sol}(C17S L57A H131 H140A) (isotipo \beta4 con pivote \beta1 modificado en donde la primera cisteína del pivote \beta1 se reemplaza por una serina), partiendo del pivote, en donde la región Fc y el grupo funcional IFN-\beta se adhieren por vía de un polipéptido ligador (SEQ ID NO:17).

Figura 19-1 a 19-3 muestra la secuencia de ácido nucleico linearizada del los vectores pdCs que contienen huFc\beta4h-(ligador)-IFN-\beta^{sol}(C17S F50H H131A H140A) (isotipo \beta4 con pivote \beta1 modificado en donde la primera cisteína del pivote \beta1 se reemplaza por una serina), en donde la región Fc y el grupo funcional IFN-\beta se adhieren por vía de un polipéptido ligador (SEQ ID NO:18).

Figura 20 es la secuencia de ácido nucleico de huFc\beta4h-(ligador)-IFN-\beta^{sol}(C17S F50H H131A H140A) (isotipo \beta4 con pivote \beta1 modificado en donde la primera cisteína del pivote \beta1 se reemplaza por una serina) partiendo del pivote, en donde la región Fc y el grupo funcional IFN-\beta se adhieren por vía de un polipéptido ligador (SEQ ID NO:19).

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Descripción detallada de la invención

El IFN-\betamedia efectos antiproliferativos, antivíricos e inmunomoduladores y, en adición a su utilidad en tratar esclerosis múltiple, se anticipa que se pueden aliviar muchas otras afecciones mediante la administración de IFN-\beta. Por ejemplo, es útil como tratamiento para una variedad de neoplasias, tal como leucemia mieloide aguda, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, carcinoma de célula basal, displasia cervical y osteosarcoma que están bajo evaluación. El IFN-\beta también se prueba como un agente terapéutico contra una variedad de infecciones víricas, que incluyen hepatitis vírica, herpes zoster y herpes genital, virus del papiloma, virus de la encefalitis, y neumonía por citomegalovirus.

Sin embargo, cuando se administra a un paciente, el IFN-\beta Maduro recombinante tiene una vida útil circulante corta, haciéndolo su optimo para uso en terapia. Por lo tanto subsiste la necesidad en la técnica de producir variantes de IFN-\beta con propiedades farmacocinéticas mejoradas, que incluye vida útil de suero mejorada.

Un método conocido en la técnica para prolongar la vida útil de proteínas pequeñas involucra ligarlas a una región Fc de inmunoglobulina. Las fusión es en las que se colocan la región Fc en el Terminal N de un ligando (denominada "inmunofusión es" o fusión es "Fc-X" en donde X es un ligando tal como IFN-\beta) tiene un número de propiedades útiles (Lo et al., Patentes estadounidenses Nos. 5,726,044 y 5,541,087; Lo et al. (1998) Protein Engineering 11: 495). Por ejemplo, si se administra leptina a un ratón como una molécula de fusión de Fc-leptina (ver, por ejemplo, publicación de solicitud de patente PCT WO 00/40615), la vida útil de circulación de la leptina se incrementa de aproximadamente 18 minutos a más de 8 horas, de manera similar, la vida útil de IL-2 en un ratón se incrementa de unos pocos minutos a unas pocas horas cuando se administra como una proteína de fusión Fc-IL2.

Otra proteína útil de las proteínas de Fc-X es aquella de la porción Fc que tiene generalmente el efecto de incrementar significativamente la producción de proteína. Se considera que esto ocurre, en parte debido a que el grupo funcional Fc de la proteína de fusión, denominada comúnmente como el casete de expresión se diseña para secreción eficiente de la proteína de fusión y, en parte, debido a que las proteínas de fusión se pueden producir en y secretar a partir de células de mamíferos anfitriones que expresan naturalmente inmunoglobulina tal como la proteína de fusión que se secreta fácilmente de la célula anfitriona.

Aunque puede ser posible producir estas proteínas de fusión en un sistema de expresión procariótico, se prefiere un sistema de expresión eucariótico y se prefiere más un sistema de expresión mamario.

De manera sorprendente se ha encontrado que cuando una inmunofusina Fc-IFN-\beta no alterada se produce en un sistema de expresión eucariótico, se expresa pobremente, se desdobla y se agrega sustancialmente. En contraste, las proteínas IFN-\beta recombinantes producidas en un sistema de expresión eucarióticos son solubles y 98 % monoméricas (Runkel et al. (1998), Pharmaceutical Research 15:641). Así parece que la ubicación del grupo funcional Fc en el Terminal N- del grupo funcional IFN-\beta afectan la capacidad de la proteína de fusión para plegarse correctamente cuando no se observa agregación cuando se produce IFN-\beta como una proteína de fusión en donde el grupo funcional IFN-\beta procede del dominio Fc (Ver Patente U.S. No. 5,908,626). Por lo tanto subsiste la necesidad en la técnica de crear proteínas de fusión Fc-IFN-\beta que se plieguen correctamente y no se agreguen sustancialmente.

Por consiguiente, la invención proporciona (i) secuencias de ácidos nucleicos que facilitan la producción eficiente de proteínas de fusión de inmunoglobulina Fc-IFN-\beta^{sol}; (ii) construcciones de ácido nucleico para producción eficiente y rápida y secreción de proteínas de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} en una variedad de células anfitrionas de mamíferos; y (iii) métodos para la producción, secreción, y purificación de variantes de proteínas de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} de inmunoglobulina.

En particular, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas de ADN o ARN, que se codifican en serie en la dirección 5' a 3', un polipéptido que incluye una región fusión Fc de inmunoglobulina y una proteína IFN-\beta^{sol}.

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Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden incorporar en una asociación operativa en un vector de expresión que se puede introducir luego, por ejemplo, por transfección, en un componente de célula de anfitrión mamífero para producir la proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} de inmunoglobulina.

La invención también proporciona métodos para estabilizar proteínas de fusión Fc=IFN-\beta^{sol} de inmunoglobulina. Aunque muchas proteínas se han producido y purificado exitosamente como fusión es Fc, que incluyen muchas proteínas de manojo de cuatro hélices tal como IL-2 (huFc-IL2), se ha encontrado que las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta, cuando IFN-\beta pertenece a la clase de proteínas de manojos de cuatro hélices, forma agregados por lo menos parcialmente debido a enlaces de disulfuro aberrantes presentes en la proteína ("agregación covalente"). Adicionalmente, se ha encontrado que las proteína Fc-IFN-\beta forman agregados a través de interacciones no covalentes así como también ("agregación no covalente").

La presente invención alivia la agregación al proporcionar métodos de estabilización de proteínas de fusión Fc-IFN-\beta que incluyen la etapa de elaborar una proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{sol}, en donde la proteína de fusión incluye una proteína IFN-\beta que tiene alteraciones en uno o más aminoácidos, ligados al Terminal carboxi de una región Fc de inmunoglobulina. En realizaciones de la invención, la estabilización incluye incrementar la solubilidad de la proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{SOL} con relación a una proteína de fusión Fc-IFN-\beta fusión, que incrementa la vida útil circulante de la proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{SOL} con relación a una proteína de fusión Fc-IFN-\beta no alterada, y/o mejorar la actividad biológica de la proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{SOL} con relación a una proteína de fusión Fc-IFN-\beta no alterada. La estabilización incrementada se alcanza en parte mediante la eliminación de un enlace de disulfuro aberrante en la proteína de fusión y en parte al reducir la cantidad de agregación no covalente de la proteína de fusión.

La invención también proporciona métodos para tratar afecciones aliviadas por fragmentos bioactivos, y IFN-\beta, o variantes activas de los mismos a la administrar a un mamífero una cantidad efectiva de IFN-\beta producida por un método de la invención y/o una proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{SOL} de la invención. La invención también proporciona métodos para tratar afecciones aliviadas por IFN-\beta o sus variantes activas al administrar un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, un "ADN desnudo", o un vector que contiene ADN o ARN de la invención, a un mamífero que tiene la afección.

Grupo funcional IFN-\beta

La invención proporciona proteínas de fusión y moléculas de ácido nucleico que codifican aquellas proteínas que incluyen una proteína IFN-\beta alterada ligada al Terminal C de una región Fc de inmunoglobulina. El grupo funcional IFN-\beta de inmunoglobulina. El grupo funcional IFN-\beta puede incluir una o más mutaciones a la estructura de aminoácido del grupo funcional IFN-\beta y la construcción Fc-IFN-\beta mejora las propiedades de plegamiento de la proteína de fusión, para reducir la agregación, y para mejorar la expresión de proteína. Por ejemplo, el grupo funcional IFN-\beta de la proteína de fusión soluble Fc-IFN-\beta^{SOL} puede contener una alteración en la posición 17, que corresponde a una cisterna IFN-\betamaduro natural ligado al Terminal carboxi de una región IFN-\betade inmunoglobulina. La secuencia de aminoácido para el IFN-\beta humano maduro natural se muestra en la Fig. 3. la alteración de aminoácido en la posición 17 de la proteína IFN-\beta se puede generar mediante una sustitución de aminoácido, eliminación de aminoácido o modificación de aminoácido a través de métodos conocidos en la técnica. Las alteraciones preferidas al grupo funcional IFN-\beta incluyen sustitución de una serina (C17S), valina (C17V), alanina (C17A) o metionina (C17M) en el lugar de la cisteína en la posición 17. Una secuencia de aminoácido de ejemplo de una proteína de fusión Fc-IFN-\beta humana soluble contiene la mutación C17S (huFc-IFN-\beta^{sol} (C17S)) que se muestra en la Fig. 5 (SEQ ID NO:4), aunque la secuencia de aminoácido para un grupo funcional IFN-\beta incluye la mutación C17S que se muestra en la Fig. 4 (SEQ ID NO:3). La invención también incluye las construcciones de proteína de fusión huFc-IFN-\beta^{sol} (C17V), huFc-IFN-\beta^{sol} (C17A) y huFc-IFN-\beta^{sol} (C17M).

En adición a una alteración en la posición 17 del grupo funcional IFN-\beta maduro, la invención proporciona proteínas de fusión Fc-IFN-\beta con otros residuos alterados. Por ejemplo, el grupo funcional IFN-\beta se puede alterar en una o más posiciones 17, 50, 57, 130, 131, 136, y 140 que corresponden a, respectivamente, una cisteína, una fenilalanina, una lisina, una leucina, una histidina, una lisina, y una histidina en la proteína IFN-\beta madura natural. El grupo funcional IFN-\beta se liga al Terminal carboxi de una región Fc de inmunoglobulina. Las alteraciones a la estructura de aminoácido en una o más de las posiciones 17, 50, 57, 130, 131, 136, y 140 pueden incluir una sustitución de aminoácido, eliminación de aminoácido o modificación de aminoácido y se pueden generar a través de métodos conocidos en la técnica. Las alteraciones introducidas en estos residuos se considera que alivian las causas de la agregación no covalente. En una realización, la fenilalanina en la posición 50 se reemplaza por histidina (F50H). En otra realización, la leucina en la posición 57 se remplaza por alanina (L57A). En una realización adicional, la histidina en la posición 131 se remplaza por alanina (H131A), aunque aún en otra realización, la histidina en 140 se remplaza por alanina (H140A) o treonina (H140T). En otra realización, la leucina en la posición 130 se remplaza por alanina (L130A), aunque aún en otra realización, la lisina en el residuo 136 se remplaza por alanina (K136A). Aunque se han enumerado ciertas sustituciones de aminoácidos aquí, la invención no se limita a estas alteraciones enumeradas. Cualquier aminoácido adecuado capaz de conferir las propiedades apropiadas sobre la proteína de fusión se puede sustituir en lugar del residuo de aminoácido original en la posición 17, 50, 57, 130, 131, 136, y/o 140 del grupo funcional IFN-\beta.

La invención contempla un grupo funcional IFN-\beta de una proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} que tiene cualquier combinación de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o de las alteraciones a las posiciones 17, 50, 57, 130, 131, 136 y/o 140 como se describe aquí.

Por ejemplo, el Fc-IFN-\beta^{sol} en una realización contiene alteraciones de aminoácidos en uno más de F50, H131 y H140 de la forma madura del IFN-\beta, combinado opcionalmente con una alteración C17. En otra realización, el grupo funcional IFN-\beta de la proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} contiene alteraciones de aminoácidos en uno o más de L57, H131 y H140 de la forma madura de IFN-\beta, combinado opcionalmente con una alteración C17, en otra realización, el grupo funcional IFN-\beta de la proteína de fusión Fc-IFN-\beta incluye las alteraciones C17S, F50H, H131A, y/o H140A. Las Figs. 8-11 muestran secuencias de aminoácido de ejemplo de las realizaciones de las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} que incorporan varias combinaciones de estas mutaciones. En aún otra modalidad, el grupo funcional IFN-\beta de la proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} incluye las alteraciones C17S, F50H, H131A, y/o H140T. En aún otra modalidad, el grupo funcional IFN-\beta de la proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} incluye las alteraciones C17S, L57A, H131A, y/o H140A, aunque en una realización adicional, las proteínas de fusión incluyen las alteraciones C17S, L57A, H131A, y/o H140T. La región Fc es preferiblemente una región Fc humana.

Otra realización de la invención incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica variantes Fc-IFN-\beta^{sol} con por lo menos una sustitución de codón en la secuencia de proteína IFN-\beta humana madura. En una realización, una sustitución de codón reemplaza la cisteína que corresponde a la posición 17 en la secuencia IFN-\beta humana madura con una serina (C17S). La expresión de esta secuencia de nucleótido, contenida en un plásmido apropiado, en un sistema de cultivo celular de mamífero resulta en la producción eficiente de la proteína de fusión huFc-liuIFN-\beta^{sol} (C17S). En realizaciones alternas, una sustitución de codón reemplaza la cisteína en la posición 17 con una alanina, valina, o una metionina. De manera similar, la expresión de cualquiera de estas secuencias de nucleótido, contenidas en un plásmido apropiado, en un sistema de cultivo celular de mamífero resultará en la producción eficiente de proteína de fusión huFc-huIFN-\beta^{sol} (C17A), huFc-huIFN-\beta^{sol} (C17V), o huFc-huIFN-\beta^{sol} (C17M). En una realización, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión Fc-IFN-\beta sol representativa huFcy4h-IFN-\beta^{sol} (C17S), que parte del pivote, se describen en la Fig. 14 (SECUENCIA ID NO:13). La invención también incluye secuencias de ácido nucleico que codifican variantes Fc-IFN-\beta sol con sustituciones de codón que reemplazan los aminoácidos en una o más posiciones 17, 50, 57,130, 131, 136 y/o 140. Los ácidos nucleicos que incorporan los codones alterados de la invención se pueden crear utilizando los métodos conocidos en la técnica.

La región Fc de inmunoglobulina y el grupo funcional IFN-\beta de una proteína de fusión Fc-IFN-\beta ^{sol} se pueden ligar una a la otra en una variedad de formas. Aunque el Terminal C del grupo funcional Fc se puede ligar directamente al Terminal N del grupo funcional IFN-\beta por vía de un enlace péptido, la invención incluye adicionalmente conectar el grupo funcional Fc y el grupo funcional IFN-\beta a través de un péptido ligador. El péptido ligador se ubica entre el Terminal C del grupo funcional Fc y el Terminal N del grupo funcional IFN-\beta maduro. La invención también incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido ligador. El péptido ligador está compuesto preferiblemente de residuos de serina y glicina. En una realización, el ligador tiene la secuencia de aminoácido Gly_{4}SerGly_{4}SerGly_{3}SerGly (SEQ ID NO:1), aunque en aún otra realización un ácido nucleico que codifica un Fc-IFN-\beta^{sol} incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido ligador Gly_{4}SerGly_{4}SerGly_{3}SerGly (SEQ ID NO:1). Algunas secuencias de aminoácido Fc-ligador-IFN-\beta^{sol} de ejemplo de la invención se muestran en las Figs. 6-11, aunque algunas pueden ser de ácido nucleico Fc-ligador-IFN-\beta^{sol} de ejemplo de la invención se muestran en las Figs. 14-16. Por ejemplo, en una realización, la proteína Fc-ligador-IFN-\beta^{sol} es huFc#4-ligador-IFN-\beta^{sol} (C17S), en donde la región Fc es una región Fc IgG4, y el ligador es Gly_{4}SerGly_{4}SerGly_{3}SerGly (SEQ ID NO:1). La expresión de la proteína de fusión de la invención de las secuencias de nucleótido Fe-IFN-\beta^{sol} y Fc-ligador-FN-\beta^{sol}, tal como aquellas discutidas anteriormente, cuando están contenidas en un plásmido apropiado, en un sistema de cultivo celular de mamífero resultara en la producción eficiente de proteínas de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} y Fc-ligador-IFN-\beta^{sol}.

Como se menciono anteriormente, las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} de la invención demuestran propiedades biológicamente mejoradas sobre las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta no alteradas. Por ejemplo, se ha encontrado que las propiedades de plegamiento exhibidas del Fc\beta4h-IFN-\beta^{sol} (C17S) humano que son diferentes de, y sobre, la proteína de fusión padre Fc\beta4-IFN-\beta^{sol} y Fc\beta4h-IFN-\beta^{sol}. En particular; como se demuestra en la Fig. 2, se ha encontrado que una especie predominantemente única de la proteína de de fusión humana Fc\beta4h-IFN-\beta^{sol} (C17S) 3, 4 se ve cuando se expresa en células de cultivo de tejido de mamífero, como se comprueba por análisis de gel SDS-PAGE sin reducción. Estas especies corresponden a la proteína de fusión Fc\beta4-IFN-\beta^{sol} plegadas correctamente 3, 4. En contraste, para la molécula padre Fc\beta4-IFN-\beta^{sol}1 y para Fc\beta4h-IFN-\beta^{sol}2, se observan muchas especies de alto peso molecular, como se evidencian por un ensayo no resuelto de proteínas de alto peso molecular en un gel SDS-PAGE de reducción 1, 2. En un sistema de gel SDS-PAGE de reducción, se resuelve este ensayo a un grado significativo dentro de una única banda para Fc\beta4-IFN-\beta^{sol}5 humano y Fc\beta4h-IFN-\beta^{sol}6, lo que sugiere que la agregación fue bastante controlada por la presencia de enlaces de disulfuro covalentes. Por lo tanto, la introducción del único punto de mutación C17S en la proteína de fusión Fc\beta4h-IFN-\beta^{sol} humana 7 se almacena nuevamente en forma apropiada plegando la proteína 7.

Más aún, se ha encontrado por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), que, aunque la proteína no agregada de la molécula padre no se puede obtener, por lo menos el 10% de la Fc-IFN-\beta^{sol} (C17S) no se agrega después de la purificación con Proteína A. Por lo tanto, la introducción de una mutación de único punto C17S en la proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} facilita la producción de material no agregado. Adicionalmente la introducción de un péptido ligador en la unión entre la región Fc el grupo funcional IFN-\beta resulta en un incremento aproximado de dos veces en el rendimiento de un material no agregado sobre el Fc-IFN-\beta^{sol} (C17S) sin el ligador. La expresión de, por ejemplo, una secuencia de nucleótido que codifica la proteína de fusión Fc-ligador-IFN-\beta^{sol} (C17S F50H H131A H140A) en donde en donde el ligador es Gly_{4}SerGly_{4}SerGly_{3}SerGly (SEQ ID NO:1), como se muestran en las Figs. 19-1 a 19-3, contenidas en un plásmido apropiado, en un sistema de cultivo celular de mamífero resultado en la producción eficiente de la proteína de fusión Fc-ligador-IFN-\beta^{sol} (C17S F50H H131A H140A). Se ha encontrado que este producto de proteína de fusión contiene aproximadamente 50% de material no agregado después de la purificación por Proteína A, como evalúa por SEC analítico, que representa una mejora adicional considerable sobre los resultados obtenidos con la proteína Fc-IFN-\beta^{sol} que contiene un única mutación de punto en IFN-\beta, Fc-ligador-IFN-\beta^{sol} (C17S). Un incremento adicional similar en las características de expresión se puede ver con la proteína Fc-IFN-\beta^{sol} Fc-ligador-IFN-\beta^{sol} (C17S L57A H131A H140T).

Como se mencionó previamente, la invención proporciona secuencias de ácido nucleico codificante y secuencias de aminoácidos que definen proteínas de fusión que incluyen una región de Fc de inmunoglobulina y por lo menos una proteína objetivo, denominada aquí como IFN-\beta o variantes de las mismas. Tres realizaciones de ejemplo de construcciones de proteínas que incorporan la invención se ilustra en los dibujos como Figs. 1A-1C. debido a que se prefieren construcciones diméricas, todas se ilustran como dímeros reticulados por un par de enlaces de disulfuro entre cisteínas en las subunidades adyacentes. En los dibujos, en los enlaces de disulfuro 11, 12 se describen por ligar las dos regiones Fc de cadena pesada de inmunoglobulina 1, 1' a través de una región de pivote de inmunoglobulina dentro de cada cadena pesada, y así son características de las formas naturales de estas moléculas. Aunque las construcciones que incluyen la región de pivote del Fc se prefieren y se han mostrado promisorios como agente terapéuticos, la invención contempla que la reticulación en otras posiciones se puede seleccionar según se desee. Adicionalmente, bajo algunas circunstancias, los dímeros o multímeros útiles en la práctica de la invención se pueden producir mediante asociación no covalente, por ejemplo, mediante interacción hidrófoba. Debido a que las construcciones homodiméricas son realizaciones importantes de la invención, los dibujos ilustran tales construcciones. Se debe apreciar, sin embargo, que las estructuras heterodiméricas también son útiles en la práctica de la invención.

Fig. 1A ilustra una construcción dimérica, también denominada una "unidad dímero", producido de acuerdo con los principios establecidos aquí (ver, por ejemplo, Ejemplo 1). Cada monómero del homodímero incluye una región de Fc de inmunoglobulina 1 que incluye una región de pivote, un dominio CH2 y un dominio CH3. Unido directamente, es decir, vía de un enlace polipéptido, al terminal C de la región Fc que es IFN-\beta^{sol}2. Se debe entender que la región Fc se puede unir a la proteína IFN-\beta^{sol} por vía un ligador polipéptido (no mostrado).

La Figs. 1B y 1C describen construcciones de proteína de la invención que incluyen como proteína objetivo una pluralidad de proteínas IFN-\beta dispuestas en tándem y y conectadas por un ligador. En la Fig. 1B, la proteína objetivo incluye IFN-\beta2 de longitud completa, un polipéptido ligador hecho de residuos glicina y serina 4, y una variante activa de IFN-\beta3. Esta construcción se puede describir por la fórmula Fc-X-X en donde las X representan diferentes proteínas objetivo. La Fig. 1C difiere de la construcción de la Fig. 1B en que el dominio de la proteína de terminal C incluye una segunda copia de terminal de longitud completa del IFN-\beta2. Esta construcción se puede describir por la fórmula Fc-X-X, en donde las X representan proteínas objetivos idénticas. Aunque las Figs. 1A-1C representan construcciones Fc-X, donde X es la proteína objetivo, se contempla que las proteínas útiles de la invención también se pueden describir por la fórmula X-Fc-X, en donde las X pueden representar las mismas o diferentes proteínas objetivo.

Como se muestran en las Figs. 1B y 1C, la proteína de fusión puede incluir una segunda proteína objetivo (Fc-X-X). Por ejemplo, en adición a una proteína de fusión que tiene una primera proteína objetivo IFN-\beta, la proteína de fusión también puede incluir una segunda variante madura, de longitud completa IFN-\beta o una variante IFN-\beta^{sol} activa o su fragmento bioactivo. En un aspecto, la variante activa es una variante en la que uno o más residuos de aminoácidos en el grupo IFN-\beta se sustituye por otro residuo de aminoácido. Se discute previamente varias variantes de sustitución IFN-\beta. Por ejemplo, una cisteína en la posición 17, que corresponde al IFN-\beta maduro natural se puede reemplazar con una serina, una valina, una alanina o una metionina. En este tipo de construcción, las primeras y las segundas proteínas pueden ser la misma proteína, como en, por ejemplo, la Fig. 1C, o pueden ser diferentes proteínas, como en, por ejemplo, la Fig. 1B. Las primeras y la segundas proteínas se pueden ligar, ya sea directamente o por medio de un ligador polipéptido. Alternativamente, se pueden ligar ambas proteínas directamente o por vía de un ligador de polipéptido, a la región Fc de inmunoglobulina. En una realización adicional, la primera proteína se puede conectar a la terminal N de la región Fc de inmunoglobulina y la segunda proteína se puede conectar al terminal C de la región Fc de inmunoglobulina.

En una realización, se pueden ligar dos proteínas de fusión para formar dímeros. Las dos proteínas de fusión se pueden asociar, covalentemente, por ejemplo, mediante un enlace de disulfuro, un enlace de polipéptido o un agente de reticulación, o no covalentemente, para producir una proteína dimérica. En una realización preferida, las dos proteínas de fusión se asocian covalentemente por medio de por lo menos uno y más preferiblemente dos enlaces de dilsufuro intracadena a través de residuos cisteína, ubicados preferiblemente dentro de regiones de pivote de inmunoglobulina dispuestos dentro de las regiones Fc de inmunoglobulina de cada cadena.

Otras realizaciones de la invención incluyen formas multivalentes y multiméricas de proteínas de fusión IFN-\beta y sus combinaciones.

Como utiliza aquí, el término "multivalente" se refiere a una molécula recombinante que incorpora dos o más segmentos biológicamente activos. Los fragmentos de proteína que forman la molécula multivalente se pueden ligar opcionalmente a través de un ligador polipéptido que une las partes constituyentes y permite que cada una funcione independientemente.

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Como utiliza aquí, el término "bivalente" se refiere a una molécula recombinante multivalente que tiene la configuración Fc-X, donde X es una proteína IFN-\beta. Las dos proteínas se pueden ligar a través de un ligador péptido. Las construcciones del tipo mostrado pueden incrementar la afinidad de unión evidente entre la proteína y su receptor.

Como utiliza aquí, el término "multímerico" se refiere a la asociación estable de dos o más cadenas de polipéptido covalentemente, por ejemplo, por medio de una interacción covalente, por ejemplo, un enlace de disulfuro, o no covalentemente, por ejemplo, mediante interacción hidrófoba. El término multímero está destinado abarcar homomultímeros, en donde las subunidades son las mismas, así como también, heteromultímeros, en donde las subunidades son diferentes.

Como utiliza aquí, el término "dimérico" se refiere a una molécula multimérica especifica en donde dos cadenas de polipéptido se asocian establemente a través de interacciones covalentes o no covalentes. Tales construcciones se muestran esquemáticamente en Fig. 1A. se debe entender que la región Fc de inmunoglobulina que incluyen por lo menos una porción de la región de pivote, un dominio CH2 y un dominio CH3, forma típicamente un dímero. Los ligandos de proteína principal se conocen por unirse a sus receptores como un dímero. Si un ligando de proteína X se dimeriza naturalmente, el grupo funcional X en una molécula Fc-X se dimerizará a un grado mucho mayor, en razón a que el proceso de dimerización es dependiente de la concentración. La proximidad física de los dos grupos funcional es X conectados por Fc harían de la dimerización un proceso intramolecular, cambiando principalmente el equilibrio a favor del dímero y mejorando su unión al receptor.

Como utiliza aquí, el término "ligador de polipéptido" se entiende que significa una secuencia de polipéptido que puede ligar dos proteínas que en la naturaleza no se ligan naturalmente. El polipéptido ligador incluye preferiblemente una pluralidad de aminoácidos tal como alanina, glicina y serina o combinaciones de tales aminoácidos. Preferiblemente, el polipéptido ligador incluye a series de péptidos glicina y serina alrededor de 10-15 residuos de longitud. Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense Nos. 5,258,698 y 5,908,626. Un polipéptido ligador preferido de la invención es Gly_{4}SerGly_{4}SerGly_{3}SerGly (SEQ ID NO:1). Sin embargo, se contempla, que la longitud del ligador óptimo y la com-
posición de aminoácido se puede determinar por métodos de experimentación de rutina bien conocidos en la técnica.

Como utiliza aquí, el término "interferón-" o "IFN-\beta" se entiende que significa no solo el interferón-\beta maduro de longitud completa, por ejemplo, IFN-\beta humano, sino también los homólogos, variantes y fragmentos bioactivos o porciones de los mismos. Las secuencias conocidas de IFN-\beta se pueden encontrar en GenBank. El término "interferón-\beta" o "IFN-\beta" también incluye IFN-\beta y proteínas similares a IFN-\beta, grupos funcional es y moléculas así como también IFN-\beta que se produce de manera recombinante o se sintetiza artificialmente.

El término "fragmentos bioactivo" o porciones se refiera a cualquier fragmento de proteína IFN-\beta que tiene por lo menos 5%, más preferiblemente por lo menos 10%, y más preferiblemente por lo menos 20% y óptimamente por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de actividad biológica de la proteína IFN-\beta humano de plantilla de la SEQ ID NO:2, determinada utilizando el ensayo de actividad o ensayo de inhibición de crecimiento celular, como se describe en los ejemplos 6 y 7. El término "variantes" incluye variantes alélicas de especie, así como también otras variantes de ocurrencia natural o no natural, por ejemplo, generadas por protocolos de ingeniería genética, que son por lo menos 70% similares o 60% idénticos, más preferiblemente por lo menos 75% similar o 65% idéntico, y más preferiblemente por lo menos 80% similar o 70% idéntico a la proteína humana IFN-\beta madura en la SEQ ID NO:2.

A fin de determinar si un polipéptido candidato tiene la identidad o porcentaje de similitud requisito con un polipéptido de referencia, la secuencia de aminoácido candidata y la secuencia de aminoácido de referencia se alinean primero utilizando el algoritmo de programación dinámico descrito en Smith y Waterman (1981) J. MOL. BIOL. 147:195-197, en combinación con la matriz de sustitución BLOSUM62 descrita en la Fig. 2 de Henikoff y Henikoff (1992), "Amino acid substitution matrix from protein blocks", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:10915-10919. Para la presente invención, un valor apropiado para la penalidad de inserción de espacio es -12, y un valor apropiado para la penalidad de extensión de espacio es -4. las alineaciones de desempeño de programas de computador que utilizan el algoritmo Smith-Waterman y la matriz BLOSUM62, tal como la suite de programas GCG (Oxparad Molecular Group, Oxparad, Inglaterra), están disponibles comercialmente y se utilizan ampliamente por aquellos expertos en la técnica.

Una vez se hace la alineación entre la secuencia de referencia y candidata, se puede calcular un porcentaje de clasificación de similitud. Los aminoácidos individuales de cada secuencia se comparan secuencialmente de acuerdo con su similitud uno al otro. Si el valor de la matriz BLOSUM62 que corresponde a los dos aminoácidos alineados es cero o un número negativo, la clasificación de similitud en forma de pares es cero; de otra forma, la clasificación de similitud en forma de pares es 1.0. La clasificación de similitud bruta es la suma de las clasificaciones de similitud en forma de pares de los aminoácidos alineados. La clasificación bruta se normaliza luego al dividirla por el número de aminoácidos en las secuencias candidato o de referencia más pequeñas. La clasificación bruta normalizada es porcentaje de similitud. Alternativamente, para calcular un porcentaje de identidad, los aminoácidos alineados de cada secuencia se comparan de nuevo secuencialmente. Si los aminoácidos no son idénticos, la clasificación de identidad en forma de pares es cero; de otra forma la clasificación de identidad en forma de pares es 1.0. La clasificación de identidad bruta es la suma de los aminoácidos alineados idénticos. En la clasificación bruta se normaliza luego al dividirla por el numero de aminoácidos en las secuencias candidato de referencia más pequeñas. La clasificación bruta normalizada es el porcentaje de identidad. Se ignoran las inserciones y eliminaciones para los propósitos de calcular el porcentaje de similitud de identidad. De acuerdo con lo anterior, no se utilizan penalidades de espacio en este cálculo, aunque ellas utilizan en la alineación inicial.

También se pueden incluir otras proteínas mutantes IFN-\beta variantes que tienen actividad similar a IFN-\beta. Las variantes alélicas y de especie, que incluye, pero no se limitan a secuencias IFN-\beta humanas y de ratón. Las proteínas IFN-\beta maduras humanas y de ratón se describen en la SEQ ID NOs.:2 y 11, y en las Figs. 3 y 12 respectiva-
mente.

Adicionalmente, la secuencia IFN-\beta puede incluir una porción o todo de la secuencia consesus establecida en la SEQ ID NO:2, en donde el IFN-\beta tiene por lo menos 5%, preferiblemente por lo menos 10%, más preferiblemente por lo menos 20%, 30% o 40%, más preferiblemente por lo menos 50%, y óptimamente 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de la actividad biológica del IFN-\beta humano maduro de la SEQ ID NO:2, como se determina utilizando el ensayo de actividad antivírica o el ensayo de inhibición de crecimiento celular de los Ejemplos 6 y 7.

La estructura tridimensional del IFN-\beta se ha resuelto por cristalografía de rayos X- (Karpusas et al, 1997, PNAS 94: 11813). Aunque en el estado cristalizado, la molécula IFN-\beta es un dímero con un ión de zinc en la interfaz de dímero, considera que el IFN-\beta no necesita ser un dímero con el fin de ser activo. Estructuralmente el IFN-\beta contiene un segmento alfa-helicoidal adicional con respecto a las proteínas de manojo de cuatro hélices clásicas, que se forma dentro del bucle C-D, de tal manera que se forma la estructura de manojo por las hélices A, B, C y E. de manera interesante, la estructura también revela una porción del grupo funcional glicano que se acopla al aminoácido N80 al inicio de la hélice C y se ordena junto con una porción de la proteína, protege más probablemente algunos de los residuos de aminoácidos hidrófobos expuestos a la superficie del disolvente. Se ha mostrado que la glucosilación del IFN-\beta es importante para la estabilidad y solubilidad de la molécula, y así puede explicar la propensión de la molécula no glucosilada IFN-\beta a agregarse. La cisteína libre en la posición 17 en la hélice A parece próxima a la superficie pero enterrado, y, sin desear estar limitado por la teoría, es posible que los enlaces de disulfuro mezclados puedan a su vez evitar la glucosilación correcta de la proteína.

La dimerización de un ligando puede incrementar la evidente afinidad de unión entre el ligando y su receptor. Por ejemplo, si un grupo funcional interferón-beta de una proteína de fusión Fc-interferón-beta se puede unir a un receptor sobre una célula con una cierta afinidad, el segundo grupo funcional interferón-beta de la misma proteína de fusión Fc-Interferón-beta se puede unir a un segundo receptor en la misma célula con una avidez mucho mayor (afinidad evidente). Esto puede ocurrir debido a la proximidad física del segundo grupo funcional interferón-beta del receptor después de que el primer grupo funcional interferón-beta ya se ha unido. En el caso de una unión de anticuerpo a un antígeno, la afinidad de evidente se puede incrementar por lo menos diez mil veces, es decir, 104. Cada subunidad de proteína, es decir, "X", tiene su propia función independiente de tal manera que en una molécula multivalente, las funciones de las subunidades de proteína pueden ser aditivas o sinérgicas. Así, la fusión de la molécula Fc normalmente dimérica para el interferón-beta puede incrementar la actividad del interferón-beta. De acuerdo con lo anterior, las construcciones de tipo mostrados en la Fig. 1A pueden incrementar la evidente afinidad de unión entre el interferón-beta y su receptor.

Grupo Funcional Fc

Las proteínas de fusión IFN-\beta descritas aquí se expresan como proteínas de fusión con una región Fc de una inmunoglobulina. Como se sabe, cada región constante de cadena pesada de inmunoglobulina incluye cuatro o cinco dominios. Los dominios se denominan secuencialmente como sigue: CH1-pivote-CH2-CH3(-CH4). Las secuencias de ADN de los dominios de cadena pesada tienen homología cruzada entre las clases de inmunoglobulina, por ejemplo, el dominio CH2 del IgG es homologo al dominio CH2 del IgA e IgD, y al dominio CH3 del IgM e IgE.

Como utiliza aquí, el término, "región Fc de inmunoglobulina" se entiende que significa la porción de Terminal carboxilo de una región constante de cadena de inmunoglobulina, preferiblemente una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, o una porción de la misma. Por ejemplo, una región Fc de inmunoglobulina puede incluir 1) un dominio CH2 2) un dominio CH3, 3) un dominio CH4 4) un dominio CH2 y un dominio CH3, 5) un dominio CH2 y a CH4, 6) un dominio CH3 y un dominio CH4 o 7) una combinación de una región de pivote de inmunoglobulina y/o un dominio CH2 y/o un dominio CH3 y/o un dominio CH4. En una realización, la región Fc de inmunoglobulina incluye por lo menos una región de pivote de inmunoglobulina, aunque en otra realización la región Fc de inmunoglobulina incluye por lo menos una región pesada constante de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio CH2 o un dominio CH3, y dependiendo del tipo de inmunoglobulina utilizada para generar la región Fc, opcionalmente un dominio CH4. En otra realización, la región Fc incluye una región de pivote, un dominio CH2 y un dominio CH3, y preferiblemente carece del dominio CH1, aunque en otra realización, la región Fc incluye una región de pivote y un dominio CH2. En aun otra realización, la región Fc incluye una región de pivote y un dominio CH3. En una realización adicional, la región Fc contiene un sitio de unión funcional para el receptor de protección Fc, FcRp. El sitio de unión del FcRp incluye aminoácidos en los dominios CH2 y CH3 y la interacción Fc-FcRp contribuye significativamente a la vida útil extendida del suero de las proteínas de fusión Fc.

Aunque las regiones Fc de inmunoglobulina y el componente de dominios pesados constantes pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, una clase preferida de inmunoglobulina para las proteína s de fusión Fc-IFN-\beta de la invención es IgG (Ig\beta) (\beta subclases 1, 2, 3, o 4). Las secuencias de aminoácido y de nucleótidos del Fc-\beta1 humano se establecen en la SEQ ID NOs: 78 y 79. Otras clases de inmunoglobulina IgA (Ig\beta), IgD (Ig\beta), IgE (Ig\beta) e IgM (Igm), también se pueden utilizar. La elección de regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina se discute en detalle en la Patente Estadounidense Nos. 5,541,087, y 5,726,044. La elección de secuencias de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina particulares de ciertas clases de inmunoglobulina y las subclases para alcanzar un resultado particular se considera que están dentro del nivel del experto en la técnica. La porción de construcción de ADN que codifica la región Fc de inmunoglobulina incluye por lo menos una porción de un dominio de pivote, y preferiblemente por lo menos una porción de un dominio CH3 del Fc-\beta o los dominios homólogos de cualquier IgA, IgD, IgE, o IgM.

Se contempla que la región Fc utilizada en la generación de las proteínas de fusión que contienen las variantes IFN-\beta se pueden adaptar a la aplicación especifica de la molécula. En una realización, la región Fc se deriva de un isotipo de inmunoglobulina \beta1 o sus variantes. El uso del Fc\beta1 humano, la secuencia de región Fc tiene varias ventajas. Por ejemplo, una región Fc derivada de un isotipo de inmunoglobulina \beta1 se puede utilizar cuando se desea objetivar la proteína de fusión al hígado. Adicionalmente, si la proteína de fusión Fc se utiliza como un biofarmacéutico, el dominio Fc\beta1 puede conferir actividad de función efectora a la proteína de fusión. Los activos de función efectora incluyen los activos biológicos tales como transferencia placentaria e incremento de la vida útil de suero. La región Fc de inmunoglobulina también proporciona la detección por detección mediante ELISA anti-Fc y la purificación a trabes de la unión a la proteína A Staphylococcus aureus ("Proteína A"). En ciertas aplicaciones, sin embargo, puede ser deseable eliminar las funciones efectoras específicas de la región Fc de inmunoglobulina, tal como fijación completa y/o unión al receptor Fc. Cuando se utiliza una región Fc derivada de inmunoglobulina \beta1, una lisina en el Terminal carboxi de la región Fc de inmunoglobulina se remplaza típicamente con una alanina. Esto mejora la vida útil circulante de la proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{sol}.

Otras realizaciones de las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} utilizan regiones Fc derivadas de un isotipo de inmunoglobulina \beta diferente. Es decir \beta2, \beta3, o \beta4, o variantes de las mismas. La región Fc puede incluir una región de pivote derivada de un isotipo de inmunoglobulina diferente al de la región Fc en sí misma. Por ejemplo, algunas realizaciones de las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} contienen una región de pivote derivada de una inmunoglobulina \beta1 o una variante de la misma. Por ejemplo, la región de inmunoglobulina Fc se puede derivar de un isotipo de inmunoglobulina \beta2 e incluyen una región de pivote derivada de un isotipo de inmunoglobulina \beta1 o una variante de la misma. En una realización, un residuo cisteína del pivote \beta1 se modifica. En una realización adicional, la primer cisteína del pivote \beta1 se modifica. En todavía otra realización, se sustituye una serina en lugar de la primer cisteína de la articulación \beta1. Debido a que el isotipo \beta2 de inmunoglobulina no es efectivo en mediar las funciones efectoras y presenta una unión muy reducida al receptor Fc\beta (Fc\betaR), se puede esperar que está configuración particular de la variante de fusión IFN-\beta imite más cercanamente la actividad biológica de la molécula IFN-\beta libre y en adición tiene la mejor vida útil circulante cuando se administra a un mamífero. Solo con el \beta1, es preferible mutar la lisina del Terminal carboxi de la región Fc a alanina con el fin de mejorar la vida útil circulante de la proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{sol}.

Como se estableció previamente, la región Fc de las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} de la invención se pueden derivar de un isotipo inmunoglobulina\beta4. En algunas realizaciones de la invención, un isotipo de inmunoglobulina\beta4 se modifica para contener una región de pivote derivada de un isotipo de inmunoglobulina\beta1 o una variante de la misma. En una realización, un residuo cisteína del pivote\beta1 se modifica. En una realización adicional se modifica la primer cisteína del pivote\beta1. En aún otra realización se sustituye una serina en lugar de la primer cisteína del pivote \beta1. Similar a los isotipos de inmunoglobulina\beta2, los isotipos de inmunoglobulina\beta4 también exhiben menor afinidad hacia Fc\betaR y así ofrecen similares ventajas en la reducción de las funciones efectoras. Cuando se utiliza una región Fc región derivada de \beta1, 2, 3 o 4, una lisina en el Terminal carboxi de la región Fc de inmunoglobulina se reemplaza típicamente con una alanina. La inmunoglobulina\beta4 es una región Fc preferida para elaborar las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta^{sol}en donde el grupo funcional IFN-\beta incluye alteraciones a uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones 17, 50, 57, 130, 131, 136 y/o 140. Una secuencia de aminoácido de ejemplo de una proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} de la presente invención que incluye una región Fc del isotipo de inmunoglobulina\beta4 modificada para contener una región de pivote derivada de una inmunoglobulina\beta1 que se muestran en las Fig. 5 (SEQ ID NO:4).

Dependiendo de la aplicación, los genes de región constante de las especies diferentes a la humana, por ejemplo, ratón o tata, se pueden utilizar. La región Fc de inmunoglobulina utilizada como una función padre de la construcción de ADN puede ser generalmente de cualquier especie de mamífero. Cuando es indeseable provocar una respuesta inmune en la célula anfitrión o animal contra la región Fc, La región Fc se puede derivar de la misma especie que la célula anfitriona o animal. Por ejemplo, se puede utilizar una región Fc de inmunoglobulina cuando el animal anfitrión o célula será un ratón.

Las secuencias de ácido nucleico modificantes, y las secuencias de aminoácidos que definen una región Fc de inmunoglobulina humana útiles en la práctica de la invención se estableces en SEQ ID NO:78 y SEQ ID NO:79 respectivamente. Sin embargo se contempla que otras secuencias de región Fc de inmunoglobulinas útiles en la práctica de la invención se pueden encontrar, por ejemplo, por aquellas codificadas por las secuencias de nucleótido de la región de contraste de cadena pesada que incluye la secuencia de región Fc como se describe en las bases de datos Genbank y/o EMBL, por ejemplo, AF045536.1 (Macaca fuscicularis, secuencia de nucleótido SEQ ID NO:20; secuencia de aminoácido SEQ ID NO:21), AF045537.1 (Macaca mulata, secuencia de nucleótido SEQ ID NO:22; secuencia de aminoácido SEQ ID NO:23), AB016710 (Felis catus, secuencia de nucleótido SEQ ID NO:24; secuencia de aminoácido SEQ ID NO:25), K00752 (Oryctolagus cuniculus, secuencia de nucleótido SEQ ID NO:26; secuencia de aminoácido SEQ ID NO:27), U03780 (Sus scrofa, secuencia de nucleótido SEQ ID NO:28; secuencia de aminoácido SEQID NO:29), Z48947 (Camelus dromedaries, secuencia de nucleótido SEQID NO:30), (Bos taurus, secuencia de nucleótido SEQ ID NO:31; secuencia de aminoácido SEQ ID NO:32), L07789 (Mustela vison, secuencia de nucleótido SEQ ID NO:33; secuencia de aminoácido SEQ ID NO:34), X69797 (Ovis aries, secuencia de nucleótido SEQ ID NO:35; secuencia de aminoácido SEQ ID NO:36), U17166 (Cricetulus migratorius, secuencia de nucleótido SEQ ID NO:37; secuencia de aminoácido SEQ ID NO:38), X07189 (Rattus rattus, secuencia de nucleótido SEQ ID NO:39; secuencia de aminoácido SEQ ID NO:40), AF157619.1 (Trichosurus vulpecula, secuencia de nucleótido SEQ ID NO:41; secuencia de aminoácido SEQ ID NO:42), o AF035195 (Monodelphis domestica, secuencia de nucleótido SEQ ID NO:43; secuencia de aminoácido SEQ ID NO:44).

Adicionalmente, se contempla que la sustitución o eliminación de aminoácidos dentro de las regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina pueden ser útiles en la práctica de la invención. Un ejemplo puede incluir introducir sustituciones de aminoácido en la región CH2 superior para crear una variante Fc con afinidad reducida de receptores Fc (Cole et al. (1997) J. Inmunol. 159:3613). Un experto en la técnica puede preparar tales construcciones utilizando técnicas de biología molecular bien conocidas.

Se entiende que la presente invención explota las metodologías de ADN recombinante convencionales para generar las proteínas de fusión Fc utilices en la práctica de la invención. Las construcciones de fusión Fc se generan preferiblemente en el nivel de ADN, y el ADN resultante integrado en los vectores de expresión, y expresado para producir las proteínas de fusión de la invención.

Como se utiliza aquí, el término "vector" se entiende que significa cualquier ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos competente para ser incorporada en una célula anfitriona y ser recombinado con e integrado en el genoma de la célula anfitriona, o para replicar autónomamente como un episoma. Tales vectores incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidos, fagémidos, comidos, vectores de ARN, vectores víricos y similares. Ejemplos no limitantes de un vector vírico incluyen un retrovirus, un adenovirus y un virus adenoasociado. Como se utiliza aquí, el término "expresión génica" o "expresión" de una proteína objetivo, se entiende que significa la transcripción de una secuencia de ADN, la conversión de un trascrito de Marn, y la secreción de un producto de proteína de fusión
Fc.

Un vector de expresión útil es pdCs (Lo et al. (1988) Protein Engineering 11:495), en la que la transcripción del gen Fc-X utiliza el mejorador/promotor del citomegalovirus y la señal de poliadenilacion SV40. La secuencia promotora y mejoradora del citomegalovirus humano utilizada se deriva de los nucleótidos -601 a +7 de la secuencia suministrada en Boshart et al. (1985) Cell 41:521. El vector también contiene el gen de reductasa dihidrofolato mutante como un marcador de selección (Simonsen y Levinson (1983) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:2495).

Una célula anfitriona apropiada se puede transformar o transfectar con una secuencia de ADN de la invención, y es utilizada para la expresión y/o secreción de una proteína objetivo. Actualmente se prefieren células anfitrionas para uso en la invención e incluyen células de hibridoma inmortales, células de mieloma NS/0, células 293, células de ovario de hámster chino, Células HeLa, y Células COS.

Un sistema de expresión que se ha utilizado para producir altos niveles de expresión de proteína de fusión en células de mamífero es una construcción de ADN que codifica, en la dirección 5' a 3' dirección, un casete de secreción, que incluye una secuencia de señal y una región Fc de inmunoglobulina, y una proteína objetivo tal con IFN-\beta. Varias proteínas objetivo se han expresado exitosamente en tal un sistema e incluyen, por ejemplo, IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, \betaIG-H3, Receptor IgE, PSMA, y gp120. Estas construcciones de expresión se describen en las Patente Estadounidense Nos. 5,541,087 y 5,726,044 otorgadas a Lo et al.

Las proteínas de fusión de la invención pueden o no incluir una secuencia de señal cuando se expresan. Como se utiliza aquí, el término "secuencia de señal" se entiende que significa un segmento que dirige la secreción de la proteína de fusión IFN-\beta y después se divide luego de la conversión en la célula anfitriona. La secuencia de señal de la invención es un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que inician el transporte de una proteína a través de la membrana del retículo endoplasmático. La secuencia de señal que son útiles en la invención incluyen secuencias de señal de cadena liviana de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo 14.18 (Gillies et al. (1989) J. Inmunol. Meth. 125:191), anticuerpo de secuencia de señal de cadena pesada, por ejemplo, las secuencia de señal de cadena pesada de anticuerpo MOPC141 (Sakano et al. (1980) Nature 286:5774), y cualquier otra secuencia de señal que se conozca en la técnica (ver, por ejemplo., Watson (1984) Nucleic Acids Research 12:5145).

Las secuencias de señal que se han caracterizado bien en la técnica y se conocen típicamente contienen 16 a 30 residuos de aminoácido, y pueden contener más o menos residuos de aminoácidos. Un péptido señal típico consiste de tres regiones: una región de Terminal N básica, una región hidrófoba central, y una región de terminal C más polar. La región hidrófoba central contiene 4 a 12 residuos hidrófobos que anclan la péptida señal a través de la bicapa del lípido de membrana durante el transporte del polipéptido naciente. Luego de la iniciación, el péptido señal se divide usualmente dentro del lumen del retículo endoplásmico mediante enzimas celulares conocidas como peptidasas señal. Los sitios de división potencial del péptido señal generalmente siguen la "regla (-3, -1)". Así un péptido señal típico tiene residuos de aminoácido neutros, pequeños y en las posiciones -1 y -3 y le falta los residuos prolina en esta región. La peptidasa señal dividida tal un péptido señal entre los aminoácidos -1 y +1. Así, la secuencia de señal se puede dividir del terminal amino de la proteína de fusión durante la secreción. Esto resulta en la secreción de una proteína de fusión Fc que consiste de la región Fc de inmunoglobulina y una proteína objetivo. Una discusión detallada de las secuencias de péptido de señal se proporciona por von Heijne (1986) Nucleic Acids Res.
14:4683.

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Como seria evidente para el experto en la técnica, la adecuabilidad de una secuencia de señal particular para uso en el casete de expresión puede requerir alguna rutina de experimentación. Tal experimentación incluirá determinar la capacidad de la secuencia de señal para dirigir la secreción de una proteína de fusión Fc y también una determinación de la configuración optima, genómica o cADN, de la secuencia a ser utilizada con el fin de lograr la secreción eficiente de las proteínas de fusión Fc adicionalmente, un experto en la técnica es capaz de crear un péptido señal sintético siguiendo las reglas presentadas por fusión las proteínas von Heijne, de referenciadas anteriormente, y probar la eficacia de tal una secuencia de señal sintética mediante la experimentación de rutina. Una secuencia de señal también se puede denominar como un "péptido señal", "secuencia líder", o "péptido líder".

La fusión de la secuencia de señal y la región Fc de inmunoglobulina se denomina algunas veces aquí como casete de secreción. Un casete de secreción de ejemplo útil en la práctica de la presente invención es un polinucleótido codificante, en una dirección 5' a 3', una secuencia de señal de un gen de cadena liviana de inmunoglobulina y una región Fc\beta1 del gen de inmunoglobulina\beta1 humano. La región Fc\beta1 del gen Fc\beta1 de inmunoglobulina incluyen preferiblemente por lo menos una porción del dominio de pivote de inmunoglobulina y por lo menos el dominio CH3, o más preferiblemente por lo menos una porción una porción del dominio de pivote, el dominio CH2 y el dominio CH3. Como se utiliza aquí, la "porción" de la región de pivote de inmunoglobulinas se entiende que significa una porción del pivote de inmunoglobulina que contiene por lo menos uno, preferiblemente dos residuos cisteína capaces de formar enlaces de disulfuro intracadena. El ADN que codifica el casete de expresión puede estar en su configuración genómica o su configuración de cADN bajo ciertas circunstancias, puede ser ventajoso producir la región Fc de las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina Fc\beta2 humana. Aunque las fusiones Fc basadas en secuencias de inmunoglobulina \beta1 y \beta2 humanas tienen se comportan de forma similar en ratones, las fusiones Fc basadas en las secuencias \beta2 pueden presentar farmacocinéticas superior en humanos.

En otra realización, la secuencia de ADN codifica un sitio de división proteolítico interpuesto entre el casete de secreción y la proteína objetivo. El sitio de división proporciona la división proteolítica de la proteína de fusión codificada separando así el dominio Fc de la proteína objetivo. Como se utiliza aquí, "el sitio de división proteolítico" se entiende que significa secuencias de aminoácidos que se dividen preferencialmente por una enzima proteolítica u otro agente de división proteolítico. Los sitios de división proteolíticos útiles incluyen secuencias de aminoácidos que se reconocen por las enzimas proteolítica tal como tripsina, plasmita o enteroquinas K. Muchos pares de agentes de sitio de división/agentes de división (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,726,044).

Adicionalmente, la sustitución o eliminación de las construcciones de estas regiones constantes, las que uno o más residuos de aminoácidos de los dominios de región constantes se sustituyen o eliminan también sería útil. Un ejemplo sería introducir sustituciones de aminoácidos en la región CH2 superior para crear una variante Fc con afinidad reducida para los receptores Fc (Cole et al. (1997) J. Inmunol. 159: 3613). Un experto en la técnica puede preparar tales construcciones utilizando técnicas de biología molecular bien conocidas.

Las construcciones de fusión descritas aquí producen altos niveles de Fc-IFN-\beta^{sol}. Los clones iniciales producen aproximadamente 100 mg/mL de Fc-IFN-\beta^{sol} alterado, que se podría purificar hasta homogeneidad por cromatografía de afinidad de Proteína A. Los niveles de expresión se pueden incrementar frecuentemente varia veces mediante su clonación. Como se estableció anteriormente, se encuentra que cuando el IFN-\beta con cisteína en la posición 17 se reemplaza con una serina, una alanina, una valina o una metionina se expresa como molécula de fusión Fc , se obtienen altos niveles de expresión, presumiblemente debido a la sustitución de aminoácidos en la posición 17 de la proteína IFN-\beta^{sol} que evita la formación de enlaces de disulfuro aberrantes en la proteína y la región Fc actúa como un portador, ayudando al polipéptido a plegarse correctamente y a ser secretado eficientemente. De manera similar, otras proteínas de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} de la invención incluyen la mutación C17S, tal como, por ejemplo Fc-(ligador)-IFN-\beta^{sol}(C17S F50H H131A H140A) y Fc-(ligador)-IFN-\beta^{sol}(C17S L57A H131A H140T) que se expresan igualmente bien. Más aún, la región Fc también se glucosila y se carga altamente en pH fisiológico. Por lo tanto, La región Fc puede ayudar a solubilizar las proteínas hidrófobas.

Adicionalmente a los altos niveles de expresión, las proteínas Fc-IFN-\beta^{sol} exhiben mayor bioactividad que la proteína de fusión padre Fc-IFN-\beta (no modificada), según se mide en un ensayo antivírico basado en células (Ejemplo 6), y son comparables con la bioactividad de una preparación comercial de IFN-\beta obtenida de R&D Systems (Mineapolis, MN).

En adición a los altos niveles de expresión, las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta alteradas exhiben mayor vida útil de suero comparada con proteínas de fusión Fc-IFN-\beta no alteradas. Por ejemplo, la vida útil circulante del Fc-IFN-\beta^{sol} que incluye la mutación C17S se encuentra que es significativamente mayor que aquella de la proteína de fusión Fc-IFN-\beta padre (ver Ejemplo 8).

Las proteínas de fusión de la invención proporcionan varios beneficios clínicos importantes. Como se demuestran en las pruebas de ensayos biológicos en los Ejemplos 6 y 7, la actividad biológica del Fc-IFN-\beta^{sol} alterado es significativamente mayor que aquella del Fc-IFN-\beta.

Otra realización de la presente invención proporciona construcciones que tienen varias conformaciones estructurales, por ejemplo, construcciones bivalentes o multivalentes, construcciones diméricas o multiméricas y sus combinaciones. Tales conformaciones de moléculas funcionales de la invención permiten el efecto sinérgico del IFN-\beta y otras proteínas anti-víricas y anti-cáncer a ser exploradas en modelos animales.

Un aspecto importante de la invención es que las secuencias y propiedades de varias proteínas IFN-\beta y ADN codificante son bastantes similares. En el contexto de las fusiones Fc-X, las propiedades de las proteína IFN-\beta y el ADN codificante son esencialmente idénticos, de tal manera que un conjunto común de técnicas se pueden utilizar para generar cualquier fusión de ADN Fc-IFN-\beta, para expresar la fusión, para purificar la proteína de fusión, y para administrar la proteína de fusión para propósitos terapéuticos.

La presente invención también proporciona métodos para la producción de IFN-\beta de especies no humanas como proteínas de fusión Fc. Las proteínas de fusión IFN-\beta no humanas son utilices para estudios preclínicos del IFN-\beta debido a los estudios de eficacia y toxicidad de un fármaco de proteína que se debe desarrollar en sistemas de modelos animales antes de probar en seres humanos. Una proteína humana puede no trabajar en un modelo de ratón en razón a que la proteína puede provocar una respuesta inmune, y/o exhibir diferentes farmacocinéticas sesgando los resultados de prueba. Por lo tanto, la proteína de ratón equivalente es el mejor subrogado para la proteína humana para pruebas en un modelo de ratón.

La presente invención proporciona métodos para tratar varios cánceres, enfermedades víricas, otras enfermedades, afecciones relacionadas y causas de la misma al administrar el ADN, ARNA o las proteínas de la invención a un mamífero que tiene tal afección. Las condiciones relacionadas pueden incluir, pero no se limitan a esclerosis múltiple; una variedad de neoplasias, tal como leucemia mieloide aguda, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, carcinoma de célula basal, displasia cervical y osteosarcoma; una variedad de infecciones víricas que incluyen hepatitis vírica, herpes zoster y herpes genital, virus papiloma, encefalitis vírica, y neumonías citomegalovirus.

En vista de los amplios papeles jugados por el IFN-\beta en la modelación de las respuestas inmunes, la presente invención también proporciona métodos para tratar afecciones aliviadas por la administración de IFN-\beta. Estos métodos incluyen administrar a un mamífero que tiene una afección, que puede o no estar relacionado directamente con una infección vírica o cáncer, una cantidad efectiva de una composición de la invención. Por ejemplo, un ácido nucleico, tal como ADN o ARN, que codifica una proteína de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} que se puede administrar a un sujeto, preferiblemente un mamífero, como un agente terapéutico. Adicionalmente, una célula que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína de fisión Fc-IFN-\beta^{sol} se puede administrar a un sujeto, preferiblemente a un mamífero, como agente terapéutico. Adicionalmente, se puede administrar una proteína Fc-IFN-\beta^{sol} a un sujeto, preferiblemente un mamífero, como un agente terapéutico.

Las proteínas de la invención no solo son útiles como agentes terapéuticos, pero un experto en la técnica reconoce que las proteínas son útiles en la producción de anticuerpos para uso diagnóstico. De la misma manera, la administración apropiada del ADN o ARN, por ejemplo, en un vector u otro sistema de suministro para tales usos, se incluyen en los métodos de uso de la invención.

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar mediante cualquier ruta que sea compatible con las moléculas particulares. Se contempla que la composición de la presente invención se puede suministrar a un mamífero mediante cualquier medio adecuado, directamente (por ejemplo, localmente, como por inyección, implantación o administración tópica a un lugar del tejido) o sistémicamente (por ejemplo, parenteralmente u oralmente). Cuando la composición se proporciona parenteralmente, tal como mediante administración intravenosa, subcutánea, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracraneal, intraspinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intranasal o por administración de aerosol, la composición incluye preferiblemente parte de una suspensión o solución de fluido acuosa o fisiológicamente compatible. Así, el portador o vehículo es fisiológicamente aceptable de tal manera que en adición al suministro de la composición deseada al paciente, no afecta adversamente o de otra forma el balance de volumen y/o electrolitos del paciente. El medio de fluido para el agente puede así incluir solución salina fisiológica normal.

Las construcciones de ADN (o construcciones de gen) de la invención también se pueden utilizar como una parte de un protocolo de terapia de gen para suministrar ácidos nucleicos que codifican IFN-\beta o una construcción de proteína de fusión de la misma. La invención caracteriza vectores de expresión para transfección in vivo y la expresión del IFN-\beta o una construcción de proteína de fusión de la misma en tipos de células particulares con el fin de reconstituir o complementar la función del IFN-\beta. Las construcciones de expresión de IFN-\beta, o construcciones de proteína de fusión de la misma, se pueden administrar en cualquier portador biológicamente efectivo, por ejemplo cualquier formulación o composición capaz de suministrar efectivamente la construcción de proteína de fusión o gen IFN-\beta de la misma a las células in vivo. Los métodos incluyen la inserción del gen objeto en los vectores víricos que incluyen retovirus recombinante, adenovirus, virus adeno-asociados, y virus herpes simplex 1, o plásmidos eucarióticos o bacterianos recombinantes. Las dosificaciones preferidas por administración de ácidos nucleicos que codifica las proteínas de fusión de la invención están dentro del rango de 1 mg/m^{2} a 100 mg/m^{2}, más preferiblemente 20 mg/m^{2} a 10 mg/m^{2}, y más preferiblemente 400 mg/m^{2} a 4 mg/m^{2}. Se contempla que la dosificación óptima y el modo de administración se pueden determinar mediante la experimentación de rutina que está dentro del nivel de experticia del técnico.

Las dosificaciones preferidas de la proteína de fusión por administración están dentro del rango de 0.1 mg/m^{2}-100 mg/m^{2}, más preferiblemente, 1 mg/m^{2}-20 mg/m^{2}, y más preferiblemente 2 mg/m^{2}-6 mg/m^{2}. Se contempla que la dosificación óptima, sin embargo, también depende de la enfermedad que se trata y de la existencia de efectos colaterales. Sin embargo, se pueden determinar dosificaciones óptimas utilizando la experimentación de rutina. La administración de la proteína de fusión puede ser mediante inyecciones de bolo periódico, o mediante administración intravenosa o intraperitoneal continua de un reservorio externo (por ejemplo, de una bolsa intravenosa) o interna (por ejemplo, de un implante bioreaccionable). Adicionalmente, se contempla que las proteínas de fusión de la invención también se pueden administrar al receptor destinado junto con una pluralidad de moléculas biológicamente activas diferentes. Se contempla, sin embargo, que la combinación optima de la proteína de fusión y otras moléculas, modos de administración, dosificaciones se pueden determinar por experimentación de rutina bien dentro del nivel del experto en la técnica. La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

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Ejemplos Ejemplo 1 Clonación de mutantes huFc-huInterferón-BETA (huFc-IFN-\beta) y huFc-IFN-\beta^{sol}

Se ordena cADN de interferón-\beta humano (IFN-\beta) del American Type Culture Collection (Número ATCC 31903). La secuencia para la forma madura se amplifica por Reacciones de Cadena Polimerasa (PCR). El cebador delantero utilizado en las reacciones de amplificación 5' C CCG GGT ATG AGC TAC VAC TTG CTT (SEQ ID NO:45), en donde la secuencia CCCGGGT codifica el terminal carboxi del CH3 sin el codón lisina, así como también el sitio de restricción endonucleasa SmaI CCCGGG (Lo et al., Protein Engineering (1998) 11:495), y la secuencia en negrilla codifica el terminal N de la secuencia codificante IFN-\beta madura. El cebador inverso para esta reacción es 5' CTC GAG TCA GTT TCG GAG GTA ACC TGT (SEQ ID NO:46), en donde TCA es al anticodón del codón de parada de traducción, y CTCGAG es el sitio de restricción XhoI. EL producto 450 bp PCR amplificado se clona en el vector pCRII (Invitrogen), y esta secuencia se verifica.

El fragmento de restricción SmaI-XhoI con la secuencia IFN-\beta madura completamente correcta se utiliza para clonar en el vector de expresión pdCs-huFc, de tal manera que la secuencia codificante del IFN-\beta maduro se fusiona en la estructura al extremo 3 de la secuencia codificante Fc. El plásmido de expresión pdCs-huFc-IFN-\beta se construye al ligar la estructura de restricción SmaI-XhoI que contiene el cADN de IFN-\beta maduro con la estructura de restricción SmaI-XhoI o del vector pdCs-huFc de acuerdo con Lo et al., (Protein Engineering (1998) 11:495). EL ADN de huFc corresponde a una secuencia que cuando se expresa produce el fragmento Fc de la inmunoglobulina humana \beta4 con una secuencia de pivote \beta1 modificada. La secuencia de aminoácido se muestra en la SEQ ID NO:77.

Para generar las proteínas de fusión adicionales que incluyen el IFN-\beta fusionado a Los grupos funcionales Fc de un isotipo diferente o que contiene otras alteraciones, la misma estrategia de clonación se utiliza, aunque sustituye la versión apropiada del vector pdCs-huFc. Así, la estructura de restricción SmaI-XhoI de IFN-\beta se inserta en el vector pdCS-huFc digerido con SmaI y XhoI, que codifica un isotipo inmunoglobulina \beta4 con una región de pivote derivada de \beta4, o un isotipo inmunoglobulina \beta1, o un isotipo inmunoglobulina \beta2, o un isotipo inmunoglobulina \beta2 pero con una región de pivote derivada de inmunoglobulina \beta1 alterada. Debido a la introducción del sitio de clonación SmaI en el vector que codifica un isotipo inmunoglobulina \beta4 no resulta en una mutación sinónima en la proteína expresada del grupo funcional Fc, la secuencia de proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico alrededor del sitio SmaI es LSLSPG (SEQ ID NO:53). La mutación ha sido sinónima, la secuencia estaría presente LSLSLG (ver por ejemplo Figura 7, residuos 101-106 o SEQ ID NO:76).

La mutación de cisteína 17 a serina (C17S) se introduce en la secuencia de nucleótido IFN-\beta mediante un método PCR traslapante (Daugherty et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:2471) utilizando cebadores mutagénicos complementarios. La secuencia de cebador delantero es: 5' AGA AGC AGC AAT TTT CAG AGT CAG AAG CTC CTG TGG CA (SEQ ID NO:47), en donde el nucleótido resaltado indica la mutación en el punto introducido (TGT to AGT). De acuerdo con lo anterior, el cebador inverso es: 5' TG CCACAGGAGCTT CTG ACTCTGAAAATTGCTGCTTCT(SEQIDNO:48). El fragmento PCR generado por el método PCR traslapante se liga al vector pCRII, la secuencia se verifica, y el fragmento SmaI-XhoI se liga a cualquiera de los vectores de expresión pdCs-huFc como se describió anteriormente. La secuencia de aminoácido se muestra como SEQ ID NO:3. La secuencia de contraparte de ratón con la mutación se describe en SEQ ID NO:12.

Como se discutió anteriormente, la cisteína en la posición 17 se muta a una serina en la proteína Fc-IFN-\beta^{sol} que tiene la porción Fc que incluye inmunoglobulina \beta4 con una secuencia de pivote \beta1 modificada. La secuencia de aminoácido se muestra como SEQ ID NO:4.

Para introducir una secuencia ligadora flexible entre el grupo funcional huFc y el grupo funcional IFN-\beta, se produce un dúplex de oligonucleótido sintético de la secuencia 5' G GGT GCA GGG GGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGA TCC GGC GGG GGC TC 3' (SEQ ID NO:49). Este dúplex bicatenario, de extremo romo, se inserta en el sitio SmaI único del vector de expresión pdCs-huFc-IFN-\beta mediante ligado. La orientación del dúplex de extremo romo en el vector resultante, pdCs-huFc-(GS ligador)-IFN-\beta se confirma mediante secuenciamiento. Como un resultado, la secuencia de aminoácido GAGGGGSGGGGSGGGS (SEQ ID NO:50) se agrega entre los residuos prolina (codón CCG) y glicina (codón GGT) codificados por la secuencia C CCG GGT (SEQ ID NO:51) que contiene el sitio SmaI. La secuencia de aminoácido de un huFc-(GS ligador) IFN-\beta partiendo con el dominio CH3 del isotipo Fc\beta4 se muestra en la Figura 6 (SEQIDNO:5).Cuando se utiliza este ligador con construcciones de inmunoglobulina \beta4 de la invención, es importante notar que la secuencia de aminoácido de terminal C LSLSPG (SEQ ID NO:52) de inmunoglobulina \beta4 carece del residuo alanina presente en la inmunoglobulina \beta1, \beta2 o \beta3 de secuencia de terminal C LSLSPGA (SEQ ID NO:53). Como se mencionó antes, la alanina es el resultado de mutar el residuo lisina nativo. Cuando el ligador se inserta en la construcción \beta1, \beta2 o \beta3, los residuos de alanina y glicina terminales se sustituyen idénticamente por una glicina y alanina del ligador. Así, cuando el ligador se inserta en la inmunoglobulina \beta4 Fc-IFN-\beta, la secuencia de aminoácido gana un residuo alanina adicional cuando la glicina de terminal C se reemplaza por glicina y alanina. Esto se ejemplifica al comparar, por ejemplo, Figura 5, residuos 226-231 (SEQ ID NO:4) y Figura 6, empezando en el residuo 101 (SEQ ID NO:5).

Se pueden producir variantes de proteína Fc-IFN-\beta^{sol} adicionales que contienen mutaciones en el grupo funcional IFN-\beta. Por ejemplo, el C17 se puede alterar para otro aminoácido, por ejemplo alanina. Con el fin de introducir la mutación C17A, se utilizan los siguientes oligonucleótidos mutagénicos: el cebador delantero es 5'AGA AGC AGC AAT TTT CAG GCT CAG AAG CTC CTG TGG CA 3', (SEQ ID NO:54), y el cebador inverso es 5' TG CCA CAG GAG CTT CTG AGC CTG AAA ATT GCT GCT TCT 3', (SEQ ID NO:55), en donde el nucleótido resaltado indica las mutaciones introducidas.

Se introducen mutaciones adicionales en Fc-IFN-\beta^{sol} en el grupo funcional IFN-\beta mediante PCR traslapante. Las proteínas de fusión de la invención IFN-\beta preferidas, Fc\beta4h-(ligador)-IFN-\beta^{sol} (C17S L57A H131A H140A) y Fc\beta4h-(ligador)-IFN-\beta^{sol} (C17S F50H H131A H140A), se producen partiendo con la plantilla Fc\beta4h-ligador-IFN-\beta^{sol}(C17S) preparada utilizando métodos previamente descritos aquí.

Para introducir la mutación H131A a la plantilla Fc\beta4h-(ligador)-IFN-\beta^{sol}(C17S), un primer fragmento de ácido nucleico se crea por PCR utilizando la secuencia de cebador delantero 5'CTC CCT GTC CCC GGG TGC AGG GGG (SEQ ID NO:56), que incorpora el sitio endonucleasa XmaI de restricción, y la secuencia de cebador inverso 5' CTT GGC CTT CAG GTA GGC CAG AAT CCT CCC ATA ATA TC (SEQ ID NO:57), en donde GGC representa la mutación H131A. Un segundo fragmento de la proteína de fusión se crea por PCR utilizando la secuencia de cebador delantero 5'GAT ATT ATG GGA GGA TTC TGG CCT ACC TGA AGG CCA AG (SEQ ID NO:58), en donde GGC representa la mutación H131A, y la secuencia de cebador inverso 5' CTT ATC ATG TCT GGA TCC CTC GAG (SEQ ID NO:59), que incorpora el sitio de restricción BamHI. Los productos de estas reacciones se purifican en un gel electroforético de acuerdo con los métodos estándar. Los fragmentos purificados de gel luego se someten juntos a PCR utilizando la secuencia de cebador delantero 5'CTC CCT GTC CCC GGG TGC AGG GGG (SEQ ID NO:60), que incorpora el sito de restricción XmaI, y la secuencia de cebador inverso 5' CTT ATC ATG TCT GGA TCC CTC GAG (SEQ ID NO:61), que incorpora el sitio de restricción BamHI. Esto resulta en un ácido nucleico que codifica Fc\beta4h-ligador-IFN-\beta^{sol}(C17S H131A).

Luego, la mutación H140A se introduce al someter el Fc\betah-ligador-IFN-\beta^{sol}(C17S H131A) a PCR para crear un primer fragmento utilizando la secuencia de cebador delantero 5'CTC CCT GTC CCC GGG TGC AGG GGG (SEQ ID NO:62), que incorpora el sitio XmaI endonucleasa de restricción, y la secuencia de cebador inverso 5' GGT CCA GGC ACA GGC ACT GTA CTC CTT GGC (SEQ ID NO:63), en donde GGC representa la mutación H140A. Un segundo fragmento de la proteína de fusión se crea por PCR utilizando la secuencia de cebador delantero 5' GGC AAG GAG TAC AGT GCC TGT GCC TGG ACC (SEQ ID NO:64), en donde GCC representa la mutación H140A. La secuencia de cebador inverso es 5' CTT ATC ATG TCT GGA TCC CTC GAG (SEQ ID NO:65), que incorpora el sitio de restricción BamHI. Los productos de estas reacciones se purifican en un gel electroforético de acuerdo con los métodos estándar. Los fragmentos purificados de gel luego se someten juntos a PCR utilizando la secuencia de cebador delantero 5'CTC CCT GTC CCC GGG TGC AGG GGG (SEQ ID NO:66), que incorpora el sitio de restricción XmaI, y la secuencia de cebador inverso 5' CTT ATC ATG TCT GGA TCC CTC GAG (SEQ ID NO:67), que incorpora el sitio de restricción BamHI. Esto resulta en un ácido nucleico que codifica Fc\beta4hligador-IFN-\beta^{sol}(C17S H131A H140A). Alternativamente, este proceso se puede seguir en lugar de insertar la mutación H140T de la invención al modificar los cebadores apropiados para expresar el codón treonina ACC.

Finalmente, para introducir la mutación F50H o la mutación L57A a la plantilla Fc\beta4h-ligador-IFN-\beta^{sol}(C17S H131A H140A) preparada en la etapa previa, un primer fragmento de ácido nucleico se crea por PCR utilizando el cebador delantero 5'CTC CCT GTC CCC GGG TGC AGG GGG (SEQ ID NO:68), que incorpora el sitio XmaI endonucleasa de restricción, y la secuencia de cebador inverso 5' GAG CAT CTC ATA GAT GGT GGC TGC GGC GTC CT C (SEQ ID NO:69), en donde GGC representa el codón para crear la mutación L57A o la secuencia de cebador inverso 5' GTC CTCCTTCTGATGCTGCTGCAGCTG(SEQ ID NO:70), en donde ATG representa el codón para crear la mutación F50H. Para crear el segundo fragmento de la proteína de fusión para la mutación L57A, la plantilla se somete a PCR utilizando la secuencia de cebador delantero 5' GAG GAC GCC GCA GCC ACC ATC TAT GAG ATG CTC (SEQ ID NO:71), en donde GCC representa la mutación L57A. Para crear el segundo fragmento de la proteína de fusión para introducir la mutación F50H, la plantilla se somete a PCR utilizando la secuencia de cebador delantero 5' CAG CTG CAG CAG CAT CAG AAG GAG GAC (SEQ ID NO:72), en donde CAT representa la mutación F50H. El cebador inverso para la producción del segundo fragmento de mutación es 5' CTT ATC ATG TCT GGA TCC CTC GAG (SEQ ID NO:73), que incorpora el sitio de restricción BamHI. Los productos de estas reacciones se purifican en un gel electroforético de acuerdo con los métodos estándar. Los fragmentos purificados de gel luego se utilizan como el PCR para producir un ácido nucleico que codifica Fc\beta4h-ligador-IFN-\beta^{sol}(C17S L57A H131A H140A) o Fc\beta4h-ligador-IFN-\beta^{sol}(C17S F50H H131A H140A). Los cebadores inverso y delantero para esta reacción son 5'CTC CCT GTC CCC GGG TGC AGG GGG (SEQ ID NO:74) y 5' CTT ATC ATG TCT GGA TCC CTC GAG (SEQ ID NO:75), respectivamente, como se utiliza en las etapas previas.

Ejemplo 2 Transfección y Expresión de las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta

Para análisis rápido de la expresión de proteína, el plásmido pdCs-huFc-IFN-\beta, pdCs-huFc-IFN-\beta^{sol}(C17S) u otras variantes de proteína de fusión huFc que contienen huIFN-\beta se introducen en células 293 HEK de riñón embriónico humano (ATCC# CRL-1573) mediante transfección transitorio utilizando lipofectamina (Invitrogen).

Para obtener clones establemente transfectados que expresen huFc-IFN-\beta^{sol}(C17S), por ejemplo, el ADN de plásmido apropiado se introduce en las células NS/0 de mieloma de ratón mediante electroporación. Se hacen crecer células NS/0 en medio Eagle modificado de Dulbecco complementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 2 mM glutamina y penicilina/estreptomicina. Se lavan aproximadamente 5x10^{6} células una vez con PBS y se resuspenden en 0.5 ml PBS. Luego se incuban 10 mg de ADN de plásmido linearizado con las células en una cubeta Gene Pulser Cuvette (0.4 cm de espacio de electrodo, BioRad) en hielo durante 10 min. Se desarrolla electroporación utilizando un Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) con configuración a 0.25 V y 500 mF. Se les permite a las células recuperar durante 10 min en hielo, después de lo cual ellas se resuspenden en medio de crecimiento y se colocan en dos placas de 96 pozos. Se seleccionan clones establemente transfectados mediante su crecimiento en la presencia de 100 nM metotrexato (MTX), que se agrega al medio de crecimiento dos días post-transfección. Las células se cargan cada 3 días durante dos a tres veces más, y los clones resistentes a MTX aparecen de 2 a 3 semanas. Los sobrenadantes de los clones se ensayan mediante anti-Fc ELISA para identificar altos productores. Se aíslan clones altamente producidos y se propagan en medio de crecimiento que contiene 100 nM MTX. El medio de crecimiento típicamente utilizado es medio H-SFM o CD (Life Technologies).

Alternativamente, los clones que expresan establemente las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} hu se obtienen en células 293 HEK de riñón embriónico humano mediante selección de metotrexato, por un método similar a uno descrito anteriormente. Se mantienen clones HEK 293 en DMEM complementado con 10% FBS.

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Ejemplo 3 Caracterización de proteínas de fusión huFc-IFN-\beta de sobrenadantes celulares

Las proteínas de fusión HuFc-IFN-\beta se capturan posteriormente del medio para análisis adicional. Para caracterización de rutina mediante electrofóresis de gel, las proteínas de fusión huFc-IFN-\beta secretadas en el medio capturan glóbulos de Sefarosa de Proteína A (Repligen, Cambridge, MA) y luego se eluyen al hervir la muestra en el amortiguador de muestra de proteína, con o sin un agente de reducción tal como \beta-mercaptoetanol. Las muestras se analizan por SDS-PAGE y las bandas se proteína se visualizan mediante teñido Coomassie.

Cuando la proteína huFc-IFN-\beta que contiene un isotipo de inmunoglobulina \beta4 se analiza por SDS-PAGE, se encuentra que la proteína no se expresa en células de cultivo de tejido de mamífero como una especie uniforme. Como se muestra en la Figura 2, bajo condiciones no reducidas, en adición a una banda principal 100 kDa que representa el huFc-IFN-\beta, otras múltiples bandas son claramente visibles, así como también un ensayo no resuelto de proteínas de alto peso molecular. Estos resultados indican que cuando se expresa como una proteína de fusión Fc, los agregados forman IFN-\beta tipo natural. Este hallazgo está en contraste al que se encuentra generalmente con IFN-\beta no modificado; cuando la secuencia tipo natural se clona en un vector de expresión, y se expresa y se secreta en cultivo celular de mamífero este se encuentra por ser 98% monomérico mediante cromatografía de tamaño de exclusión (Runkel et al., (1998), Pharmaceutical Research 15:641). Este resultado es adicionalmente inesperado en claridad del hecho que IFN-\beta se puede producir como una proteína de fusión de la forma IFN-\beta-Fc. Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,908,626.

Una porción de estos agregados es estable para reducir los agentes, como bandas adicionales para la banda 50 kDa esperada para huFc-IFN-\beta persiste en un sistema SDS-PAGE reducido. Sin embargo, la cantidad de material que exhibe la migración anormal es bastantemente disminuido. Este resultado sugiere que en un grado significativo la agregación es debido a la formación de enlace de disulfuro mezclado.

Se analiza una variante Fc-IFN-\beta que contiene una sustitución de la región de pivote con un derivado de inmunoglobulina \beta1. Se encuentra que esta sustitución no tiene impacto en el comportamiento de la proteína de fusión, aunque este no contiene cuatro enlaces disulfuro similares a la región de pivote de inmunoglobulina \beta4. De forma similar, utilizando un isotipo Fc derivado de una inmunoglobulina \beta1 en la construcción de fusión tampoco tiene efecto. Así, aunque la agregación parece ser debido a la presencia del grupo funcional Fc, la agregación no se puede aliviar por alteraciones en el grupo funcional Fc.

Se ha reportado que cuando el IFN-\beta se fusiona a la región de terminal N de Fc, es útil la introducción de una secuencia ligadora. Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,908,626. Similar a las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta con las regiones pivote alteradas o regiones Fc alteradas, una proteína de fusión Fc-IFN-\beta contiene una región ligadora Gly-Ser, que separa la región Fc del grupo funcional IFN-\beta también produce el mismo resultado como anteriormente.

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En contraste, el análisis SDS-PAGE de huFc-IFN-\beta(C17S) revela que esta proteína no se agrega sustancialmente. Bajo condiciones no reducidas, la banda de 100 kDa que corresponde a huFc-IFN-\beta (C17S) representa prácticamente la banda solo visible en el gel. Más aún, bajo condiciones de reducción, también está ausente la banda más prominente que representa la proteína de fusión agregada, más probablemente debido a la interacción de los parches hidrófobos expuestos. Por lo tanto, la introducción de una sustitución de cisteína en la posición 17 de la secuencia madura de IFN-\beta promueve el plegado correcto de la proteína de fusión. Este resultado es sorprendente en dos conteos: para uno, la presencia de una cisteína libre en la porción "X" de una proteína Fc-X no ha presentado un problema en otras proteínas de fusión, tal como Fc-IL2; y la presencia de la cisteína libre en IFN-\beta no ha presentado un problema cuando la proteína libre o cuando una proteína IFN-\beta-Fc se expresan en un sistema de expresión de mamífero.

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Ejemplo 4 Procedimientos ELISA

Se determinan la concentración de productos de proteína que contienen Fc humanos en los sobrenadantes de clones resistentes a MTX y otras muestras de prueba mediante anti-huFc ELISA. Los procedimientos estándar como se describe en detalle adelante se siguen esencialmente.

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A. Placas cubiertas

Se cubren placas ELISA con IgG antihumano de Cabra AffiniPure (H+L) (JacksonInmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) a 5 mg/mL en PBS, y 100 mL/pozo en placas de 96 pozos (placa Nunc-Ixnmuno Maxisorp). Se recuperan las placas cubiertas y se incuban a 4ºC durante la noche. Las placas luego se lavan 4 veces con 0.05% Tween (Tween 20) en PBS, y se bloquean con 1% BSA/1% de suero de cabra en PBS, 200 mL/pozo. Después de incubación con el amortiguador de bloqueo a 37ºC durante 2 hrs, las placas se lavan 4 veces con 0.05% Tween en PBS y se atrapan secas en toallas de papel.

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B. Incubación con muestras de prueba y el anticuerpo secundario

Se diluyen muestras de prueba como sea apropiado en el amortiguador de muestra (1% BSA/1% suero de cabra/0.05% Tween en PBS). Se prepara una curva estándar utilizando un anticuerpo quimérico (con un Fc humano), la concentración de la cual se conoce. Para preparar una curva estándar, se hacen diluciones seriales en el amortiguador de muestra para dar una curva estándar que varía de 125 ng/mL a 3.9 mg/mL. Las muestras diluidas y los estándares se agregan a la placa, 100 mL/pozo y la placa se incuba a 37ºC durante 2 hr. Después de incubación, la placa se lava 8 veces con 0.05% Tween en PBS. Luego se agrega a cada pozo 100 mL del anticuerpo secundario, el IgG antihumano conjugado con peroxidasa de rábano (Jackson ImmuneResearch), se diluye aproximadamente 1:120,000 en el amortiguador de muestra. La dilución exacta del anticuerpo secundario se ha determinado para cada lote del IgG antihumano conjugado con HRP. Después de incubación a 37ºC durante 2 hr, la placa se lava 8 veces con 0.05%
Tween en PBS.

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C. Desarrollo

La solución de sustrato se agrega a la placa a 100 mL/pozo. La solución de sustrato se prepara al disolver 30 mg de OPD (diclorhidrato o-fenilenodiamina (OPD), (1 comprimido) en 15 mL de amortiguador de 0.025M de ácido cítrico/0.05M Na2HPO4, pH 5, que contiene 0.03% de peróxido de hidrógeno frescamente agregado. Se le permite desarrollar color durante 30 min. a temperatura ambiente en la oscuridad. El tiempo de desarrollo se somete a cambio, dependiendo de la variabilidad de lote a lote de las placas cubiertas, el anticuerpo secundario, etc. Se detiene la reacción al agregar 4N de ácido sulfúrico, 100 mL/pozo. La placa se lee mediante un lector de placa, que se establece a 490 y 650 nm y se programa para sustraer el OD anterior a 650 nm del OD a 490 nm.

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Ejemplo 5 Purificación y análisis de proteínas huFc-IFN-\beta

La purificación estándar de proteínas de fusión que contienen Fc se desarrolla con base en la afinidad del grupo funcional de proteína Fc para la Proteína A. En resumen, los sobrenadantes celulares (de células transfectadas con proteínas mutantes o tipo natural) que contienen la proteína de fusión se cargan en una columna de Flujo Rápido de Sefarosa de Proteína A pre-equilibrada (50 mM Fosfato de Sodio, 150 mM NaCl a pH neutro) y la columna se lava extensivamente en el amortiguador (50 mM Fosfato de Sodio, 150 mM NaCl a pH neutro). Se eluye la proteína de unión un pH bajo (pH 2.5) en el mismo amortiguador como se hizo anteriormente y las fracciones se neutralizan inmediatamente, opcionalmente al eluir directamente en una solución de 1M Tris base, pH 11.

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Se analizan huFc-IFN-\beta purificado con Sefarosa de Proteína A y las proteínas de fusión huFc-IFN-\beta^{sol} mediante cromatografía de tamaño de exclusión analítica (SEC), y el % de material no agregado se cuantifica al calcular el área baja la cura de picos de cromatograma. La integridad y pureza de las proteínas de fusión se verifica por electrofóresis SDS-PAGE.

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TABLA 1 Análisis de SEC analítico de proteínas de fusión Fc-IFN-\beta

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En una segunda etapa de purificación, la Sefarosa de Proteína A neutralizada eluada que contiene las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta^{sol} se aplican a una columna SEC preparativa y se recolectan las fracciones pico, produciendo preparaciones de proteína Fc-IFN-\beta^{sol} que consisten de por lo menos 90% del material no agregado. Aunque la producción del producto purificado para Fc-\beta4h-ligador-IFN-\beta(C175) es aproximadamente 10%, para Fc-\beta4h-ligador-IFN-\beta^{sol}(C17S L57A H131A H140T) este es aproximadamente 75%. Este resultado indica que la combinación de las mutaciones C17S con, por ejemplo L57A, H131A, y H140T en el grupo funcional IFN-\beta promueve significativamente las características de solubilidad de las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta.

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Ejemplo 6 Medición de la Actividad Antivírica

La replicación vírica en el cultivo celular frecuentemente resulta en citotoxicidad, un efecto conocido como efecto citopático (CPE). Los interferones pueden inhibir la proliferación vírica y proteger las células de CPE. La actividad antivírica de IFN-\beta se puede cuantificar mediante reducción del efecto citopático (CPER), como se describe en "Lymphokines and Interferons: A Practical Approach", editado por M.J. Clemens, A.G. Morris, y A.J.H. Gearin, I.R.L. Press, Oxford, 1987. Las actividades antivíricas de huFc-IFN-\beta y huFc-IFN-\beta^{sol} purificado se comparan relacionado con un estándar huIFN-\beta comercial (R&D Systems) o Betaferón (Serono) utilizando la línea de carcinoma de pulmón epitelial humana A549 (ATCC # CCL-185) y el virus encefalomiocarditis s (EMCV; ATCC # VR 129B) de acuerdo con el protocolo CPER descrito en la referencia anterior. La dosis efectiva (ED50) se establece como la cantidad de proteína que conduce a 50% CPER (es decir 50% de las células se han protegido de lisis), determinado con relación a células de control no infectadas. Los valores ED50 son el promedio de por lo menos tres experimentos separados. Se encuentra que las dosis efectivas que dan 50% CPER son 50 pg/ml para huFc-IFN-\beta 70 pg/ml para huFc-IFN-\beta^{sol}(C17S), 14 pg/ml para huFc-IFN-\beta^{sol}(C17S, F50H, H131A, H140A) y 17 pg/ml para huFc-IFN-\beta^{sol}(C17S, L57A, H131A, H140T). Estos valores, que se han normalizado a la cantidad de IFN-\beta en la proteína de fusión, se correlacionan bien con el ED50 de 90 pg/ml o 40 pg/ml encontrado con el estándar comercial o Betaferón, respectivamente. Por lo tanto, las proteínas de fusión IFN-\beta retienen actividad antivírica sustancial en un ensayo CPER, y las proteínas de fusión huFc-IFN-\beta^{sol} tienen un ED50 aproximadamente equivalente al del huIFN-\beta libre.

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Ejemplo 7 Ensayo de Inhibición de Crecimiento Celular

La actividad de las proteínas de fusión Fc-IFN-\beta purificadas se determina adicionalmente en un ensayo de inhibición de crecimiento celular. La proliferación de células Daudi (ATCC # CCL-123), una línea de linfoblasto B derivada de un paciente con linfoma de Burkit, se inhibe normalmente por IFN-\beta. De acuerdo con lo anterior, los efectos antiproliferativos de las proteínas de fusión huFc-IFN-\beta y huFc-IFN-\beta^{sol} (C17S) en células Daudi se comparan con relación a un estándar humano comercial (Calbiochem). Para configurar el ensayo para cada una de estas proteínas, una serie de dilución cubre aproximadamente un rango de concentración miles de veces se prepara en medio RPMI complementado con 10% de suero bovino fetal, y se forman alícuotas de muestras de 100 ml en pozos de una placa de 96 pozos. Las células Daudi en fase de crecimiento se lavan y se resuspenden a 2 x 10^{5} células/ml en el medio RPMI complementado con 10% de suero bovino fetal, y 100 ml de las células se forman alícuotas a cada pozo que contiene las diluciones IFN-\beta. Los pozos de control adicionales contienen células no tratadas o el medio solo. Después de incubación durante 72 horas adicionales se mide la proliferación mediante actividad deshidrogenasa mitocondrial, utilizando el sustrato de enzima cromogénico MTS (Promega # G5421) en la presencia de del donante de electrón PMS (Sigma # P 5812). Los valores ED50, que se determinan de las curvas de actividad, se encuentran por estar alrededor de 3 ng/ml a 3.5 ng/ml para cada una de las proteínas de fusión así como también para la proteína IFN-\beta comercial. Esto por lo tanto concluye que las proteínas de fusión IFN-\beta son tan efectivas como el IFN-\beta libre en inhibir el crecimiento de células Daudi.

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Ejemplo 8 Farmacocinéticas de proteínas huFc-IFN-\beta

Las farmacocinéticas de huFc-IFN-\beta y las proteínas de fusión huFc-IFN-\beta^{sol} se determinan en un grupo de 4 ratones Balb/c, para cada proteína. Se inyecta veinticinco miligramos de la proteína de fusión en la vena de la cola de cada ratón. Se obtiene sangre mediante mezcla retro-orbital inmediatamente después de inyección (es decir, a t = 0 min), y a 30 min, 1 hr, 2 hrs, 4 hrs, 8 hrs, y 24 hrs post-inyección. Se recolectan muestras sanguíneas en tubos que contienen heparina para evitar división. Se remueven las células mediante centrifugación en una microcentrífuga de alta velocidad Eppendorf durante 4 min a 12,500 g. La concentración de Fc-huIFN-\beta o huFc-IFN-\beta^{sol} en el plasma se mide por anti-huFc ELISA y análisis Western blot utilizando el anticuerpo anti-huFc. Alternativamente, se puede utilizar un IFN-\beta ELISA. La integridad de la proteína de fusión circulante se mantiene mediante un inmunoblot del suero probado con un anticuerpo anti-huFc o con un anticuerpo anti-IFN-\beta. Se encuentra que la vida útil circulante de huFc-IFN-\beta^{sol} es mayor que la de huFc-IFN-\beta, y por lo menos 5 veces que la del IFN-\beta libre.

Adicionalmente, se contempla que los efectos específicos de Fc-IFN-\beta^{sol} son más pronunciados en el tratamiento de afecciones y enfermedades tal como esclerosis múltiple, en donde se conoce la administración de IFN-\beta por aliviar la afección.

Claims

1. Una proteína de fusión Fc-interferón-\beta con plegamiento mejorado y agregación reducida que comprende:

(i): una región de Fc de inmunoglobulina; y

(ii): una proteína de interferón ligada por unión de péptido o una secuencia ligadora de péptido al terminal carboxi de la región Fc de inmunoglobulina,

en donde la proteína interferón comprende sustituciones de aminoácido comparado con la secuencia de interferón madura natural en las posiciones 17 y 50 y 131 y 140, o 17 y 57 y 131 y 140.

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2. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, que tiene las siguientes sustituciones de aminoácido dentro de la proteína interferón-\beta: C17S y F50H y H131A y H140T o A, o C17S y L57A y H131A y H140T o A.

3. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la región Fc de inmunoglobulina comprende una región de pivote de inmunoglobulina y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.

4. Una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la región Fc de inmunoglobulina se deriva de IgG4, IgG2 o IgG1.

5. Una proteína de fusión de la reivindicación 4, en donde la región Fc de inmunoglobulina se deriva de IgG4 y comprende adicionalmente una región de pivote de inmunoglobulina derivada de IgG1.

6. Una proteína de fusión de la reivindicación 5, en donde un residuo cisteína de la región de pivote se ha mutado.

7. La proteína de fusión de la reivindicación 4, en donde la región Fc de inmunoglobulina se deriva de IgG1, y un residuo alanina se sustituye en lugar de la lisina de terminal C de la región Fc de inmunoglobulina.

8. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la región Fc de inmunoglobulina se deriva de IgG2 y comprende adicionalmente una región de pivote de inmunoglobulina derivada de IgG1.

9. Una proteína de fusión de la reivindicación 8, en donde un residuo cisteína de la región de pivote se ha mutado.

10. Una proteína de fusión de la reivindicación 8 o 9, en donde un residuo alanina se sustituye adicionalmente en lugar de la lisina de terminal C de la región Fc de inmunoglobulina.

11. Una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la secuencia ligadora de péptido es Gly4SerGly4SerGly3SerGly.

12. Una molécula de ácido nucleico que codifica una cualquiera de las proteínas de fusión Fc-interferón-\beta de las reivindicaciones 1-11.

13. Un vector de expresión replicable para transfectar una célula de mamífero que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 12.

14. Una célula de mamífero, seleccionada del grupo que consiste de células de hibridoma inmortal, Células de mieloma NS/0, células 293, Células de ovario de hámster Chino, Células HeLa y Células COS, dicha célula de mamífero contiene un vector de expresión de la reivindicación 13.

15. Un método para estabilizar una proteína de fusión Fc-interferón-\beta que comprende expresar una proteína de fusión Fc-interferón-\beta como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 en una célula de mamífero como se especifica en la reivindicación 14.

16. El método de la reivindicación 15, en donde estabilizar comprende

(i): incrementar la vida útil circulante de la proteína de fusión Fc-interferón-\beta relacionada con una proteína de fusión Fc-interferón-\beta no alterada, o

(ii): reducir la agregación de la proteína de fusión Fc-interferón-\beta relacionada con una proteína de fusión Fc-interferón-\beta no alterada, o

(iii): incrementar la actividad biológica de la proteína de fusión Fc-interferón-\beta relacionada con una proteína de fusión Fc-interferón-\beta no alterada.

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17. Uso de una proteína de fusión Fc-interferón-\beta de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple, leucemia mieloide, mieloma múltiple, Enfermedad de Hodgkin, carcinoma de célula basal, displasia cervical, osteosarcoma, hepatitis vírica, herpes zóster y herpes genital, virus papiloma, encefalitis vírica y neumonía citomegalovirus.

18. Una proteína de fusión Fc-interferón-\beta de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para uso como un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple, leucemia mieloide, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, carcinoma de célula basal, displasia cervical, osteosarcoma, hepatitis vírica, herpes zóster y herpes genital, virus papiloma, encefalitis vírica y neumonía citomegalovirus.