ES2336393T3 - Complejo antigenico que comprende un inmoestimulador, cd4, y un dominio receptor de quimioquina para tratamiento de vih y desordenes inmunes. - Google Patents

Abstract

Un péptido antígeno CD4-CDR2, caracterizado porque el péptido antígeno está entre aproximadamente 30 y aproximadamente 46 aminoácidos de longitud; en donde el péptido antígeno CD4-CDR2 contiene dos residuos de cisteína separados por una secuencia interpuesta de 28 a 40 residuos de aminoácidos; y en donde la secuencia interpuesta es una porción contigua de la secuencia representada por los residuos 27 a 66 de SEC. DE IDENT. NO:1, o es un homólogo inmunológicamente funcional de residuos 27 a 66 de SEC. DE IDENT. NO:1, donde dicho homólogo es un péptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos con sustituciones conservativas de hasta el 10% de los aminoácidos.

Description

Complejo antigénico que comprende un péptido inmunoestimulador, CD4, y un dominio receptor de quimioquina para tratamiento de VIH y desórdenes inmunes.

Campo de la invención

Esta invención se dirige al uso de una composición peptídica como un inmunógeno, que comprende cada péptido contenido en la misma, un sitio antigénico objetivo que se reconoce por anticuerpos en contra de un complejo de célula huésped receptor/co-receptor para VIH. El complejo comprende CD4 asociado con un dominio receptor de quimiocina. El sitio antigénico objetivo está en una forma cíclica unido covalentemente, linealmente y en tándem a (1) una proteína portadora a través de un acoplamiento químico, o preferiblemente a (2) un epítope de células T asistente y otras secuencias peptídicas inmunoestimuladoras por acoplamiento químico o más preferiblemente por síntesis directa. Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de tal composición peptídica como un inmunógeno para producir la producción en mamíferos sanos, que incluye humanos, de anticuerpos de alto título que tienen actividades neutralizadas amplias en contra de aislados primarios de todos los clados de VIH tipo 1 (VIH-1) y aislados primarios de VIH tipo 2 (VIH-2). La presente invención se dirige también a un método para utilizar la composición peptídica como un inmunógeno para la prevención y tratamiento de la infección de virus de inmunodeficiencia así como para el tratamiento de respuestas inmunes indeseables tales como rechazo al transplante, y trastornos autoinmunes tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, y psoriasis.

Antecedentes de la invención

A pesar de la investigación intensiva para una vacuna en los 14 años desde el descubrimiento y caracterización de VIH, permanecen obstáculos principales para el desarrollo de la vacuna e inmunoterapia de VIH. Estos obstáculos incluyen variabilidad del VIH-1, una falta de entendimiento de la estructura del virus, y una falta de entendimiento de las respuestas inmunes necesarias para la prevención de la infección de VIH. Ver D. Burton and J. Moore, Nature Medicine, 1998, 4:495-48. El presidente del comité para la investigación de la vacuna del SIDA del gobierno de los Estados Unidos, declaró el 1 de febrero de 1998 que una vacuna segura para prevenir el SIDA podría estar aún más lejos de una década de probarse, debido a que mucho permanece desconocido acerca de cómo trabaja el sistema inmune del cuerpo (http://cnn.com/HEALTH/9802/01/aids.vaccine.search).

Hubo un optimismo temprano para vacunas eficaces subunitarias de envoltura VIH-1 recombinantes (por ejemplo, productos de vacuna gp120 y gp160) dado que el suero de vacuna de diversas pruebas clínicas eran capaces de neutralizar aislados de laboratorio de VIH-1 in vitro (Belshe et al., J. Am. Med. Assoc., 1994, 272:475; Keefer et al., AIDS Res. Hum Retroviruses, 1994, 10:1713). Este optimismo se sacudió cuando se encontró que el suero de vacuna era muy inefectivo para neutralizar aislados de VIH-1 de pacientes primarios (Hanson, AIDS Res. Hum Retroviruses, 1994, 10:645; Mascola et al., J Infect Dis., 1996, 173:340). Estos decepcionantes descubrimientos condujeron a NIH a decidir en junio de 1994 a posponer pruebas eficaces costosas a gran escalas de diversas proteínas de envoltura recombinantes basadas en vacunas subunitarias VIH.

La investigación de la vacuna VIH se enfoca ahora en aislados primarios lo cual se cree se parecen más a las cepas VIH responsables de la infección humana que las cepas de laboratorio usadas comúnmente (Sawyer et al., J Virol, 1994, 68:1342; Wrin et al., J Virol, 1995, 69:39). Los aislados primarios de VIH-1 se obtienen por cultivo limitado de PBMCs de paciente de plasma con PBMCs sin infectar. Los virus primarios pueden distinguirse fácilmente por fenotipo como se dispuso posteriormente de los virus adaptados de línea de la célula T (TCLA) tales como IIIb/LAI, SF2 y MN, los cuales han pasado durante el tiempo en líneas de células T-linfoide humana y se han vuelto bien adaptadas para crecer en estas líneas de células T:

(1)

A diferencia de los virus TCLA, la mayoría de los aislados primarios no crecen fácilmente en líneas de células T.

(2)

A diferencia de los virus TCLA, los cuales inducen todos sincitio, los aislados primarios incluyen aislados que incluyen sincitio (SI) que inducen formación de sincitio en cultivo de PBMC y aislados que no inducen sincitio (NSI). Entre los aislados primarios SI, la mayoría se replicará especialmente en la línea MT2 de células T sensibles a VIH, pero unas cuantas pueden replicarse en las líneas de células T menos permitidas tales como CEM o H9 que se usan comúnmente para el cultivo de aislados TCLA. Los aislados primarios que no inducen sincitio (NSI) se replican solamente en células T primarias.

(3)

Los aislados primarios son altamente resistentes a la neutralización in vitro por formas solubles recombinantes de la proteína CD4 receptora viral (rsCD4) que requiere 200-2700 veces más rsCD4 que las cepas TCLA para una neutralización comparable (Daar et al., PNAS USA, 1990, 87:6574-6578).

(4)

Los aislados primarios son también resistentes a los anticuerpos neutralizantes producidos por el uso de vacunas gp120 (envoltura). En contraste, las cepas TCLA son sensibles a la neutralización por anticuerpos con especificidades para la envoltura viral (Sawyer et al., J Virol, 1994, 68:1342; y, Mascola et al., 1996).

\newpage

Estas características fenotípicas de aislados primarios se deben a las características estructurales pobremente entendidas de VIH, particularmente la cualidad inaccesible de la envoltura viral con respecto a anticuerpos anti-env (D. Burton and J. Moore, Nature Medicine, 1998, 4:495-498). La variabilidad viral, una característica genotípica, también permanece como una obstáculo para el desarrollo de vacunas VIH de eficiencia mundial (Mascola et al., 1996). Estos factores juntos cuentan para el fracaso inesperado de las vacunas viralmente dirigidas a SIDA que se desarrollaron en contra de cepas homotípicas TCLA ya crecidas. Una propuesta alternativa para el desarrollo de vacuna para el VIH podría ser por la intervención de los receptores de VIH de la célula huésped, bloqueando con esto la infección al prevenir el VIH de enlazarse a, o unirse con células susceptibles. La propuesta dirigida a células ofrece métodos para superar la hipervariabilidad de la envoltura VIH y la diversidad fenotípica.

Una propuesta dirigida a células para la protección de la infección de VIH se sugirió por los estudios de inmunización activa y pasiva en el modelo de macaco rhesus SIV el cual mostró que los anticuerpos anti-células contribuyeron en gran medida a la protección de la infección (Stott, Nature, 1991, 353:393). Además, los anticuerpos monoclonales dirigidos en contra de CD4, moléculas de clase II MHC para el receptor de célula T y el receptor primario para el enlace de VIH, desde hace tiempo se han conocido que bloquean la infección en las pruebas de neutralización de VIH-1 en una forma que es dependiente del epítope CD4, no la cepa de virus (Sattentau et al., Science, 1986; 234:1120). En esta propuesta para inmunoprofilaxis se ha encontrado que los anticuerpos monoclonales anti-CD4 son efectivos para bloquear la infección de células por aislados primarios (Daar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990; 87: 6574; and Hasunuma et al., J Immunol., 1992; 148:1841).

Otras propuestas dirigidas a células potencialmente efectivas incluyen seleccionar receptores quimiocina CXCR4, CCR5, CCR2b, y CCR3 que se han identificado recientemente como co-receptores para VIH (Feng et al., Science, 1996; 272:872; y, Doranz et al., Cell, 1996; 85:1149). Estos co-receptores funcionan juntos con CD4 para iniciar interaccionar post-enlace de la envoltura viral de glicoproteína con la membrana celular del huésped y en etapas pos-entrada de la replicación del retrovirus (Chackerian et al., J Virol, 1997; 71:3932).

El requerimiento para el enlace y fusión eficiente de VIH para CD4 y un co-receptor sugiere que una o ambas de estas moléculas pueden ser buenos objetivos para estrategias dirigidas a células para inhibir la infección. Los anticuerpos dirigidos a un complejo de célula huésped CD4/co-receptor han demostrado afectar las etapas de enlace y pos-enlace de la infección de VIH (Wang, WO 97/46697). Estos anticuerpos neutralizaron la transmisión de virus a célula o de célula a célula de cepas de VIH que inducen (SI) y que no inducen (NSI) sincitio.

Un antagonista de quimiocina que se enlaza a CCR5 también ha demostrado ser efectivo para prevenir la infección por virus SI y NSI (Simmons et al., Science, 1997; 276:276). La neutralización de aislados NSI es particularmente significativa puesto que las cepas NSI se cree que son responsables para la mayoría de la transmisión VIH y son frecuentemente resistentes a anticuerpos anti-VIH que neutralizan aislados TCLA (Fauci, 1996). Los agentes que seleccionan los receptores celulares de VIH evitan la necesidad de confrontar diversos fenotipos y la hipervariabilidad de la envoltura viral y además ofrecen actividad de neutralización potencial en contra de VIH-2 y SIV, (Chen et al, J Virol, 1997; 71:2705; Pleskoff et al., J Virol, 1997; 71:3259; WO 97/46697).

Un complejo de célula huésped receptor/co-receptor que comprende CD4 y un co-receptor quimiocina sobre la superficie de las células huésped T, lo cual facilita el enlace y entrada viral dentro de las células T huésped, se reporta que es un objetivo efectivo para anticuerpos neutralizantes en una solicitud de patente co-pendiente (WO 97/46697). En esta aplicación, el inventor actual demostró que los anticuerpos surgidos se dirigen específicamente en contra de esta complejo antígeno superficial celular. Ningún otro anticuerpo anti-célula surge en respuesta a los antígenos de superficie celular en las células HPB-ALL de aislados primarios VIH-1 neutralizados. Los anticuerpos con las propiedades deseadas como se describe en esta solicitud pueden bloquear la infección de monos por SIV, infección del sistema inmune VIH-1 in vivo reconstituido en ratones, infecciones in vitro de células humanas por aislados primarios VIH-1 en células humanas por VIH-2. Este complejo antígeno de superficie celular que comprende el receptor CD4 asociado con un co-receptor quimiocina (complejo CD4/co-receptor) actúa como un objetivo para anticuerpos protectores anti-célula.

Los anticuerpos anti-célula al complejo CD4/co-receptor presentan un patrón más efectivo de neutralización en contra de cepas VIH relevantes que los anticuerpos anti-virus dirigidos en contra de la envoltura viral. Como se muestra en la solicitud co-pendiente (WO 97/46697), un anticuerpo monoclonal (MAb B4), producido en contra de HPB-ALL reacciona moderadamente en contra de la proteína CD4 soluble recombinante (rsCD4) y se enlaza fuertemente a las células HPB-ALL. La especificidad para el complejo de superficie celular CD4/co-receptor se encontró que es altamente efectivo para neutralizar aislados primarios de VIH-1, pero menos efectivos para neutralizar cepas de TCLA. En contraste, los anticuerpos anti-env presentan un patrón inverso para la neutralización preferencial de cepas TCLA.

Se encontró que MAb B4 neutralizó aislados primarios de VIH en una prueba de microplaca in vitro a una concentración de <10 \mug/ml. En contraste, los anticuerpos policlonales con alto título (>5 Log_{10}) de especificidad para CD4 soluble recombinante (rsCD4) fracasó en presentar cualquier actividad neutralizante para aislados primarios de VIH a pesar de sus actividades fuertemente enlazantes a células T. Así, los aislados primarios parecen ser preferentemente sensibles a los anticuerpos con especificidad para el complejo antígeno de superficie celular CD4/co-receptor, en comparación con los anticuerpos con una especificidad CD4 pura. La caracterización extensiva de la neutralización de VIH por anticuerpos del complejo anti-CD4/co-receptor incluyen MAb B4 y sus homólogos MAb M2 y MAb B13 (WO 97/46697).

El mecanismo para la amplia actividad neutralizante de los anticuerpos al complejo CD4/co-receptor no está claro debido a los diversos papeles de este complejo de superficie celular para mediar la infección de VIH, como se muestra por la capacidad de esos anticuerpos para afectar las etapas de enlace y pos-enlace de la infección de VIH (Wang, WO 97/46697). El complejo de superficie celular CD4/co-receptor puede jugar papeles duales para mediar la infección y patogénesis de VIH: (1) como un receptor de superficie celular T para enlace de VIH, fusión y entrada a las células del VIH; o (2) como un factor que suprime VIH.

Sin embargo, aún cuando estos agentes son efectivos para la inhibición de la infección de VIH, los antagonistas o anticuerpos dirigidos a células anteriores no pueden usarse como vacunas preventivas. Los antagonistas o anticuerpos dirigidos a células previamente discutidos (WO 97/46697) no son inmunógenos y no pueden usarse como vacunas preventivas. Son agentes para la inmunización pasiva. Su eficiencia requiere que esos agentes se administren frecuentemente para mantener concentraciones en suero suficiente para la ocupación compleja de receptores. Una vacuna que induzca una respuesta anticuerpo anti-propia activa en contra del complejo CD4/co-receptor por inmunización activa, sería preferible para inmunidad protectora. Tal vacuna, si puede desarrollarse, proporcionaría protección efectiva y a largo plazo de la infección no obstante requeriría la administración conveniente e infrecuente de pequeñas cantidades de inmunógeno.

Para tener eficiencia, los componentes inmunogénicos de tales vacunas deben comprender o imitar un epítope de célula B, un sitio relevante, sobre el complejo de la célula huésped receptor/co-receptor, con suficiente fidelidad para evocar anticuerpos inhibitorios cruzados a la vez que retienen suficiente especificidad de sitio para evitar la inmunosupresión adversa. Tales sitios para imitación por antígenos sintéticos no son fácilmente identificables en el presente, aún cuando anticuerpos anti-células que neutralizan VIH, que incluyen anticuerpos anti-CD4 con actividad neutralizante, se han hecho disponibles. El anticuerpo monoclonal anti-CD4 que se reportó que es neutralizante (Burkly et al., J Immunol, 1992; 149:1779) y el anticuerpo monoclonal ampliamente neutralizante anti-CD4/co-receptor reportado por Wang (WO 97/46697) reconoce sitios conformacionales discontinuos sobre CD4 que no pueden duplicarse fácilmente. Sin el conocimiento exacto de los sitios vulnerables, la selección de los inmunógenos recombinantes prolongados útiles como blancos antigénicos de células huésped y la reproducción de los mismos es muy difícil. La mayoría de los anticuerpos surgidos por inmunización con CD4 carecen de especificidades útiles (Davis et al., Nature, 1992; 358:76). Por ejemplo, el antisuero hiperinmune de alto título rsCD4 estaba vacío de actividad neutralizante para aislados primarios de VIH (WO 97/46697). Además, los anticuerpos con amplia reactividad para regiones extensivas de un antígeno de célula T se espera que sean muy inmunosupresivos (Reimann et al., AIDS Res. Hum Retroviruses, 1997; 13: 933).

Además, aunque los estudios de mapeo extensivo de CD4 han producido un mapa de estructura de función para la molécula (Sattentau et al., Science, 1986, 234:1120; Peterson and Seed, Cell, 1988, 54:65; Jameson et al., Science, 1988, 240:1335; Sattentau et al., J Exp. Med., 1989, 170:1319; Hasunuma et al., J Immunol, 1992, 148:1841; Burkly et al., J Immunol, 1992, 149:1779; Davis et al., Nature, 1992, 358:76), este mapeo no proporciona modelos estructurales de suficiente precisión para predecir sitios efectores vulnerables que pueden duplicarse como péptidos sintéticos. La disponibilidad de modelos para CD4 no describe inmunógenos útiles basados en CD4.

Además de la apropiada especificidad de sitio, los inmunógenos receptor/co-receptor de una vacuna efectiva de VIH debe ser altamente inmunoestimuladora para evocar respuestas anticuerpo de suficiente nivel de protección. Estos inmunógenos deben diseñarse también para superar la fuerte tolerancia presentada hacia las moléculas propias. Así, también permanece una necesidad para inmunógenos de suficiente inmunopotencia.

Es un objeto de la presente invención proporcionar composiciones peptídicas que tienen la deseada especificidad de sitio e inmunopotencia, como inmunógenos para la prevención de la infección de VIH.

La inmunogenicidad mejorada y la especificidad apropiadas para las inmunógenos peptídicos sintéticos útiles de la presente invención se han logrado a través de la incorporación de una colección de métodos para la identificación y diseño de inmunógenos peptídicos sintéticos. Estos métodos incluyen: (1) un procedimiento efectivo para la identificación de un epítope efectivo de alta afinidad objetivo; (2) los medios para la estabilización de las características conformacionales de este sitio objetivo sobre un péptido sintético por la introducción de represiones cíclicas, para maximizar la reactividad cruzada de la molécula nativa; (3) los medios para aumentar la inmunogenicidad del epítope objetivo de célula B al combinarlo con un sitio que comprende un epítope de célula asistente T (Th) promiscuo altamente reactivo; y (4) los medios para agrandar el repertorio de epítopes de células T por aplicación de química peptídica combinatorial y acomodar adicionalmente con eso la capacidad de respuesta inmunovariable de una población producida por mezclas de razas.

Los péptidos sintéticos se han usado para "mapeo epítope" para identificar determinantes o epítopes inmunodominantes sobre las superficies de proteínas para el desarrollo de nuevas vacunas y diagnósticos. El mapeo epítope emplea una serie de péptidos que se traslapan que corresponden a regiones sobre la proteína de interés para identificar sitios que participan en la interacción determinante anticuerpo-inmunogénica. Comúnmente, el mapeo epítope emplea péptidos de longitud relativamente corta para detectar precisamente determinantes lineales. Un método rápido de mapeo epítope conocido como PEPSCAN se basa en la síntesis simultánea de cientos de péptidos que se traslapan, de longitudes de 8 a 14 aminoácidos, acoplados a soportes sólidos. Los péptidos acoplados se prueban por su capacidad para enlazar anticuerpos. La propuesta PEPSCAN es efectiva para localizar determinantes continuas lineales, pero no para la identificación de epítopes que se necesitan para la imitación de sitios efectores discontinuos tales como el sitio de enlace VIH receptor/co-receptor (Meloen et al., Ann Biol. Clin., 1991; 49:231-242. Un método alternativo radica en un conjunto de péptidos que se traslapan y anidan de longitudes múltiples que varían de 15 a 60 residuos. Estos péptidos más largos pueden sintetizarse confiablemente, pero laboriosamente por una serie de síntesis peptídica de fase sólida independiente, mas que por las síntesis PEPSCAN rápidas y simultáneas. El conjunto resultante de péptidos que se traslapan y anidan pueden usarse después para análisis del enlace de anticuerpo en sistemas tales como inmunizaciones experimentales e infecciones naturales, para identificar péptidos largos que presentan mejores determinantes inmunodominantes, que incluyen epítopes discontinuos sencillos. Este método se ejemplifica en los estudios de Wang para el mapeo de sitios inmunodominantes de HTLV I/II (US 5, 476, 765) y HCV (US 5, 106, 726). Se usó para la selección de una posición precisa sobre la secuencia gp120 para la presentación óptima de un epítope neutralizante VIH (Wang et al., Science, 1991; 254:285-288).

Los inmunógenos peptídicos son generalmente más flexibles que las proteínas y no tienden a retener ninguna estructura preferida. Por lo tanto, es útil para estabilizar un inmunógeno peptídico por la introducción de represiones cíclicas. Un inmunógeno peptídico ciclizado correctamente puede imitar y conservar la conformación de un epítope seleccionado y evocar con eso anticuerpos con reactividades cruzadas para ese sitio sobre la molécula auténtica. Por ejemplo, una estructura ondulada presente sobre un epítope auténtico puede duplicarse más precisamente sobre un péptido sintético por la adición de residuos de cisteína colocados ventajosamente seguido por ciclización a través de grupos sulfhidrilo (Moore, Capítulo 2 en Synthetic Péptidos: A User's Guide, ed. Grant, WH Freeman and Company: New York, 1992, pp. 63-67).

Otro factor importante que afecta la inmunogenicidad de un inmunógeno peptídico derivado de un complejo receptor/co-receptor es la presentación de este péptido al sistema inmune por epítopes de células asistentes T que reaccionan con un receptor de célula asistente T de huésped y moléculas Clase II MHC (Babbitt et al., Nature, 1985; 317:359-361). Los epítopes asistentes T (Th) se proporcionan frecuentemente por proteínas portadoras con desventajas concomitantes debido a las dificultades para la fabricaciones de conjugados portadores peptídicos bien definidos, mala dirección de la mayoría de la respuesta anticuerpo al portador, y supresión epitópica inducida por portador (Cease, Intern Rev Immunol, 1990; 7:85-107; Schutze et al., J Immunol, 1985; 135:2319-2322). Alternativamente, la ayuda de la célula T puede estimularse por péptidos sintéticos que comprenden los sitios Th. Así, los epítopes Clase II Th, llamados Th promiscuos evocan suficiente ayuda de célula T y pueden combinarse con epítopes de células B que por sí mismos son pobremente inmunogénicos para generar inmunógenos peptídicos potentes (US 5, 759, 551). Los péptidos quiméricos epítopes de células Th/B promiscuos bien diseñados son capaces de producir respuestas Th y respuestas anticuerpo resultantes seleccionadas para los sitios de célula B en la mayoría de los miembros de una población genéticamente diversa que expresa diversos haplotipos MHC. Los Th promiscuos pueden proporcionarse por secuencias específicas derivadas de antígenos extranjeros potentes, tales como por ejemplo, proteína F del virus del sarampión, antígeno de superficie del virus B de hepatitis y proteína de la membrana extrema principal de Chlamydia trachomatis (MOMP). Muchos Th promiscuos conocidos han mostrado ser efectivos para potenciar un péptido pobremente inmunogénico que corresponde a la hormona decapéptido LHRH (Patente Norteamericana No. 5, 759, 551).

Los epítopes Th promiscuos varían en tamaño de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 residuos de aminoácidos de longitud (Patente Norteamericana 5, 759, 551), y frecuentemente comparten características estructurales comunes y pueden contener secuencias específicas de marca. Por ejemplo, una característica común son hélices anfipáticas, las cuales son estructuras alfa-helicoidales con residuos de aminoácido hidrofóbicos que dominan una cara de la hélice y con residuos cargados y polares que dominan las caras circundantes (Cease et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1987; 84:4249-4253). Los epítopes Th contienen frecuentemente patrones de aminoácidos primarios adicionales tales como un residuos cargado o Gly seguido por dos o tres residuos hidrofóbicos, seguidos a su vez por un residuo cargado o polar. Este patrón define lo que se llama secuencias de Rothbard. También, los epítopes Th frecuentemente obedecen la regla de 1, 4, 5, 8 en donde un residuo cargado positivamente está seguido por residuos hidrofóbicos en las posiciones cuarta, quinta y octava, después del residuos cargada, consistente en una hélice anfipática que tiene las posiciones 1, 4, 5, y 8 ubicadas sobre la misma cara. Desde que todas estas estructuras están compuestas de aminoácidos cargados y polares comúnmente hidrofóbicos, cada estructura puede existir simultáneamente dentro de un epítope Th sencillo (Partidos et al., J Gen Virol, 1991; 72:1293-99; Alexander et al., Immunity, 1994; 1:751-761). La mayoría, sino todos, de los epítopes de células T promiscuos contienen al menos una de las periodicidades descritas anteriormente. Estas características pueden incorporarse dentro de los diseños de "sitios Th artificiales idealizados".

Los epítopes Th promiscuos derivados de patógenos extranjeros incluyen como ejemplos, pero no se limitan a, epítopes de células T asistentes de antígeno de núcleo y hepatitis B de superficie (HB_{s} Th y HB_{c} Th), epítopes de células T asistentes de toxina pertussis (PT Th), epítopes de célula T asistente de toxina de tétanos (TT Th), epítopes de célula T asistentes de proteína F del virus de sarampión (MV_{F} Th), epítomes de células T asistentes de proteína de la membrana externa principal de Chlamydia trachomatis (CT Th), epítopes de célula T asistentes de toxina de difteria (DT Th), epítopes de células T asistentes de circunsporozoito de Plasmodium falciparum (PF Th), epítopes de células T asistentes de triosa fosfato isomerasa de Schistosoma mansoni (SM Th), y epítopes de células T asistentes de Trat Escherichia coli (Trat Th). El Th derivado de patógeno se listó como SEC. DE IDENT. NOS: 2-9 y 42-52 en la Patente Norteamericana 5,759,551; como sitio P11 asistente de Chlamydia en Stagg et al., Immunology, 1993; 79;1-9; y como péptido HBc 50-69 en Ferrari et al., J Clin Invest, 1991; 88: 214-222.

Los sitios Th útiles también pueden incluir Th combinatorial que incorporan sitios degenerados seleccionados dentro del diseño de los sitios Th idealizados. En Wang et al.(WO 95/11998), una clase particular de un epítope combinatorial se diseño como una "Biblioteca de Antígeno Sintética Estructurada" o SSAL. Un Th construido como un epítope SSAL está compuesto de sustituciones de ubicación organizadas alrededor de un marco estructural de residuos sin variación. La secuencia de la SSAL se determina al alineal la secuencia de aminoácidos primarios de un Th promiscuo, que retiene residuos relativamente sin variación en las posiciones responsables de la estructura única del péptido Th y que proporciona degeneración en las posiciones asociadas con el reconocimiento de los diversos elementos de restricción MHC. Listas de posiciones variables e invariables y aminoácidos preferidos están disponibles para motivos que enlazan MHC. (Meister et al., Vaccine, 1995; 13:581-591; Alexander et al., Immunity, 1994; 1:751-761).

Todos los miembros de la SSAL se producen simultáneamente en una síntesis peptídica de fase sólida sencilla en tándem con el epítope de célula B seleccionado de otras secuencias. La secuencia de la biblioteca Th mantiene los motivos estructurales de un Th promiscuo y acomoda la reactividad en un rango más amplio de haplotipos. Por ejemplo, el epítope Th degenerado descrito como SSAL1TH1 se modeló después de que un epítope promiscuo se tomó de la proteína F del virus de sarampión (Partidos et al., 1991). SSAL1TH1 se uso en tándem con un péptido objetivo LHRH. Como el epítope del sarampión, SSAL1TH1 sigue la secuencia de Rothbard y la regla de 1, 4, 5, 8:

1

Los residuos cargados de Glu o Asp se agregan en la posición 1 para incrementar la carga que rodea la cara hidrofóbica del Th. La cara hidrofóbica de la hélice anfipática se mantiene después por los residuos hidrofóbicos en 2, 5, 8, 9, 10, 13, y 16 con variabilidad en 2, 5, 8, 9, 10, 13 y 16 para proporcionar una fachada con la capacidad de enlace a un amplio rango de elementos de restricción MHC. El efecto neto de la característica SSAL es aumentar el rango de inmunocapacidad de respuesta a un Th artificial (WO 95/11998).

La base de datos JPO Proteins [Online] de 1 de julio de 1997 (1997-07-01), fragmento "N-terminal de humano CD4" divulga un péptido anti-VIH que tiene 52 residuos de aminoácidos de longitud y tiene 100% de identidad en una superposición de 52 aminoácidos con SEQ ID NO:1 como en la presente solicitud (aminoácidos 16-17). La presencia de una segunda cisterna, sin embargo, no puede derivarse a partir de dicho documento.

De acuerdo con la presente invención, los inmunógenos peptídicos que son efectivos para VIH se han diseñado con mapeo epítope preciso, represiones cíclicas, la incorporación de epítopes Th promiscuos o Th promiscuos idealizados y epítopes SSAL idealizados. Tales péptidos son preferidos debidos a que son seguros y efectivos. Se cree que los inmunógenos peptídicos de la presente invención proporcionan inmunopotencia debido a la presentación efectiva de un sitio de enlace VIH receptor/co-receptor el cual sea optimizado a través de la optimización y ciclización precisas y el uso de epítopes responsivos Th ampliamente reactivos

Resumen de la invención

Las composiciones peptídicas de la presente invención comprenden uno o más inmunógenos peptídicos que se han diseñado como se discutió anteriormente. Las composiciones peptídicas son la base para una vacuna para la prevención y tratamiento efectivo de la infección de VIH y los trastornos inmunes. Los péptidos componentes de la invención son preferidos por su presentación para neutralizar sitios efectores receptor/co-receptor del dominio parecido a CDR2 de CD4. Estos péptidos evocan respuestas de anticuerpos efectivas al (1) tener especificidad de sitio optimizada, obtenida por medio del mapeo epítope preciso del dominio parecido a CDR2 y la ciclización selectiva tomando en consideración la conformación nativa de CDR2 y por (2) su capacidad de respuesta Th ampliamente reactiva.

De acuerdo con la presente invención, se han proporcionado uno o más péptidos comprendiendo cada uno de los péptidos una de dos secuencias peptídicas que corresponden a los sitios efectores ubicados en el dominio CDR2 de CD4, o análogos inmunológicamente funcionales de los mismos.

Además, los sitios objetivo de los péptidos de la invención se vuelven más inmunogénicos por medio del enlace covalente a una proteína portadora a través del acoplamiento químico, o más preferiblemente por medio del enlace covalente a elementos inmunoestimuladores sintéticos (tales como epítopes Th promiscuos), a través del acoplamiento químico o más preferiblemente por síntesis peptídica directa. Ejemplos específicos de proteína portadora y elementos inmunoestimuladores se proporcionan, por ejemplo, portador de hemocianina de lapa ranurada (KLH), enterotoxina A de pertussis modificada (PEA), epítopes Th (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NO: 6), y péptidos inmunoestimuladores generales (por ejemplo, el péptido invasina (Inv) de Yersinia (SEC. DE IDENT. NO:7)).

Los péptidos sintéticos de la invención pueden representarse por las fórmulas:

2

en donde:

cada A es independientemente un aminoácido, o un péptido inmunoestimulador general;

cada B es independientemente un aminoácido u otro enlace químico;

X es un aminoácido \alpha-COOH o \alpha-COHN_{2};

Th es un epítope de célula T asistente o un homólogo que mejora la inmunidad o el segmento del mismo;

"péptido antígeno CD4-CDR2" es un antígeno peptídico que evoca anticuerpos que reaccionan con el complejo de superficie CD4;

n es desde 1 a 10;

m es de 1 a 4; y

o es de 0 a 10.

Las composiciones peptídicas de la presente invención comprenden inmunógenos peptídicos de 30 a 115 residuos de aminoácidos, de preferencia de 40 a 90 residuos de aminoácidos y más preferiblemente de 50 a 80 residuos de aminoácidos.

Las composiciones de la presente invención comprenden adicionalmente además adyuvantes y/o vehículos de suministro y otros ingredientes incorporados rutinariamente con las formulaciones de vacuna. La presente invención proporciona instrucciones para la dosificación de manera tal que se generen los anticuerpos inmunoterapéuticos dirigidos en contra de los sitios efectores CD4-CDR2 seleccionados.

La presente invención proporciona, por primera vez, péptidos sintéticos capaces de producir anticuerpos en mamíferos que son protectores en contra de la infección por aislados primarios de VIH de clados múltiples.

La respuesta anticuerpo a las composiciones peptídicas de la invención proporciona protección o terapia en contra de la infección de VIH de un huésped al: (1) bloquear el enlace de VIH a las células que expresan CD4, (2) bloquear la formación de sincitio inducido por VIH entre las células que expresan CD4, (3) neutralizar efectivamente in vitro la infección de células positivas CD4 por aislados primarios de todos los clados de VIH tipo 1 y VIH tipo 2, y (4) prevenir la infección por aislados primarios de VIH; cuando se administra al huésped una formación de vacuna que comprende una composición peptídica de la presente invención.

Las composiciones peptídicas son útiles para la prevención y tratamiento de la infección por VIH por aislados primarios de todos los clados de VIH-1 y aislados primarios de VIH-2 así como para el tratamiento de respuestas inmunes mediadas por células CD4 indeseables, tales como rechazo de trasplante, y trastornos autoinmunes, tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y psoriasis.

Breve descripción del dibujo

La Figura 1 representa la secuencia de aminoácidos de CD4 (SEC. DE IDENT. NO: 1) humano, una parte del complejo CD4/co-receptor antígeno de célula huésped como se deduce de la secuencia de ácidos nucleicos. Los aminoácidos se representan por los códigos de letras sencillas estándares como sigue:

3

El sistema de numeración es el de Littman et al. (Cell, 1988, 55:541. La región subrayada (AA27-AA66) es la región de la cual se derivan los péptidos antígeno CD4-CDR2 de la invención.

Descripción detallada de la invención

Como se usa en la presente "aislados primarios de virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1)" se obtienen por cultivo limitado, de hasta cinco pasadas, sobre células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donadores. Los aislados primarios pueden distinguirse de cepas de laboratorio adaptadas a líneas de célula T (TCLA) tales como IIIb/LAI, SF2 y MN que se han pasado durante el tiempo en líneas de células linfoides T humanas. Primero, los aislados más primarios no crecen fácilmente en líneas de células T y presentan fenotipos que inducen (SI) y que no inducen sincitio (NSI). Por ejemplo, muchos aislados primarios SI que inducen la formación de sincitio en cultivos de PBMC se replicarán en las líneas de células especialmente VIH sensibles MT2 T, pero unas cuantas se replicarán en líneas de células T menos permisivas tales como CEM o H9. Los aislados primarios NSI se replicarán solamente en células T primarias. Segundo, difieren de las cepas TCLA en su sensibilidad a la neutralización in vitro por formas solubles recombinantes de la proteína receptora viral CD4 (rsCD4) (Daar et al., PNAS USA, 1990, 87:6574-6578). Tercero, las cepas adaptadas a laboratorio son sensibles a la neutralización por anticuerpos con especificidades para la envoltura viral, mientras que los aislados primarios son resistentes (Sawyer et al., J Virol, 1994, 68:1342; Mascola et al., J Infect Dis, 1996, 173:340).

Como se usa en la presente, "CD4" significa cualquier proteína CD4 codificada por un gen CD4 que ocurre naturalmente. La CD4 se describió inicialmente como un marcador de superficie celular para linfocitos asistentes T. La CD4 se encontró subsecuentemente expresándose escasamente sobre monocitos, Langerhans, células microgliales, y subconjuntos de células B. También se encontró que la molécula CD4 participa directamente en la activación de células asistentes T específicas para antígeno a través de su función como un receptor para la molécula de clase II MHC. En 1984, se encontró que la CD4 humana es la receptora para VIH (Dalgleish et al., Nature, 1984, 312:763). El enlace de la glicoproteina de envoltura de VIH, gp120 a la CD4 representa la etapa inicial de la entrada viral dentro de la célula objetivo. La secuencia de aminoácido para la CD4 humana se incorpora en la presente de Maddon et al. (Cell, 1985; 42:93; y, Littman et al., Cell, 1988; 55:541) y se muestra como la Figura 1 y SEC. DE IDENT. NO: 1.

Como se usa en la presente, "CD4 soluble recombinante" o "rsCD4" es un polipéptido expresado por microorganismos recombinantes en células que consisten de AA_{1}-AA_{375} de CD4 humana (Figura 1, SEC. DE IDENT. NO:1).

Como se usa en la presente, "complejo de CD4 superficial" o " complejo de superficie que comprende CD4" o "complejo de receptor/co-receptor que comprende CD4" se refieren a la proteína CD4 nativa intacta, como aparece en su contexto natural sobre la superficie de las células de mamífero, junto con y/o complejo con cualquier proteína de membrana asociada.

Como se usa en la presente, el término "inmunógeno" se refiere a una composición peptídica, la cual, cuando se administra a un huésped, es capaz de inducir anticuerpos en contra de sitios efectores objetivos presentes sobre el dominio CDR2 de CD4 (SEC. DE IDENT. NOS: 2 y 3), conduciendo a anticuerpos de alto título que tienen actividades neutralizantes amplias en contra de aislados primarios de todos los clados de VIH tipo 1 (VIH-1) y tipo 2 (VIH-2). Los sitios objetivos CDR2-CD4 se subrayan en la Figura 1 y se enlistan como SEC. DE IDENT. NOS: 2 y 3.

Un "péptido antígeno CD4-CDR2" de acuerdo con la presente invención, está entre aproximadamente 25 y aproximadamente 50, de preferencia entre aproximadamente 30 y aproximadamente 46, aminoácidos de longitud, y contiene dos residuos de cisteína separados por una secuencia interpuesta de 28 a 40 residuos de aminoácido. La secuencia interpuesta puede ser cualquier porción contigua de la secuencia representada por los residuos 27 a 66 de SEC. DE IDENT. NO: 1, o puede ser un homólogo inmunológicamente funcional de los residuos 27 a 66 de SEC. DE IDENT. NO: 1.

Un péptido conjugado, como se usa en la presente, se refiere a una molécula que comprende un péptido antígeno CD4-CDR2 unido covalentemente a un péptido epítope asistente Th, por cualquier medio a la síntesis peptídica directa de la molécula. Ejemplos del acoplamiento covalente de un péptido antígeno CD4-CDR2 con un péptido epítope Th para formar un conjugado péptido es el acoplamiento tiol-haloacetamida, acoplamiento tiol-maleimida, formación de enlace disulfuro intercadena tiol-tiol, y similares.

Un "inmunógeno peptídico" como se usa en la presente se refiere a un péptido o péptido conjugado, que comprende un péptido antígeno CD4-CDR2 unido covalentemente a un péptido epítope Th, que comprende adicionalmente en forma opcional, un péptido inmunoestimulador general, un enlazador, y un espaciador como se describe adicionalmente en la presente; y que tiene la capacidad para evocar anticuerpos para el péptido antígeno CD4-CDR2.

El término "homólogos" como se usa en la presente se refiere a un péptido que tiene esencialmente la misma secuencia de aminoácidos, con sustituciones conservativas de hasta aproximadamente 10% de los aminoácidos. Las sustituciones conservativas son aquellas en donde un aminoácido se reemplaza por otro, preferiblemente de la misma clase (por ejemplo, hidrofóbico, polar, cargado, etc.), sin alterar significativamente las propiedades del péptido. Los homólogos también pueden tener inserciones o eliminaciones de aminoácidos que no alternan significativamente las propiedades inmunológicas del péptido. Los homólogos pueden obtenerse artificialmente, o pueden encontrarse como variantes que ocurren naturalmente de las secuencias peptídicas presentadas en la presente.

Los homólogos inmunológicamente funcionales son homólogos que inducen esencialmente la misma reacción del sistema inmune, por ejemplo, capacidad de respuesta de células T, capacidad de respuesta de células B o inducción de anticuerpos en contra de un antígeno dado.

Esta invención se dirige al uso de composiciones peptídicas novedosas como inmunógenos. Los inmunógenos son útiles para la generación, por inmunización activa, de anticuerpos de alto título dirigidos en contra de los sitios efectores (SEC. DE IDENT. NOS: 2 y 3) sobre el dominio CDR2 de CD4 en mamíferos que incluyen humanos. Los inmunógenos de la presente invención son útiles para la prevención y tratamiento de infección de virus de inmunodeficiencia así como para el tratamiento de respuestas inmunes mediadas por células CD4+ indeseables, tales como rechazo de transplante y trastornos autoinmunes tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y psoriasis.

Tales intervenciones empleadas en la prevención y tratamiento de la infección de VIH y trastornos inmunes a través del uso de anticuerpos reactivos a CD4 específicos, es decir, un tipo de inmunoterapia, puede lograrse pasivamente, a través del tratamiento profiláctico con anticuerpos "dirigidos al sitio" específicos, a un sitio sobre el dominio parecido a CDR2 de CD4. Más preferiblemente, como se describe en la presente, la terapia puede efectuarse a través de la inmunización activa, al inocular al huésped con una composición que comprende uno o más inmunógenos peptídicos de la presente invención. Estos inmunógenos producen la producción por el huésped de sus propios anticuerpos reactivos CD4-CDR2 dirigidos al sitio, los cuales tienen actividades neutralizantes amplias en contra de aislados primarios, todos los clados de VIH tipo 1 (VIH-1) y tipo 2 (VIH-2). Se cree que la inmunización activa proporcionará una forma más efectiva y más duradera de protección que la inmunización pasiva.

Los sitios objetivos del dominio parecido a CDR2 de la CD4 (SEC. DE IDENT. NOS: 2 y 3) se restringen conformacionalmente por ciclización a través de la adición de residuos de cisteína al N y C terminales (SEC. DE IDENT. NOS: 4 y 5). Tales sitios objetivo también pueden incluir homólogos inmunológicos de SEC. DE IDENT. NOS: 4 y 5 que comprenden 1-5 aminoácidos adicionales tomados de cualquier término de SEC. DE IDENT. NOS: 2 y 3, con la condición de que la estructura ondulada del disulfuro sencilla se conserve (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NOS: 10 y 11).

Los sitios objetivo se modifican adicionalmente dentro de los péptidos antígeno CD4-CDR2 inmunogénicos por acoplamiento químico a una proteína portadora, por ejemplo, hemocianina de lapa ranurada (KLH) y enterotoxina A de pertussis modificada (PEA). Una deficiencia de tales vacunas basadas en "proteína portadora de péptido antígeno CD4-CDR2" son (1) las inmunogenicidades débiles de los sitios antigénicos objetivos, un problema inherente asociados con casi todos los antígenos propios; (2) la gran porción de los anticuerpos no funcionales dirigidos en contra de las proteínas portadoras y (3) el potencial de supresión epitópico inducido por el portador.

Es por lo tanto preferible volver los péptidos inmunogénicos por la adición en tándem de Th promiscuos definidos químicamente y/u otros péptidos inmunoestimuladores, a través del acoplamiento químico o preferiblemente a través de la síntesis peptídica directa. Los inmunógenos preferidos de la presente invención minimizan la generación de anticuerpos irrelevantes para producir una respuesta inmune más enfocada a las "secuencias objetivo". Los anticuerpos deseados tienen reactividad al complejo de superficie CD4, sin producir efectos secundarios indeseables que puedan complicar el proceso de inmunoterapia para la prevención y tratamiento de la infección de VIH y trastornos inmunes. Además, los anticuerpos específicos de sitios seleccionados para los sitios deseados pueden generarse más ampliamente en una población huésped genéticamente diversa por el uso de Th promiscuos. Estas respuestas de anticuerpo conducen a anticuerpos de alto título que tienen actividades neutralizantes amplias en contra de aislados primarios de todos los clados de VIH tipo 1 y tipo 2.

La presente invención se dirige también a un método para usar las composiciones peptídicas como inmunógenos para la prevención y tratamiento de infección del virus de inmunodeficiencia así como para el tratamiento de respuestas inmunes mediadas por células CD4 indeseables, tales como rechazo al transplante, y trastornos autoinmunes tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y psoriasis.

Los anticuerpos que son específicos para el complejo receptor/co-receptor de la superficie de la célula huésped que comprende CD4, como se distinguen de los anticuerpos específicos para los cuales rsCD4, probablemente interactúan con el sistema inmune en formas diversas:

1.

Pueden bloquear la interacción Clase II CD4 entre las células T que expresan CD4 y otras células T activadas, células B, o monocitos;

2.

Pueden suministrar señales a las células T, inhibiendo así las funciones inmunorreguladoras mediadas por células T CD4+ normales;

3.

Pueden inducir la muerte celular de las células que expresan CD4 por apoptosis cuando se dispara por una unión simultánea de las moléculas receptoras de células T; y

4.

Bloquean las interacciones entre CD4 y VIH, lo cual inhibe la inmunopatología mediada por VIH.

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Los anticuerpos para el complejo de superficie que comprenden CD4 son buenos candidatos para prevenir y tratar la infección de VIH y enfermedades asociadas con VIH que incluyen SIDA. En un nivel más general, los anticuerpos para el complejo CD4 de superficie pueden ser útiles para prevenir o curar respuestas inmunes indeseables mediadas por células T que expresan CD4, tales como rechazo de transplantes, y enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, o psoriasis.

Las propiedades de los anticuerpos generados por las composiciones peptídicas de la presente invención se resumen aquí basadas en los resultados obtenidos en los Ejemplos 1-5:

1.

Enlace a rsCD4 en una prueba de ELISA;

2.

Enlace a células que expresan CD4 en una prueba inmunofluorescente; y

3.

Aislados primarios de VIH resistentes a la neutralización neutralizante en una prueba microplana in vitro.

Los anticuerpos con estas características son especialmente útiles para la prevención y tratamiento en humanos de enfermedades causadas por agentes infecciosos cuyos objetivos primarios son células CD4-positivas. En consecuencia, la presente invención proporciona composiciones peptídicas como inmunógenos, útiles para la prevención y tratamiento de enfermedades en humanos causadas por agentes infecciosos cuyos objetivos primarios son células CD4 positivas, particularmente las enfermedades relacionadas a VIH, que incluyen todas las etapas de SIDA. La presente invención también proporciona métodos para usar estas composiciones de anticuerpos.

Las composiciones peptídicas de la presente invención comprenden inmunógenos peptídicos que incorporan cualquiera de dos secuencias peptídicas que corresponden a sitios efector objetivos ubicados sobre el dominio parecido a CDR2 de CD4 (SEC. DE IDENT. NOS: 2 y 3), u homólogos inmunológicamente funcionales de los mismos. Los inmunógenos se caracterizan por su evocación de anticuerpos neutralizantes en contra de sitios efectores de CD4/co-receptor del dominio de CDR2 de CD4. Los inmunógenos evocan respuestas anticuerpo protectoras en virtud de su especificidad de sitio optimizada, obtenida por medio de (1) mapeo epítope preciso, (2) ciclización para reprimir sus conformaciones en consideración de su conformación nativa; y (3) su respuesta Th ampliamente reactiva.

Específicamente, los sitios objetivo se toman del dominio parecido CDR2 de la secuencia de la CD4 humana nativa. La secuencia de aminoácidos para la CD4 se incorpora en la presente de Maddon et al. (Cell, 1985; 42:93; y, Littman et al., Cell, 1988; 55:541) y se muestra como la Figura 1 y SEC. DE IDENT. NO:1. Los sitios objetivo CD4-CDR2 se muestran subrayados en la Figura 1 y se enlistan como SEC. DE IDENT. NOS: 2 y 3. Las composiciones peptídicas de la presente invención se producen preferiblemente como péptidos sintéticos que comprenden los sitios objetivo (SEC. DE IDENT. NOS: 2 y 3), en los cuales los objetivos se han modificado de sus secuencias nativas por la inserción de residuos de cisteína en, o cerca de la N terminal y C terminal, para facilitar la formación de péptidos cíclicos (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NOS: 4 y 5).

Las composiciones peptídicas de la invención también comprenden homólogos inmunológicos de SEC. DE IDENT. NOS: 4 y 5 que pueden comprender de 1-5 aminoácidos adicionales tomados de cualquier terminal de SEC. DE IDENT. NOS: 2 y 3 (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NOS: 10 y 11), con la condición de que la estructura ondulada de disulfuro sencilla se conserve. El sitio objetivo también puede incluir homólogos inmunológicamente funcionales que comprenden un péptido cíclico en el rango de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 aminoácidos, que tienen una secuencia de aminoácidos contigua derivada de SEC. DE IDENT. NOS: 2 y 3. La estructura cíclica es un elemento esencial de la invención, puesto que los péptidos que comprenden las contrapartes lineales de los sitios objetivos no producen anticuerpos con actividad neutralizante en contra de los aislados primarios de VIH.

Además, el sitio objetivo de los péptidos de la invención, se vuelve inmunogénico por medio del enlace covalente a una proteína portadora a elementos inmunoestimuladores sintéticos, tales como por ejemplo, epítopes Th promiscuos derivados de virus y bacterias patógenos, epítopes Th promiscuos artificiales, y péptidos inmunoestimuladores generales. Se proporcionan ejemplos específicos de proteínas portadoras y elementos inmunoestimuladores, por ejemplo, proteína portadora de hemocianina de lapa ranurada (KLH), proteína portadora de enterotoxina A de pertussis modificada (PEA), un Th de antígeno de superficie de virus de hepatitis B (SEC. DE IDENT. NO: 8), un Th artificial (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NO:6), y un péptido de invasina inmunoestimulador general (Inv) de Yersinia (SEC. DE IDENT. NO:7).

Los péptidos completamente sintéticos de la invención pueden representarse por las fórmulas:

4

en donde:

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cada A es independientemente un aminoácido, \alpha-NH_{2}, o un péptido inmunoestimulador general;

cada B se escoge independientemente del grupo que consiste de aminoácidos, -NHCH(X)CH_{2}SCH_{2}CO-, -NHCH(X)CH2SCH2CO(-N)Lys-, -NHCH(X)CH2S-succinimidil(-N)Lys-, y -NHCH(X)CH2S-(succinimidilo)-;

X es un aminoácido \alpha-COOH o \alpha-CONH_{2};

Th es un epítope de célula T asistente o un homólogo inmunomejorador o un segmento del mismo;

"péptido antígeno CD4-CDR2" es como se definió anteriormente, y es preferiblemente SEC. DE IDENT. NO:4 o SEC. DE IDENT. NO:5, o un homólogo de reacción cruzada e inmunológicamente funcional del mismo;

n es de 1 a aproximadamente 10;

m es de 1 a aproximadamente 4; y

o es de 0 a aproximadamente 10.

Las composiciones peptídicas de la presente invención comprenden inmunógenos peptídicos de aproximadamente 30 a aproximadamente 115 residuos de aminoácido, de preferencia de aproximadamente 40 a aproximadamente 90 residuos de aminoácido, y de mayor preferencia de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 residuos de aminoácido.

Cuando A es un aminoácido, puede ser cualquier aminoácido que ocurra naturalmente o que no ocurra naturalmente. Los aminoácidos que no ocurren naturalmente incluyen, pero no se limitan a D-aminoácidos, \beta-alanina, ornitina, norleucina, norvalina hidroxipropilina, tiroxina, ácido \gamma-aminobutírico, homoserina, citrulina y similares. Además, cuando m es más grande de uno, dos o más de los grupos A son aminoácidos, entonces cada aminoácido puede ser independientemente el mismo o diferente.

Cuando A es un dominio invasina, puede ser un epítope inmunoestimulador de la proteína invasina de una especie de Yersinia. Esta propiedad inmunoestimuladora, resulta de la capacidad del dominio de invasina para interactuar con las moléculas de \beta1 integrina presentes en las células T, particularmente inmunoactivadas por células T de memoria. La secuencia específica encontrada para un dominio invasina que interactúa con las integrinas \beta1 ha sido descrita por Brett et al (Eur J Immunol, 1993; 23:1608).

Una modalidad preferida del dominio invasina (Inv) para enlace a un epítope Th promiscuo ha sido previamente descrito en la Patente Norteamericana 5,759,551, la cual se incorpora en la presente para referencia. El dominio Inv tiene preferiblemente la secuencia:

5

o es un homólogo inmunoestimulador del mismo de la región que corresponde en otra proteína invasina de especies Yersinia. Tales homólogos también pueden contener sustituciones, eliminaciones o inserciones de residuos de aminoácido para acomodar la variación de cepa a cepa, con la condición de que los homólogos retengan las propiedades inmunoestimuladoras. El dominio invasina se une preferiblemente a través de un espaciador, proporcionado por aminoácidos adicionales "A", al péptido Th.

En una modalidad preferida, n es 3 y (A)_{3} es un dominio invasina (Inv), glicina y glicina en este orden.

(B)_{o} es un espaciador opcional y comprende aminoácidos los cuales pueden ocurrir naturalmente o los aminoácidos que no ocurren naturalmente como se describió anteriormente. Cada B es independientemente la misma o diferente. Las proteínas portadoras se unen covalentemente a los péptidos con un espaciador (por ejemplo, Lys-Lys-Lys) por medio de acoplamiento químico. Los aminoácidos de (B)_{o} también pueden proporcionar un espaciador, por ejemplo, Gly-Gly o \varepsilonNLys, entre el epítope Th promiscuo y el péptido antígeno CD4-CDR2 (SEC. DE IDENT. NOS: 4 y 5), para evocar suficientes respuestas anticuerpo. Además de separar físicamente el epítope Th del epítope de célula B (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NOS:4 y 5) y homólogos inmunológicos del mismo, un espaciador tal como Gly-Gly puede desorganizar cualquier estructura secundaria de artefacto creada por la unión del epítope Th con los péptidos antígeno CDR-CDR2 y eliminar con eso la interferencia entre las respuestas Th y/o célula B.

Los aminoácidos de (B)_{o} también pueden formar un espaciador el cual actúa como un gozne flexible que mejora la separación de los dominios de Th e IgE. Los ejemplos de las secuencias que codifican goznes flexibles se encuentran en la región de gozne de cadena pesada de inmunoglobulina. Las secuencias de gozne flexible son frecuentemente ricas en prolina. Un gozne flexible particularmente útil se proporciona por la secuencia Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEC. DE IDENT. NO:9), en donde Xaa es cualquier aminoácido, y preferiblemente ácido aspártico. La separación conformacional proporcionada por los aminoácidos de (B)_{o} permite interacciones más eficientes entre el inmunógeno específico presentado y las células Th apropiadas y las células B y así mejora las respuestas inmunes al epítope Th y el epítope que produce anticuerpo y su reacción cruzada y homólogos inmunológicamente funcionales de los mismos.

Th es una secuencia de aminoácidos (aminoácidos naturales o no naturales) que comprende un epítope Th. Un epítope Th puede consistir de un epítope continuo o discontinuo, de ahí que no todos los aminoácidos del Th son necesariamente parte del epítope. Los epítopes Th, que incluyen homólogos y segmentos de epítopes Th, son capaces de mejorar y estimular una respuesta inmune a los péptidos de antígeno CD4-CDR2 (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NOS:4 y 5, y homólogos inmunológicamente funcionales de los mismos). Los epítopes Th que son inmunodominantes y promiscuos son altamente y ampliamente reactivos en poblaciones animales y humanas con tipos MHC ampliamente divergentes (Partidos et al., 1991; US 5,759,551). El dominio Th de los péptidos del sujeto tiene de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 aminoácidos y de preferencia de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 aminoácidos. Cuando están presentes epítopes Th múltiples (es decir \geq 2), entonces cada epítope Th es independientemente el mismo o diferente. Los segmentos son porciones contiguas de un epítope Th que son suficientes para mejorar o estimular una respuesta inmune a los péptidos antígeno CD4-CDR2 (por ejemplo SEC. DE IDENT. NOS:4 y 5), y/o para análogos inmunológicamente funcionales de los mismos.

Los epítopes Th de la presente invención incluyen aquellos derivados de patógenos extranjeros y se proporcionan como ejemplos, pero no se limitan a, epítopes de célula T asistente, antígeno de núcleo y superficie de hepatitis B (HB_{s} Th y HB_{c} Th), epítopes de células T asistente de toxina pertussis (PT Th), epítopes de célula T asistente de toxina de tétanos (TT Th), epítopes de célula T asistente de proteína F de virus de sarampión (MV_{F} Th), epítopes de célula T asistente de proteína de membrana externa principal de Chlamydia trachomatis (CT Th), epítopes de célula T asistente de toxina de difteria (DT Th), epítopes de célula T asistente de circunsporozoito de Plasmodium falciparum (PF Th), epítopes de células T asistente de triosa fosfato isomerasa de Schistosoma mansoni (SM Th), y epítopes de célula T asistente Trat de Escherichia coli (Trat Th). Los epítopes de Th derivados de patógenos enlistados como SEC. DE IDENT. NOS:2-9 y 42-52 en la Patente Norteamericana 5,759,551; como célula T asistente P11 de Chlamydia en Stagg et al., Immunology, 1993; 79; 1-9; y como un péptido HBc 50-69 en Ferrari et al., J Clin Invest, 1991; 88: 214-222; se incorporan en la presente para referencia y se enlistan en la presente junto con otros como SEC. DE IDENT. NOS: 8, 13, 38-58 (Tabla 8).

Los epítopes incluyen adicionalmente Th idealizados artificiales por ejemplo, SEC. DE IDENT. NOS: 6, 12, 36, 59 (Tabla 9), y homólogos inmunológicamente funcionales. Los homólogos de Th funcionales incluyen homólogos inmunomejoradores, homólogos de reacción cruzada y segmentos de cualquiera de estos epítopes de Th. Los homólogos de Th funcionales incluyen adicionalmente sustituciones conservativas, adiciones, eliminaciones e inserciones desde uno a aproximadamente 10 residuos de aminoácido y el epítope Th que no modifica esencialmente la función estimuladora del Th del epítope Th.

Los conjugados peptídicos de la invención también incluyen péptidos antígeno CD4-CDR2 (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NOS: 4 ó 5) acoplados a una proteína portadora (por ejemplo, hemocianina de lapa ranurada).

Los inmunógenos peptídicos preferidos de esta invención son los péptidos que contienen los péptidos antígeno CD4-CDR2 (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NO: 4 ó 5, u homólogos inmunológicamente funcionales de los mismos) y los epítopes Th, y opcionalmente un sitio inmunoestimulador general, por ejemplo, Inv (SEC. DE IDENT. NO: 7). En una modalidad más preferida, el epítope Th es un HBs Th, HBc Th, MVF Th, PT Th, TT Th, CT Th o VIH Th derivado de patógenos extranjeros o un Th artificial idealizado, o un homólogo inmunogénico funcional de los mismos. Opcionalmente, A es un péptido inmunoestimulador general, por ejemplo, Inv (SEC. DE IDENT. NO: 7), preferiblemente unida por medio de un espaciador Gly-Gly o \varepsilonNLys.

La estructura del sitio modificado se basa en una secuencia peptídica tomada del dominio parecido a CDR2 de la CD4 humana (aminoácidos 27-66 de la SEC. DE IDENT. NO:1), o la secuencia homóloga de otras especies. Este sitio objetivo CD4-CDR2 se somete a las siguientes modificaciones:

(1)

la adición o inserción de un residuo de cisteína cercano a la N-terminal,

(2)

la adición o inserción de un residuo cisteína cerca de la C terminal, preferiblemente en, o cerca de la posición 66 o una posición homóloga, y

(3)

la formación de un enlace disulfuro entre las cisteínas retenidas para producir una estructura cíclica.

Las estructuras peptídicas también pueden comprenden de 1 a 5 aminoácidos adicionales tomados de cualquier término del segmento 27-66 o 39-66 de la CD4, con la condición de que se conserve la estructura cíclica ondulada de disulfuro sencilla (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NOS: 10 y 11). Preferiblemente, cualesquiera cisteínas que intervengan en la secuencia nativa no intentadas para ser empleadas para la ciclización se sustituirán conservativamente por, por ejemplo, con serina.

Por ejemplo, los sitios objetivo de CD4-CDR2 humana (SEC. DE IDENT. NOS:2 y 3) se ciclizan por medio de agregar cisteínas en o cerca de ambas de N- y C-terminales (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NOS:4 y 5) o a través de una cisteína agregada en el N-terminal y una sustitución de cisteína cerca de la C terminal (por ejemplo, sustituyendo Cys por Phe en la posición 67, para obtener SEC. DE IDENT. NOS:10 y 11).

Los péptidos antígeno CD4-CDR2 modificados, ciclizados y traslapados con las siguientes secuencias

6

se proporcionan a manera de ejemplos. En estos ejemplos, las posiciones modificadas se indican por el tipo en negritas.

El anticuerpo que es evocado por los inmunógenos peptídicos que comprenden los péptidos de antígeno CD4-CDR2 de la invención es de reacción cruzada con el complejo receptor/co-receptor de la superficie celular del huésped que comprende CD4, y neutraliza los aislados primarios de VIH. Los sitios antigénicos objetivo correspondientes para la superficie CD4 de otras especies pueden de la misma forma derivarse de los segmentos homólogos de las especies relevantes.

Los homólogos de reacción cruzada e inmunológicamente funcionales de los péptidos antígenos CD4-CDR2 (SEC. DE IDENT. NOS: 4, 5, 10 y 11) pueden comprender adicionalmente sustituciones conservativas, adiciones, eliminaciones o inserciones desde uno hasta aproximadamente cuatro residuos de aminoácido, con la condición de que los homólogos peptídicos sean capaces de producir respuestas inmunes de reacción cruzada con los péptidos CD4-CDR2 (SEC. DE IDENT. NOS: 2, 3, 4 y 5) y que tienen actividad neutralizante en contra de los aislados primarios de VIH. Las sustituciones conservativas, adiciones e inserciones son conocidas por aquellos expertos en la técnica, y pueden lograrse fácilmente con aminoácidos naturales o no naturales como se definen en la presente.

Los inmunógenos peptídicos preferidos de esta invención son péptidos que contienen (1) los sitios CD4-CDR2 modificados ciclizados referidos en la presente como péptidos antígeno CD4-CDR2 (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NOS:4, 5, 10 y 11) u homólogos inmunológicos de los mismos y (2) Los péptidos epítope Th. Los inmunógenos peptídicos más preferidos son aquellas construcciones en tándem que contienen los péptidos antígeno CD4-CDR2 ciclizados (SEC. DE IDENT. NOS: 4, 5, 10 y 11) u homólogos de reacción cruzada e inmunológicamente funcionales de los mismos; un espaciador (por ejemplo, Gly-Gly o \varepsilonNLys); un epítope Th seleccionado del grupo que consiste de un HB_{s} Th, HB_{c} Th, MV_{F} Th, PT Th, TT Th, SMTh, VIHTh (por ejemplo., SEC. DE IDENT. NOS:8, 38-50, 55), como Th artificial (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NOS:6, 12, 36, 59), o un homólogo de los mismos; y opcionalmente, un dominio Inv (SEC. DE IDENT. NO:7) o análogo del mismo.

Los inmunógenos peptídicos de esta invención pueden fabricarse por métodos de síntesis química los cuales son bien conocidos a los artesanos comúnmente expertos. Ver, por ejemplo, Fields et al., Capítulo 3 en Synthetic Péptidos: A User's Guide, ed. Grant, W.H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p.77. De ahí, los péptidos pueden sintetizarse utilizando las técnicas Merrifield automatizadas de síntesis de fase sólida con el \alpha-NH_{2} protegido ya sea por química t-Boc o Fmoc, y usando aminoácidos protegidos de cadena lateral disponibles comercialmente. Ejemplos de instrumentos adecuados para la síntesis peptídica son el Applied Biosystems Péptido Synthesizer Modelo 430A o 431.

Después del ensamble completo del inmunógeno peptídico deseado, la resina se trata de acuerdo a los procedimientos estándares para desdoblar los péptidos de la resina y desbloquear los grupos funcionales sobre las cadenas secundarias de aminoácido. El péptido libre se purifica por HPLC y se caracteriza bioquímicamente, por ejemplo, por análisis de aminoácidos, por espectrometría de masas, y/o por secuenciación. Los métodos de purificación y caracterización para los péptidos son bien conocidos para aquellos con experiencia en la técnica.

Otros medios químicos para generar las construcciones peptídicas de la invención que contienen CD4 y los sitios Th incluyen el ligado de péptido haloacetilado y cisteínalizado a través de la formación de un enlace "tioéter". Por ejemplo, una cisteína puede agregarse a la C terminal de un péptido que contiene Th y el grupo tiol de la cisteína puede usarse para formar un enlace covalente para un grupo electrofílico (por ejemplo, un N-(cloroacetil) o una maleimida derivada con un grupo \alpha- o \varepsilon-NH_{2} de un residuo de lisina) unido a la N terminal de un péptido antígeno CD4-CDR2. De esta manera, una composición conjugada es peptídica que comprende Th-(B)_{o}-(CD4-CDR2 péptido antígeno) o su inverso, (péptido antígeno CD4-CDR2)-(B)_{o}-Th, con o sin sitio inmunoestimulador general, puede obtenerse, en donde uno de los enlazantes "B" es Gly-Gly, (\varepsilon-N)Lys, -NHCH(X)CH_{2}SCH_{2}CO-, -NHCH(X)CH_{2}SCH_{2}CO(\varepsilon-N)Lys-, -NHCH(X)CH_{2}S-succinimidil(\varepsilon-N)Lys-, o -NHCH(X)CH_{2}S-(succinimidilo)-.

El sujeto inmunógeno también puede polimerizarse. La polimerización puede lograrse por la reacción del inmunógeno con un reactivo reticulante, por ejemplo por reacción entre los grupos glutaraldehído y -NH_{2} de los residuos de lisina, utilizando metodología de rutina.

Por otro método, los inmunógenos peptídicos sintéticos pueden polimerizarse o co-polimerizarse por utilización de una cisteína adicional agregada a la N-terminal del inmunógeno. El grupo tiol de la cisteína N-terminal, puede usarse para la formación de un enlace "tioéter" con haloacetilo modificado con aminoácido o una maleimida derivada con un grupo \alpha- o \varepsilon-NH_{2} de un residuo de lisina que se une a la N-terminal de una molécula de núcleos poli-lisil ramificada (por ejemplo, K_{2}K, K_{4}K_{2}K o K_{8}K_{4}K_{2}K). El sujeto inmunógeno también puede polimerizarse como una estructura ramificada a través de la síntesis de la construcción de péptido deseada directamente sobre una resina de núcleo poli-lisil ramificada (Wang, et al., Science, 1991; 254:285-288).

Alternativamente, los inmunógenos peptídicos sintéticos más largos pueden sintetizarse por técnicas de ADN recombinante bien conocidas. Muchos manuales estándares sobre tecnología de ADN proporcionan protocolos detallados para producir los péptidos de la invención. Para construir un gen que codifique un péptido de esta invención, la secuencia de aminoácidos se traduce inversamente dentro de una secuencia de ácido nucleico, preferiblemente utilizando el tratamiento de codón utilizado para el organismo en el cual el gen será expresado. Enseguida, se hace un gen sintético, típicamente al sintetizar oligonucleótidos que se traslapan los cuales codifican el péptido y cualesquier elementos regulatorios necesarios. El gen sintético se inserta en un vector de clonación adecuado y los recombinantes se obtienen y se caracterizan. El péptido se expresa después bajo condiciones adecuadas apropiadas para el sistema de expresión seleccionado y el huésped. El péptido se purifica y caracteriza por métodos estándares.

Los ácidos nucleicos descritos anteriormente pueden ser útiles en si mismos como componentes de las así llamadas "vacunas de ADN". En esta modalidad de la invención, la expresión de los péptidos inmunogénicos de la invención se induce en las propias células del paciente, por la introducción dentro de aquellas células de ácidos nucleicos que codifican los péptidos, usando preferiblemente codones y promotores que optimizan la expresión en células humanas. Los métodos para fabricar y usar vacunas de ADN se describen en las Patentes Norteamericanas 5,580,859, 5,589,466, y 5,703,055; ver también WO 97/02840 y W. McDonnell y F. Askari, New Engl. J. Med., 1996, 334:2-45, todas las cuales se incorporan en la presente para referencia. Tales métodos para fabricar y usar los péptidos y conjugados peptídicos de esta invención se contemplan que están dentro del alcance de esta invención.

La eficiencia de la composición peptídica de la presente invención puede establecerse al inyectar animales, por ejemplo, cobayos, seguido por la observación de la respuesta inmune humoral a los péptidos antígeno CD4-CDR2 por la capacidad del suero inmune para neutralizar los aislados primarios de VIH como se detalla en los Ejemplos.

Otro aspecto de esta invención proporciona una composición de vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de uno o más de los inmunógenos peptídicos de esta invención en un sistema de suministro farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones inmunogénicas se usan para la prevención y tratamiento de la infección del virus de inmunodeficiencia, así como para el tratamiento de respuestas inmunes indeseables mediadas por células T que expresan CD4, tales como rechazo de transplante, y trastornos autoinmunes tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y psoriasis.

En consecuencia, la composición peptídica de la invención puede formularse como una composición inmunogénica usando adyuvantes, emulsificadores, portadores farmacéuticamente aceptables u otros ingredientes rutinablemente provistos en composiciones de vacuna. Los adyuvantes o emulsificadores que pueden ser usados en esta invención incluyen alumbre, adyuvante incompleto de Freund, liposina, saponina, escualeno, L121, emulsígeno, monofosforilo lípido A (MPL), bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), QS21, ISA206 e ISA 720, así como otros adyuvantes y emulsificadores eficaces conocidos. Tales formulaciones se determinan fácilmente por alguien con experiencia común en la técnica y también incluyen formulaciones para liberación inmediata y/o para liberación sostenida, y para la inducción de inmunidad sistémica y/o inducción de inmunidad de la mucosa localizada, la cual puede lograrse, por ejemplo, por captura inmunogénica, o por co-administración con micropartículas. Las vacunas presentes pueden administrarse o cualquier ruta conveniente que incluye ruta subcutánea, oral, intramuscular, o alguna ruta parenteral o enteral. En forma similar, los inmunógenos pueden administrarse como una dosis sencilla o dosis múltiples. Los itinerarios de inmunización se determinan fácilmente por el artesano experto común.

La composición inmunogénica de la invención presente contiene una cantidad efectiva de uno o más de los inmunógenos peptídicos de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptables. Tal composición en una forma de dosificación unitaria adecuada generalmente contiene aproximadamente 0.5 \mug hasta aproximadamente 1 mg del inmunógeno por kg de peso corporal. Cuando se suministra en dosis múltiples, puede dividirse convenientemente en una cantidad apropiada por forma de dosificación unitaria. Por ejemplo, la dosis inicial, por ejemplo, 0.2-2.5 mg; preferiblemente 1 mg, de inmunógeno representado como una composición peptídica de la presente invención, será administrada por inyección, de preferencia intramuscularmente, seguido por dosis repetidas (impulsor). La dosificación dependerá de la edad, peso y salud en general del paciente como es bien conocido en las técnicas de vacuna terapéuticas.

Las vacunas que contienen mezclas de los inmunógenos peptídicos del sujeto con dos o más de epítopes Th pueden mejorar la inmunoeficiencia en una población más amplia y así proporcionar una respuesta inmune mejorada al péptido antígeno CD4-CDR2 (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NOS: 4 y 5).

La respuesta inmune a los inmunógenos CD4-CDR2 sintéticos de la invención pueden mejorarse por suministro a través de la captura en, o sobre micropartículas biodegradables del tipo descrito por O'Hagan et al. (Vaccine, 1991; 9:768). Los inmunógenos pueden encapsular con y sin un adyuvante, y tales micropartículas pueden portar un adyuvante inmunoestimulador. Las micropartículas también pueden co-administrarse con los inmunógenos peptídicos para potenciar las respuestas inmunes que incluyen inmunidad de la mucosa localizada la cual puede aplicarse especialmente a un virus transmitido por la mucosa tal como VIH, y para proveer liberación controlada por el tiempo para las respuestas sostenidas o periódicas, para la administración oral, y para la administración local. (O'Hagan et al., 1991; y, Eldridge et al., 1991; 28:287).

Para que esta invención se entienda mejor, se establecen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos, son solamente para propósitos de ilustración, y no deben interpretarse como que limitan el alcance de la invención de ninguna manera.

Ejemplos

Los péptidos de sitio antigénico objetivo de estos Ejemplos se sintetizaron por el método de fase sólida subrayado en el Ejemplo 1. Cada péptido puede representarse por la fórmula (A)_{n}-(Th)_{m}-(B)_{o}-(CD4-CDR2 péptido antígeno) o (A)_{n}-(CD4-CDR2 péptido antígeno)-(B)_{o}-(Th)_{m}, pero otras fórmulas como se describieron anteriormente también se abarcan dentro de la invención. El sitio antigénico objetivo CD4 es un péptido ciclizado, ejemplificado por SEC. DE IDENT. NOS: 4, 5, 10 y 11, pero los homólogos inmunológicamente funcionales que comprenden un péptido cíclico en el rango de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 aminoácidos, que tienen una secuencia de aminoácidos contigua derivada de SEC. DE IDENT. NOS: 2 ó 3 y hasta una secuencia de cinco aminoácidos adicional unida a la N- o C-terminal de la estructura cíclica, intentan estar dentro del alcance de la invención.

Cada péptido utilizando para estos ejemplos tiene Gly-Gly o \varepsilonNLys como el espaciador (B)_{o} entre el Th y los elementos inmunogénicos del sitio objetivo CD4-CDR2 modificado y algunos incorporan un elemento opcional (A)_{3} que comprende Inv-Gly-Gly en donde Inv (SEC. DE IDENT. NO:7), está acoplado al péptido antigénico (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NOS:32-35), aunque péptidos de la invención también pueden tener otros espaciadores (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NO:9, \varepsilonNLys) o no espaciadores. Los epítopes Th, como se ejemplificó en la Tabla 8, incluyen sitios asistentes promiscuos derivados de patógenos extranjeros tales como proteína F del virus de sarampión y núcleo y superficie del virus de hepatitis B, y otros epítopes Th como se muestra en la Tabla 8 (SEC. DE IDENT. NOS:8, 13 y 43-58) y Th artificial es como se muestra en la Tabla 9 (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NOS: 6, 12, 36 y 59). Los péptidos de este ejemplo también incluyen un sitio inmunoestimulador general opcional (por ejemplo, SEC. DE IDENT. NO: 7).

Además, la invención no se limita a Inv como el elemento inmunoestimulador adicional.

Ejemplo 1 Identificación de sitios efectores potenciales sobre el complejo de superficie de CD4/co-receptor A. Diseño Peptídico

Los sitios dentro de todos los cuatro dominios de la CD4 humana junto con los sitios co-receptores que representan los cuatro dominios externos de receptores de quimiocina, que incluyen CC-CKR1, CC-CKR2b, CC-CKR3, CCKR5 y LESTR se seleccionaron para imitación por péptidos. Como el "epítope" reconocido por MAb B4 (WO 97/46697) es conformacional en naturaleza, ninguno de los péptidos lineales derivados del anterior receptor/co-receptores reaccionó fuertemente con MAb B4, aunque la reactividad de MAb B4 con rsCD4 se mejoró significativamente en la presencia de ciertos péptidos derivados de los dominios co-receptores de quimiocina como se muestra en la WO 97/46697.

A pesar de la falta de fuerte reactividad de MAb B4 con cualquier CD4 sencillo- o péptidos derivados de co-receptor quimiocina, se detectaron reactividades MAb B4 débiles para péptidos derivados de diversas regiones de CD4 (AA1-A20, AA81-92, AA60-AA109, AA118-AA165, AA235-251, AA297-AA351, o AA361-AA375). Esto impulsó una respuesta diferente que pretende diseñar péptidos sintéticos que producirían anticuerpos de alta afinidad reactivos con un o unos sitios vecinos al conformacional reconocidos por MAb B4, para inhibición de la infección de VIH de las células objetivo.

Las secuencias de tales sitios potenciales diseminadas a través de los cuatro dominios de la CD4 y los dominios externos de diversos co-receptores de quimiocina se diseñaron por lo tanto y se sintetizaron como péptidos objetivo y se volvieron inmunógenos por péptidos de construcción en donde los Th promiscuos derivados de HBsAg (SEC. DE IDENT. NO:8) e Inv (SEC. DE IDENT. NO:7) se enlazaron a los sitios objetivo, como se muestra en las Tablas 1 y 2. Los sitios CD4 específicos dentro de estos dominios se seleccionaron para ciclización basados en las predicciones del modelo tridimensional de Brookhaven para la CD4 humana (http:www.pdb.bnl.gov/pdb.bin/pdbids) de ondulaciones expuestas a las superficies. Las restricciones cíclicas especificadas se instalaron dentro de estos péptidos para maximizar las reacciones cruzadas entre los sitios antigénicos objetivo y la molécula CD4 nativa.

En consecuencia, varias de las construcciones sintéticas de las Tablas 1 y 2 se sintetizaron con cisteínas introducidas no encontradas en la secuencia nativa, para producir ondulaciones de enlace disulfuro para imitar las estructuras onduladas predichas por el modelo de Brookhaven. En algunos casos, las cisteínas que ocurren naturalmente se sustituyeron con serinas para prevenir la formación de conformaciones no favorecidas por el modelo. Para péptidos derivados de un co-receptor quimiocina, el reticulado entre los péptidos de los dominios externos 2 y 3, mostrado en el extremo derecho de la Tabla 2, se hizo por medio de residuos de cisteína que existen naturalmente en los dominios respectivos, en imitación de su estructura nativa.

Los sitios marcados por * en la columna de descripción de la Tabla 1 se han diseñado así con ciclización especificada. Otros sitios peptídicos son lineales. Los péptidos marcados por "a" en las columnas de forma de las Tablas 1 y 2 representan el sitio antígeno objetivo CD4 o CCKR solo. Estos se usaron como los antígenos sustrato para el péptido basado en ELISA. Los péptidos marcados por "b" se sintetizaron como sitios antigénicos objetivo en tándem con el sitio HBs Th (SEC. DE IDENT. NO:8) como se muestra. Los péptidos marcados por "c" son variantes de las construcciones "b" sintetizadas en tándem con el péptido inmunoestimulador de dominio Inv (SEC. DE IDENT. NO:7) como se muestra en las Tablas 1 y 2. Los péptidos diseñados como "d" son variantes de las construcciones "b" sintetizadas en tándem con un segundo péptido Th CT P11 Th (SEC. DE IDENT. NO:13) unido a la N-terminal a través de un enlazante Gly-Gly. Los péptidos marcados por "e" se sintetizaron como la inversa de "b" con los sitios Th ubicados en la C terminal y el sitio antigénico objetivo en la N terminal de la construcción. Un péptido marcado por "g" representa un péptido tetramérico ramificado con síntesis conducido directamente sobre un núcleo de resina polilisilo. Los péptidos marcados por "x" representan péptidos que comprenden una estructura de dos cadenas unida por un enlace inter-disulfuro por medio de los residuos de cisteína que existen naturalmente presentes sobre las cadenas respectivas.

Otros sitios Th usados en los experimentos mostrados en las Tablas 1 y 2, pero no mostrados aquí, emplean los sitios Th artificiales, "1,4,9 PALINDROMIC" (SEC. DE IDENT. NO:6) y "Syn Th (1,2,4)" (SEC. DE IDENT. NO:12). Los péptidos con el sitio Inv ubicados en la C terminal, y el antígeno CD4-CDR2 en la N terminal (péptido antígeno CD4-CDR2 GG-Th-GG-Inv) también se prepararon, pero no se muestran.

Los péptidos inmunogénicos "b", "c", "d", "e", "x", y "otros" Th usados para los estudios de las Tablas 1 y 2 también se sintetizaron con espaciadores de Gly-Gly para la separación del sitio antigénico objetivo del sitio Th, y la separación del Th del Inv o de un segundo sitio inmunoestimulador Th. Los inmunógenos peptídicos resultantes se seleccionaron como sitios antigénicos objetivos candidatos por su capacidad para inducir huéspedes inmunizados anticuerpos con las siguientes propiedades:

1.

Enlace al sitio antigénico objetivo en una prueba de ELISA;

2.

Enlace a rsCD4 en una prueba de ELISA, en los casos de péptidos antigénicos derivados de CD4;

3.

Enlace en una prueba inmunofluorescente a células T que expresan el complejo de receptor de superficie celular/co-receptor que comprende CD4;

\quad

y

4.

Aislados primarios de VIH resistentes a la neutralización neutralizante en una prueba de microplana in vitro.

B. Selección de Péptidos Antigénicos Objetivos Candidatos 1. Síntesis de Péptidos Antigénicos Objetivos derivados de Receptor de Quimiocina y CD4

Los péptidos enlistados en las Tablas 1 y 2 en su forma correspondiente "a", "b", "c", "d", "e", o "x" se sintetizaron individualmente por la técnica de síntesis en fase sólida de Merrifield en sintetizadores peptídicos automatizados de Applied Biosystems (Modelos 430, 431 y 433A) que usan química Fmoc. La preparación de inmunógenos peptídicos comprende una biblioteca de antígeno sintético estructurado (SSAL) para epítopes de células T artificiales "(1, 4, 9 PALINDROMIC) Th" (SEC. DE IDENT. NO:6) como se logra al proporcionar una mezcla de aminoácidos alternativos para acoplamiento en una posición variable dada, en la relación apropiada como se especifica en el diseño de SEC. DE IDENT. NO:6. Los péptidos SSAL que tienen diseños de biblioteca para los sitios de antígeno objetivo de células B u otros sitios Th SSAL pueden sintetizarse en una forma similar. Después del ensamble completo del péptido deseado, la resina se trató de acuerdo al procedimiento estándar utilizando ácido trifluoroacético para desdoblar el péptido de la resina y desbloquear los grupos protectores sobre las cadenas secundarias de aminoácidos. Para los péptidos cíclicos, el péptido desdoblado se dejó permanecer en 15% de DMSO en agua durante 48 horas para facilitar la formación del enlace disulfuro intracadena entre cisteínas. Los péptidos desdoblados, extraídos y lavados se purificaron por HPLC y se caracterizaron por espectrometría de masa y HPLC de fase inversa.

1. La generación de Suero Inmune Específico para el Sitio Antigénico Objetivo derivado del Receptor Quimiocina y CD4 para Eficiencia Funcional y Evaluación.

La eficiencia inmunogénica de las composiciones peptídicas se evalúo como se especifica por el protocolo de inmunización experimental delineado posteriormente seguido por pruebas serológicas de respuesta anticuerpo.

Diseño Experimental Estándar

Inmunógenos:

(1)

Inmunógeno peptídico individual; o

(2)

una mezcla que comprende una relación equimolar de inmunógenos peptídicos como se especifica en cada protocolo.

Dosis:

\quad

100 \mug en 0.5 ml por inmunización a menos que se especifique lo contrario.

Ruta:

\quad

intramuscular a menos que se especifique lo contrario.

Adyuvantes:

(1)

Adyuvante Completo de Freund (CFA)/Adyuvante Incompleto (IFA):

(2)

0.4% de Alumbre (hidróxido de aluminio); o

(3)

otros adyuvantes como se especifica. Un adyuvante por inmunógeno por grupo.

Itinerario de Dosis:

\quad

0, 2 y 4 semanas; o 0, 3 y 6 semanas; o como se especifique de otra manera. Los grupos CFA/IFA recibieron CFA semana 0, e IFA en semanas subsiguientes. Alumbres u otros grupos adyuvantes especificados recibieron las mismas formulaciones para todas las dosis.

Itinerario de Sangrado:

\quad

semanas 0, 3, 6 y 8, o como de otra forma especificado

Especies:

\quad

Cobayos Duncan Hartley

Tamaño de Grupo:

\quad

3 cobayos/grupo

Prueba:

\quad

ELISA específica para cada actividad antipeptídica de suero inmune. Los sustratos de fase sólida fueron los correspondientes a la forma "a" del péptido antigénico objetivo (por ejemplo, péptido antigénico objetivo CD4, péptido derivado del receptor de quimiocina, etc.).

La sangre se recolectó y procesó en suero, y se almacenó antes de titularlo por ELISA con los péptidos antigénicos objetivo.

2. Sueros y Anticuerpos

Los siguientes reactivos serológicos, derivados de suero inmune de cobayos, o murinos o anticuerpo monoclonal humanizado se utilizaron para evaluaciones en diversas pruebas serológicas. Todos los sueros de cobayos dirigidos en contra de rsCD4, y los sitios antigénicos objetivos derivados de co-receptor quimiocina y CD4 se obtuvieron como se describió anteriormente en diversos puntos de tiempo después de la inmunización. Se obtuvieron otros reactivos serológicos a través de estudios previos o de fuentes externas como se describen. Estos se incorporaron ocasionalmente para propósitos de comparación.

Por ejemplo, gp anti-gp120 V3 MN (anti-V3 MN) es suero reunido de cobayos que ha sido hiperinmunizado con un antígeno peptídico sintético que corresponde al dominio V3 hipervariable de gp120 de VIH-1 MN (Wang et al., Science, 1991, 254:285-288). El suero de biblioteca GP anti-gp120 V3 es antisuero reunido de tres cobayos hiperinmunizados con una mezcla compleja de péptidos que representa una SSAL de aproximadamente 10^{13} secuencias posibles de VIH-1 V3 (anti-V3 SSAL). Los inmunógenos V3 MN y V3 SSAL usados para las inmunizaciones de los cobayos fueron inmunógenos peptídicos sintéticos V3 multiramificados que se utilizaron para generar anticuerpos policlonales con actividad neutralizante para diversas cepas de laboratorio de VIH-1 como se describe en Walfield et al. (Chapter 18 in AIDS Research Reviews, ed. Koff et al., Marcel Dekker: New York, 1993, pp.345-360).

Otro anticuerpo anti-gp120 fue un anticuerpo monoclonal humano recombinante designado IgG1 b12 con especificidad para el sitio de enlace gp120 para CD4 (anti-gp120 CD4-BS) (Burton et al., Science, 1994, 266:1024-1027). El IgG1 b12 se generó como un fragmento Fab de una biblioteca que presenta anticuerpo fago preparado de médula de hueso de un donador seropositivo de VIH-1 asintomático de largo plazo y se convirtió en un anticuerpo humano completo por clonación dentro de un vector de expresión ADN IgG1 recombinante. Se considera como el "estándar dorado" de los anticuerpos para neutralización de diversos aislados primarios de VIH (Burton et al., supra).

3. ELISA Anti-péptido

Las actividades anticuerpo anti-péptido se determinaron por ELISA (pruebas inmunosorbente enlazadas a enzima) utilizando placas de microtítulo de fondo plano de 96 pozos las cuales se recubrieron con el correspondiente péptido de sitio antigénico objetivo en forma "a" como inmunosorbente. Alícuotas (100 \mul) de una solución peptídica antigénica objetivo en una concentración de 5 \mug/ml se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Las placas se bloquearon por otra incubación a 37ºC durante 1 hora con una solución al 3% de gelatina/PBS. Las placas de bloqueo se secaron después y se usaron para la prueba. Las alícuotas (100 \muL) del suero inmune de prueba, iniciando con una dilución 1:100 en un regulador de dilución de muestra y diluciones en serie de diez veces posteriormente, se agregaron a las placas recubiertas de péptidos. Las placas fueron incubadas durante 1 hora a 37ºC.

Las placas se lavaron seis veces con 0.05% de regulador de PBS/TWEEN®. 100 \muL de peroxidasa de rábano picante marcada cabra-anti-especies anticuerpo específico se agregó a diluciones apropiadas en regulador de dilución conjugado (regulador de Fosfato conteniendo 0.5M de NaCl, y suero de cabra normal). Las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC antes de lavarse como anteriormente. Se agregaron después alícuotas (100 \muL de solución sustrato de o-fenilendiamina. El color se dejó desarrollar durante 5-15 minutos antes de que la reacción enzimática de color se detuviera por la adición de 50 \muL de 2N H_{2}SO_{4}. El A_{492} de los contenidos de cada pozo se leyó en un lector de placa. Los títulos de ELISA, mostrados como Log_{10} de la dilución recíproca, se calculó basado en el análisis de regresión lineal de las absorbancias, con corte de A_{492} fijado a 0.5. Este valor de corte fue riguroso puesto que los valores para las muestras control de cobayo normales diluidas corridas con cada prueba fue menor de 0.15.

4. Determinación de las reactividades anticuerpo con rsCD4, y con células que expresan CD4 a. Determinación de la reactividad anti-CD4 por rsCD4 ELISA

CD4 soluble recombinante purificado (rsCD4) se obtuvo de una fuente comercial (American Bio-Technologies, Inc. Cambridge, MA) y de NIH (USA) AIDS Research and Reference Reagent Program. Se condujo rsCD4 ELISA al recubrir placas microtítulos de 96 pozos por incubación durante la noche a 4ºC con rsCD4 a 0.25 \mug/ml utilizando 100 \muL por pozo en 10 mM de regulador de NaHCO_{3}, pH 9.5. Los pozos recubiertos con rsCD4 se incubaron con 250 \muL de 3% en peso de gelatina en PBS a 37ºC durante 1 hora para bloquear los sitios de enlace a proteína no específicos, se lavaron tres veces con PBS conteniendo 0.05% en volumen de TWEEN 20 y después se secaron.

Los sueros inmunes o anticuerpos monoclonales se diluyeron en serie con PBS conteniendo 20% en volumen de suero de cabra normal, 1% en peso de gelatina y 0.05% en volumen de TWEEN 20 a diluciones de 1:20 volumen a volumen a menos que se indique lo contrario. 100 \muL de la muestra diluida se agregó a cada uno de los pozos y se dejó reaccionar durante 1 hora a 37ºC. Los pozos se lavaron después seis veces con 0.05% en volumen de TWEEN 20 en PBS para eliminar anticuerpos marcados sin enlazar. 100 \muL de peroxidasa de rábano picante marcado cabra anti-ratón IgG o cabra anti-cobayo IgG a una dilución de 1:1000 en 1% en volumen de suero de cabra normal, 0.05% en volumen de TWEEN 20 en PBS se agregó a cada pozo y se incubó a 37ºC durante 15 minutos. Los pozos se lavaron seis veces con 0.05% en volumen de TWEEN 20 en PBS para eliminar el anticuerpo conjugado marcado sin enlazar y se hizo reaccionar con 100 \muL de la mezcla de sustrato que contiene 0.04% en peso de ortofenilendiamina (OPD) y 0.12% en volumen de peróxido de hidrógeno en regulador de citrato de sodio pH 5.0, durante 15 minutos. Las reacciones se detuvieron por la adición de 100 \muL de 1.0 M H_{2}SO_{4} y la absorbancia a 492 nm (A_{492}) se midió. El título anticuerpo Log_{10} recíproco se calculó para la reactividad de punto final de cada muestra de prueba, como se interpoló por la regresión lineal, como se describe para la ELISA anti-péptido.

a. Determinación de la reactividad de células que expresan CD4 por tinción inmunofluorescente indirecta

0.5 x 10^{6} células que expresan CD4 (por ejemplo células de línea celular HPB-ALL, MT2 o SUP-T1) por pozo se lavaron dos veces en PBS que contiene 1% de BSA antes de su incubación con el suero inmune designado o anticuerpos monoclonales, a una concentración óptima como se determina para cada experimento, durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación de las células con el primer anticuerpo de tinción, las células se lavaron durante dos veces adicionales en el mismo regulador de lavado y se incubaron con un reactivo de residuo secundario de isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado cabra anti ratón IgG o (FITC)-conjugado cabra anti-especies específico IgG a diluciones apropiadas (Cappel, Malvern PA) durante 45 minutos adicionales a temperatura ambiente. Las células teñidas se lavaron de nuevo en el mismo regulador de lavado y las células se procesaron para análisis de fluorescencia por citofluorografía y/o microscopía de inmunofluorescencia para la determinación del porcentaje de células teñidas, y la intensidad de la tinción.

b. Prueba indirecta de inhibición de inmunofluorescencia

Para las pruebas de inhibición de enlace competitivo "células T de anticuerpos B4 monoclonales biotinilados" que emplean la técnica de tinción indirecta de inmunofluorescencia, las células se incubaron primero con los reactivos que interfieren o los sueros inmunes apropiadamente diluidos y se lavaron dos veces en el mismo regulador de lavado antes de la adición del anticuerpo B4 monoclonal biotinilado. La tinción de las células T que expresan CD4 se completó por la incubación subsecuente con FITC-avidina apropiadamente diluida seguida por tres lavados adicionales antes del análisis por citofluorografía o microscopía de fluorescencia de alta resolución.

5. Determinación de la neutralización del virus por anticuerpos. a. Células

La línea MT-2 de Célula T humana (ATCC 237) se mantuvo en medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 15% de suero bovino fetal como se describió previamente (Hanson et al., J Clin Microbiol, 1990, 28:2030-2034). Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de donadores seronegativos VIH-1 de unidades de cubierta amarilla de leucocitos recientes por gradiente de separación Ficoll-Hypaque (Organon Teknika S.A., Durham, NC). Las PBMCs resultantes se estimularon con 0.5% de PHA-P (Difco Laboratories, Detroit, MI). Después de 3 a 4 días, el medio que contiene PHA-P se eliminó y las células se mantuvieron en RPMI con 15% de suero bovino fetal, 900 \mug/ml de glutamina, antibióticos, y 5% de interleucina-2 (Cellular Products, Inc., Búfalo, NY).

b. Virus

El VIH-1 MN es una cepa TCLA disponible como y mantenida como un cultivo de células H9 infectado persistentemente del National Institute of Healt, Bethesda MD (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog no. 402) del cual se prepararon patrones concentrados libres de células. Los ailados primarios de VIH-1 se prepararon de pacientes PBMCs por co-cultivación PBMC. Los cultivos patrón de aislados primarios se prepararon por no más de 3-5 pasadas a través de PBMCs, y se clarificaron por centrifugación (Sawer et al., J Virol, 1994, 68:1342-1349). Se suministraron por Carl Hanson de California Department of Healt Services, Berkeley CA.

c. Prueba de Neutralización Microplaca MT-2

La determinación del título anticuerpo que neutraliza VIH emplea la preincubación de suero o anticuerpo diluido en serie con una cantidad fija de VIH seguida por infección de células MT-2 sensibles a VIH y la formación de una capa monocelular que presenta microplacas inducidas por VIH. Los resultados se contaron por cuantificación de las microplacas. La prueba es adecuada solamente para aislados SI, ya sean aislados TCLA o primarios, debido a que las microplacas representan sincitios gigantes formados por células MT-2 que se fusionan a los focos de células infectadas por VIH. La prueba es apropiada para evaluar la inhibición de la transmisión de virus a célula y de célula a célula debido a que la inhibición de la formación de sincitios resulta de la acción del anticuerpo sobre partículas VIH o células infectadas con VIH, es decir, la prueba mide la inhibición de la fusión inducida de VIH de virus a célula o la fusión inducida de VIH de célula a célula. La neutralización se observa después por la reducción de microplacas como se observa por la enumeración de las placas teñidas con yoduro de propidio 1 semana después (Véase, Hanson et al., J Clin Microbiol, 1990, 28:2030-2034). En esta prueba, el virus y el suero o anticuerpo se diluyeron en 50% en plasma humano normal desfibrinado reunido para negar cualquier aumento no específico o efectos inhibitorios.

C. Resultados

Los péptidos y sitios antigénicos objetivos derivados de co-receptor de quimiocina o CD4 candidata usados para inmunogenicidad y estudios funcionales preliminares se describen en las Tablas 1 y 2. Los cobayos se inmunizaron como se describió anteriormente con las formas "b" o "c" del sitio antigénico objetivo a menos que se indique lo contrario en las Tablas 3 y 4, y el suero inmune recolectado de 6 u 8 semanas después de la inmunización inicial se analizó por ELISA antipéptido y ELISA rsCD4 como se describió en los Procedimientos.

Como se muestra en las Tablas 3 y 4, la mayoría de los inmunógenos peptídicos derivados de correceptor de quimiocina y CD4 fueron altamente inmunogénicos conforme evocaron anticuerpos antipeptídicos con títulos en el rango de 2.5 a >5 Log_{10}, excepto para péptidos p1590b, p1699b, p1699c y p1700b. Los sitios antigénicos derivados de CD4 que comprenden segmentos largos del receptor CD4 (por ejemplo, p1612c, p1678b, p1678c, p1686b, p1697b, p1817b, p1889b y 1901b) junto con algunos sitios objetivos ciclizados fueron de reacción cruzada elevada con rsCD4, como se muestra por sus títulos correspondientes >3.5 Log_{10} por la ELISA anti-rsCD4 (ver Tabla 3, columna A2). La reactividad cruzada con rsCD4 para cada una de las construcciones peptídicas no fue predecible. Además, tal reactividad cruzada de rsCD4 no se extendió a la superficie de CD4 de la célula huésped correspondiente porque entre esas construcciones peptídicas que tienen alta reactividad cruzada de rsCD4, solamente p1697b y p1901b se encontraron fuertemente reactivas con células T que expresan CD4 por tinción de inmunofluorescencia indirecta con células de la línea celular HPB-ALL o MT2 (Tabla 3, columna B).

En contraste, los sueros derivados de sitios peptídicos antigénicos objetivos CD4 con una estructura ciclizada (por ejemplo p1472b, p1472c) o del dominio CDR2 (por ejemplo, p1403b, p1471c) fueron altamente reactivos con las células T que expresan CD4 a pesar de su baja reactividad cruzada con rsCD4 (Tabla 3, columna B). Para los co-receptores de quimiocina, los sueros derivados de construcciones peptídicas p1990, p1999, p2028, p2047, p2048, p2049, p2087 y p2089, la mayoría consecuencia de los dominios 1, 3 ó 4 de los co-receptores, se encontraron reactivas con el "complejo de superficie receptor/co-receptor" (Tabla 4, columna B).

Los resultados anteriores indican que la reactividad cruzada con rsCD4 o complejo de superficie receptor/co-receptor es un fenómeno complejo e impredecible, influenciado por características conformacionales que solamente pueden deducirse por observación experimental.

Los sueros inmunes (6 u 8 semanas después de la inmunización inicial) obtenido por las construcciones peptídicas anteriores se seleccionó también por su actividad neutralizante en contra de un aislado VL 135 de VIH-1 de clado B por la prueba de neutralización de microplaca MT-2 como se describió anteriormente. A pesar de la presencia de anticuerpos de reactividad cruzada de alto título con rsCD4 o "complejo de superficie CD4/co-receptor" en algunos de los sueros inmunes, ninguno presentó niveles significativos de tales anticuerpos neutralizantes (Tablas 3 y 4, columna C).

Los sueros inmunes que tienen patrones de tinción de inmunofluorescencia brillante con células T que expresan CD4 se evaluaron adicionalmente por su capacidad para inhibir o bloquear el enlace por MAb B4 a células T que expresan CD4 para ubicar los sitios efectores potenciales con proximidad a los sitios discontinuos del epítope conformacional reconocido por MAb B4. Los resultados obtenidos de tales experimentos pueden conducir a vistas para el diseñó efectivo de nuevos inmunógenos peptídicos. Esta evaluación se logró por experimentos que involucran la inhibición de la tinción por inmunofluorescencia del enlace de "células T a MAb B4-T". Las células T objetivo CD4+ (por ejemplo, Células de T MT2) se reincubaron con sueros inmunes apropiadamente diluidos (por ejemplo, 1:10) seguido por incubación de las células con avidina biotinilada MAb B4 y conjugado FITC con procedimientos detallados descritos anteriormente.

Entre todos los sueros inmunes evaluados, solamente los sueros generados a través de inmunización con el péptido p1471c del dominio CD4-CDR2 se encontró ser inhibitorio del enlace MAb B4 (Tabla 5). Ninguna de estas inmunizaciones con péptidos derivados de co-receptor de quimiocina interfirieron con el enlace de "células T a MAb B4". Esta falta de inhibición de enlaces de "células T a MAb B4" puede relacionarse en parte menos que óptima afinidad presentada por los anticuerpos hacia los sitios efectores potenciales, y puede no deberse exclusivamente a la distancia espacial de los sitios representados por los sitios antigénicos objetivo a aquel reconocido por MAb B4.

Todos excepto uno de los sueros hiperinmunes dirigidos en contra de los péptidos receptor y co-receptor fallaron en inhibir el enlace de MAb B4 en las células T, y ninguno presentó actividad neutralizante en contra de un aislado primario de VIH. Se hicieron intentos adicionales para el diseño de nuevas construcciones peptídicas con la el proposito de capturar los sitios efectores potenciales sobre la superficie de la molécula CD4, basados en la posición de p1471 en la secuencia CD4, la pista proporcionada por el estudio de inhibición de "enlace de células T a MAb B4-T".

Más específicamente, los péptidos que comprenden sitios antigénicos objetivo que rodean el dominio CD4-CDR2 que abarca los residuos de aminoácidos de 20 a 75 de acuerdo al sistema de numeración de SEC. DE IDENT. NO:1 se volvieron a visitar y se rediseñaron construcciones peptídicas adicionales que cubren esta región con un énfasis particular en la conservación de la estructura tridimensional de esta región por inserción de residuos de cisteína en ambos N- y C-terminales de los péptidos derivados de esta región CDR2 con un tamaño de ondulación en el rango de 30 a 45 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos para las construcciones peptídicas representativas derivadas de esta región se muestran en la tabla 6.

Los sueros inmunes se recolectaron a las 6 u 8 semanas después de la inmunización inicial y se evaluaron similarmente a aquellos descritos en la selección previa. Entre los 41 sitios antigénicos objetivo evaluados, p2057, p2189, p2190, y p2240 (SEC. DE IDENT. NOS: 4, 11, 10 y 5), como construcciones "c" (SEC. DE IDENT. NOS:32-35), se encontraron producir anticuerpos neutralizantes dirigidos en contra de aislados de VIH-1 primarios (Tabla 6). El aislado VL135 (Tabla 6) (Sawyer et al., J. Virol., 1994, 68:1342-1349) es un aislado primario resistente a la neutralización representativo. No es un aislado primario sensible a la neutralización atípico que pueda usarse para proporcionar positivo aparente pero engañoso (D. Burton y J. Moore, Nature Medicine, 1998, 4:495-48). Por lo tanto, la neutralización viral observada en la presente, no es la inactivación de un virus neutralizado fácilmente pero es evidencia de inmunidad protectora de un reto por un campo aislado de VIH. No ha habido observaciones anteriores en el campo de la investigacion de SIDA en donde los inmunógenos químicamente definidos produjeran anticuerpos con esta función de neutralización de VIH crítica. A pesar de la falta de actividad de enlace por MAb B4 a cualquiera de los sitios de dominio CD4-CDR2 de péptidos (como se muestra en la solicitud de patente copendiente publicada como WO 97/46697), se demuestra aquí que un sitio objetivo CD4-CDR2 está proximal al epítope discontinuo diseminado que constituye el sitio de reconocimiento para el anticuerpo B4 monoclonal neutralizante. Este sitio de reconocimiento parece contener sitios peptídicos de todos los cuatro dominios de CD4 debido probablemente a la naturaleza curvada del "complejo de superficie receptor/co-receptor que comprende CD4", reconocido por MAb B4. Esta "CD4 de superficie" es distinta del modelo del modelo 3D extendido bien conocido de rsCD4. Es de consideración notar que solamente ciertos sitios antigénicos objetivo derivados de la región CD4-CDR2, por ejemplo, aquellos que abarcan un área más extendida presentados como péptidos cíclicos (por ejemplo p2057c, p2189c, p2190c y p2240c, SEC. DE IDENT. NOS:32-35), produjeron tales anticuerpos neutralizantes

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Ejemplo 2 Sueros hiperinmunes generados por los péptidos p2057c Y p2240c demostraron anticuerpos neutralizantes ampliamente reactivos en contra de VIH primario de clados múltiples

Los sueros hiperinmunes derivados de las sangrías obtenidas 15 y 12 semanas después de la inmunización inicial para inmunógenos peptídicos p2057c y p2240c (SEC. DE IDENT. NOS:32 y 35) demostraron títulos anticuerpo significativos 90% neutralizantes en contra de aislados primarios de VIH de clados múltiples en un patrón paralelo a aquel demostrado por MAb B4. Los títulos de anticuerpo neutralizante variaron en un orden creciente de 1:20 a 1:185 para aislados primarios de clados D, A, B(DH12), E, a B(VL 135) y clado C para sueros inmunes para p2057c (SEC. DE IDENT. NO:32); de 1:20 a 1:324 para aislados primarios de clados D, B(DH12), A, E a clado B (VL 135) para sueros inmunes para p2240c (SEC. DE IDENT. NO:35). Con el propósito de determinar la equivalencia, la actividad de neutralización de MAb B4 varió de 25.6 \mug/ml a 1.54 \mug/ml para aislados primarios de VIH-1 de clados D, A, E, C, B(DH12), a clados B (aislado primario VL 135). En comparación, los sueros de cobayo dirigidos al dominio gp120 V3 N-terminal y anticuerpos monoclonales dirigidos al dominio gp120 V3 N-terminal de VIH-1 MN (MAb 50.1) o un sitio de enlace gp120 CD4 conformacional menos variable (MAb IgG1 b12) falló en neutralizar cualquiera de estos aislados primarios de VIH resistentes a neutralización. Las diluciones de 1:20 a 1:300 de los sueros inmunes anti-p2057c y anti-p2240c proporcionaron el 90% de neutralización de aislados primarios de VIH de clados A a E, como se demuestra en la Tabla 7, sería aproximadamente una concentración de MAb B4 en suero no diluido de aproximadamente 300 \mug/ml de un cálculo de la concentración de MAb B4 y las diluciones de suero en actividades de neutralización equivalentes (es decir un promedio de la concentración MAb B4 (\mug/ml) x factor de dilución de suero inmune para actividad de neutralización en contra de cada uno de los aislados correspondientes).

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Ejemplo 3 Correlación de los títulos anticuerpo neutralizantes en suero con eficiencia de protección en macacos de la india en contra de la infección por SIVmac251

En la solicitud de patente copendiente WO 97/46697, la eficiencia protectora de MAb B4 y su correlación a los títulos de anticuerpo de neutralización in vitro se evaluó por una prueba de reto de MAb B4 en contra de la infección experimental de los macacos de la India con SIV, un modelo animal comúnmente usado para SIDA humano.

En aquel estudio, se introdujo MAb B4 a macacos de la India y el suero se recolectó en pre-tratamiento, pre-reto, y 1 hora después del reto para evaluación. El nivel de suero del anticuerpo MAb B4, determinado por inmunoensayo de rsCD4 en contra de una curva MAb B4 precalibrada, se encontró que está en el rango de 30-45 \mug/ml para todos los animales que recibieron una dosificación de 5 mg/kg de peso corporal. Tres de cuatro animales que recibieron esta cantidad MAb B4 se protegieron en contra de SIV_{mac \ 251}, durante el periodo de un año observado. El nivel (es decir, 30-45 \mug/ml) de suero MAb B4 presente en los animales retados es mucho más bajo que el nivel estimado de anticuerpo (péptido antígeno CD4-CDR2) (alrededor de 300 \mug/ml) que estaría presente en los sueros inmunes generados en los huéspedes si se hubieran inmunizado con una composición inmunogénica que comprende p2057c o p2240c (SEC. DE IDENT. NOS:32 y 35).

Por lo tanto, los huéspedes inmunizados con una composición peptídica de la presente invención que comprende SEC. DE IDENT. NOS:4, 5, 10 y 11 u homólogos de las mismas pueden predecirse para tener inmunidad protectora de la infección de VIH por aislados de VIH primarios de clados múltiples.

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Ejemplo 4 Composiciones peptídicas inmunogénicas que comprenden un epítope Th artificial promiscuo

Se sintetizó un péptido antígeno Th/CD4-CDR2 artificial de diseño (SEC. DE IDENT. NO:6)-Gly-Gly-(SEC. DE IDENT. NO:5) y dada la designación SEC. DE IDENT. NO:60.

El péptido de la SEC. DE IDENT. NO:60 se formuló en ISA 206/DDA. ISA 206/DDA es una emulsión del aceite/agua en la cual se dispersa MONTANIDE^{TM} ISA 206 a 30 mg/ml (MONTANIDE^{TM} ISA 206 es una solución metabolizable aceitosa suministrada por SEPPIC Inc. of Fairfield, NJ). La suspensión de aceite se emulsificó después a una relación en volumen de 1:1 dentro de una solución peptídica acuosa la cual se ha ajustado para un contenido peptídico para proporcionar la dosis deseada de composición peptídica en 0.5 ml de la preparación final.

La inmunogenicidad de SEC. DE IDENT. NO:60 en las formulaciones anteriores se estableció en cobayas que recibieron 100 \mug/dosis, dadas en las semanas 0, 3, y 6. La inmunogenecidad se determinó por ELISA antipéptido como se describió en el Ejemplo 1 usando SEC. DE IDENT. NO:5 como el péptido de sitio antigénico objetivo ciclizado para el sustrato de fase sólida. Seis de seis cobayos se seroconvirtieron exitosamente en reactividad a ELISA.

Significativamente, la SEC. DE IDENT. NO:60 también se encontró que es altamente inmunogénica y de actividad funcional en un animal grande. Una composición inmunogénica que comprende SEC. DE IDENT. NO:60 se formuló en Adyuvante Incompleto de Freunds (IFA), 300 \mug/dosis, y se administró a un cerdo por inyección intramuscular en las semanas 0, 3, y 6. El cerdo seroconvertido y el suero de la semana 8 se probó por actividad de neutralización en contra de aislado primario VIH-1 VL135 por la Prueba de Neutralización en Microplaca de MT-2 (Ejemplo 1). La muestra de suero de cerdo proporcionó 50% de neutralización del virus de alimentación a una dilución de 1:249, y 90% de neutralización a una dilución de 1:97. Por lo tanto, la inmunización con una composición peptídica de la invención comunicó a un animal grande huésped con una respuesta inmune que incluye anticuerpos a los receptores de célula huésped que comprende CD4 y actividad neutralizante hacia VIH.

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Ejemplo 5 Construcciones peptídicas representativas de la invención

Los péptidos inmunogénicos de la invención mostrados en la Tabla 10 son construcciones completamente sintéticas que se sintetizaron por el método de fase sólida señalado en el Ejemplo 1. Cada péptido en la Tabla puede representarse por la fórmula (A)_{n}-(Th)_{m}-(B)_{o}-(CD4-CDR2 antígeno)-X, pero se entiende que los péptidos de las otras fórmulas descritas anteriormente están abarcadas dentro de los péptidos de esta invención. La secuencia de antígeno CD4-CDR2 es SEC. DE IDENT. NO:4 ó 5. Los péptidos inmunogénicos mostrados comprenden los sitios Th artificiales (como se muestra en la Tabla 9). Cada péptido de este ejemplo tienen espaciadores Gly-Gly entre los elementos inmunogénicos, pero los péptidos de la invención pueden tener otro espaciadores tales como \varepsilonNLys o sin espaciadores.

Materiales y métodos

Las construcciones peptídicas representativas de la invención como se enlistan en la Tabla 10 (SEC. DE IDENT. NOS:60, 61 y 62) se sintetizaron, desdoblaron, ciclizaron y purificaron, como se describió en el Ejemplo 1. Las construcciones peptídicas se formularon para inmunización dentro de animales pequeños tales como cobayos, o dentro de animales más grandes tales como cerdos o mandriles para evaluación de sus inmunogenicidades. Los péptidos se suspendieron en un volumen de 0.5 mL que contiene emulsificadores representativos o adyuvantes tales como ISA51, ISA720, DDA o monofosforil lípido A (MPL). La dosis fue 100 \mug de péptido para cobayos o 300 \mug de péptido para cerdos o mandriles y los animales se inmunizaron intramuscularmente.

Los animales recibieron inyecciones en las semanas 0, 3 y 6 como se especificó en Tabla 1. Los sangrados de prueba de 5, 8 u otras semanas específicas después de la inmunización inicial se evaluaron para reactividad cruzada a rsCD4 por rsCD4 ELISA como se describió en el Ejemplo 1, y se probaron adicionalmente por su capacidad para neutralizar aislados primarios de VIH-1 también como se describió en el Ejemplo 1.

Resultados

Las construcciones péptidicas representativas fueron de inmunogenicidad relevante, puesto que todos los péptidos probados produjeron fuerte reactividad cruzada dirigida al sitio a la correspondiente rsCD4, como se muestra por los títulos Log_{10} en la ELISA rsCD4 anti-humana de más de 3.5 (Tabla 11). La neutralización de aislados primarios VIH-1 (por ejemplo VL135) también se observó para sueros inmunes obtenidos de cobayos, cerdos, y mandriles. Esta reactividad cruzada funcional para los sueros de mandril es digna de atención de manera que la neutralización de aislados primarios de VIH humano por el suero de mandril es casi un sistema humano. Así, la eficiencia de una construcción péptidica de la invención, como un agente para la prevención y/o inmunoterapia de la infección por VIH por inmunización activa, se indica fuertemente por el modelo de primate.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: UNITED BIOMEDICAL, INC., et al.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIÓN PEPTÍDICA PARA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE INFECCIÓN POR VIH Y DESÓRDENES INMUNES

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 61

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(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A)

ATENCIONADO: MORGAN & FINNEGAN

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(B)

CALLESTREET: 345 Park Avenue

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(C)

CIUDAD: New York

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(D)

ESTADO: NY

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(E)

PAÍS: EEUU

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(F)

ZIP: 10154-0054

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(v)

FORMA LEÍBLE EN ORDENADOR:

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(A)TIPO

DE MEDIO: Floppy disk

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(B)

ORDENADORCOMPUTER: IBM PC compatible

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(C)SISTEMA

OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: Word 7.0

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(vi)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 09/100,409

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(B)FECHA

DE PRESENTACIÓN: 20 DE JUNIO DE 1998

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(C)

CLASIFICACIÓN: 514

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(vii)

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

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(A)NÚMERO

DE SOLICITUD: Por asignar

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 21 DE JUNIO DE 1999

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE:MARIA C.H. LIN, ESQ.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO:29,323

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(C)

NÚMERO REFERENCIA/EXPEDIENTE: 1151-4154PC1

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(ix)

INGORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: 212-758-4800

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(B)

TELEFAX: 212-751-6849

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 433 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

29

30

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 40 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

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31

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 28 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

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32

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Ile, Met or Leu"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 2

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Ser or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Lys or Arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Gly or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "His or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 11

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Lys or Arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Ile, Met or Leu"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 14

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Gly or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 15

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Ile, Met or Val"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 46 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 61 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 77 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:32

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 69 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

\vskip1.000000\baselineskip

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 81 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Ser or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Lys or Arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Gly or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "His or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Lys or Arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Gly or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

66

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

68

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:39:

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:40:

\vskip1.000000\baselineskip

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:41:

\vskip1.000000\baselineskip

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:42:

72

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:43:

73

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:44:

74

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:45:

75

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:46:

76

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:47:

77

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:48:

78

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:49:

79

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:50:

\vskip1.000000\baselineskip

80

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:51:

\vskip1.000000\baselineskip

81

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:52:

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:53:

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:54:

84

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:55:

85

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:56:

86

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:57:

87

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:58:

88

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Ile, Met or Leu"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Ser or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Lys or Arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Gly or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "His or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Lys or Arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 14

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Ile, Met or Leu"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Gly or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 17

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Ile, Met or Val"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:59:

89

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 51 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Ser or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Lys or Art"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Gly or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "His or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Lys or Arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Gly or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:60:

90

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 24

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Ile, Met or Leu"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 25

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Ser or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 27

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Lys or Arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 28

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Gly or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "His or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 34

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Lys or Arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 35

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Ile, Met or Leu"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 37

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Gly or Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 38

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Ile, Met or Val"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:61:

91

Claims (25)

1. Un péptido antígeno CD4-CDR2, caracterizado porque el péptido antígeno está entre aproximadamente 30 y aproximadamente 46 aminoácidos de longitud; en donde el péptido antígeno CD4-CDR2 contiene dos residuos de cisteína separados por una secuencia interpuesta de 28 a 40 residuos de aminoácidos; y en donde la secuencia interpuesta es una porción contigua de la secuencia representada por los residuos 27 a 66 de SEC. DE IDENT. NO:1, o es un homólogo inmunológicamente funcional de residuos 27 a 66 de SEC. DE IDENT. NO:1, donde dicho homólogo es un péptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos con sustituciones conservativas de hasta el 10% de los aminoácidos.

2. El péptido antígeno CD4-CDR2 de la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido antígeno se selecciona del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO:4, SEC. DE IDENT. NO:5, SEC. DE IDENT. NO:10, y SEC. DE IDENT. NO:11.

3. El péptido sintético de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, que comprende

(a) un epítope (Th) de célula T asistente,

(b) un péptido antígeno CD4-CDR2 de conformidad con la reivindicación 1; y

(c) un dominio inmunoestimulador de invasina.

\vskip1.000000\baselineskip

4. El péptido sintético de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, que comprende

(a) un epítope (Th) de célula T asistente,

(b) un péptido antígeno CD4-CDR2 de conformidad con la reivindicación 2; y

(c) un dominio inmunoestimulador de invasina.

\vskip1.000000\baselineskip

5. Un péptido o conjugado peptídico caracterizado porque comprende a un epítope (Th) de célula T asistente unido covalentemente a un péptido antígeno CD4-CDR2 de conformidad con la reivindicación 1.

6. Un péptido o conjugado peptídico caracterizado porque comprende epitope (Th) de célula T asistente unido covalentemente a un péptido antígeno CD4-CDR2 de conformidad con la reivindicación 2.

7. Un péptido o conjugado peptídico representado por la fórmula

92

caracterizado porque

cada A es independientemente un aminoácido o una secuencia inmunoestimuladora general;

cada B se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos, -NHCH(X)CH_{2}SCH_{2}CO-, -NHCH(X)CH_{2}SCH_{2}CO(\varepsilon-N)Lys-, -NHCH(X)CH_{2}S-succinimidil(\varepsilon-N)Lys-, y -NHCH(X)CH_{2}S-(succinimidilo)-;

cada Th es independientemente una secuencia de aminoácidos que comprenden un epítope de célula T asistente, o un análogo inmunomejorador o segmentos del mismo;

el péptido antígeno CD4-CDR2 representa la secuencia de un péptido antígeno de conformidad con la reivindicación 1;

X es un aminoácido \alpha-COOH o \alpha-CONH_{2};

n es de 0 a aproximadamente 10;

m es de 1 a aproximadamente 4; y

o es de 0 a aproximadamente 10.

\vskip1.000000\baselineskip

8. El péptido o conjugado peptídico representado por la fórmula

93

donde

cada A es independientemente un aminoácido o una secuencia inmunoestimuladora general;

cada B se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos, -NHCH(X)CH_{2}SCH_{2}CO-, -NHCH(X)CH_{2}SCH_{2}CO(\varepsilon-N)Lys-, -NHCH(X)CH_{2}S-succinimidil(\varepsilon-N)Lys-, y -NHCH(X)CH_{2}S-(succinimidilo)-;

cada Th es independientemente una secuencia de aminoácidos que comprende un epítope de célula T asistente, o un análogo inmunomejorador o segmento del mismo;

el péptido antígeno CD4-CDR2 representa la secuencia de un péptido antígeno de conformidad con la reivindicación 1;

X es un aminoácido \alpha-COOH o \alpha-CONH_{2};

n es de 0 a aproximadamente 10;

m es de 1 a aproximadamente 4; y

o es de 0 a aproximadamente 10.

\vskip1.000000\baselineskip

9. Un péptido o conjugado peptídico representado por la fórmula

94

caracterizado porque

cada A es independientemente un aminoácido o una secuencia inmunoestimuladora general;

cada B se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos, -NHCH(X)CH_{2}SCH_{2}CO-, -NHCH(X)CH_{2}SCH_{2}CO(\varepsilon-N)Lys-, -NHCH(X)CH_{2}S-succinimidil(\varepsilon-N)Lys-, y -NHCH(X)CH_{2}S-(succinimidil)-;

cada Th es independientemente una secuencia de aminoácidos que comprenden un epítope de célula T asistente, o un análogo inmunomejorador o segmento del mismo;

el péptido antígeno CD4-CDR2 representa la secuencia de un péptido antígeno de conformidad con la reivindicación 2;

X es un aminoácido \alpha-COOH o \alpha-CONH_{2};

n es de 0 a aproximadamente 10;

m es de 1 a aproximadamente 4; y

o es de 0 a aproximadamente 10.

\vskip1.000000\baselineskip

10. El péptido o conjugado peptídico representado por la fórmula

95

Donde

cada A es independientemente un aminoácido o una secuencia inmunoestimuladora general;

cada B se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos, -NHCH(X)CH_{2}SCH_{2}CO-, -NHCH(X)CH_{2}SCH_{2}CO(\varepsilon-N)Lys-, -NHCH(X)CH_{2}S-succinimidil(\varepsilon-N)Lys-, y -NHCH(X)CH_{2}S-(succinimidil)-;

cada Th es independientemente una secuencia de aminoácidos que comprenden un epítope de célula T asistente, o un análogo inmunomejorador o segmento del mismo;

el péptido antígeno CD4-CDR2 representa la secuencia de un péptido antígeno de conformidad con la reivindicación 2;

X es un aminoácido \alpha-COOH o \alpha-CONH_{2};

n es de 0 a aproximadamente 10;

m es de 1 a aproximadamente 4; y

o es de 0 a aproximadamente 10.

\vskip1.000000\baselineskip

11. El péptido o conjugado peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-10, caracterizado porque el Th tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 6, 8, 12, 13, 36, y 38-59.

12. El péptido o conjugado peptídico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el Th tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO:6 y SEC. DE IDENT. NO:8.

13. El péptido o conjugado peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-10, caracterizado porque n es 3, y (A)_{3} es (dominio invasina)-Gly-Gly.

14. El péptido o conjugado peptídico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque al menos una porción A es un dominio invasina.

15. El péptido o conjugado peptídico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque al menos una porción A es un dominio invasina.

16. El péptido o conjugado peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-10, caracterizado porque el péptido antígeno CD4-CDR2 se selecciona del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 4, 5, 10, y 11.

17. El péptido o conjugado peptídico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el péptido antígeno CD4-CDR2 se selecciona del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 4, 5, 10, y 11.

18. El péptido o conjugado peptídico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el péptido antígeno CD4-CDR2 se selecciona del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 4, 5, 10, y 11.

19. Un péptido seleccionado del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS:32, 33, 34, 35, y 60.

20. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un péptido o conjugado peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-10 ó 19, caracterizada además porque comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

21. La composición farmacéutica de conformidad con reivindicación 20, caracterizada porque la cantidad inmunológicamente efectiva del péptido o conjugado peptídico está entre aproximadamente 0.5 \mug y aproximadamente 1 mg por kilogramo de peso corporal por dosis.

22. Uso de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20 para la manufactura de un medicamento para inducir anticuerpos para un complejo de superficie de CD4 en un mamífero.

23. Uso de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 21 para la manufactura de un medicamento para inducir anticuerpos para un complejo de superficie de CD4 en un mamífero.

24. Uso de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20 para la manufactura de un medicamento para inhibir el enlace de VIH a células CD4+ en un mamífero.

25. Uso de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 21 para la manufactura de un medicamento para inhibir el enlace de VIH a células CD4+ en un mamífero.