ES2337773T3 - Antigenos de streptococcus del grupo b y fragmentos de adn correspondientes. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido aislado seleccionado entre: a) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta entre el aminoácido 44 y el aminoácido 1579 de la SEQ ID NO: 2; o b) un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta entre el aminoácido 44 y el aminoácido 1579 de la SEQ ID NO: 2; y c) un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, en el que el polipéptido aislado es capaz de expandir los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido que consta de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2.
Description
Antígenos de Streptococcus del grupo B y
fragmentos de ADN correspondientes.
La presente invención está relacionada con los
polipéptidos de Streptococcus del grupo B (GBS) (S.
agalactiae) que se pueden usar para prevenir, diagnosticar y/o
tratar infecciones por GBS.
Los Streptococcus son bacterias gram (+)
que se diferencian por antígenos de carbohidratos específicos del
grupo A a O encontrados en su superficie celular. Los grupos de
Streptococcus se distinguen además por antígenos del
polisacárido capsular específicos de tipo. Se han identificado
varios serotipos para el GBS: Ia, Ib, II, III, IV, V, VI,
VII y VIII. El GBS también contiene proteínas antigénicas
conocidas como "proteínas C" (alfa, beta, gamma y delta),
algunas de las cuales han sido clonadas.
Aunque el GBS es un componente habitual
de la flora vaginal y del colon humana normal este patógeno ha sido
reconocido desde hace tiempo como una causa importante de
infecciones en neonatos, mujeres embarazadas, algunos adultos no
preñados así como mastitis en ganado vacuno lechero. Las mujeres
embarazadas expuestas al GBS presentan riesgos de infección
postparto y pueden transferir la infección a su bebé cuando el niño
pasa a través del canal del parto.
Las infecciones por GBS en infantes están
restringidas a la infancia muy temprana. Aproximadamente el 80% de
las infecciones en infantes se producen en los primeros días de
vida, la denominada enfermedad de comienzo temprano. Las
infecciones de comienzo tardío se producen en infantes de entre 1
semana y 2 a 3 meses de edad. Los síndromes clínicos de enfermedad
por GBS en neonatos incluyen sepsis, meningitis, neumonía,
celulitis, osteomielitis, artritis séptica, endocarditis y
epiglotis. Además de enfermedad aguda debida al GBS, que ya
de por sí es costosa, las infecciones por GBS en neonatos
pueden acabar en muerte, discapacidad, y en casos raros,
recurrencia de la infección. Aunque el organismo es sensible a
antibióticos, la elevada velocidad de ataque y el comienzo rápido
de la sepsis en neonatos y meningitis en infantes da como resultado
una alta morbilidad y mortalidad.
Entre mujeres embarazadas, el GBS provoca
enfermedades clínicas que abarcan desde infección leve del tracto
urinario a sepsis y meningitis que ponen en riesgo la vida,
incluyendo también osteomielitis, endocarditis, amniotis,
endometritis, infecciones de heridas (post-cesárea y
post-episiotomía), celulitis, fascitis.
Entre adultos no preñados, las presentaciones
clínicas de enfermedad por GBS invasiva la mayor parte de las
veces toman la forma de bacteremia primaria, pero también infección
de la piel o del tejido blando, neumonía, urosepsis, endocarditis,
peritonitis, meningitis, empiema. Las infecciones de la piel o del
tejido blando incluyen celulitis, úlceras periféricas infectadas,
osteomielitis, artritis séptica e infecciones por decúbito o
heridas. Entre las personas con riesgo, hay hospedadores debilitados
tales como personas con una enfermedad crónica tal como diabetes
mellitus y cáncer, o personas mayores.
Las infecciones por GBS también se pueden
producir en animales y provocar mastitis en ganado vacuno
lechero.
Los polisacáridos específicos de tipo han
demostrado ser muy poco inmunógenos en hospedadores y están
restringidos al serotipo particular a partir del cual se origina el
polisacárido. Además, el polisacárido capsular desencadena una
respuesta independiente de las células T, es decir, sin producción
de IgG. En consecuencia los antígenos de polisa-
cáridos capsulares no son adecuados como componente de una vacuna para la protección contra la infección por GBS.
cáridos capsulares no son adecuados como componente de una vacuna para la protección contra la infección por GBS.
Otros se han centrado en el antígeno beta de la
proteína C, que ha demostrado propiedades inmunógenas en modelos de
ratones y de conejo. Se encontró que esta proteína no era adecuada
como vacuna humana debido a su propiedad no deseable de interactuar
con elevada afinidad y de una manera no inmunógena con la región Fc
de la IgA humana. El antígeno alfa de la proteína C es raro en los
serotipos de tipo III del GBS, que es el serotipo responsable
de la mayoría de dolencias mediadas por GBS y por tanto es
de poca utilidad como componente de una vacuna.
Maria Delores Fernandez-Espla y
col. (2000), Applied and Environmental Microbiology, Vol. 66 no. 11,
Noviembre de 2000 (2000-11), pp
4772-4778, se refiere a una proteinasa anclada a la
pared celular de Streptococcus thermophilus.
Aún existe una necesidad insatisfecha de
polipéptidos de GBS que se puedan usar para prevenir,
diagnosticar y/o tratar una infección por GBS.
Según un aspecto, la presente descripción
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos una identidad del 80% con un segundo polipéptido
que comprende una secuencia seleccionada entre la SEQ ID NO: 2 o
sus fragmentos o análogos.
Según un aspecto, la presente invención se
refiere a polipéptidos que comprenden la SEQ ID NO: 2 o sus
fragmentos o análogos, en la medida en que estos estén englobados
por las reivindicaciones anexas.
\vskip1.000000\baselineskip
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona un polipéptido aislado seleccionado entre:
a) un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos al menos un 99% idéntica a la secuencia de
aminoácidos expuesta entre el aminoácido 44 y el aminoácido 1579 de
la SEQ ID NO: 2; o
b) un polipéptido aislado que comprende la
secuencia de aminoácidos expuesta entre el aminoácido 44 y el
aminoácido 1579 de la SEQ ID NO: 2; y
c) un polipéptido aislado que comprende la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2,
en el que el polipéptido aislado es capaz de
expandir los anticuerpos que se unen específicamente a un
polipéptido que consta de la secuencia de aminoácidos expuesta en
la SEQ ID NO: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona adicionalmente un
polipéptido aislado (a) que comprende la secuencia de aminoácidos
expuesta en las posiciones de los aminoácidos
43-1045 de la SEQ ID NO: 2; o (b) que consta de la
secuencia de aminoácidos expuesta en las posiciones de los
aminoácidos 43-1045 de la SEQ ID NO: 2; en la que el
polipéptido aislado es capaz de provocar una respuesta inmunitaria
contra Streptococcus del grupo B, y en el que el polipéptido
aislado es capaz de activar anticuerpos que se unen específicamente
a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta
en la SEQ ID NO: 2.
La invención proporciona adicionalmente un
polipéptido aislado (a) que comprende la secuencia de aminoácidos
expuesta en las posiciones de los aminoácidos
152-1453 de la SEQ ID NO: 2; o (b) que consta de la
secuencia de aminoácidos expuesta en las posiciones de los
aminoácidos 152-1453 de la SEQ ID NO: 2; en la que
el polipéptido aislado es capaz de provocar una respuesta
inmunitaria contra Streptococcus del grupo B, y en el que el
polipéptido aislado es capaz de activar anticuerpos que se unen
específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.
La invención proporciona adicionalmente un
polipéptido aislado (a) que comprende la secuencia de aminoácidos
expuesta en las posiciones de los aminoácidos
996-1579 de la SEQ ID NO: 2; o (b) que consta de la
secuencia de aminoácidos expuesta en las posiciones de los
aminoácidos 996-1579 de la SEQ ID NO: 2.
En otros aspectos, se proporcionan, según se
define por las reivindicaciones anexas, polipéptidos codificados
por polinucleótidos de la invención, una composición farmacéutica,
vectores que comprenden polinucleótidos de la invención unidos de
manera operable a una región para el control de la expresión, así
como células hospedadoras transfectadas con dichos vectores y
procesos para la producción de polipéptidos que comprenden el
cultivo de dichas células hospedadoras en condiciones adecuadas
para su expresión.
La Figura 1 representa la secuencia de ADN del
gen BVH-A5 procedente del serotipo III de la cepa
NCS 954 de Streptococcus del grupo B; (SEQ ID NO: 1). La
porción subrayada de la secuencia representa la región codificante
para el péptido líder.
La Figura 2 representa la secuencia de
aminoácidos de polipéptido BVH-A5 procedente del
serotipo III de la cepa NCS 954 de Streptococcus del grupo
B; (SEQ ID NO: 2). La porción subrayada de la secuencia representa
los 43 residuos aminoácidos del péptido líder.
La presente invención proporciona
polinucleótidos purificados y aislados, que codifican polipéptidos
de estreptococos que se pueden usar para evitar, diagnosticar y/o
tratar infección por estreptococos. Estos son como se define en las
reivindicaciones anexas.
\vskip1.000000\baselineskip
En el presente documento se describe
un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene al menos una identidad de secuencia del 80%
con un segundo polipéptido que comprende una secuencia seleccionada
entre la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos;
un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene al menos una identidad de secuencia del 80%
con un segundo polipéptido que comprende una secuencia seleccionada
entre la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos;
un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene al menos una identidad de secuencia del 90%
con un segundo polipéptido que comprende una secuencia seleccionada
entre la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos;
un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene al menos una identidad de secuencia del 95%
con un segundo polipéptido que comprende una secuencia seleccionada
entre la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos;
un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene al menos una identidad de secuencia del 98%
con un segundo polipéptido que comprende una secuencia seleccionada
entre la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos.
\vskip1.000000\baselineskip
Según un aspecto, la presente invención se
refiere a polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos
seleccionada entre la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos, en
la medida en que estos estén englobados por las reivindicaciones
anexas.
Según un aspecto, la presente invención se
refiere polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos
SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos, en la medida en que estos
estén englobados por las reivindicaciones anexas.
En el presente documento también se describe un
polinucleótido que codifica una porción que lleva un epítopo de un
polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o
análogos.
En el presente documento también se describen
porciones que llevan un epítopo de un polipéptido que comprende la
SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos.
\vskip1.000000\baselineskip
En el presente documento también se
describen:
un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene al menos una identidad del 80% con un segundo
polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2;
un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene al menos una identidad del 90% con un segundo
polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2;
un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene al menos una identidad del 95% con un segundo
polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2;
un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene al menos una identidad del 98% con un segundo
polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Según un aspecto, la presente invención se
refiere a polipéptidos que comprenden la SEQ ID NO: 2.
Según un aspecto, la presente invención se
refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de
aminoácidos SEQ ID NO: 2.
La presente descripción proporciona un
polinucleótido que codifica una porción que lleva un epítopo de un
polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2.
Según un aspecto, la presente descripción se
refiere a porciones que llevan un epítopo de un polipéptido que
comprende la SEQ ID NO: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Según un aspecto, la presente descripción
proporciona un polinucleótido aislado que comprende un
polinucleótido seleccionado entre:
- (a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos una identidad del 80% con un segundo polipéptido que comprende una secuencia seleccionada entre: la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos;
- (b)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos una identidad del 95% con un segundo polipéptido que comprende una secuencia seleccionada entre: la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos;
- (c)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada entre: la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos;
\newpage
- (d)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido capaz de expandir los anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada entre: la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos;
- (e)
- un polinucleótido que codifica una porción que lleva un epítopo de un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada entre la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos;
- (f)
- un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada entre la SEQ ID NO: 1 o sus fragmentos o análogos;
- (g)
- un polinucleótido que es complementario a un polinucleótido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f).
\vskip1.000000\baselineskip
Según un aspecto, la presente descripción
proporciona un polinucleótido aislado que comprende un
polinucleótido seleccionado entre:
- (a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos una identidad del 80% con un segundo polipéptido que comprende una secuencia seleccionada entre: la SEQ ID NO: 2;
- (b)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos una identidad del 95% con un segundo polipéptido que comprende una secuencia seleccionada entre: la SEQ ID NO: 2;
- (c)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada entre: la SEQ ID NO: 2;
- (d)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido capaz de expandir los anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada entre: la SEQ ID NO: 2;
- (e)
- un polinucleótido que codifica una porción que lleva un epítopo de un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada entre la SEQ ID NO: 2;
- (f)
- un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada entre la SEQ ID NO: 1;
- (g)
- un polinucleótido que es complementario a un polinucleótido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f).
\vskip1.000000\baselineskip
Según un aspecto, la presente descripción
proporciona un polipéptido aislado que comprende un polipéptido
seleccionado entre:
- (a)
- un polipéptido que tiene al menos una identidad del 80% con un segundo polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos;
- (b)
- un polipéptido que tiene al menos una identidad del 95% con un segundo polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos;
- (c)
- un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos;
- (d)
- un polipéptido capaz de expandir los anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos;
- (e)
- una porción que lleva un epítopo de un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos;
- (f)
- el polipéptido de (a), (b), (c), (d), o (e) en el que se ha eliminado el residuo Met N-terminal;
- (g)
- el polipéptido de (a), (b), (c), (d), o (e)
en el que se ha eliminado la secuencia de
aminoácidos secretora.
\vskip1.000000\baselineskip
Según un aspecto, la presente descripción
proporciona un polipéptido aislado que comprende un polipéptido
seleccionado entre:
- (a)
- un polipéptido que tiene al menos una identidad del 80% con un segundo polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2;
- (b)
- un polipéptido que tiene al menos una identidad del 95% con un segundo polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2;
- (c)
- un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2;
- (d)
- un polipéptido capaz de expandir los anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2;
- (e)
- una porción que lleva un epítopo de un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2;
- (f)
- el polipéptido de (a), (b), (c), (d), o (e) en el que se ha eliminado el residuo Met N-terminal;
- (g)
- el polipéptido de (a), (b), (c), (d), o (e)
en el que se ha eliminado la secuencia de
aminoácidos secretora.
\vskip1.000000\baselineskip
Aquellos expertos en la materia apreciarán que
la invención incluye moléculas de ADN, es decir, polinucleótidos y
sus secuencias complementarias que codifican análogos tales como
mutantes, variantes, análogos y derivados de esos polipéptidos,
como se describe en la presente solicitud de patente en la medida en
que estos estén englobados por las reivindicaciones anexas. La
invención también incluye moléculas de ARN correspondientes a las
moléculas de ADN de la invención. Además de las moléculas de ADN y
ARN, la invención incluye los polipéptidos correspondientes y
anticuerpos monoespecíficos que se unen específicamente a esos
polipéptidos.
De acuerdo con la presente invención, todos los
polinucleótidos que codifican polipéptidos de la presente invención
están dentro del alcance de la presente invención, como se define
por las reivindicaciones anexas.
La presente invención se refiere a polipéptidos
que son antigénicos.
La presente invención se refiere a polipéptidos
que son inmunógenos.
La presente invención se refiere a polipéptidos
que pueden provocar una respuesta inmunitaria en un hospedador.
Como se define en las reivindicaciones anexas,
la presente invención proporciona polipéptidos que son capaces de
expandir los anticuerpos que tienen especificidad de unión a los
polipéptidos de la presente invención.
Un anticuerpo que "tiene especificidad de
unión" es un anticuerpo que reconoce y se une al polipéptido
seleccionado pero que sustancialmente no reconoce ni se une a otras
moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que
incluye de forma natural el péptido seleccionado. La unión
específica se puede medir usando un ensayo de ELISA en el que el
polipéptido seleccionado se usa como antígeno.
De acuerdo con la presente invención,
"protección" en los estudios biológicos se define por un
incremento significativo en la curva, tasa o periodo de
supervivencia. El análisis estadístico usando el test
Log-rango para comparar curvas de supervivencia, y
prueba exacta de Fisher para comparar tasas de supervivencia y
número de días hasta la muerte, respectivamente, puede ser útil
para calcular valores de P y determinar si la diferencia entre los
dos grupos es estadísticamente significativa. Valores de P de 0,05
se considera que no son significativos.
En un aspecto adicional de la invención se
proporcionan fragmentos antigénicos/inmunógenos de los polipéptidos
de la invención, o de sus análogos, como se define en las
reivindicaciones anexas.
Los fragmentos de la presente invención deben
incluir una o más de estas regiones epitópicas o ser suficientemente
similares a esas regiones para retener sus propiedades
antigénicas/inmunógenas. Así, para fragmentos según la presente
invención el grado de identidad quizás es irrelevante, puesto que
pueden ser 100% idénticas a una parte particular de un polipéptido
o uno de sus análogos como se describe en el presente documento. En
el presente documento se describen fragmentos que tienen al menos 10
residuos aminoácidos contiguos de las secuencias del polipéptido de
la presente invención. En un ejemplo, al menos 15 residuos
aminoácidos contiguos. En un ejemplo, al menos 20 residuos
aminoácidos contiguos.
La persona experta apreciará que los análogos de
los polipéptidos de la invención también serán útiles en el
contexto de la presente invención, es decir, como material
antigénico/inmunógeno. Así, por ejemplo, proteínas o polipéptidos
que incluyen una o más adiciones, deleciones, sustituciones o
similares están englobados por la presente invención, en la medida
en que estos estén englobados por las reivindicaciones anexas.
Como se usa en el presente documento,
"fragmentos", "análogos" o "derivados" de los
polipéptidos de la invención incluyen aquellos polipéptidos en los
que uno o más de los residuos aminoácidos están sustituidos con un
residuo aminoácido conservado o no conservado (preferentemente
conservado) y que puede ser de origen natural o no natural en la
medida en que estos estén englobados por las reivindicaciones
anexas. En un ejemplo de la descripción, los derivados y análogos
de polipéptidos tendrán el 80% de identidad aproximadamente con
aquellas secuencias ilustradas en las figuras o sus fragmentos.
Esto es, el 80% de los residuos son los mismos. En un ejemplo
adicional, los polipéptidos tendrán una identidad superior al 80%.
En un ejemplo más, los polipéptidos tendrán una identidad superior
al 85%. En un ejemplo más, los polipéptidos tendrán una identidad
superior al 90%. En un ejemplo más, los polipéptidos tendrán una
identidad superior al 95%. En una forma de realización adicional de
la invención, los polipéptidos tendrán una identidad superior al
99%. En un ejemplo más, los análogos de polipéptidos de la
invención tendrán menos de 20 sustituciones, modificaciones o
deleciones de residuos aminoácidos aproximadamente y más
preferentemente menos de 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Estas sustituciones son aquellas que tienen una
influencia mínima en la estructura secundaria y en la natureza
hidropática del polipéptido. Las sustituciones preferidas son
aquellas conocidas en la materia como conservadas, es decir, los
residuos sustituidos comparten propiedades físicas o químicas tales
como hidrofobicidad, tamaño, carga o grupos funcionales. Éstas
incluyen sustituciones tales como aquellas descritas por Dayhoff, M.
en Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978 y por Argos, P.
en EMBO J. 8, 779-785, 1989. Por ejemplo,
aminoácidos, ya sea naturales o no naturales, que pertenecen a uno
de los siguientes grupos representan cambios conservativos:
ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr, val;
cys, ser, tyr, thr;
val, ile, leu, met, ala, phe;
lys, arg, orn, his; y
phe, tyr, trp; his.
Las sustituciones preferidas también incluyen
sustituciones de D-enantiómeros por los
L-aminoácidos correspondientes.
\vskip1.000000\baselineskip
En un enfoque alternativo, los análogos podrían
ser proteínas de fusión, que incorporan restos que hacen la
purificación más sencilla, por ejemplo, marcando eficazmente el
polipéptido deseado. Puede ser necesario retirar el "marcador"
o se puede dar el caso de que el propio polipéptido de fusión
retenga una antigenicidad suficiente para ser útil.
El porcentaje de homología se define como la
suma del porcentaje de identidad más el porcentaje de similitud o
conservación del tipo de aminoácido.
En un ejemplo, los análogos de polipéptidos
tendrán una identidad del 80% aproximadamente con aquellas
secuencias ilustradas en las figuras o sus fragmentos. Esto es, el
80% de los residuos son los mismos. En un ejemplo más, los
polipéptidos tendrán una identidad superior al 85%. En un ejemplo
más, los polipéptidos tendrán una identidad superior al 90%. En un
ejemplo más, los polipéptidos tendrán una identidad superior al 95%.
En una forma de realización adicional de la invención, los
polipéptidos tendrán una identidad superior al 99%. En un ejemplo
más, los análogos de polipéptidos de la invención tendrán menos de
20 sustituciones, modificaciones o deleciones de residuos
aminoácidos aproximadamente y más preferentemente menos de 10.
En un ejemplo, los análogos de polipéptidos
tienen una homología del 80% con aquellas secuencias ilustradas en
las figuras o sus fragmentos. En un ejemplo más, los polipéptidos
tendrán una homología superior al 85%. En un ejemplo más, los
polipéptidos tendrán una homología superior al 90%. En un ejemplo
más, los polipéptidos tendrán una homología superior al 95%. En una
forma de realización adicional de la invención, los polipéptidos
tendrán una homología superior al 99%. En un ejemplo más, los
análogos de polipéptidos de la invención tendrán menos de 20
sustituciones, modificaciones o deleciones de residuos aminoácidos
aproximadamente y más preferentemente menos de 10.
Se puede usar un programa tal como el programa
CLUSTAL para comparar secuencias de aminoácidos. Este programa
compara secuencias de aminoácidos y encuentra el alineamiento óptimo
insertando espacios en cualquiera de las secuencias según sea
apropiado. Es posible calcular la identidad u homología de los
aminoácidos para un alineamiento óptimo. Un programa como BLASTx
alineará el tramo más largo de secuencias similares y asignará un
valor al ajuste. Así es posible obtener una comparación en la que se
encuentran varias regiones de similitud, cada una que tiene una
puntuación diferente. Ambos tipos de análisis de identidad están
contemplados en la presente invención.
En un enfoque alternativo, los análogos o
derivados podrían ser polipéptidos de fusión, que incorporan restos
que hacen la purificación más sencilla, por ejemplo marcando
eficazmente la proteína o polipéptido deseado. Puede ser necesario
retirar el "marcador" o se puede dar el caso de que el propio
polipéptido de fusión retenga una antigenicidad suficiente para ser
útil.
Es bien sabido que es posible someter a cribado
un polipéptido antigénico para identificar regiones epitópicas, es
decir, aquellas regiones que son responsables de la antigenicidad o
inmunogenicidad del polipéptido. Procedimientos para llevar a cabo
ese cribado son muy conocidos en la materia. Así, los fragmentos de
la presente invención deben incluir una o más de estas regiones
epitópicas o ser suficientemente similares a estas regiones para
retener sus propiedades antigénicas/inmunógenas.
Así, lo que es importante para los análogos,
derivados y fragmentos es que posean al menos un grado de la
antigenicidad/inmunogenicidad de la proteína o polipéptido de la que
se derivan.
También están incluidos polipéptidos que tienen
fusionados a ellos otros compuestos que alteran las propiedades
biológicas o farmacológicas de los polipéptidos, es decir,
polietilenglicol (PEG) para incrementar la
semi-vida; las secuencias de aminoácidos líder o
secretora para facilitar la purificación; prepro- y
pro-secuencias; y (poli)sacáridos.
Además, en aquellas situaciones en las que se
encuentra que las regiones de aminoácidos son polimórficas, puede
ser deseable variar uno o más aminoácidos particulares para
mimetizar más eficazmente los diferentes epítopos de las diferentes
cepas de Streptococcus.
Adicionalmente, los polipéptidos de la presente
invención se pueden modificar por acilación del -NH_{2} terminal
(por ejemplo, mediante acetilación, o amidación del ácido
tioglicólico, amidación carboxi-terminal, por
ejemplo, con amoniaco o metilamina) para proporcionar estabilidad,
incrementar la hidrofobicidad para la ligación o unión a un soporte
o a otra molécula.
También están contemplados multímeros hetero y
homo-polipeptídicos de los fragmentos y análogos de
los polipéptidos. Estas formas poliméricas incluyen, por ejemplo,
uno o más polipéptidos que han sido entrecruzados con
entrecruzadores tales como avidina/biotina, glutaraldehído o
dimetil-superimidato. Esas formas poliméricas
también incluyen polipéptidos que contienen dos o más secuencias
contiguas en tándem o invertidas, producidas a partir de ARNm
multicistrónicos generadas mediante tecnología de ADN
recombinante.
En una forma de realización adicional, la
presente invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que
comprenden uno o más polipéptidos o sus fragmentos o análogos como
se define en las figuras de la presente solicitud. Los polipéptidos
quiméricos de la invención son como se define en las
reivindicaciones anexas.
En una forma de realización adicional, la
presente invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que
comprenden dos o más polipéptidos que tienen una secuencia
seleccionada entre la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos; a
condición de que los polipéptidos estén unidos para formar
polipéptidos quiméricos, y en la medida en que estos estén
englobados por las reivindicaciones anexas.
En una forma de realización adicional, la
presente invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que
comprenden dos o más polipéptidos que tienen una secuencia
seleccionada entre la SEQ ID NO: 2; a condición de que los
polipéptidos estén unidos para formar un polipéptido quimérico.
Preferentemente, un fragmento, análogo o derivado de un polipéptido
de la invención comprenderá al menos una región antigénica, es
decir, al menos un epítopo.
Para conseguir la formación de polímeros
antigénicos (es decir, multímeros sintéticos), se pueden utilizar
polipéptidos que tengan grupos bishaloacetilo, nitroarilhaluros, o
similares, en los que los reactivos son específicos para grupos
tio. Por tanto, la unión entre dos grupos mercapto de los diferentes
polipéptidos puede ser un enlace sencillo o puede estar compuesto
de un grupo de unión de al menos dos, normalmente al menos cuatro,
y no más de 16, pero normalmente no más de 14 átomos de carbono
aproximadamente.
En una forma de realización particular, los
fragmentos y análogos del polipéptido de la invención no contienen
un residuo inicial metionina (Met) o valina (Val). Preferentemente,
los polipéptidos no incorporarán una secuencia líder o secretora
(secuencia señal). La fracción señal de un polipéptido de la
invención se puede determinar según técnicas de biología molecular
establecidas. En general, el polipéptido de interés se puede aislar
a partir de un cultivo de estreptococos y posteriormente se puede
secuenciar para determinar el residuo inicial de la proteína madura
y por tanto la secuencia del polipéptido maduro.
Se entiende que los polipéptidos se pueden
producir y/o usar sin su codón de iniciación (metionina o valina)
y/o sin su péptido líder para favorecer la producción y purificación
de polipéptidos recombinantes. Es sabido que la clonación de genes
sin secuencias que codifican los péptidos líder restringirá los
polipéptidos al citoplasma de E. coli y facilitará su
recuperación (Glick, B.R. y Pasternak, J.J. (1998) Manipulation of
gene expression in prokaryotes. En "Molecular biotechnology:
Principles and applications of recombinant DNA", 2nd edition,
ASM Press, Washington DC, p. 109-143).
Según otro aspecto de la invención, también se
proporciona (i) una composición de la materia que contiene un
polipéptido de la invención, junto con un vehículo, diluyente o
adyuvante; (ii) una composición farmacéutica que comprende un
polipéptido de la invención y un vehículo, diluyente o adyuvante;
(iii) una vacuna que comprende un polipéptido de la invención y un
vehículo, diluyente o adyuvante. En el presente documento también se
describe:
(iv) un procedimiento para inducir una respuesta
inmunitaria contra Streptococcus, en un hospedador,
administrando al hospedador, una cantidad inmunogénicamente eficaz
de un polipéptido de la invención para provocar una respuesta
inmunitaria, por ejemplo, una respuesta inmunitaria protectora a
Streptococcus; y particularmente, (v) un procedimiento para
prevenir y/o tratar una infección por Streptococcus,
administrando una cantidad profiláctica o terapéutica de un
polipéptido de la invención a un hospedador que lo necesite.
\newpage
Según otro aspecto de la invención, también se
proporciona (i) una composición de la materia que contiene un
polinucleótido de la invención, junto con un vehículo, diluyente o
adyuvante; (ii) una composición farmacéutica que comprende un
polinucleótido de la invención y un vehículo, diluyente o adyuvante.
En el presente documento también se describe:
(iii) un procedimiento para inducir una
respuesta inmunitaria contra Streptococcus, en un hospedador,
administrando al hospedador, una cantidad inmunogénicamente eficaz
de un polinucleótido de la invención para provocar una respuesta
inmunitaria, por ejemplo, una respuesta inmunitaria protectora a
Streptococcus; y particularmente, (iv) un procedimiento para
prevenir y/o tratar una infección por Streptococcus,
administrando una cantidad profiláctica o terapéutica de un
polinucleótido de la invención a un hospedador que lo necesite.
La invención también proporciona, en un aspecto
adicional, los polipéptidos aislados, polipéptidos quiméricos,
composiciones farmacéuticas y sus fragmentos que se unen a
anticuerpos o antígenos de la invención, para su uso en el
tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección por
Streptococcus del grupo B. La invención también proporciona
el uso de los polipéptidos aislados, polipéptidos quiméricos,
composiciones farmacéuticas y sus fragmentos que se unen a
anticuerpos y antígenos de la invención en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una
infección por Streptococcus del grupo B.
Antes de la inmunización, los polipéptidos de la
invención también se pueden acoplar o conjugar a proteínas
portadoras tales como la toxina del tétanos, toxina de la difteria,
antígeno superficial del virus de la hepatitis B, antígeno VP1 del
virus de la poliomielitis y cualquier otra toxina o antígeno vírico
o bacteriano o cualquier proteína adecuada para estimular el
desarrollo de una respuesta inmunitaria más fuerte. Este
acoplamiento o conjugación se puede realizar química o
genéticamente. Una descripción más detallada de la conjugación
péptido-portador está disponible en Van
Regenmortel, M.H.V., Briand J.P., Muller S., Plaué S., "Synthetic
Polypeptides as antigens" en Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology, Vol.19 (ed.) Burdou, R.H. &
Van Knippenberg P.H. (1988), Elsevier Nueva York.
Según otro aspecto, se proporcionan
composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más polipéptidos de
estreptococo de la invención en una mezcla con un adyuvante
farmacéuticamente aceptable. Adyuvantes adecuados incluyen (1)
formulaciones en emulsión de aceite en agua tales como My59^{TM},
SAF^{TM}, Ribi^{TM} (2) adyuvante completo o incompleto de
Freund; (3) sales, es decir, AlK(SO4)2,
AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4)2,
Al(OH)s, AlPO4, sílice, caolín; (4) derivados de
saponina tales como Stimulon^{TM} o partículas generadas a partir
de ellas como ISCOMs (complejos inmunoestimuladores); (5)
citoquinas tales como interleuquinas, interferones, factor
estimulante de colonias de macrófagos(M-CSF),
factor de necrosis tumoral (TNF); (6) otras sustancias tales como
polinucleótidos de carbono, es decir, poli IC y poli AU, toxina del
cólera detoxificada (CTB) y toxina lábil térmicamente de E.
coli para inducción de inmunidad en la mucosa. Una descripción
más detallada de los adyuvantes está disponible en una revisión por
M.Z.I. Khan y col. en Pharmaceutical Research, vol. 11, No. 1
(1994) pp2-11, y también en otra revisión por Gupta
y col., en Vaccine, Vol. 13, No. 14, pp1263-1276
(1995) y en el documento WO 99/24578. Los adyuvantes preferidos
incluyen QuiltA^{TM}, QS21^{TM}, Alhydrogel^{TM} y
Adjuphos^{TM}.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se pueden administrar parenteralmente mediante inyección, infusión
rápida, absorción nasofaríngea, absorción dérmica, o bucal u
oral.
El término composición farmacéutica también se
pretende que incluya anticuerpos. De acuerdo con la presente
invención, también se proporciona uno o más anticuerpos que tienen
especificidad de unión por los polipéptidos de la presente
invención para su uso en el tratamiento o profilaxis de infección
por Streptococcus y/o enfermedades y síntomas mediados por
infección por Streptococcus, en la medida en que estos estén
incluidos englobados por las reivindicaciones anexas.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se usan para la profilaxis o tratamiento de infección por
estreptococos y/o enfermedades y síntomas mediados por infección por
estreptococos como se describe en Manual of Clinical Microbiology,
P.R. Murray (Ed, en jefe), E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover y
R.H. Yolken. ASM Press, Washington, D.C. 7ª edition, 1999, 1773p.
En una forma de realización, las composiciones farmacéuticas de la
presente invención se usan para la profilaxis o tratamiento de
faringitis, erisipelas e impétigo, fiebre escarlata, y enfermedades
invasivas tales como bacteremia y fascitis necrotizante y también
choque tóxico. En una forma de realización, las composiciones
farmacéuticas de la invención se usan para el tratamiento o la
profilaxis de infección por Streptococcus y/o enfermedades y
síntomas mediados por infección por Streptococcus, en
particular de Streptococcus del grupo B (GBS o
Saalactiae), Streptococcus el grupo A
(Streptococcus pyogenes), S. pneumoniae, S. dysgalactiae,
S. uberis, S. nocardia así como Staphylococcus aureus. En
una forma de realización adicional, la infección por
Streptococcus es de Streptococcus del grupo B
(GBS o S. agalactiae).
En el presente documento también se describe un
procedimiento para la profilaxis o el tratamiento de infección por
Streptococcus en un hospedador susceptible a infección por
Streptococcus que comprende la administración a dicho
hospedador de una cantidad profiláctica o terapéutica de una
composición de la invención.
En el presente documento también se describe un
procedimiento para la profilaxis o el tratamiento de infección por
GBS en un hospedador susceptible a infección por GBS
que comprende la administración a dicho hospedador de una cantidad
profiláctica o terapéutica de una composición de la invención.
Como se usa en la presente solicitud, el término
"hospedador" incluye mamíferos. En una forma de realización
adicional, el mamífero es un miembro de ganado lechero. En una forma
de realización adicional, el mamífero es una madre preñada. En una
forma de realización adicional, el mamífero es humano. En una forma
de realización adicional, el hospedador es una mujer embarazada. En
una forma de realización adicional, el hospedador es un adulto no
preñado. En una forma de realización adicional, el hospedador es un
neonato o un infante.
En una forma de realización particular, las
composiciones farmacéuticas se administran a aquellos hospedadores
en riesgo de infección por Streptococcus tales como infantes,
personas mayores y hospedadores inmunocomprometidos.
Las composiciones farmacéuticas preferentemente
están en una forma de dosificación unitaria de 0,001 a 100
\mug/kg aproximadamente (antígeno/peso corporal) y más
preferentemente de 0,01 a 10 \mug/kg y lo más preferentemente de
0,1 a 1 \mug/kg de 1 a 3 veces con un intervalo de entre 1 y 6
semanas aproximadamente entre inmunizaciones.
Las composiciones farmacéuticas preferentemente
están en una forma de dosificación unitaria de 0,1 \mug a 10 mg
aproximadamente y más preferentemente de \mug a 1 mg y lo más
preferentemente de 10 a 100 \mug de 1 a 3 veces con un intervalo
de entre 1 y 6 semanas aproximadamente entre inmunizaciones.
Según otro aspecto, se proporcionan
polinucleótidos que codifican polipéptidos caracterizados por la
secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2 o sus
fragmentos o análogos, como se define en las reivindicaciones
anexas.
En una forma de realización, los polinucleótidos
son aquellos ilustrados en la SEQ ID NO: 1 que pueden incluir los
marcos de lectura abiertos (ORF), que codifican los polipéptidos de
la invención, y que son como se define en las reivindicaciones
anexas.
Se apreciará que las secuencias de
polinucleótidos ilustradas en las figuras pueden estar alteradas con
codones degenerados y aún así codificar los polipéptidos de la
invención. Por consiguiente, la presente invención proporciona
adicionalmente, en la medida en que estos estén englobados por las
reivindicaciones anexas, polinucleótidos que se hibridan a los
polinucleótidos proporcionados, que se hibridan a las secuencias de
polinucleótidos descritas anteriormente en el presente documento (o
sus secuencias complementarias) que tienen una identidad del 80%
entre secuencias. En una forma de realización, una identidad de al
menos el 85% entre secuencias. En una forma de realización, una
identidad de al menos el 90% entre secuencias. En una forma de
realización, los polinucleótidos son inviables en condiciones
rigurosas, es decir, que tienen una identidad de al menos el 95%.
En una forma de realización adicional, una identidad superior al
97%.
Condiciones rigurosas adecuadas para la
hibridación se pueden determinar fácilmente por alguien con
conocimientos en la materia (véase por ejemplo Sambrook y col.,
(1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring
Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology, (1999) editado
por Ausubel F.M. y col., John Wiley & Sons, Inc., N.Y.).
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización adicional, la
presente invención proporciona, en la medida en que estos estén
englobados por las reivindicaciones anexas, polinucleótidos que se
hibridan en condiciones rigurosas a cualquiera de
(a) una secuencia de ADN que codifica un
polipéptido o
(b) el complementario de una secuencia de ADN
que codifica un polipéptido; en el que dicho polipéptido comprende
la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos.
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En una forma de realización adicional, la
presente invención proporciona, en la medida en que estos estén
englobados por las reivindicaciones anexas, polinucleótidos que se
hibridan en condiciones rigurosas a cualquiera de
(a) una secuencia de ADN que codifica un
polipéptido o
(b) el complementario de una secuencia de ADN
que codifica un polipéptido; en el que dicho polipéptido comprende
la SEQ ID NO: 2.
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En el presente documento también se describen
polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas a
cualquiera de
(a) una secuencia de ADN que codifica un
polipéptido o
(b) el complementario de una secuencia de ADN
que codifica un polipéptido;
en el que dicho polipéptido comprende al menos
10 residuos aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la
SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o análogos.
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En el presente documento también se describen
polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas a
cualquiera de
(a) una secuencia de ADN que codifica un
polipéptido o
(b) el complementario de una secuencia de ADN
que codifica un polipéptido;
en el que dicho polipéptido comprende al menos
10 residuos aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende
la SEQ ID NO: 2.
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En una forma de realización adicional, los
polinucleótidos son aquellos ilustrados en la SEQ ID NO: 1 que
codifican polipéptidos de la invención.
Como apreciará fácilmente alguien experto en la
materia, los polinucleótidos incluyen tanto ADN como ARN.
La presente invención también incluye
polinucleótidos complementarios a los polinucleótidos descritos en
la presente solicitud.
Los polinucleótidos que codifican polipéptidos
como los descritos en el presente documento, o sus fragmentos,
análogos o derivados, se pueden usar en un procedimiento de
inmunización con ADN. Esto es, se pueden incorporar a un vector que
sea replicable y expresable tras su inyección produciendo así el
polipéptido antigénico in vivo. Por ejemplo, los
polinucleótidos se pueden incorporar a un vector plásmido bajo el
control del promotor del CMV que es funcional en células
eucariotas. Preferentemente el vector se inyecta
intramuscularmente.
Según otro aspecto, se proporciona un proceso
para la producción de polipéptidos de la invención mediante
técnicas recombinantes expresando un polinucleótido que codifica
dicho polipéptido en una célula hospedadora y recuperando el
producto del polipéptido expresado.
Alternativamente, los polipéptido se pueden
producir según técnicas químicas sintéticas establecidas, es decir,
síntesis en fase sólida o en fase de disolución de oligopéptidos que
están ligados para producir el polipéptido completo (ligación en
bloque).
Procedimientos generales para la obtención y
evaluación de polinucleótidos y polipéptidos se describen en las
siguientes referencias: Sambrook y col, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current
Protocols in Molecular Biology, editado por Ausubel F.M. y col.,
John Wiley and Sons, Inc. Nueva York; PCR Cloning Protocols, de
Molecular Cloning to Genetic Engineering, editado por White B.A.,
Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, 1997, 490 páginas; Protein
Purification, Principles and Practices, Scopes R.K.,
Springer-Verlag, Nueva York, 3rd Edition, 1993, 380
páginas; Current Protocols in Immunology, editado por Coligan J.E.
y col., John Wiley & Sons Inc., Nueva York.
La presente invención proporciona un proceso
para la producción de un polipéptido que comprende el cultivo de
una célula hospedadora de la invención en condiciones adecuadas para
la expresión de dicho polipéptido.
Para la reproducción recombinante, las células
hospedadoras se transfectan con vectores que codifican los
polipéptidos de la invención, y a continuación se cultivan en un
medio nutriente modificado según sea apropiado para activar los
promotores, seleccionar los transformantes o amplificar los genes.
Los vectores adecuados son aquellos que son viables y replicables
en el hospedador seleccionado e incluyen secuencias cromosómicas,
secuencias no cromosómicas y ADN sintético, por ejemplo, plásmidos
bacterianos, ADN fágico, baculovirus, plásmidos de levadura,
vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN fágico. La
secuencia polipeptídica se puede incorporar al vector en el sitio
apropiado usando enzimas de restricción de manera que esté unida de
manera operable a una región para el control de la expresión que
comprende un promotor, un sitio de unión a ribosomas (región
consenso o secuencia de Shine-Dalgarno), y
opcionalmente un operador (elemento de control). Uno puede
seleccionar componentes individuales de la región para el control de
la expresión que sean apropiadas para un hospedador y un vector
dados según principios de biología molecular establecidos (Sambrook
y col, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring
Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, editado
por Ausubel F.M. y col., John Wiley and Sons, Inc. Nueva York). Los
promotores adecuados incluyen, pero no están limitados a, el
promotor de LTR o SV40, los promotores lac, tac o trp de E.
coli y el promotor P_{L} del fago lambda. Los vectores
preferentemente incorporarán un origen de replicación así como
marcadores de selección, es decir, un gen de resistencia a
ampicilina. Los vectores bacterianos adecuados incluyen pET, pQE70,
pQE60, pQE-9, pD10 phagescript, psiX174, pbluescript
SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a,
pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 y
los vectores eucariotas pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1,
pSG, pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL. Las células hospedadoras pueden ser
bacterianas, es decir, E. coli, Bacillus subtilis,
Streptomyces; fúngicas, es decir, Aspergillus niger,
Aspergillus nidulins; de levadura, es decir,
Saccharomyces o eucariotas, es decir, CHO, COS.
Tras la expresión del polipéptido en cultivo,
normalmente las células se recogen por centrifugación y a
continuación se rompen por medios físicos o químicos (si el
polipéptido expresado no es secretado al medio) y el extracto en
bruto resultante es retenido para aislar el polipéptido de interés.
La purificación del polipéptido a partir del medio de cultivo o el
lisado se puede conseguir mediante técnicas establecidas dependiendo
de las propiedades del polipéptido, es decir, usando precipitación
con sulfato de amonio o con etanol, extracción ácida, cromatografía
de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa,
cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de
hidroxilapatita y cromatografía de lectina. La purificación final se
puede conseguir HPLC.
Los polipéptidos se pueden expresar con o sin
una secuencia líder o de secreción. En este último caso la secuencia
líder se puede eliminar usando procesamiento
post-traduccional (véanse las patentes de EE.UU. US
4.431.739; US 4.425.437; y US 4.338.397) o se puede eliminar
químicamente después de purificar el polipéptido expresado.
Según un aspecto adicional, los polipéptidos de
estreptococos de la invención se pueden usar en una prueba
diagnóstica para infección por Streptococcus, en particular
infección por Streptococcus del grupo B.
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Diversos procedimientos diagnósticos son
posibles, por ejemplo, para detectar organismos Streptococcus
en una muestra biológica, se puede realizar el procedimiento
siguiente:
(a) obtener una muestra biológica de un
hospedador;
(b) incubar un anticuerpo o uno de sus
fragmentos reactivo con un polipéptido de Streptococcus de la
invención con la muestra biológica para formar una mezcla; y
(c) detectar el anticuerpo o fragmento unido
específicamente en la mezcla que indica la presencia de
Streptococcus.
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Alternativamente, se puede realizar un
procedimiento para la detección de anticuerpo específico para un
antígeno de Streptococcus en una muestra biológica que
contiene o que se sospecha que contiene dicho anticuerpo de la
manera siguiente:
(a) obtener una muestra biológica de un
hospedador;
(b) incubar uno o más polipéptidos de
Streptococcus de la invención o sus fragmentos con la muestra
biológica para formar una mezcla; y
(c) detectar el antígeno o fragmento unido
específicamente en la mezcla que indica la presencia de anticuerpo
específico para Streptococcus.
\vskip1.000000\baselineskip
Alguien experto en la materia reconocerá que
esta prueba diagnóstica puede adoptar diversas formas, incluyendo
una prueba inmunológica tal como un ensayo inmunoabsorbente unido a
enzima (ELISA), un radioinmunoensayo o un ensayo de aglutinación
con látex, esencialmente para determinar si anticuerpos específicos
para la proteína están presentes en un organismo.
Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos
de la invención también se pueden usar para diseñar sondas de ADN
para su uso en la detección de la presencia de Streptococcus
en una muestra biológica sospechosa de contener esa bacteria. Ese
procedimiento de detección comprende:
(a) la obtención de una muestra biológica de un
hospedador;
(b) la incubación de una o más sondas de ADN que
tienen una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la
invención o sus fragmentos con la muestra biológica para formar una
mezcla; y
(c) la detección de la sonda de ADN unida
específicamente en la mezcla que indica la presencia de la bacteria
Streptococcus.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas de ADN descritas en el presente
documento también se pueden usar para detectar Streptococcus
circulantes, es decir, ácidos nucleicos de Streptococcus del
grupo B en una muestra, por ejemplo, usando la reacción en cadena
de la polimerasa, como procedimiento para el diagnóstico de
infecciones por Streptococcus. La sonda se puede sintetizar
usando técnicas convencionales y se puede inmovilizar sobre una fase
sólida, o se puede marcar con un marcador detectable. Una sonda de
ADN preferida para esta solicitud es un oligómero que tiene una
secuencia complementaria a, al menos, 6 nucleótidos contiguos
aproximadamente de los polipéptidos de Streptococcus del
grupo B de la invención. En un ejemplo adicional, la sonda de ADN
preferida será un oligómero que tiene una secuencia complementaria
a, al menos, 15 nucleótidos contiguos aproximadamente de los
polipéptidos de Streptococcus del grupo B de la invención.
En un ejemplo adicional, la sonda de ADN preferida será un oligómero
que tiene una secuencia complementaria a, al menos, 30 nucleótidos
contiguos aproximadamente de los polipéptidos de
Streptococcus del grupo B de la invención. En un ejemplo
adicional, la sonda de ADN preferida será un oligómero que tiene
una secuencia complementaria a, al menos, 50 nucleótidos contiguos
aproximadamente de los polipéptidos de Streptococcus del
grupo B de la invención.
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Otro procedimiento diagnóstico para la detección
de Streptococcus en un hospedador comprende:
(a) el marcaje de un anticuerpo reactivo con un
polipéptido de la invención o uno de sus fragmentos con un marcador
detectable;
(b) la administración del anticuerpo marcado o
el fragmento marcado al hospedador; y
(c) la detección de anticuerpo marcado o
fragmento marcado unido específicamente en el hospedador que indica
la presencia de Streptococcus.
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Un aspecto adicional de la invención es el uso
de polipéptidos de Streptococcus de la invención como
inmunógenos para la producción de anticuerpos específicos para el
diagnóstico y, en particular, el tratamiento de infección por
Streptococcus. Los anticuerpos adecuados se pueden determinar
usando procedimientos de cribado apropiados, por ejemplo, midiendo
la capacidad de un anticuerpo particular para proteger pasivamente
contra la infección por Streptococcus en un modelo de
prueba. Un ejemplo de un modelo animal es el modelo de ratón
descrito en los ejemplos del presente documento. El anticuerpo
puede ser un anticuerpo completo o uno de sus fragmentos de unión
al antígeno y puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina.
El anticuerpo o el fragmento puede ser de origen animal,
específicamente de origen mamífero y más específicamente de origen
murino, de rata o humano. Puede ser un anticuerpo natural o uno de
sus fragmentos, o si se desea, un anticuerpo o un fragmento de
anticuerpo recombinante. El término anticuerpo o fragmento de
anticuerpo recombinante significa anticuerpo o fragmento de
anticuerpo que se produce usando técnicas de biología molecular. El
anticuerpo o fragmentos de anticuerpos pueden ser policlonales, o
preferentemente monoclonales. Pueden ser específicos para una serie
de epítopos asociados a los polipéptidos de Streptococcus del
grupo B, pero preferentemente es específico para uno.
Según un aspecto, la presente invención
proporciona un anticuerpo para su uso en el tratamiento y/o
profilaxis de infecciones por estreptococos, en la medida en que
estos estén englobados en las reivindicaciones anexas.
Un aspecto adicional de la invención son
anticuerpos dirigidos a los polipéptidos de la invención para su
uso en la inmunización pasiva, en la medida en que estos estén
englobados por las reivindicaciones anexas. Alguien podría usar los
anticuerpos descritos en la presente solicitud.
En el presente documento también se describe un
procedimiento para la inmunización, por el que un anticuerpo
expandido por un polipéptido de la invención se administra a un
hospedador en una cantidad suficiente para proporcionar una
inmunización pasiva.
En una forma de realización adicional, la
invención proporciona el uso de una composición farmacéutica de la
invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento
profiláctico o terapéutico de infección por estreptococo, en la
medida en que ésta esté englobada por las reivindicaciones
anexas.
En una forma de realización adicional, la
invención proporciona un kit que comprende un polipéptido de la
invención para la detección o diagnóstico de infección por
estreptococo.
A menos que se definan de otra forma, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen los mismos significados entendidos normalmente por alguien
con conocimientos ordinarios en la materia a la que pertenece esta
invención.
Además, los materiales, procedimientos, y
ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean
limitantes.
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Este ejemplo ilustra la identificación del gen
BVH-A5 de estreptococos del grupo B.
Se aisló ADN cromosómico procedente de
diferentes cepas de estreptococos del grupo B como se ha descrito
previamente (Jayarao, BM y col. 1991. J. Clin. Microbiol.
29:2774-2778). Se construyó una librería genómica
\lambdaZAPExpress usando ADN cromosómico purificado a partir de
la cepa NCS 954 de estreptococos del grupo B serotipo III (National
Center for Streptococcus, Provincial Laboratory of Public
Health for Northern Alberta, Edmonton, Canada) y se cribó según las
instrucciones del fabricante (Stratagene, La Jolla, CA) con
fracciones reunidas de suero humano normal. Resumiendo, el ADN
cromosómico purificado se digirió parcialmente con la enzima de
restricción tsp 509I, y los fragmentos resultantes se sometieron a
electroforesis en un gel de agarosa al 1% (Bio-Rad).
Los fragmentos en el intervalo de tamaños de 5 a 10 kb se
extrajeron del gel y se ligaron con los extremos Eco RI del vector
\lambdaZAPExpress y el vector se encapsidó usando el extracto de
empaquetamiento Gigapack II (Stratagene). Se usaron los fagos
recombinantes para infectar a E. coli
XL1-Blue MRF' [\Delta(mcrA) 183
\Delta(mcrCB-hsdSMR-mrr)173
endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac (F'
proABlacI^{q}Z\DeltaM15Tn10[Tet^{R}])], que a
continuación se cultivaron en placa sobre agar LB. Las placas
resultantes se transfirieron a membranas de
Hybond-nitrocelulosa C (Amersham Pharmacia Biotech,
Baie d'Urfé, Québec, Canada) pre-impregnadas con
isopropil-\beta-d-tiogalactopiranósido
10 mM (IPTG: ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA). Las membranas
se bloquearon usando tampón fosfato salino (PBS) con leche
desnatada al 3% y se incubaron secuencialmente con las fracciones
reunidas del suero humano, antisuero de inmunoglobulinas de cabra
anti-humano marcadas con peroxidasa (Jackson
Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA) y sustrato. Las
placas positivas se aislaron y se purificaron dos veces. El inserto
se amplificó por PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400
Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir de ADN fágico positivo usando
los siguientes cebadores de oligonucleótidos:
T3pBK
(5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3') (SEQ ID
NO: 11) y T7pBK (5'-GTAATACGACTCACTATAGG
GC-3') (SEQ ID NO: 12). El producto de la PCR se purificó en gel de agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuencia del producto de la PCR se determinó usando el kit TAQ Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit con un secuenciador automático de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) modelo 373A según las recomendaciones del fabricante. El análisis de secuencia reveló la presencia de un ORF que codifica para un polipéptido con un péptido señal. Este polipéptido a continuación se identificó como BVH-A5.
GC-3') (SEQ ID NO: 12). El producto de la PCR se purificó en gel de agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuencia del producto de la PCR se determinó usando el kit TAQ Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit con un secuenciador automático de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) modelo 373A según las recomendaciones del fabricante. El análisis de secuencia reveló la presencia de un ORF que codifica para un polipéptido con un péptido señal. Este polipéptido a continuación se identificó como BVH-A5.
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Este ejemplo ilustra la clonación del gen
BVH-A5 de estreptococos del grupo B.
Se amplificó la región codificante del gen
BVH-A5 de estreptococos del grupo B (SEQ ID NO: 1)
sin la región codificante para el péptido líder por PCR (DNA
Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer) a partir de
ADN genómico de la cepa NCS 954 de estreptococos del grupo B
serotipo III usando cebadores de oligonucleótidos que contenían
extensiones de bases para la adición de los sitios de restricción
NcoI (CCATGG) y XhoI (CTCGAG). Se usaron los cebadores de
oligonucleótidos (Tabla 1) DMAR577 y DMAR747 para amplificar el gen
BVH-A5. Los productos de la PCR se purificaron en
gel de agarosa usando el kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen
siguiendo las instrucciones del fabricante, y se digirió con NcoI y
XhoI (Amersham Pharmacia Biotech). El vector
pET-21d(+) (Novagen, Madison, WI) se digirió con
NcoI y XhoI y se purificó en gel de agarosa usando el kit de
extracción en gel QIAquick de QIAgen. El producto de la PCR
NcoI-XhoI se ligó al vector de expresión
NcoI-XhoI pET-21d(+). El producto
ligado se transformó en la cepa de E. coli STBL2
[F-mcr A \Delta(mcr BC-hsd
RMS-mrr) rec A1 end A1 lon gyrA96
thi-1 sup E44 rel Al
\lambda-\Delta(lac-proAB)]
(Gibco BRL, Gaithersburg, MD) según las recomendaciones del
fabricante. El plásmido pET-21d(+) recombinante
(rpET21d(+)) que contiene el gen BVH-A5 se purificó
usando un kit para plásmidos de QIAgen y el inserto de ADN se
secuenció (Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI,
Foster City, CA).
Se determinó que el marco de lectura abierto
(ORF) que codifica para el gen BVH-A5 (SEQ ID NO: 1)
contiene 4740 pb y codifica un polipéptido de 1579 residuos
aminoácidos con un pI predicho de 6,69 y una masa molecular
predicha de 173.249,19 Da. El análisis de la secuencia de los
residuos aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 2) usando el software
Spscan (Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer
Group) sugería la existencia de un péptido señal de 43 residuos
aminoácidos (MLQEKEIFMNTKQRFSIRKYKLGAVSVLLGTLFFLGGITNVAA) (SEQ ID
NO: 2, aa 1-43), que termina con un sitio de
escisión situado entre un residuo de alanina y un residuo de ácido
aspártico. El análisis de la secuencia de los residuos aminoácidos
reveló la presencia de una secuencia de unión a la célula (RGD)
localizada entre los residuos 454 y 456, y de un motivo de anclaje
a la pared celular (LPXTG) localizado entre los residuos 1544 y
1548. La comparación de la secuencia de aminoácidos de
BVH-A5 (SEQ ID NO: 2) con las secuencias compiladas
en los bancos de datos disponibles reveló una identidad del 49% con
la proteinasa de la envuelta celular de Streptococcus
thermophilus (número de acceso del GeneBank: AF243528:
Fernandez-Espla, MD y col. 2000. Appl. Environ.
Microbiol. 66:4772-4778).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Este ejemplo describe la amplificación por PCR
del gen BVH-A5 de estreptococos del grupo B de otras
cepas del grupo B.
Para confirmar la presencia por amplificación
por PCR del gen BVH-A5 (SEQ ID NO: 1), se usaron las
siguientes 11 cepas de estreptococos del grupo B serológicamente
distintas: C388/90 (serotipo Ia/c), ATCC12401 (serotipo Ib),
ATCC27591 (serotipo Ic), NCS246 (serotipo II/R), NCS954 (serotipo
III/R), NCS97SR331 (serotipo IV), NCS535 (serotipo V), NCS9842
(serotipo VI), NCS7271 (serotipo VII), NCS970886 (serotipo VIII), y
ATCC27956 (aislado bovino). Estas cepas se obtuvieron de la
American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) y el National
Center for Streptococcus, Provincial Laboratory of Public
Health for Northern Alberta (Edmonton, Alberta, Canada). La cepa de
E. coli XL1-Blue MRF' se usó en estos
experimentos como control negativo. Se aisló el ADN cromosómico de
cada cepa de estreptococos del grupo B como se ha descrito
previamente (Jayarao, BM y col. 1991. J. Clin. Microbiol.
29:2774-2778). El gen BVH-A5 (SEQ ID
NO: 1) se amplificó por PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system
2400 Perkin Elmer) a partir del ADN genómico purificado de las 11
cepas de estreptococos del grupo B, y la cepa control de E.
coli usando los siguientes oligonucleótidos presentados en la
Tabla 1: DMAR577 y DMAR747. La PCR se llevó a cabo con 35 ciclos de
30 s a 94ºC, 30 s a 55ºC y 210 s a 68ºC y un periodo de elongación
final de 10 minutos a 68ºC. Los productos de la PCR se fraccionaron
por tamaños en geles de agarosa al 1% y se visualizaron por tinción
con bromuro de etidio. Los resultados de estas amplificaciones por
PCR se presentan en la Tabla 2. El análisis de los productos de
amplificación reveló que el gen BVH-A5 (SEQ ID NO:
1) está presente en el genoma de todas las 11 cepas de estreptococos
del grupo B probadas. Este producto no se detectó cuando el ADN
control de E. coli se sometió a amplificaciones idénticas por
PCR con estos cebadores de oligonucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la clonación del gen
BVH-A5 de estreptococos del grupo B en el plásmido
pCMV-GH de CMV.
Se insertó en fase la región codificante de ADN
del gen BVH-A5 (SEQ ID NO: 1) de estreptococos del
grupo B sin el péptido líder aguas abajo del gen de la hormona del
crecimiento humana (hGH) que estaba bajo el control transcripcional
del promotor de citomegalovirus (CMV) en el vector plasmídico
pCMV-GH (Tang y col., Nature, 1992, 356:152). El
promotor de CMV es un plásmido no funcional en células de E.
coli, pero activo tras la administración del plásmido en
células eucariotas. El vector también incorporaba el gen de
resistencia a ampicilina.
Se amplificó la región codificante del gen
BVH-A5 (SEQ ID NO: 1) sin su péptido líder por PCR
(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer) a partir
de ADN genómico procedente de la cepa NCS 954 de estreptococos del
grupo B serotipo III usando cebadores de oligonucleótidos que
contenían extensiones de bases para la adición de sitios de
restricción BamHI (GGATCC) y SalI (GTCGAC). Se usaron los cebadores
de oligonucleótidos DMAR748 y DMAR749 para amplificar el gen
BVH-A5 (SEQ ID NO: 1). El producto de la PCR se
purificó en gel de agarosa usando un kit de extracción en gel
QIAquick de QIAgen y se digirió con enzimas de restricción (Amersham
Pharmacia Biotech). El vector pCMV-GH (Laboratory
of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The
University of Texas, Dallas, Texas) se digirió con BamHI y SalI y
se purificó en gel de agarosa usando un kit de extracción en gel
QIAquick de QIAgen. Los fragmentos de ADN BamHI-SalI
se ligaron al vector pCMV-GH
BamHI-SalI para crear la proteína de fusión hGH-
BVH-A5 bajo el control del promotor de CMV. El
producto ligado se transformó en la cepa de E. coli
DH5\alpha [\varphi80 dlac Z\DeltaM15 \Delta(lac ZYA-
arg F)U169 end A1 rec A1 hsd
R17(rK-mK+) deo R thi-1 sup
E44 \lambda-gyr A96 rel A1] (Gibco BRL) según el
método de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed),
pp. 109-135). El plásmido pCMV recombinante se
purificó usando un kit de plásmidos de QIAgen y la secuencia de
nucleótidos del inserto de ADN se verificó por secuenciación del
ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra el uso de ADN para provocar
una respuesta inmunitaria al antígeno del polipéptido
BVH-A5 de estreptococos del grupo B.
Grupos de 8 hembras de ratones BALB/c (Charles
River, St-Constant, Québec, Canada) fueron
inmunizados mediante inyección intramuscular de 100 \mul tres
veces a intervalos de dos o tres semanas con 50 \mug de
pCMV-GH recombinante que codifica el gen
BVH-A5 (SEQ ID NO: 1) en presencia de 50 \mug de
plásmido
pCMV-GH-GM-CSF
(Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry,
The University of Texas, Dallas, Texas) que expresa el factor
estimulante de colonias de macrófagos-granulocitos
(GM-CSF)-. Como controles, grupos de ratones fueron
inyectados con 50 \mug de pCMV-GH en presencia de
50 \mug de
pCMV-GH-GM-CSF. Se
recogieron muestras de sangre procedentes del sinus orbital antes
de cada inmunización y siete días después de la tercera inyección y
se determinaron las respuestas de anticuerpos en suero mediante
ELISA usando polipéptidos recombinantes
BVH-A5-His\cdotTag como antígeno
de membrana.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la producción y
purificación de polipéptido BVH-A5 de estreptococos
del grupo B recombinante.
Se usó el plásmido pET-21d(+)
recombinante con el gen BVH-A5 correspondiente a la
SEQ ID NO: 1 para transformar por electroporación (aparato Gene
Pulser II, BIO-RAD Labs, Mississauga, Ontario,
Canada) la cepa de E. coli BL21(DE3)
(F-ompT hsdS B
(r-Bm-B) gal dcm (DE3)) (Novagen,
Madison, WI). En esta cepa de E. coli, el promotor de T7 que
controla la expresión del polipéptido recombinante es reconocido
específicamente por la ARN polimerasa de T7 (presente en el profago
\lambdaDE3) cuyo gen está bajo el control del promotor lac que es
inducible por IPTG. Los transformantes BL21(DE3)/rpET21 se
crecieron a 37ºC con agitación a 250 rpm en caldo LB (peptona 10
g/L, extracto de levaduras 5 g/L, NaCl 10 g/L) que contiene 100
\mug de carbenicilina (Sigma-Aldrich Canada Ltd.,
Oakville, Ontario, Canada) por ml hasta que la A600 alcanzó un valor
de 0,6. Para inducir la producción de polipéptido recombinante
BVH-A5-His\cdotTag de
estreptococos del grupo B, las células se incubaron durante 3 h más
en presencia de IPTG a una concentración final de 1 mM. Las células
inducidas en un cultivo de 500 ml se sedimentaron por
centrifugación y se congelaron a -70ºC.
La purificación de los polipéptidos
recombinantes a partir de la fracción citoplasmática soluble de
BL21(DE3)/
rpET21d(+) inducida por IPTG se realizó por cromatografía de afinidad basándose en las propiedades de la secuencia His\cdotTag (6 residuos de histidina consecutivos) para unir cationes divalentes (Ni^{2+}) inmovilizados sobre la resina quelante de metales unida a His. Resumiendo, las células sedimentadas obtenidas a partir de un cultivo de 500 ml inducidas con IPTG se resuspendieron en tampón de lisis (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, pH 7,9) que contiene PMSF 1 mM, se sometieron a sonicación y se centrifugaron a 12.000 X g durante 20 min para retirar los restos celulares. El sobrenadante se depositó sobre una columna de agarosa Ni-NTA (QIAgen). El polipéptido recombinante BVH-A5-His\cdotTag de estreptococos del grupo B se eluyó con imidazol 250 mM - NaCl 500 mM - Tris 20 mM a pH 7,9. La retirada de la sal y del imidazol de las muestras se realizó por diálisis contra PBS a 4ºC. Las cantidades de polipéptidos recombinantes obtenidas a partir de la fracción soluble de E. coli se estimó por MicroBCA (Pierce, Rockford, Illinois).
rpET21d(+) inducida por IPTG se realizó por cromatografía de afinidad basándose en las propiedades de la secuencia His\cdotTag (6 residuos de histidina consecutivos) para unir cationes divalentes (Ni^{2+}) inmovilizados sobre la resina quelante de metales unida a His. Resumiendo, las células sedimentadas obtenidas a partir de un cultivo de 500 ml inducidas con IPTG se resuspendieron en tampón de lisis (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, pH 7,9) que contiene PMSF 1 mM, se sometieron a sonicación y se centrifugaron a 12.000 X g durante 20 min para retirar los restos celulares. El sobrenadante se depositó sobre una columna de agarosa Ni-NTA (QIAgen). El polipéptido recombinante BVH-A5-His\cdotTag de estreptococos del grupo B se eluyó con imidazol 250 mM - NaCl 500 mM - Tris 20 mM a pH 7,9. La retirada de la sal y del imidazol de las muestras se realizó por diálisis contra PBS a 4ºC. Las cantidades de polipéptidos recombinantes obtenidas a partir de la fracción soluble de E. coli se estimó por MicroBCA (Pierce, Rockford, Illinois).
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la reactividad del
polipéptido recombinante BVH-A5 marcado con His de
GBS con suero humano y suero recogido de ratones después de
la inmunización con una preparación antigénica de GBS.
Como se muestra en la Tabla 3, el polipéptido
recombinante BVH-A5 marcado con His fue reconocido
en inmunotransferencias por los anticuerpos presentes en el
reservorio de suero humano normal. Este es un resultado importante
puesto que indica claramente que los humanos que normalmente están
en contacto con GBS desarrollan anticuerpos que son
específicos para ese polipéptido. Estos anticuerpos humanos
particulares podrían estar implicados en la protección contra la
infección por GBS. Además, las inmunotransferencias también
revelaron que el suero recogido de ratones inmunizados con una
preparación antigénica de GBS enriquecida con polipéptidos de
la superficie externa que indujo una protección significativa en un
modelo de ratón también desarrollaron anticuerpos que reconocían el
polipéptido recombinante BVH-A5 marcado con His.
Estos resultados indican que este polipéptido estaba presente en la
preparación antigénica de GBS que protegía a los ratones
contra la infección y que indujo anticuerpos que reaccionaron con
el polipéptido recombinante BVH-A5 marcado con His
correspondiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la clonación de productos
del gen BVH-A5 truncado mediante reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) y la expresión de moléculas de
BVH-A5 truncadas.
Los fragmentos génicos se amplificaron por PCR
(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer) a partir
de ADN genómico de la cepa NCS 954 de estreptococos del grupo B
serotipo III usando cebadores de oligonucleótidos presentados en la
Tabla 1. Los procedimientos usados para la clonación de los
productos del gen BVH-A5 truncado en un vector de
expresión y la secuenciación son similares a los procedimientos
descritos en el Ejemplo 2. Los polipéptidos recombinantes se
purificaron a partir de fracciones del sobrenadante obtenidas
después de la centrifugación de cultivos de E. coli
inducidos por IPTG sonicados usando una resina de quelación de
metales de unión a histidina (QIAgen) como se describe en el
Ejemplo 6. Los productos génicos generados se listan en la Tabla
4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la protección de ratones
frente a infección fatal por estreptococos del grupo B inducidas
por inmunización con polipéptidos BVH-A5 truncados
recombinantes.
Grupos de ratones CD-1 hembra
(Charles River) fueron inmunizados subcutáneamente tres veces a
intervalos de dos semanas con 20 \mug de polipéptidos
BVH-A5-1-His\cdotTag
truncados en presencia de 10 \mug de adyuvante QuilA (Cedarlane
Laboratories Ltd, Hornby, Ontario, Canada). Los ratones control
fueron inyectados con un adyuvante QuilA solo en PBS. Se recogieron
muestras de sangre procedentes del sinus orbital los días 1, 14, y
28 previos a la inmunización y 14 días (día 42) después de la
tercera inyección. Una semana más tarde los ratones fueron
expuestos a dosis letales de las cepas de GBS. Las muestras
del inóculo de la exposición a los estreptococos del grupo B se
cultivaron en placas de agar con sangre para determinar las CFU y
verificar la dosis de exposición. Las muertes se registraron
durante un periodo de 7 días. Los datos de supervivencia se
presentan en la Tabla 5. Más del 74% de los ratones inmunizados con
cualquiera de los polipéptidos recombinantes
BVH-A5-1 y
BVH-A5-2 estaban protegidos contra
una exposición a la cepa C388/90 (Ia/c) de GBS. Se obtuvo una
protección similar contra una exposición letal a las cepas NCS 251
(II) y NCS 535 (V). Por el contrario, la inmunización de ratones
con BVH-A5-3 no confirió esa
protección contra la exposición a la cepa C388/90 (Ia/c) de
GBS. La tasa de supervivencia determinada para los grupos
inmunizados con BVH-A5-1 y
BVH-A5-2 se demostró que era
estadísticamente diferente del grupo control mediante una prueba
exacta de Fisher.
<110> Shire BioChem Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTÍGENOS DE STREPTOCOCCUS
DEL GRUPO B Y FRAGMENTOS DE ADN CORRESPONDIENTES
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 74872-85
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/303.101
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-07-06
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4740
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa NCS 954 de Streptococcus
del grupo B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1579
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa NCS 954 de Streptococcus
del grupo B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcccatgg attctgtcat aaataagcca tctg
\hfill34
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<210> 4
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<211> 39
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipgcagctcgag ttctcttttg atagacttta gtttgattg
\hfill39
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<210> 5
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipatctggatcc tgattctgtc ataaataagc catctg
\hfill36
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<210> 6
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipgccggtcgac ttattctctt ttgatagact ttagtttg
\hfill38
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<210> 7
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipcatcctcgag atccttttct tgtttgataa atac
\hfill34
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<210> 8
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill36
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<210> 9
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\newpage
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<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatactcgag tctattggaa agcagcaatt ctgc
\hfill34
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 33
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<220>
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<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattccatgg tagaacacgg ggaatctggt atc
\hfill33
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<210> 11
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<211> 20
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattaaccct cactaaaggg
\hfill20
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<210> 12
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<220>
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<223> cebador
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<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaatacgac tcactatagg gc
\hfill22
Claims (20)
1. Un polipéptido aislado seleccionado
entre:
- a)
- un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta entre el aminoácido 44 y el aminoácido 1579 de la SEQ ID NO: 2; o
- b)
- un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta entre el aminoácido 44 y el aminoácido 1579 de la SEQ ID NO: 2; y
- c)
- un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2,
en el que el polipéptido aislado es capaz de
expandir los anticuerpos que se unen específicamente a un
polipéptido que consta de la secuencia de aminoácidos expuesta en
la SEQ ID NO: 2.
2. Un polipéptido aislado (a) que comprende la
secuencia de aminoácidos expuesta en las posiciones de los
aminoácidos 43-1045 de la SEQ ID NO: 2; o (b) que
consta de la secuencia de aminoácidos expuesta en las posiciones de
los aminoácidos 43-1045 de la SEQ ID NO: 2; en la
que el polipéptido aislado es capaz de provocar una respuesta
inmunitaria contra Streptococcus del grupo B, y en el que el
polipéptido aislado es capaz de activar anticuerpos que se unen
específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.
3. Un polipéptido aislado (a) que comprende la
secuencia de aminoácidos expuesta en las posiciones de los
aminoácidos 152-1453 de la SEQ ID NO: 2; o (b) que
consta de la secuencia de aminoácidos expuesta en las posiciones de
los aminoácidos 152-1453 de la SEQ ID NO: 2; en la
que el polipéptido aislado es capaz de provocar una respuesta
inmunitaria contra Streptococcus del grupo B, y en el que el
polipéptido aislado es capaz de activar anticuerpos que se unen
específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.
4. El polipéptido aislado según una cualquiera
de las reivindicaciones 1-3 en el que el polipéptido
aislado es capaz de provocar una respuesta inmunitaria a
Streptococcus del grupo B.
5. Un polipéptido aislado (a) que comprende la
secuencia de aminoácidos expuesta en las posiciones de los
aminoácidos 996-1579 de la SEQ ID NO: 2; o (b) que
consta de la secuencia de aminoácidos expuesta en las posiciones de
los aminoácidos 996-1579 de la SEQ ID NO: 2.
6. Un polipéptido quimérico que comprende (a)
dos o más polipéptidos cada uno que comprende la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2; o (b) dos o más fragmentos
antigénicos, cada fragmento antigénico que comprende al menos 20
aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID
NO: 2, a condición de que los dos o más polipéptidos o dos o más
fragmentos antigénicos estén unidos para formar un polipéptido
quimérico, en el que el polipéptido quimérico es capaz de expandir
los anticuerpos que tienen especificidad de unión por un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la
SEQ ID NO: 2.
7. Una composición farmacéutica que comprende
(i) un vehículo, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable
y (ii) un polipéptido aislado seleccionado entre
- a)
- el polipéptido aislado según la reivindicación 1;
- b)
- un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta entre el aminoácido 44 y el aminoácido 1579 de la SEQ ID NO: 2;
- c)
- un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 85% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta entre el aminoácido 44 y el aminoácido 1579 de la SEQ ID NO: 2;
- d)
- un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta entre el aminoácido 44 y el aminoácido 1579 de la SEQ ID NO: 2;
- e)
- un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta entre el aminoácido 44 y el aminoácido 1579 de la SEQ ID NO: 2; y
- f)
- un polipéptido aislado que comprende un fragmento antigénico de, al menos, 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2,
en la que el polipéptido aislado es capaz de
expandir los anticuerpos que se unen específicamente a un
polipéptido que consta de la secuencia de aminoácidos expuesta en
la SEQ ID NO: 2.
8. Una composición farmacéutica que comprende el
polipéptido quimérico de la reivindicación 6 y un vehículo,
diluyente o adyuvante.
9. La composición farmacéutica de cualquiera de
la reivindicación 7 o la reivindicación 8 en la que la composición
farmacéutica es una vacuna.
10. La composición farmacéutica de cualquiera de
la reivindicación 7 o la reivindicación 8 en la que el polipéptido
aislado provoca una respuesta inmunitaria a Streptococcus del
grupo B.
11. La composición farmacéutica de la
reivindicación 7 en la que el polipéptido aislado se produce
mediante un proceso que comprende el cultivo de una célula
hospedadora transfectada con un polinucleótido que codifica el
polipéptido aislado y que está unido de manera operable a una región
para el control de la expresión, en condiciones adecuadas para la
expresión del polipéptido aislado.
12. Un polinucleótido aislado que comprende un
polinucleótido que codifica el polipéptido aislado de una cualquiera
de las reivindicaciones 1-5 o que codifica el
polipéptido quimérico de la reivindicación 6.
13. El polinucleótido aislado según la
reivindicación 12 en el que el polinucleótido comprende la secuencia
de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1.
14. Un polinucleótido aislado que es
complementario al polinucleótido de cualquiera de la reivindicación
12 o reivindicación 13.
15. Un vector que comprende el polinucleótido de
cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, en el que dicho
polinucleótido está unido de manera operable a una región para el
control de la expresión.
16. Una célula hospedadora transfectada con el
vector de la reivindicación 15.
17. Un procedimiento de producción del
polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones
1-5, dicho proceso que comprende el cultivo de la
célula hospedadora según la reivindicación 16 en condiciones
adecuadas para la expresión de dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Uso de
- a)
- el polipéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4;
- b)
- el polipéptido quimérico según la reivindicación 6;
- c)
- la composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 7-11; o
- d)
- un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión a un antígeno, que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2;
en fabricación de un medicamento para el
tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección por
Streptococcus del grupo B (GBS).
\vskip1.000000\baselineskip
19. a)
\,El polipéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4;
- b)
- el polipéptido quimérico según la reivindicación 6;
- c)
- la composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 7-11; o
- d)
- un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión a un antígeno, que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2;
para su uso en el tratamiento profiláctico o
terapéutico de una infección por Streptococcus del grupo
B.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Un procedimiento para la detección de un
anticuerpo específico para un antígeno de Streptococcus del
grupo B (GBS) en una muestra biológica que contiene, o que
se sospecha que contiene, el anticuerpo, dicho procedimiento que
comprende:
- a)
- la incubación de la muestra biológica con uno o más polipéptidos aislados según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o el polipéptido quimérico según la reivindicación 6, para formar una mezcla; y
- b)
- la detección del polipéptido o polipéptido quimérico unido específicamente en la mezcla que indica la presencia de anticuerpo que se une específicamente al antígeno de Streptococcus del grupo B en la muestra.
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