ES2338012T3 - Formulaciones farmaceuticas para la liberacion prolongada de principios(s) activo(s) asi como sus aplicaciones, particularmente terapeuticas. - Google Patents

Abstract

Formulación farmacéutica líquida para la liberación prolongada de principio(s) activo(s) -PA-, comprendiendo esta formulación al menos un principio activo PA, preferentemente en solución acuosa, y una suspensión coloidal, acuosa, de baja viscosidad, a base de partículas submicrónicas de polímero (PO) biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrófobos (GH), siendo dichas partículas asociadas de manera no covalente con dicho principio activo (PA), Caracterizada porque: ♦ medio de dispersión de la suspensión está esencialmente constituido por agua, ♦ concentración en [PO] está fijada a un valor suficientemente elevado de manera que dicha formulación farmacéutica sea apta para ser inyectada por vía parenteral y para formar después in vivo un depósito gelificado, esta formación de depósito gelificado: - siendo, por un lado, al menos en parte provocada por al menos una proteína fisiológica presente in vivo, - y permitiendo, por otro lado, prolongar y controlar la duración de liberación del PA in vivo, más allá de 24 h después de la administración, ♦ líquida en las condiciones de inyección, ♦ es asimismo líquida a la temperatura y/o al pH fisiológicos, y/o en presencia: * de electrolito fisiológico en concentración fisiológica, * y/o de al menos un tensoactivo.

Description

Formulaciones farmacéuticas para la liberación prolongada de principio(s) activo(s) así como sus aplicaciones, particularmente terapéuticas.

La presente invención se refiere a nuevas formulaciones farmacéuticas a base de suspensiones coloidales acuosas estables y fluidas para la liberación prolongada de principio(s) activo(s), en particular proteínica(s) y peptídica(s), así como a las aplicaciones, en particular terapéuticas, de estas formulaciones.

Estas formulaciones farmacéuticas activas se refieren tanto a la terapéutica humana como veterinaria.

En el campo de la liberación prolongada de los principios activos farmacéuticos, en particular de proteínas terapéuticas, existe una necesidad, en muchos casos, de reproducir lo mejor posible en el paciente una concentración plasmática en proteína o en péptido próxima al valor observado en el sujeto sano.

Este objetivo se enfrenta a la baja duración de vida de las proteínas en el plasma, lo que conduce a inyectar de manera repetitiva la proteína terapéutica. La concentración plasmática en proteína terapéutica presenta entonces un perfil "en diente de sierra" caracterizado por picos de concentración elevada y mínimos de concentración muy baja. Los picos de concentración, muy superiores a la concentración basal en el sujeto sano, tienen efectos nocivos muy marcados debido a la toxicidad elevada de las proteínas terapéuticas tales como la interleucina IL2. Por otra parte, los mínimos de concentración son inferiores a la concentración necesaria para tener un efecto terapéutico, lo que conlleva una mala cobertura terapéutica del paciente y efectos secundarios graves a largo plazo.

Asimismo, para reproducir en el paciente una concentración plasmática en proteína terapéutica próxima al valor ideal para el tratamiento del paciente, es importante que la formulación farmacéutica considerada permita liberar la proteína terapéutica con una duración prolongada, para limitar las variaciones de concentración plasmática a lo largo del tiempo.

Por otro lado, esta formulación activa debe preferentemente satisfacer a las características deseadas siguientes, ya conocido por los expertos en la técnica:

1 -

liberación prolongada de una proteína terapéutica activa y no desnaturalizada, por ejemplo humana o sintética, de manera que la concentración plasmática está mantenida a nivel terapéutico;

2 -

forma líquida suficientemente fluida para ser fácilmente inyectable y esterilizable mediante filtración sobre filtros cuyo tamaño de poros es inferior o igual a 0,2 micrones;

3 -

forma líquida estable;

4 -

biocompatibilidad y biodegradabilidad;

5 -

ninguna toxicidad;

6 -

ninguna inmunogenicidad;

7 -

excelente tolerancia local.

\vskip1.000000\baselineskip

Para intentar alcanzar estos objetivos, ya se han propuesto varios enfoques en la técnica anterior.

En el primer enfoque, la proteína terapéutica nativa es modificada mediante injerto covalente de una o más cadenas de polímero o también mediante injerto covalente de una proteína tal como la albúmina sérica humana (HSA). La proteína así modificada tiene una menor afinidad para sus receptores y su término medio de vida en la circulación general aumenta considerablemente. La amplitud de la variación de concentración entre los picos y los huecos de concentración plasmática en proteína está así considerablemente reducida. De esta manera, la compañía Shering Plough comercializa con el nombre VIRAFÉRON® PEG un interferón alfa 2b modificado químicamente mediante injerto de una cadena de polietilenglicol de masa 12 kD. Esta modificación química se traduce por un aumento del término medio de vida en el paciente de 6,8 a 33 horas. Esta conducta de modificación química de la proteína terapéutica presenta, de manera general, dos inconvenientes mayores. En primer lugar, la modificación irreversible de la proteína que, no siendo ya una proteína humana, puede conducir a largo plazo a problemas de toxicidad y de inmunogenicidad. El segundo inconveniente proviene de la pérdida parcial de bioactividad de la proteína terapéutica
modificada.

En un segundo enfoque, se ha propuesto aumentar la duración de acción gracias a formulaciones que comprenden al menos un polímero y un principio activo, líquidos a temperatura y atmósfera ambientes, inyectables y que se vuelven más viscosos después de la inyección, por ejemplo, bajo el efecto de un cambio de pH y/o de temperatura.

\newpage

De esta manera, en este registro, la patente US-B-6 143 314 divulga una solución orgánica de polímero de liberación controlada de PA, que forma un implante sólido después de la inyección. Esta solución comprende:

\medcirc

(A) 10 a 80% en peso de un polímero termoplástico de base, biocompatible, biodegradable e insoluble en agua o en los fluidos fisiológicos (por ejemplo poliláctico y/o poliglicólico);

\medcirc

(B) un disolvente orgánico, tal como la N-metilpirrolidona que se dispersa en los fluidos fisiológicos;

\medcirc

(C) un principio activo (PA);

\medcirc

(D) y finalmente 1 a 50% en peso de un agente de liberación controlado constituido por un copolímero bloque de tipo poli-láctico-glicólico/poli-butilenglicol.

\vskip1.000000\baselineskip

Después de la inyección, (B) se dispersa o se disipa en los fluidos fisiológicos. (A) forma un implante encapsulante (C) que no está relacionado de manera covalente con (A) ni con (D), y que se libera entonces lentamente in vivo.

El principal inconveniente de esta técnica es usar un disolvente orgánico (B), potencialmente desnaturalizante para el PA (C) (por ejemplo proteínas terapéuticas) y tóxico para el paciente. Además, la hidrólisis in vivo del polímero (A) genera un ácido que puede conducir a problemas de tolerancia local.

Las solicitudes PCT WO-A-99/18142 y WO-A-00118821 se refieren a disoluciones acuosas de polímeros que contienen un PA en forma disuelta o coloidal, que son administrables a animales de sangre caliente, particularmente mediante inyección y que forman un depósito de PA (por ejemplo insulina) gelificado in vivo, debido a que la temperatura fisiológica es superior a su temperatura de gelificación. El gel así formado libera el PA de manera prolongada. Estos polímeros biodegradables particulares son unos tribloques ABA o BAB con A = poliláctico-coglicólico (PLAGA) o poliláctico (PLA) y B = polietilenglicol. Las temperaturas de transformación líquida \Rightarrow gel de estos polímeros tribloques son, por ejemplo, de 36, 34, 30 y 26ºC. Al igual que los polímeros (A) según el documento US-B-6 143 314, la hidrólisis de estos polímeros tribloques ABA o BAB in vivo conduce a ácidos que pueden no ser correctamente tolerados localmente.

La solicitud PCT WO-A-98/11874 describe formulaciones farmacéuticas que comprenden un principio activo lipófilo, un polímero gelificante (Gelrite® = goma gellan desacetilada o etilhidroxicelulosa) y un tensoactivo. La interacción polímero/tensoactivo y eventualmente, tratándose del polímero Gelrite®, la única presencia de electrólitos tales como iones Ca^{++} en concentración fisiológica conduce a la formación de un gel constituido por un agregado de polímero/tensoactivo, al que se enlaza de manera no covalente el principio activo lipófilo. Esta formulación está destinada a una administración local en un órgano diana (el ojo, por ejemplo). La asociación de agregado/principio activo que se forma in situ permite la lenta liberación del principio activo en el órgano diana.

Un tercer enfoque realizado para intentar prolongar la duración de acción de una proteína conservando al mismo tiempo su bioactividad, fue usar una proteína terapéutica no desnaturalizada e incorporarla en microesferas o implantes a base de polímeros biocompatibles. Este enfoque está en particular ilustrado por la patente US-B-6 500 448 y la solicitud US-A-2003/0133980 que describen una composición de liberación prolongada de una hormona humana de crecimiento (hGH) en la que la proteína hormonal, previamente estabilizada mediante complejación con un metal, está después dispersada en una matriz de polímero biocompatible. El polímero biocompatible es, por ejemplo, un poli(láctico), un poli(glicólico) o un copolímero poli(láctico-co-glicólico). La composición se presenta por ejemplo en forma de una suspensión de microesferas en una solución de carboximetilcelulosa de sodio. Este enfoque presenta varios inconvenientes: en primer lugar, durante el procedimiento de fabricación de las microesferas, la proteína se pone en contacto con disolventes orgánicos potencialmente desnaturalizantes. Además, las microesferas son de un tamaño elevado (1 a 1000 micrones), lo que constituye una restricción en términos de inyección y de esterilización fácil sobre filtros. Finalmente, pueden aparecer problemas de tolerancia local durante la hidrólisis in situ del polímero.

Según un cuarto enfoque, se han desarrollado formas de liberación prolongada de proteína terapéutica constituidas por suspensiones, líquidas y poco viscosas, debido a nanopartículas cargadas en proteínas terapéuticas. Estas suspensiones han permitido la administración fácil de proteínas terapéuticas nativas.

La patente FR-B-2 822 834 describe una suspensión coloidal de partículas submicrónicas susceptibles de ser usadas, en particular para la vectorización de principio(s) activo(s) (PA), siendo estas partículas combinaciones supramoleculares individualizadas, siendo estas partículas a base de al menos un copolímero anfifílico que comprende al menos un bloque de polímero hidrofílico de tipo polialquilenglicol (PAG), preferentemente polietilenglicol (PEG) y al menos un copoliaminoácido (PAA) anfifílico lineal, en cadenas \alpha-peptídicas. Esta patente divulga específicamente una suspensión coloidal obtenida mezclando 10 mg de copolímero anfifílico con 1 ml de una solución de insulina a 1,4 mg/ml a pH 7,4.

Una primera forma de suspensiones de nanopartículas de liberación prolongada es aquella constituida por unas suspensiones de liposomas en las que está encapsulada la proteína terapéutica nativa no modificada. Después de la inyección, la proteína está liberada progresivamente de los liposomas, lo que prolonga el tiempo de presencia de la proteína en la circulación general. De esta manera, por ejemplo, Frossen y otros, describen en el artículo Cancer Res 43 p. 546, 1983, la encapsulación de agentes anti-neoplásticos en liposomas a fin de aumentar su eficacia terapéutica. La liberación de los agentes es, sin embargo, demasiado rápida para obtener una liberación real prolongada. La compañía Liposome Company Inc., en su patente US-B-5 399 331, propone mejorar el tiempo de liberación in vitro de la interleucina 2 injertándola de manera covalente en el liposoma. Se vuelve a caer entonces en los defectos del enfoque "proteína modificada" mencionados anteriormente.

Con el fin de paliar la falta de estabilidad de los liposomas, guardando al mismo tiempo las ventajas de una formulación de nanopartículas líquida y de baja viscosidad, la compañía Flarnel Technologies ha propuesto otra vía, en la que la proteína terapéutica está asociada a nanopartículas de un poliaminoácido hidrosoluble "modificado hidrófobo", es decir, modificado mediante injerto de grupos hidrófobos. Este polímero se elige, en particular, entre los poliaminoácidos (poliglutamatos o poliaspartatos) portadores de injertos hidrófobos.

Uno de los intereses notables de estos polímeros modificados hidrófobos es el de autoensamblarse espontáneamente en el agua para formar nanopartículas.

Otro interés de estos sistemas es que las proteínas o los péptidos, en particular las proteínas terapéuticas, se asocian espontáneamente con las nanopartículas de polímeros modificados hidrófobos. Esta asociación es no covalente y se efectúa sin la necesidad de recurrir a un tensoactivo ni a un procedimiento de transformación potencialmente desnaturalizante. No se trata de una encapsulación de la proteína en una microesfera, tal como se divulga en la patente US-B-6 500 448 y en la solicitud US-A-2003/0133980. De manera totalmente diferente, estas nanopartículas de copoliaminoácidos modificados hidrófobos adsorben espontáneamente las proteínas en solución, sin modificarlas químicamente ni desnaturalizarlas y sin hacerles sufrir etapas de tratamiento agresivos de tipo "puesta en emulsión" y "evaporación de disolvente". Las formulaciones se pueden almacenar en forma líquida o liofilizada.

Después de la inyección, por ejemplo por vía subcutánea, estas suspensiones de nanopartículas cargadas en proteínas liberan progresivamente la proteína no desnaturalizada y bioactiva in vivo. Tales asociaciones no covalentes de principio activo (PA) proteínico/poli[Glu] o poli[Asp] están divulgadas en la solicitud de patente WO-A-00/30618.

Esta solicitud describe en particular suspensiones coloidales de pH 7,4, que comprenden asociaciones de insulina humana con nanopartículas de poliglutamato "modificado hidrófobo". La tabla a continuación muestra unos poliaminoácidos "modificados hidrófobos" usados y unos índices de asociación obtenidos en los ejemplos del documento WO-A-00/30618.

1

Estas suspensiones coloidales titulan 1,4 mg/ml de insulina y 10 mg/ml de poliaminoácido "modificado hidrófobo".

Destaca de la figura 1 del documento WO-A-00/30618 que la duración de la liberación in vivo de la insulina vectorizada por las suspensiones en cuestión anteriores, es de 12 h. Esta duración de liberación ganaría al ser aumentada.

De esta manera, incluso si esta solicitud PCT representa ya un progreso considerable, su contenido técnico se puede todavía optimizar frente a las características deseadas enunciado anteriormente, y sobre todo frente a la prolongación de la duración de la liberación in vivo.

Las solicitudes de patente francesas no publicadas n^{os} 02 07008 del 07/06/2002, 02 09670 del 30/07/2002,
03 50190 del 28/05/2003 y 01 50641 del 03/10/2003, se refieren a nuevos poliaminoácidos anfifílicos, hidrosolubles, y que comprenden unidades ácido aspártico y/o unidades ácido glutámico, en las que al menos una parte de estas unidades son portadoras de injertos hidrófobos. Al igual que los poliaminoácidos modificados hidrófobos divulgados en la solicitud WO-A-00/30618, estas nuevas materias primas de polímeros forman espontáneamente, en un medio líquido acuoso, unas suspensiones coloidales de nanopartículas que se pueden usar para la liberación prolongada de PA (insulina). Estas son biocompatibles, biodegradables y las proteínas, en particular las proteínas terapéuticas, se adsorben espontáneamente sobre estas nanopartículas sin sufrir ninguna modificación química o de desna-
turalización.

Estas solicitudes tienen asimismo como objetivo nuevas composiciones farmacéuticas, cosméticas, dietéticas o fitosanitarias a base de estos poliaminoácidos.

Los poliaminoácidos "modificados hidrófobos" anfifílicos según la solicitud de patente francesa nº 02 07008 comprenden unidades de ácido aspártico y/o unidades de ácido glutámico, portadoras de injertos hidrófobos que comprenden al menos un motivo alfa-tocoferol, por ejemplo: (poliglutamato o poliaspartato injertado por el alfa tocoferol de origen sintético o natural).

Esta solicitud, no publicada, divulga específicamente una suspensión coloidal que contiene nanopartículas formadas por asociaciones de polímero/proteína activa y que se obtiene mezclando 1 mg de un poliglutamato injertado por el alfa-tocoferol y 7 mg de insulina en 1 ml de agua, a pH 7,0.

Los poliaminoácidos "modificados hidrófobos" anfifílicos según la solicitud de patente francesa nº 02 09670 comprenden unidades de ácido aspártico y/o unidades de ácido glutámico, portadoras de injertos hidrófobos que comprenden al menos un motivo hidrófobo enlazados a las unidades de ácido aspártico y/o ácido glutámico por medio de una rótula que contiene dos funciones amida, y más precisamente por medio de un "separador" de tipo lisina u ornitina.

Esta solicitud no publicada divulga específicamente una suspensión coloidal que contiene nanopartículas formadas por asociaciones de polímero/proteína activa y que se obtienen mezclando 10 mg de un poliglutamato injertado con ácido palmítico por medio de un "separador" de lisina y 200 Ul de insulina (7,4 mg) en 1 ml de agua, a pH 7,4.

Los poliaminoácidos "modificados hidrófobos" anfifílicos según la solicitud de patente francesa nº 03 50190 comprenden unidades de ácido aspártico y/o unidades de ácido glutámico, de las cuales algunas son portadoras de al menos un injerto enlazado a una unidad de ácido aspártico o glutámico, por medio de un "separador" "aminoácido" a base de Leu y/o ILeu y/o Val y/o Phe, siendo un grupo hidrófobo en C6-C30 enlazado mediante un enlace éster al "separador".

Esta solicitud no publicada divulga específicamente una suspensión coloidal que contiene nanopartículas formadas por asociaciones de polímero/proteína activa y que se obtiene mezclando una solución acuosa que contiene 10 mg de un poliglutamato injertado con un injerto -Leu-OC8, -Val-OC12 o -Val-colesterilo y 200 Ul de insulina (7,4 mg), por mililitro de agua, pH 7,4.

La solicitud de patente francesa FR-A-01 50641 divulga homopoliaminoácidos lineales, anfifílicos, aniónicos, que comprenden unidades de ácido aspártico o unidades de ácido glutámico cuyos extremos son portadores de grupos hidrófobos que comprenden de 8 a 30 átomos de carbono.

En particular, los homopoliaminoácidos telequélicos "modificados hidrófobos" son, por ejemplo, un poli[GluONa] con extremos PheOC18/C18 o un poli[GluONa] con extremos PheOC18/alfa-tocoferol. Esta solicitud no publicada describe asimismo una suspensión coloidal que contiene unas nanopartículas formadas por unas asociaciones de polímero/proteína activa y que se obtiene mezclando 10 mg de uno de los polímeros antes mencionados y 200 Ul de insulina (7,4 mg) por mililitro de agua, a pH 7,4.

La duración de la liberación in vivo de la insulina "vectorizada" por las suspensiones, según estas solicitudes no publicadas, ganaría al ser aumentada.

En todo caso, toda esta técnica anterior sobre las suspensiones coloidales de nanopartículas de poliaminoácidos modificados hidrófobos no revela ninguna formulación que permita:

(I)

aumentar suficientemente la duración de la liberación de la proteína activa después de la inyección por vía parenteral, en particular subcutánea;

(II)

y/o reducir el pico de concentración plasmático de la proteína activa después de la inyección de la formulación que la contiene.

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En estas condiciones, uno de los objetivos esenciales de la presente invención es, por lo tanto, proponer una formulación farmacéutica líquida para la liberación prolongada de principio(s) activo(s), que soluciona las carencias de la técnica anterior, y en particular que permite después de la inyección por vía parenteral (por ejemplo subcutánea), obtener una duración de liberación in vivo prolongada para unos principios activos -PA- (por ejemplo, proteínas, péptidos terapéuticos y pequeñas moléculas) no desnaturalizados, por ejemplo proteínas humanas o sintéticas.

Otro objetivo esencial de la invención es proponer una formulación farmacéutica líquida de liberación prolongada del PA in vivo, que sea suficientemente fluida para ser fácilmente inyectable y esterilizable por filtración sobre filtros cuyo tamaño de poros es inferior o igual a 0,2 micrones.

Otro objetivo esencial de la invención es proponer una formulación farmacéutica líquida de liberación prolongada del PA in vivo, que sea estable a la conservación tanto en el plano fisicoquímico como biológico.

\newpage

Otro objetivo esencial de la invención es proponer una formulación farmacéutica líquida de liberación prolongada del PA in vivo, que presenta al menos una de las propiedades siguientes: biocompatibilidad, biodegradabilidad, atoxicidad, buena tolerancia local.

Otro objetivo esencial de la invención es proponer una formulación farmacéutica para la liberación prolongada lenta del PA in vivo, siendo esta formulación una suspensión coloidal acuosa de baja viscosidad que comprende partículas submicrónicas de polímero PO autoasociadas a al menos un PA, siendo el polímero PO un polímero biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrófobos.

Otro objetivo esencial de la invención es proponer una formulación farmacéutica para la liberación prolongada lenta del PA in vivo, siendo esta formulación una suspensión coloidal acuosa de baja viscosidad que comprende unas partículas submicrónicas de polímero PO autoasociadas a al menos un PA, siendo el polímero PO, por ejemplo, un poliaminoácido formado por unidades de ácido aspártico y/o unidades de ácido glutámico, siendo al menos una parte de estas unidades portadoras de injertos que comprenden al menos un grupo hidrófobo (GH), siendo PO además biodegradable, hidrosoluble y anfifílico.

Otro objetivo esencial de la invención es proponer productos derivados y/o precursores de la formulación mencionada en los objetivos antes enunciados.

Es en particular mérito de la Solicitante haber realizado unas formulaciones farmacéuticas líquidas acuosas de baja viscosidad a temperatura fisiológica que, de manera sorprendente, forman un depósito gelificado in vivo después de una fácil administración parenteral en el ser humano o en los mamíferos de sangre caliente, no siendo la formación de este depósito iniciada mediante un cambio de pH, ni de temperatura durante la inyección parenteral, ni por la presencia de electrolito(s) (tales como iones Ca^{++}) en concentración fisiológica y/o de al menos un tensoactivo, ni tampoco por dispersión de disolvente orgánico en el medio fisiológico. El depósito gelificado así formado aumenta de manera significativa la duración de la liberación del PA in vivo.

De lo cual resulta que la invención se refiere a una formulación farmacéutica líquida para la liberación prolongada de principio(s) activo(s) -PA-, comprendiendo esta formulación una suspensión coloidal, acuosa, de baja viscosidad, a base de partículas submicrónicas de polímero (PO) biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrófobos (GH), siendo dichas partículas asociadas de manera no covalente con al menos un principio activo (PA), caracterizada:

\blacklozenge

porque el medio de dispersión de la suspensión está esencialmente constituido por agua,

\blacklozenge

porque es apta para ser inyectada por vía parenteral y para formar después in vivo un depósito gelificado, esta formación de depósito gelificado:

\medcirc

siendo, por un lado, al menos en parte provocada por al menos una proteína fisiológica presente in vivo,

\medcirc

y permitiendo, por otro lado, prolongar y controlar la duración de liberación del PA in vivo, más allá de 24 h después de la administración,

\blacklozenge

porque es líquida en las condiciones de inyección,

\blacklozenge

y porque es asimismo líquida a la temperatura y/o al pH fisiológicos, y/o en presencia:

*

de electrolito fisiológico en concentración fisiológica,

*

y/o de al menos un tensoactivo.

\vskip1.000000\baselineskip

Ventajosamente, esta gelificación in vivo no resulta de un cambio de pH y/o de temperatura, ni de la presencia de electrolitos (Ca^{++} por ejemplo) en concentración fisiológica y/o de al menos un tensoactivo, ni de una dispersión in vivo de uno o más disolventes orgánicos eventualmente contenidos en la formulación inyectada. Sin querer estar sujeto a la teoría, se puede pensar que las proteínas fisiológicas, presentes in vivo en unas concentraciones fisiológicas, permiten la agregación de las nanopartículas de PO asociadas a al menos un PA. Tal gelificación se lleva a cabo, por ejemplo, en una o más horas, 24 h, 48 h o 72 h, entre otras.

Según la invención, la concentración en [PO] de la formulación se fija a un valor suficientemente elevado para permitir la formación del depósito gelificado in vivo, después de la inyección parenteral, en presencia de al menos una proteína fisiológica.

Según un modo de definición que ya no está basado en un comportamiento in vivo como el indicado anteriormente, sino en un comportamiento in vitro, la invención se refiere a una formulación farmacéutica líquida para la liberación prolongada de principio(s) activo(s) -PA-, siendo esta formulación:

\medcirc

líquida en atmósfera ambiente,

\medcirc

asimismo líquida a la temperatura y/o al pH fisiológicos y/o en presencia:

*

de electrolito fisiológico en concentración fisiológica,

*

y/o de al menos un tensoactivo,

\medcirc

y que comprende una suspensión coloidal; acuosa, de baja viscosidad, una base de partículas submicrónicas de polímero PO biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrófobos GH, siendo dichas partículas asociadas de manera no covalente con al menos un principio activo PA, preferentemente en solución acuosa, y estando el medio de dispersión de la suspensión esencialmente constituido por agua,

caracterizada porque su concentración en [PO] está fijada a un valor suficientemente elevado para permitir la formación del depósito gelificado in vitro, en presencia de al menos una proteína.

\vskip1.000000\baselineskip

Preferentemente, la formulación farmacéutica líquida según la invención se caracteriza porque su concentración en [PO] es tal que:

\blacksquare

[PO] \geq 0,9.C1,

\blacksquare

preferentemente 20.C1 \geq [PO] \geq C1,

\blacksquare

y más preferentemente 10.C1 \geq [PO] \geq C1

representando C1 la concentración de "gelificación inducida" de las partículas de PO tal como se mide en un ensayo GI.

\vskip1.000000\baselineskip

El depósito gelificado obtenido después de la inyección parenteral de la formulación permite una prolongación interesante de la duración de la liberación del PA (por ejemplo, proteína terapéutica) así como una reducción del pico de concentración plasmática. La duración de la liberación del PA está en particular significativamente aumentada con relación a aquella de las formulaciones de la técnica anterior, en particular aquellas descritas en las solicitudes de patente PCT publicada WO-A-00/30618 y sus solicitudes de patente francesa no publicadas n^{os} 02 07008, 02 09670, 03 50190 y 01 50641.

La prolongación de la duración de la liberación de PA in vivo inducida por las formulaciones según la invención es aún más apreciable que los PA (por ejemplo proteínas terapéuticas) que están todavía bioactivas y no desnaturali-
zadas.

En todo el presente texto, las combinaciones supramoleculares de polímero PO asociado o no al PA, se designarán indiferentemente como "partículas submicrónicas" o "nanopartículas". Esto corresponde a partículas (líquidas o sólidas) de diámetro hidrodinámico medio (medido según un modo de realización Md definido más adelante en los ejemplos) por ejemplo, comprendido entre 1 y 500 nm, preferentemente entre 5 y 250 nm.

Además, es muy importante tener en cuenta que estas formulaciones son líquidas, es decir, que presentan ventajosamente una viscosidad muy baja, que hace su inyección fácil. Éstas gelifican sólo in vivo.

Según la invención, los calificativos "líquida", "baja" o "muy baja viscosidad" corresponden, ventajosamente, a una viscosidad dinámica a 20ºC inferior o igual a 5 Pa.s. La medición de referencia para la viscosidad se puede realizar, por ejemplo, a 20ºC con la ayuda de un reómetro AR1000 (TA Instruments) equipado de una geometría cono-plano (4 cm, 2º). La viscosidad v se mide para un gradiente de cizallamiento de 10 s^{-1}.

De esta manera, la viscosidad de las formulaciones según la invención puede estar, por ejemplo, comprendida entre 1.10^{-3} y 5 Pa.s, preferentemente entre 1.10^{-3} y 0,8 Pa.s y, aún más preferentemente, entre 1.10^{-3} y 0,5 Pa.s.

Esta baja viscosidad hace las formulaciones de la invención no sólo fácilmente inyectables por vía parenteral, en particular por vía intramuscular o subcutánea, entre otros, sino también esterilizables fácilmente y a menor coste por filtración sobre unos filtros de esterilización de 0,2 \mum de tamaño de poros.

Este estado líquido o esta baja viscosidad de las formulaciones de la invención existen tanto a temperaturas de inyección que corresponden a temperaturas ambientes, por ejemplo, comprendidas entre 4 y 30ºC, como a temperatura fisiológica.

La formulación según la invención es, preferentemente, una suspensión coloidal acuosa de nanopartículas asociadas a uno o más PA. Esto significa que, según la invención, el medio de dispersión de esta suspensión está esencialmente formado por agua. En la práctica, este agua representa, por ejemplo, al menos 50% en peso con relación a la masa total de la formulación.

Según el sentido de la invención, el término "proteína" designa tanto una proteína como un péptido. Pudiendo ser esta proteína o este péptido modificado o no, por ejemplo, mediante injerto de uno o más grupos polioxieti-
lénicos.

Mediante la expresión "proteínas fisiológicas" se entienden, según el sentido de la invención, las proteínas y/o los péptidos endógenos de los mamíferos de sangre caliente presentes en el lugar de inyección.

Mediante la expresión "temperatura fisiológica" se entiende, según el sentido de la invención, la temperatura fisiológica de los mamíferos de sangre caliente, a saber por ejemplo, aproximadamente 37-42ºC.

Mediante la expresión "pH fisiológico" se entiende, según el sentido de la invención, un pH por ejemplo comprendido entre 6 y 7,6.

Por el término "gel" se entiende, según el sentido de la invención, un estado semisólido en el que se transforma la formulación líquida, según la invención, de forma espontánea mediante la única presencia de proteína(s) fisiológica(s), sin ninguna intervención esencial del pH fisiológico y/o de la temperatura fisiológica y/o de la presencia de un electrolito fisiológico (Ca^{++} por ejemplo) y/o de la dispersión (o disipación) in vivo de un disolvente orgánico eventualmente presente en la formulación inyectada.

Mediante la expresión "electrolito fisiológico" se entiende, según el sentido de la invención, cualquier elemento electrolito (por ejemplo iones Ca^{++}) presente en los mamíferos de sangre caliente.

Mediante la expresión "concentración fisiológica" se entiende, según el sentido de la invención, cualquier concentración fisiológica encontrada en los mamíferos de sangre caliente, para el medio fisiológico considerado.

Además, las formulaciones, según la invención, son no tóxicas, bien toleradas localmente y estables.

Es asimismo mérito de los inventores haber realizado un ensayo in vitro GI que permite seleccionar una población de las formulaciones preferentes, según la invención, y determinar las concentraciones adecuadas en PO en las formulaciones.

Según la invención, el ensayo GI de medición de la concentración de gelificación C1, es un ensayo de referencia que permite definir la concentración crítica C1, denominada a continuación concentración de gelificación inducida C1, que caracteriza cada formulación coloidal según la invención.

El ensayo GI de determinación de la concentración C1 de gelificación inducida es el siguiente:

\quad

A fin de determinar la concentración C1, se preparan formulaciones coloidales de concentraciones variables en polímero anfifílico según la invención y de concentración constante en proteína terapéutica. Para eso, se ponen en solución en agua ionizada cantidades crecientes de polvo seco del polímero. Las soluciones se mantienen a 25ºC bajo agitación magnética durante 16 horas antes de ser mezcladas con una solución concentrada en proteína terapéutica. El volumen y la concentración de esta solución de proteína terapéutica se ajustan a fin de obtener la concentración en proteína buscada para la formulación [por ejemplo 0,3 mg/ml de interferón alfa 2b o 2,5 mg/ml de interleucina 2 (IL2)].

Las formulaciones coloidales así preparadas se mezclan en una solución acuosa de albúmina de suero bovino (BSA) concentrada a 30 mg/ml, y después centrifugada durante 15 minutos a 3000 rpm. Las mezclas se dejan bajo agitación suave durante 24 horas antes de ser recuperadas para ser caracterizadas.

Las mediciones de viscoelasticidad se efectúan sobre un reómetro TA Instrument AR 1000, equipado de una geometría cono-plano (diámetro 4 cm y ángulo 1,59º). Una deformación de 0,01 rad, situada en el dominio de viscoelasticidad lineal, se impone de manera sinusoidal sobre un rango de frecuencia comprendido entre 0,1 y 300 rad/s. La temperatura de la muestra está mantenida constante a 20ºC por medio de una célula Peltier.

Los espectros de frecuencia del módulo elástico G' y del módulo viscoso o de pérdida, G'', permiten definir el tiempo de relajación característico Tr definido aquí como la inversa de la frecuencia a la que el módulo elástico G' cruza el módulo viscoso G''. Se encontrará una exposición detallada de estas cuestiones en el documento Ferry, Viscoelastic Properties of Polymers, J.D.Ferry, J.Wiley, NY, 1980 y en el artículo de J. REGALADO y otros Macromolecules 1999, 32, 8580.

La medición del tiempo de relajación Tr en función de la concentración en polímero de la formulación permite definir la concentración C1 a la que este tiempo Tr pasa por 1 segundo. Ejemplos de valores de la concentración de gelificación C1 se darán en el ejemplo 8 a continuación.

\newpage

De la misma manera, se pueden definir las concentraciones C0,1 y C10 para las cuales el tiempo de relajación supera respectivamente 0,1 s y 10 s. Estas concentraciones se clasifican en el orden creciente siguiente: C0,1 < C1 < C10.

Según una variante de la formulación según la invención:

\ding{226}

[PO] \geq C0,1,

\ding{226}

Preferentemente [PO] \geq C1,

\ding{226}

Y más preferentemente todavía [PO] \geq C10.

\vskip1.000000\baselineskip

Según una característica adicional ventajosa: [PO] \leq 20.C1.

Según el sentido de la invención y en todo el presente texto los términos "asociación" o "asociar" usados para calificar las relaciones entre uno o más principios activos y los polímeros PO (por ejemplo los poliaminoácidos) significan, en particular, que el principio o principios activos están unidos al polímero o polímeros PO [por ejemplo el (o los) poliaminoácido(s)] mediante una unión no covalente, por ejemplo mediante interacción electroestática y/o hidrófoba y/o una unión de hidrógeno y/o un gen estérico.

Los polímeros PO, según la invención, son polímeros biodegradables, hidrosolubles y portadores de grupos hidrófobos GH. Los grupos hidrófobos pueden encontrarse en número reducido frente al resto de la cadena y pueden situarse lateralmente a la cadena o ser intercalados en la cadena, y ser repartidos de manera aleatoria (copolímero estático) o repartidos en forma de secuencias o de injertos (copolímeros bloque o copolímeros secuenciados).

Sin que sea limitativo, los polímeros PO modificados hidrófobos se pueden elegir del grupo que comprende los copoliaminoácidos anfifílicos, los polisacáridos (preferentemente en el subgrupo que comprende los pululanos y/o los quitosanos y/o los mucopolisacáridos), las gelatinas, o sus mezclas.

Según un modo preferente de realización de la invención, PO se elige entre los copoliaminoácidos anfifílicos. Según el sentido de la invención y en todo el presente texto, el término "poliaminoácido" cubre tanto los oligoaminoácidos que comprenden de 2 a 20 unidades de "aminoácido" como los poliaminoácidos que comprenden más de 20 unidades de "aminoácido".

Preferentemente, los poliaminoácidos según la presente invención son oligómeros u homopolímeros que comprenden unidades recurrentes de ácido glutámico o aspártico, o copolímeros que comprenden una mezcla de estos dos tipos de unidades de "aminoácido". Las unidades consideradas en estos polímeros son unos aminoácidos que tienen la configuración D o L o D/L y que están unidos por sus posiciones alfa o gamma para la unidad glutamato o ácido glutámico y alfa o beta para la unidad ácido aspártico o aspartato.

Las unidades de "aminoácido" preferentes de la cadena de poliaminoácido principal son aquellas que tienen la configuración L y una unión de tipo alfa.

Según un modo todavía más preferente de realización de la invención, el polímero PO es un poliaminoácido formado por unidades de ácido aspártico y/o unidades de ácido glutámico, siendo al menos una parte de estas unidades portadora de injertos que comprenden al menos un grupo hidrófobo GH. Estos poliaminoácidos son en particular del tipo de aquellos descritos en la solicitud de patente PCT WO-A-00/30618.

Según una primera posibilidad, el (o los) PO de la formulación son definidos por la fórmula general (I) siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\newpage

en la que:

\blacksquare

\vtcortauna R^{1} representa un H, un alquilo lineal en C2 a C10 o ramificado en C3 a C10, bencilo, una unidad de aminoácido terminal o -R^{4}-[GH];

\blacksquare

\vtcortauna R^{2} representa un H, un grupo acilo lineal en C2 a C10 o ramificado en C3 a C10, un piroglutamato o -R^{4}-[GH];

\blacksquare

\vtcortauna R^{3} es un H o una entidad catiónica preferentemente seleccionada del grupo que comprende:

-

\vtcortauna los cationes metálicos ventajosamente elegidos del subgrupo que comprende: el sodio, el potasio, el calcio, el magnesio,

-

\vtcortauna los cationes orgánicos ventajosamente elegidos del subgrupo que comprende:

\bullet

\vtcortauna los cationes a base de amina,

\bullet

\vtcortauna los cationes a base de oligoamina,

\bullet

\vtcortauna los cationes a base de poliaminas (siendo la polietilenimina particularmente preferida),

\bullet

\vtcortauna los cationes a base de aminoácido(s) ventajosamente elegidos en la clase que comprende los cationes a base de lisina o de arginina,

-

\vtcortauna o los poliaminoácidos catiónicos ventajosamente elegidos del subgrupo que comprende la polilisina o la oligolisina;

\blacksquare

\vtcortauna R^{4} representa una unión directa o un "separador" a base de 1 a 4 unidades de aminoácido;

\blacksquare

\vtcortauna A representa independientemente un radical -CH_{2}- (unidad aspártica) o -CH_{2}-CH_{2}- (unidad glutámica);

\blacksquare

\vtcortauna n/(n+m) se ha definido como el índice de injerto molar y su valor es suficientemente bajo para que PO puesto en solución en agua de pH 7 y 25ºC forme una suspensión coloidal de partículas submicrónicas de PO, preferentemente n/(n+m) está comprendido entre 1 a 25% molar y mejor todavía entre 1 y 15% molar;

\blacksquare

\vtcortauna n + m se ha definido como el grado de polimerización y varía de 10 a 1000, preferentemente entre 50 y 300;

\blacksquare

\vtcortauna GH representa un grupo hidrófobo.

\vskip1.000000\baselineskip

Según una segunda posibilidad, el (o los) PO de la formulación responden a una de las fórmulas generales (II), (III) y (IV) siguientes:

3

\newpage

en las que:

\blacksquare

\vtcortauna GH representa un grupo hidrófobo;

\blacksquare

\vtcortauna es un grupo alquilo lineal en C2 a C6;

\blacksquare

\vtcortauna R^{3}' es un H o una entidad catiónica, preferentemente seleccionada del grupo que comprende:

-

\vtcortauna los cationes metálicos ventajosamente elegidos del subgrupo que comprende: el sodio, el potasio, el calcio, el magnesio,

-

\vtcortauna los cationes orgánicos ventajosamente elegidos del subgrupo que comprende:

\bullet

\vtcortauna los cationes a base de amina,

\bullet

\vtcortauna los cationes a base de oligoamina,

\bullet

\vtcortauna los cationes a base de poliaminas (siendo la polietilenimina particularmente preferida),

\bullet

\vtcortauna los cationes a base de aminoácido(s) ventajosamente elegidos en la clase que comprende los cationes a base de lisina o de arginina,

-

\vtcortauna o los poliaminoácidos catiónicos ventajosamente elegidos del subgrupo que comprende la polilisina o la oligolisina;

\blacksquare

\vtcortauna R^{50} es un grupo alquilo, dialcoxi o diamina en C2 a C6;

\blacksquare

\vtcortauna R^{4} representa una unión directa o un "separador" a base de 1 a 4 unidades de aminoácido;

\blacksquare

\vtcortauna A representa independientemente un radical -CH_{2}- (unidad de ácido aspártico) o -CH_{2}-CH_{2}- (unidad de ácido glutámico);

\blacksquare

\vtcortauna n' + m' o n'' se ha definido como el grado de polimerización y varía de 10 a 1000, preferentemente entre 50 y 300.

\vskip1.000000\baselineskip

Ventajosamente, los grupos GH del PO representan cada uno independientemente entre sí un radical monovalente de fórmula siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

en la que:

-

\vtcortauna R^{5} representa metilo (alanina), isopropilo (valina), isobutilo (leucina), secbutilo (isoleucina), bencilo (fenilalanina);

-

\vtcortauna R^{6} representa un radical hidrófobo que comprende de 6 a 30 átomos de carbono;

-

\vtcortauna I varía de 0 a 6.

\vskip1.000000\baselineskip

Según una característica destacable de la invención, todo o parte de los grupos hidrófobos R^{6} de los PO se eligen de manera independiente, en el grupo de radicales que comprende:

\blacksquare

\vtcortauna un alcoxi lineal o ramificado que comprende de 6 a 30 átomos de carbono y que puede comprender al menos un heteroátomo (preferentemente O y/o N y/o S) y/o al menos una insaturación,

\blacksquare

\vtcortauna un alcoxi que comprende de 6 a 30 átomos de carbono y que tiene uno o más carbociclos anulares y que contiene eventualmente al menos una insaturación y/o al menos un heteroátomo (preferentemente O y/o N y/o S),

\blacksquare

\vtcortauna un alcoxiarilo o un ariloxialquilo de 7 a 30 átomos de carbono y que puede comprender al menos una insaturación y/o al menos un heteroátomo (preferentemente O y/o N y/o S).

\vskip1.000000\baselineskip

En la práctica y sin que eso sea limitativo, el radical hidrófobo R^{6} del injerto del PO procede de un precursor alcohólico elegido del grupo que comprende: el octanol, el dodecanol, el tetradecanol, el hexadecanol, el octadecanol, el oleilalcohol, el tocoferol o el colesterol.

Según una primera forma de realización de la invención, las cadenas principales de poliaminoácidos son homopolímeros de alfa-L-glutamato o de ácido alfa-L-glutámico.

Según una segunda forma de realización de la invención, las cadenas principales de poliaminoácidos son homopolímeros de alfa-L-aspartato o de ácido alfa-L-aspártico.

Según una tercera forma de realización de la invención, las cadenas principales de poliaminoácidos son copolímeros de alfa-L-aspartato/alfa-L-glutamato de ácido alfa-L-aspártico/alfa-L-glutámico.

Ventajosamente, la distribución de las unidades de ácido aspártico y/o de ácido glutámico de la cadena poliaminoácido principal del PO es tal que el polímero así constituido es aleatorio, o bien de tipo bloque, o bien de tipo multiboque.

Según otro modo de definición, el PO usado en la formulación, según la invención, tiene una masa molar que se sitúa entre 2000 y 100.000 g/mol, y preferentemente entre 5000 y 40.000 g/mol.

Según una variante, el PO de la formulación, según la invención, es portador de al menos un injerto de tipo polialquilenglicol unido a una unidad glutamato y/o aspartato.

Ventajosamente, este injerto de tipo polialquilenglicol es de fórmula (V) siguiente.

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

en la que:

-

\vtcortauna R'^{4} representa una unión directa o un "separador" a base de 1 a 4 unidades de aminoácidos;

-

\vtcortauna X es un heteroátomo elegido del grupo que comprende el oxígeno, el nitrógeno o un azufre;

-

\vtcortauna R^{7} y R^{8} representan independientemente un H, un alquilo lineal en C1 a C4;

-

\vtcortauna N''' varía de 10 a 1000, preferentemente de 50 a 300.

\vskip1.000000\baselineskip

En la práctica, el polialquilenglicol es, por ejemplo, un polietilenglicol.

Es deseable, según la invención, que el porcentaje molar de injerto del polialquilenglicol varíe de 1 a 30%.

Los poliaminoácidos PO son además extremadamente interesantes debido a un índice de injerto ajustable, se dispersan en agua de pH 7,4 (por ejemplo con un tampón fosfato) para dar unas suspensiones coloidales.

Además, principios activos PA tales como proteínas, péptidos o pequeñas moléculas, pueden asociarse espontáneamente a nanopartículas que comprenden estos poliaminoácidos PO.

\newpage

Se debe comprender que los PO a base de poliaminoácidos contienen unas funciones carboxílicas que son, bien neutras (forma COOH), o bien ionizadas (anión COO-), según el pH y la composición. Por estas razones, la solubilidad en una fase acuosa es directamente función del índice de COOH libres de los PO (no injertado por el motivo hidrófobo) y del pH. En solución acuosa, el contracatión puede ser un catión metálico tal como sodio, calcio o magnesio, o un catión orgánico tal como trietanolamina, tris(hidroximetil)-aminometano o poliamina tal como la polietilenimina.

Los PO de tipo poliaminoácidos susceptibles de ser usados en la formulación de la invención son obtenidos, por ejemplo, mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. Los poliaminoácidos estadísticos se pueden obtener mediante injerto del injerto hidrófobo, previamente funcionalizado por el "separador", directamente en el polímero mediante reacción habitual de acoplamiento. Los PO poliaminoácidos bloque o multibloques se pueden obtener mediante polimerización secuencial de los anhídridos de N-carboxi-aminoácidos (NCA) correspondientes.

Se prepara por ejemplo un poliaminoácido, un homopoliglutamato, un homopoliaspartato o un copolímero glutamato/aspartato, bloque, multibloque o aleatorio según métodos habituales.

Para la obtención de un poliaminoácido de tipo alfa, la técnica más habitual se basa en la polimerización de anhídridos de N-carboxi-aminoácidos (NCA), descrita por ejemplo en el artículo Biopolymers, 1976, 15, 1869 y en el documento de H.R. Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-carboxy Anhydrides and related Heterocycles" Springer Verlag (1987). Los derivados de NCA son preferentemente unos derivados NCA-O-Me, NCA-O-Et o NCA-O-Bz (Me = Metilo, Et = Etilo y Bz = Bencilo). Los polímeros se hidrolizan después en condiciones apropiadas para obtener el polímero en su forma ácida. Estos métodos se basan en la descripción dada en la patente FR-A-2 801 226 de la solicitante. Un cierto número de polímeros utilizables según la invención, por ejemplo de tipo ácido poli(alfa-L-aspártico), ácido poli(alfa-L-glutámico), ácido poli(alfa-D-glutámico) y ácido poli(gamma-L-glutámico) de masas variables están disponibles comercialmente. El ácido poliaspártico de tipo alfa-beta se obtiene mediante condensación del ácido aspártico (para obtener una polisuccinimida) seguida de una hidrólisis básica (véase Tomida y otros, Polymer 1997, 38, 4733-36).

El acoplamiento del injerto con una función ácida del polímero se realiza fácilmente mediante reacción del poliaminoácido en presencia de una carbodiimida como agente de acoplamiento y, de forma opcional, un catalizador tal como la 4-dimetilaminopiridina y en un disolvente apropiado tal como la dimetilformamida (DMF), la N-metilpirrolidona (NMP) o el dimetilsulfóxido (DMSO). La carbodiimida es, por ejemplo, la diciclohexilcarbodiimida o la diisopropilcarbodiimida. El índice de injerto se controla químicamente mediante la estoiquiometría de los constituyentes y reactivos o el tiempo de reacción. Los injertos hidrófobos funcionalizados por un "separador" se obtienen mediante acoplamiento peptídico clásico o mediante condensación directa por catalización ácida. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Para la síntesis de copolímero bloque o multibloque, se usan derivados NCA previamente sintetizados con el injerto hidrófobo. Por ejemplo, el derivado NCA-hidrófobo se copolimeriza con el NCA-O-bencilo y después se eliminan mediante hidrólisis selectivamente los grupos bencílicos.

La síntesis de poliaminoácidos PO conduce preferentemente a unas suspensiones acuosas de nanopartículas de PO.

Tales suspensiones se pueden transformar en polvos de nanopartículas de PO mediante secado, de manera apropiada y conocida por los expertos en la técnica, como por ejemplo: calentamiento (autoclave, etc.), puesta al vacío, uso de desecantes, liofilización, atomización.

Estas nanopartículas de PO, en suspensión o en estado pulverulento, forman una materia prima para la preparación de las formulaciones, según la invención.

A propósito de eso, se puede precisar que las formulaciones, según la invención, resultan de la asociación no covalente de nanopartículas a base de al menos un PO y de al menos un PA, en un medio líquido acuoso.

Para la preparación, el PO y/o el PA pueden estar en forma sólida (preferentemente polvo) y/o en forma líquida (preferentemente suspensión acuosa coloidal).

La asociación PA/PO significa, según el sentido del presente documento, que el PA o los PA está (están) asocia-
do(s) al (a los) polímero(s) PO [por ejemplo uno o más poliaminoácidos(s)] mediante una o más uniones distinta(s) que una (o más) unión(es) química(s) covalente(s).

Las técnicas de asociación de uno o más PA a los PO, según la invención, se describen especialmente en la solicitud de patente WO-A-00/30618. Consisten en incorporar al menos un PA en el medio líquido que contiene unas nanopartículas de PO, para obtener una suspensión coloidal de nanopartículas cargadas en o asociadas con uno o más principio(s) activo(s).

La invención tiene, por lo tanto, asimismo, por objeto un procedimiento de preparación de la formulación mencionada anteriormente.

\newpage

Según un primer modo preferente de realización, este procedimiento se caracteriza porque consiste esencialmentes en:

\blacklozenge

llevar a cabo una suspensión coloidal de nanopartículas de al menos un PO,

\blacklozenge

mezclar esta suspensión coloidal de nanopartículas de PO con al menos un PA, preferentemente en solución acuosa,

\blacklozenge

añadir eventualmente al menos un excipiente

\blacklozenge

si es necesario, ajustar el pH y/o la osmolaridad, y

\blacklozenge

eventualmente en filtrar la suspensión así obtenida.

\vskip1.000000\baselineskip

Ventajosamente, el PA o los PA se obtienen en forma de suspensión o de solución acuosa para la mezcla con la suspensión coloidal de nanopartículas de PO.

Según un segundo modo de realización, este procedimiento se caracteriza porque consiste esencialmentes en:

\blacklozenge

realizar un polvo de al menos un polímero PO,

\blacklozenge

mezclar este polvo con una suspensión o solución acuosa de al menos un PA, preferentemente en solución acuosa,

\blacklozenge

añadir eventualmente al menos un excipiente,

\blacklozenge

si es necesario ajustar el pH y/o la osmolaridad, y

\blacklozenge

eventualmente filtrar la suspensión así obtenida.

\vskip1.000000\baselineskip

Las formulaciones así obtenidas pueden asimismo ser elaboradas en forma de geles, de polvo o de película mediante los métodos clásicos conocidos por los expertos en la técnica, tales como la concentración por diafiltración o evaporación, el revestimiento, la atomización o la liofilización, entre otros. Estos métodos pueden ser eventualmente combinados.

De lo anterior resulta un tercer modo de realización del procedimiento de preparación de las formulaciones líquidas, según la invención, consistiendo este tercer modo esencialmente en:

\blacklozenge

realizar un polvo procedente del secado de la formulación líquida, según la invención, tal como se ha definido anteriormente,

\blacklozenge

mezclar este polvo con un medio líquido acuoso, preferentemente bajo agitación,

\blacklozenge

añadir eventualmente al menos un excipiente,

\blacklozenge

si es necesario ajustar el pH y/o la osmolaridad, y

\blacklozenge

eventualmente filtrar la suspensión así obtenida

\vskip1.000000\baselineskip

Los excipientes susceptibles de ser añadidos son, por ejemplo, antimicrobianos, tampones, antioxidantes, agentes que permiten ajustar la isotonicidad, que son conocidos por los expertos en la técnica. Se podrá, por ejemplo, referirse al documento: Injectable Drug Development, P.K. Gupta y otros, Interpharm Press, Denver, Colorado 1999.

La filtración eventual de la formulación líquida sobre filtros de porosidad igual, por ejemplo, de 0,2 \mum, permite esterilizarla. Se puede así inyectar directamente a un paciente.

Todos estos ejemplos de preparación de formulaciones líquidas, según la invención, son ventajosamente realizados en atmósfera y a temperatura ambientes (25ºC por ejemplo).

Según otro de sus aspectos, la invención engloba cualquier producto derivado obtenido a partir de la formulación líquida según la invención, tal como se ha definido anteriormente, y que comprende partículas submicrónicas, formadas mediante asociaciones no covalentes PO/PA tales como se han definido anteriormente.

En la práctica, estos productos derivados pueden en particular estar constituidos por polvos, geles, implantes o películas, entre otros.

Además, la invención se refiere a cualquier precursor de la formulación líquida inyectable tal como se ha definido anteriormente.

Haciendo referencia adicional a estos productos derivados, se debe subrayar que la invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de un polvo derivado de la formulación tal como se ha definido anteriormente, estando este procedimiento caracterizado porque dicho polvo se obtiene mediante secado de la formulación tal como se ha definido anteriormente.

Según la invención, el PA puede ser una proteína, una glicoproteína, una proteína enlazada a una o más cadenas polialquilenglicol [preferentemente polietilenglicol (PEG): "proteína-PEGilada"], un polisacárido, un liposacárido, un oligonucleótido, un polinucleótido o un péptido.

Preferentemente, el PA se selecciona entre las hemoglobinas, los citocromos, las albúminas, los interferones, las citocinas, los antígenos, los anticuerpos, la eritropoietina, la insulina, las hormonas de crecimiento, los factores VIII y IX, las interleucinas, o sus mezclas, los factores estimulantes de la hematopoiesis, y sus mezclas.

Según una variante, el principio activo es una "pequeña" molécula orgánica hidrófoba, hidrofílica o anfifílica del tipo de las que pertenecen a la familia de las antraciclinas, de los taxoides o de las camptotecinas, o del tipo de aquellas que pertenecen a la familia de los péptidos tales como la leuprolida o la ciclosporina, y sus mezclas.

Según el sentido del presente texto, una "pequeña" molécula es en particular una pequeña molécula no proteínica.

Según una disposición interesante de la formulación, según la invención, que se refiere a todos los PA con la exclusión de las pequeñas moléculas, la fracción másica del principio activo PA no asociado a las nanopartículas de polímero PO, es tal que (expresada en % con relación a la masa total de la formulación):

\ding{226}

[PA no asociado] \leq 1

\ding{226}

Preferentemente [PA no asociado] \leq 0,5.

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Entre las características primordiales de la formulación, según la invención, figuran su carácter inyectable y su capacidad de formar un depósito sobre el sitio de inyección, in vivo, mediante gelificación o también mediante agregación de las nanopartículas, en presencia de proteínas fisiológicas o análogos.

La formulación, según la invención, puede en particular ser inyectada por vía parenteral, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor.

La formulación, según la invención, puede asimismo ser administrada por vía oral, nasal, vaginal, ocular o bucal.

Ventajosamente, la formulación se destina a la preparación de medicamentos, en particular para administración parenteral, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor, incluso por vía oral, nasal, vaginal u ocular.

Aunque la formulación, según la invención, sea preferentemente farmacéutica, esto no excluye sin embargo las formulaciones cosméticas, dietéticas o fitosanitarias que comprenden al menos un PO tal como se definió anteriormente y al menos un principio activo correspondiente.

Según todavía otro de sus aspectos, la invención se refiere a un procedimiento de preparación de medicamentos, en particular para administración parenteral, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor, incluso por vía oral, nasal, vaginal u ocular, caracterizado porque consiste esencialmente en realizar al menos una formulación definida anteriormente y/o cualquier producto derivado y/o cualquier precursor de dicha formulación.

La invención se refiere asimismo al uso terapéutico de la formulación tal como se describe en el presente texto, que consiste esencialmente en administrar dicha formulación por vía parenteral, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor, incluso por vía oral, nasal, vaginal u ocular, de manera que ésta forme un depósito gelificado/reticulado en el sitio de inyección.

La invención se entenderá mejor y sus ventajas y variantes de realización se comprenderán mejor a partir de los ejemplos siguientes, que describen la síntesis de los PO formados por poliaminoácidos injertados por un grupo hidrófobo, su transformación en sistema de liberación prolongada de PA, a saber, en formulación según la invención (suspensión coloidal acuosa estable) y la demostración de la capacidad de tal sistema, no sólo en asociarse a una proteína terapéutica, sino sobre todo en gelificarse/reticularse para liberar de manera muy prolongada in vivo la proteína terapéutica.

Descripción de las figuras

Figura 1: Curvas de las concentraciones plasmáticas de IFN (picogramo/ml) conseguidas en un perro después de inyección subcutánea

\bullet

de la formulación de IFN (A) según la invención (ejemplos 9 y 10):

\rightarrow curva -\blacksquare-\blacksquare-

\bullet

y de la formulación de IFN (D) control no incluida en la invención (ejemplo 10):

\rightarrow curva -\ding{115}-\ding{115}-,

en función del tiempo T en horas y a una dosis de IFN de 60 \mug/kg.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 2: Curvas de las concentraciones plasmáticas de IL2 (picogramo/ml) conseguidas en un mono después de la inyección subcutánea

\bullet

de la formulación de IL2 según la invención (ejemplo 11):

\rightarrow curva -\Box-\Box-,

\bullet

de la formulación de IL2 (F) control no incluida en la invención (ejemplo 11):

\rightarrow curva -\bullet-\bullet-,

\bullet

y de la formulación de IL2 (G) control no incluida en la invención (ejemplo 11):

\rightarrow curva -\blacksquare-\blacksquare-,

en función del tiempo T en horas y a una dosis de IL2 de 0,5 mg/kg.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Ejemplo 1 Polímero anfifílico P1 Síntesis de un poliglutamato injertado por el alfa-tocoferol de origen sintético

Se solubilizan 5,5 g de un alfa-L-poliglutamato (de masa equivalente a aproximadamente 10.000 Da) con respecto a un estándar de polioxietileno y obtenido mediante polimerización de NCAGluOMe seguida de una hidrólisis tal como se describe en la solicitud de patente FR-A-2 801 226) en 92 ml de dimetilformamida (DMF) calentando a 40ºC durante 2 horas. Una vez solubilizado el polímero, se deja volver la temperatura hasta 25ºC y se añaden sucesivamente 1,49 g de D,L-alfa-tocoferol (> 98% obtenido de Fluka®) previamente solubilizado en 6 ml de DMF, 0,09 g de 4-dimetilaminopiridina previamente solubilizada en 6 ml de DMF y 0,57 g de diisopropilcarbodiimida previamente solubilizada en 6 ml de DMF. Después de 8 horas a 25ºC bajo agitación, el medio de reacción se vierte en 800 ml de agua que contiene 15% de cloruro de sodio y de ácido clorhídrico (pH 2). El polímero precipitado se recupera después mediante filtración, se lava con ácido clorhídrico 0,1N y después con agua. El polímero se resolubiliza después en 75 ml de DMF, y después se reprecipita en agua que contiene como antes sal y ácido a pH 2. Después de dos lavados con agua, se lava varias veces con éter diisopropílico. El polímero se seca después en estufa, en vacío a 40ºC. Se obtiene un rendimiento del orden de 85%.

\newpage

Ejemplo 2 Polímeros anfifílicos P2, P3, P4, P5 y P6

Estos polímeros se obtienen de la misma manera que para la obtención del polímero P1. La siguiente tabla 1 resume las características de estos polímeros. Las del polímero P1 se dan a título de comparación.

TABLA 1

6

Ejemplo 3 Preparación de 30 ml de una formulación de interferón alfa 2b (IFN) a base del polímero P6 (a) Preparación de una solución coloidal de polímero anfifílico

Se introducen en un frasco 1,5 g de polvo liofilizado del poliaminoácido anfifílico P6 del ejemplo 1 anterior. Este polvo se disuelve en 30 ml de agua estéril para inyección. La solución de polímero se mantiene durante 16 horas a 35ºC bajo agitación magnética. La osmolaridad de la solución se ajusta a 275 \pm 20 mOsmol con la ayuda de un osmómetro Fiske Mark 3, introduciendo la cantidad necesaria de una solución acuosa de NaCl 5,13M (30% p/p). El pH se ajusta si es necesario a pH 7,4 \pm 0,2 mediante la adición de una solución de NaOH 1N. La concentración en polímero se ajusta a 45 mg/ml mediante la adición de una solución acuosa estéril de NaCl 0,15M. La solución de polímero se filtra a continuación sobre un filtro de tamaño de poro 0,8 y 0,2 micrones, y después se almacena a 4ºC.

(b) Asociación de la proteína al polímero

En un frasco de vidrio, se mezclan después 26,65 ml de la solución coloidal de polímero P6 anterior y 1,85 ml de una solución de IFN (PC GEN; solución concentrada a 2,42 mg/ml). La osmolaridad y el pH se reajustan si es necesario a 300 \pm 20 mOsmol y pH 7,4 \pm 0,2 mediante la adición de sosa 0,1N y de cloruro de sodio 0,9% estéril. La solución cargada en proteína se pone en maduración durante 5 h a 25ºC en estufa, y después se filtra sobre 0,8-0,2 micrones. Se obtienen así 30 ml de una formulación lista para ser inyectada que contiene 0,15 mg/ml de IFN y 40 mg/ml de polímero P6.

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Ejemplo 4 Preparación de una formulación de IFN de larga acción, según la presente invención, a base de uno de los polímeros P1 a P5

La preparación se efectúa como en el ejemplo 3, preparando en un primer tiempo una solución coloidal de polímero a 1,25 veces la concentración final buscada, y después mezclando esta solución con una solución de interferón concentrada a 2,42 mg/ml. El volumen de la solución de proteína se determina mediante la elección de la relación de la concentración en polímero, a la concentración en proteína diana. Como en el ejemplo 3, los ajustes de concentraciones y de pH se realizan mediante adición de una solución de NaCl y de sosa.

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Ejemplo 5 Preparación de una formulación de interleucina-2 (IL2) de larga acción, según la presente invención, a base del polímero P3

Se introduce en un frasco la cantidad de polvo liofilizado del polímero anfifílico y de agua estéril necesaria para obtener una concentración en polímero igual a X = 1,3 veces la concentración final buscada en la formulación.

La solución del polímero se prolonga durante 16 horas bajo agitación magnética.

La cantidad necesaria de IL2 liofilizada (Prospec) se concentra a X/(X-1) veces la concentración final buscada.

La concentración precisa de la solución de IL2 concentrada se determina mediante determinación UV a 280 nm, con la ayuda de un espectrofotómetro UV Perkin Elmer Lambda 35.

Esta solución de IL2 se filtra sobre 0,8-0,2 \mum y se almacena a 4ºC. Su pH se ajusta a pH 11 mediante adición de NaOH 1M. Se denomina Y la relación de la concentración en proteína de esta solución con la concentración deseada en la formulación. Se procede después a la mezcla a temperatura ambiente de la solución de proteína y de la solución de polímero. Para un volumen de polímero, se añaden X-1 volúmenes de solución de proteína. El pH y la osmolaridad se ajustan a pH 7,4 \pm 0,2 y a 300 \pm 20 mOsm.

De esta manera, para preparar una formulación de IL2 de larga acción, según la invención, a base del polímero P3 que contiene 20 mg/ml de polímero P3 y 2,5 mg/ml de IL2, la solución inicial de polímero se concentra a 26 mg/ml. La solución inicial de IL2 se concentra a 11 mg/ml. Para un volumen de polímero, se añaden 0,3 volúmenes de solución de proteína.

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Ejemplo 6 Medición del diámetro hidrodinámico medio de las nanopartículas de diferentes polímeros PO, según la invención

El diámetro hidrodinámico medio de las partículas de polímero PO según la invención se mide según el modo de realización Md definido a continuación:

Las disoluciones de PO se preparan en unas concentraciones de 1 ó 2 mg/ml en medio NaCl 0,15M y se dejan bajo agitación durante 24 h. Estas disoluciones se filtran después sobre 0,8-0,2 \mum, antes de analizarlas en difusión dinámica de la luz gracias a un aparato de tipo Brookhaven, que funciona con un haz láser de longitud de onda 488 nm y polarizado verticalmente. El diámetro hidrodinámico de las nanopartículas de polímero PO se calcula a partir de la función de autocorrelación del campo eléctrico por medio del método de los cumulantes, tal como se describe en el texto "Surfactant Science Series" volumen 22, Surfactant Solutions, Ed. R Zana, cap. 3, M. Dekker, 1984.

Se obtienen los resultados siguientes para los polímeros PO, P2, P3, P4 y P6 del ejemplo 2:

TABLA 2

7

Ejemplo 7 Asociación espontánea de una proteína a las nanopartículas de polímero PO

Una solución de tampón fosfato a 25 mM se prepara a partir de polvo de NaH_{2}Po_{4} (Sigma ref. S-0751) y se ajusta con sosa 1N (SDS ref. 3470015) a pH = 7,2.

Una suspensión coloidal de nanopartículas de polímero P1 se prepara mediante disolución del polímero liofilizado durante una noche a 5 mg/ml en la solución de tampón fosfato anterior.

Una solución madre de BSA (Sigma A-2934) se prepara mediante disolución durante dos horas de una proteína a 10 mg/ml en el mismo tampón.

Las disoluciones madres así como el tampón se filtran sobre 0,22 \mum.

Se realizan unas mezclas mediante adición de volúmenes predeterminados de dos soluciones madres y de la dilución en el tampón fosfato para obtener al final una gama de muestras que tienen una concentración constante en polímero (0,1 mg/ml) y unas concentraciones crecientes de proteínas (0 a 1,8 mg/ml).

Las muestras se dejan asociarse durante 5 horas a 25ºC y después se analizan mediante electroforesis capilar en un método denominado de frontal en el que es posible visualizar separadamente la proteína y el complejo de proteína-polímero. Para más detalles de esta técnica, se consultará el siguiente artículo: Gao JY, Dublin PL, Muhoberac BB, Anal. Chem. 1997, 69, 2945. Los análisis se realizan en un aparato Agilent G16000A provisto de una burbuja capilar de sílice fundida (tipo G1600-62-232). La altura del primer nivel que corresponde a la proteína libre permite determinar la concentración en BSA no asociada. El experimento muestra que para unas cantidades de proteínas inferiores a 0,1 g de proteína por g de polímero, la proteína se asocia a las nanopartículas de polímero.

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Ejemplo 8 Determinación de la concentración de gelificación C1 para los polímeros P0, P1 a P4 y P6

Se aplica el ensayo GI a formulaciones de IFN y de IL2 asociadas a los polímeros P1 a P6 de los ejemplos 1 y 2. Las concentraciones en proteínas de estas formulaciones se trasladan a la tabla siguiente. La medición del tiempo de relajación de las formulaciones en presencia de BSA (concentración 30 mg/ml) se efectúa según el modo de realización del ensayo GI. La concentración crítica C1, para la cual el tiempo de relajación excede 1 s se traslada a las tablas 3 y 4 para IFN e IL-2 respectivamente:

TABLA 3

8

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TABLA 4

9

Ejemplo 9 Farmacocinética de IFN en el perro después de la inyección subcutánea de una formulación de IFN que pertenece a la selección según la invención

Una formulación (A) de IFN (concentración 0,3 mg/ml) y de polímero anfifílico P1 a la concentración de 30 mg/ml se prepara según el modo de realización descrito en el ejemplo 3.

Esta formulación se inyecta por vía subcutánea a unos perros Beagles (n=3), en dosis de 60 \mug/kg). Se efectúan extracciones de suero en los tiempos 1, 5, 11, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168 y 240 horas. La concentración plasmática en IFN se mide sobre estas extracciones mediante determinación ELISA (kit immunotech IM 3193).

Se obtiene así un perfil de concentración plasmática medio tal como se representa en la figura 1 que demuestra claramente la liberación prolongada de la proteína en el suero con respecto a una formulación de control (D) no incluida en la invención de IFN (concentración 0,3 mg/ml) y de polímero anfifílico P6 a la concentración de 40 mg/ml (véase la tabla 5, ejemplo 10). En un plano cuantitativo, la prolongación de la liberación de IFN por las formulaciones, según la invención, se estima mediante la medición:

(a)

del tiempo Tmax, mediana del tiempo para el cual la concentración plasmática es máxima,

(b)

del tiempo T50, media del tiempo al final del cual el área debajo de la curva de concentración plasmática alcanza 50% de su valor máximo de medida.

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En el caso de esta formulación, los tiempos Tmax y T50 toman los valores:

Tmax = 28 horas

T50 = 54,2 horas

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Ejemplo 10 Farmacocinética de IFN en el perro después de la inyección subcutánea de diversas formulaciones de IFN a base de poliaminoácidos anfifílicos

Las siguientes formulaciones se preparan según el modo de realización descrito en el ejemplo 3.

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TABLA 5

10

La formulación A tiene una concentración en polímero superior a la concentración de gelificación C1 medida en el ejemplo 8. En otras palabras, el tiempo de relajación, medido en el ensayo GI, es superior a 1 segundo. Esta formulación A pertenece, por lo tanto, a la selección según la invención. En cambio, las formulaciones B, C y D tienen unas concentraciones inferiores a sus concentraciones de gelificación y no pertenecen a la selección según la invención.

Estas formulaciones se inyectan a una dosis de 60 \mug/kg a perros Beagle. Se efectúan extracciones de plasma en los tiempos 1, 5, 11, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168 y 240 horas. La concentración plasmática en IFN se mide como en el ejemplo anterior.

Los tiempos Tmax y T50 para las formulaciones A, B, C y D se trasladan a la tabla 6 siguiente.

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TABLA 6

11

De esta manera, la formulación A, que pertenece a la selección según la invención, presenta una duración de liberación considerablemente aumentada con respecto a las formulaciones B, C y D que no pertenecen a la selección según la invención.

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Ejemplo 11 Farmacocinética de la interleucina 2 (IL2) en el mono después de la inyección subcutánea de diversas formulaciones a base de poliaminoácidos anfifílicos

Las formulaciones siguientes se preparan según el modo de realización descrito en el ejemplo 5.

TABLA 7

12

Las formulaciones E y F, que tienen una concentración en polímero superior a la concentración de gelificación C1 medida en el ejemplo 8, pertenecen por lo tanto a la selección según la invención. En cambio, la formulación G tiene una concentración inferior a la concentración de gelificación C1 y no pertenece a la selección según la invención.

Estas formulaciones se inyectan a la dosis de 0,5 mg/kg a unos monos Cynomolgus. Se efectúan unas extracciones plasmáticas en los tiempos 1, 5, 11, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168 y 240 horas. La concentración plasmática en IL2 se mide sobre estas extracciones mediante el ensayo de determinación ELISA (Kit Immunotech IM 3583).

Los tiempos Tmax y T50 para las formulaciones E, F y G se trasladan en la tabla 8 siguiente.

TABLA 8

13

De esta manera, las formulaciones E y F, que pertenecen a la selección según la invención, presentan una duración de liberación considerablemente aumentada con respecto a la formulación G que no pertenece a la selección según la invención.

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Ejemplo 12 Observación de la gelificación in vivo de las formulaciones, según la invención, después de la inyección subcutánea

El comportamiento subcutáneo de las formulaciones, según la invención, se ha estudiado en el cerdo doméstico. Se ha procedido a inyectar debajo de la piel de la barriga, a 4 mm de profundidad, seis cerdos domésticos, con 0,3 ml de las siguientes formulaciones:

Formulación A:

solución acuosa isotónica de pH 7,3 del polímero P6 del ejemplo 2 concentrado a 45 mg/ml.

Formulación B:

solución acuosa isotónica de pH 7,3 del polímero P1 del ejemplo 1 concentrado a 20 mg/ml.

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Los sitios inyectados han sido extraídos 72 horas después de la administración. El examen histológico muestra la presencia de un depósito gelificado de polímero para la formulación B. Este se presenta en forma de zonas uniformemente coloreadas. Sin embargo, este fenómeno no se observa para la formulación A para la cual el polímero se infiltra entre las fibras de colágeno. Se puede subrayar que la matriz de polímero B es perfectamente biodegradable debido a que el tejido ha vuelto completamente a su estado normal después de 21 días.

Claims (34)

1. Formulación farmacéutica líquida para la liberación prolongada de principio(s) activo(s) -PA-, comprendiendo esta formulación al menos un principio activo PA, preferentemente en solución acuosa, y una suspensión coloidal, acuosa, de baja viscosidad, a base de partículas submicrónicas de polímero (PO) biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrófobos (GH), siendo dichas partículas asociadas de manera no covalente con dicho principio activo (PA),

Caracterizada porque:

\blacklozenge

el medio de dispersión de la suspensión está esencialmente constituido por agua,

\blacklozenge

su concentración en [PO] está fijada a un valor suficientemente elevado de manera que dicha formulación farmacéutica sea apta para ser inyectada por vía parenteral y para formar después in vivo un depósito gelificado, esta formación de depósito gelificado:

\medcirc

siendo, por un lado, al menos en parte provocada por al menos una proteína fisiológica presente in vivo,

\medcirc

y permitiendo, por otro lado, prolongar y controlar la duración de liberación del PA in vivo, más allá de 24 h después de la administración,

\blacklozenge

es líquida en las condiciones de inyección,

\blacklozenge

y es asimismo líquida a la temperatura y/o al pH fisiológicos, y/o en presencia:

*

de electrolito fisiológico en concentración fisiológica,

*

y/o de al menos un tensoactivo.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Formulación farmacéutica líquida para la liberación prolongada de principio(s) activo(s) -PA-, siendo esta formulación:

\medcirc

líquida en atmósfera ambiente,

\medcirc

asimismo líquida a la temperatura y/o al pH fisiológicos y/o en presencia:

*

de electrolito fisiológico en concentración fisiológica,

*

y/o de al menos un tensoactivo,

\medcirc

y que comprende al menos un principio activo PA, preferentemente una solución acuosa, y una suspensión coloidal, acuosa, de baja viscosidad, a base de partículas submicrónicas de polímero PO biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrófobos GH, siendo dichas partículas asociadas de manera no covalente con dicho principio activo PA, y estando el medio de dispersión de la suspensión esencialmente constituido por agua,

caracterizada porque su concentración en [PO] está fijada a un valor suficientemente elevado para permitir la formación de depósito gelificado in vitro, en presencia de al menos una proteína.

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3. Formulación, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque su concentración en [PO] es tal que:

\blacksquare

[PO] \geq 0,9.C1,

\blacksquare

preferentemente 20.C1 \geq [PO] \geq C1,

\blacksquare

y más preferentemente 10.C1 \geq [PO] \geq C1

representando C1 la concentración de "gelificación inducida" de las partículas de PO tal como se mide en un ensayo GI.

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4. Formulación, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque su viscosidad es inferior o igual a 5 Pa.s.

5. Formulación, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque los polímeros modificados hidrófobos PO se seleccionan del grupo que comprende: poliaminoácios, polisacáridos preferentemente en el subgrupo que comprende pululanos y/o quitosanos y/o mucopolisacáridos, gelatinas, o sus mezclas.

6. Formulación, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque los grupos hidrófobos (GH) se sitúan lateralmente en la cadena.

7. Formulación, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el polímero (PO) es un poliaminoácido formado por unidades de ácido aspártico y/o unidades de ácido glutámico, siendo al menos una parte de estas unidades portadora de injertos que comprenden al menos un grupo hidrófobo (GH).

8. Formulación, según la reivindicación 7, caracterizado porque el (los) PO se ha definido(n) mediante la fórmula general (I) siguiente:

14

en la que:

\blacksquare

R^{1} representa un H, un alquilo lineal en C2 a C10 o ramificado en C3 a C10, bencilo, una unidad de aminoácido terminal o -R^{4}-[GH];

\blacksquare

R^{2} representa un H, un grupo acilo lineal en C2 a C10 o ramificado en C3 a C10, un piroglutamato o -R^{4}-[GH];

\blacksquare

R^{3} es un H o una entidad catiónica preferentemente seleccionada del grupo que comprende:

-

\vtcortauna los cationes metálicos ventajosamente elegidos del subgrupo que comprende: el sodio, el potasio, el calcio, el magnesio,

-

\vtcortauna los cationes orgánicos ventajosamente elegidos del subgrupo que comprende:

\bullet

\vtcortauna los cationes a base de amina,

\bullet

\vtcortauna los cationes a base de oligoamina,

\bullet

\vtcortauna los cationes a base de poliaminas (siendo la polietilenimina particularmente preferida),

\bullet

\vtcortauna los cationes a base de aminoácido(s) ventajosamente elegidos en la clase que comprende los cationes a base de lisina o de arginina,

-

\vtcortauna o los poliaminoácidos catiónicos ventajosamente elegidos del subgrupo que comprende la polilisina o la oligolisina;

\blacksquare

R^{4} representa una unión directa o un "separador" a base de 1 a 4 unidades de aminoácido;

\blacksquare

A representa independientemente un radical -CH_{2}- (unidad de ácido aspártico) o -CH_{2}-CH_{2}- (unidad de ácido glutámico);

\blacksquare

n/(n+m) se ha definido como el índice de injerto molar y su valor es suficientemente bajo para que PO puesto en suspensión en agua de pH 7 y 25ºC forme una suspensión coloidal de partículas submicrónicas de PO, preferentemente n/(n+m) está comprendido entre 1 a 25% molar y mejor todavía entre 1 y 15% molar;

\blacksquare

n + m varían de 10 a 1000, preferentemente entre 50 y 300;

\blacksquare

GH representa un grupo hidrófobo.

\vskip1.000000\baselineskip

9. Formulación, según la reivindicación 7, caracterizada porque el (o los) PO responde(n) a una de las fórmulas generales (II), (III) y (IV) siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

en las que:

\blacksquare

GH representa un grupo hidrófobo;

\blacksquare

R^{30} es un grupo alquilo lineal en C2 a C6;

\blacksquare

R^{3}' es un H o una entidad catiónica, preferentemente seleccionada del grupo que comprende:

-

\vtcortauna cationes metálicos ventajosamente elegidos del subgrupo que comprende: sodio, potasio, calcio, magnesio,

-

\vtcortauna cationes orgánicos ventajosamente elegidos del subgrupo que comprende:

\bullet

\vtcortauna cationes a base de amina,

\bullet

\vtcortauna cationes a base de oligoamina,

\bullet

\vtcortauna cationes a base de poliamina (siendo la polietilenimina particularmente preferida),

\bullet

\vtcortauna cationes a base de aminoácido(s) ventajosamente elegidos en la clase que comprende los cationes a base de lisina o de arginina,

-

\vtcortauna o los poliaminoácidos catiónicos ventajosamente elegidos del subgrupo que comprende la polilisina o la oligolisina;

\blacksquare

R^{50} es un grupo alquilo, dialcoxi o diamina en C2 a C6;

\blacksquare

R^{4} representa una unión directa o un "separador" a base de 1 a 4 unidades de aminoácido;

\blacksquare

A representa independientemente un radical -CH_{2}- (unidad de ácido aspártico) o -CH_{2}-CH_{2}- (unidad de ácido glutámico);

\blacksquare

n' + m' o n'' se ha definido como el grado de polimerización y varía de 10 a 1000, preferentemente entre 50 y 300.

\newpage

10. Formulación, según la reivindicación 8 ó 9, caracterizada porque los grupos GH del PO representan cada uno independientemente entre sí un radical monovalente de fórmula siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

en la que:

-

\vtcortauna R^{5} representa metilo (alanina), isopropilo (valina), isobutilo (leucina), secbutilo (isoleucina), bencilo (fenilalanina);

-

\vtcortauna R^{6} representa un radical hidrófobo que comprende de 6 a 30 átomos de carbono;

-

\vtcortauna 1 varía de 0 a 6.

\vskip1.000000\baselineskip

11. Formulación, según la reivindicación 10, caracterizada porque todo o parte de los radicales hidrófobos R^{6} de los PO se eligen de manera independiente del grupo de radicales que comprende:

\blacksquare

un alcoxi lineal o ramificado que comprende de 6 a 30 átomos de carbono y que puede comprender al menos un heteroátomo (preferentemente O y/o N y/o S) y/o al menos una insaturación,

\blacksquare

un alcoxi que comprende de 6 a 30 átomos de carbono y que tiene uno o más carbociclos anulares y que contiene eventualmente al menos una insaturación y/o al menos un heteroátomo (preferentemente O y/o N y/o S),

\blacksquare

un alcoxiarilo o un ariloxialquilo de 7 a 30 átomos de carbono y que puede comprender al menos una insaturación y/o al menos un heteroátomo (preferentemente O y/o N y/o S).

\vskip1.000000\baselineskip

12. Formulación, según la reivindicación 10 u 11, caracterizada porque el radical hidrófobo R^{6} del injerto del PO procede de un precursor alcohólico elegido del grupo que comprende: el octanol, el dodecanol, el tetradecanol, el hexadecanol, el octadecanol, el oleilalcohol, el tocoferol o el colesterol.

13. Formulación, según la reivindicación 7, caracterizada porque el PO está constituido por un homopolímero de alfa-L-glutamato o de ácido alfa-L-glutámico.

14. Formulación, según la reivindicación 7, caracterizada porque el PO está constituido por un homopolímero de alfa-L-aspartato o de ácido alfa-L-aspártico.

15. Formulación, según la reivindicación 7, caracterizada porque el PO está constituido por un copolímero de alfa-L-aspartato/alfa-L-glutamato o de ácido alfa-L-aspártico/alfa-L-glutámico.

16. Formulación, según la reivindicación 15, caracterizada porque en el PO la distribución de las unidades de ácido aspártico y/o de ácido glutámico portadoras de injertos que comprenden al menos un motivo GH es tal que el polímero así constituido es aleatorio, o bien de tipo bloque o bien de tipo multibloque.

17. Formulación, según la reivindicación 1, caracterizada porque la masa molar del PO se sitúa entre 2000 y 100.000 g/mol, y preferentemente entre 5000 y 40.000 g/mol.

18. Formulación, según la reivindicación 7, caracterizada porque el PO es portador de al menos un injerto de tipo polialquilenglicol unido a una unidad glutamato y/o aspartato.

\newpage

19. Formulación, según la reivindicación 18, caracterizada porque el injerto de tipo polialquilenglicol es de fórmula (V) siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

en la que:

-

\vtcortauna R'^{4} representa una unión directa o un "separador" a base de 1 a 4 unidades de aminoácidos;

-

\vtcortauna X es un heteroátomo elegido del grupo que comprende el oxígeno, el nitrógeno o un azufre;

-

\vtcortauna R^{7} y R^{8} representan independientemente un H, un alquilo lineal en C1 a C4;

-

\vtcortauna N''' varía de 10 a 1000, preferentemente de 50 a 300.

\vskip1.000000\baselineskip

20. Formulación, según la reivindicación 18 ó 19, caracterizada porque el polialquilenglicol es un polietilenglicol.

21. Formulación, según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizada porque el porcentaje molar de injerto del polialquilenglicol varía de 1 a 30%.

22. Formulación, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el PA es una proteína, una glicoproteína, una proteína enlazada a una o más cadenas polialquilenglicol [preferentemente polietilenglicol (PEG): "proteína-PEGilada"], un polisacárido, un liposacárido, un oligonucleótido, un polinucleótido o un péptido,

preferentemente seleccionada entre las hemoglobinas, los citocromos, las albúminas, los interferones, las citocinas, los antígenos, los anticuerpos, la eritropoietina, la insulina, las hormonas de crecimiento, los factores VIII y IX, las interleucinas, o sus mezclas, los factores estimulantes de la hematopoiesis.

23. Formulación, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizada porque el principio activo es una "pequeña" molécula orgánica hidrófoba, hidrofílica o anfifílica.

24. Formulación, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizada porque su fracción másica en PA no asociado a las partículas submicrónicas [PA no asociado] en % en peso es tal que:

\medcirc

[PA no asociado] \leq 1

\medcirc

Preferentemente [PA no asociado] \leq 0,5.

\vskip1.000000\baselineskip

25. Formulación, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es inyectable por vía parenteral, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor.

26. Formulación, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque se destina a la preparación de medicamentos, en particular para la administración parenteral, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor, incluso por vía oral, nasal, vaginal u ocular.

27. Procedimiento de preparación de medicamentos, en particular para la administración parenteral, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor, incluso por vía oral, nasal, vaginal u ocular, caracterizado porque consiste esencialmente en realizar al menos una formulación, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

28. Producto derivado, caracterizado porque comprende unas partículas submicrónicas, formadas por asociaciones no covalentes PO/PA tales como se han definido en la reivindicación 1, y porque se obtiene a partir de la formulación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

29. Producto derivado, según la reivindicación 28, caracterizado porque está constituido por un polvo o por un gel.

30. Procedimiento de preparación de la formulación, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque consiste esencialmente:

\blacklozenge

en realizar una suspensión coloidal de nanopartículas de al menos un PO,

\blacklozenge

en mezclar esta suspensión coloidal de nanopartículas de PO con al menos un PA, preferentemente en solución acuosa,

\blacklozenge

en añadir eventualmente al menos un excipiente,

\blacklozenge

si es necesario, en ajustar el pH y/o la osmolaridad, y

\blacklozenge

eventualmente, en filtrar la suspensión así obtenida.

\vskip1.000000\baselineskip

31. Procedimiento, según la reivindicación 30, caracterizado porque el (o los) PA está(n) en forma de suspensión o de solución acuosa para la mezcla con la suspensión coloidal de nanopartículas de PO.

32. Procedimiento de preparación de la formulación, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque consiste esencialmente:

\quad

en realizar un polvo de nanopartículas de al menos un polímero PO,

\quad

en mezclar este polvo con una suspensión o solución acuosa de al menos un PA, preferentemente en solución acuosa,

\quad

en añadir eventualmente al menos un excipiente,

\quad

si es necesario, en ajustar el pH y/o la osmolaridad, y

\quad

eventualmente, en filtrar la suspensión así obtenida.

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33. Procedimiento de preparación de la formulación, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque consiste esencialmente:

\quad

en realizar un polvo procedente del secado de la formulación líquida, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26,

\quad

en mezclar este polvo con un medio líquido acuoso, preferentemente bajo agitación,

\quad

en añadir eventualmente al menos un excipiente,

\quad

si es necesario, en ajustar el pH y/o la osmolaridad, y

\quad

eventualmente, en filtrar la suspensión así obtenida.

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34. Procedimiento de preparación de un polvo derivado de la formulación, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque dicho polvo se obtiene mediante secado de la formulación, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.