ES2340280T3 - Anticuerpos dirigidos contra el receptor de il-21 humano y uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado que ejerce antagonismo sobre la actividad de IL-21R, comprendiendo el anticuerpo una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en 95% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 1 y 2; (b) SEQ ID NO: 3; (c) SEQ ID NO: 19 y 20; (d) SEQ ID NO: 21; (e) SEQ ID NO: 47 y 48; (f) SEQ ID NO: 4 9; (g) SEQ ID NO: 65 y 66; (h) SEQ ID NO: 67; (i) SEQ ID NO: 83 y 84; (j) SEQ ID NO: 85; (k) SEQ ID NO: 101 y 102; (l) SEQ ID NO: 103; (m) SEQ ID NO: 119 y 120; (n) SEQ ID NO: 121; (o) SEQ ID NO: 137 y 138; y (p) SEQ ID NO: 139, donde el anticuerpo se une selectivamente sobre un dominio extracelular de un receptor de IL-21 humano o de un receptor de IL-21 que es idéntico al menos en 85% a una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 45.

Description

Anticuerpos dirigidos contra el receptor de IL-21 humano y uso de los mismos.

Campo técnico

Esta invención se refiere a anticuerpos, p. ej., anticuerpos humanos, y a sus fragmentos de unión a antígenos que se unen al receptor de interleuquina-21 (IL-21), en particular, al receptor de IL-21 humana, y a su uso en la regulación de las respuestas inmunitarias mediadas por el receptor de IL-21. Los anticuerpos descritos en la presente memoria son útiles en el diagnóstico, prevención, y/o el tratamiento de trastornos inmunitarios, p. ej., trastornos autoinmunitarios.

Antecedentes de la invención

Los antígenos inician las respuestas inmunitarias y activan las dos poblaciones más grandes de linfocitos: las células T y las células B. Después de encontrar el antígeno, las células T proliferan y se diferencian en células efectoras, mientras las células B proliferan y se diferencian en células del plasma secretoras de anticuerpos. La proliferación y diferenciación de linfocitos están reguladas por proteínas extracelulares. Algunas de estas proteínas se denominan citoquinas, que son pequeñas proteínas (<30 kDa) secretadas por los linfocitos y otros tipos de células.

La interleuquina 21 (IL-21) es una citoquina descubierta recientemente, que está íntimamente relacionada con la IL-2, la IL-4 y la IL-15 (Parrish-Novak et al. (2000) Nature 408:57-63). La IL-21 humana tiene un peso molecular de aproximadamente 15 kDa, consiste en 131 aminoácidos, y comparte una identidad de aproximadamente 57% con la IL-21 de ratón. La IL-21 es producida principalmente por las células T CD4+ activadas.

El receptor de IL-21 (IL-21 R) es una proteína de unión a IL-21, transmembrana, que pertenece a la clase I de la familia de receptores de citoquinas. Tanto la IL-21 humana como la de ratón han sido descritas en el documento WO 01/85792, en la presente memoria incorporado como referencia. El tamaño pronosticado de IL-21 R es de aproximadamente 52 9 aminoácidos. El IL-21R muestra una elevada homología de secuencia con la cadena \beta del receptor de IL-2 y la cadena \alpha del receptor de IL-4 (Ozaki et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:11439-114.44). Las secuencias de aminoácidos de IL-21R humano y de ratón comparten una identidad de aproximadamente 62%. Tras la unión al ligando, el IL-21R se asocia con la cadena gamma del receptor de citoquina común (\gammac) que es compartida por los receptores de IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13 y IL-15 (Ozaki et al. (2000) supra; Asao et al. (2001) J. Immunol. 167:1-5).

El IL-21 R es expresado principalmente en tejidos linfoides, tales como células B, células T, y células asesinas naturales (NK). La amplia distribución linfoide del IL-21 R sugiere que IL-21 puede jugar un papel en la regulación inmunitaria. En efecto, los estudios in vitro han demostrado que la IL-21 modula significativamente la función de las células B, las células T CD4+ y CD8+, y las células NK (Parrish-Novak et al. (2000) supra; Kasaian, M.T. et al. (2002) Immunity. 16:559-569). También se ha demostrado que la IL-21 y el IL-21 R son importantes para modular la actividad de los macrófagos, y las células sinoviales. Por ejemplo, la IL-21 aumenta la proliferación de las células B estimuladas con anticuerpo anti-CD40, y suprime la proliferación de las células B estimuladas con anti-IgM e IL-4. La IL-21 aumenta la proliferación y la actividad citolítica de las células T de las células NK humanas. La IL-21 también media la expresión de las citoquinas, las quimioquinas, o una combinación de las mismas, secretadas por las células T, las células NK, los macrófagos, y las células sinoviales. Debido a la dependencia de las células B, las células T, las células NK, los macrófagos, y las células sinoviales de IL-21, la alteración de la unión de IL-21 a IL-21 R puede afectar a ciertas respuestas inmunitarias. Semejante manipulación proporciona un medio para tratar trastornos del sistema inmunitario, tales como trastornos por enfermedades autoinmunitarias, trastornos inflamatorios, alergias, rechazo de transplantes, cáncer, déficit inmunitario, y otros trastornos.

En el documento WO 01/77171 A1 se describen anticuerpos anti-z alfa 11 que tienen actividad no limitante (antagonistas de z alfa 11). Dichos anticuerpos se utilizan para la detección de la distribución del receptor z alfa en diferentes células.

En el documento US 200210128446 A1) se describen anticuerpos anti-z alfa 11 utilizados en los métodos para estimular la proliferación y/o desarrollo de células hematopoyéticas.

Compendio de la invención

La presente solicitud proporciona anticuerpos que ejercen antagonismo sobre la actividad de IL-21R como se define en la reivindicación 1 con una elevada afinidad y especificidad. El anticuerpo reduce, inhibe o ejerce antagonismo sobre la actividad de IL-21 R. Tales anticuerpos pueden ser utilizados para regular las respuestas inmunitarias o los trastornos asociados a las células inmunitarias ejerciendo antagonismo sobre la actividad de IL-21R. En otras realizaciones, se puede utilizar un anticuerpo anti-IL-21R como diagnóstico, o como anticuerpo diana para liberar un agente terapéutico o citotóxico en una célula que expresa IL-21 R. De este modo, los anticuerpos anti-IL-21 R de la invención son útiles en el diagnóstico y el tratamiento de patologías asociadas con las células inmunitarias (p. ej., patologías asociadas con la actividad de al menos uno de: células T (células T CD8+, CD4+), células NK, células B, macrófagos y megacariocitos, incluyendo el rechazo de transplantes y los trastornos autoinmunitarios).

Por consiguiente, en un aspecto, la invención ofrece un anticuerpo aislado que se une a IL-21R como se expone en la reivindicación 1. Un anticuerpo anti-IL-21R puede tener al menos una de las siguientes características: (1) es un anticuerpo monoclonal o con una única especificidad; (2) es un anticuerpo humano o generado in vitro; (3) se une a IL-21 R, en particular, al dominio extracelular de IL-21R humano, con una constante de afinidad (K_{a}) de al menos 10^{6} M^{-1}; y (4) inhibe la unión de IL-21 a IL-21R con una CI_{50} de 10 nM o menos como IgG, por ejemplo, medida mediante un análisis basado en células descrito en el Ejemplo 9, o inhibe la unión de un anticuerpo a IL-21 R con una CI_{50} de 10 nM o menos, por ejemplo, medida por medio de un análisis de unión al epítopo descrito en el Ejemplo 11.

Las realizaciones ilustrativas no limitantes de los anticuerpos de la invención son referidas en la presente memoria como "MUF", "línea germinal MUF","MU11", "18G4", "18A5", "19F5", "CP5G2" y "R18". Los anticuerpos de la invención se unen específicamente al dominio extracelular de un IL-21 R, p. ej., aproximadamente del aminoácido 20 al 235 del SEQ ID NO:43 (IL-21 R humano), o una secuencia que es idéntica al menos en un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a ésta. Los anticuerpos se unen específicamente a un fragmento de un IL-21 R, p. ej., un fragmento de al menos 10, 20, 50, 75, 100, 150, o 200 aminoácidos contiguos a la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 43, o una secuencia que es idéntica al menos en un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a ésta. El anticuerpo se une al dominio extracelular de un IL-21 R e inhibe competitivamente la unión de "MUF", la "línea germinal MUF", "MU11", "18G4", "18A5", "19F5", "CP5G2" o "R18" a su epítopo diana. En otras realizaciones más, un anticuerpo se une al dominio extracelular de un IL-21 R e inhibe competitivamente la unión de IL-21 a IL-21 R. Semejante inhibición de la unión de IL-21 a su receptor por un anticuerpo de la invención se puede medir mediante uno o más análisis proporcionados en la presente memoria.

En una realización, un anticuerpo de la presente invención incluye un dominio V_{H}, y un dominio V_{L}, o el fragmento scF_{v} de "MUF", "línea germinal MUF", "MU11", "18G4", "18A5", "19F5", "CP5G2" o "R18". Por ejemplo, un anticuerpo incluye un dominio V_{H} y/o un dominio V_{L} que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en las Tablas 1A y 1B (SEQ ID NO: 1, 19,47, 65, 83, 101, 119 o 137 para V_{H} y SEQ ID NO: 2, 20, 48, 66, 84, 102, 120 o 138 para V_{L}), o una secuencia esencialmente idéntica a ésta (p. ej., una secuencia idéntica al menos aproximadamente en un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a ésta, o que difiere en no más de 1, 2, 5, 10 o 15 restos aminoácido del SEQ ID NO: 1, 2, 19, 20, 47, 48, 65, 66, 83, 84, 101, 102, 119, 120, 137 o 138). En otra realización, el anticuerpo incluye un dominio V_{H} y V_{L} codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos mostrada en las Tablas 1A y 1 B (SEQ ID NO: 10, 28, 56, 74, 92, 110, 128, o 146 para V_{H} y SEQ ID NO: 11, 29, 57, 75, 93, 111, 129, o 147 para V_{L}), o una secuencia esencialmente idéntica a ésta (p. ej., una secuencia idéntica al menos aproximadamente en un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a ésta, o que difiere en no más de 3, 6, 15, 30 o 45 nucleótidos del SEQ ID NO: 10, 11, 28, 29, 56, 57, 74, 75, 92, 93, 110, 111, 128, 129, 146 o 147). Típicamente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento scFv están unidos por una secuencia conectora.

En otras realizaciones, el anticuerpo incluye un dominio scFv que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en las Tablas 1A y 1B (SEQ ID NO: 3, 21, 49, 67, 85, 103, 121, o 139) o una secuencia esencialmente idéntica a ésta (p. ej., una secuencia idéntica al menos aproximadamente en un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a ésta, o que difiere en no más de 1, 2, 5, 10, 15, 20, 30 o 35 restos aminoácido del SEQ ID NO: 3, 21, 49, 67, 85, 103, 121, o 139). En otra realización, el anticuerpo incluye un dominio scFv codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos mostrada en las Tablas 1A y 1B (SEQ ID NO: 12, 30, 58, 76, 94, 112, 130, o 148), o una secuencia esencialmente idéntica a ésta (p. ej., una secuencia idéntica al menos aproximadamente en un 95%, 96%. 97%, 98%, 99% o más a ésta, o que difiere en no más de 3, 6, 15, 30, 45, 60, 90 o 105 nucleótidos del SEQ ID NO: 12, 30, 58, 76, 94, 112, 130, o 148). También se describe un anticuerpo que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de estos dominios V_{H} y V_{L}. Por ejemplo, el anticuerpo puede incluir una, dos, o tres CDR del dominio V_{H} (esto es, H1, H2, y H3) que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en las Tablas 1A y 1B (SEQ ID NO: 4, 5, 6, 22, 23, 24, 50, 51, 52, 68, 69, 70, 86, 87, 88, 104, 105, 106, 122, 123, 124, 140, 141, o 142), o una secuencia esencialmente homóloga a ésta (p. ej., una secuencia idéntica en al menos aproximadamente un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a ésta). También se describe, una secuencia que es esencialmente homóloga a las secuencias de aminoácidos de H1, H2, o H3 mostradas en el SEQ ID NO: 4, 5, 6, 22, 23, 24, 50, 51, 52, 68, 69, 70, 86, 87, 88, 104, 105, 106, 122, 123, 124, 140, 141, o 142 que incluye una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, una o más sustituciones conservativas de aminoácidos. El anticuerpo puede incluir una, dos, o tres CDR del dominio V_{L} (esto es, L1, L2 y L3) que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en las Tablas 1A y 1B (SEQ ID NO: 7, 8, 9, 25, 26, 27, 53, 54, 55, 71, 72, 73, 89, 90, 91, 107, 108, 109, 125, 126, 127, 143, 144, o 145), o una secuencia esencialmente idéntica a esta (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente idéntica a ésta en un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más). También se describe una secuencia que es esencialmente homóloga a las secuencias de aminoácidos de L1, L2, o L3 mostradas en el SEQ ID NO: 7, 8, 9, 25, 26, 27, 53, 54, 55, 71, 72, 73, 89, 90, 91, 107, 108, 109, 125, 126, 127, 143, 144 o 145 que incluye una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, una o más sustituciones conservativas de aminoácidos.

También se describe un anticuerpo que comprende una CDR del dominio V_{H} de MUF, MU11, línea germinal MUF, 18G4, 18A5, 19F5, CP5G2, o R18, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las Tablas 1A y 1B (SEQ ID NO: 6, 24, 52, 70, 88, 106, 124, o 142), o una secuencia esencialmente idéntica a ésta (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente idéntica a esta en un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más), que incluye una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, una o más sustituciones conservativas de aminoácidos. El anticuerpo puede comprender una región variable de la cadena pesada que incluye una única CDR, tal como H3, o cualquier combinación de H1, H2 y H3. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una CDR (H3) combinada con una CDR2 (H2). Un anticuerpo puede incluir una CDR3 (H3) combinada con una CDR1 (H1), o una combinación de CDR H1 y H2. No obstante, preferiblemente, un anticuerpo incluye una región variable de la cadena pesada que comprende una CDR3 (H3), mostrada en cualquiera de los SEQ ID NO: 6, 24, 52, 70, 88, 106, 124, 142, y sus sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, una o más sustituciones conservativas de aminoácidos, ya sea sola o combinada con una o ambas H1 y H2.

De un modo similar, también se describe un anticuerpo que comprende una CDR del dominio V_{L} de MUF, MU11, línea germinal MUF, 18G4, 18A5, 19F5, CP5G2, o R18, p. ej., una CDR L3 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las Tablas 1A y 18 (SEQ. ID NO: 9, 27, 55, 73, 91, 109, 127, o 145), o una secuencia esencialmente idéntica a ésta (p. ej., una secuencia idéntica al menos aproximadamente en un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a ésta), que incluye una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, una o más sustituciones conservativas de aminoácidos. Un anticuerpo puede comprender una región variable de la cadena ligera incluyendo una única CDR, tal como L3, o cualquier combinación de L1, L2 y L3. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una L3 combinada con una L2. Un anticuerpo puede incluir una L3 combinada con una L1. Incluso, un anticuerpo puede incluir una combinación de CDR L1 y L2. Sin embargo, preferiblemente, un anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende una L3, como se muestra en cualquiera de los SEQ ID NO: 9, 27, 55, 73, 91, 109, 127, 145 y sus sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, una o más de sus sustituciones conservativas de aminoácidos, ya sea solas o combinadas con una o ambas de L1 y L2.

Un anticuerpo compite por la unión a IL-21 R con un anticuerpo que incluye un dominio V_{H} que es idéntico al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más de un 99% a una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1, 19, 47, 65, 83, 101, 119 o 137, y un dominio V_{L} que es idéntico al menos en un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más de un 99% a una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2, 20, 48, 66, 84, 102, 120 o 138. Un anticuerpo compite por la unión a IL-21 R con un anticuerpo que incluye una región variable de una cadena pesada que comprende al menos una CDR de la cadena pesada seleccionada entre los SEQ ID NO: 6, 24, 52, 70, 88, 106, 124, 142 y sus sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, una o más de sus sustituciones conservativas de aminoácidos. Un anticuerpo compite por la unión a IL-21 R, la unión a IL-21 R humano, con un anticuerpo que incluye una región variable de la cadena ligera que comprende al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada entre los SEQ ID NO: 9, 27, 55, 73, 91, 109, 127, 145 y sus sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, una o más de sus sustituciones conservativas de aminoácidos. Un anticuerpo con el cual compite un anticuerpo de la invención por la unión a IL-21 R, por ejemplo, IL-21 R humano, puede incluir tanto una CDR de la cadena pesada seleccionada entre los SEQ ID NO: 6, 24, 52, 70, 88, 106, 124, y 142, como una CDR de la cadena ligera seleccionada entre los SEQ ID NO: 9, 27, 55, 73, 91, 109, 127, y 145. Un anticuerpo incluye más de una CDR de la cadena pesada seleccionada entre los SEQ ID NO: 4, 5, 6 para MUF; SEQ ID NO: 22, 23, 24 para MU11; SEQ ID NO: 50, 51, 52 para 18G4; SEQ ID NO:68, 69, 70 para 18A5; SEQ ID NO: 86, 87, 88 para la línea germinal MUF; SEQ ID NO: 104, 105, 106 para 19F5; SEQ ID NO: 122, 123, 124 para CP5G2; y SEQ ID NO: 140, 141, 142 para R18, y/o una o más CDR de la región variable de la cadena ligera seleccionada entre los SEQ ID NO: 7, 8, 9 para MUF; SEQ ID NO: 25, 26, 27 para MU11; SEQ ID NO: 53, 54, 55 para 18G4; SEQ ID NO: 71, 72, 73 para 18A5; SEQ ID NO: 89, 90, 91 para la línea germinal MUF; SEQ ID NO: 107,
108, 109 para 19F5; SEQ ID NO: 125, 126, 127 para CP5G2; y SEQ ID NO: 143, 144, 145 para R18.

En otras realizaciones, un anticuerpo de acuerdo con la invención compite con IL-21, por ejemplo, IL-21 humana, por la unión a IL-21R, por ejemplo, IL-21 R humano.

Un anticuerpo de la invención puede ser completo (p. ej., incluir al menos una cadena pesada completa y al menos una cadena ligera completa) o puede incluir solamente un fragmento de unión al antígeno (p. ej., un fragmento Fab, F(ab')_{2}, Fv o FV de cadena sencilla (scFv)). Un anticuerpo puede incluir una región constante, o una de sus porciones, seleccionadas entre cualquiera de: los genes de la región constante de kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu. Por ejemplo, se pueden utilizar las regiones constantes de la cadena pesada de los diferentes isotipos, incluyendo: IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}, IgM, IgA_{1}, IgA_{2}, IgD, e IgE. La región constante de la cadena ligera se puede seleccionar entre kappa o lambda. Un anticuerpo puede ser una IgG, o también puede ser una IgG_{1\kappa} o IgG_{1\lambda}.

Un anticuerpo anti-IL-21 R descrito en la presente memoria puede ser derivatizado o conectado a otra molécula funcional (tal como otro péptido o proteína (p. ej., un fragmento Fab)). Por ejemplo, un anticuerpo de la invención se puede conectar funcionalmente (p. ej., mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a al menos otra entidad molecular, tal como otro anticuerpo (p. ej., un anticuerpo biespecífico o multiespecífico), toxina, radioisótopo, agente citotóxico o citostático, entre otros.

En otro aspecto, la invención ofrece una composición farmacéutica que contiene al menos un anticuerpo anti-IL-21 R y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede incluir adicionalmente una combinación de al menos un anticuerpo anti-IL-21R y al menos un agente terapéutico (p. ej., citoquina e inhibidores del factor de crecimiento, inmunosupresores, agentes anti-inflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores de enzimas, agentes citotóxicos, agentes citostáticos, o sus combinaciones, como se describe con más detalle en la presente memoria). Las combinaciones del anticuerpo anti-IL-21 R y un agente terapéutico también están dentro del alcance de la invención. Las composiciones y combinaciones de la invención se pueden utilizar para regular las células inmunitarias dependientes de IL-21, tales como las células B, las células T, las células NK, los macrófagos, y las células sinoviales.

En otro aspecto, la invención ofrece un anticuerpo de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad asociada con las células inmunitarias como se define en la reivindicación 21. El uso incluye administrar al sujeto un anticuerpo anti-IL-21 R en una cantidad suficiente para inhibir al menos una actividad de IL-21 R de las células inmunitarias, tratando de ese modo la enfermedad asociada a las células inmunitarias.

El anticuerpo anti-IL-21 R se puede administrar a un sujeto, solo o combinado, con otros agentes terapéuticos como se describe en la presente memoria. El sujeto puede ser un mamífero que padece una patología asociada con células inmunitarias (p. ej., una patología asociada con la actividad aberrante de al menos una de: las células T, las células NK, las células B, los macrófagos y los megacariocitos). El sujeto puede ser un ser humano. Por ejemplo, el anticuerpo se puede utilizar para tratar a un sujeto con un trastorno asociado a células inmunitarias tal como el rechazo de transplantes y las enfermedades autoinmunitarias. Las enfermedades autoinmunitarias pueden incluir diabetes melitus (tipo I), artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, y espondilitis anquilosante), esclerosis múltiple, miastenia grave, vasculitis, lupus eritematoso generalizado, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), psoriasis, esclerodermia, asma, alergia, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), y enfermedad de Crohn. El tratamiento de un trastorno artrítico (p. ej., un trastorno seleccionado entre al menos uno de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, y espondilitis anquilosante) utilizando los anticuerpos anti-IL-21 R de la presente invención es una realización de la invención.

Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para detectar la presencia de IL-21R en una muestra, in vitro. Las muestras pueden incluir muestras biológicas tales como suero, plasma, tejido y biopsia. Los anticuerpos se pueden utilizar para diagnosticar un trastorno, tal como un trastorno asociado a células inmunitarias como se describe en la presente memoria (1) poniendo en contacto la muestra o una muestra de control con un anticuerpo anti-IL-21 R, y (2) detectando la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-IL-21 R y la muestra o la muestra de control, donde un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en la muestra con respecto a la muestra de control, es indicativo de la presencia de IL-21 R en la muestra.

Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para detectar la presencia de IL-21R in vivo (p. ej., la formación de imágenes in vivo en un sujeto) para diagnosticar un trastorno, p. ej., un trastorno asociado a células inmunitarias como se describe en la presente memoria (1) administrando un anticuerpo anti-IL-21R a un sujeto o a un sujeto de control en condiciones que permitan la unión del anticuerpo a IL-21 R, y (2) detectando la formación de un complejo entre el anticuerpo e IL-21 R, donde un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en el sujeto con respecto a un control, p. ej., un sujeto de control, es indicativo de la presencia de IL-21R.

Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede estar marcado directamente o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen diferentes enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminescentes y materiales radiactivos.

Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para liberar o dirigir un agente, p. ej., un agente terapéutico o citotóxico, a una célula que expresa IL-21 R in vivo administrando un anticuerpo anti-IL-21 R a un sujeto en condiciones que permitan la unión del anticuerpo a IL-21 R. El anticuerpo se puede acoplar a un segundo radical terapéutico, tal como una toxina.

La descripción proporciona secuencia de ácido nucleico de los dominios V_{H} y V_{L} de MUF, línea germinal MUF, MU11, 18G4, 18A5, 19F5, CP5G2 y R18. Asimismo se proporcionan secuencias de ácido nucleico que comprenden al menos una CDR de MUF, línea germinal MUF, MU11, 18G4, 18A5, 19F5, CP5G2 y R18. La descripción también proporciona vectores y células anfitrionas que comprenden tales ácidos nucleicos.

La descripción proporciona adicionalmente métodos de producción de nuevos dominios V_{H} y V_{L} y anticuerpos funcionales que comprenden todos o una porción de tales dominios derivados de los dominios V_{H} o V_{L} de MUF, línea germinal MUF, MU11, 18G4, 18A5, 19F5, CP5G2 o R18.

Los aspectos adicionales de la descripción se expondrán en parte en la explicación, y en parte serán obvios a partir de la explicación, o se pueden aprender poniendo en práctica la invención. La invención se expone y concretamente se muestra en las reivindicaciones, y la explicación no se debe considerar limitante del alcance de las reivindicaciones. La siguiente explicación detallada incluye representaciones ilustrativas de diferentes realizaciones de la invención, que no son restrictivas de la invención reivindicada. Las figuras adjuntas constituyen una parte de esta memoria y, junto con la descripción, sirven solamente para ilustrar las realizaciones y no limitan la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A describe el resultado de un ELISA que muestra que MU11 se une específicamente a IL-21 R humano.

La Figura 1B describe el resultado de un análisis de unión analizado mediante FACS que muestra que tanto MUF como MU11 se unen sobre la superficie del IL-21 R humano.

La Figura 1C describe el resultado de un análisis de unión analizado mediante FACS que muestra que MUF se une a IL-21 R sobre células B de ratón.

La Figura 2 describe el resultado de un ELISA que muestra que MUF inhibe la unión de IL-21 humana a IL-21 R humano.

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La Figura 3A describe el resultado de un análisis de proliferación celular que muestra que la adición de MUF bloqueaba la capacidad de IL-21 para incrementar la proliferación de células T CD4+ humanas.

La Figura 3B describe el resultado de un análisis de proliferación celular que muestra que MU11 bloqueaba la capacidad de IL-21 en medios de cultivo de células COS para incrementar la proliferación de células T CD4+ de ratón.

La Figura 3C describe el resultado de un análisis de proliferación celular que muestra que MU11 bloqueaba la capacidad de IL-21 en medios de cultivo de células COS para incrementar la proliferación de células T CD8+ de ratón, de una manera dependiente de la dosis.

La Figura 4 describe el resultado de un análisis de proliferación celular que muestra que tanto MUF scFv como MUF IgG bloqueaban la capacidad de IL-21 para incrementar la proliferación de células Baf3Mu-1 que expresan un IL-21 R.

La Figura 5A describe que la adición de IL-21 a sinoviocitos de tipo fibroblasto humanos aislados de pacientes con artritis conduce a un aumento de la secreción de las quimioquinas MCP-1 y GRO.

La Figura 5B describe que la adición de IL-21 a sinoviocitos de tipo fibroblasto humanos aislados de pacientes con artritis conduce a un incremento en la secreción de las quimioquinas 1-309, TARC, Eotaxina, MDC, Linf, SDFIB, IP-10, I-TAC, MG y MP3B.

Las Figuras 5C y 5D describen que la adición de IL-21 a sinoviocitos de tipo fibroblasto humanos aislados de pacientes con artritis conduce a un incremento en la secreción de las citoquinas IFN-alfa y TNF-alfa (Fig. 5C) e IL-6 e IL8 (Fig. 5D).

La Figura 5E muestra que IL-21 exacerba la artritis inducida por colágeno (AIC) en un modelo de ratón para artritis, medida por los indicios de AIC.

La Figura 6 muestra que IL-21 aumenta la proliferación de células C57BU6J en una reacción de linfocitos mixtos, en un modelo in vitro para el rechazo de transplantes.

Descripción detallada Definiciones

Con el fin de comprender más fácilmente la presente invención, se definen primero ciertos términos. Las definiciones adicionales se exponen a lo largo de toda la descripción detallada.

"Anticuerpo" hace referencia a una inmunoglobulina o uno de sus fragmentos, y abarca cualquier polipéptido que comprende un sitio de unión a un antígeno. El término no está limitado a anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespecíficos, poliespecíficos, no específicos, humanizados, humanos, de cadena sencilla, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, injertados, y generados in vitro. A menos que esté precedido por la palabra "intacto", el término "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpo tales como Fab, F(ab')_{2}, Fv, scFv, Fd, dAb, y otros fragmentos de anticuerpo que conservan la función de unión al antígeno. Típicamente, tales fragmentos comprenderían un dominio de unión a un antígeno.

Los términos "dominio de unión a un antígeno" y "fragmento de unión a un antígeno" hacen referencia a una parte de una molécula de anticuerpo que comprende los aminoácidos responsables de la unión específica entre el anticuerpo y el antígeno. La porción del antígeno que es específicamente reconocida y unida por el anticuerpo es referida como "epítopo". Un dominio de unión a un antígeno puede comprender una región variable de la cadena ligera del anticuerpo (V_{L}) y una región variable de la cadena pesada del anticuerpo (V_{H}); sin embargo, no tiene que comprender ambas. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones V_{H} y a menudo conservan una cierta función de unión al antígeno del dominio de unión al antígeno intacto. Los ejemplos de los fragmentos de unión a un antígeno de un anticuerpo incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V_{L}, V_{H}, C_{L} y C_{H}1; (2) un fragmento F(ab')_{2}, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (3) un fragmento Fd que consiste en los dos dominios V_{H} y C_{H}1; (4) un fragmento Fv que consiste en los dominios V_{L }y V_{H} de un brazo sencillo de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio V_{H}; y (6) una región determinante de la complementariedad aislada (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V_{L} y V_{H}, están codificados por genes separados, estos se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, por medio de un conector sintético que les permite ser formados como una única cadena de proteína en la que las regiones V_{L} y V_{H} se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véanse p. ej., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se escrutan en busca de su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

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El término "cantidad eficaz" hace referencia a una dosificación o una cantidad que es suficiente para regular la actividad de IL-21 R para aliviar los síntomas clínicos o lograr un resultado biológico deseado, p. ej., disminución de la actividad de las células T y/o las células B, supresión de la autoinmunidad, supresión del rechazo de transplantes, etc.

El término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes correspondientes esencialmente a secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana como describen Kabat et al. (Véase Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas al azar o mutagénesis específica del sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR, y en particular, CDR3. El anticuerpo humano puede tener al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, o más posiciones remplazadas por un resto aminoácido que no codificado por la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana.

El término "actividad IL-21R" hace referencia a al menos un proceso celular iniciado o interrumpido como resultado de la unión de IL-21 a IL-21 R sobre la célula. Las actividades de IL-21 R incluyen al menos una de, pero no están limitadas a: (1) unión a IL-21 (p. ej., IL-21 humana); (2) asociación con moléculas transductoras de señales (p. ej., \gammac y/o JAK-1); (3) estimulación de la fosforilación de las proteínas STAT (p. ej., STAT5, STAT3, o una de sus combinaciones); (4) activación de proteínas STAT; y (5) modulación (p. ej., aumento o disminución) de la proliferación, diferenciación, función de células efectoras, actividad citolítica, secreción de citoquinas, supervivencia, o sus combinaciones, de las células inmunitarias. Las células inmunitarias pueden incluir células T CD8+ y CD4+, células NK, células B, macrófagos, y megacariocitos. La actividad de IL-21 R se puede determinar in vitro, por ejemplo, utilizando análisis de proliferación de células T como los descritos en los Ejemplos 8 y 9. La actividad de IL-21R también se puede determinar in vivo, por ejemplo, puntuando el progreso de una respuesta inmunitaria o un trastorno como se describe en el Ejemplo 12.

La frase "inhibir" o "ejercer antagonismo" sobre la actividad de IL-21R o sus cognados hace referencia a una reducción, inhibición, o disminución de otro modo de al menos una actividad de IL-21 R debido a la unión a un anticuerpo anti-IL-21 R, donde la reducción es con respecto a la actividad de IL-21 R en ausencia del mismo anticuerpo. La actividad se puede medir como se describe en los Ejemplos 7, 8, 9 y 11. La inhibición o antagonismo no indican necesariamente una eliminación total de la actividad biológica del polipéptido IL-21 R. La reducción de la actividad puede ser de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más.

El término "receptor de interleuquina 1" o "IL-21R" hace referencia a una clase de receptor de citoquina I, también conocido como NILR (documento WO 01/85792; Parrish-Novak et al. (2000) Nature 408:57-63; Ozaki et al. (2000) Proc. Natl. Acad Sci. USA 97:11439-114444). Tras la unión al ligando, IL-21 R interacciona con una cadena receptora de citoquina \gamma común (\gammac) (Asao et al. (2001) J. Immunol. 167:1-5), e induce la fosforilación de STAT1 y STAT3 (Asao et al. (2001) supra o STAT5 (Ozaki et al. (2000) supra). El IL-21 R muestra una amplia distribución en el tejido linfoide. El término "IL-21R" hace referencia a un receptor (que puede ser de mamífero) que es capaz de unirse a IL-21, y tiene al menos una de las siguientes características: (1) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido IL-21 R de mamífero de origen natural o uno de sus fragmentos, p. ej., una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 43 (humana) o SEQ ID NO: 45 (murina) o uno de sus fragmentos; (2) una secuencia de aminoácidos esencialmente idéntica, p. ej., idéntica al menos en un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, a una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 43 (humana) o SEQ ID NO: 45 (murina) o uno de sus fragmentos; (3) una secuencia de aminoácidos que es codificada por una secuencia de nucleótidos de IL-21 R de mamífero de origen natural o uno de sus fragmentos (p. ej., SEQ ID NO: 44 (humana) o SEQ ID NO: 4 6 (murina) o uno de sus fragmentos); (4) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es esencialmente idéntica, p. ej., idéntica al menos en un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, a una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO: 44 (humana) o SEQ ID NO: 46 (murina) o uno de sus fragmentos; (5) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos degenerada con respecto a una secuencia de nucleótidos de IL-21 R de origen natural o uno de sus fragmentos, p. ej., SEQ ID NO: 44 (humana) o SEQ ID NO: 46 (murina) o uno de sus fragmentos; o (6) una secuencia de nucleótidos que hibrida con una de las secuencias de nucleótidos anteriores en condiciones restrictivas, p. ej., condiciones muy restrictivas. El IL-21R se puede unir a la IL-21 de origen mamífero, p. ej., humana o de ratón (Parrish-Novak et al. (2000) supra).

Según se utiliza en la presente memoria, "anticuerpo generado in vitro " hace referencia a un anticuerpo en el que toda o parte de la región variable (p. ej., al menos una CDR) es generada en una selección de células no inmunitarias (p. ej., una presentación en fagos in vitro, un chip de proteína o cualquier método en el cual se puedan someter a ensayo secuencias candidato en cuanto a su capacidad para unirse a un antígeno). Este término excluye secuencias generadas mediante transposición genómica en una célula inmunitaria.

El término "aislado" hace referencia a una molécula que está esencialmente libre de de su entorno natural. Por ejemplo, una proteína aislada está esencialmente libre de material celular u otras proteínas de la célula o tejido de origen de la cual derivaba. El término también hace referencia a preparaciones en las que la proteína aislada es suficientemente pura para las composiciones farmacéuticas; o pura al menos en un 70-80% (p/p); o pura al menos en un 80-90% (p/p); o pura al menos en un 90-95%; o pura al menos en un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o pura en un 100% (p/p).

La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos pronosticada del IL-21R humano se muestran en el SEQ ID NO: 44 y el SEQ ID NO: 43, respectivamente. El análisis de la secuencia de aminoácidos de IL-21R humano (SEQ ID NO: 43) reveló las siguientes características estructurales: una secuencia líder (aproximadamente aminoácidos 1-19 del SEQ ID NO: 43); un motivo WSXWS (aproximadamente aminoácidos 213-217 del SEQ ID NO: 43); un dominio transmembrana (aproximadamente aminoácidos 236-252 del SEQ ID NO:43); un dominio extracelular (aproximadamente aminoácidos 1-235 del SEQ ID NO: 43 y aproximadamente 20-235 de la secuencia de IL-21R madura); y un dominio intracelular desde aproximadamente los aminoácidos 253-538 del SEQ ID NO: 43. Se cree que el IL-21R humano maduro tiene la secuencia de aminoácidos 20-538 del SEQ ID NO: 43.

El término "repertorio" hace referencia a una colección genéticamente diversa de secuencias de nucleótidos derivadas total o parcialmente de secuencias que codifican inmunoglobulinas. Las secuencias pueden ser generadas mediante transposición in vivo de los segmentos V, D, y J de las cadenas pesadas, y los segmentos V y J de las cadenas ligeras. Alternativamente, las secuencias se pueden generar a partir de una célula en respuesta a la cual se produce la transposición, p. ej., estimulación in vitro. Alternativamente, parte o todas las secuencias se pueden obtener mediante empalme de ADN, síntesis de nucleótidos, mutagénesis, y otros métodos, véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.565.332.

Los términos "unión específica", "unión selectiva" y "se une selectivamente" hacen referencia a dos moléculas que forman un complejo que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión selectiva se caracteriza por una elevada afinidad y una capacidad baja a moderada que se distingue de la unión no específica que tiene normalmente una baja afinidad con una capacidad moderada a elevada. Típicamente, la unión se considera específica o selectiva cuando la constante de afinidad K_{a} es mayor de 10^{6}\cdotM^{-1}. Si es necesario, se puede reducir la unión no específica sin afectar esencialmente la unión selectiva variando las condiciones de unión. Las condiciones de unión apropiadas, tales como la concentración de anticuerpos, la fuerza iónica de la solución, la temperatura, el tiempo permitido para la unión, la concentración de agente de bloqueo (p. ej., albúmina de suero, caseína de la leche), etc., pueden ser optimizados por un experto en la técnica utilizando técnicas rutinarias. Las condiciones ilustrativas se exponen en los Ejemplos 1-11, pero otras condiciones conocidas por el experto en la técnica están dentro del alcance de esta invención.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "restrictivo" describe las condiciones de la hibridación y el lavado. Las condiciones restrictivas son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Los métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y se puede utilizar cualquiera. Un ejemplo de condiciones de hibridación restrictivas es la hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguida de al menos un lavado en 0,2X SSC, SDS al 0,1%, a 50ºC. Un segundo ejemplo de condiciones de hibridación restrictivas es la hibridación en 6X SSC a aproximadamente 45ºC, seguido de al menos un lavado en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 55ºC. Otro ejemplo de condiciones de hibridación restrictivas es la hibridación en 6X SSC a aproximadamente 45ºC, seguida de al menos un lavado en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 60ºC. Un ejemplo adicional de condiciones de hibridación restrictivas es la hibridación en 6X SSC a aproximadamente 45ºC, seguida de al menos un lavado en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC. Las condiciones muy restrictivas incluyen hibridación en fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7% a 65ºC, seguida de al menos un lavado a 0,2X SSC, SDS al 1% a 65ºC.

La frase "como se expone esencialmente", "esencialmente idéntico" o "esencialmente homólogo" significa que la secuencia de aminoácidos o nucleótidos relevante, (p. ej., CDR, dominio V_{H}, o V_{L}) será idéntica o tendrá diferencias insustanciales (por medio de sustituciones de aminoácidos conservadas) en comparación con las secuencias que se exponen. Las diferencias insustanciales incluyen cambios de aminoácidos minoritarios, tales como 1 o 2 sustituciones en una secuencia de 5 aminoácidos de una región especificada. En el caso de los anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene al menos una afinidad del 50% con la misma.

Las secuencias esencialmente idénticas u homólogas (p. ej., una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85%) con las secuencias descritas en la presente memoria también son parte de esta solicitud. La identidad de secuencia puede ser de aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o superior. Alternativamente, existe una identidad u homología esenciales cuando los segmentos de ácido nucleico hibridan en condiciones de hibridación selectivas (p. ej., condiciones de hibridación altamente restrictivas), con el complemento de la hebra. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un producto lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o esencialmente pura.

El porcentaje de identidad puede ser determinado mediante algoritmos de alineamiento convencionales, por ejemplo, la Herramienta de Alineamiento Local Básica (BLAST) descrita por Altshul et al. ((1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410); el algoritmo de Needleman et al. ((1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453); o el algoritmo de Meyers et al. ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17). Un grupo de parámetros puede ser la matriz de puntuación Blosum 62 con una penalización del espacio de 12, una penalización de la extensión del espacio de 4, y una penalización del espacio del desplazamiento del marco de 5. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ((1989) CABIOS, 4: 11-17) que ha sido incorporado el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de restos de peso PAM120, una penalización de la longitud del espacio de 12 y una penalización del espacio de 4.

El término "agente terapéutico" es una sustancia que trata o ayuda al tratamiento de un trastorno médico. Según se utiliza en la presente memoria, un agente terapéutico hace referencia a una sustancia que, cuando se administra a un sujeto con el anticuerpo anti-IL-21R, proporciona una tratamiento mejor en comparación con la administración del agente terapéutico o el anticuerpo anti-IL-21R solos. Estos agentes terapéuticos pueden incluir, pero no están limitados a, sustancias que modulan las células inmunitarias o las respuestas inmunitarias de una manera que complementa la actividad IL-21R de los anticuerpos anti-IL-21R. Los ejemplos no limitantes y los usos de los agentes terapéuticos se describen en la presente memoria.

Según se utiliza en la presente memoria, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo anti-IL-21R hace referencia a una cantidad de un anticuerpo que es eficaz, tras la administración de una dosis sencilla o múltiple a un sujeto (tal como un paciente humano) en tratamiento, prevención, curación, retraso, reducción de la gravedad de, alivio de al menos un síntoma de un trastorno o un trastorno recurrente, o prolongación de la supervivencia del sujeto más allá de lo esperado en ausencia de semejante tratamiento.

El término "tratamiento" hace referencia a una medida terapéutica o preventiva. El tratamiento se puede administrar a un sujeto que tiene un trastorno médico o que puede adquirir a la larga el trastorno, con el fin de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad de, o aliviar uno o más síntomas de un trastorno o trastorno recurrente, o con el fin de prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de los esperado en ausencia de semejante tratamiento.

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Anticuerpos Anti-IL-21R

La descripción proporciona anticuerpos anti-IL-21R novedosos que comprenden fragmentos de unión al antígeno novedosos.

En general, se pueden elaborar anticuerpos, por ejemplo, utilizando técnicas de hibridoma tradicionales (Kohler y Milstein (1975) Nature, 256: 495-499), métodos de ADN recombinante (Patente de los Estados Unidos 4.816.567), o presentación en fagos utilizando genotecas de anticuerpos (Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597). Para las técnicas de producción de anticuerpos adicionales, véase Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. La presente invención no está limitada a ninguna fuente concreta, método de producción, u otras características especiales de un anticuerpo.

Los anticuerpos intactos son las inmunoglobulinas (Ig), y éstas son típicamente proteínas glicosiladas tetraméricas compuestas por dos cadenas ligeras (-25 kDa cada una) y dos cadenas pesadas (-50 kDa cada una). Las cadenas ligeras se clasifican en dos isotipos (\lambda y k), y las cadenas pesadas se clasifican en cinco isotipos (A, D, E, G, y M). Algunos isotipos de cadenas pesadas se dividen adicionalmente en subclases de isotipo, p. ej., IgGi, IgG_{2}, IgG_{3}, y IgG_{4}.

El dominio y las estructuras tridimensionales de los diferentes anticuerpos son conocidos en la técnica (Harlow et al., supra). En resumen, la cadena ligera está compuesta por un dominio constante (CL) y un dominio variable N-terminal (V_{L}). La cadena pesada está compuesta por tres o cuatro dominios constantes (C_{H}), una región bisagra, y un dominio variable N-terminal (V_{H}). El C_{H} adyacente al dominio V_{H} se denomina C_{H}1. Los dominios V_{H} y V_{L} contienen cuatro regiones de secuencia conservada denominadas regiones marco (FR) (FR1, FR2, FR3, y FR4), que forman un armazón para tres regiones de secuencia hipervariable denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Las CDR (CDR1, CDR2, y CDR3) contienen la mayor parte de los aminoácidos del anticuerpo que se unen específicamente al antígeno. Las CDR de la cadena pesada se indican como H1, H2, y H3, mientras las CDR de la cadena ligera se indican como L1, L2, y L3.

El fragmento Fab (de Fragment antigen-binding en inglés, fragmento de unión al antígeno) consiste en los dominios V_{H}-C_{H}1 y V_{L}-C_{L} conectados covalentemente por un enlace disulfuro entre las regiones constantes. El fragmento F_{v} es más pequeño y consiste en los dominios V_{H} y V_{L} conectados no covalentemente. Para superar la tendencia de dominios no covalentes a disociarse, se puede construir un fragmento Fv de cadena sencilla (scF_{v}). El scF_{v} contiene un polipéptido flexible que conecta (1) el extremo C de V_{H} al extremo N de V_{L}, o (2) el extremo C de V_{L} al extremo N de V_{H}. Se puede utilizar un péptido (Gly_{4}Ser)_{3} de 15 unidades como conector, pero se conocen otros conectores en la técnica.

La diversidad de anticuerpos se crea mediante el uso de múltiples genes de la línea germinal que codifican regiones variables y una variedad de eventos somáticos. Los eventos somáticos incluyen la recombinación de segmentos de genes variables y segmentos de genes de diversidad (D) y unión (J) para elaborar una región V_{H }completa y la recombinación de segmentos de genes variables y de unión para elaborar una región V_{L} completa. La CDR3 (H3) es la mayor fuente de diversidad molecular de una secuencia de anticuerpo. H3, por ejemplo, puede ser tan corta como dos restos aminoácido o mayor de 26. El fragmento de unión al antígeno más pequeño es Fv, que consiste en los dominios V_{H} y V_{L}.

No es probable que los anticuerpos y las composiciones que tienen una secuencia de CDR idéntica o similar a las descritas en la presente memoria hayan sido generados independientemente. La secuencia de los genes del anticuerpo después del ensamblaje y la mutación somática varía enormemente, y se estima que estos genes variados codifican 10^{10} moléculas de anticuerpo diferentes (Immunoglobulin Genes, 2ª ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995).

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La presente descripción proporciona CDR novedosas derivadas de genotecas de genes de inmunoglobulina humana. La estructura para portar una CDR es generalmente una cadena pesada o ligera de un anticuerpo o una de sus porciones, donde la CDR está localizada en la región de una CDR de origen natural. Las estructuras y localizaciones de los dominios variables se pueden determinar como describen Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, MD (1991).

Las secuencias de ADN y aminoácidos (AA) de las realizaciones ilustrativas de los anticuerpos anti-IL-21R de esta invención, incluyendo sus fragmentos scF_{v}, dominios V_{H} y V_{L}, y CDR, se exponen en la Lista de Secuencias y se enumeran en las Tablas 1A y 1B. Las realizaciones específicas de los anticuerpos se identifican como MUF, línea germinal MUF, MU11, 18G4, 18A5, 19F5, CP5G2 y R18. Las posiciones de CDR en los dominios V_{H} y V_{L} de los anticuerpos se enumeran en la Tabla 2.

TABLA 1A Secuencias de AA y ADN de los Dominios V_{H} y V_{L}, F_{v}, y CDR

1

2

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TABLA 1B Secuencias de AA y ADN de los Dominios V_{H} y V_{L}, F_{v}, y CDR

3

4

TABLA 2 Posiciones de las CDR en las Secuencias AA

5

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Los anticuerpos anti-IL-21R de esta invención pueden comprender opcionalmente regiones constantes de anticuerpos o sus porciones. Por ejemplo, se puede anclar un dominio V_{L} en su extremo C-terminal a un dominio constante de la cadena ligera como Ck o C\lambda. De un modo similar, se puede anclar un dominio V_{H} o una de sus porciones a toda o parte de una cadena pesada como IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y cualquier subclase de isotipo. Las regiones constantes son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, MD (1991).

En realizaciones ilustrativas, MUF comprende dominios constantes de la cadena pesada y ligera de IgG_{1\lambda} humana, y MU11 comprende los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de IgG_{1\kappa} humana. En estos anticuerpos, las secuencias de las cadenas pesadas fuera del dominio V_{H} son idénticas. Las secuencias de ADN y de aminoácidos para el fragmento C terminal de la cadena ligera \lambda se exponen en el SEQ ID NO: 40 y el SEQ ID NO: 39, respectivamente. Las secuencias de ADN y de aminoácidos para el fragmento C terminal de la cadena \kappa se exponen en el SEQ ID NO: 42 y el SEQ ID NO: 41, respectivamente. Las secuencias de ADN y de aminoácidos para el fragmento C terminal de la cadena pesada de IgG_{1} se exponen en el SEQ ID NO: 38 y el SEQ ID NO: 37, respectivamente.

Ciertas realizaciones comprende un dominio V_{H} y un dominio V_{L}, o un fragmento scF_{v} del fragmento F_{v} de MUF, línea germinal MUF, MU11, 18G4, 18A5, 19F5, CP5G2, o R18. Asimismo se describen anticuerpos que comprenden una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de los dominios V_{H} y V_{L}. Los anticuerpos cuyas secuencias de CDR se exponen en los SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, o 145 están incluidos en el alcance de esta invención. Por ejemplo, un anticuerpo comprende un fragmento de CDR3 (H3) del dominio V_{H} de MUF, línea germinal MUF, MU11, 18G4, 18A5, 19F5, CP5G2, o R18.

Los dominios V_{H} y/o V_{L} pueden ser asimilados a la línea germinal, esto es, las regiones marco (FR) de estos dominios se mutan utilizando técnicas de biología molecular convencionales para que correspondan a las producidas por las células de la línea germinal. Las secuencias de FR permanecen diferentes de las secuencias de la línea germinal consenso.

Se proporcionan las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico para MUF asimilado a la línea germinal. La secuencia de aminoácidos para el dominio V_{H} de MUF asimilado a la línea germinal se representa en el SEQ ID NO: 83 y 85. La secuencia de aminoácidos para el dominio V_{L} de MUF asimilado a la línea germinal MUF se representa en el SEQ ID NO: 84 y 85. La secuencia de ácido nucleico para el dominio V_{H} de MUF asimilado a la línea germinal se representa en el SEQ ID NO: 92 y 94 y la del dominio V_{L} asimilado a la línea germinal se representa en el SEQ ID NO: 93 y 94. Las secuencias de la línea germinal para los dominios V_{H} y V_{L} pueden ser identificadas realizando alineamientos de la secuencia de aminoácidos y ácido nucleico frente a la base de datos VBASE (MRC Center for Protein Engineering, UK). Las regiones FR de los scFvs se mutan en conformidad con los emparejamientos más próximos de la base de datos VBASE y las porciones CDR se mantienen intactas.

Los anticuerpos reaccionan específicamente con un epítopo del dominio extracelular del IL-21R humano. El dominio extracelular pronosticado consiste en una secuencia de aproximadamente el aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 235 del SEQ ID NO: 43. Los anticuerpos anti-IL-21R bloquean la unión de IL-21 a IL-21R. Los anticuerpos anti-IL-21R reaccionan específicamente con un epítopo del dominio extracelular de IL-21R de ratón. El dominio extracelular de IL-21R murino consiste en una secuencia de aproximadamente el aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 236 del SEQ ID NO: 45. El dominio extracelular del IL-21R de ratón es idéntico en aproximadamente un 65% a la contraparte humana.

Se contempla que los anticuerpos de esta invención se puedan unir a otras proteínas, tales como, por ejemplo, proteínas recombinantes que comprenden todo o una porción del dominio extracelular de IL-21R.

Un experto normal en la técnica reconocerá que los anticuerpos descritos se pueden usar para detectar, medir, y/o inhibir proteínas que difieren algo del IL-21R. Por ejemplo, estas proteínas pueden ser homólogos de IL-21R. Se espera que los anticuerpos anti-IL-21R se unan a proteínas que comprenden una secuencia que es idéntica al menos aproximadamente en un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a cualquier secuencia de al menos 100, 80, 60, 40, o 20 aminoácidos contiguos de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 43.

Además de los análisis de homología de la secuencia, se pueden llevar a cabo el mapeo epitópico (véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols, ed. Morris, Humana Press, 1996), y los análisis de la estructura secundaria y terciaria para identificar estructuras 3D específicas adoptadas por los anticuerpos descritos actualmente y sus complejos con antígenos. Tales métodos incluyen, pero no están limitados a, cristalografía de rayos X (Engstom (1974) Biochem. Exp. Biol., 11:7-13) y modelado por ordenador de representaciones virtuales de los presentes anticuerpos (Fletterick et al. (1986) Computer Graphics y Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Se pueden obtener los anticuerpos anti-IL-21R producidos creando anticuerpos con las secuencias de V_{H} y/o V_{L} alteradas de las Tablas 1A y 1B. Tales anticuerpos pueden ser obtenidos por el experto en la técnica utilizando mecanismos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden introducir sustituciones, deleciones, o adiciones de aminoácidos en las regiones FR y/o CDR. Los cambios en FR se diseñan normalmente para mejorar la estabilidad y la inmunogenicidad del anticuerpo, si bien los cambios en las CDR se diseñan típicamente para aumentar la afinidad del anticuerpo por su antígeno. Los cambios que aumentan la afinidad se pueden someter a ensayo alterando la secuencia de CDR y midiendo la afinidad del anticuerpo por su diana (véase Antibody Engineering, 2ª ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck, 1995).

Los anticuerpos cuyas secuencias de CDR difieren insustancialmente de los expuestos en los SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, o 145 se describen dentro del alcance de esta invención. Típicamente, esto implica la sustitución de un aminoácido por un aminoácido que tiene características de carga, hidrofobicidad, o estereoquímica similares. También se pueden realizar sustituciones más drásticas en las regiones FR, en contraste con las regiones CDR, con tal que no afecten adversamente a las propiedades de unión del anticuerpo. Asimismo se pueden realizar sustituciones para asimilar a la línea germinal el anticuerpo o estabilizar el sitio de unión al antígeno.

Las modificaciones conservativas producirán moléculas con características funcionales y químicas similares a las de la molécula a partir de la cual se realizan tales modificaciones. En contraste, se pueden lograr modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de las moléculas seleccionando las sustituciones de la secuencia de aminoácidos que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (1) de la estructura del esqueleto molecular en la zona de la sustitución, por ejemplo, en forma de una lámina o una conformación helicoidal, (2) de la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (3) del tamaño de la molécula.

Por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservativa" puede implicar una sustitución de un resto aminoácido nativo por un resto no nativo de manera que haya un efecto pequeño o no haya efecto sobre la polaridad o la carga del resto aminoácido de esa posición. Además, cualquier resto nativo del polipéptido también puede ser sustituido por alanina, como se ha descrito previamente para la "mutagénesis de barrido con alanina" (véase, por ejemplo, MacLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand. Supl. 643:55-67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35:1-24).

Las sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sean conservativas o no conservativas) pueden ser determinadas por los expertos en la técnica en el momento en el que se desean tales sustituciones. Por ejemplo, se pueden utilizar sustituciones de aminoácidos para identificar restos importantes de la secuencia de la molécula, o para incrementar o disminuir la afinidad de las moléculas descritas en la presente memoria. Las sustituciones de aminoácidos ilustrativas se exponen en la Tabla 3.

TABLA 3 Sustituciones de Aminoácidos

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En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos conservativas también abarcan restos aminoácido de origen no natural que se incorporan típicamente mediante síntesis peptídica química en lugar de mediante síntesis en sistemas biológicos.

Un método para elaborar un dominio V_{H} variante puede comprender añadir, suprimir, o sustituir al menos un aminoácido en los dominios V_{H} descritos, o combinar los dominios V_{H} descritos con al menos un dominio V_{L}, y someter a ensayo el dominio V_{H} variante para la unión de IL-21R o la modulación de la actividad de IL-21R.

Un método análogo para elaborar un dominio V_{L} variante puede comprender añadir, suprimir, o sustituir al menos un aminoácido en los dominios V_{L} descritos, o combinar los dominios V_{L} descritos con al menos un dominio V_{H}, y someter a ensayo el dominio V_{L} variante en cuanto a la unión a IL-21R o la modulación de la actividad de IL-21R.

Un método para preparar fragmentos de unión a un antígeno que se unen a IL-21R puede comprender:

(a) proporcionar un repertorio de partida de ácidos nucleicos que codifican un dominio V_{H} que carece de una o más de las CDR1, 2 o 3 o contiene una CDR1, 2 o 3 que va a ser remplazada;

(b) insertar en o remplazar la región CDR1, 2 o 3 del repertorio de partida por un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos esencialmente como la expuesta en la presente memoria para una CDR1, 2, o 3 de V_{H}, dando lugar a un repertorio de productos;

(c) expresar los ácidos nucleicos del repertorio de productos;

(d) seleccionar un fragmento de unión al antígeno específico que se une a IL-21R; y

(e) recuperar el fragmento de unión al antígeno específico o un ácido nucleico que lo codifica.

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Un método análogo en el que se combinan la CDR1, 2 o 3 de V_{L} con un repertorio de ácidos nucleicos que codifican un dominio V_{L} que carece de CDR1, 2 o 3 o contiene una CDR1, 2 o 3 que va a ser remplazada.

Utilizando la metodología del ADN recombinante, se puede introducir una secuencia de CDR descrita en un repertorio de dominios V_{H} o V_{L} que carecen de la respectiva CDR (Marks et al. (BioTechnology (1992) 10: 779-783). Por ejemplo, se puede utilizar un cebador adyacente al extremo 5' del dominio variable y un cebador para la tercera FR para generar un repertorio de secuencias de dominios variables que carecen de CDR3. Este repertorio se puede combinar con una CDR3 de un anticuerpo descrito. Utilizando técnicas análogas, se pueden barajar porciones de una secuencia de CDR descrita con porciones de secuencias de CDR de otros anticuerpos para proporcionar un repertorio de fragmentos de unión al antígeno que se unen a IL-21R. Cualquier repertorio puede ser expresado en un sistema anfitrión tal como una presentación en fagos (descrita en el documento WO 92/01047) de manera que se puedan seleccionar los fragmentos de unión al antígeno adecuados que se unan a IL-21R.

Una alternativa adicional utiliza la mutagénesis al azar de las secuencias de V_{H} o V_{L} descritas para generar dominios V_{H} o V_{L} variantes capaces todavía de unirse a IL-21R. Gram et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89: 3576-3580) describen una técnica que utiliza una PCR con predisposición a errores.

Otro método utiliza la mutagénesis directa de las secuencias V_{H} o V_{L} descritas. Tales técnicas son descritas por Barbas et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1994) 91: 3809-3813) y Schier et al. (J. Mol. Biol. (1996) 263: 551-567).

Una porción de un dominio variable comprenderá al menos una región CDR esencialmente como se muestra en la presente memoria y, opcionalmente, regiones marco intermedias de los dominios V_{H} o V_{L} como se expone en la presente memoria. La porción puede incluir la mitad C terminal de FR1 y/o la mitad N terminal de FR4. Los restos adicionales del extremo N terminal o C terminal del dominio variable pueden no ser los mismos restos encontrados en los anticuerpos de origen natural. Por ejemplo, la construcción de anticuerpos mediante técnicas de ADN recombinante a menudo introduce restos No C terminales de su uso como conectores. Algunos conectores pueden ser utilizados para unir dominios variables a otros dominios variables (p. ej., fragmentos bivalentes), dominios constantes, o marcas proteináceas.

Aunque las realizaciones ilustradas en los Ejemplos comprenden un par de "emparejamiento" de los dominios V_{H} y V_{L}, un experto en la técnica reconocerá que las realizaciones alternativas pueden comprender fragmentos de unión a antígenos que contienen solamente una única CDR de cualquiera de los dominios V_{L} o V_{H}. Se puede utilizar cualquiera de los dominios de unión al antígeno específico de cadena sencilla para escrutar en busca de dominios complementarios capaces de formar un fragmento de unión al antígeno específico de dos dominios capaz, por ejemplo, de unirse a IL-21R. El escrutinio se puede completar mediante métodos de escrutinio de presentación en fagos utilizando el denominado enfoque combinatorio dual jerárquico descrito en el documento WO 92/01047. En este enfoque, se utiliza una colonia individual que contiene un clon de la cadena H o L para infectar una genoteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H), y el dominio de unión al antígeno específico de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con las técnicas de presentación en fagos descritas.

En algunas realizaciones alternativas, los anticuerpos anti-IL-21R se pueden unir a una proteína (p. ej., albúmina) mediante entrecruzamiento químico métodos recombinantes. Los anticuerpos descritos también se pueden conectar a una variedad de polímeros no proteináceos (p. ej., polietilenglicol, polipropilen-glicol, o polioxialquilenos) de las maneras expuestas en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; o 4.179.337. Los anticuerpos pueden ser modificados químicamente mediante conjugación covalente con un polímero, por ejemplo, para incrementar su vida media en la circulación sanguínea. Los polímeros y los métodos de anclaje ilustrativos se muestran en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285; y 4.609.546.

Los anticuerpos descritos pueden ser modificados para alterar su glicosilación; esto es, se puede suprimir o añadir al menos un radical carbohidrato al anticuerpo. La deleción o adición de sitios de glicosilación se puede completar cambiando la secuencia de aminoácidos para suprimir o crear sitios consenso de glicosilación, que son bien conocidos en la técnica. Otro método para añadir radicales carbohidrato es el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a restos aminoácido del anticuerpo (véase el documento WO 87/05330 y Aplin et al. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306). La eliminación de radicales carbohidrato también se puede completar químicamente o enzimáticamente (véanse Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52; Edge et al. (1981) Anal. Biochem., 118: 131; Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350).

Los métodos para alterar una región constante de un anticuerpo son conocidos en la técnica. Los anticuerpos con una función alterada (p. ej., afinidad alterada por un ligando efector tal como FcR en una célula o el componente C1 del complemento) pueden ser producidos remplazando al menos un resto aminoácido de la porción constante del anticuerpo por un resto diferente (véanse p. ej., los documentos EP 388.151 A1, US 5.624.821 y US 5.648.260). Se podrían describir tipos similares de alteraciones que si se aplicaran a un anticuerpo murino o de otra especie reducirían o eliminarían funciones similares.

Por ejemplo, es posible alterar la afinidad de una región Fc de un anticuerpo (p. ej., una IgG, tal como una IgG humana) por FcR (p. ej., Fc gamma R1) o C1q. La afinidad puede ser alterada remplazando al menos un resto especificado por al menos un resto que tiene una funcionalidad apropiada en su cadena lateral, o introduciendo un grupo funcional cargado, tal como glutamato o aspartato, o quizás un resto no polar aromático tal como fenilalanina, tirosina, triptófano o alanina (véase p. ej., el documento US 5.624.821).

Por ejemplo, remplazando el resto 297 (asparragina) por alanina en la región constante de la IgG se inhibe significativamente el reclutamiento de células efectoras, aunque solo se reduce ligeramente (aproximadamente tres veces más débil) la afinidad por Clq (véase p. ej., el documento US 5.624.821). La numeración de los restos de la cadena pesada es la del índice EU (véase Kabat et al., 1991 supra). Esta alteración destruye el sitio de glicosilación y se cree que se requiere la presencia de carbohidrato para la unión al receptor Fc. Se cree que cualquier otra sustitución en este sitio que destruya el sitio de glicosilación causa un descenso similar en la actividad lítica. También se sabe que otras sustituciones de aminoácidos, p. ej., el cambio de uno cualquiera de los restos 318 (Glu), 320 (Lys) y 322 (Lys), por Ala, abole la unión de Clq a la región Fc de los anticuerpos IgG (véase p. ej., el documento US 5.624.821). La numeración de los restos en la cadena pesada es la del indice UE (véase Kabat et al., 1991 supra). Esta alteración destruye el sitio de glicosilación y se cree que se requiere la presencia del carbohidrato para la unión al receptor Fc. Se cree que cualquier otra sustitución en este sitio que destruya el sitio de glicosilación ocasiona un descenso similar de la actividad lítica. También se sabe que otras sustituciones de aminoácidos, p. ej., el cambio de uno cualquiera de los restos 318 (Glu), 320 (Lys) y 322 (Lys), por Ala, abole la unión de Clq a la región Fc de los anticuerpos IgG (véase p. ej., el documento US 3.624.821).

Se pueden producir anticuerpos modificados que tienen una interacción reducida con un receptor Fc. Por ejemplo, se ha demostrado que en la IgG_{3} humana, que se une al receptor R1 gamma Fc, el cambio de Leu 235 por Glu destruye su interacción con el receptor. La mutación en sitios adyacentes o próximos en la región de unión a la bisagra de un anticuerpo (p. ej., remplazando los restos 234, 236 o 237 por Ala) también pueden ser utilizadas para afectar a la afinidad del anticuerpo hacia el receptor R1 gamma Fc. La numeración de los restos en la cadena pesada se basa en el índice EU (véase Kabat et al., 1991 supra).

Los métodos adicionales para alterar la actividad lítica de un anticuerpo, por ejemplo, alterado al menos un aminoácido de la región N terminal del dominio CH2, son descritos en el documento WO 94/29351 de Morgan et al. y en el documento US 5.624.821.

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Los anticuerpos de esta invención pueden ser etiquetados con una marca detectable o funcional. Estas marcas incluyen radiomarcas (p. ej., I^{131} o Tc^{99}), marcas enzimáticas (p. ej., peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina), y otros radicales químicos (p. ej., biotina).

Un experto en la técnica apreciará que las modificaciones descritas antes no son del todo exhaustivas, y que muchas otras modificaciones son obvias para el experto en la técnica a la luz de las enseñanzas de la presente descripción.

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Ácidos Nucleicos, Sistemas de Clonación y Expresión

La descripción proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos descritos. Los ácidos nucleicos pueden comprender ADN o ARN, y pueden ser sintéticos (completamente o parcialmente) o recombinantes (completamente o parcialmente). La referencia a una secuencia de nucleótidos expuesta en la presente memoria incluye una molécula de ADN con la secuencia especificada, e incluye una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que U está sustituido por T.

También se proporcionan ácidos nucleicos que comprenden una secuencia codificante para una, dos o tres CDR, un dominio V_{H}, un dominio V_{L}, o sus combinaciones, como se describe en la presente memoria, o una secuencia esencialmente idéntica a esta (p. ej., una secuencia idéntica al menos en un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a esta, o que es capaz de hibridar en condiciones restrictivas con las secuencias descritas).

Los ácidos nucleicos aislados tienen secuencias de nucleótidos que codifican regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo anti-IL-21R que tiene al menos una CDR seleccionada entre las secuencias de aminoácidos del SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 140, 141, 142, 143, 144 y 145 o una secuencia que codifica una CDR que difiere en uno o dos aminoácidos de las secuencias descritas en la presente memoria. La secuencia de aminoácidos de una CDR incluye sustituciones de aminoácidos conservativas de uno o más aminoácidos en las secuencias mostradas en los SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 140, 141, 142, 143, 144 y 145.

Un ácido nucleico puede codificar solamente la región variable de la cadena ligera o la cadena pesada, o puede codificar también una región constante de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo, conectado operativamente a la correspondiente región variable. Una región variable de la cadena ligera (V_{L}) está conectada a una región constante seleccionada entre una región constante kappa o una lambda. La región constante de la cadena ligera también puede ser del tipo kappa o lambda humano. Una región variable de la cadena pesada (V_{H}) está conectada a una región constante de la cadena pesada de un isotipo de anticuerpo seleccionado entre IgG (p. ej., IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}), IgM, IgA_{1}, IgA_{2}, IgD, e IgE. La región constante de la cadena pesada puede ser un isotipo de IgG (p. ej., una IgG_{1}).

Las composiciones de ácido nucleico aunque están a menudo en la secuencia nativa (de ADNc o ADN genómico o sus mezclas), excepto para los sitios de restricción modificados y similares, pueden ser mutadas de acuerdo con las técnicas convencionales para proporcionar secuencias génicas. Para las secuencias codificantes, estas mutaciones, pueden afectar a la secuencia de aminoácidos según se desee. En particular, se contemplan las secuencias de nucleótidos esencialmente idénticas o derivadas de V, D, J nativas, constantes, con intercambios y otras secuencias semejantes descritas en la presente memoria (donde "derivadas" indica que una secuencia es idéntica o está modificada a partir de otra secuencia).

En una realización, un ácido nucleico difiere (p. ej., difiere por sustitución, inserción, o deleción) de aquel que tiene las secuencias proporcionadas (p. ej., como sigue: en al menos uno pero menos de 10, 20, 30, o 40 nucleótidos; al menos uno pero menos de 1%, 5%, 10% o 20% de los nucleótidos del ácido nucleico sujeto). Si es necesario para este análisis las secuencias se deben alinear para su máxima homología. Las secuencias "que forman bucles" a partir de deleciones o inserciones, o emparejamientos erróneos, se consideran diferencias. La diferencia puede estar en uno o varios nucleótidos que codifican uno o varios restos no esenciales, o la diferencia puede ser una o varias sustituciones conservativas. La descripción también proporciona constructos de ácido nucleico en forma de plásmidos, vectores, casetes de
transcripción o expresión, que comprenden al menos un ácido nucleico como se describe en la presente memoria.

La descripción proporciona adicionalmente una célula anfitriona que comprende al menos un constructo de ácido nucleico descrito en la presente memoria. Asimismo se proporcionan los métodos de elaboración de las proteínas codificadas a partir de los ácidos nucleicos que comprenden la secuencia descrita en la presente memoria. El método comprende cultivar células anfitrionas en condiciones apropiadas de manera que expresen la proteína a partir del ácido nucleico. Tras la expresión y la producción, se puede aislar y/o purificar el dominio V_{H} o V_{L}, o un miembro de unión específica utilizando cualquier técnica adecuada, utilizándolo después según sea apropiado.

Los fragmentos de unión al antígeno, los dominios V_{H} y/o V_{L}, y las moléculas y vectores de ácido nucleico codificantes pueden ser aislados y/o purificados de su entorno natural, en una forma esencialmente pura u homogénea, o, en el caso del ácido nucleico, libre o esencialmente libre de ácido nucleico o genes de un origen distinto al de la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida.

Los sistemas para clonar y expresar polipéptidos en una variedad de células anfitrionas son conocidos en la técnica. Las células adecuadas para producir anticuerpos son descritas, por ejemplo, por Fernández et al. (1999) Gene Expression Systems, Academic Press, eds. En resumen, las células anfitrionas adecuadas incluyen células de mamífero, células de insecto, células vegetales, células de levadura, o células procarióticas, p. ej., E. coli. Las células de mamífero asequibles en la técnica para la expresión de polipéptidos heterólogos incluyen líneas celulares linfocíticas (p. ej., NSO), células HEK293, células de ovario de hámster Chino (CHO), células COS, células HeLa, células de riñón de cría de hámster, oocitos, y células de un animal transgénico, p. ej., células epiteliales mamarias. Los anticuerpos MUF y MU11 se expresan en células HEK293 o CHO. Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención se colocan bajo el control de un promotor específico del tejido (p. ej., un promotor específico mamario) y los anticuerpos se producen en animales transgénicos. Por ejemplo, los anticuerpos se secretan en la leche del animal transgénico, tal como una vaca, cerdo, caballo, oveja, cabra o roedor transgénicos. Se pueden construir o seleccionar vectores adecuados para que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias intensificadoras, genes marcadores, y otras secuencias. Los vectores también pueden contener un esqueleto plasmídico o viral. Para los detalles, véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Muchas de las técnicas establecidas utilizadas con vectores, incluyendo la manipulación, preparación, mutagénesis, secuenciación, y transfección de ADN, se describen en Current Protocols in Molecular Biology, Segunda Edición, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons (1992).

Un aspecto adicional de la descripción proporciona un método para introducir el ácido nucleico en una célula anfitriona. Para las células eucarióticas, las técnicas de transfección adecuadas pueden incluir el fosfato de calcio, el DEAE-Dextrano, la electroporación, la transfección mediada por liposomas, y la transducción utilizando retrovirus u otros virus, p. ej., vaccinia o baculovirus. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación, y transfección utilizando bacteriófagos. La introducción de ADN puede estar seguida de un método de selección (p. ej., resistencia a fármacos) para seleccionar las células que contienen el ácido nucleico.

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Depósitos Biológicos

Las células CHO transformadas con los vectores que contienen la cadena pesada y ligera de MUF, y las células CHO transformadas con los vectores que contienen la cadena pesada y ligera de MU11, fueron depositadas el 5 de marzo de 2003, en la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC) con los respectivos Números de Designación del Depósito PTA-5031 y PTA-5030. La dirección del depósito es 10801 University Blvd, Manassas, VA 20110, EEUU.

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Usos de Anticuerpos Anti-IL-21R

Los anticuerpos anti-IL-21R que actúan como antagonistas de IL-21R se utilizan para regular al menos una respuesta inmunitaria mediada por IL-21R, donde la respuesta inmunitaria comprende la proliferación celular, la secreción de citoquinas, la secreción de quimioquinas, y la actividad citolítica, de las células T, las células B, las células NK, los macrófagos, o las células sinoviales. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para inhibir la actividad (p. ej., proliferación, diferenciación, y/o supervivencia) de una célula inmunitaria o hematopoyética (p. ej., una célula de linaje mieloide, linfoide, o eritroide, o sus células precursoras), y, de este modo, se pueden utilizar para tratar una variedad de trastornos inmunitarios y trastornos hiperproliferativos. Los ejemplos no limitantes de los trastornos inmunitarios que se pueden tratar incluyen, pero no están limitados a, rechazo de transplantes, enfermedad de anfitrión frente a injerto, alergias (por ejemplo, alergia atópica) y enfermedades autoinmunitarias. Las enfermedades autoinmunitarias pueden incluir diabetes melitus, trastornos artríticos (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, y espondilitis anquilosante), espondiloartropatías, esclerosis múltiple, encefalomielitis, miastenia grave, lupus eritematoso generalizado, lupus eritematoso cutáneo, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), psoriasis, Síndrome de Sjogren, IBD (incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa), asma (incluyendo asma intrínseca y asma alérgica), esclerodermia y vasculitis.

La esclerosis múltiple es una enfermedad del sistema nervioso central que se caracteriza por inflamación y pérdida de vainas de mielina - la materia grasa que aísla los nervios y es necesaria para el funcionamiento apropiado de los nervios. La inflamación que resulta de una respuesta inmunitaria que es dependiente de IL-21 se puede tratar con los anticuerpos y composiciones de esta invención. En el modelo en ratón de encefalitis autoinmunitaria experimental (EEA) para la esclerosis múltiple (Tuohy et al. (J. Immunol. (1988) 141: 1126-1130), Sobel et al. (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401), y Traugott (Cell Immunol. (1989) 119: 114-129), el tratamiento de los ratones con inyecciones de MU11 antes (y continuamente) de la inducción de EEA retrasa profundamente el comienzo de la enfermedad. Los anticuerpos de esta invención se pueden utilizar de un modo similar para tratar la esclerosis múltiple en seres humanos.

La artritis es una enfermedad caracterizada por la inflamación de las articulaciones. La Artritis Reumatoide (AR) es la forma más común de artritis, implicando inflamación del tejido conectivo y de la membrana sinovial, una membrana que reviste la articulación. La membrana sinovial inflamada a menudo infiltra las articulaciones y daña el cartílago y el hueso de la articulación. Los estudios demuestran que el tratamiento de las células sinoviales y los macrófagos con IL-21 induce a estas células a secretar citoquinas y quimioquinas asociadas con la inflamación. En el modelo en ratón de artritis inducida por colágeno (AIC) para artritis reumatoide (Courtenay et al. (Nature (1980) 283: 666-628) y Williams et al. (Immunol. (1995) 84: 433-439)), el tratamiento de los ratones con IL-21 posteriormente (y continuamente) a la inducción de AIC exacerba la enfermedad. El aumento de secreción de citoquinas y quimioquinas inflamatorias, y muy importantemente, el recrudecimiento de la enfermedad resultante de las respuestas inmunitarias que dependen de IL-21 pueden ser tratados con los anticuerpos de esta invención. De un modo similar, los anticuerpos y composiciones de esta invención pueden ser utilizados para tratar la AR u otras enfermedades artríticas en seres humanos.

El rechazo de transplantes es el fenómeno inmunológico en el que los tejidos de un donante son atacados "específicamente" por las células inmunitarias del anfitrión. Las principales células "atacantes" son las células T, cuyos receptores de las células T reconocen las moléculas del MHC del donante como "foráneas". Este reconocimiento activa las células T, que proliferan y secretan una variedad de citoquinas y proteínas citolíticas que destruyen por último el transplante. Las células T en una reacción de linfocitos mezclados (MLR), un análisis in vitro del rechazo de transplantes, proliferan más fuertemente cuando se suplementan con IL-21. Los modelos de MLR y transplantes han sido descritos en Current Protocols in Immunology, Segunda Edición, Coligan et al. eds., John Wiley & Sons, 1994; Kasaian et al. (Immunity (2002) 16: 559-569); Fulmer et al. (Am. J. Anat. (1963) 113: 273-285), y Lenschow et al. (Science (1992) 257: 789-792). Se puede utilizar los anticuerpos y composiciones de esta invención para reducir la MLR y tratar el rechazo de transplantes y las enfermedades relacionadas (p. ej., la enfermedad de anfitrión versus injerto) en seres humanos que son dependientes de IL-21.

El Lupus Eritematoso Generalizado (LEG) es una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por la presencia de auto-anticuerpos, incluyendo anticuerpos para el ADN, antígenos nucleares, y ribonucleoproteínas. Estos autoanticuerpos se asocian con lesiones en los tejidos y los órganos. La causa de LEG es desconocida, pero la aparición de auto-anticuerpos sugiere una inhibición inadecuada de las células T o las células B auto-reactivas. Los anticuerpos y composiciones de esta invención se pueden utilizar para inhibir las actividades mediadas por IL-21 de las células T y las células B auto-reactivas, y tratar el LEG o enfermedades relacionadas en ratones NZB X NZW (el modelo de ratón para LEG) (Immunologic Defects in Laboratory Animals, Gershwin et al. eds., Plenum Press, 1981) o en seres humanos.

Los anticuerpos de esta invención también se pueden utilizar para tratar trastornos hiperproliferativos asociados con la actividad aberrante de las células sensibles a IL-21 y las células sensibles a IL-21R. Los ejemplos de tales células incluyen células neoplásicas de origen hematopoyético, p. ej., células que surgen de linajes mieloides, linfoides o eritroides, o sus células precursoras. Los ejemplos de tales trastornos neoplásicos incluyen cánceres leucémicos, y tumores de la sangre, médula ósea (p. ej., mieloma), y tejido linfático (p. ej., linfomas). En ciertas realizaciones, la presente invención está dirigida al tratamiento de diferentes cánceres leucémicos incluyendo, pero no limitados a, leucemia promieloide aguda (LPMA), leucemia mielógena aguda (LMA) y leucemia mielógena crónica (LMC) (revisado por Vaickus, L. (1991) Crit. Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-97). Los ejemplos de las malignidades linfoides que se pueden tratar mediante los métodos sujeto incluyen, pero no están limitados a, leucemia linfoblástica aguda (LLA, que incluye LLA de linaje B y LLA de linaje T), leucemia linfocítica crónica (LCC), leucemia prolinfocítica (LPL), leucemia de células vellosas (LCV), y macroglobulinemia de Waldenstrom (MW). Las formas adicionales de linfomas malignos que se pueden tratar por medio de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, linfoma no Hodgkin, linfomas de células T periféricas, leucemia/linfoma de células t adultas (LTA), linfoma de células T cutáneas (LCTC), leucemia linfocítica de células granulares grandes (LGL), linfoma de Hodgkin, y sus variantes.

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Terapia Combinada

En una realización, se administra una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-21R de la invención y al menos un agente terapéutico en una terapia combinada. La terapia es útil para tratar estados patológicos o trastornos, tales como trastornos inmunitarios e inflamatorios. El término "combinada" en este contexto significa que la composición de anticuerpo y el agente terapéutico se administran esencialmente al mismo tiempo, ya sea simultáneamente o sucesivamente. Si se administran sucesivamente, al comienzo de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos todavía puede ser detectable a concentraciones eficaces en el lugar del tratamiento.

Por ejemplo, la terapia combinada puede incluir al menos un anticuerpo anti-IL-21R co-formulado con, y/o co-administrado con, al menos un agente terapéutico adicional. Los agentes adicionales pueden incluir al menos un inhibidor de citoquina, un inhibidor de un factor de crecimiento, un inmunosupresor, un agente anti-inflamatorio, un inhibidor metabólico, un inhibidor enzimático, un agente citotóxico, y un agente citostático, como se describe con más detalle más abajo. Semejantes terapias combinadas se pueden utilizar ventajosamente dosis más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando de ese modo posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diferentes monoterapias. Por otro lado, los agentes terapéuticos descritos en la presente memoria actúan sobre las rutas que difieren de la ruta IL-21/IL-21R, y de este modo se espera que aumenten y/o ejerzan un efecto sinérgico con los efectos de los anticuerpos anti-IL-21R.

Los agentes terapéuticos utilizados combinados con los anticuerpos anti-IL-21R pueden ser aquellos agentes que interfieren en diferentes fases de la respuesta autoinmunitaria y en la inflamatoria posterior. En una realización, al menos un anticuerpo anti-IL-21R descrito en la presente memoria puede ser formulado simultáneamente con, y/o administrado simultáneamente con, al menos un antagonista de citoquinas y/o factores de crecimiento. Los antagonistas pueden incluir receptores, solubles, inhibidores peptídicos, moléculas pequeñas, fusiones con ligandos, anticuerpos (que se unen a citoquinas o factores de crecimiento o sus receptores u otras moléculas de la superficie celular), y citoquinas "anti-inflamatorias" y sus agonistas.

Los ejemplos no limitantes de los agentes que se pueden utilizar combinados con los anticuerpos anti-IL-21R descritos en la presente memoria, incluyen, pero no están limitados a, antagonistas de al menos una interleuquina (p. ej., IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, y IL-22); citoquina (p. ej., TNF\alpha, LT, EMAP-II, y GM-CSF); y factor de crecimiento (p. ej., FGF y PDGF). Los agentes también pueden incluir, pero no están limitados a, antagonistas de al menos un receptor para una interleuquina, citoquina, y factor de crecimiento. Los anticuerpos anti-IL-21R también se pueden combinar con inhibidores (p. ej., anticuerpos) para las moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD4 0, CD4 5, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, o sus ligandos (p. ej., CD154 (gp39, CD40L)), o LFA-1/ICAM-1 y VLA-4/VCAM-1 (Yusuf-Makagiansar et al. (2002) Med Res Rev 22(2):146-67)). Los antagonistas que se pueden utilizar combinados con los anticuerpos anti-IL-21R descritos en la presente memoria pueden incluir antagonistas de IL-1, IL-12, TNF\alpha, IL-15, IL-17, IL-18, IL-22, y sus receptores.

Los ejemplos de estos agentes incluyen los antagonistas de IL-12 (tales como los anticuerpos que se unen a IL-12 (véase p. ej., el documento WO 00/56772, Genetics Institute/BASF)); los inhibidores del receptor de IL-12 (tales como los anticuerpos para el receptor de IL-12); y el receptor de IL-12 soluble y sus fragmentos. Los ejemplos de los antagonistas de IL-15 incluyen anticuerpos contra IL-15 o su receptor, fragmentos solubles del receptor de IL-15, y proteínas de unión a IL-15. Los ejemplos de los antagonistas de IL-18 incluyen los anticuerpos para IL-18, los fragmentos solubles del receptor de IL-18, y las proteínas de unión a IL-18 (IL-18BP, Mallet et al. (2001) Circ. Res. 28). Los ejemplos de los antagonistas de IL-1 incluyen los inhibidores de la Enzima Conversora de Interlequina I (ICE) (tales como Vx740), los antagonistas de IL-1 (p. ej., IL-1 RA (ANIKINRA, AMGEN)), sIL-1RII (Immunex), y los anticuerpos anti-receptor de IL-1.

Los ejemplos de los antagonistas de TNF incluyen los anticuerpos para TNF (p. ej., TNF\alpha humano), tales como D2E7 (anticuerpo anti-TNF\alpha humano, documento U.S. 6.258.562, Humira®, BASF); CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (anticuerpos anti-TNF\alpha humanizados, Celltech/Pharmacia); cA2 (anticuerpo anti-TNF\alpha quimérico, Remicade®, Centocor); y fragmentos de anticuerpos anti-TNF (p. ej., CPD870). Otros ejemplos incluyen fragmentos y derivados del receptor de TNF soluble (p. ej., p55 o p75 humano), tales como p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de receptor de TNF-IgG de 55 kD, Lenercept®) y 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de receptor de TNF-IgG de 75 kD, Enbrel®, Immunex, véase, p. ej., Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A). Los ejemplos adicionales incluyen antagonistas de enzimas (p. ej., inhibidores de la enzima conversora de TNF\alpha (TACE) tales como derivado de ácido alfa-sulfonil-hidroxámico (documento WO 01/55112) o inhibidor de N-hidroxiformamida (GW 3333, -005, o -022)) y TNF-bp/s-TNFR (proteína de unión a TNF soluble, véanse p. ej., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S284; y Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. (1995) Vol. 268, págs. 37-42). Los antagonistas de TNF pueden ser fragmentos y derivados del receptor de TNF soluble (p. ej., p55 o p75 humano), tales como 75 kdTNFR-IgG; e inhibidores de la enzima conversora de TNF\alpha (TACE).

Los anticuerpos anti-IL-21R descritos en la presente memoria se pueden administrar combinados con al menos uno de los siguientes: antagonistas de IL-13, tales como receptores de IL-13 solubles y/o anticuerpos anti-IL-13; y antagonistas de IL-2, tales como las proteínas de fusión con IL-2 (p. ej., DAB 486-IL-2 y/o DAB 389-IL-2, Seragen, véase p. ej., Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223) y los anticuerpos anti-IL-2R (p. ej., anti-Tac (anticuerpo humanizado, Protein Design Labs, véase Cancer Res. 1990 Mar 1;50(5):1495-502)). Otra combinación incluye anticuerpos anti-IL-21R combinados con inhibidores anti-CD4 sin depleción tales como IDEC-CE9.1/SB 210396 (anticuerpo anti-CD4, IDEC/SmithKline). Otras combinaciones incluyen anticuerpos anti-IL-21R con antagonistas de la ruta co-estimuladora CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2) (tales como anticuerpos, receptores solubles, o ligandos antagónicos); ligando de la glicoproteína P-selectina (PSGL); y citoquinas anti-inflamatorias y sus agonistas (p. ej., anticuerpos). Las citoquinas anti-inflamatorias pueden incluir IL-4 (DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000, IL-10 recombinante, DNAX/Schering); IL-13; y TGF.

Se puede formular simultáneamente al menos un anticuerpo anti-IL-21R con, y/o administrar simultáneamente con, al menos un fármaco anti-inflamatorio, inmunosupresor, inhibidor metabólico, e inhibidor enzimático. Los ejemplos no limitantes de los fármacos o inhibidores que se pueden utilizar combinados con los antagonistas de IL-21 descritos en la presente memoria, incluyen, pero no están limitados a, al menos uno de: un fármaco anti-inflamatorio no esteroide (AINES) (tales como ibuprofeno, Tenidap (véase p. ej., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S280)), Naproxeno (véase p. ej., Neuro Report (1996) Vol. 7, págs. 1209-1213), Meloxicam, Piroxicam, Diclofenaco, e Indometacina); Sulfasalazina (véase p. ej., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S281); un corticosteroide (tal como prednisolona); un fármaco anti-inflamatorio supresor de citoquinas (CSAID); y un inhibidor de la biosíntesis de nucleótidos (tal como un inhibidor de la biosíntesis de purina (p. ej., un antagonista de folato tal como el metotrexato) y un inhibidor de la biosíntesis de pirimidina (p. ej., un inhibidor de la dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH) tal como leflunomida (véanse p. ej., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45, págs. 103-107)). Los agentes terapéuticos para su uso combinado con los antagonistas de IL-21/IL-21R pueden incluir AINES, CSAID, inhibidores de DHODH (tales como leflunomida), y antagonistas de folato (tales como metotrexato).

Los ejemplos de los inhibidores adicionales incluyen al menos uno de: corticosteroides (orales, inhalados e inyectado localmente); inmunosupresores (tales como ciclosporina y tacrolimus (FK-506)); inhibidores de mTOR (tales como sirolimus (rapamicina) o un derivado de rapamicina (p. ej., un derivado éster de rapamicina tal como CCI-779 (Elit. L. (2002) Current Opinion Investig. Drugs 3(8):12 49-53; Huang, S. et al. (2002) Current Opinion Investig. Drugs 3(2):295-304))); un agente que interfiere en la señalización de las citoquinas proinflamatorias tales como TNF\alpha e IL-1 (p. ej., IRAK, NIK, IKK, p38 o un inhibidor de la quinasa MAP); un inhibidor de COX2 (p. ej., celecoxib y sus variantes (MK-966), véase p. ej., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S81); un inhibidor de fosfodiesterasa (tal como R973401, véase p. ej., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282)); un inhibidor de fosfolipasa (p. ej., un inhibidor de fosfolipasa 2 citosólica (cPLA2) tal como los análogos de trifluorometilcetona (documento U.S. 6.350.892)); un inhibidor del factor de crecimiento de las células endoteliales vasculares (VEGF); un inhibidor del receptor de VEGF; y un inhibidor de la angiogénesis. Los agentes terapéuticos para su uso combinado con anticuerpos anti-IL-21R pueden incluir inmunosupresores (tales como ciclosporina y tacrolimus (FK-506)); y los inhibidores de mTOR (tales como sirolimus (rapamicina) o derivados de rapamicina (p. ej., derivados éster de rapamicina tales como CCI-779)); inhibidores de COX2 (tales como celecoxib y sus variantes); e inhibidores de fosfolipasa (tales como inhibidores de fosfolipasa 2 citosólica (cPLA2) (p. ej., análogos de trifluorometil-
cetona)).

Los ejemplos de los agentes terapéuticos que se pueden administrar simultáneamente y/o formular simultáneamente con al menos un anticuerpo anti-IL-21R, incluyen, pero no están limitados a, al menos uno de: antagonistas de TNF (tales como anticuerpos anti-TNF); fragmentos solubles de receptores de TNF (p. ej., p55 y p75 humanos) y sus derivados (tales como p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de receptor de TNF-IgG de 55 kD, Lenercept®) y 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de receptor de TNF-IgG de 75 kD, Enbrel®)); antagonistas enzimáticos de TNF (tales como los inhibidores TACE); antagonistas de IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, y IL-22; agentes de depleción de las células T y las células B (tales como los anticuerpos anti-CD4 o anti-CD22); inhibidores de molécula pequeña (tales como metotrexato y leflunomida); sirolimus (rapamicina) y sus análogos (tales como CCI-779); inhibidores de Cox-2 y cPLA2; inhibidores de p38, TPL-2, Mk-2 y NFkB; RAGE y RAGE soluble; inhibidores de P-selectina y PSGL-1 (tales como anticuerpos e inhibidores de molécula pequeña); y agonistas del receptor beta de estrógenos (ERB), y antagonistas de ERB-NFkb. Los agentes terapéuticos que se pueden administrar simultáneamente y/o formular simultáneamente con al menos un anticuerpo anti-IL-21R pueden incluir al menos uno de: un fragmento soluble de un receptor de TNF (p. ej., p55 o p75 humanos) tal como 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de receptor de TNF-IgG de 75 kD, Enbrel®); metotrexato; leflunomida; y sirolimus (rapamicina) y sus análogos (tales como
CCI-779).

Los anticuerpos anti-IL-21R descritos en la presente memoria se pueden utilizar combinados con otros agentes terapéuticos para tratar trastornos inmunitarios específicos como se comenta con más detalle más abajo.

Los ejemplos no limitantes de los agentes para tratar los trastornos artríticos (p. ej., artritis reumatoide, artritis inflamatoria, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis y artritis psoriásica), con los cuales se puede combinar un anticuerpo anti-IL-21R incluyen al menos uno de los siguientes: antagonistas de TNF (tales como anticuerpos anti-TNF); fragmentos solubles de receptores de TNF (p. ej., p55 y p75 humanos) y sus derivados (tales como p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de receptor de TNF-IgG de 55 kD, Lenercept®) y 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de receptor de TNF-IgG de 75 kD, Enbrel®)); antagonistas enzimáticos de TNF (tales como inhibidores TACE); antagonistas de IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, y IL-22; agentes para la depleción de células T y células B (tales como los anticuerpos anti-CD4 o anti-CD22); inhibidores de molécula pequeña (tales como metotrexato y leflunomida); sirolimus (rapamicina) y sus análogos (p. ej., CCI-779); inhibidores de Cox-2 y cPLA2; AINES; inhibidores de p38, TPL-2, Mk-2, y NFkB; RAGE o RAGE soluble; inhibidores de P-selectina o PSGL-1 (tales como inhibidores de molécula pequeña y anticuerpos); agonistas del receptor beta de estrógenos (ERB), y antagonistas de ERB-NF\kappaB. Los agentes terapéuticos que se pueden administrar simultáneamente y/o formular simultáneamente con al menos un antagonista de IL-21/IL-21R pueden incluir al menos uno de: un fragmento soluble de un receptor de TNF (p. ej., p55 o p75 humanos) tales como 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de receptor de TNF-IgG de 75 kD, Enbrel®); metotrexato; leflunomida; y sirolimus (rapamicina) o uno de sus análogos (p. ej., CCI-779).

Los ejemplos no limitantes de los agentes para el tratamiento de la esclerosis múltiple con los cuales se puede combinar el anticuerpo anti-IL-21R incluyen interferón-\beta (por ejemplo, IFN\beta-1a y IFN\beta-1b), copaxona, corticosteroides, inhibidores IL-I, inhibidores TNF, anticuerpos para el ligando CD40, anticuerpos para CD80, y antagonistas de IL-12.

Los ejemplos no limitantes de los agentes para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino o de la enfermedad de Crohn con los cuales se puede combinar el anticuerpo anti-IL-21R incluyen budenosida; factor de crecimiento epidérmico; corticosteroides; ciclosporina; sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores de tromboxano; antagonistas del receptor de IL-1; anticuerpos monoclonales anti-IL-1; anticuerpos monoclonales anti-IL-6; factores de crecimiento; inhibidores de elastasa; compuestos de piridinil-imidazol; antagonistas de TNF como los descritos en la presente memoria; IL-4, IL-10, IL-13, y/o TNF\beta o sus agonistas (p. ej., anticuerpos agonistas); IL-11; profármacos de predinisolona, dexametasona o budesonida conjugados con glucurónido o dextrano; fosforotioato-oligodesoxinucleótidos antisentido para ICAM-I (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor 1 del complemento soluble (TP10; T Cell Sciences, Inc.); mesalazina de liberación lenta; metotrexato; antagonistas del Factor Activador de Plaquetas (PAF); ciprofloxacina; y lignocaína.

Se puede utilizar un anticuerpo anti-IL-21R combinado con al menos un anticuerpo dirigido a otras dianas implicadas en la regulación de las respuestas inmunitarias, p. ej., el rechazo de transplantes o la enfermedad de anfitrión versus injerto. Los ejemplos no limitantes de los agentes para el tratamiento de las respuestas inmunitarias con los que se puede combinar un antagonista de IL-21/IL-21R incluyen los siguientes: anticuerpos contra moléculas de la superficie celular, incluyendo pero no limitadas a CD25 (receptor \alpha de IL-2), CD11a (LFA-1), CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD2 8/CTLA4, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), o sus combinaciones. Se utiliza un anticuerpo anti-IL-21R combinado con al menos un agente inmunosupresor general, tal como ciclosporina A o FK506.

Otro aspecto de la presente descripción se refiere por consiguiente a kits para llevar a cabo la administración combinada de anticuerpos anti-IL-21R con otros agentes terapéuticos. El kit comprende al menos un anticuerpo anti-IL-21R formulado en un portador farmacéutico, y al menos un agente terapéutico, formulado como sea apropiado en una o más preparaciones farmacéuticas separadas.

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Usos Diagnósticos

Los anticuerpos de acuerdo con esta invención también se pueden utilizar para detectar la presencia de IL-21R en muestras biológicas. Correlacionando la presencia o el nivel de estas proteínas con una afección médica, un experto en la técnica puede diagnosticar la afección médica asociada. Por ejemplo, las células T estimuladas aumentan su expresión de IL-21R, y una concentración inusualmente elevada de células T que expresan IL-21R en las articulaciones puede indicar inflamación de la articulación y posible artritis. Las afecciones médicas ilustrativas que se pueden diagnosticar por medio de los anticuerpos de esta invención incluyen esclerosis múltiple, artritis reumatoide, y rechazo de transplantes.

Los métodos de detección basados en anticuerpos son bien conocidos en la técnica, e incluyen ELISA, radioinmunoanálisis, inmunotransferencias, transferencias Western; citometría de flujo, inmunofluorescencia, inmunoprecipitación, y otras técnicas relacionadas. Los anticuerpos pueden ser proporcionados en un kit de diagnóstico que incorpora al menos uno de estos procedimientos para detectar IL-21R. El kit puede contener otros componentes, envases, instrucciones, u otro material para ayudar a la detección de la proteína y al uso del kit.

Los anticuerpos pueden estar modificados con marcadores detectables, incluyendo grupos ligando (p. ej., biotina), fluoróforos y cromóforos, radioisótopos, reactivos densos a los electrones, o enzimas. Las enzimas se detectan por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante se detecta por su capacidad para convertir la tetrametilbenzidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. Otros patrones de unión adecuados incluyen biotina y avidina, IgG y proteína A, y otros pares de receptor-ligando conocidos en la técnica.

Los anticuerpos también se pueden unir funcionalmente (p. ej., mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a al menos otra entidad molecular, tal como otro anticuerpo (p. ej., un anticuerpo biespecífico o multiespecífico), toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos o citostáticos, entre otros. Otras permutaciones y posibilidades resultan evidentes para los expertos en la técnica, y se consideran equivalentes en el alcance de esta invención.

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Composiciones Farmacéuticas y Métodos de Administración

Ciertas realizaciones de la invención incluyen composiciones que comprenden los anticuerpos deseados. Las composiciones pueden ser adecuadas para uso farmacéutico y para la administración a los pacientes. Las composiciones comprenden un anticuerpo de la presente invención y un excipiente farmacéutico. Según se utiliza en la presente memoria, "excipiente farmacéutico" incluye disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, etc., que son compatibles con la administración farmacéutica. El uso de estos agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Las composiciones también pueden contener otros compuestos activos que proporcionan funciones terapéuticas suplementarias, adicionales, o intensificadas. Las composiciones farmacéuticas también pueden ser incluidas en un recipiente, paquete, o dispensador junto con las instrucciones para su administración.

Una formulación farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su ruta de administración pretendida. Los métodos para completar la administración son conocidos por los expertos en la técnica. También puede ser posible crear composiciones que pueden ser administradas tópicamente u oralmente, o que pueden ser susceptibles de transmisión a través de las membranas mucosas. Por ejemplo, la administración puede ser intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavital, subcutánea, o transdérmica.

Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación intradérmica o subcutánea incluyen típicamente al menos uno de los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua, solución salina, aceites fijados, polietilenglicol, glicerina, propilenglicol, u otro disolvente sintético; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); tampones tales como acetato, citrato, o fosfato; y agentes de tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases. Tales preparaciones pueden estar incluidas en ampollas, jeringas desechables, o viales de múltiples dosis.

Las soluciones o suspensiones utilizadas para la administración intravenosa incluyen un portador tal como solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, NJ), etanol, o polioles. En todos los casos, la composición debe ser estéril y fluida para una fácil jeringabilidad. La fluidez apropiada se puede obtener a menudo utilizando lecitina o tensioactivos. La composición también debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Se pueden evitar los microorganismos con agentes antibacterianos y antifúngicos, p. ej., parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, etc. En muchos casos, se pueden incluir en la composición agentes isotónicos (azúcar), polialcoholes (manitol y sorbitol), o cloruro de sodio. La absorción prolongada de la composición se puede lograr añadiendo un agente que retrase la absorción, p. ej., monoestearato de aluminio y gelatina.

Las composiciones orales incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. La composición puede estar incluida en gelatina o comprimida en comprimidos. Para la administración oral, se pueden incorporar los anticuerpos a excipientes y colocarlos en comprimidos, trociscos, o cápsulas. Se pueden incluir en la composición agentes de unión o materiales coadyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, trociscos, y cápsulas, pueden contener (1) un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; (2) un excipiente tal como almidón o lactosa, (3) un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; (4) un lubricante tal como estearato de magnesio; (5) un antiapelmazante tal como dióxido de silicio coloidal; o (6) un agente edulcorante o un agente aromatizante.

Las composiciones también se pueden administrar por ruta transmucosal o transdérmica. Por ejemplo, los anticuerpos que comprende una porción Fc pueden ser capaces de atravesar las membranas mucosas del intestino, la boca, o los pulmones (por medio de los receptores de Fc). La administración transmucosal se puede completar por medio del uso de grageas, pulverizaciones nasales, inhaladores, o supositorios. También se puede lograr la administración transdérmica por medio del uso de composiciones que contienen pomadas, ungüentos, geles, o cremas conocidos en la técnica. Para la administración transmucosal o transdérmica, se utilizan penetrantes apropiados para la barrera que va a ser penetrada. Para la administración por inhalación, se liberan los anticuerpos en forma de pulverización en aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado, que contiene un propelente (p. ej., líquido o gas) o un nebulizador.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos de esta invención se preparan con portadores para proteger a los anticuerpos de la rápida eliminación del organismo. A menudo se utilizan polímeros biodegradables (p. ej., acetato de vinilo/etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, poli(ácido láctico). Los métodos para la preparación de tales formulaciones son conocidos por los expertos en la técnica. También se pueden utilizar suspensiones liposomales como portadores farmacéuticamente aceptables. Los liposomas se preparan de acuerdo con los métodos establecidos en la técnica (Patente de los Estados Unidos Núm. 4.522.811).

Los anticuerpos o las composiciones de anticuerpo de la invención se administran en cantidades terapéuticamente eficaces como se ha descrito. Las cantidades terapéuticamente eficaces pueden variar con la edad, el estado, el sexo y la gravedad del estado médico del paciente. La dosificación apropiada puede ser determinada por un médico basándose en las indicaciones clínicas. Los anticuerpos o las composiciones se pueden administrar como una dosis de bolo para maximizar los niveles circulantes de anticuerpos durante la mayor extensión de tiempo. También se puede utilizar la infusión continua después de la dosis de bolo.

Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "sujeto" incluya seres humanos y animales no humanos. Los sujetos pueden incluir un paciente humano que tenga un trastorno caracterizado por células que expresen IL-21R, p. ej., una célula cancerosa o una célula inmunitaria. El término "animales no humanos" de la invención incluye todos los vertebrados, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Los ejemplos de los intervalos de dosificación que se pueden administrar a un sujeto se pueden seleccionar entre: 1 \mug/kg a 20 mg/kg, 1 \mug/kg a 10 mg/kg, 1 \mug/kg a 1 mg/kg, 10 \mug/kg a 1 mg/kg, 10 \mug/kg a 100 \mug/kg, 100 \mug a 1 mg/kg, 500 \mug/kg a 1 mg/kg.

Puede resultar ventajoso formular composiciones en una forma de dosificación unitaria y con uniformidad de las dosis. La forma de dosificación unitaria según se utiliza en la presente memoria hace referencia a unidades físicamente discretas adecuadas para el paciente. Cada unidad de dosificación contiene una cantidad predeterminada de anticuerpo calculada para producir un efecto terapéutico asociado con el portador. La unidad de dosificación depende de las características de los anticuerpos y del efecto terapéutico concreto que se vaya a alcanzar.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de la composición se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en los cultivos celulares o los animales experimentales, p. ej., determinando la DL_{50} (dosis letal para el 50% de la población) y la DE_{50} (dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón entre los efectos tóxicos y los terapéuticos de la dosis es el índice terapéutico y se puede expresar como la razón DL_{50}/DE_{50}. Los anticuerpos que muestran índices terapéuticos elevados pueden ser menos tóxicos y/o más eficaces terapéuticamente.

Los datos obtenidos de los análisis en cultivos celulares y los estudios en animales se pueden utilizar para formular un intervalo de dosificación en seres humanos. La dosificación de estos compuestos puede encontrarse en el intervalo de las concentraciones de anticuerpo circulante en la sangre, que incluyen una DE_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de la composición de dosificación empleada y de la ruta de administración. Para cualquier anticuerpo utilizado en la presente invención, se puede estimar inicialmente la dosis terapéuticamente eficaz utilizando análisis en cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos en animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluya la CI_{50} (esto es, la concentración de anticuerpo que logra una inhibición semi-máxima de los síntomas). Los efectos de cualquier dosificación concreta pueden ser controlados mediante un bioanálisis adecuado. Los ejemplos de tales bioanálisis adecuados incluyen análisis de replicación de ADN, análisis basados en la transcripción, análisis de unión IL-21R/IL-21 y otros análisis inmunológicos.

Los siguientes ejemplos no limitan en modo alguno el alcance de la invención. Un experto en la técnica reconocerá las numerosas modificaciones y variaciones que se pueden realizar sin alterar el alcance de la presente invención. Tales modificaciones y variaciones están incluidas en el alcance de la invención.

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Ejemplos Ejemplo 1 Selección de scFv Anti-IL-21R MUF y MU11

Se utilizó una genoteca de fagémidos de scF_{v}, que es una versión ampliada de la genoteca de 1,38x10^{10} descrita por Vaughan et al. ((1996) Nature Biotech., 14: 309-314), para seleccionar anticuerpos específicos para el IL-21R humano. Los pocillos de las placas de microtitulación se recubrieron con proteína de fusión con IL-21R soluble o proteína de fusión de control (5-20 \mug/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) y se incubaron durante la noche a 4ºC. Los pocillos se lavaron en PBS, después se bloquearon durante 1 hora a 37ºC en MPBS (leche en polvo en PBS al 3%). El fago purificado (10^{12} unidades de transducción), bloqueado durante 1 hora en MPBS, fue añadido a los pocillos recubiertos con la proteína de fusión de control e incubado durante 1 hora. El fago no unido se transfirió después a los pocillos con la proteína de fusión con IL-21R y se incubó durante una hora. Los pocillos se lavaron 5 veces con PBST (Tween 20 0,1% v/v en PBS), después 5 veces con PBS. Los fagos unidos se hicieron eluir y se utilizaron para infectar exponencialmente E. coli TG1 en crecimiento. Las células infectadas se hicieron crecer en caldo 2TY durante 1 hora a 37ºC, después se sembraron en estrías sobre placas 2TYAG y se incubaron durante la noche a 30ºC. Al día siguiente, las colonias se transfirieron a 10 ml de caldo 2TY más glicerol al 15% y se almacenaron a -70ºC. Más tarde, las colonias de esta primera ronda de selección se descongelaron y se superinfectaron con fago coadyuvante para rescatar (generar) el fago que expresa el anticuerpo scF_{v} para una segunda ronda de selección.

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Ejemplo 2 Selección de scFv Anti-IL-21R R18 y 19F5

Se aisló scFv anti-IL21R (R18) utilizando 200 nM de proteína de fusión con IL-21R humano biotinilado
(bio.hIL21R) (Wyeth, Giralda Farms, NJ) en solución. El fago scFv purificado (10^{12} tu) se bloqueó con MPBS y 125 \mug/ml de proteína de fusión de control, como se ha descrito antes en el Ejemplo 1. La proteína de fusión a IL-21R biotinilada se añadió al fago bloqueado a una concentración final de 200 nM y se incubó durante 1 hora a la temperatura ambiente. Se añadió el fago/antígeno a 75 \mul de cuentas magnéticas Dynal M280 Streptavidin (Dynal Biotech Inc., Lake Success, NY) que habían sido bloqueadas durante 90 minutos a la temperatura ambiente en 1 ml de MPBS al 3%. La mezcla se incubó durante 15 minutos a la temperatura ambiente mezclando. Las cuentas fueron capturadas utilizando una gradilla magnética y se lavaron 5 veces en 1 ml de PBST seguido de tres lavados en PBS. Los fagos unidos se hicieron eluir con 500 \mul de tripsina de 10 \mug/ml en tampón de fosfato de sodio 0,2 M, pH 7,0 y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Los fagos eluidos se utilizaron para infectar 10 ml de células de E. coli TG-1 en crecimiento exponencial como se ha descrito antes. Los clones de scFv se aislaron después de tres rondas de selección.

La producción de scFv fue inducida mediante la adición de IPTG 1 mM a cultivos que crecen exponencialmente e incubación durante la noche a 30ºC. Los extractos periplásmicos que contienen scFv bruto (Griffiths et al. (1993) EMBO J., 12:725-734) se escrutaron en busca de la capacidad para inhibir la unión de la proteína de fusión a IL-21R humano a la proteína etiquetada con IL-21-FLAG humana. En resumen, se inmovilizó el anticuerpo anti-FLAG sobre plástico y se utilizó para capturar la proteína IL-21 humana etiquetada con FLAG. La unión de la proteína de fusión con IL-21R humano se detectó con un anticuerpo marcado con Europio para la proteína de fusión IL-21R, y se detectó la fluorescencia resuelta con el tiempo con el kit reactivo DELFIA (PerkinElmer, Boston, MA). El clon de scFv R18 purificado mostró un valor de CI_{50} de 770 nM para la inhibición de la unión de la proteína de fusión de IL-21R a la proteína etiquetada con IL-21-FLAG.

Se aisló un clon anti-IL21R 19F5 mediante el método de selección utilizado para R18, excepto que se utilizaron 50 nM de proteína de fusión a IL-21R humano en la tercera ronda de selección.

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Ejemplo 3 Selección de scFv Anti-IL-21R 18A5 y 18G4

Se aislaron los scFv anti-IL21R scFv, 18A5 y 18G4, mediante selección en líneas celulares que expresaban IL-21R y proteína de fusión a IL-21R en solución. Las células hBaf3Mu-1 transfectadas (Wyeth, Giralda Farms, NJ) que expresaban el IL-21R humano sobre la superficie celular se cultivaron utilizando métodos de cultivo de tejidos convencionales. Los fagos de scFv purificados (10^{12} tu) fue ron bloqueados con 1x10 células Baf3 no transfectadas durante 1 hora a la temperatura ambiente en MPBS.

Los fagos bloqueados se añadieron a 1x10^{7} células hBaf3Mu-1, que habían sido pre-incubadas en MPBS durante 1 hora. Esto estuvo seguido de incubación durante una hora a la temperatura ambiente mezclando. Las células hBaf3Mu-1 se lavaron con posterioridad 6 veces en PBST. Los fagos unidos específicamente se hicieron eluir de las células utilizando 10 \mug/ml de tripsina en tampón de fosfato de sodio 0,2 M, pH 7,0, y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos con sacudimiento. El sobrenadante de los fagos eluidos se utilizó para infectar células E. coli TG-1 como se ha descrito antes.

Se produjeron fagos que expresaban scFv para la segunda ronda de selección como se ha descrito antes. Los fagos se bloquearon con MPBS y 125 \mug/ml de proteína de fusión de control. La selección se llevó a cabo en una solución con proteína de fusión a IL-21R humano biotinilada (Wyeth) siguiendo el método se selección descrito para R18, excepto que las cuentas se lavaron 5 veces en 1 ml de MPBS/Tween 20 al 0,1% (v/v) seguido de tres lavados en PBS.

Las partículas de fago que expresaban el anticuerpo scFv se seleccionaron después adicionalmente utilizando el método de selección que empleaba células hBaf3Mu-1, como se ha descrito antes.

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Ejemplo 4 Selección de scFv Anti-IL-21R CP5G2

Se aisló el clon CP5G2 mediante selección en IL-21R murino etiquetado con hexahistidina y una etiqueta de afinidad Flag (hIL21R.His.Flag) (Wyeth, Giralda Farms, NJ). Los fagos scFv purificados (10^{12} tu) se bloquearon con MPBS más 30 \mul de cuentas de agarosa anti-Flag durante 1 hora a la temperatura ambiente. Se añadió hIL-21R.His.Flag, a una concentración final de 25 nM en MPBS, a los fagos bloqueados y se incubó a la temperatura ambiente durante 1 hora. Después se añadió la mezcla de genoteca/antígeno a 100 \mul de cuentas de agarosa anti-Flag que habían sido bloqueadas en MPBS durante 2 horas a la temperatura ambiente, se lavó 3 veces en PBS, y se incubó 20 minutos más mezclando. Las cuentas se lavaron 4 veces con PBST, seguido de 4 veces con PBS y los fagos se hicieron eluir de las cuentas con 0,5 \mug/ml de tripsina en Tris 50 mM, pH 8,0, CaCl_{2} 1 mM, como se ha descrito antes. Las cuentas se recogieron utilizando centrifugación. Los fagos eluidos se utilizaron para infectar 10 ml de células E. coli TG-1, como se ha descrito antes. Se llevó a cabo una segunda ronda de selección soluble, también como se ha descrito antes.

Las colonias fueron seleccionadas en placas de 96 pocillos que contenían 100 \mul de 2TYAG. Se produjeron extractos periplásmicos que contenían scFv bruto como se ha descrito antes, excepto que el tampón utilizado fue sacarosa al 20% (p/v), Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM. Los extractos que contenían scFv bruto se escrutaron en busca de la capacidad para inhibir la unión de 16 ng/ml de IL-21 murina biotinilada (bio.mIL21) a la proteína IL-21R murina inmovilizada sobre plástico en un análisis en placas de microtitulación de 96 pocillos. Se detectó la unión de bio.mlL21 con estreptavidina marcada con Europio, y se detectó TRF utilizando el kit de reactivos DELFIA (PerkinElmer, Boston, MA).

El scFv CP5G2 purificado mostró un valor de CI_{50} de 590 nM en el análisis anterior para la inhibición de la unión de IL-21 a IL-21R.

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Ejemplo 5 Identificación de scF_{v} a partir de clones de fagos MUF y MU11

Para establecer la especificidad de los scF_{v} para IL-21R, se realizó un ELISA con fagos frente a la proteína de fusión a IL-21R. Se transfirieron colonias de células TG1 individuales de la segunda selección a pocillos de microtitulación que contenían 100 \mul de medio 2TYAG. Se añadió fago coadyuvante M13K07 (10 moi) al cultivo TG1 en crecimiento exponencial, y las muestras se incubaron durante una hora a 37ºC. Las placas se centrifugaron y se sobrenadante se separó, después se suspendieron los sedimentos restantes en 100 \mul de 2TYAG y se incubaron durante la noche a 30ºC con sacudimiento. Al día siguiente, las placas se centrifugaron y el sobrenadante con los fagos se transfirió a los pocillos de nuevas placas de microtitulación. El fago se bloqueó en MPBS antes del ELISA.

Los pocillos de las placas de microtitulación se recubrieron con proteína de fusión a IL-21R o proteína de fusión de control (0,5-2,5 \mug/ml) y se incubaron a 4ºC durante la noche. Al día siguiente, la solución de proteína de fusión se separó y los pocillos se bloquearon durante 1 hora en MPBS. Los pocillos se lavaron con PBS, después se añadieron 50 \mul de fago bloqueado. Las placas se incubaron durante 1 hora, después se lavaron 3 veces con PBST y 3 veces con PBS. Se añadió a los pocillos producto conjugado anti-M13-HRP (Pharmacia, Peapack, NJ), y las muestras se incubaron durante una hora. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBST y 3 veces con PBS. Se añadió TMB a los pocillos, y las muestras se incubaron hasta que se desarrolló color. La reacción se detuvo con 25 \mul de H_{2}SO_{4} 0,5M. Se midió la señal de color mediante lectura de la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de placa de microtitulación. Dos clones de fagos mostraron unión específica a la proteína de fusión a IL-21R y no a la proteína de fusión de control, y estos clones son referidos en esta solicitud como clones de fagos MUF y MU11.

Las colonias TG-1 individuales que contenían los clones de fagos MUF y MU11 se sembraron en estrías sobre placas 2TYAG y se incubaron durante la noche a 30ºC. Utilizando oligos específicos del vector pCANTAB6, se amplificaron las regiones V_{H} y V_{L} del fago mediante PCR y se secuenciaron. Las búsquedas en las bases de datos revelaron que la región V_{L} del clon del fago MUF se originaba a partir de la cadena lambda, y la región V_{L} del clon del fago MU11 se originaba a partir de la cadena kappa.

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Ejemplo 6 Conversión de scF_{v} en IgG

Las regiones V_{H} y V_{L} de los clones de fagos MUF y MU11 fueron amplificadas mediante PCR utilizando cebadores específicos del clon. Los productos de la PCR fueron digeridos con enzimas de restricción y subclonados en los vectores apropiados (véase el Ejemplo 2) que contenían el dominio constante de la cadena pesada de la IgG_{1} humana (Takahashi et al. (1982) Cell 29, 671) o el dominio constante de la cadena ligera lambda humana o el dominio constante de la cadena ligera kappa humana (Hieter et al. (1982) Nature 294: 536). Los cuatro constructos codifican los polipéptidos referidos en esta solicitud como cadena pesada MUF, cadena ligera MUF, cadena pesada MU11, y cadena ligera MU11.

Los vectores que contenían la cadena pesada MUF, la cadena ligera MUF, la cadena pesada MU11, y la cadena ligera MU11, fueron preparados, secuenciados, y utilizados para transfectar células HEK293 o CHO utilizando técnicas convencionales. Las células que expresaban las cadenas pesada y ligera MUF produjeron el anticuerpo MUF, que es referido en esta solicitud como "MUF", y las células que expresaban las cadenas pesada y ligera MU11 produjeron el anticuerpo MU11, que es referido en esta solicitud como "MU11". Los anticuerpos secretados fueron purificados utilizando proteína A-Sefarosa (Pharmacia), después se sometieron a diálisis con PBS.

La especificidad de unión de los anticuerpos se determinó como sigue: se recubrieron placas de ELISA durante la noche con 2,5 \mug/ml de proteína de fusión a IL-21R. Las placas se lavaron con PBSB (PBS + 1% albúmina de suero bovino), después se incubaron con diferentes concentraciones de MUF o MU11 durante 2 horas a 25ºC. Las placas se lavaron, después se añadió una cantidad saturante de anti-anticuerpo humano de cabra conjugado con HRP. Las placas se incubaron durante 1 hora a 25ºC, luego se lavaron con PBSB, y se revelaron utilizando TMB. Un ejemplo de los resultados obtenidos por medio de ELISA se presenta en la Figura 1A.

La especificidad de unión de los anticuerpos se confirmó adicionalmente mediante tinción en la superficie celular. Las células TF-1 transducidas con IL-21R humano se unieron con MUF o MU11 purificado o biotinilado (1 mg/ml). Las células se incubaron sobre hielo durante 30 minutos, se lavaron con PBSB, después se suspendieron en una solución que contenía anticuerpo anti-IgG humana conjugado con PE o avidina conjugada con PE. Las células se incubaron sobre hielo durante 30 minutos, se lavaron, después se analizaron en un FACScan. Los resultados se presentan en la Figura 1B. Las células B de ratón purificadas se tiñeron de un modo similar con MUF, y los resultados se presentan en la Figura 1C.

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Ejemplo 7 MUF Bloquea la Unión de IL-21 a IL-21R

Se realizaron análisis de inhibición para evaluar la capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión de IL-21 a IL-21R. El ELISA se realizó como se ha descrito en el Ejemplo 3 con las siguientes modificaciones. Tras la incubación con MUF o MU11 durante 2 horas a 25ºC, se añadió IL-21 conjugada con biotina (1 \mug/ml), y las muestras se incubaron durante 1 hora a 25ºC. Después de lavar, se añadió una cantidad saturante de avidina-HRP, y las muestras se incubaron adicionalmente durante 1 hora a 25ºC. Los pocillos se lavaron con PBSB, y las muestras se revelaron utilizando TMB. Los resultados se presentan en la Figura 2. En estas condiciones, MUF bloqueó la unión de IL-21 a IL-21R, mientras MU11 no lo hizo. Estos datos sugieren que MUF y MU11 reconocen diferentes epítopos de IL-21R.

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Ejemplo 8 MUF y MU11 Disminuyen las Respuestas de las Células T

Se realizaron análisis de proliferación para evaluar la capacidad del anticuerpo para bloquear la proliferación de células T mediada por IL-21. Las células T CD4+ humanas (5 x 10^{4} células/pocillo) se estimularon con PHA (fitohemaglutinina) e IL-21 humana. Se añadió IL-21 en medio de cultivo de células COS (COS CM) a diferentes muestras a diferentes concentraciones. En las muestras indicadas, se añadieron MUF, MU11, o control de isotipo IgG_{1} humano. Después de 72 horas, se añadió timidina-H^{3}, y se midió la proliferación celular mediante la radiactividad incorporada utilizando un contador de centelleo líquido LKB 1205. Como se muestra en la Figura 3A, la IL-21 aumentó la proliferación de células T estimuladas con PHA. La adición de MUF bloqueó la capacidad de IL-21 para aumentar la proliferación en el intervalo entre aproximadamente 1:500 y 1:10.000. El bloqueo con MUF fue superado a dosis superiores de IL-21. La adición de MU11 o anticuerpo de control de isotipo no afectó significativamente a la proliferación de células T humanas aumentada por IL-21.

En la Figura 3B, se estimuló una línea de células T CD4+ de ratón específica de PLP con el péptido PLP (1 \mug/ml) y células de bazo de ratón SJL. Se tituló la IL-21 en medio de cultivo de células COS (COS IL-21) como se muestra en el eje de las X. "Cos Simulado" es un medio de cultivo COS sin IL-21. En las muestras indicadas, se añadió MU11 (1 \mug/ml). Después de 72 horas, se añadió timidina H^{3}, y se midió la proliferación mediante la radiactividad incorporada. Como se muestra en la Figura 3B, IL-21 aumentó la proliferación de las células T de ratón estimuladas. La adición de MU11 bloqueó la capacidad de IL-21 para incrementar la proliferación de las células T CD4+ de ratón. Estos datos sugieren que MU11 actúa como un inhibidor no competitivo: bloquea la capacidad de IL-21 para incrementar la proliferación incluso aunque no bloquee la unión de IL-21 al receptor.

En la Figura 3C, las células T de ratón CD8+ purificadas fueron estimuladas con cuentas de tosilo (Dynal, Great Neck, NY) recubiertas con anticuerpo anti-CD3. La IL-21 del medio de cultivo de células COS (COS s/n) fue titulada como se indica en el eje de las X. La muestra marcada como "no anticuerpo" se utilizó cómo control. En las muestras indicadas, se añadió MU11 a la concentración marcada. Después de 72 horas, se añadió timidina-H^{3}, y se midió la proliferación por medio de la radiactividad incorporada. Como se muestra en la Figura 3C, la adición de MU11 bloqueó, de una manera dependiente de la dosis, la capacidad de IL-21 para incrementar la proliferación de las células T CD8+.

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Ejemplo 9 Inhibición de la Proliferación Celular por scFv e IgG

Se sometieron a ensayo los anticuerpos de la invención en un análisis basado en las células para el antagonismo de IL-21R. En uno de tales experimentos, se sometieron a ensayo diferentes clones del fago scFv que habían sido aislados como se describe en los Ejemplos 1-3, en un análisis basado en células en busca de su potencia para inhibir la proliferación celular mediante el bloqueo de la unión de IL-21 a IL-21R. Para semejante análisis se utilizó una suspensión de células hBaf3Mu-1 que expresaban IL21R humano. Se lavaron las células hBaf3Mu-1 (Wyeth) para separar los vestigios de IL-3 murina de su medio de crecimiento y se incubaron durante 2 horas en medio de crecimiento RPMI Glutamax con suero bovino fetal al 10% sin IL-3 a 37ºC en una incubadora con CO_{2} al 5%. Se añadieron aproximadamente de 10.000 a 20.000 células Baf3Mu-1 a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos y después se incubaron con scFv o IgG durante 30 minutos a 37ºC. Luego se añadió IL-21 (Wyeth, Giralda Farms, NJ) a una concentración de 5 ng/ml y las células se incubaron durante 24 horas. Después las células se marcaron con pulsos con 0,1 mCi/pocillo de timidina-H^{3} durante la noche a 37ºC y con posterioridad se cosecharon para medir la incorporación de timidina como indicación de proliferación de las células. En un protocolo alternativo, se añadió IL-21 a una concentración de 0,3 ng/ml y las células se incubaron durante 48 horas. Después las células se calentaron a la temperatura ambiente, y se añadieron 15 ml/pocillo de CellTiter-Glo (Promega, WI). Después de mezclar y de un período de incubación de 10 minutos, se midió la luminescencia en un contador Wallac MicroBeta 1450 TriLux (Perkin Elmer, Boston, MA) como indicación de la proliferación o la viabilidad celular.

Se puede determinar el valor de la CI_{50} (esto es, la concentración de anticuerpo requerida para una competición del 50%) para cada scFv trazando una medida de la proliferación celular, p. ej., la incorporación de timidina, frente al log de la concentración de IL-21. Típicamente, a menor CI_{50}, mejor afinidad tiene el anticuerpo por IL-21R. En un experimento representado en la Fig. 4, MUF inhibió la respuesta celular a IL-21 con una CI_{50} de 2 68 nM en forma de scFv y de 3 nM en forma de IgG. Los valores de la CI_{50} de otros clones de scFv fueron comparados con posterioridad con el de MUF, como se resume en la siguiente Tabla 4.

TABLA 4 Valores de CI_{50} de diferentes scFv

8

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Ejemplo 10 Asimilación a la Línea Germinal de MUF

Los datos de la secuencia para los clones de scFv se utilizaron para identificar la secuencia de la línea germinal más próxima para la cadena pesada y ligera del clon MUF utilizando VBASE. Se realizaron mutaciones utilizando técnicas de mutagénesis dirigida al sitio convencionales con los cebadores mutagénicos apropiados. La mutación de las secuencias de scFv se confirmó mediante análisis de la secuencia. Las secuencias de los dominios scFv y V_{H} y V_{L} asimilados a la línea germinal para MUF se exponen en los SEQ ID NO: 85, 83 y 84, respectivamente.

La secuencia asimilada a la línea germinal de scFv de MUF se analizó con posterioridad en cuanto a su capacidad para bloquear la proliferación de la línea celular hBaf3Mu-1 inducida por IL-21 en el análisis descrito en la presente memoria. No hubo diferencia significativa en la potencia de MUF asimilado a la línea germinal para bloquear la proliferación de las células Baf3Mu-1 cuando se comparó con scFv de MUF no asimilado a la línea germinal.

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Ejemplo 11 Análisis de Competición por el Epítopo

Los clones de scFv 18A5, 19F5 y 18G4 fueron sometidos a ensayo adicionalmente en un análisis de competición por el epítopo para determinar si se unían al mismo o diferente epítopo que MUF. Se prepararon los extractos periplásmicos que contenían scFv como se ha descrito antes para los diferentes clones. El tampón final utilizado fue MOPS 50 mM, pH 7,4, EDTA 0,5 mM, sorbitol 0,5 M. Los extractos periplásmicos brutos que contenían scFv fueron escrutados en busca de su capacidad para inhibir la unión de la proteína de fusión a IL-21R humano biotinilada (bio.hIL21R) a la proteína IgG MuF inmovilizada sobre plástico en un análisis en una placa de microtitulación de 96 pocillos. La unión de bio.hIL21R se detectó con estreptavidina marcada con Europio y se detectó TRF utilizando el kit de reactivos DELFIA (PerkinElmer). Se utilizaron los clones positivos en un análisis de competición por epítopos descrito en la presente memoria.

Los valores de la CI_{50} obtenidos para los diferentes clones en el análisis de competición por los epítopos se resumen en la Tabla 5.

TABLA 5 Análisis de Competición por Epítopos

9

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Ejemplo 12 Tratamiento de la Artritis

Se utilizó la IL-21 para estudiar su efecto sobre las células de la membrana sinovial, la membrana que reviste las articulaciones. Se aislaron sinoviocitos de tipo fibroblasto humanos (HFLS) (Cell Applications (San Diego, CA)) de tejidos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide que habían sido sometidos a cirugía en las articulaciones. Las células HFLS se cultivaron con IL-21 humana durante 48 horas, y los sobrenadantes se separaron y se sometieron a ensayo en busca de las quimioquinas MCP-1 (proteína quimioatrayente de monocitos o CCL11), GRO (oncogén regulado por el crecimiento o ligando 1 de CXC), I-309 (CCL1), TARC (quimioquina reguladora de la actividad del timo), Eotaxina, MDC (quimioquina derivada de macrófagos o CCL22), LYMPH (linfotactina o XCL1), SDF-1 B (factor 1B derivado de células estromáticas o ligando 12 de CXC), IP-10 (ligando 10 de CXC), I-TAC (quimioquina atrayentes de células T o ligando 11 de CXC), MG (monoquina inducida por el interferón o ligando 9 de CXC), MP3B (proteína inhibidora de macrófagos) y citoquinas IFN-\alpha, TNF-\alpha, IL-6, y IL-8 mediante ELISA. Se sabe en la técnica que estas quimioquinas y citoquinas promueven la inflamación a través de numerosas actividades, y que el incremento de concentraciones en las articulaciones causado por la IL-21 exacerba la inflamación y la AR.

Como se muestra en las Figuras 5A-5D, la IL-21 aumentaba repetidamente la secreción por los HFLS de las quimioquinas MCP-1, GRO, 1-309, TARC, Eotaxina, MDC, LYMPH, SDF-1B, IP-10, I-TAC, MG, MP3B y las citoquinas IFN-\alpha, TNF-\alpha, IL-6, e IL-8. Se utilizó la IL-21 para regular el progreso clínico de la AIC (Artritis Inducida por Colágeno). La AIC es el modelo convencional en ratón y rata para estudiar la artritis reumatoide, véase p. ej., Holmdahl et al., (2002) Ageing Res. Rev., 1:135. El día 0, se inyectaron a los ratones 100 \mug de colágeno de Tipo II en coadyuvante completo de Freund, y el día 21, los ratones fueron sensibilizados con 100 \mug de Colágeno de Tipo II en coadyuvante incompleto de Freund. El día 21, también se inyectó diariamente a los ratones 1 \mug de IL-21, y cada día, los ratones fueron examinados en busca de la enfermedad. Los signos clínicos se puntuaron como sigue: 0 = sin hinchazón, 1 = 1 a 2 dedos hinchados o tobillo hinchado, 2 = más de dos dedos hinchados o leve hinchazón de la pata, 3 = considerable hinchazón de la pata, y 4 = anquilosamiento de la pata. Como se muestra en la Figura 5E, los ratones a los que se había inyectado PBS después de las inyecciones de colágeno desarrollaron progresivamente la enfermedad. Los ratones a los que se había inyectado IL-21 después de las inyecciones de colágeno desarrollaron progresivamente una enfermedad más grave. Debido a que el tratamiento con IL-21 exacerba específicamente la AIC, se espera que el tratamiento con anticuerpos anti-IL-21R suprima o retrase la AIC. De este modo, puesto que este modelo pronostica la eficacia del tratamiento para la AR, también cabría esperar que el tratamiento con anticuerpos anti-IL-21R suprimiera o retrasara la AR en seres humanos.

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Ejemplo 13 Tratamiento del Rechazo de Transplantes

El rechazo de transplantes es el fenómeno inmunológico en el que los tejidos de un donante son "atacados" específicamente por las células inmunitarias del anfitrión. Un análisis para estudiar el rechazo de transplantes in vitro es la reacción de linfocitos mezclados (MLR). En el análisis de MLR, se mezclan las células del "donante" y las células del "anfitrión" in vitro, y las células del anfitrión se activan y proliferan. Entre el día 3 y el 5, se añade timidina-H^{3}, y se mide la proliferación por medio de la radiactividad incorporada utilizando un contador de centelleo líquido.

\newpage

En la Figura 6, se suspendieron en 200 \mul de medio de cultivo en un pocillo de una placa de microtitulación células de bazo de ratón C57BL/6J (500.000) y células de bazo de ratón BDF1 irradiadas (500.000). A tres pocillos por duplicado se les añadió un suplemento de diferentes cantidades de IL-21 de ratón. El día 4, se añadió timidina-H^{3}, y el día 5 se midió la radiactividad incorporada utilizando un contador de centelleo líquido LKB 1205. Las muestras "0" y "simulado" indican cultivos sin IL-21. En ausencia de IL-21, las células C57BL/6J proliferaron modestamente (-6000 rads). En presencia de IL-21, las células C57BL/6J proliferaron más fuertemente (~28.000-38.000 rads). El tratamiento con IL-21 aumenta la proliferación de las células C57BL/6J (las células del "anfitrión" o alorreactiva), sugiriendo que IL-21 media en la MLR. Se espera por lo tanto que la adición o el tratamiento con anticuerpos anti-IL-21R suprima o retrase la MLR y el rechazo de transplantes y las enfermedades relacionadas (p. ej., la enfermedad injerto versus anfitrión).

<110> WYETH

\hskip1cm

CAMBRIDGE ANTIBODY TECHNOLOGY

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<120> ANTICUERPOS CONTRA EL RECEPTOR DE IL-21 HUMANO Y SUS USOS

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<130> 08702.0137-00304

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<140>

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<141>

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<150> 60/454,336

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-03-14

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<160> 154

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<170> PatentIn Ver. 3.2

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<210> 1

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<211> 113

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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10

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<210> 2

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<211> 113

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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11

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 253

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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12

1200

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\hskip1cm

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\hskip1cm

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 759

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atctatagtg tcagc

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggctggcc ccttggactc c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaggcggca gcctcagaca atattatgca agt

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtaaaaata agcgaccctc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagtcccggg acagcagtgg taaccatccc ctttatgtc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

25

250

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm

1000

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 417

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 381

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 728

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

33

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtagctatg gcatgcac

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcatggtc agtacgctct tgatatctgg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggccagtc agggtattag tagctggttg gcc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggcatcta ctttagaaag t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caacagagtt acagtacccc gtggacg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 329

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1599

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

38

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 538

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2665

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 529

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2628

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 348

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 327

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 726

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atctatagtg tcagc

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggctggcc ccttggactc c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagggagaca gcctcagaac ttattatgcg age

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtagaaata agaggccctc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaatcccggg cctacagtgg taacctcgta gaa

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212>PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\hskip1cm

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\hskip1cm

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\hskip1cm

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\hskip1cm

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\hskip1cm

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 354

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 330

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 735

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtggttact actggggc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\hskip1cm

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgggggaa ttagcaggcc ggagtac

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaggagaca gcctcagaac ctattatgca age

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtaaacaca aacggccctc a

\hfill

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactcccggg actccagtgg caacccccat gttctg

\hfill

36

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

80

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\hskip1cm

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\hskip1cm

1001

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212>PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\hskip1cm

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 348

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 333

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 732

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atctatagtg tcagc

\hfill

15

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\hskip1cm

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggctggcc ccttggactc c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaggcggca gcctcagaca atattatgca agt

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtaaaaata agcgaccctc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagtcccggg acagcagtgg taaccatccc ctttatgtc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

93

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\hskip1cm

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\hskip1cm

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 330

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 741

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacaactata tacac

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcctttccc catatggtgg ccaactcctc tac

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaggagaca gcctcagaag atattatgca agc

\hfill

33

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtaaaaaca accggccctc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactcccggg acaccagtat taaccatccc gtgata

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\hskip1cm

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\hskip1cm

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\hskip1cm

110

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\hskip1cm

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\hskip1cm

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\hskip1cm

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 354

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 330

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

115

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 735

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctatgcca tgagc

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\hskip1cm

117

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggtggaaac ttccattttt tgcctac

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaggagaca gcctcagaac cttttatgca aac

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtaaaagca accgtccctc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tactcccggg acagaagtgg taaccatcta gggatg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\hskip1cm

122

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\hskip1cm

123

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\hskip1cm

124

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\hskip1cm

125

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\hskip1cm

126

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 363

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

127

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 327

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

128

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 741

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

129

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctatgcca tgagc

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\hskip1cm

130

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catatctcgg aacgtccacg tggtgctttt gatatc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaggagaca gcctcagaaa gtatcatgca act

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtaaaaaca ggcgcccctc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactcccggg acaccagtgg tcttcattat gtc

\hfill

33

Claims (30)

1. Un anticuerpo aislado que ejerce antagonismo sobre la actividad de IL-21R, comprendiendo el anticuerpo una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en 95% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

SEQ ID NO: 1 y 2;

(b)

SEQ ID NO: 3;

(c)

SEQ ID NO: 19 y 20;

(d)

SEQ ID NO: 21;

(e)

SEQ ID NO: 47 y 48;

(f)

SEQ ID NO: 4 9;

(g)

SEQ ID NO: 65 y 66;

(h)

SEQ ID NO: 67;

(i)

SEQ ID NO: 83 y 84;

(j)

SEQ ID NO: 85;

(k)

SEQ ID NO: 101 y 102;

(l)

SEQ ID NO: 103;

(m)

SEQ ID NO: 119 y 120;

(n)

SEQ ID NO: 121;

(o)

SEQ ID NO: 137 y 138; y

(p)

SEQ ID NO: 139,

donde el anticuerpo se une selectivamente sobre un dominio extracelular de un receptor de IL-21 humano o de un receptor de IL-21 que es idéntico al menos en 85% a una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 45.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Un anticuerpo aislado que ejerce antagonismo sobre la actividad de IL-21R, codificado el anticuerpo por una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en 95% a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

SEQ ID NO: 10 y 11;

(b)

SEQ ID NO: 12;

(c)

SEQ ID NO: 2 8 y 29;

(d)

SEQ ID NO: 30;

(e)

SEQ ID NO: 56 y 57;

(f)

SEQ ID NO: 58;

(g)

SEQ ID NO: 74 y 75;

(h)

SEQ ID NO: 76;

(i)

SEQ ID NO: 92 y 93; (j) SEQ ID NO: 94;

(k)

SEQ ID NO: 110 y 111;

(l)

SEQ ID NO: 112;

(m)

SEQ ID NO: 128 y 129;

(n)

SEQ ID NO: 130;

(o)

SEQ ID NO: 14 6 y 147; y

(p)

SEQ ID NO: 148,

donde el anticuerpo se une selectivamente sobre un dominio extracelular de un receptor de IL-21 humano o de un receptor de IL-21 que es idéntico al menos en 85% a una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 45.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Un anticuerpo aislado que ejerce antagonismo sobre la actividad de IL-21R, comprendiendo el anticuerpo:

(a)

un dominio V_{H} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 4, 5, y 6, y un dominio V_{L} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 7, 8 y 9;

(b)

un dominio V_{H} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 22, 23, y 24, y un dominio V_{L} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 25, 26, y 27;

(c)

un dominio V_{H} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 50, 51, y 52, y un dominio V_{L} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 53, 54, y 55;

(d)

un dominio V_{H} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 68, 69, y 70, y un dominio V_{L} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 71, 72, y 73;

(e)

un dominio V_{H} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 86, 87, y 88, y un dominio V_{L} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 89, 90, y 91;

(f)

un dominio V_{H} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 104, 105, y 106, y un dominio V_{L} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 107, 108, y 109;

(g)

un dominio V_{H} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 122, 123, y 124, y un dominio V_{L} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 125, 126, y 127; o

(h)

un dominio V_{H} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 140, 141, y 142, y un dominio V_{L} que comprende secuencias de CDR idénticas al menos en 95% a las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOs: 143, 144, y 145,

donde el anticuerpo se une selectivamente sobre un dominio extracelular de un receptor de IL-21 humano o de un receptor de IL-21 que es idéntico al menos en un 85% a una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 45.

\vskip1.000000\baselineskip

4. Un anticuerpo aislado que ejerce antagonismo sobre la actividad de IL-21R y compite con un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

SEQ ID NO: 1 y 2;

(b)

SEQ ID NO: 3;

(c)

SEQ ID NO: 19 y 20;

(d)

SEQ ID NO: 21;

(e)

SEQ ID NO: 47 y 48;

(f)

SEQ ID NO: 49;

(g)

SEQ ID NO: 65 y 66;

(h)

SEQ ID NO: 67;

(i)

SEQ ID NO: 83 y 84;

(j)

SEQ ID NO: 85;

(k)

SEQ ID NO: 101 y 102;

(l)

SEQ ID NO: 103;

(m)

SEQ ID NO: 119 y 120;

(n)

SEQ ID NO: 121;

(o)

SEQ ID NO: 137 y 138; y

(p)

SEQ ID NO: 139,

donde el anticuerpo se une selectivamente sobre un dominio extracelular de un receptor de IL-21 humano o un receptor de IL-21 que es idéntico al menos en 85% a una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 45.

\vskip1.000000\baselineskip

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, donde el anticuerpo se une selectivamente al dominio extracelular del polipéptido mostrado en el SEQ ID NO: 43.

6. El anticuerpo de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, donde el anticuerpo inhibe la unión de IL-21 a un dominio extracelular de un receptor de IL-21 humano o de un receptor de IL-21 que es idéntico al menos en 85% a una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 45.

7. El anticuerpo de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, donde el anticuerpo es humano.

8. El anticuerpo de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, donde el anticuerpo es un anticuerpo IgG_{1}.

9. El anticuerpo de la reivindicación 8, donde el anticuerpo es IgG_{1\lambda} o IgG_{1\kappa}.

10. Un anticuerpo aislado que ejerce antagonismo sobre la actividad de IL-21R, expresado el anticuerpo por una célula anfitriona que tiene un Núm. de Designación de Depósito en la ATCC PTA-5030 o PTA-5031.

11. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, y un excipiente farmacéutico.

12. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de la reivindicación 1, 2, 3, o 4.

13. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 12.

14. Una célula anfitriona transformada con el vector de la reivindicación 13.

15. La célula anfitriona de la reivindicación 14, donde el anfitrión es una bacteria, una célula de mamífero, una célula de levadura, una célula vegetal, o una célula de insecto.

16. Una célula anfitriona que tiene un Núm. de Designación de Depósito en la ATCC PTA-5030 o PTA-5031.

17. Un método de producción de un anticuerpo que se une a un receptor de IL-21, comprendiendo el método cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 16 en condiciones que permiten la expresión del anticuerpo, y aislar el anticuerpo del cultivo celular.

18. El uso del anticuerpo de la reivindicación 1, 2, 3 o 4 para la fabricación de un medicamento para regular una respuesta inmunitaria, donde la respuesta inmunitaria comprende proliferación, actividad citolítica, secreción de citoquinas, o secreción de quimioquinas de una célula.

19. El uso de la reivindicación 18, donde la célula es un leucocito o una célula sinovial.

20. El uso de la reivindicación 19, donde el leucocito es una célula T, una célula B, una célula NK, o un macrófago.

21. El uso del anticuerpo de la reivindicación 1, 2, 3 o 4, en una cantidad suficiente para tratar o prevenir un trastorno asociado a las células inmunitarias en un sujeto para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir el trastorno asociado a las células inmunitarias en el sujeto, donde el trastorno asociado a las células inmunitarias se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso generalizado, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, rechazo de transplantes, enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis y enfermedad de Crohn.

22. El uso de la reivindicación 21, donde el trastorno asociado a las células inmunitarias se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn y psoriasis.

23. El uso de la reivindicación 21, donde el medicamento comprende adicionalmente un agente terapéutico adicional.

24. El uso de la reivindicación 23, donde el agente terapéutico adicional se selecciona entre un inhibidor de citoquina, un inhibidor de un factor de crecimiento, un inmunosupresor, un agente anti-inflamatorio, un inhibidor metabólico, un inhibidor enzimático, un agente citotóxico, y un agente citostático.

25. El uso de la reivindicación 24, donde el agente terapéutico adicional se selecciona entre un antagonista de TNF, un antagonista de IL-12, un antagonista de IL-15, un antagonista de IL-17, un antagonista de IL-18, un antagonista de IL-22, un agente de depleción de células T, un agente de depleción de células B, metotrexato, leflunomida, rapamicina, o uno de sus análogos, un inhibidor de Cox-2, un inhibidor de cPLA2, un AINE, y un inhibidor de p38.

26. El uso del anticuerpo de la reivindicación 1, 2, 3 o 4, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno hiperproliferativo en un sujeto en una cantidad suficiente para inhibir o reducir la hiperproliferación de células sensibles a IL-21 y/o receptor de IL-21 en el sujeto, donde el trastorno hiperproliferativo se selecciona del grupo que consiste en cánceres leucémicos y tumores de la sangre, la médula ósea, y el tejido linfático.

27. El uso de la reivindicación 26, donde el sujeto es un mamífero.

28. El uso de la reivindicación 27, donde el sujeto es un ser humano.

29. El uso de acuerdo con la reivindicación 21 o la reivindicación 25, donde el anticuerpo se utiliza en un intervalo seleccionado entre 1 \mug/kg a 20 mg/kg, 1 \mug/kg a 10 mg/kg, 1 \mug/kg a 1 mg/kg, 10 \mug/kg a 1 mg/kg, 10 \mug/kg a 100 \mug/kg, 100 \mug/kg a 1 mg/kg, y 500 \mug/kg a 1 mg/kg.

30. Un kit de diagnóstico que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1, 2, 3 o 4.