ES2340377T3 - Procedimiento para el cultivo de celulas para la produccion de substancias. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para el cultivo de células de mamíferos para la producción de substancias, caracterizado porque, se cultivan unas células de mamíferos que producen una substancia, con una limitación de glucosa, en donde el grado de limitación de la glucosa, DGL, es DGL = qGlc/qGlcmáx siendo qGlc = grado de consumo específico de glucosa observado en el momento, y qGlcmáx = grado de consumo máximo específico de glucosa conocido para estas células, mayor que el grado de limitación de glucosa que conduce al mantenimiento exclusivo, DGLmantenimiento, de las células, y es <=q 0,5, en donde DGLmantenimiento = qGlcmantenimiento/qGlcmáx, siendo qGlcmantenimiento = en un metabolismo de mantenimiento puro, grado de consumo específico de glucosa observado, y qGlcmáx = máximo grado de consumo específico de glucosa conocido para estas células, en donde la cantidad de glucosa suministrada durante el procedimiento se mantiene constante.
Description
Procedimiento para el cultivo de células para la
producción de substancias.
La invención se refiere a un procedimiento para
el cultivo de células para la producción de substancias según el
concepto general de la reivindicación 1.
En la producción de substancias, en particular
de proteínas, se emplean cultivos celulares en procesos
fermentativos. A este respecto, dichos procesos se diferencian de
aquellos en que los cultivos celulares permanecen genéticamente
invariables, y forman algunos productos de metabolismo, y de
aquellos en que los organismos se modifican genéticamente de tal
forma que o bien multiplican substancias propias, por ejemplo
proteínas, o bien producen substancias extrañas, por ejemplo
proteínas. Los organismos que producen las substancias se alimentan
para ello con un medio nutritivo, el cual garantiza la
supervivencia de los organismos y hace posible la producción del
compuesto diana deseado. Para esta finalidad se conoce un gran
número de medios de cultivo, que hacen posible la fermentación. Uno
de los componentes más importante de los medios de cultivo es la
glucosa. Según el estado actual de la técnica, se procura conseguir
en una mezcla de fermentación que se mantenga una mínima
concentración de glucosa correctamente, para optimizar el
rendimiento del compuesto diana. La solicitud de patente japonesa
001 101 882 A, da a conocer un procedimiento de cultivo para
células de mamíferos en el cual se mantiene constante una mínima
concentración de 0,2 mmoles/litro de glucosa. La patente US 544 39
68 da a conocer un procedimiento de cultivo en el cual tiene lugar
una limitación de la glucosa. El procedimiento no conduce sin
embargo a un mayor grado específico de producción de las células
respecto a una alimentación no limitante.
En la patente WO 98/41611 se describe un método
para el cultivo de células que crecen en suspensión, mediante la
adición de glucosa, en donde la cantidad de glucosa añadida se
adecua siempre al estado momentáneo del cultivo.
Una finalidad de la invención es el de descubrir
un procedimiento para el cultivo para la creación de células, con
el cual aumente la productividad de las células individuales en el
producto, y cómo hacer posible una alta densidad celular. Debe ser
posible un alto rendimiento de la relación espacio/tiempo en el
producto.
El procedimiento debe ser particularmente
sencillo en su ejecución, unido a un mínimo gasto de medidas y de
reglas, y particularmente económico.
Partiendo del concepto general de la
reivindicación 1, se resuelve sorprendentemente la tarea, efectuando
el cultivo de una línea celular que produce la substancia, mediante
la alimentación con un medio nutritivo de manera que se ajuste en
la solución del cultivo una limitación de glucosa. El grado de
limitación de la glucosa puede definirse como la relación entre el
grado de consumo específico de glucosa observado y el máximo grado
de consumo de glucosa conocido para estas células. El grado de
limitación de glucosa DGL = qGlc/qGlc_{máx} (qGlc = grado de
consumo específico de glucosa observado en el momento; qGlc_{máx}
= máximo grado de consumo específico de glucosa conocido para estas
células). El DGL está entre los límites DGL_{mantenimiento} y 1,
en donde el DGL_{mantenimiento} significa la limitación completa
del crecimiento y 1 significa ninguna limitación o respectivamente,
el exceso completo de glucosa.
Juntamente con la limitación de glucosa tiene
lugar un continuo retroceso de la concentración de glucosa residual
en una concentración estacionaría de la solución de cultivo, la cual
es mayor de 0 mmoles/litro pero menor de 1 mmol/litro, de
preferencia menor de 0,5 mmoles/litro. Hay que hacer notar que con
la disminución del DGL se puede obtener otro aumento de la densidad
de células vivas en el recipiente de cultivo. Con una limitación
creciente de glucosa converge entonces la densidad celular hacia un
valor máximo. De ello resulta que el grado de limitación de la
glucosa converge hacia un valor mínimo, con lo cual el DGL según la
invención es mayor o igual que el DGL que conduce al mantenimiento
de las células (metabolismo de mantenimiento).
DGL_{mantenimiento} =
qGlc_{mantenimiento}/qGlc_{max} (qGlc_{mantenimiento} = en el
caso de metabolismo de mantenimiento puro, grado de consumo
específico de glucosa observado; qGlc_{máx} = grado de consumo
máximo de glucosa específico conocido para estas células), y la
inferior a 0,5, de preferencia inferior a 0,4, con particular
preferencia inferior a 0,3.
Es característico sin embargo, que con la
disminución de la concentración de glucosa no se logra ninguna
disminución de la concentración de células en la solución. Con una
creciente limitación de las glucosa, a saber con valores
decrecientes del DGL, aumenta la productividad específica de una
célula. Puesto que la densidad de células vivas en el recipiente de
cultivo no disminuye, esto conduce a un aumento del rendimiento
espacio-tiempo. Con la incorporación de la
limitación de las glucosa, tiene lugar fenomenológicamente una
disminución del grado de formación específico de lactato. El grado
de formación de lactato converge hacia un valor mínimo. Esto
conduce a que la concentración de lactato residual en el recipiente
de cultivo disminuya, máximo hasta 0. Con la limitación de la
glucosa tiene lugar pues, una alteración del metabolismo
celular.
Es importante que antes del empleo de la
limitación de la glucosa no tenga lugar ninguna otra limitación de
otro substrato. Por lo tanto el medio de crecimiento debe estar
creado de modo que la glucosa sea limitada en primer lugar.
Con el procedimiento según la invención se
aumenta el rendimiento espacio/tiempo para una densidad celular
dada. Mediante el procedimiento según la invención la cantidad de
glucosa disponible por célula disminuye de forma que la glucosa se
incorpora principalmente al metabolismo de mantenimiento y unido a
la misma el producto, y se incorpora menos en el crecimiento
celular. El procedimiento según la invención no requiere por lo
tanto ninguna regulación del suministro de glucosa, de manera que el
procedimiento es particularmente fácil, puesto que puede
prescindirse de una costosa regulación de la glucosa. Puesto que es
necesaria una menor entrada del medio, se ahorra en el coste de la
glucosa, puesto que es necesaria menos glucosa. Además, se logra
una muy alta concentración del producto. Esto puede conducir a una
disminución de los costes de retoque. El procedimiento según la
invención hace posible en particular el aumento de la producción de
proteínas, sin que además deba modificarse genéticamente una línea
celular para la transformación del procedimiento según la
invención. El aumento del título del producto hace posible la
producción de la cantidad deseada de producto en un volumen de
cultivo más pequeño, lo cual conduce a unos menores costes de
inversión.
El procedimiento según la invención puede
efectuarse según los siguientes pasos de procedimiento:
Las células deben cultivarse en un procedimiento
continuo con separación de las células, por ejemplo, con un filtro
centrífugo (cultivo por perfusión). Para ello son apropiadas todas
las clases corrientes de recipientes de cultivo, como por ejemplo
una caldera con agitación, y mecanismos de separación de las
células, como por ejemplo filtros centrífugos, ultrasonidos o
decantadores. De preferencia el sistema de cultivo debe hacer
posible altas densidades celulares. De preferencia se efectúa una
separación de las células, con el fin de que la densidad celular
cuando actúe la limitación de la glucosa no pueda disminuir. Esto
conduce a que cuando la densidad de las células vivas aumenta y se
mantiene la alimentación de la glucosa, el DGL disminuye de nuevo.
Una alta densidad celular hace posible una disminución del DGL por
debajo de un valor de 0,4 con un grado de caudal ajustado a un
orden de magnitud del grado máximo de crecimiento. Así pueden
emplearse por ejemplo grados de caudal de 0,03 - 0,05 h^{-1} para
las células CHO
MUC2-GFP-C-term
empleadas, así como también para las células
CHO/MUC1-IgG2a PH3744/25 empleadas.
Para conseguir una disminución del DGL, se puede
proceder a la estrategia de alimentación con glucosa según lo
siguiente: la cantidad de glucosa a suministrar no aumenta con un
aumento de la densidad de células vivas para evitar una limitación
de las glucosa. Antes bien, la cantidad de glucosa a suministrar
durante el proceso se mantiene constante desde el principio. Por
esto la cantidad de glucosa a suministrar debe escogerse de tal
manera que el DGL no sobrepase los valores requeridos, a saber que
el DGL sea \leq 0,5, de preferencia \leq 0,4, con particular
preferencia \leq 0,3. De ello resulta que la cantidad de glucosa a
suministrar no es de preferencia superior al 50%, con más
preferencia no superior al 35%, lo cual es lo que el sistema puede
consumir como máximo para un número de células vivas que cabe
esperar en una convencional conducción del proceso no limitador de
glucosa. Después de la modificación del metabolismo de las células
(metabolismo de lactato y productividad), puede elevarse lentamente
la cantidad de glucosa a suministrar, aunque no debe ser posible un
DGL superior a 0,5, de preferencia no superior a 0,4. Esto conduce a
un posterior aumento de la densidad de las células vivas
manteniendo una alta productividad y con ello un rendimiento mayor
del espacio/tiempo. La cantidad de glucosa suministrada puede ser
influida en un proceso continuo mediante la velocidad de entrada
del medio y la concentración de glucosa en el medio de alimentación.
Es decisivo que el caudal de masa de glucosa transportada durante
el proceso no aumente o aumente solamente de tal medida que el DGL
alcance un valor más pequeño de 0,5, de preferencia menor de 0,4, ó
quede por debajo de estos valores y ya no los sobrepase.
En las reivindicaciones subordinadas se
mencionan ventajosos perfeccionamientos.
A partir de ahora, la invención se describirá en
sus detalles individuales.
Las figuras muestran resultados de pruebas como
ejemplo.
En las mismas se muestra:
Figura 1: Aumento del número de células vivas
[ml^{-1}] y representación del grado de fluido medio [h^{-1}]
con respecto al tiempo de proceso [h] para la producción de
MUC1-IgG2a de células CHO MUC1/IgG2a PH3744/25 en
un reactor de perfusión.
Figura 2: Productividad específica de las
células MUC1-IgG2a [\mug/h*E9] y DGL con respecto
al tiempo de proceso en el reactor de perfusión.
Figura 3: Aumento del número de células vivas
[ml^{-1}] y mM de glucosa residual, aplicado respecto al tiempo
de proceso [h], para la producción de MUC1-IgG2a de
células CHO MUC1/IgG2a PH3744/25 en el reactor de perfusión.
Figura 4: Concentración de glucosa y lactato así
como concentración de glucosa en la entrada del medio
[mmoles/litro], aplicada respecto al tiempo de proceso [h], para la
producción de MUC1-IgG2a de células CHO MUC1/
IgG2a PH3744 en el reactor de perfusión.
IgG2a PH3744 en el reactor de perfusión.
Figura 5: aumento de la concentración de
MUC1-IgG2a [\mug/ml] y qMUC1-IgG2a
[células \mug/h*E9] con respecto al tiempo [h], para la
producción de MUC1-IgG2a a partir de células CHO
MUC1/IgG2a PH3744/25 en el reactor de perfusión.
Figura 6: aumento del número de células vivas
[ml^{-1}] y representación del grado de caudal del medio
[h^{-1}] con respecto al tiempo de proceso [h], para la
producción de
MUC2-GFP-C-term a
partir de células CHO
MUC2-GFP-C-term en
el reactor de perfusión.
Figura 7: productividad específica de
MUC2-GFP-C-term [n
moles/células h*E9] y DGL con respecto al tiempo de proceso, en el
reactor de perfusión.
Figura 8: aumento del número de células vivas
[ml^{-1}] y glucosa residual [mM], aplicado con respecto al
tiempo de proceso [h], para la producción de
MUC2-GFP-C-term a
partir de células CHO
MUC2-GFP-C-term en
el reactor de perfusión.
Figura 9: concentración de glucosa y de lactato
así como concentración de glucosa en la entrada del medio
[mmol/litro], aplicada con respecto al tiempo de proceso [h], para
la producción de
MUC2-GFP-C-term a
partir de células CHO
MUC2-GFP-C-term en
el reactor de perfusión.
Figura 10: aumento de la concentración de
MUC2-GFP-C-term [nM]
y qMUC2-GFP-C-term
[nmol/células h*E9] con respecto al tiempo [h], para la producción
de MUC2-GFP-C-term a
partir de células CHO
MUC2-GFP-C-term en
el reactor de perfusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, en la tabla 1 se muestran los datos del
ensayo a partir del empleo del procedimiento según la invención con
las células CHO MUC1/IgG2a PH 3744/25.
En la tabla 2 se representan los datos del
ensayo a partir del empleo del procedimiento según la invención con
las células CHO
MUC2-GFP-C-term.
El procedimiento según la invención puede
efectuarse con diferentes líneas celulares de producción. Las líneas
celulares pueden emplearse como tipo salvaje o como células
recombinantes genéticamente modificadas. La modificación genética
puede tener lugar por ejemplo por inserción de genes adicionales del
mismo organismo o de otro organismo en el ADN, o de un vector, o en
el reforzamiento de la actividad o respectivamente expresión de un
gen mediante la incorporación de un promotor activo, por ejemplo a
partir del CMV. Los genes pueden codificar diferentes proteínas,
como por ejemplo proteínas como proteínas de fusión, o como
anticuerpos.
Pueden citarse como ejemplo las siguientes
líneas celulares: células de mamíferos, como líneas de células CHO,
como por ejemplo CHO-K1, BHK, como
BHK-21, hibridomas, NS/O, otras células de mieloma,
y células de insectos u otras células superiores. Es
particularmente preferido el empleo de células que de preferencia,
no copulan con el crecimiento.
Una línea celular CHO recombinante cuya
productividad puede aumentar con el procedimiento según la
invención, es la línea celular CHO MUC1/IgG2a, PH 3744/25, con la
cual puede segregarse la glicoproteína MUC1-IgG2a.
Otra línea celular CHO, a saber la CHO
MUC2-GFP-C-term, es
capaz de segregar de forma creciente una proteína de fusión
MUC2-GFP-C-term,
cuando es sometida al procedimiento según la invención.
Como medio de cultivo puede emplearse en
principio cualquier medio que contenga glucosa, que no sea limitante
con respecto a otros componentes. A manera de ejemplo puede citarse
el ProCHO4-CDM. Pueden emplearse también medios a
base de recetas ya conocidas como por ejemplo el IMDM, DMEM ó F12 de
Ham, los cuales han sido optimizados por el procedimiento según la
invención, de forma que solamente hay limitación para la glucosa.
Esto puede lograrse por ejemplo concentrando más los otros
componentes en relación con la glucosa. En general, es también
posible dosificar la glucosa separadamente del medio.
La zona del pH está de preferencia entre
6,7-7,7, con particular preferencia entre
7-7,3. Sin embargo, son también posibles otros
intervalos de pH.
El intervalo de temperaturas está de preferencia
entre 35ºC-38,5ºC, con particular preferencia 37ºC
para CHO MUC1-IgG2a. Sin embargo son también
posibles otros intervalos de temperatura, como por ejemplo <
35ºC, en los que no se produzca la destrucción irreversible del
producto.
Con el procedimiento de cultivo según la
invención se pueden producir substancias como por ejemplo,
glicoproteínas, proteínas de fusión, anticuerpos, proteínas en
general, de las cuales pueden citarse como ejemplo,
MUC1-IgG2a,
MUC2-GFP-C-term,
EPO, interferonas, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, PA,
inmunoglobulinas o fragmentos de
inmuno-globulinas.
La figura 1 muestra el transcurso de la densidad
de células vivas (cv) en células CHO/MUC1-IgG2a y el
grado de caudal del medio (D) con respecto al tiempo de proceso
(h), en el reactor de perfusión. En la misma, son:
- \sqbullet
- grado de caudal del medio (litros/hora), y
- \bullet
- densidad de las células vivas.
\newpage
La figura 2 muestra la productividad específica
de MUC1-IgG2a (qMUC1-IgG2a) y DGL
con respecto al tiempo de proceso, en el reactor de perfusión. En
el mismo son:
- - - - - - -
- productividad específica (\mug/células hE9),
- ------
- DGL (grado de limitación de la glucosa)
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 3 muestra una gráfica en la cual, en
el lado izquierdo está representado el número de células vivas
[ml^{-1}] y en el lado derecho está representada la concentración
de la glucosa residual [mM] respecto al tiempo de proceso [h] para
la producción de MUC1-IgG2 en CHO MUC/IgG2a
PH3744/25. En la misma son:
- \Box
- número de células vivas, y
- \lozenge
- glucosa
\vskip1.000000\baselineskip
En la figura 4, está representada la
concentración de glucosa y de lactato, así como la concentración de
glucosa en la entrada del medio [mmoles/litro] respecto al tiempo
de proceso [h]. En la misma, las curvas son:
- \Box
- curvas de la concentración de lactato, y
- \lozenge
- curvas de la concentración de glucosa.
- x
- 23,9 mmoles/litro concentración de glucosa en la entrada del medio (grado de caudal D = 0, 035 h^{-1}).
\vskip1.000000\baselineskip
En la figura 5, está representada la
concentración de MUC1-IgG2a [\mug/ml] sobre el
lado izquierdo, así como qMUC1-IgG2a
[\mug/(células h*E9) sobre el lado derecho de la gráfica, respecto
al tiempo [h]. En la misma son:
- \bullet
- productividad específica q de MUC1-IgG2a (\mug/células hE9), y
- \lozenge
- concentración de MUC1-IgG2a (mg/litro).
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 6 muestra el transcurso de la densidad
de células vivas (cv) de células CHO/MUC2-GFP y el
caudal del medio (D) respecto al tiempo de proceso (h), en el
reactor de perfusión. En la misma, son:
- ^{\blacksquare}
- caudal del medio (litros/hora), y
- \bullet
- densidad de las células vivas (litros/ml)
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 7 muestra la productividad específica
de MUC2-GFP-C-term
(qMUC2-GFP-C-term) y
DGL respecto al tiempo de proceso, en el reactor de perfusión. En
la misma son:
- - - - - - -
- productividad específica (nmoles/células hE9),
- ------
- DGL (degree of glucose limitation)("grado de limitación de la glucosa")
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 8 muestra una gráfica en la cual, en
el lado izquierdo está representado el número de células vivas
[ml^{-1}] y en el lado derecho está representada la concentración
de la glucosa residual [mM] respecto al tiempo de proceso [h], para
la producción de
MUC2-GFP-C-term en
CHO MUC/IgG2a PH3744/25. En la misma son:
- \Box
- número de células vivas, y
- \lozenge
- glucosa
\vskip1.000000\baselineskip
En la figura 9, está representada la
concentración de glucosa y de lactato, así como la concentración de
glucosa en la entrada del medio [mmoles/litro] respecto al tiempo
de proceso [h]. En la misma, las curvas son:
- \Box
- curvas de la concentración de lactato, y
- \lozenge
- curvas de la concentración de glucosa.
- x
- 23,9 mmoles/litro concentración de glucosa en la entrada del medio (grado de caudal D = 0, 035 h^{-1}).
\vskip1.000000\baselineskip
En la figura 10 la concentración de
MUC2-GFP-C-term [nM]
está representada sobre el lado izquierdo así como
qMUC2-GFP-C-term
[nmoles/(células h*E9)] está representado sobre el lado derecho de
la gráfica respecto al tiempo [h]. En la misma son:
- \bullet
- productividad específica q de MUC2-GFP-C-term (nmoles/células hE9), y
- \lozenge
- concentración de MUC2-GFP-C-term (nM).
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 muestra el procedimiento según la
invención como ejemplo correspondiente a la alimentación de
glucosa. En un cultivo de perfusión en continuo, se alimenta una
cantidad constante de glucosa. En el ejemplo mostrado esto se logra
mediante un caudal constante del medio, por lo que la concentración
de glucosa en la entrada del medio es constante. El grado de caudal
del medio no aumenta al aumentar la densidad de células vivas. El
procedimiento empezó como un procedimiento discontinuo por partidas
antes de empezar el procedimiento en forma continua.
La figura 2 muestra que en esta forma de
procedimiento, el DGL disminuye en el transcurso del procedimiento,
y finalmente alcanza un valor por debajo de 0,4. Mientras esto
sucede, aumenta la productividad específica y alcanza finalmente un
valor de alrededor de 4 veces mayor que el valor del DGL por debajo
de 0,4.
A partir de la figura 3 se desprende que en el
procedimiento según la invención la densidad de células vivas corre
hacia un valor máximo el cual puede mantenerse a continuación,
mientras que la concentración de glucosa residual en el transcurso
del ensayo va hacia cero. Esto ocurre aunque la glucosa se
incorpore. Durante la disminución de la concentración de glucosa
residual empieza a disminuir la absorción específica de glucosa por
el organismo. Mientras tanto el número de células vivas puede
todavía aumentar. Paralelamente al retroceso de la absorción
específica de glucosa, disminuye también la formación específica de
lactato, lo cual conduce en primer lugar a un aumento ralentizado,
y a continuación a una caída de la concentración de lactato en el
recipiente de cultivo. Finalmente la concentración de lactato en el
recipiente de cultivo va hacia cero, como se desprende de la figura
4. Existe por lo tanto una clara alteración del metabolismo de las
células. Como se desprende de la figura 5, unido a la
transformación del metabolismo de las células tiene lugar un aumento
de la productividad específica de aproximadamente 4 veces respecto
al momento anterior a la transformación del metabolismo de las
células. El aumento de la productividad específica con por lo menos
las densidades de las células constantes o incluso todavía
crecientes, durante la fase descrita, conduce finalmente a un
marcado aumento del título del producto en el sobrenadante del
cultivo, como se desprende de la figura 5, y con ello a un aumento
del rendimiento espacio/tiempo.
La tabla 1 muestra datos de la fermentación de
MUC1-IgG2a.
Análogamente a las figuras 1 a 5, las figuras de
6 a 10 describen los resultados del empleo del procedimiento según
la invención con las células CHO
MUC2-GFP-C-term.
La tabla 2 muestra datos de la fermentación de
MUC2-GFP-C-term.
La técnica de producción puede hacer que el
procedimiento funcione según la invención con el procedimiento de
perfusión que se acaba de describir, pero puede funcionar además
también con el sistema "Fed Batch" ("alimentación por
partidas") (procedimiento de alimentación).
En un funcionamiento por
Fed-Batch, el cultivo de producción, es abastecido
una vez o repetidas veces, respectivamente por partidas o en
contínuo con un medio que contiene glucosa o una solución de glucosa
por separado, de forma y manera que el DGL está de preferencia por
debajo del valor 0,5, con particular preferencia por debajo de 0,4
y todavía con mayor preferencia por debajo de 0,3. Es posible
también aquí un "Fed Batch" repetitivo.
Tanto en el sistema de procedimiento por
perfusión como también en el sistema Fed-Batch, el
proceso puede empezar en todas las formas de procedimiento
generalmente conocidas. Así antes del principio de la forma de
procedimiento según la invención, el cultivo puede funcionar como
por partidas, como Fed Batch o como procedimiento en contínuo, con
o también sin separación de las células.
Claims (15)
1. Procedimiento para el cultivo de células de
mamíferos para la producción de substancias, caracterizado
porque, se cultivan unas células de mamíferos que producen una
substancia, con una limitación de glucosa, en donde el grado de
limitación de la glucosa, DGL, es
DGL =
qGlc/qGlc_{máx}
siendo
qGlc = grado de consumo específico de glucosa
observado en el momento, y
qGlc_{máx} = grado de consumo máximo
específico de glucosa conocido para estas células,
mayor que el grado de limitación de glucosa que
conduce al mantenimiento exclusivo, DGL_{mantenimiento}, de las
células, y es \leq 0,5, en donde
DGL_{mantenimiento} =
qGlc_{mantenimiento}/qGlc_{máx},
siendo
qGlc_{mantenimiento} = en un metabolismo de
mantenimiento puro, grado de consumo específico de glucosa
observado, y
qGlc_{máx} = máximo grado de consumo
específico de glucosa conocido para estas células,
en donde la cantidad de glucosa suministrada
durante el procedimiento se mantiene constante.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque, el DGL es \leq 0,4 ó \leq 0,3.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque, la cantidad de glucosa suministrada no
es mayor del 50% de la que pueden consumir como máximo sin la
limitación de la glucosa, el número máximo de células
esperadas.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque, la cantidad de glucosa suministrada no
es mayor del 35%, de la que pueden consumir como máximo sin la
limitación de glucosa, el número máximo de células esperadas.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque, se emplea un
componente del grupo de las líneas celulares CHO, como por ejemplo
CHO-K1, BHK, como por ejemplo
BHK-21, hibridoma, células de mieloma, como por
ejemplo NS/O, otras células de mamíferos y células de insectos u
otras células superiores.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque, las substancias
producidas son proteínas o polipéptidos.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque, las substancias producidas son
proteínas de fusión, la proteína de fusión
MUC1-IgG2a, la glicoproteína
MUC2-GFP-C-term,
EPO, interferones, citocinas, factores de crecimiento, hormonas,
PA, inmunoglobulinas, fragmentos de inmunoglobulinas u otras
glicoproteínas.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque, se emplea un
medio que contiene glucosa el cual, respecto a otros componentes de
substancias nutritivas no efectúa ninguna otra limitación antes del
comienzo de la limitación de glucosa.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque, la glucosa se suministra separadamente
de los otros substratos.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque, se efectúa en
un intervalo de pH de 6,7-7,7.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque, se efectúa en
un intervalo de temperaturas entre 35ºC y 38,5ºC.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque, se efectúa de
acuerdo con la modalidad continua de procedimiento, con por lo
menos una separación parcial de las células.
\newpage
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque, se efectúa de
acuerdo con el procedimiento de Fed-Batch.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque, da comienzo
como un procedimiento por partidas y se continúa como un
procedimiento de Fed-Batch o un procedimiento en
continuo.
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque, se efectúa con
células productoras que no copulan con el crecimiento.
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