ES2341432T3 - Nueva glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. - Google Patents
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Abstract
ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por: (a) una secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº:11; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos representa por la SEC ID nº:12 o (c) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que presenta una homología del 95% o superior con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº:2, y que presenta actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, en el que está presente una treonina en la posición 213.
Description
Nueva
glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa.
La presente invención se refiere a una nueva
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (en
adelante denominada "G6PD") obtenida a partir de una bacteria
perteneciente al género Corynebacterium, un ADN que codifica
dicha enzima, un ADN recombinante que comprende el ADN, un
transformante que comprende el ADN recombinante, un transformante
que comprende el ADN en su cromosoma y un procedimiento para
producir un L-aminoácido que comprende el cultivo
del transformante descrito en las reivindicaciones.
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Para obtener una cepa bacteriana que produzca un
aminoácido con eficacia, es importante conocer las propiedades de
los genes relacionados con la biosíntesis del aminoácido en las
bacterias y su forma de controlar la expresión y la actividad, y
llevar a cabo un cultivo racional basándose en estas
características.
Uno de los procedimientos más importantes para
comprender las funciones de los genes relacionadas con la producción
de aminoácidos es, por ejemplo, un procedimiento genético en el que
se dilucida la relación entre el incremento o el decremento de la
productividad de aminoácidos y la mutación génica.
El cultivo de microorganismos productores de
aminoácidos se realiza principalmente confiriendo resistencia a
fármacos tales como los análogos de aminoácidos y otros, pero en
muchos casos, no está claro qué gen contribuye a incrementar la
productividad a través de su mutación.
Se necesita NADPH como coenzima en la reacción
de reducción de la biosíntesis de aminoácidos de muchos
microorganismos. Por ejemplo, se necesitan 4 moléculas de NADPH
para la biosíntesis de 1 molécula de L-lisina. De la
misma manera, se necesitan 3 moléculas de NADPH para 1 molécula de
treonina y 5 moléculas de NADPH para 1 molécula de isoleucina. Por
lo tanto, se necesitan dos o más moléculas de NADPH para la
biosíntesis de 1 molécula de la mayoría de aminoácidos. En
consecuencia, el suministro de NADPH es una cuestión importante en
la producción de estos aminoácidos utilizando microorganismos.
En muchos microorganismos, las enzimas que
suministran NADPH son limitadas. Se considera que las enzimas que
pueden suministrar NADPH en las vías principales del metabolismo de
los azúcares de los microorganismos son principalmente la G6PD [EC
1.1.1.49] y la 6-fosfogluconato deshidrogenasa [EC
1.1.1.4] en la vía de la pentosa fostato (HMP), y la isocitrato
deshidrogenasa [EC 1.1.1.41] en la vía del TCA.
Particularmente, la G6PD, que es la primera
enzima de la HMP y también la enzima del punto de división de la
vía de Embden-Meyerhof (EMP), es considerada una
enzima muy importante para la producción de diversos aminoácidos
por bacterias pertenecientes al género Escherichia y el
género Corynebacterium, y se han llevado a cabo varios
análisis sobre sus diversas propiedades bioquímicas. Por ejemplo, la
G6PD de bacterias pertenecientes al género Corynebacterium
se describe en el documento Journal of Bacteriology, 98, 1151
(1969), Agricultural and Biological Chemistry, 51, 101
(1987) y en la solicitud de patente japonesa publicada sin examinar
n.º 224661/97, pero no se ha dado a conocer ninguna investigación
sobre mejora de la productividad de aminoácidos mediante la
enzima.
Asimismo, se ha determinado la secuencia de
nucleótidos de la G6PD de bacterias tales como Escherichia
coli y Corynebacterium glutamicum (Journal of
Bacteriology, 173, 968 (1991) y solicitud de patente japonesa
publicada sin examinar n.º 224661/97), pero no se ha dado a conocer
ninguna investigación sobre mejora de la productividad de
aminoácidos mediante el gen.
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Un objetivo de la presente invención consiste en
producir L-aminoácidos a nivel industrial de manera
ventajosa, utilizando la G6PD en relación con la biosíntesis de
L-aminoácidos, un ADN que codifica la enzima, un ADN
recombinante obtenido insertando el ADN en un vector o un
transformante que comprende el ADN recombinante, para incrementar
de ese modo aún más la productividad de
L-aminoácidos de un microorganismo.
En el contexto de la presente invención se ha
aislado con éxito un ADN que codifica un polipéptido que comprende
la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº:2, y se ha
determinado que puede utilizarse en la producción de
L-aminoácidos. Asimismo, como resultado de estudios
exhaustivos, se ha determinado que un polipéptido en el que el
aminoácido Ala de la posición 213 de la secuencia de aminoácidos
representada por SEC ID nº:2 es sustituido por otro aminoácido y
que presenta actividad G6PD puede aumentar todavía más la
productividad del L-aminoácido. Por lo tanto, la
presente invención ha cumplido con su objetivo. En particular, la
presente invención se refiere a los elementos (1) a (21) siguientes
y se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas.
- (1)
- Polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que el aminoácido Ala en la posición 213 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº:2 es sustituido por la treonina, y presenta actividad G6PD.
- (2)
- Polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº:12.
- (3)
- Polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos, en la que se elimina, se sustituye o se añade uno o varios aminoácidos distintos al resto de aminoácido situado en la posición 213 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido del tipo (1), que presenta actividad G6PD y una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº:2.
- (4)
- Polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº:12.
- (5)
- ADN que codifica los polipéptidos de cualquiera de los tipos (1) a (4).
- (6)
- ADN que comprende una secuencia de nucleótidos, en la que una secuencia de nucleótidos entre las posiciones 637 y 639 que codifica el aminoácido Ala de la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº:1 es sustituida por un codón que codifica un aminoácido distinto a la Ala.
- (7)
- ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº:11.
- (8)
- ADN recombinante que se puede obtener insertando el ADN de cualquiera de los tipos (5) a (7) en un vector.
- (9)
- ADN recombinante del tipo (8), en el que el ADN recombinante es replicable en un microorganismo perteneciente al género Escherichia o al género Corynebacterium.
- (10)
- Plásmido pCRBzwfM contenido en Escherichia coli TOP10 (FERM BP-7135).
- (11)
- Transformante que se puede obtener introduciendo el ADN o el plásmido recombinante de cualquiera de los tipos (8) a (10) dentro de una célula huésped.
- (12)
- Transformante del tipo (11), en el que la célula huésped es un microorganismo que es capaz de producir un L-aminoácido.
- (13)
- Transformante del tipo (12), en el que la célula huésped es un microorganismo perteneciente al género Escherichia o el género Corynebacterium.
- (14)
- Transformante perteneciente al género Escherichia o el género Corynebacterium, que comprende un cromosoma en el cual se integra artificialmente el ADN de cualquiera de los tipos (5) a (7).
- (15)
- Transformante del tipo (13) o (14), en el que el microorganismo perteneciente al género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.
- (16)
- Procedimiento para producir un polipéptido, que comprende el cultivo del transformante de cualquiera de los tipos (11) a (15) en un medio para generar y acumular el polipéptido de cualquiera de los tipos (1) a (4) en un cultivo, y la recuperación del polipéptido a partir del cultivo.
- (17)
- Procedimiento para producir un L-aminoácido, que comprende el cultivo del transformante de cualquiera de los tipos (12) a (15) en un medio para generar y acumular un L-aminoácido que se biosintetiza utilizando NADPH en el cultivo, y la recuperación del L-aminoácido a partir del cultivo.
- (18)
- Procedimiento para producir un L-aminoácido del tipo (17), en el que el L-aminoácido que se biosintetiza utilizando NADPH se selecciona de entre L-lisina, L-treonina, L-isoleucina, L-triptófano, L-fenilalanina, L-tirosina, L-histidina y L-cisteína.
- (19)
- Procedimiento para producir un L-aminoácido del tipo (17), en el que el L-aminoácido es L-lisina.
A continuación, se describirá con mayor detalle
la presente invención.
El polipéptido de la presente invención es un
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que el
aminoácido Ala situado en la posición 213 de la secuencia de
aminoácidos representada por SEC ID nº:2 es sustituido por
treonina, y presenta actividad G6PD y una homología del 95% o más
con la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº:2. Entre
los ejemplos del polipéptido cabe citar un polipéptido que comprende
la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº:12.
No obstante, el polipéptido no comprende la G6PD
conocida (por ejemplo, un polipéptido en el que el aminoácido Thr
situado en la posición 120 de la SEC ID nº:2 es sustituido por
Ala).
La proteína que comprende una secuencia de
aminoácidos en la que se elimina, sustituye o añade uno o varios
aminoácidos y presenta actividad G6PD puede obtenerse introduciendo
una mutación dirigida a sitio específico en un ADN que codifica un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada
por SEC ID nº:12, utilizando la mutagénesis dirigida a sitio
específico descrita en los documentos Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory
Press (1989) (denominado en lo sucesivo "Molecular
Cloning, segunda edición"), Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons (1987 - 1997) (denominado en lo
sucesivo "Current Protocols in Molecular Biology"),
Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. acad. Sci.
USA., 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids
Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82,
488 (1985), etcétera. Dicha proteína también puede obtenerse
introduciendo una mutación dirigida a sitio específico, según el
anterior procedimiento, en un ADN que codifica un polipéptido que
originalmente presenta una secuencia en la que se elimina, sustituye
o añade uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos
representada por SEC ID nº:2, y que presenta actividad G6PD (por
ejemplo, una G6PD obtenida a partir de un microorganismo parecido a
Corynebacterium glutamicum), para sustituir de ese modo un
aminoácido correspondiente al aminoácido de la posición 213 de la
secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº:2 por
treonina.
En la presente memoria, se describen
polipéptidos en los que el número de aminoácidos que se van a
eliminar, sustituir o añadir no está particularmente limitado, sino
que es el número que puede eliminarse, sustituirse o añadirse
mediante un procedimiento muy conocido, tal como la mutagénesis
dirigida a sitio específico u otro similar, y es preferentemente un
número comprendido entre 1 y 10 y más preferentemente entre 1 y
5.
Asimismo, para que el polipéptido de la presente
invención presente actividad G6PD, resulta preferido que el
polipéptido presente una homología del 95% o más con la secuencia de
aminoácidos descrita en SEC ID nº2, en la que el aminoácido
treonina se halla en la posición 213, o en SEC ID nº:12, calculada
mediante los programas BLAST [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)],
FASTA [Methods in Enzymology, 183, 63-98 (1990)] u
otros.
Entre los ejemplos de ADN de la presente
invención que codifican el polipéptido de la presente invención se
incluye un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos, en la que
la secuencia de nucleótidos de las posiciones 637 a 639 que
codifica el aminoácido Ala de la secuencia representada por SEC ID
nº:1 es sustituida por un codón que codifica la treonina
(denominada en lo sucesivo "SEC ID nº:1 sub"), y un ADN que
comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID
nº:11, en la que el nucleótido en la posición 637 de la secuencia
de nucleótidos SEC ID nº:1 es adenina.
En la presente memoria también se describe un
ADN que comprende un ADN que se hibrida con un ADN que presenta la
secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº:1 en condiciones
estrictas, contiene una secuencia de nucleótidos en la que la
secuencia de nucleótidos comprendida entre la posición 637 y la 639
que codifica el aminoácido Ala de la secuencia de nucleótidos
representada por SEC ID nº:1 se sustituye por un codón que codifica
un aminoácido distinto a la Ala, y codifica un polipéptido que
presenta actividad G6PD. No obstante, el ADN no comprende un ADN
conocido (por ejemplo, un ADN en el que la adenina en la posición
358 de SEC ID nº:1 se sustituye por guanina).
En la presente memoria, el ADN que se hibrida
con el ADN de SEC ID nº:1 en condiciones estrictas corresponde a un
ADN que se puede obtener mediante hibridación de colonias,
hibridación de placas, hibridación Southern blot, etc., utilizando
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por
SEC ID nº:1 u 11 como sonda, y entre los ejemplos de este cabe
citar un ADN que puede identificarse realizando hibridación a 65ºC
en presencia de 0,7 a 1,0 mol/l de cloruro de sodio, mediante un
filtro en el cual se inmoviliza un ADN obtenido de una colonia o
placa, y a continuación lavando el filtro a 65ºC mediante una
solución SSC entre 0,1 y 2 veces concentrada (la composición de SSC
1 vez concentrada contiene 150 mmol/l de cloruro de sodio y 15
mmol/l de citrato de sodio). La hibridación puede realizarse según
el procedimiento descrito en, por ejemplo, los documentos
Molecular Cloning, segunda edición, Current Protocols in
Molecular Biology o DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical
Approach, segunda edición, Oxford University (1995). Los
ejemplos de ADN que se puede hibridar comprenden un ADN que
contiene una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos un
60% o más de identidad con la secuencia de nucleótidos representada
por SEC ID nº:1 u 11, preferentemente un ADN que contiene una
secuencia de nucleótidos que presenta un 80% o más de identidad, y
más preferentemente un ADN que contiene una secuencia de
nucleótidos que presenta un 95% o más de identidad según el programa
BLAST, FASTA u otros similares.
El ADN de la presente invención puede obtenerse
a partir de Corynebacterium glutamicum N.º 58 (FERM
BP-7134) o a partir de un mutante que presenta una
productividad de L-aminoácido incrementada, obtenido
aplicando una operación de mutagénesis general a la cepa.
Entre los ejemplos de la operación de
mutagénesis se incluyen el procedimiento convencional mediante
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG); (Microbial Experimentation Manual, 1986, p.131, Kodansha
Scientific).
El ADN de la presente invención puede aislarse
mediante el procedimiento siguiente.
Se prepara un ADN cromosómico a partir de una
cepa que contiene el ADN, por ejemplo mediante el procedimiento de
Saito et al. [Biochimica et Biophysica Acta, 72, 619
(1963)], y el ADN cromosómico se digiere con una enzima de
restricción adecuada. El fragmento de ADN obtenido se liga a un
vector (por ejemplo, un plásmido) que puede replicarse de manera
autónoma en células bacterianas, y el ADN ligado se introduce en un
microorganismo que presenta actividad G6PD deficiente. Se aísla un
transformante a partir del microorganismo obtenido utilizando la
actividad G6PD como índice, y se aísla el gen para la enzima a
partir del transformante.
Por ejemplo, una cepa de Escherichia coli
que es deficiente sólo en
glucosa-6-fostato isomerasa puede
crecer en un medio que contiene glucosa como única fuente de
carbono, pero una cepa que además es deficiente en G6PD no puede
crecer en un medio que contiene glucosa como fuente única de carbono
[Escherichia coli y Salmonella typhimurium, 192
(1996)]. Por lo tanto, el ADN de la presente invención puede
aislarse a partir de la cepa, seleccionando una cepa que pueda
crecer en un medio que contiene glucosa como única fuente de
carbono entre las cepas obtenidas introduciendo el ADN en la cepa
doblemente deficiente.
El microorganismo dentro del cual se introduce
el ADN de la presente invención puede ser una bacteria perteneciente
a cualquier género, siempre y cuando el ADN pueda expresarse.
Asimismo, el vector replicable de manera autónoma puede ser
cualquier vector, con tal que pueda replicarse autónomamente en la
bacteria. Por ejemplo, cuando se utiliza un microorganismo
perteneciente al género Escherichia, particularmente
Escherichia coli, el vector replicable autónomamente
comprende un pUC18 (fabricado por Takara Schuzo) y un pBluescript
SK(-) (fabricado por TOYOBO). Asimismo, el vector puede ser un
vector transportador que es autónomamente replicable tanto en
Escherichia coli como en una bacteria del género
Corynebacterium, tal como el pCE54 (solicitud de patente
japonesa publicada sin examinar n.º 105999/83).
El vector puede ligarse al ADN de la presente
invención mediante un procedimiento general en el que se utiliza
una T4 ADN ligasa y similares. Por ejemplo, cuando se utiliza
Escherichia coli, el vector puede introducirse en un huésped
mediante el procedimiento de Hanahan et al. [Journal of
Molecular Biology, 166, 557 (1983)] y similares.
Asimismo, el gen también puede aislarse a partir
de una cepa que se obtiene sintetizando un ADN oligomérico basado
en la información de la secuencia de nucleótidos del gen de la G6PD
(por ejemplo, entrada n.º E13655 de GenBank o la secuencia de
nucleótidos representada por SEC ID nº:1 en el caso de
Corynebacterium glutamicum), realizando la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) mediante el ADN oligomérico como
cebador y el ADN cromosómico de un microorganismo perteneciente al
género Corynebacterium como molde, ligando el fragmento de
ADN obtenido a un vector que presenta un gen marcador de selección y
a continuación introduciéndolo en un huésped adecuado, tal como una
bacteria del género Escherichia o el género
Corynebacterium. En este caso, no es necesario utilizar una
cepa deficiente en G6PD.
Además, el gen puede sintetizarse también
mediante un sintetizador de ADN de uso general, tal como el ABI
3948 fabricado por Perkin-Elmer, basado en una
secuencia de nucleótidos del gen; por ejemplo, la secuencia de
nucleótidos representada por SEC ID nº:1.
El ADN de la presente invención aislado mediante
el procedimiento anterior se introduce en un vector de expresión
que puede replicarse y expresarse en el microorganismo huésped, y el
microorganismo huésped se transforma con el vector recombinante
obtenido de esta manera.
El ADN recombinante que comprende el ADN que
codifica el polipéptido de la presente invención es preferentemente
un vector que puede replicarse de forma autónoma y que comprende un
promotor, una secuencia de unión al ribosoma, el ADN de la presente
invención y una secuencia de terminación de la transcripción. El ADN
recombinante también puede contener un gen para regular el
promotor.
Cuando se utiliza un microorganismo
perteneciente al género Escherichia, los ejemplos de vector
para este objetivo comprenden pBTrp2, pBTac1 y pPTac2
(comercializados todos por Boehringer Manheim),
pKK233-2 (fabricado por Pharmacia), pSE280
(fabricado por Invitrogen), pGEMEX-1 (fabricado por
Promega), pQE-8 (fabricado por QIAGEN), pKYP10
(solicitud de patente japonesa publicada sin examinar n.º
110600/83), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1
[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK(-) (fabricado por
Stratagene), pTrs30 [preparado a partir de Escherichia coli
JM 09/pTrS30 (FERM BP-5407), pTrs32 [preparado a
partir de Escherichia coli JM 109/pTrS32 (FERM
BP-5408), pGHA2 [preparado a partir de
Escherichia coli IGHA2 (FERM B-400),
solicitud de patente japonesa publicada sin examinar nº 221091/85],
pGKA2 [preparado a partir de Escherichia coli IGKA2 (FERM
BP-6798), solicitud de patente japonesa publicada
sin examinar n.º 221091/85], pTerm2 (US nº 4.686.191, US nº
4.939.094 y US nº 5.160.735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400
[J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pGEX (fabricado por Pharmacia) y
el sistema pET (fabricado por Novagen). Cuando se utiliza un
microorganismo perteneciente al género Corynebacterium, los
ejemplos comprenden pCG1 (solicitud de patente japonesa publicada
sin examinar n.º 134500/82), pCG2 (solicitud de patente japonesa
publicada sin examinar n.º 35197/83), pCG4 (solicitud de patente
japonesa publicada sin examinar nº 183799/82), pCG11 (solicitud de
patente japonesa publicada sin examinar n.º 134500/82), pCG116,
pCE54 y pCB101 (todos de la solicitud de patente japonesa publicada
sin examinar n.º 105999/83), pCE51, pCE52 y pCE53 [todas de
Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)] y pCS299P descrito
en los ejemplos de la presente solicitud.
Puede utilizarse cualquier promotor, siempre y
cuando pueda funcionar en la célula huésped. Entre los ejemplos
cabe citar los promotores obtenidos a partir de Escherichia
coli, bacteriófagos, etc., tales como el promotor trp
(P_{trp}), el promotor lac, el promotor P_{L}, el promotor
P_{R}, el promotor T7, etc. Asimismo, se pueden utilizar
promotores diseñados y modificados artificialmente, tales como un
promotor en el que se enlazan dos P_{trp} conjuntamente
(P_{trp} x2), el promotor tac, el promotor lacT7, el promotor
letl, etc.
Resulta preferido utilizar un plásmido en el que
el espacio entre la secuencia Shine-Dalgamo, que es
la secuencia de unión al ribosoma, y el codón de iniciación se
ajusta a una distancia adecuada (por ejemplo, de 6 a 18 bases).
En el ADN recombinante de la presente invención,
la secuencia de terminación de la transcripción no siempre es
necesaria para la expresión del ADN de la presente invención. No
obstante, resulta preferido facilitar una secuencia de terminación
de la transcripción justo a continuación del gen estructural.
Puede utilizarse cualquier célula huésped,
siempre y cuando sea una célula capaz de producir el
L-aminoácido descrito más adelante.
Preferentemente, se utiliza un microorganismo capaz de producir el
aminoácido. Preferentemente, dicho microorganismo es un
microorganismo perteneciente al género Escherichia o el
género Corynebacterium, más preferentemente un
microorganismo perteneciente al género Corynebacterium, y
todavía más preferentemente Corynebacterium glutamicum.
Entre los ejemplos de microorganismos cabe
mencionar los microorganismos pertenecientes al género
Serratia, el género Corynebacterium, el género
Arthrobacter, el género Microbacterium, el género
Bacillus y el género Escherichia. Los ejemplos
específicos comprenden Escherichia coli
XL1-Blue, Escherichia coli
XL2-Blue, Escherichia coli DH1,
Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276,
Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109,
Escherichia coli HB101, Escherichia coli n.º 49,
Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49,
Escherichia coli GI698, Escherichia coli TB1,
Escherichia coli ATCC 9637, Escherichia coli FERM
BP-5985, Serratia ficaria, Serratia fonticola,
Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Bacillus subtilis,
Bacillus amyloliquefacines, Corynebacterium ammoniagenes ATCC
6872, Brevibacterium immariophilium ATCC 14068,
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium
roseum ATCC 13825, Brevibacterium thiogenitalis ATCC
19240, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067,
Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC
13869, Corynebacterium glutamicum ATCC 13870,
Corynebacterium callunae ATCC 15991, Corynebacterium
acetoglutamicum ATCC 15806, Microbacterium ammoniaphilum
ATCC 15354 y Corynebacterium thermoaminogenes AJj 12340.
Preferentemente, se utiliza una de las cepas del microorganismo
siguiente o una cepa mutante productora de
L-aminoácidos obtenida a partir de las cepas del
microorganismo
siguiente:
siguiente:
Corynebacterium glutamicum ATCC
13.032;
Corynebacterium glutamicum ATCC 13869
y
Corynebacterium glutamicum ATCC
13870.
Puede utilizarse cualquier procedimiento de
introducción de ADN dentro de la célula huésped como procedimiento
de introducción del vector recombinante. Por ejemplo, cuando se
utiliza un microorganismo perteneciente al género
Escherichia, entre los ejemplos de procedimientos se incluye
el procedimiento que comprende la utilización de un ion de calcio
[Proc. Natl. Acad. Sci USA, 69, 2110 (1972)] y el
procedimiento de electroporación [Methods in Enzymology, 235, 375
(1994)]. Cuando se utiliza un microorganismo perteneciente al género
Corynebacterium, entre los ejemplos de procedimientos se
incluye el procedimiento del protoplasto (por ejemplo, solicitud de
patente japonesa publicada sin examinar n.º 186492/82 y solicitud de
patente japonesa publicada sin examinar n.º 18649/82), y el
procedimiento de electroporación [por ejemplo, Journal of
Bacteriology, 175, 4096 (1993)].
El microorganismo que pertenece al género
Escherichia o el género Corynebacterium y comprende el
ADN de la presente invención en el cromosoma puede ser cualquier
microorganismo en el que el fragmento de ADN se integra
artificialmente en el cromosoma mediante una recombinación genética
o un tratamiento mutagénico. Por ejemplo, el microorganismo puede
ser una cepa modificada mediante un tratamiento mutagénico a través
del cual la cepa que contiene un gen de la G6PD de cualquier
secuencia se convierte en una cepa que comprende el ADN de la
presente invención, o una cepa en la que el fragmento de ADN se
integra artificialmente en el cromosoma mediante el procedimiento
de recombinación homóloga [BioITechnology, 9, 84 (1991);
Microbiology, 144, 1863 (1998)], el procedimiento en el que se
emplea un bacteriófago o transposón [Escherichia coli y
Salmonella typhimurium, 2325-2339 (1996)], y
similares. Preferentemente, se ejemplifica una cepa en la que el
ADN se integra en el cromosoma mediante el procedimiento de
recombinación homóloga.
En la presente invención, una cepa obtenida
mediante un tratamiento mutagenético, así como una cepa obtenida
mediante recombinación genética, se denomina transformante.
El polipéptido de la presente invención puede
producirse cultivando el transformante de la presente invención
obtenido de esta forma en un medio, para formar y acumular el
polipéptido de la presente invención en el cultivo y posteriormente
recuperarlo del cultivo.
Asimismo, el L-aminoácido puede
producirse cultivando el transformante en un medio, para formar y
acumular de ese modo el L-aminoácido en el cultivo y
posteriormente recuperarlo del cultivo.
Es posible producir cualquier
L-aminoácido, siempre y cuando se necesite NADPH
para la biosíntesis de este. Entre los ejemplos se hallan:
L-lisina, L-treonina,
L-isoleucina, L-triptófano,
L-fenilalanina, L-tirosina,
L-histidina y L-cisteína. Asimismo,
es posible producir un compuesto que no es un aminoácido y que
emplea dichos aminoácidos como intermediarios. Preferentemente, se
ejemplifica la L-lisina. En la figura 1, se
representan las vías biosintéticas de los aminoácidos. En el
dibujo, las reacciones que consumen NADPH se indican con un
subrayado.
El transformante de la presente invención puede
cultivarse en un medio según el procedimiento habitual utilizado
para cultivar un huésped.
Como medio de cultivo, puede utilizarse el medio
nutritivo general que contiene una fuente de carbono, una fuente de
nitrógeno, sales inorgánicas, etc.
Se utiliza cualquier fuente de carbono que puede
ser asimilada por el transformante o el microorganismo de la
presente invención. Entre los ejemplos de fuentes de carbono cabe
citar hidratos de carbono tales como glucosa, fructosa, sacarosa,
melazas que contienen a estas, almidón, almidón hidrolizado, etc.;
ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, etc.;
y alcoholes tales como etanol, propanol, etc.
Los ejemplos de fuentes de nitrógeno comprenden
amoníaco; sales de amonio de ácidos inorgánicos o ácidos orgánicos,
tales como cloruro amónico, sulfato amónico, acetato amónico,
fosfato amónico, etc.; otros compuestos que contienen nitrógeno;
peptona; extracto de carne; extracto de levadura; agua de maceración
de maíz; hidrolizado de caseína; harina de soja e hidrolizado de
harina de soja; y diversas células obtenidas mediante fermentación
y sus productos digeridos.
Los ejemplos de sales inorgánicas comprenden
potasio dihidrógeno fosfato, di-potasio hidrógeno
fosfato, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de
sodio, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre y
carbonato cálcico.
El cultivo se realiza en condiciones aeróbicas
en cultivo agitado, cultivo sumergido con agitación centrífuga y
ventilación o similares. La temperatura de cultivo está comprendida
preferentemente entre 15 y 40ºC, y el tiempo de cultivo está
comprendido generalmente entre 16 horas y 7 días. El pH durante el
cultivo se mantiene preferentemente entre 3.0 y 9.0. El pH puede
ajustarse utilizando un ácido inorgánico u orgánico, una solución
de álcali, urea, carbonato cálcico, amoníaco, etc.
Asimismo, pueden añadirse antibióticos tales
como ampicilina, tetraciclina, etc. al medio durante el cultivo, si
es necesario.
Cuando se cultiva un microorganismo transformado
con un vector recombinante que lleva un promotor de tipo inducible,
puede añadirse un inductor al medio, si es necesario. Por ejemplo,
cuando se cultiva un microorganismo transformado con un vector
recombinante que lleva el promotor lac, puede añadirse
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) o un compuesto similar al medio, o cuando se cultiva un
microorganismo transformado con un vector recombinante que lleva el
promotor trp, puede añadirse ácido indoleacrílico o un
compuesto similar al medio.
Tras el cultivo, los precipitados tales como
células y similares se eliminan del cultivo, y entonces se puede
recuperar el aminoácido del cultivo, mediante un tratamiento
combinado de intercambio iónico, concentración, extracción por
adición de sal y similares.
El polipéptido producido mediante el
transformante de la presente invención puede aislarse y purificarse
utilizando el procedimiento habitual para aislar y purificar una
enzima. Por ejemplo, cuando el polipéptido de la presente invención
se expresa como un producto soluble en las células huésped, las
células se recuperan mediante centrifugación tras el cultivo, se
suspenden en un tampón acuoso y se fraccionan mediante un
ultrasonicador, una prensa francesa, un homogeneizador Manton
Gaulin, un molino Dynomill o un dispositivo similar para obtener una
solución de extracto libre de células. A partir del sobrenadante
obtenido centrifugando la solución de extracto libre de células,
puede obtenerse un producto purificado mediante el procedimiento
habitual utilizado para aislar y purificar una enzima, por ejemplo,
extracción por solvente; extracción por adición de una sal como el
sulfato de amonio o similar; desalación, precipitación mediante un
solvente orgánico; cromatografía de intercambio aniónico mediante
una resina como la dietilaminoetil (DEAE)-sefarosa,
la DIAION HPA-75 (fabricada por Mitsubishi
Chemical) etc.; cromatografía de intercambio catiónico mediante una
resina como la S-Sefarosa FF (fabricada por
Pharmacia), etc.; cromatografía hidrofóbica mediante una resina como
la butil sefarosa, la fenil sefarosa, etc.; filtración en gel
mediante un tamiz molecular; cromatografía de afinidad;
cromatoenfoque; electroforesis, tal como enfoque isoeléctrico,
etc.; y otras técnicas similares, por separado o en combinación.
Cuando el polipéptido se expresa como un cuerpo
de inclusión intracelular, las células se recuperan de la misma
manera, mediante fraccionamiento y centrifugación para recuperar el
polipéptido en forma de fracción de precipitación. El cuerpo de
inclusión del polipéptido recuperado se solubiliza con un agente
desnaturalizaante de proteínas. La solución de polipéptido
solubilizado se diluye o dializa para reducir la concentración del
agente desnaturalizante de proteínas en la solución, y restaurar de
ese modo la estructura terciaria normal del polipéptido. Tras el
procedimiento, puede obtenerse un producto purificado del
polipéptido mediante un procedimiento de purificación/aislamiento
similar a los anteriores.
Cuando el polipéptido de la presente invención
se secreta extracelularmente, el polipéptido puede recuperarse en
el sobrenadante del cultivo. En particular, el sobrenadante del
cultivo se obtiene aplicando al cultivo un tratamiento similar a
los anteriores, tal como la centrifugación u otro. A continuación,
puede obtenerse un producto purificado a partir del sobrenadante,
mediante un procedimiento de purificación/aislamiento similar a los
anteriores.
Entre los ejemplos de polipéptidos obtenidos de
esta manera se halla un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos representada por SEC ID nº:12.
Asimismo, el polipéptido de la presente
invención puede producirse mediante un procedimiento de síntesis
química, tal como el procedimiento del Fmoc
(fluorenilmetiloxicarbonil), tBoc
(t-butiloxicarbonil) o procedimientos similares.
Además, el polipéptido puede sintetizarse químicamente utilizando un
sintetizador de péptidos fabricado por Advanced ChemTech,
Perkin-Elmer, Pharmacia, Protein Technology
Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu
Corporation o similares.
A continuación se proporcionan ejemplos no
limitativos de la presente invención.
La figura 1 representa las vías biosintéticas de
20 aminoácidos que forman proteínas en una bacteria del género
Corynebacterium. Las partes subrayadas representan reacciones
que consumen NADPH. Las partes enmarcadas representan reacciones
que producen NADPH.
La denominación de los genes que corresponden a
enzimas relativas a las respectivas reacciones se realiza
básicamente de conformidad con la nomenclatura de Escherichia
coli. En el dibujo, la
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se
representa como G6PD (zwf).
La figura 2 representa las etapas de
construcción del vector pCS299P.
Ejemplo
1
Corynebacterium glutamicum n.º 58 (en lo
sucesivo, denominada "cepa n.º 58") es una cepa productora de
L-lisina obtenida aplicando una operación de
mutagénesis a Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (en
adelante, denominada "cepa ATCC 13032").
La cepa se depositó el 14 de abril de 2000 en la
institución International Patent Organism Depositary, National
Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST
Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi
1-Chrome Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, Japón (nombre antiguo: National
Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial
Science and Technology: 1-3, Higashi
1-Chrome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, Japón), con número de entrada FERM BP
7134. Los genes de la G6PD de la cepa ATCC 13032 y la cepa n.º 58 se
clonaron de la forma indicada a continuación.
Se prepara un ADN cromosómico de cada cepa
mediante el procedimiento de Saito et al. [Biochimica et
Biophysica Acta, 72, 619 (1963)]. Asimismo, basándose en la
secuencia de nucleótidos del gen de la G6PD conocida previamente en
Corynebacterium glutamicum MJ233 (número de entrada GenBank
E13655), se preparan cebadores de PCR para la secuencia de
nucleótidos de destino mediante el procedimiento habitual. Las
secuencias de nucleótidos de los cebadores se representan en SEC ID
nº: 3 y 4. La PCR se realiza en 25 ciclos, cada uno de los cuales
consiste en una reacción a 94ºC durante 1 minuto, una reacción a
60ºC durante 1 minuto y una reacción a 74ºC durante 2 minutos,
utilizando un termociclador fabricado por
Perkin-Elmer (GeneAmp PCR System 9600), ADN
polimerasa Pfu turbo (fabricada por Stratagene), 100 ng de cada ADN
cromosómico y el tampón añadido. Un producto de la PCR amplificado
de alrededor de 2,2 kb se somete a electroforesis en gel de agarosa
y se extrae y purifica mediante el sistema QIAquick Gel Extraction
Kit (fabricado por Quiagen).
El fragmento de ADN de 2,2 kb anterior que
contiene el gen de la G6PD y un vector pCR-Blunt
(fabricado por Invitrogen) se ligan mediante la T4 ADN ligasa
(fabricada por Takara Shuzo), y el resultado de esta unión se
utiliza para transformar células competentes de Escherichia
coli Shot TOP10 (fabricadas por Invitrogen) según el
procedimiento habitual. Cada uno de los transformantes seleccionados
en un medio de agar LB [medio que contiene 5 g de extracto de
levadura (fabricado por Difco), 10 g de
Bacto-triptona (fabricada por Difco), 10 g de
cloruro de sodio y 16 g de agar (fabricado por Difco) en 1 litro de
agua y ajustado a un pH 7,2] que contiene 50 \mug/ml de
kanamicina se cultiva durante toda la noche en un medio LB que
contiene 50 \mug/ml de kanamicina, y se preparan plásmidos a
partir de los respectivos medios de cultivo obtenidos mediante el
procedimiento de lisis alcalina con SDS (Molecular Cloning,
segunda edición).
Al plásmido que contiene el gen de la G6PD
obtenido a partir de la cepa ATCC 13032, se le asigna la
denominación pCRBzwf1, y al plásmido que contiene el gen de la G6PD
obtenido a partir de la cepa n.º 58, se le asigna la denominación
pCRBzwf2.
A continuación, se determinan las secuencias de
nucleótidos del gen de la G6PD en los plásmidos mediante el
procedimiento convencional. Se comprueba que las secuencias de
nucleótidos de los genes de la G6PD obtenidas a partir de la cepa
ATCC 13032 y n.º 58 son completamente idénticas. La secuencia de
nucleótidos se representa en SEC ID nº:1. Es decir, se demuestra
que el gen de la G6PD de la cepa productora de
L-lisina n.º 58 es un gen natural.
La cepa n.º 58 se somete a un tratamiento
mutagénico con NTG (Microbial Experimentation Manual, 1986, p. 131,
Kodansha Scientific) y a continuación se inocula en un medio de agar
mínimo [un medio que contiene 10 g de glucosa, 4 g de cloruro de
amonio, 2 g de urea, 1 g de potasio dihidrógeno fosfato, 3 g de
di-potasio hidrógeno fosfato, 4 mg de sulfato
ferroso heptahidratado, 40 \mug de cloruro de zinc heptahidratado,
200 \mug de cloruro férrico hexahidratado, 10 \mug de cloruro
de cobre dihidratado, 10 \mug de cloruro de manganeso
tetrahidratado, 10 \mug de tetraborato de sodio decahidratado, 10
\mug de molibdato de amonio tetrahidratado, 50 \mug de biotina,
5 mg de ácido nicotínico y 16 g de agar (fabricado por Difco) en 1
litro de agua y ajustado a un pH 7,2] que contiene 1 mg/ml de
6-azauracilo y se cultiva a 30ºC durante 2 días. Las
colonias formadas de esta manera se aíslan y someten al test de
producción de L-lisina descrito en el Ejemplo
2(4), y se seleccionan los clones que presentan una
productividad superior a la cepa n.º 58. A una de estas cepas se la
denomina "cepa M1". Se aísla el gen de la G6PD de la cepa M1
mediante el procedimiento indicado en el punto (1), y el gen se
inserta en el vector pCR-Blunt. Al plásmido
recombinante obtenido de esta forma, se le denomina pCRBzwfM.
Cuando se determina su secuencia de nucleótidos, el nucleótido de la
posición 637 de SEC ID nº:1, que es guanina en los genes de la G6PD
de la cepa ATCC 13032 y la cepa n.º 58, se ha cambiado por la
adenina del gen G6PD de la cepa M1. La secuencia de nucleótidos se
representa en SEC ID nº:11.
Como consecuencia de la mutación, el aminoácido
Ala de la posición 213 (codón GCT) del lado del terminal amino de
la G6PD de la cepa ATCC 13032 y n.º 58 ha cambiado a Thr (codón ACT)
de la G6PD de la cepa M1. La secuencia de aminoácidos se representa
en SEC ID nº:12.
Es decir, se demuestra que la mutación de
sustitución del aminoácido Ala213Thr está presente en la G6PD de la
cepa M1. Escherichia coli Top10 que comprende el plásmido
pCRBzwfM se deposita el 14 de abril de 2000 en la institución
International Patent Organism Depositary, National Institute of
Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central 6,
1-1, Higashi 1-Chrome
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón
(nombre antiguo: National Institute of Bioscience and Human
Technology, Agency of Industrial Science and Technology:
1-3, Higashi 1-Chrome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) con
número de entrada FERM BP-7135.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Para examinar el efecto de la mutación de
sustitución del aminoácido en la G6PD indicada en el Ejemplo 1, el
gen de la G6PD de la cepa n.º 58 se sustituye en un mutante.
Se construye un vector para esta sustitución
génica de la forma indicada a continuación.
Se sintetiza un ADN de cadena sencilla de 37
meros y un ADN de cadena sencilla de 29 meros que comprenden las
secuencias de nucleótidos representadas por SEQ ID No:5 y 6,
respectivamente, según el procedimiento convencional. Estos ADN se
mezclan en 50 \mul de 0,1 M de NaCl para obtener una respectiva
concentración de 10 pmol/\mul y se mantienen a 95ºC durante 2
minutos y, a continuación, a 65ºC durante 15 minutos. Tras
enfriamiento a 30ºC durante 3 horas, ambas moléculas de ADN de
cadena sencilla se aparean para obtener un ADN de cadena doble.
El plásmido pHSG299 (fabricado por Takara Shuzo)
se digiere con las enzimas EcoRI y SphI (ambas fabricadas por
Takara Shuzo), se somete a electroforesis en gel de agarosa y a
continuación se extrae y purifica mediante el sistema QIAquick Gel
Extraction Kit (fabricado por Quiagen). El fragmento de plásmido
pHSG299 obtenido se liga con el fragmento de ADN de cadena doble
anterior mediante el sistema Ligation Kit versión 2 (fabricado por
Takara Shuzo), y los fragmentos unidos se utilizan para transformar
Escherichia coli DH5\alpha según el procedimiento
habitual. La cadena se cultiva en un medio de agar LB que contiene
50 \mug/ml de kanamicina, y se seleccionan transformantes. Una
cepa de los transformantes se cultiva durante toda la noche en un
medio LB que contiene 50 \mug/ml de kanamicina, y se prepara un
plásmido a partir del medio de cultivo obtenido de esta forma
mediante el procedimiento de lisis alcalina con SDS. Al plásmido
obtenido se le denomina pHSG299L.
Se prepara un vector transportador pCS299P que
se puede replicar autónomamente tanto en Escherichia coli
como en las bacterias corineformes de conformidad con el
procedimiento siguiente.
Se obtiene un fragmento digerido mediante BG
III, realizando la digestión de pCG116 [Biol Technnology, 11, 921
(1993)] con la enzima Bg III (fabricada por
Takara-Shuzo).
Tras la digestión del plásmido pHSG299
(fabricado por Takara Shuzo) con BamHI (fabricada por Takara
Shuzo), el fragmento digerido mediante BamHI obtenido de
esta forma se concentra mediante precipitación en etanol según el
procedimiento convencional, y el fragmento se trata con fosfatasa
alcalina. Los dos fragmentos obtenidos se mezclan y someten a una
reacción de ligación mediante el sistema Ligation Kit versión 1
(fabricado por Takara Shuzo). Con el producto de la reacción, se
transforma Escherichia coli NM522 según el procedimiento
convencional (Molecular Cloning, segunda edición). La cepa se
cultiva en un medio de agar LB que contiene 20 \mug/ml de
kanamicina para seleccionar un transformante. El transformante se
cultiva durante toda la noche en un medio de agar LB que contiene
20 \mug/ml de kanamicina, y se prepara un plásmido a partir del
cultivo obtenido de esta forma mediante el procedimiento de lisis
alcalina con SDS para obtener ADN
pCS116-299Bg11.
Se confirman los sitios de restricción del ADN
pCS116-299Bg11 según el procedimiento
convencional.
Utilizando el ADN
pCS116-299Bg11, se transforma Corynebacterium
ammoniagenes ATCC 6872 mediante electroporación [FEMS
Microbiology Letters, 65, 299 (1989)].
Se selecciona un transformante cultivando la
cepa en un medio de agar CM [un medio que contiene 10 g de
polipeptona S (fabricada por Nihon Pharmaceutical), 5 g de extracto
de levadura S (fabricado por Nihon Pharmaceutical), 10 g de
extracto de carne Ehrlich (fabricado por Kyokuto Pharmaceutical), 3
g de cloruro de sodio y 30 \mug de biotina en 1 litro de agua y
ajustado a un pH 7,2] que contiene 20 \mug/ml de kanamicina. Se
extrae un plásmido del transformante según el procedimiento
convencional, y el plásmido se digiere con enzimas de restricción
para confirmar que el plásmido es
pCS116-299Bg11.
El ADN pCS116-299Bg11 se digiere
con la enzima PstI (fabricada por Takara Shuzo) y BamHI y
después se purifica mediante precipitación en etanol. Se prepara un
plásmido parcialmente eliminado a partir del ADN obtenido de esta
forma, mediante el sistema Deletion kit for
kilo-sequencing (fabricado por Takara Shuzo). Se
transforma Escherichia coli NM522 mediante el plásmido según
el procedimiento convencional. La cepa se cultiva en un medio de
agar LB que contiene 20 \mug/ml de kanamicina para seleccionar
transformantes. Los transformantes se cultivan durante toda la
noche en un medio LB que contiene 20 \mug/ml de kanamicina, y se
preparan plásmidos a partir del medio de cultivo obtenido mediante
el procedimiento de lisis alcalina con SDS. Según el procedimiento
convencional, se prepara un mapa de restricción de cada uno de los
plásmidos obtenidos, y se seleccionan plásmidos que presentan una
longitud parcialmente eliminada diferente.
Se transforma Corynebacterium
ammoniagenes ATCC 6872 utilizando los plásmidos seleccionados
mediante electroporación. Los transformantes obtenidos se siembran
en un medio de agar CM que contiene 20 \mug/ml de kanamicina y se
cultivan a 30ºC durante 2 días, y se seleccionan plásmidos que se
pueden replicar de forma autónoma en Corynebacterium
ammoniagenes, dependiendo de si se forman o no colonias
resistentes a la kanamicina.
Entre los plásmidos dotados de capacidad de
replicación autónoma, se selecciona un plásmido que presenta la
zona de eliminación más larga, y a este plásmido se le denomina
pCS299de16.
El ADN pCS299de16 se prepara a partir del
transformante según el procedimiento convencional y a continuación
se digiere con las enzimas de restricción DraI y PvuII (ambas
fabricadas por Takara Shuzo). Los fragmentos de ADN digeridos se
fraccionan mediante electroforesis en gel de agarosa, y se separa un
fragmento de ADN de alrededor de 2,7 kb que presenta un ADN
obtenido a partir del pCG116, y a continuación este se extrae y
purifica mediante el sistema DNA prep (fabricado por Asahi
Glass).
El ADN del vector pBluescript SK(+) (fabricado
por TOYOBO) se digiere con la enzima EcoRV (fabricada por Takara
Shuzo) según el procedimiento convencional. Los fragmentos de ADN
digeridos de esta forma se concentran mediante precipitación en
etanol y posterior tratamiento con fosfatasa alcalina. Los
fragmentos de ADN tratados se fraccionan mediante electroforesis en
gel de agarosa, y a continuación se extraen y se purifican mediante
el sistema DNA prep.
El fragmento de ADN de 2,7 kb y el fragmento
pBluescript SK(+) se ligan utilizando el sistema Ligation Kit
versión 1, y a continuación se transforma Escherichia coli
NM522 utilizando el ADN ligado según el procedimiento convencional.
La cepa se cultiva en un medio de agar LB que contiene 100 \mug/ml
de ampicilina, 50 \mug/ml de X-Gal (5
bromo-4-cloro-3-indoil-\beta-D-galactósido)
y 1 mmol/l de IPTG
(isopropiltio-\beta-D-galactósido)
para seleccionar transformantes. Los transformantes se cultivan
durante toda la noche en un medio LB que contiene 100 \mug/ml de
ampicilina, y se preparan plásmidos a partir del cultivo obtenido
mediante el procedimiento de lisis alcalina con SDS. Según el
procedimiento convencional, se prepara un mapa de restricción de
cada uno de los plásmidos obtenidos. A un plásmido capaz de formar
un fragmento de ADN de 3,4 kb y un fragmento de ADN de 2 kb
mediante digestión con EcoRI, se le denomina pCSSK21.
Se sintetizan fragmentos de ADN que presentan
las secuencias de ADN representadas por SEC ID nº:7 y 8, y se
realiza la PCR utilizando los fragmentos de ADN como cebadores y el
ADN pHSG299 como molde, y utilizando la polimerasa Taq de ADN
(fabricada por Takara Shuzo) según las condiciones de reacción
asociadas a ésta. El producto de la reacción se precipita con
etanol según el procedimiento convencional y a continuación se
digiere con las enzimas de restricción PstI y XhoI
(fabricadas por Takara Shuzo). Los fragmentos de ADN digeridos se
fraccionan mediante electroforesis en gel de agarosa, y el fragmento
de ADN de alrededor de 1,3 Kb obtenido se extrae y purifica
mediante el sistema DNA prep.
Se sintetizan fragmentos de ADN que presentan
las secuencias de nucleótidos representadas por SEC ID nº:9 y 10, y
se realiza la reacción PCR utilizando la polimerasa Taq de ADN según
las condiciones de reacción asociadas a esta, en la que los
fragmentos de ADN se utilizan como cebadores y el ADN pHSG299 se usa
como molde. El producto de la reacción se precipita con etanol
según el procedimiento convencional y a continuación se digiere con
las enzimas de restricción PstI y BglII. Los
fragmentos de ADN digeridos se fraccionan mediante electroforesis
en gel de agarosa, y el fragmento de ADN de alrededor de 1,3 kb
obtenido se extrae y purifica mediante el sistema ADN
prep.
prep.
El plásmido pCSSK21 obtenido se digiere con
SalI (fabricada por Takara Shuzo) y BamHI. Los
fragmentos de ADN digeridos se fraccionan mediante electroforesis
en gel de agarosa, y el fragmento de ADN de alrededor de 2,7 kb
obtenido se extrae y purifica mediante el sistema DNA prep. Los tres
fragmentos de ADN extraídos y purificados anteriores se mezclan y
ligan mediante el sistema Ligation Kit versión 1.
Escherichia coli NM522 se transforma con
el fragmento de ADN ligado según el procedimiento convencional. La
cepa se cultiva en un medio de agar LB que contiene 20 \mug/ml de
kanamicina, 50 \mug/ml de X-Gal y 1 mmol/l de
IPTG para seleccionar transformantes.
Los transformantes se cultivan durante toda la
noche en un medio de LB que contiene 20 \mug/ml de kanamicina, y
se preparan plásmidos a partir del medio de cultivo obtenido de esta
forma mediante el procedimiento de lisis alcalina con SDS. Según el
procedimiento convencional, se prepara un mapa de restricción de
cada uno de los plásmidos obtenidos, y al plásmido que presenta la
estructura descrita en la figura 1 se le denomina pCS299P.
Los plásmidos pCS299P y pHSG299L se digieren con
las enzimas XbaI y PstI (ambas fabricadas por Takara Shuzo) y, a
continuación, se someten a electroforesis en gel de agarosa. Tanto
el fragmento de 2,5 kb que contiene una zona de iniciación de
replicación derivada del vector pCS299P (OriC) en la bacteria
del género Corynebacterium como el fragmento pHSG299L se
extraen y purifican mediante el sistema QIAquick Gel Extraction Kit
(fabricado por QUIAGEN). El fragmento de ADN de 2,5 kb y el
fragmento pHSG299L se ligan utilizando el sistema Ligation Kit
versión 2 (fabricado por Takara Shuzo) y se utilizan para la
transformación en Escherichia coli DH\alpha según el
procedimiento convencional. Se prepara un plásmido a partir del
transformante obtenido de la misma manera que con el procedimiento.
Al plásmido obtenido, se le denomina pHSG299OC.
Los plásmidos pMOB3 (ATCC 77282) y pHSG2990C se
digieren con PstI (fabricada por Takara Shuzo) y a continuación se
someten a electroforesis en gel de agarosa. Tanto el fragmento de
2,6 kb que contiene un gen de la levan-sacarasa
(SacB) de Bacillus subtilis obtenido a partir de pMOB3 como
el fragmento pHSG2990C se extraen y purifican mediante el sistema
QIAquic Gel Extraction Kit (fabricado por QUIAGEN).
El fragmento de ADN de 2,6 kb y el fragmento
pHSG2990C se ligan mediante el sistema Ligation Kit versión 2
(fabricado por Takara Shuzo) y se transforman en Escherichia
coli DH\alpha según el procedimiento convencional. La cepa se
cultiva en un medio de agar LB que contiene 50 \mug/ml de
kanamicina para seleccionar un transformante. Se prepara un
plásmido a partir del transformante obtenido de la misma manera que
con el procedimiento anterior. Al plásmido se le denomina
pHSG2990CSB.
Un fragmento de ADN de 5,1 kb obtenido
digiriendo el plásmido pHSG299OCSB con NotI se somete a
electroforesis en gel de agarosa y a continuación se extrae y
purifica mediante el sistema QIAquick Gel Extraction Kit (fabricado
por QUIAGEN). El plásmido pCRBzwfM preparado en el Ejemplo 1 se
digiere con NotI, se somete a electroforesis en gel de agarosa y a
continuación se extrae y purifica mediante el sistema QIAquick Gel
Extraction Kit (fabricado por QUIAGEN). Un fragmento de NotI que
contiene OriC y el gen de la SacB se conecta al sitio NotI
del plásmido pcRBwwfM mediante el sistema Ligation Kit versión 2
(fabricado por Takara Shuzo) y se transforma en Escherichia
coli DH5\alpha según el procedimiento convencional. La cepa se
cultiva en un medio de agar LB que contiene 50 \mug/ml de
kanamicina para seleccionar un transformante. Se prepara un plásmido
a partir del transformante obtenido de la misma manera que con el
procedimiento anterior. Al plásmido se le denomina pCRBOSzwfM, y
este se utiliza como un vector recombinante para el gen de la
G6PD.
El gen de la G6PD mutante que contiene el
plásmido pCRBOSzwfM se introduce en la cepa n.º 58 y a continuación
se integra en el ADN cromosómico mediante recombinación homóloga,
utilizando el procedimiento de Ikeda et al. [Microbiology,
144, 1863 (1998)].
Las cepas en las que tiene lugar la segunda
recombinación se seleccionan mediante el procedimiento de selección
que aprovecha la propiedad de la levan-sacarasa de
Bacillus subtilis codificada por pCRBOSzwfM para producir un
sustrato suicida [Journal of Bacteriology, 174, 5462 (1992)], y una
cepa en la que el gen de la G6PD (tipo natural) contenido
originalmente en la cepa n.º 58 se sustituye con el gen de la G6PD
mutante se aísla a partir de las cepas seleccionadas anteriores
mediante el procedimiento indicado a continuación.
El pCRBOSzwfM se introduce en la cepa n.º 58
mediante electroporación [FEMS Microbiology Letters, 65, 299
(1989)], y se obtienen transformantes cultivando la cepa a 30ºC
durante 2 horas en un medio de agar KM163 [un medio que contiene 10
g de glucosa, 10 g de peptona (fabricada por Kyokuto
Pharmaceutical), 5g de extracto de carne Ehrlich (fabricado por
Kyokuto Pharmaceutical), 2 g de urea, 2,5 g de cloruro de sodio y 18
g de Bacto-agar (fabricado por Difco) en 1 litro de
agua y ajustado a un pH 7,2] que contiene 50 \mug/ml de
kanamicina. Se selecciona una cepa Tf1 de los transformantes, y la
cepa se cultiva en un medio KM163 que contiene 20 \mug/ml de
kanamicina y se somete a electroporación para introducir el vector
pCG11 (solicitud de patente japonesa n.º 91827/1994). Tras la
operación de introducción, la cepa se cultiva en un medio de agar
KM163 que contiene 50 \mug/ml de kanamicina y 200 \mug/ml de
espectomicina a 30ºC durante 2 días, para obtener transformantes.
Se examina el cromosoma de una cepa de los transformantes mediante
hibridación Southern blot, de conformidad con el procedimiento de
Ikeda et al. [Microbiology, 144, 1863 (1998)]. Por
consiguiente se confirma que el plásmido pCRBOSzwfM se ha integrado
en el cromosoma mediante una recombinación homóloga tipo Campbell.
Puesto que los genes natural y mutante de la G6PD están situados muy
próximos entre sí en el cromosoma de dichas cepas, ambos genes son
propensos a una segunda recombinación mutua.
El transformante (recombinante único) se siembra
en un medio Suc [medio que contiene 100 g de sacarosa, 7 g de
extracto de carne, 10 g de peptona, 3 g de cloruro de sodio, 5 g de
extracto de levadura (fabricado por Difco) y 18 g de
Bacto-agar (fabricado por Difco) en 1 litro de agua
y ajustado a un pH 7,2] y se cultiva a 30ºC durante 1 día, y se
seleccionan las colonias supervivientes. Una cepa que presenta el
gen de la SacB no puede crecer en este medio, porque convierte la
sacarosa en un sustrato suicida. Por otro lado, una cepa en la que
el gen de la SacB se ha eliminado mediante la segunda recombinación
homóloga entre el gen natural y el mutante de la G6PD puede crecer
en este medio, ya que no se forma el sustrato suicida. Durante la
recombinación homóloga, el gen natural o mutante de la G6PD se
elimina junto con el de la SacB. En este caso, la sustitución del
gen en el gen mutante de la G6PD se produce en una cepa en la que el
gen natural de la G6PD se suprime conjuntamente con el gen de
la
SacB.
SacB.
Se prepara un ADN cromosómico del recombinante
secundario obtenido anteriormente, mediante el procedimiento de
Saito et al. [Biochimica et Biophysica Acta, 72, 619
(1963)], y se realiza la reacción PCR utilizando la ADN polimerasa
Pfu turbo (fabricada por Stratagene) y el tampón añadido,
empleándose como cebadores los fragmentos de ADN que presentan las
secuencias de nucleótidos representadas por SEC ID nº:3 y 4. La
tipificación del gen de la G6PD del doble recombinante como natural
o mutante se realiza determinando las secuencias de nucleótidos de
estos productos de la PCR de la forma habitual. En los resultados,
se confirma que se obtienen cepas que contienen sólo el gen natural
de la G6PD (cepa n.º 58W, por ejemplo) y cepas que contienen sólo
el gen mutante de la G6PD (cepa n.º 58M, por ejemplo).
\vskip1.000000\baselineskip
Se evalúa la productividad de la lisina en las
cepas con sustitución génica de G6PD obtenidas (n.º 58W y n.º 58M)
y la cepa n.º 58, que es la cepa progenitora, mediante el cultivo de
estas en un frasco de fermentación de 5 litros.
Cada cepa se inocula en 100 ml de un primer
medio de siembra [un medio preparado disolviendo 50 g de glucosa,
10 g de extracto de levadura (fabricado por Nihon Pharmaceutical),
10 g de peptona (fabricada por Kyokuto Pharmaceutical Industry), 5
g de agua de maceración de maíz, 2,5 g de cloruro de sodio, 3 g de
urea y 50 \mug de biotina en 1 litro de agua, ajustando la
solución a un pH 7,2 y añadiendo además 10 g de carbonato cálcico],
y se cultiva a 30ºC durante 24 horas en un matraz de Erlenmeyer con
deflectores de 1 litro de capacidad. A continuación, se inoculan 40
ml del primer caldo de cultivo en 2.000 ml de un segundo medio de
siembra (medio preparado disolviendo 50 g de glucosa, 10 g de agua
de maceración de maíz, 0,5 g de sulfato de magnesio heptahidratado,
5 mg de ácido nicotínico, 1 mg de hidrocloruro de tiamina, 100
\mug de biotina, 10 mg de pantotenato de calcio, 2 g de
dihidrogenofosfato de potasio, 3 g de urea, 10 mg de sulfato ferroso
heptahidratado, 1 mg de sulfato de zinc heptahidratado, 8 g de
sulfato de amonio, 20 g de peptona y 2 g de bicarbonato de sodio en
1 litro de agua), y se cultivan a 30ºC durante 12 horas en un frasco
de fermentación de 5 litros. A continuación, se inoculan 230 ml del
segundo caldo de cultivo en 1.675 ml de un medio de cultivo
principal [medio preparado disolviendo 93 g de melaza residual (la
cantidad de azúcar equivalente), 0,5 g de potasio
dihidrogenofostato, 10 mg de sulfato ferroso heptahidratado, 100
\mug de hidrocloruro de tiamina, 2 g de peptona de soja, 0,5 g de
sulfato de magnesio heptahidratado, 5 mg de ácido nicotínico y 15 g
de sulfato de amonio en 1 litro de agua, y ajustando el pH a 7,4],
y se cultivan a 35ºC durante 42 horas en un frasco de fermentación
de 5 litros.
La cantidad de L lisina acumulada en el cultivo
principal se cuantifica mediante cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC).
La tabla 1 representa los resultados de la
medición de la cantidad de L-lisina producida por la
cepa n.º 58, la cepa n.º 58W y la cepa n.º 58M. Los resultados
demuestran que la productividad de L-lisina aumenta
con la nueva G8PD mutante.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la presente invención, se obtiene una G6PD
modificada y un ADN que codifica la G6PD, y la productividad de
L-aminoácidos por un microorganismo puede aumentar
mediante la G6PD modificada.
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº:3: Descripción de la secuencia
artificial - ADN sintético
SEC ID Nº:4: Descripción de la secuencia
artificial - ADN sintético
SEC ID Nº:5: Descripción de la secuencia
artificial - ADN sintético
SEC ID Nº:6: Descripción de la secuencia
artificial - ADN sintético
SEC ID Nº:7: Descripción de la secuencia
artificial - ADN sintético
SEC ID Nº:8: Descripción de la secuencia
artificial - ADN sintético
SEC ID Nº:9: Descripción de la secuencia
artificial - ADN sintético
SEC ID Nº:10: Descripción de la secuencia
artificial - ADN sintético
<110> Kyowa Hakko Kogyo, Co., LTD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 11308W01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2000/185789
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-06-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente en Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1452
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1452)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 484
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligómero sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccgatga ggctttggct ctgcgtggc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligómero sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcattggt ggactcggta actgcagcg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligómero sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattcgcggc cgctctagac tgcagcggcc gcgcatg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligómero sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggccgct gcagtctaga gcggccgcg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaagatct cgacggatcg ttccactg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaaaacgac ggccatg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgagtcgact cgcgaagtag cacctgtcac ttttg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggggatccg caccaacaac tgcgatggtg gtc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1452
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1452)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 484
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. ADN que comprende una secuencia de
nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:
- (a)
- una secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº:11;
- (b)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos representa por la SEC ID nº:12 o
- (c)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que presenta una homología del 95% o superior con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº:2, y que presenta actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, en el que está presente una treonina en la posición 213.
2. Polipéptido que está codificado por el ADN
según la reivindicación 1 y que presenta actividad de
glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa.
3. ADN recombinante que puede obtenerse
insertando el ADN según la reivindicación 1 en un vector.
4. ADN recombinante según la reivindicación 3,
en el que el ADN recombinante puede replicarse en un microorganismo
perteneciente al género Escherichia o el género
Corynebacterium.
5. Plásmido pCRBzwfM comprendido en
Escherichia coli TOP10 (FERM BP-7135).
6. Transformante que se puede obtener
introduciendo el plásmido recombinante o el ADN recombinante según
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en una célula huésped.
7. Transformante según la reivindicación 6, en
el que la célula huésped es un microorganismo que puede producir un
L-aminoácido.
8. Transformante según la reivindicación 7, en
el que la célula huésped es un microorganismo perteneciente al
género Escherichia o el género Corynebacterium.
9. Transformante perteneciente al género
Escherichia o el género Corynebacterium, que comprende
un cromosoma en el cual se integra de manera artificial el ADN
según la reivindicación 1.
10. Transformante según la reivindicación 8 ó 9,
en el que el microorganismo que pertenece al género
Corynebacterium es el Corynebacterium glutamicum.
11. Procedimiento para producir un polipéptido
según la reivindicación 2, que comprende el cultivo del
transformante según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 en un
medio para formar y acumular el polipéptido en un cultivo, y la
recuperación del polipéptido del cultivo.
12. Procedimiento para producir un
L-aminoácido, que comprende el cultivo del
transformante según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 en un
medio para formar y acumular el L-aminoácido que se
biosintetiza utilizando NADPH en el cultivo, y la recuperación del
L-aminoácido del cultivo.
13. Procedimiento para producir un
L-aminoácido según la reivindicación 12, en el que
el L-aminoácido que se biosintetiza utilizando
NADPH se selecciona de entre L-lisina,
L-treonina, L-isoleucina,
L-triptófano, L-fenilalanina,
L-tirosina, L-histidina y
L-cisteína.
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