JPH09224662A - ６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 コリネ型細菌由来の６−ホスホグルコン酸デ
ヒドロゲナ−ゼをコ−ドするＤＮＡを提供する。 【解決手段】 公知の配列を基に設計したプライマーＤ
ＮＡを用いて、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３のＤＮＡから上記酵素をコ−ドするＤＮＡの部分断
片を単離し、プラ−クハイブリダイゼ−ション、ＰＣＲ
反応等の手法を用いて、該酵素をコ−ドするＤＮＡを得
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、６−ホスホグルコ
ン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするＤＮＡに
関する。

【０００２】

【従来の技術】６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ
は、ペントースリン酸回路の酵素であり、６−ホスホグ
ルコン酸を酸化および脱炭酸してＤ−リブロース−５−
リン酸を生成する不可逆反応の触媒である。６−ホスホ
グルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子につい
ては、原核生物ではエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来の遺伝子［Ｇｅｎｅ， Ｖ
ｏｌ．２７， ｐ．２５３（１９８４）］、バシルス・
サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来
の遺伝子［Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．２
６１， ｐ．１３７４４（１９８６） ］、シネココッ
カス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｓｔｒａ
ｉｎ ＰＣＣ７９４２）由来の遺伝子［Ｊ． Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．， Ｖｏｌ．１７２， ｐ．４０２３（１
９９０）］等が、単離され、その塩基配列が決定されて
いる。

【０００３】しかしながら、アミノ酸合成等、産業上重
要なコリネ型細菌については、酵素タンパク及びその塩
基配列について報告されていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】一般に由来が異なる
と、酵素遺伝子は宿主において発現しないまたは発現し
にくいことから、コリネ型細菌内で発現可能なコリネ型
細菌由来の６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコ
ードするＤＮＡ断片の単離が望まれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組み換えの
手法を駆使することにより、コリネ型細菌から６−ホス
ホグルコン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードする
ＤＮＡが単離可能であることを見い出し、本発明を完成
するに至った。すなわち、本発明の要旨は、配列表の配
列番号１記載のアミノ酸配列で示される６−ホスホグル
コン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするＤＮＡ
に存する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の６−ホスホグルコン酸デ
ヒドロゲナーゼおよびそれをコードするＤＮＡ（以下、
ｇｎｄ遺伝子と略記する）は、コリネ型細菌の染色体Ｄ
ＮＡ、具体的には、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２
３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）株等の染色体ＤＮＡ
から以下に述べる方法で単離、決定することができる。

【０００７】まず、上記コリネ型細菌を常法［例えば、
特開昭５１−１３０５９２号公報参照］に従い培養し、
培養物から菌体を集め、該菌体から染色体ＤＮＡを抽出
する。染色体ＤＮＡは、例えば、特開平５−１５３７８
号公報の実施例１（Ａ）に記載の方法等により菌体から
容易に抽出することができる。エシエリヒア・コリ等の
６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの一次構造の相
同性の高い部分から逆翻訳したオリゴデオキシリボヌク
レオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）を行い、ｇｎｄ遺伝子の部分断片を得ることがで
きる。

【０００８】該断片を鋳型として、染色体ＤＮＡ制限酵
素分解物に対してサザンハイブリダイゼーションを行
い、少なくともｇｎｄ断片の一部を含む、染色体ＤＮＡ
制限酵素断片の大きさを決定する。ＰＣＲで得られたｇ
ｎｄ遺伝子の部分断片を鋳型として、遺伝子ライブラリ
ーλＦＩＸＩＩからプラークハイブリダイゼーションで
該断片を含むλファージを単離し、これをクローニング
する。

【０００９】この染色体ＤＮＡ断片を適当な制限酵素を
用いて切り出し、得られたＤＮＡ断片を適当なクローニ
ングベクター、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）へサブ
クローニングし、エシエリヒア・コリＪＭ１０９株（宝
酒造製）を形質転換する。この形質転換株を適当な抗生
物質選択下で培養し、培養物から菌体を回収し、菌体か
ら常法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを
抽出する。このプラスミドに挿入されたＤＮＡの塩基配
列を決定することにより、本発明のｇｎｄ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を取得することができる。

【００１０】このＤＮＡ断片の塩基配列は、ジデオキシ
ヌクレオチド酵素法［ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法；Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ．， ｅ
ｔａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ．７４， ｐ．５４６３，
（１９７７）］により決定することができる。このよう
にして決定した大きさ約２ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列
を後記配列表の配列番号１に示す。

【００１１】この配列中に存在するオープンリーディン
グフレームから、本発明の６−ホスホグルコン酸デヒド
ロゲナーゼは配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、
またそれをコードする遺伝子は、例えば、配列番号１記
載の塩基配列中の３７４番目から１８４９番目までの塩
基配列で示されるものである。本発明におけるｇｎｄ遺
伝子は、天然の細菌、例えばコリネ型細菌の染色体ＤＮ
Ａから分離されたもののみならず、本明細書記載の塩基
配列を元に、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベ
ックマン社製システム−１プラス（Ｓｙｓｔｅｍ−１
Ｐｌｕｓ）を用いて合成されたものであってもよい。

【００１２】また、前記の如くコリネ型細菌の染色体か
ら取得される本発明のＤＮＡ断片は、６−ホスホグルコ
ン酸デヒドロゲナーゼをコードする機能を実質的に損な
うことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と
置換されていても、削除されていてもよく、新たに塩基
が挿入されていてもよく、あるいは塩基配列の一部が転
位されているものであってもよく、さらにそれらの塩基
配列にハイブリダイズする塩基配列であってもよく、こ
れらの誘導体のいずれもが、本発明の６−ホスホグルコ
ン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片に包含されるものである。

【００１３】

【実施例】以下、実施例によりさらに具体的に説明す
る。しかしながら、これらの実施例は本発明の範囲を限
定するものではない。 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）を、半合成培地であるＡ培地［組
成：尿素 ２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄
０．５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ
₄・４〜６Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミ
ノ酸 ５ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チアミン ２
００μｇ、グルコース ２０ｇを蒸留水に溶解して１リ
ットルとする］１リットル中で対数増殖期後期まで培養
した後に菌体を回収した。

【００１４】得られた菌体をリゾチームを１０ｍｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する溶液［組成：１０ｍＭ ＮａＣｌ、
２０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ・２Ｎａ］１５ｍｌに懸濁した。該懸濁液にプロテ
ナーゼＫを１００μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、これ
を３７℃で１時間インキュベートした。次に、ドデシル
硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加
し、５０℃で６時間インキュベートして溶菌させた。得
られた溶菌液に等量のフェノール／クロロホルム溶液を
添加して室温で１０分間穏やかに振盪した後、その全量
を１０〜１２℃で２０分間、５，０００×ｇの遠心分離
に供し、その上清画分を分取した。該上清画分中に酢酸
ナトリウムをその濃度が０．３Ｍとなるように添加し、
次いで２倍量のエタノールを穏やかに添加した。水層と
エタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒で搦め取
り、これを７０％エタノールで洗浄して風乾した。得ら
れたＤＮＡは、溶液［組成：１０ｍＭ トリス緩衝液
（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ］５ｍｌを
加えて４℃で一晩静置した後、実験に供した。

【００１５】（Ｂ）ｇｎｄ遺伝子の部分断片の採取 エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）［Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， Ｖｏｌ．１７
３， ｐ．９６８（１９９１）］、エルウィニア・クリ
サンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍ
ｉ）［Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１０１， ｐ．５１（１９９
１） ］、および、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ）［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．２
６６， ｐ．１３０２８（１９９１）］の６−ホスホグ
ルコン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ遺伝子の
塩基配列をもとに推定したアミノ酸配列の相同性部分の
配列をもとに遺伝子クローニング用のＰＣＲプライマー
ＤＮＡを設計した。

【００１６】ポリメラーゼ連鎖反応の一例を以下に示
す。反応液は以下の組成である。濃度は最終濃度を表
す。［２５ユニット／ｍｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５
０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２５ｍ
Ｍ ｄＡＴＰ、０．２５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２５ｍＭ
ｄＧＴＰ、０．２５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．５μｇ／ｍ
ｌ 染色体ＤＮＡ飽和水溶液、１μＭ プライマー１：A
TGGTICA(TC)AA(TC)GGNAT(ATC)GA(AG)TA(TC)GGNGA(TC)AT
G（配列番号１記載のアミノ酸配列１９６〜２０６を元
にして設計した配列：配列番号２）、１μＭ プライマ
ー２：GCICC(AG)AA(AG)TA(AG)TCIC(TG)(TC)TGIGC(TC)TG
（配列番号１記載のアミノ酸配列４５９〜４６７を元に
して設計した配列：配列番号３）、として１００μｌの
反応混合液を用いる。］ ポリメラーゼ連鎖反応の反応条件は例えば、９４℃で１
分、５５℃で２分、７２℃で３分を１サイクルとする２
５サイクルである。そして上記反応で得られたＤＮＡを
精製した。

【００１７】それぞれ最終濃度が、５０ｍＭ トリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２
０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｕｎ
ｉｔ／１０μｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｎｇ／１０
μｌ ｐＧＥＭ−Ｔベクター、１０ｎｇ／１０μｌ Ｐ
ＣＲ産物となるように各成分を添加し、１６℃で３時間
反応させて、ＰＣＲ産物ＤＮＡを結合させた。

【００１８】ついで、常法［Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ
ｌ．， ５３， １５９（１９７０）参照］に従って、
得られた溶液を用いてエシエリヒア・コリＪＭ１０９を
形質転換した。得られた形質転換菌を選択培地［組成：
トリプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇ、ＮａＣｌ ５
ｇ、寒天 １５ｇ、アンピシリン ５０ｍｇ、イソプロ
ピオチオガラクトシド ０．２３８ｇ、Ｘ−ｇａｌ
０．２ｇ、ジメチルホルムアミド２ｍｌを蒸留水に溶解
して１リットルとする］に塗抹し、３７℃で１６時間培
養した。

【００１９】こうして得られたコロニーを青／白カラー
スクリーニングした。選択培地上に生育した菌株を、ア
ンピシリンを最終濃度で５０μｇ／ｍｌ含有するＬ培養
液［トリプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇ、ＮａＣｌ
５ｇを蒸留水に溶解して１リットルとする］に植菌
し、これを３７℃で７時間培養した。培養液を４℃で１
０分間８,０００×ｇの遠心分離にかけて菌体を回収し
た。回収した菌体からアルカリ−ＳＤＳ法［Ｔ． Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｊ．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎ
ｉｎｇ， ｐ．９０−９１（１９８２）参照］によりプ
ラスミドを抽出した。

【００２０】次に、得られた該プラスミドに挿入された
染色体ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシヌクレオチド
酵素法により決定した。具体的には、上記培養物より抽
出したプラスミドＤＮＡをパーキン・エルマー社製カタ
リスト８００モレキュラー・バイオロジー・ラボステー
ション（ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｓｔａｔｉｏｎ ； Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてプロトコールに従い
反応させた後、パーキン・エルマー社製３７３Ａ ＤＮ
Ａシークエンサーによりプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の
塩基配列を決定した。

【００２１】決定した塩基配列を翻訳して得られるタン
パク質と、既知のエシエリヒア・コリの６−ホスホグル
コン酸デヒドロゲナーゼとの相同性の比較により、それ
がブレビバクテイウム・フラバムＭＪ−２３３のｇｎｄ
遺伝子の一部（配列番号１記載の塩基配列中９５９番目
から１７７３番目）であることが判明した。 （Ｃ）ｇｎｄ遺伝子の部分断片を含む染色体ＤＮＡ制限
酵素断片の大きさ決定 染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩでそれぞれ分解した。これらをＯ
ｎｃｏｒ社製Ｐｒｏｂｅ ｔｅｃｈ ２を用いてサザン
ハイブリダイゼーション用のナイロンメンブレンフィル
ターを作成した。

【００２２】上記、ＰＣＲで得られたｇｎｄ遺伝子の部
分断片を鋳型に、標識にはアマシャム社製［α−³²Ｐ］
ｄＣＴＰ ＡＡ０００５を用いて、宝酒造社製Ｒａｍｄ
ｏｍＰｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉ
ｔ Ｖｅｒ．２の方法でプローブを標識した。フィルタ
ーを以下の組成の溶液［５×ＳＳＣ溶液、５×デンハル
ト溶液、０．５％ ドデシル硫酸ナトリウム、０．１ｍ
ｇ／ｍｌ ＳＩＧＭＡ社製ＳＡＬＭＯＮ ＴＥＳＴＥＳ
ＤＮＡ Ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１０
ｍｇ／ｍｌ）］で６５℃で２時間プレハイブリダイゼー
ションを行った。なお２０×ＳＳＣ溶液は、以下の組成
［３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸ナトリウム］、
１００×デンハルト溶液は以下の組成［２％ 牛血清ア
ルブミン、２％ ポリビニルピロリドン、２％ フィコ
ール］である。

【００２３】上記で調製したプローブを加え、６５℃で
一晩サザンハイブリダイゼーションを行った。フィルタ
ーを２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにて６５℃で１５分
間緩やかに振盪させながら洗浄した。次にフィルターを
１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにて６５℃で１５分間緩
やかに振盪させながら洗浄した。フィルターを風乾した
後、オートラジオグラフィーを行った。読みとりは、富
士写真フィルム社製バイオイメージングアナライザーＢ
ＡＳ−２０００を用いた。

【００２４】この結果、ｇｎｄ遺伝子の部分断片を含む
染色体ＤＮＡ制限酵素断片の大きさは、ＢａｍＨＩ断
片、ＥｃｏＲＩ断片、ＨｉｎｄＩＩＩ断片、ＳａｌＩ断
片が、それぞれ約５ｋｂ、８ｋｂ、５ｋｂ、９ｋｂであ
った。 （Ｄ）ｇｎｄ遺伝子の部分断片を含む染色体ＤＮＡ Ｂ
ａｍＨＩ断片の単離 ０．２％ マルトース、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄を添加し
たＬＢ培養液に、エシエリヒア・コリＰ２３２９を植菌
し、３７℃で培養した。そして遺伝子ライブラリーλＦ
ＩＸＩＩファージ溶液４００μｌにＰ２３２９培養液を
混合し、３７℃で１５分間培養した。次に４ｍｌのλト
ップアガー（５０℃保温）を加え、λプレートに均一に
なるように撒いて、３７℃で一晩培養した。

【００２５】ニトロセルロースフィルターをλプレート
上に空気が入らないように静かに置いて、予めフィルタ
ーに書いた目印の点をプレートに写した。フィルターを
剥がし、吸着面を上にして、以下の溶液に浸した濾紙上
に置き、順次５分間処理した（溶液１：［０．５Ｍ Ｎ
ａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ］、溶液２：［１Ｍ トリ
ス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．７５Ｍ ＮａＣｌ］、溶
液３：２×ＳＳＣ）。フィルターを乾燥させた後、８０
℃で３０分間加熱してフィルターへＤＮＡを固定化し
た。

【００２６】フィルターを以下の混合溶液［５×ＳＳＰ
Ｅ、１×デンハルト溶液、５０％ホルムアミド、０．１
ｍｇ／ｍｌ ＳＩＧＭＡ社製ＳＡＬＭＯＮ ＴＥＳＴＥ
ＳＤＮＡ Ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１０
ｍｇ／ｍｌ）］にて４２℃で１時間プレハイブリダイゼ
ーションを行った。２０×ＳＳＰＥの組成は、３．６Ｍ
ＮａＣｌ、０．２Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄、０．０２Ｍ Ｅ
ＤＴＡである。上記（Ｃ）項で調製したＤＮＡプローブ
を加え、４２℃で一晩、ハイブリダイゼーションを行っ
た。

【００２７】フィルターを５×ＳＳＰＥ、１×デンハル
ト溶液、５０％ ホルムアミド溶液にて４２℃で１５分
間緩やかに振盪させながら洗浄した。次にフィルターを
２×ＳＳＰＥ、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム溶液
にて４２℃で１５分間緩やかに振盪させながら洗浄し
た。フィルターを風乾した後、オートラジオグラフィー
を行った。読みとりは、富士写真フィルム社製バイオイ
メージングアナライザーＢＡＳ−２０００を用いた。

【００２８】目的プラークのソフトアガロースを砕い
て、２００μｌのＳＭ緩衝液に懸濁した。上記溶液１０
μｌを、３７℃で３〜４時間培養したエシエリヒア・コ
リＰ２３２９株３００μｌと混合し、トップアガロース
を加えてλプレートに撒いた。３７℃で一晩培養し、プ
ラークを形成させた。このλプレートに４ｍｌのＳＭ緩
衝液を加え、トップアガロースを掻き取って、４℃で１
時間穏やかに振盪した。トップアガロースを混入させな
いよう、上澄みを新しいチューブに移し、クロロホルム
を数滴加えた。そして５，０００ｒｐｍで５分間遠心
し、上澄みを得た。さらにＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ
（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１５分間保
温した。等量の２０％ ポリエチレングリコール（平均
分子量６，０００）−２Ｍ ＮａＣｌを加え、氷上で１
時間放置した後、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間
遠心後、上澄みを完全に除去した。２５０μｌのトリス
−ＥＤＴＡ緩衝液を加えて懸濁し、５μｌの１０％ ド
デシル硫酸ナトリウムを加え、６８℃で５分間加熱後、
１０μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、等量のフェノール／
クロロホルムを加え、よく懸濁した。１２，０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心し、水層を新しいチューブに移した。
イソプロパノール沈殿後、７０％ エタノール洗浄・乾
燥させ、５０μｌのトリス−塩酸緩衝液に懸濁した。

【００２９】以上の操作で得られたλＦＩＸＩＩのＤＮ
ＡをＢａｍＨＩで切断した。切断物をアガロース電気泳
動して、ｇｎｄ遺伝子の一部を含む染色体ＤＮＡのＢａ
ｍＨＩ断片を分離・精製した。このＢａｍＨＩ断片をｐ
ＵＣ１１８でサブクローニングした。サブクローニング
したＢａｍＨＩ断片を含むｐＵＣ１１８をＢａｍＨＩで
切断し、ＢａｍＨＩ断片を回収した。

【００３０】（Ｅ）ｇｎｄ遺伝子の全塩基配列決定 （Ｄ）で得られた大きさ約５ｋｂのＤＮＡ断片溶液を制
限酵素Ｓａｕ３ＡＩを用いて３７℃で処理してＤＮＡ断
片を部分分解した。また、クローニングベクターｐＵＣ
１１８を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。得られたベク
ターＤＮＡ断片と部分分解ＤＮＡ断片とを混合し、この
混合液にそれぞれ最終濃度が５０ｍＭ トリス緩衝液
（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍ
Ｍ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および１ｕｎｉｔ
／１０μｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼとなるように各成分を
添加し、ベクターＤＮＡ断片と部分分解ＤＮＡ断片とを
結合させた。

【００３１】上記と同様に大きさ約５ｋｂのＤＮＡ断片
溶液を制限酵素ＴａｑＩと反応させて部分分解ＤＮＡ断
片を調製した。クローニングベクターｐＵＣ１１８を制
限酵素ＡｃｃＩで切断した後、これを上記と同様にして
部分分解ＤＮＡと結合させた。得られたプラスミド混液
を用い、常法によりエシエリヒア・コリＪＭ１０９株を
形質転換し、前記の選択培地に塗抹した。

【００３２】上記選択培地に生育した菌株を常法に従い
液体培養し、得られた培養物よりプラスミドＤＮＡを抽
出した。抽出したプラスミドＤＮＡを用いて、ベクター
ｐＵＣ１１８に挿入された部分分解ＤＮＡ断片の塩基配
列を決定した。そして、これらの個々の配列の連結は、
パーキン・エルマー社製のシークエンス解析ソフト オ
ートアッセンブラー（Ａｕｔｏａｓｓｅｍｂｌｅｒ）を
用いて行った。

【００３３】この結果、配列番号１記載の塩基配列が判
明した。それを翻訳したタンパク質のアミノ酸一次構造
と既知のエシエリヒア・コリの６−ホスホグルコン酸デ
ヒドロゲナーゼのアミノ酸一次構造との相同性の比較に
より、それがブレビバクテイウム・フラバムＭＪ−２３
３のｇｎｄ遺伝子オープンリーディングフレーム配列番
号１記載の塩基配列中３７４番目から１８５２番目）を
含んでいることが判明した。

【００３４】

【発明の効果】本発明により提供される６−ホスホグル
コン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を用いてコリネ型細菌を育種改良することによ
り、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ高産生能を
有するコリネ型細菌の取得が可能となる。

【００３５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１９１６ 鎖の数：二本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 AATGATCCAG TGGATTCGGC AATGGCGGCG TAGACACCAC CGTTGACCAA GCCCACCACT 60 TGCAGGTGCT TGGATGCCAC GTGAAGTTCG CTGACCACGT GACCGGGTTC GATGGTGGTG 120 TAGCGCAGTC CAAGATTGCG GTCGAGGCCG TAATTGGCGT TGTTGAGTGC TTCAAGTTCG 180 TCAGTTGTTA AAGCTCTGGT GGCGGCAAGT TCTGCAAGCG AAAGCAGATC TTGGGGTTGA 240 TCATCGCGGG AAGTCATATT TTATTACTCT AGTCGGCCTA AAATGGTTGG ATTTTCACCT 300 GCTGTGACCT GGTAAAATGG CCACTACCCC CAAATGGTCA CACCTTTTAG GCCGATTTTG 360 CTGACACCGG GCT 373 ATG CCG TCA AGT ACG ATC AAT AAC ATG ACT AAT GGA GAT AAT CTC GCA 421 Met Pro Ser Ser Thr Ile Asn Asn Met Thr Asn Gly Asp Asn Leu Ala 1 5 10 15 CAG ATC GGC GTT GTA GGC CTA GCA GTA ATG GGC TCA AAC CTC GCC CGC 469 Gln Ile Gly Val Val Gly Leu Ala Val Met Gly Ser Asn Leu Ala Arg 20 25 30 AAC TTC GCC CGC AAC GGC CAC ACT GTC GCT GTC TAC AAC CGC AGC ACT 517 Asn Phe Ala Arg Asn Gly His Thr Val Ala Val Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45 GAC AAA ACC GAC AAG CTC ATC GCC GAT CAC GGC TCC GAA GGC AAC TTC 565 Asp Lys Thr Asp Lys Leu Ile Ala Asp His Gly Ser Glu Gly Asn Phe 50 55 60 ATC CCT TCC GCA ACC GTC GAA GAG TTC GTA GCA TCC CTG GAA AAG CCA 613 Ile Pro Ser Ala Thr Val Glu Glu Phe Val Ala Ser Leu Glu Lys Pro 65 70 75 80 CGC CGC GCC ATC ATC ATG GTT CAG GCT GGT AAC GCC ACC GAC GCA GTC 661 Arg Arg Ala Ile Ile Met Val Gln Ala Gly Asn Ala Thr Asp Ala Val 85 90 95 ATC AAC CAG CTG GCA GAC GCC ATG GAC GAA GGC GAC ATC ATC ATC GAC 709 Ile Asn Gln Leu Ala Asp Ala Met Asp Glu Gly Asp Ile Ile Ile Asp 100 105 110 GGC GGC AAC GCC CTC TAC ACC GAC ACC ATT CGT CGC GAG AAG GAA ATC 757 Gly Gly Asn Ala Leu Tyr Thr Asp Thr Ile Arg Arg Glu Lys Glu Ile 115 120 125 TCC GCA CGC GGT CTC CAC TTC GTC GGT GCT GGT ATC TCT GGC GGC GAA 805 Ser Ala Arg Gly Leu His Phe Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Gly Glu 130 135 140 GAA GGC GCA CTC AAC GGC CCA TCC ATC ATG CCT GGT GGC CCA GCA AAG 853 Glu Gly Ala Leu Asn Gly Pro Ser Ile Met Pro Gly Gly Pro Ala Lys 145 150 155 160 TCC TAC GAG TCC CTC GGA CCA CTG CTT GAG TCC ATC GCT GCC AAC GTT 901 Ser Tyr Glu Ser Leu Gly Pro Leu Leu Glu Ser Ile Ala Ala Asn Val 165 170 175 GAC GGC ACC CCA TGT GTC ACC CAC ATC GGC CCA GAC GGC GCC GGC CAC 949 Asp Gly Thr Pro Cys Val Thr His Ile Gly Pro Asp Gly Ala Gly His 180 185 190 TTC GTC AAG ATG GTC CAC AAC GGC ATC GAG TAC GCC GAC ATG CAG GTC 997 Phe Val Lys Met Val His Asn Gly Ile Glu Tyr Ala Asp Met Gln Val 195 200 205 ATC GGC GAG GCA TAC CAC CTT CTC CCG TAC GCA GCA GGC ATG CAG CCA 1045 Ile Gly Glu Ala Tyr His Leu Leu Pro Tyr Ala Ala Gly Met Gln Pro 210 215 220 GCT GAA ATC GCT GAG GTT TTC AAG GAA TGG AAC GCA GGC GAC CTG GAT 1093 Ala Glu Ile Ala Glu Val Phe Lys Glu Trp Asn Ala Gly Asp Leu Asp 225 230 235 240 TCC TAC CTC ATC GAG ATC ACC GCA GAG GTT CTC TCC CAG GTG GAT GCT 1141 Ser Tyr Leu Ile Glu Ile Thr Ala Glu Val Leu Ser Gln Val Asp Ala 245 250 255 GAA ACC GGC AAG CCA CTG ATC GAC GTC ATC GTT GAC GCT GCA GGC CAG 1189 Glu Thr Gly Lys Pro Leu Ile Asp Val Ile Val Asp Ala Ala Gly Gln 260 265 270 AAG GGC ACC GGA CGT TGG ACC GTC AAG GCT GCT CTT GAT CTG GGT ATT 1237 Lys Gly Thr Gly Arg Trp Thr Val Lys Ala Ala Leu Asp Leu Gly Ile 275 280 285 GCT ACC ACC GGC ATC GGC GAA GCT GTT TTC GCA CGT GCA CTC TCC GGC 1285 Ala Thr Thr Gly Ile Gly Glu Ala Val Phe Ala Arg Ala Leu Ser Gly 290 295 300 GCA ACC AGC CAG CGC GCT GCA GCA CAG GGC AAC CTA CCT GCA GGT GTC 1333 Ala Thr Ser Gln Arg Ala Ala Ala Gln Gly Asn Leu Pro Ala Gly Val 305 310 315 320 CTC ACC GAT CTG GAA GCA CTT GGC GTG GAC AAG GCA CAG TTC GTC GAA 1381 Leu Thr Asp Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Lys Ala Gln Phe Val Glu 325 330 335 GAC GTT CGC CGT GCA CTG TAC GCA TCC AAG CTT GTT GCT TAC GCA CAG 1429 Asp Val Arg Arg Ala Leu Tyr Ala Ser Lys Leu Val Ala Tyr Ala Gln 340 345 350 GGC TTC GAC GAG ATC AAG GCT GGC TCC GAC GAG AAC AAC TGG GAT GTT 1477 Gly Phe Asp Glu Ile Lys Ala Gly Ser Asp Glu Asn Asn Trp Asp Val 355 360 365 GAC CCT CGC GAC CTC GCT ACC ATC TGG CGC GGC GGC TGC ATT ATT CGC 1525 Asp Pro Arg Asp Leu Ala Thr Ile Trp Arg Gly Gly Cys Ile Ile Arg 370 375 380 GCT AAG TTC CTC AAC CGC ATC GTC GAA GCA TAC GAT GCA AAC GCT GAA 1573 Ala Lys Phe Leu Asn Arg Ile Val Glu Ala Tyr Asp Ala Asn Ala Glu 385 390 395 400 CTT GAG TCC CTG CTG CTC GAC CCT TAC TTC AAG AGC GAG CTC GGC GAC 1621 Leu Glu Ser Leu Leu Leu Asp Pro Tyr Phe Lys Ser Glu Leu Gly Asp 405 410 415 CTC ATC GAT TCA TGG CGT CGC GTG ATT GTC ACC GCC ACC CAG CTT GGC 1669 Leu Ile Asp Ser Trp Arg Arg Val Ile Val Thr Ala Thr Gln Leu Gly 420 425 430 CTG CCA ATC CCA GTG TTC GCT TCC TCC CTG TCC TAC TAC GAC AGC CTG 1717 Leu Pro Ile Pro Val Phe Ala Ser Ser Leu Ser Tyr Tyr Asp Ser Leu 435 440 445 CGT GCA GAG CGT CTG CCA GCA GCC CTG ATC CAG GGA CAG CGC GAC TTC 1765 Arg Ala Glu Arg Leu Pro Ala Ala Leu Ile Gln Gly Gln Arg Asp Phe 450 455 460 TTC GGT GCG GAC ACC TAC AAG GGC ATC GAC AAG GAT GGC CCC TTC CAC 1813 Phe Gly Ala Asp Thr Tyr Lys Gly Ile Asp Lys Asp Gly Pro Phe His 465 470 475 480 ACC GAG TGG TCC GGC GAC CGC TCC GAG GTG GAA GCT 1849 Thr Glu Trp Ser Gly Asp Arg Ser Glu Val Glu Ala 485 490 TAAAGGCTCC CCCTAAATAG CAAAACGCTA AAACCCCTCA CAGTCACCTT AGGTTGTAAG 1909 GGGTTTT 1916 配列番号：２ 配列の長さ： 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ATGGTNCAYA AYGGNATHGA RTAYGGNGAY ATG 33 配列番号：３ 配列の長さ： 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GCNCCRAART ARTCNCKYTG NGCYTG 26

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号 三菱化学株式会社筑波研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列
   で示される６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ。
2. 【請求項２】 請求項１記載の６−ホスホグルコン酸デ
   ヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１記載の塩基配列中３
   ７４番目から１８４９番目の塩基配列で示される６−ホ
   スホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ。