ES2344120T3 - Metodo para prevenir la formacion de derivados de trisulfuro de polipeptidos. - Google Patents
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Abstract
Método para reducir o prevenir sustancialmente la formación de un derivado de trisulfuro de un polipéptido en un medio líquido conteniendo dicho polipéptido, comprendiendo el método de desorción dicho medio líquido con un gas seleccionado del grupo que consiste en dióxido de carbono, nitrógeno (N2), o los gases nobles, en particular helio (He), (Ar) argón y combinaciones de los mismos.
Description
Método para prevenir la formación de derivados
de trisulfuro de polipéptidos.
La presente invención se refiere a un método
para prevenir la formación de derivados de trisulfuro de
polipéptidos durante la producción o tratamiento del mismo en medios
líquidos.
En particular, la invención se refiere a la
producción de una hormona del crecimiento humana, o un
intermediario, derivado, análogo, variante o mutante de la misma,
que está sustancialmente libre de, o contiene una cantidad reducida
de, derivado(s) de trisulfuro.
Varios polipéptidos conteniendo enlaces de
disulfuro se conocen por formar derivados de trisulfuro. Entre estos
están superóxido-dismutasa, interleuquina muteina y
hormona del crecimiento (GH). En principio, no obstante, otros
polipéptidos conteniendo enlaces de disulfuro, p. ej. insulina,
interleukinas y determinados factores de coagulación (tales como
factor VII) pueden formar de forma potencial derivados de trisulfuro
bajo condiciones específicas.
Entre la mayoría de los polipéptidos estudiados
conocidos por formar derivados de trisulfuro están las hormonas de
crecimiento (GH), en particular la hormona del crecimiento humana.
El término "hormona del crecimiento humana" (hGH; a veces
también referida, entre otras cosas, como "somatropina" o
"somatotropina") se entiende generalmente por referirse a la
hormona proteínica (polipéptido) que consiste en una única cadena de
191 residuos de aminoácidos reticulados por dos puentes de
disulfuro, teniendo la forma monomérica de la misma un peso
molecular de aprox. 22.000 (22 kDa). Las preparaciones de hormonas
del crecimiento aisladas de la glándula pituitaria humana no son
homogéneas. Por ejemplo, también se conoce una variante más pequeña
(20 kDa) producida a partir del mismo gen. La variante "hGH
básica" (hGH-V) expresada por la placenta durante
el embarazo es otro análogo/variante el cual es un producto de un
gen separado; como el polipéptido hGH de 22 kDa éste consiste en 191
residuos de aminoácidos, pero 13 residuos de aminoácidos en
diferentes posiciones en la secuencia difieren de los de la hGH de
22 kDa [véase, p. ej, Bewley et al., Adv. Enzymol. 42,
73-166 (1975), y Frankenne et al., J. Clin.
Endocrin. and Metabol. 66, 1171-1180 (1988)].
En la hGH (es decir, el polipéptido de 22 kDa),
cuatro residuos de cisteína están presentes proporcionando altura a
los dos puentes de disulfuro. El primer puente de disulfuro forma un
bucle mayor entre Cys 53 y Cys 165, mientras que el segundo forma un
bucle menor entre Cys 182 y Cys 189. El bucle menor se localiza en
la superficie de la molécula, mientras que el bucle mayor se
introduce en la molécula de hGH. Una formación de puente de
trisulfuro puede ocurrir en el bucle menor y en el mayor.
La hormona del crecimiento humana es esencial,
entre otras cosas, para el crecimiento del hueso longitudinal y el
desarrollo del crecimiento normal durante la infancia. Se conocen
otros numerosos efectos o aplicaciones de la hGH, incluyendo la
mejora en la curación de fracturas de hueso, la descomposición del
tejido adiposo y la minimización del síndrome de fatiga
postoperatoria.
La producción de polipéptidos terapéuticamente
útiles, p. ej. la hGH, en una escala industrial se realiza en la
actualidad habitualmente usando técnicas recombinantes. Algunos de
los procesos recombinantes desarrollados usan huéspedes bacterianos,
tales como diferentes cepas de Escherichia coli, mientras que
otros procesos usan microorganismos eucarióticos, tales como
levaduras (p. ej. Saccharomyces cerevisiae), como
huéspedes.
Después de la producción (fermentación), el
medio comprendiendo el polipéptido recombinante normalmente se sigue
procesando. Durante un tratamiento de este tipo el polipéptido puede
someterse a diferentes procesos de extracción y purificación, tales
como centrifugado, microfiltración y/o ultrafiltración.
Uno de los problemas encontrados usando métodos
de fabricación recombinantes convencionales para producir
polipéptidos es la formación de subproductos de polipéptidos. En la
producción de polipéptidos conteniendo enlaces de disulfuro, la
formación de derivados, en particular de derivados de trisulfuro,
puede ser problemática.
El derivado del trisulfuro en cuestión es uno
donde la molécula peptídica contiene un átomo de azufre extra que
forma un "puente de trisulfuro" dentro de la molécula. Tal
derivado de trisulfuro se ha aislado durante la producción de la
hormona del crecimiento, donde ésta constituye un subproducto
indeseable.
Así, WO 94/24157 expone un método para detectar
un derivado hidrofóbico de hGH comprendiendo un átomo de azufre
extra en comparación con la hGH nativa. El átomo de azufre extra del
derivado hidrofóbico de hGH forma un "puente de trisulfuro"
produciendo un derivado de trisulfuro de hGH
(TS-hGH). También se describe un método para
reconvertir este derivado de trisulfuro de la hGH de nuevo a su
forma nativa de hGH tratando el derivado de trisulfuro de la hGH con
un compuesto de mercapto, tal como cisteína, glutationa,
2-mercaptoetanol o ditiotreitol.
\newpage
Además, el derivado de trisulfuro de la hGH se
ha descrito por Andersson et al., "Isolation and
characterization of a trisulfide variant of recombinant human growth
hormone formed during expression in Escherichia coli",
("Aislamiento y caracterización de una variante de trisulfuro de
la hormona del crecimiento humana recombinante formada durante la
expresión de Escherichia coli") Int. J. PeDtide Protein
Res. 47 (1996) págs. 311-321, y por A. Jesperson
et al., "Characterisation of a trisulfide derivative of
biosintetic human growt hormone produced in Escherichia
coli", ("Caracterización de un derivado de trisulfuro de la
hormona del crecimiento humana producida en Escherichia
coli") Eur J. Biochem. 219 (1994) págs.
365-373 (1994), y derivados de trisulfuro también se
han proporcionado para otros péptidos, es decir,
superóxido-dismutasa recombinante [Briggs et
al., Biochem. Biophys. Acta, 537 (1978) págs.
100-109] y una muteína de interleuquina [J. Bretón
et al., J. Chromatoar. A 709 (1) (1995) págs.
135-46].
WO 96/02570 describe otro método para
reconvertir el derivado de trisulfuro de la hGH de nuevo a su forma
nativa de hGH tratando el derivado con un compuesto de sulfito, tal
como sulfito de sodio, sulfito de potasio o sulfito de amonio, o un
sulfito de metal alcalinotérreo tal como sulfito de magnesio o
sulfito de calcio.
WO 00/02900 describe, entre otras cosas, un
método para la producción de péptidos recombinantes con una cantidad
baja de trisulfuros, caracterizado por la adición de una sal
metálica (p. ej. potasio o sal sódica) durante o después de la etapa
de fermentación.
WO 04/31213 expone, entre otras cosas, un método
para reducir la cantidad de una impureza de isoforma de trisulfuro
producida en la producción recombinante de un "polipéptido de
antagonista de la hormona del crecimiento" en células huéspedes
genéticamente modificadas, donde la impureza se pone en contacto con
un "compuesto de mercapto" (ejemplificado por sulfitos,
glutationa, \beta-mercapto-etanol,
ditiotreitol, cisteína y otros). La solicitud también expone el uso
de agentes quelantes o sales metálicas para conseguir una reducción
en la cantidad de trisulfuro formado.
La Figura 1 muestra la distribución de especies
de sulfuro de hidrógeno (H_{2}S, HS y S^{2}-, respectivamente)
en agua a 20ºC como una función del pH.
La Figura 2 muestra mecanismos sugeridos de
formación de derivados de trisulfuro de péptidos en presencia de
H_{2}S.
La Figura 3 muestra el impacto de la exposición
en la formación de TS-hGH en homogeneizado
micro-filtrado, a partir de un cultivo discontinuo
produciendo hGH.
Se ha descubierto sorprendentemente que la
formación de un derivado de trisulfuro de un polipéptido durante la
producción y/o el tratamiento del polipéptido en un medio líquido
puede minimizarse o evitarse mediante un proceso en el cual el medio
líquido se deshace con un gas, p. ej. por aireación del medio
mediante el pasaje a través del mismo de una corriente de burbujas
del gas en cuestión.
Como se ha indicado anteriormente, un aspecto de
la invención se refiere a un método para reducir o prevenir
sustancialmente la formación de un derivado de trisulfuro de un
polipéptido en un medio líquido (típicamente un medio acuoso)
conteniendo el polipéptido, comprendiendo el método la desorción del
medio líquido con un gas tal y como se define en las
reivindicaciones.
El polipéptido de interés puede ser de origen
natural o sintético, y el método según la invención por tanto no
está limitado a aplicaciones para polipéptidos recombinantes o para
polipéptidos producidos por otros medios bajo condiciones
controladas, sino que pueden aplicarse de forma potencial a
polipéptidos extraídos a partir de cualquier fuente, p. ej. de una
planta o un animal.
Como se ha mencionado anteriormente, varios
polipéptidos se conocen por ser propensos a formar derivados de
trisulfuro. Estos polipéptidos, particularmente polipéptidos
terapéuticos, normalmente contienen uno o más enlaces de disulfuro,
y entre estos están superóxido-dismutasa,
interleuquina muteina y hormonas del crecimiento (GH). En principio,
otros polipéptidos conteniendo enlaces de disulfuro, p. ej.
insulina, pueden formar de forma potencial derivados de trisulfuro
bajo condiciones apropiadas.
Entre la mayoría de los polipéptidos estudiados
conocidos por formar impurezas derivadas de TS están las hormonas de
crecimiento (GH), y en formas de realización de la invención el
polipéptido de interés es una hormona del crecimiento, tal como una
hormona del crecimiento mamífera (p. ej. GH humana, bovina, equina,
porcina, ovina, canina o felina), una GH aviar, o GH de salmón,
trucha o atún, particularmente la hormona del crecimiento humana
(hGH), hGH producida de forma notablemente recombinante (rhGH). El
término hormona del crecimiento en el contexto de la invención
también comprende: formas truncadas de GH, es decir formas truncadas
de una hormona del crecimiento donde uno o más residuos de
aminoácidos se ha/han delecionado; análogos de GH, donde uno o más
residuos de aminoácidos en la molécula nativa se ha/han sustituido
por otro residuo de aminoácido, preferiblemente un residuo de un
aminoácido de origen natural, mientras que la sustitución no cause
ningún efecto adverso tal como antigenicidad o actividad reducida; y
derivados de GH, p. ej. formas deamidadas o sulfoxidadas de la
hormona del crecimiento, o formas con una extensión N- o
C-terminal (tal como Met-hGH,
Met-Glu-Ala-Glu-hGH
o Ala-Glu-hGH). Otros derivados de
GH de relevancia incluyen aquellos en los cuales una GH (p. ej. hGH)
se conjuga a una molécula tal como una albúmina, p. ej. albúmina de
suero humano (véase, p. ej., WO 97/24445), o un polímero
hidrosoluble tal como un polietilenoglicol (PEG) (véase, p. ej., WO
03/044056), para conseguir, p. ej., una duración prolongada de la
actividad de GH. Como ya se ha indicado, entre las hormonas del
crecimiento per se, la hormona del crecimiento preferida en
relación con el tratamiento de seres humanos es normalmente hGH [es
decir, la hormona del crecimiento humana natural, la hormona del
crecimiento humana producida de forma particularmente recombinante
(rhGH) la cual es idéntica a la hormona natural], y formas
truncadas, análogos y derivados de hGH de los tipos últimos son de
relevancia en el contexto de la presente invención.
En el contexto presente, el término
"desorción" se refiere al desplazamiento o la eliminación de un
componente volátil (p. ej. un componente disuelto que en su estado
nativo bajo condiciones ambientales es un gas) del medio líquido
mediante la aireación del medio líquido con un gas adecuado (véase
abajo) a una velocidad y temperatura apropiadas, y durante un
espacio de tiempo apropiado.
Esto puede hacerse, por ejemplo, pasando el gas
en cuestión a través del medio líquido (p. ej. enviando una
corriente de burbujas de gas en el medio), con o sin agitación u
otros medios de mezcla, o mediante otros medios creando una gran
interfaz de fase gaseosa/fase líquida en la cual pueda tener lugar
una difusión de gas entre fases. A este respecto, los parámetros que
pueden ajustarse para conseguir un efecto de desorción deseado
incluyen:
- duración del contacto entre el gas (gas de desorción) y el medio líquido;
- velocidad de introducción/pasaje del gas de desorción en el medio líquido;
- volumen del gas de desorción empleado;
- magnitud del área de superficie de contacto entre la fase gaseosa y la fase líquida;
- vigorosidad de agitación/mezclado;
- pH del medio líquido; y
- temperatura del medio líquido y/o el gas de desorción.
El sulfuro de hidrógeno puede formarse en
presencia de una fuente conteniendo sulfuro apropiada (p. ej. un
polipéptido conteniendo un puente de disulfuro en sí mismo) en un
medio líquido bajo condiciones redox apropiadas, y en relación con
la presente invención se cree (véase abajo) que la presencia de
sulfuro de hidrógeno (H_{2}S) y/o de formas deprotonadas de las
mismas (es decir, HS- y/o S2-) juega un papel importante en la
formación de derivados de trisulfuro (TS) de polipéptidos.
Sin estar atado a ninguna teoría, se cree que
H_{2}S puede inducir la formación de derivados de TS de
determinados polipéptidos conteniendo puentes de disulfuro [p. ej.
hormonas del crecimiento (GH), tales como la hormona de crecimiento
humana (hGH)] por uno o los dos mecanismos ilustrados
esquemáticamente en la Fig. 2. En el primer mecanismo propuesto
(parte superior de la Figura 2), un agente oxidante (denominado
"Ox."), p. ej. oxígeno (O_{2}), presente en la solución actúa
por oxidación de S en H_{2}S con la formación presente de un
puente de trisulfuro en el polipéptido. En el segundo mecanismo
propuesto (parte inferior de la Figura 2), el polipéptido en sí
mismo actúa como un agente oxidante, formando un puente de
trisulfuro en presencia de H_{2}S.
Sin estar atado a ninguna teoría, se cree que el
desplazamiento o la eliminación de H_{2}S del medio líquido en
cuestión puede jugar un papel más importante a la hora de reducir o
eliminar la formación de derivados de TS indeseados.
El sulfuro de hidrógeno es un gas moderadamente
hidrosoluble débilmente acídico, el cual en solución acuosa existe
en equilibrio dinámico con las especies aniónicas HS- y S^{2}-,
respectivamente. Es aparente a partir de la Fig. 1 aquí (véase
abajo), la cual muestra la distribución de las tres especies
H_{2}S, HS- y S^{2}-, respectivamente, en agua a 20ºC como
función del pH, de manera que la proporción de H_{2}S en solución
es extremadamente pequeña a valores de pH mayores de aprox. 9, y se
acerca al 100% a un pH de aprox. 4. Suponiendo que H_{2}S es el
único de las tres especies en cuestión que existe en estado gaseoso
bajo condiciones ambientales, si la presencia de H_{2}S en el
medio líquido es de hecho de gran importancia en relación con la
formación de derivados de TS de polipéptidos, entonces se cree
apropiado que la desorción del medio líquido con un gas se
desarrolla a pH 9 en el medio líquido, tal como a pH 8, p. ej. a pH
6. Debería, no obstante, destacarse que puesto que el equilibrado
entre las tres especies de sulfuro (H_{2}S, HS- y S^{2}-) en
solución es rápido, en un principio debería ser posible ejecutar la
desorción de gas a un pH mayor que 9.
La elección del pH en el medio líquido durante
la desorción del gas a la manera de la invención, por supuesto,
también será influida por otros factores, tales como la estabilidad
del polipéptido de interés durante la formación de otros derivados
de los mismos (p. ej. dimeros o oligómeros más altos de las mismas,
formas deamidadas de las mismas, formas sulfoxidadas de las mismas,
etc.), la invalidación de la precipitación, etcétera.
El gas empleado en la desorción del medio
líquido a la manera de la invención es un gas que no reacciona
significativamente con o de lo contrario afecta contrariamente al
polipéptido de interés (u otros componentes centrales o esenciales
contenidos en el medio líquido) y se selecciona del grupo que
consiste en dióxido de carbono de nitrógeno y los gases nobles, en
particular helio o argón, helio, argón, o combinaciones de los
mismos. No obstante, si la presente creencia del inventor (véase
arriba) de que la presencia de H_{2}S en el medio líquido es de
central importancia en relación a la formación de derivados de TS de
polipéptidos es correcta, entonces estos gases que son más
apropiados para el uso en esa conexión se cree que son gases los
cuales son de forma sustancial químicamente inertes, particularmente
con respecto a causar oxidación, reducción u otras reacciones, y/o
influenciar en las condiciones de pH pertenecientes al medio
líquido, y las cuales están fácilmente disponibles en una forma
sustancialmente pura a un coste aceptable. Gases de particular
relevancia a este respecto incluyen entonces nitrógeno (N_{2}) y
los elementos más abundantes y fácilmente disponibles de los
denominados "gases nobles" [los cuales incluyen helio (He),
neón (Ne), argón (Ar), kriptón (Kr) y xenón (Xe)], sobre todo helio
y argón, particularmente argón. Estos gases (sobre todo N_{2}, He
y Ar) están fácilmente disponibles a nivel comercial en un alto
estado de pureza (típicamente un \geq99,8% en volumen para
N_{2}, y un \geq99,9% en volumen o más para He y Ar) en forma
comprimida en cilindros de capacidad variable.
En un principio se pueden formar derivados de
trisulfuro en cualquier etapa durante la producción y la
purificación de un polipéptido del tipo en cuestión. No obstante,
hay indicaciones de que es de enorme importancia evitar la formación
derivada de TS durante las etapas de purificación
post-producción, particularmente las etapas de
filtración; así, por ejemplo, en el caso de la hormona del
crecimiento humana recombinante (hGH), parece que la formación
sustancial de TS-hGH se desarrolla durante, en
particular, los procedimientos de filtración subsecuentes a la
producción per se.
El método según la invención es particularmente
adecuado para la aplicación subsecuente a la producción del
polipéptido de interés (p. ej. la producción por fermentación en un
medio conteniendo un microorganismo modificado expresando
recombinantemente el polipéptido), p. ej. conjuntamente con la
separación de flujo descendente (post-producción)
y/o las etapas de purificación, tales como filtración,
microfiltración, ultrafiltración, separación de columna y similares.
Empleado en relación a la hormona del crecimiento humana, el método
se aplica adecuadamente durante los procedimientos de
post-producción antes de las etapas de purificación
finales.
En otras formas de realización de métodos según
la invención, compuestos que influyen en la estabilidad de, o
reducen la formación de derivados indeseables de, el polipéptido
deseado pueden añadirse al medio líquido en relación a las etapas de
tratamiento post-producción. Así, por ejemplo, se
pueden añadir sales de sulfito (p. ej. un sulfito de metal alcalino
tal como sulfito de sodio o potasio) o compuestos de mercapto (p.
ej. uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en
glutationa, \beta-mercaptoetanol, ditiotreitol,
ditioeritritol, mercaptoetilamina, cisteína y cistina) al medio
líquido que se va a someter a desorción a la manera de la
invención.
Se tomó una muestra comprendiendo
microorganismos recombinantes de caldo de fermentación [E.
Coli conteniendo un cassette de expresión comprendiendo el gen
codificante para la hormona del crecimiento humana recombinante
(rhGH)] de un lote de producción de hGH. La muestra se homogeneizó,
y 6 sub-muestras, cada una de 1.500 ml, se
introdujeron en cilindros de medición de 2.000 ml y se agitaron
magnéticamente. La desorción de H_{2}S a partir de
sub-muestras se realizó por gas de nitrógeno de
burbujeo (obtenible, por ejemplo, a través de Air Liquide Danmark
A/S, Ballerup, Dinamarca; \geq99,8% de pureza) en cada
sub-muestra (temperatura 20ºC) a una velocidad de
15-20 l/hora a través de un tubo de silicona que se
extiende hasta el fondo del cilindro de medición. La
sub-muestra 1 no se sometió a desorción (control),
la sub-muestra 2 se sometió a desorción durante 2,5
horas, mientras que las sub-muestras 3, 4, 5 y 6 se
sometieron a desorción durante 20 horas.
Después de la desorción del gas de esta manera,
las sub-muestras se purificaron usando un sistema de
microfiltración en escala de laboratorio [sistema Millipore
Labscale^{TM} TFF usando membranas de polietersulfona modificadas
(BIOMAX^{TM}-1000)], dando como resultado una
formación de TS-hGH muy baja en el permeado
recogido. No obstante, en el caso de las
sub-muestras 4, 5 y 6, se añadió sulfuro de sodio
(Na_{2}S) hasta concentraciones de aprox. 5, 10 y 15 ppm,
respectivamente, antes de la microfiltración.
\newpage
La cantidad de hGH en las
sub-muestras microfiltradas se midió usando un
método ELISA dirigido por hGH: en este método un anticuerpo de
cobaya policlonal dirigido contra la hormona del crecimiento humana
se une a una placa de microtest. Este anticuerpo (anticuerpo de
revestimiento) reacciona con la hormona del crecimiento de las
muestras. Un anticuerpo policlonal de cobaya marcada con peroxidasa
(anticuerpo de detección) dirigido contra hGH reacciona entonces con
la hormona de crecimiento ahora fijada. Al añadir sustrato
enzimático (sustrato de peroxidasa), la actividad de la peroxidasa
en el anticuerpo marcado de peroxidasa resulta en el desarrollo de
un color con una intensidad proporcional a la concentración de
hormona del crecimiento en la muestra. La reacción se detiene por la
adición de ácido, y la absorbancia se lee en un fotómetro a 450 nm,
al igual que a una longitud de onda de referencia de 620 nm.
Los niveles de TS-hGH se
determinaron por cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC): Las
condiciones de medición optimizadas se ha observado que se obtienen
a una concentración de hGH aproximada en la muestra de 0,71 g
1-1, y por tanto se diluyeron muestras para
ajustarías a esta concentración de hGH particular. La concentración
de hGH inicial se determina a partir de una medición de la
absorbancia a 277 nm según la ecuación:
Un volumen total de 15 \mul de muestra
ajustada se aplicó a una columna de 200 mm de largo y 4,6 mm de
ancho. Una elución de gradiente con los siguientes dos
eluyentes:
A: 1M (NH_{4})_{2}SO_{4}: 0,1M de
Na_{2}HPO_{4}; pH 6.5
B: 0,1M Na_{2}HPO_{4}; 5% v/v de CH_{3}CN;
pH 6.5
se realizó como se resume en la siguiente
tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
Otras condiciones fueron de la siguiente
manera:
Temperatura, muestra ajustada:
2ºC-8ºC
Temperatura, calefactor de columna: 28ºC \pm
2ºC
Longitud de onda, detección de UV: 220 nm
\newpage
La cantidad relativa de TS-hGH
(en porcentaje de peso) en la muestra investigada se obtiene
entonces a partir de la siguiente ecuación:
Este procedimiento da un límite de
cuantificación (LOQ) de 20 ng de TS-hGH contenido
en la muestra investigada. Para verificar los resultados medidos
para las muestras, se mide un estándar al principio de cada serie y
también al final de cada serie.
Se determinaron las concentraciones de sulfuro
de hidrógeno en las muestras líquidas usando la prueba rápida Merck
Spectroquant^{TM}.Esta prueba está diseñada para medir todas las
especies de sulfuro disueltas en muestras acuosas en una extensión
de concentración de 0,03 a 3,3 ppm usando un análisis fotométrico.
El kit de la prueba contiene tres reactivos diferentes que causan
una reacción de color: El sulfuro de hidrógeno reacciona con
dicloruro de
N,N'-dimetil-1,4-fenilenediamonio
(Reactivo 2) para dar leucometilene azul incoloro, el cual se oxida
luego con sulfato férrico (Reactivo 3) a cloruro de metiltioninio.
El ácido sulfámico (Reactivo 1) previene la interferencia de
nitrito. La reacción de color que genera cloruro de metiltioninio
resulta en un máximo de absorción pronunciado a 665 nm, con espacios
en blanco mostrando prácticamente ninguna absorbancia a esta
longitud de onda. Para la medición de niveles de H_{2}S en caldo
de fermentación no filtrado, el caldo se centrifugó (10 min, 5.000
r.p.m.) después de la adición de los tres reactivos. Se usaron
soluciones estándar de H_{2}S de concentración conocida para la
calibración.
Los resultados se muestran en la Tabla 1,
abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos experimentos indican que H_{2}S se
implica en una formación de TS-hGH, y que la
desorción de H_{2}S del caldo de fermentación homogenizado resulta
en la reducción (en la sub-muestra 2) o casi la
eliminación (en la sub-muestra 3) de la formación
de TS-hGH en el homogeneizado microfiltrado.
\vskip1.000000\baselineskip
Una muestra comprendiendo microorganismos
recombinantes de caldo de fermentación [E. Coli conteniendo
un cassette de expresión comprendiendo el gen codificante para la
hormona del crecimiento humana recombinante (rhGH)] se tomó de un
lote de producción de hGH y se homogeneizó. Se tomaron 5
sub-muestras idénticas a partir de la muestra del
volumen homogenizado. Una de estas sub-muestras
(sub-muestra 1) no se sometió a desorción; las 4
sub-muestras restantes se sometieron a desorción por
nitrógeno [en un vaso fermentador aireado de nitrógeno (burbujeado)
agitado (B. Braun Biostat CT; volumen de trabajo normal 1 litro) con
control de pH y temperatura] usando las condiciones detalladas en la
Tabla 2, abajo. Los experimentos 2 y 3 se realizaron sin control de
pH, siendo el valor de pH dado en la Tabla 2 el valor inicial.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras se sometieron entonces a
microfiltración como se describe en el Ejemplo 1. El análisis del
contenido de hGH y TS-hGH se realizó asimismo como
se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla
3, abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de documentos citados por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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- \bullet WO 0431213 A [0015]
- \bullet WO 9602570 A [0013]
- \bullet WO 9724445 A [0021]
- \bullet WO 0002900 A [0014]
- \bullet WO 03044056 A [0021]
\bulletBewley et al. Adv.
Enzymol., 1975, vol. 42, 73-166
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\bulletFrankenne et al. J. Clin.
Endocrin. and Metabol., 1988, vol. 66,
1171-1180 [0004]
\bulletAndersson et al.
Isolation and characterization of a trisulfide variant of
recombinant human growth hormone formed during expression in
Escherichia coli Int. J. PeDtide Protein Res.,
1996, vol. 47, 311-321 [0012]
\bulletJesperson et al.
Characterisation of a trisulfide derivative of biosynthetic human
growth hormone produced in Escherichia coli Eur. J.
Biochem., 1994, vol. 219, 365-373
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\bulletBriggs et al. Biochem.
Biophys. Acta, 1978, vol. 537, 100-109
[0012]
\bullet J. Bretón et al. J.
Chromatoar. A, 1995, vol. 709, no. 1.
135-46 [0012]
Claims (11)
1. Método para reducir o prevenir
sustancialmente la formación de un derivado de trisulfuro de un
polipéptido en un medio líquido conteniendo dicho polipéptido,
comprendiendo el método de desorción dicho medio líquido con un gas
seleccionado del grupo que consiste en dióxido de carbono, nitrógeno
(N_{2}), o los gases nobles, en particular helio (He), (Ar) argón
y combinaciones de los mismos.
2. Método según la reivindicación 1, donde dicho
polipéptido contiene uno o más enlaces de disulfuro.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, donde
dicho polipéptido es un polipéptido producido recombinantemente.
4. Método según la reivindicación 3, donde dicho
polipéptido se selecciona de: hGH producida recombinantemente
(rhGH); formas truncadas de la misma; sus análogos; y derivados de
la misma.
5. Método según la reivindicación 3 ó 4, donde
dicha desorción se realiza durante el tratamiento de producción o
post-producción de dicho polipéptido.
6. Método según la reivindicación 3 ó 4, donde
dicha desorción se realiza durante el tratamiento de
post-producción de dicho polipéptido.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, donde dicho gas se selecciona
del grupo que consiste en dióxido de carbono, nitrógeno (N_{2}),
helio (He), argón (Ar) y combinaciones de los mismos y neón (Ne),
kriptón (Kr) y xenón (Xe).
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, donde dicho gas se selecciona
del grupo que consiste en nitrógeno (N_{2}), helio (He) y argón
(Ar).
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde dicho polipéptido se somete a una
o más etapas de purificación después del procedimiento de
desorción.
10. Método según la reivindicación 9
comprendiendo al menos una etapa de filtración.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 5-10, donde un sulfito o compuesto
de mercapto se añade al medio líquido después de la producción de
dicho polipéptido.
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