ES2349669T3 - Bacterias del ácido láctico que incrementan la inmunidad. - Google Patents

Bacterias del ácido láctico que incrementan la inmunidad. Download PDF

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Abstract

Una composición de un cultivo biológicamente puro de B. lactis HN019, con número de depósito en AGAL NM97/09513, de fecha 18 de agosto de 1997, en una concentración inmunoestimulante, con un excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.

Description

Campo técnico
Esta invención se refiere a nuevas cepas de bacterias del ácido láctico y su uso en la mejora de la inmunidad. Antecedentes de la técnica
El consumo de productos que contienen bacterias del ácido láctico (LAB, por sus siglas en inglés) está asociado con un abanico de beneficios para la salud, que incluyen la mejora de la inmunidad. Hay miles de cepas de bacterias del ácido láctico, pero sólo algunas cepas exhiben propiedades promotoras de la salud. La capacidad de estas bacterias de tolerar los ácidos y las sales biliares, adherirse a las células de la mucosa epitelial y sobrevivir al paso a través del tracto gastrointestinal es considerada como un criterio importante para la selección de cepas promotoras de la salud. Sólo se han identificado hasta la fecha unas cuantas cepas de bacterias del ácido láctico con beneficios para la salud probados.
La solicitud de patente europea EP 295 794 A describe un promotor del crecimiento para especies de Bifidobacterium que comprende alimento de calabaza como ingrediente activo.
La solicitud de patente internacional WO 94 18997 A describe un método para mejorar la respuesta inmune a una vacuna oral por parte de un receptor de una vacuna mediante la administración, con la vacuna oral o lo suficientemente próximo en el tiempo para causar una mejora de la respuesta inmune, de un inmunoadyuvante que comprende una cantidad eficaz de una cepa de bacterias Lactobacillus que tiene la capacidad de colonizar el tracto intestinal del receptor, preferiblemente la Cepa de Lactobacillus GG.
La solicitud de patente europea EP A 0577904 describe que Bifidobacterium breve CNCM I-1226, Bifidobacterium infantis CNCM I-227 y Bifidobacterium longum CNCM I-1228 se adhieren a y excluyen competitivamente bacterias patógenas de las células Caco-2. Las cepas se pueden incorporar en yogures, leches acidificadas y otras composiciones de alimentos.
La solicitud de patente internacional WO 98 23727 A describe una cepa purificada de Lactobacillus acidofilus CNCM/I-1492 (L.a. 1492) que, cuando se administra sola o en combinación con otra cepa de Lactobacillus acidofilus (L.a.) y una cepa de Lactobacillus casei (L.c.), tiene un efecto beneficioso sobre el nivel de colesterol en sangre en los mamíferos. También refuerza el sistema inmunitario, facilita la absorción de nutrientes y estimula la flora intestinal. Tales cepas también neutralizan los efectos secundarios causados por antibióticos. La invención se ocupa de la cepa específica L.a. I-1492, un fermento que comprende L.a. I-1492, cepas de
L.a. y L.c., un producto lácteo obtenido mediante este fermento y un método de fabricación del producto lácteo.
Se conocen unas cepas de LAB que muestran una buena adhesión a las células del epitelio mucoso del intestino delgado, prestándose de este modo a aplicaciones terapéuticas, de la patente de Nueva Zelanda 248057. Los microorganismos descritos en esta patente mejoran tanto la inmunidad natural (función fagocítica) como la inmunidad adquirida (respuestas de anticuerpos y respuestas de proliferación linfocítica).
Es deseable tener otras bacterias LAB que mejoren un amplio espectro de respuestas inmunes, incluyendo la función fagocítica.
Es un objeto de esta invención contribuir en alguna medida a la consecución de estas aspiraciones, o al menos ofrecer al público una alternativa útil de bacterias del ácido láctico que mejoren el sistema inmunitario.
Se puede decir, en líneas generales, que la invención consiste en una composición de un cultivo biológicamente puro de Bifidobacterium lactis HN019, con número de depósito en AGAL NM97/09513, de fecha 18 de agosto de 1997, en una concentración inmunoestimulante, con un excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.
En una realización, dicha composición comprende una composición de acuerdo con la reivindicación 1, que contiene B. lactis HN019, con número de depósito en AGAL NM97/09513, de fecha 18 de agosto de 1997, y una cualquiera o más de L. rhamnosus HN001, con número de depósito en AGAL NM97/09514, de fecha 18 de agosto de 1997, L. rhamnosus HN067, con número de depósito en AGAL NM97/01925, de fecha 11 de febrero de 1998, y L. acidophilus HN017, con número de depósito en AGAL NM97/09515, de fecha 18 de agosto de 1997.
Preferiblemente, dicho excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable es un alimento. Preferiblemente, dicho alimento es uno cualquiera entre leche fermentada, yogur, queso, bebida láctea o leche en polvo. Alternativamente, dicha composición es una composición farmacéutica y dicho excipiente o diluyente es un excipiente o diluyente farmacológicamente aceptable. En otra realización, se puede decir, en líneas generales, que la invención consiste en el uso de las composiciones de la invención en un método para mejorar la
inmunidad natural y adquirida, que comprende administrar a un mamífero uno cualquiera de los cultivos biológicamente puros anteriores en una tasa de dosificación inmunoestimulante.
Preferiblemente, dicho cultivo se administra en la forma de una composición con un excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.
Preferiblemente, dicho excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable es un alimento.
Preferiblemente, dicho alimento es leche fermentada, yogur, queso, bebida láctea o leche en polvo. Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el efecto de la suplementación de ratones con un producto fermentado con L. rhamnosus HN001 o un producto no fermentado que contiene L. rhamnosus HN001 sobre la actividad fagocítica de los leucocitos de la sangre periférica, como se describe en el Ejemplo 5. Se alimentaron ratones BALB/c con dietas basadas en leche que contenían 109 ufc (por día) de L. rhamnosus HN001, bien en un producto fermentado o bien no fermentado, durante 14 días. La actividad fagocítica de los leucocitos de la sangre periférica se determinó usando citometría de flujo y Escherichia coli marcada con isotiocianato de fluoresceína. Los valores son media ± error estándar. Diferencias significativas (ANOVA, el programa SAS) respecto al control: **P<0,0001.
La Figura 2 muestra el efecto de la suplementación de ratones con L. rhamnosus HN001 vivos o L. rhamnosus HN001 muertos por calor sobre la actividad fagocítica de los leucocitos de la sangre periférica, como se describe en el Ejemplo 7. Se alimentaron ratones BALB/c con dietas basadas en leche y se administraron por vía oral 109 ufc (por día) de L. rhamnosus HN001, bien vivos o bien muertos por calor, durante 14 días. La actividad fagocítica de los leucocitos de la sangre periférica y los macrófagos peritoneales se determinó usando citometría de flujo y Escherichia coli marcada con isotiocianato de fluoresceína. Los valores son media ± error estándar. Diferencias significativas (ANOVA, el programa SAS) respecto al control: **P<0,0001.
La Figura 3 muestra el efecto de la suplementación de ratones con L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 sobre la traslocación bacteriana en ratones sometidos a un desafío con S. typhimurium como se describe en el Ejemplo 8. Ratones BALB/c no suplementados y suplementados con B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 fueron sometidos por vía oral a un desafío con S. typhimurium después de una suplementación diaria continua. Seis días después del desafío, se mataron los ratones de forma humanitaria y sus hígados y bazos se recogieron para hacer un seguimiento de la traslocación bacteriana. Después, se cultivaron suspensiones tisulares de los órganos recogidos sobre placas de agar MacConkey durante 24-48 h antes de hacer una cuantificación. Los valores son media ± error estándar. Diferencias significativas (ANOVA, el programa SAS) respecto al control: **P<0,05.
La Figura 4 muestra el efecto de la suplementación de ratones con L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 sobre la actividad fagocítica de los leucocitos de la sangre periférica de ratones sometidos a un desafío con S. typhimurium como se describe en el Ejemplo 8. Ratones BALB/c no suplementados y suplementados con B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 fueron sometidos a un desafío por vía oral con S. typhimurium después de una suplementación diaria continua. La actividad fagocítica de los leucocitos de la sangre periférica se determinó seis días después del desafío usando citometría de flujo y Escherichia coli marcada con isotiocianato de fluoresceína. Los valores son media ± error estándar. Los valores (media ± error estándar) con diferentes superíndices son significativamente diferentes (ANOVA, el programa SAS): P<0,01.
La Figura 5 muestra el efecto de la suplementación de ratones con L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 sobre las respuestas proliferativas de los linfocitos del bazo de ratones sometidos a un desafío con S. typhimurium, como se describe en el Ejemplo 8. Ratones BALB/c no suplementados y suplementados con B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 fueron sometidos a un desafío por vía oral con S. typhimurium después de una suplementación diaria continua. Seis días después del desafío, las respuestas proliferativas de los linfocitos del bazo se midieron colorimétricamente después de la incorporación de 5-bromo-2’-desoxiuridina durante las 16 h finales de la incubación de 96 h. Los valores (media ± error estándar) con diferentes superíndices son significativamente diferentes (ANOVA, el programa SAS): P<0,01. Modos de llevar a cabo la invención
Se han depositado cultivos liofilizados de las cuatro cepas bacterianas en los Laboratorios Analíticos del Gobierno Australiano (AGAL, por sus siglas en inglés), The New South Wales Regional Laboratory, 1 Suakin Street, Pymble, NSW 2073, Australia. Los detalles de los depósitos son:
Cepa Número Fecha
L. acidophilus HN017 NM97/09515 18 de agosto de 1997 L.rhamnosus HN001 NM97/09514 18 de agosto de 1997
B. lactis HN019 NM97/09513 18 de agosto de 1997 L.rhamnosus HN067 NM97/01925 11 de febrero de 1998
Se ha encontrado que las cuatro cepas identificadas anteriormente mejoran un amplio espectro de respuestas inmunes, que incluyen las respuestas inmunes tanto naturales como adquiridas.
5 Ejemplo 1 -Morfología y propiedades generales
Se usó un análisis RAPD, secuenciación de ARNr 16S y análisis SDS-PAGE para confirmar la caracterización taxonómica de las cepas. También se encontró que el L. acidophilus HN017 era genéticamente diferente del L. acidophilus (LC1) de la patente de Nueva Zelanda Nº 248057.
10 Se usó un análisis RAPD, secuenciación de ARNr 16S y análisis SDS-PAGE para confirmar la caracterización taxonómica del L. rhamnosus HN067; los cebadores específicos de especie usados para la caracterización del L. rhamnosus HN067 a nivel molecular incluyeron Pr I (directo) 5-CAGACTGAAAGTCTGACGG-3 Y Pha II (inverso) 5-GCGATGCGAATTTCTATTATT-3.
15 La morfología y propiedades de fermentación de los azúcares de estas cepas se detallan en las Tablas 1 y 2.
Tabla 1 -Morfología y otras características
L. acidophilus HN017
L. rhamnosus HN001 B. lactis HN019 L. rhamnosus HN067
Bacilos cortos a medios con extremos redondeados, que aparecen generalmente por separado o en pares o cadenas cortas, cuando se cultivan en caldo MRS. Bacilos gram positivos, no formadores de esporas, catalasa negativos,
Bacilos cortos a medios con extremos cuadrados, en cadenas, generalmente de 0,7 x 1,1 x 2,0 -4,0 �m, cuando se cultivan en caldo MRS. Bacilos gram positivos, no móviles, no formadores de esporas, catalasa negativos, Bacilos microaerófilos a anaerobios con formas características, tales como células alargadas por el centro, disposición en “V” o en empalizada de las células cuando se cultivan en bloques de agar TPY. En caldo MRS con hidrocloruro de cisteína al 0,05%, Bacilos cortos a medios con extremos cuadrados, en cadenas, generalmente de 0,7 x 1,1 x 2,0 a 4,0 �m, cuando se cultivan en caldo MRS. Bacilos gram positivos, catalasa negativos, no formadores de esporas, facultativamente
facultativamente
facultativamente
forman células anaerobios con una
anaerobios con una temperatura óptima
anaerobios con una temperatura óptima
alargadas por el centro y células con temperatura óptima de crecimiento de
de crecimiento de 37 ± 1ºC y un pH óptimo de 6,0-6,5.
de crecimiento de 37 ± 1ºC y un pH óptimo de 6,0-6,5.
forma de bastón (extremos espatulados). 37 ± 1ºC y un pH óptimo de 6,0-6,5. Estas son bacterias
Estas son bacterias obligadamente
Estas son bacterias facultativamente Bacilos gram positivos, no obligadamente homofermentativas
homofermentativas y no se produce gas a partir de la
heterofermentativas y no se produce gas a partir de la móviles y no formadores de esporas, catalasa y no se produce gas a partir de la glucosa.
glucosa.
glucosa.
negativos, con una temperatura óptima
de crecimiento de 37 ± 1ºC y un pH óptimo de 6,0-7,0.
Fructosa-6-fosfato fosfocetolasa
positivos.
Tabla 2 -Patrón de fermentación de carbohidratos de las cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium seleccionadas
Cepa Nº
Nombre de la bacteria Puntuación *
1
L.acidophilus HN017 5755546
2
L.rhamnosus HN001 5757177
3
B. lactis HN019 1051622
4
L.rhamnosus HN067 5757175
Se usó el kit de fermentación de azúcares API 50 CH para determinar el patrón de fermentación de los azúcares. * Las puntuaciones se basan en puntuaciones de 22 azúcares prominentes (manual de Bergey)
5 Ejemplo 2 -Adhesión a las células intestinales
La capacidad de las cepas probióticas de adherirse a las células epiteliales del intestino humano (HT-29 y CaCo-2) fue evaluada in vitro usando líneas celulares diferenciadas. Se cultivaron monocapas de células HT-29 y CaCo-2 en cubreobjetos y se pusieron en platos de pocillos múltiples. Después, se añadieron a las capas
10 celulares 108 ufc/ml de LAB en 1 ml de sobrenadante de cultivo gastado junto con 1 ml de medio DMEM, y se incubaron durante 1 h a 37ºC en 10% de CO2 -90% de aire. Las monocapas se lavaron 4 veces con PBS, se fijaron en metanol, se tiñeron con Gram y se determinó microscópicamente el número de bacterias que se adhirieron a las células epiteliales. De media, se contaron 20 campos, y los resultados se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3 -Adherencia a las líneas celulares HT-29 y CaCo-2*
CEPA
HT-29 CaCo-2
L.acidophilus HN 017
98 ± 17 171 ± 16
L.rhamnosus HN 001
161 ± 18 218 ± 35
B. lactis HN 019
188 ± 27 194 ± 25
* Número (media ± error estándar de medida) de bacterias/100 células epiteliales
5 Ejemplo 3 -Mejora de la inmunidad natural y adquirida
Los efectos inmunopotenciadores de las tres cepas L. rhamnosus HN001, L. acidophilus HN017 y B. lactis HN019 se examinaron determinando la función fagocítica (leucocitos sanguíneos y macrófagos peritoneales), y cuantificando las concentraciones de anticuerpos específicos contra antígenos proteínicos usados para imitar las
10 respuestas a las vacunas en ratones. Se usó el siguiente protocolo experimental:
1. Se usaron ratones BALB/c de seis a siete semanas de edad, que pesaban 20-30 g.
2. Los ratones fueron distribuidos al azar a diferentes grupos de tratamiento 15 (Tabla 4).
3. Los ratones fueron alimentados con L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 (109 ufc/día) en 50 �l de leche desnatada durante 10 días. Los ratones de control recibieron 50 �l de leche desnatada en polvo solamente.
20 4. Todos los ratones recibieron una dieta basada en leche desnatada en polvo durante todo el experimento. Los leucocitos sanguíneos y macrófagos de los ratones que recibieron L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 mostraron una capacidad fagocítica significativamente mayor comparado con las células de los ratones de
25 control (Tabla 4). La producción de radicales de oxígeno (estallido oxidativo) por los leucocitos de los ratones alimentados con probióticos fue también más alta que la de los ratones de control (datos no mostrados).
Tabla 4 -Efecto de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 y B. lactis HN019 dietéticos sobre la función fagocítica en ratones
Tratamiento
% de leucocitos sanguíneos con actividad fagocítica % de macrófagos peritoneales con actividad fagocítica
Control
14,33 ± 0,87 66,1 ± 3,5
L. acidophilus HN017
22,7 ± 1,21 ** 79,0 ± 1,0 **
L. rhamnosus HN001
24,84 ± 0,93 ** 80,5 ± 1,8 **
B. lactis HN019
23,19 ± 0,95 ** 77,4 ± 2,6 *
Se administró por vía oral a ratones BALB/c 109 ufc (por día) de L. acidophilus
5 HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 durante 10 días. La actividad fagocítica de los leucocitos sanguíneos y los macrófagos peritoneales se determinó usando citometría de flujo y Escherichia coli marcada con isotiocianato de fluoresceína. Los valores son media ± error estándar. Diferencias significativas (test t de Student) respecto al control: *P<0,05, **P<0,01.
10 La concentración de anticuerpos IgG específicos en los sueros y en los lavados intestinales de los ratones que recibieron L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001
o B. lactis HN019 también fue mayor que la de los ratones de control (Tabla 5).
Tabla 5 -Efecto de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 y B. lactis HN019 15 dietéticos sobre las respuestas de anticuerpos del suero y mucosos
Tratamiento
Respuesta de anticuerpos del suero (unidades/ml) Respuesta de anticuerpos mucosos (unidades/ml)
Control
80,2 ± 6,0 1350 ± 96,0
L. acidophilus HN017
134,6 ± 25,2 * 1548 ± 270,0
L. rhamnosus HN001
118,5 ± 12,5 ** 1512 ± 198,0
B. lactis HN019
158,1 ± 51,6 *** 1548 ± 234,0
Se administró por vía oral a ratones BALB/c 109 ufc (por día) de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 durante 10 días. Los ratones fueron inmunizados con la toxina del cólera (un antígeno usado para imitar la infección 20 entérica) en los días 0 y 7. La concentración de anticuerpos específicos en el suero y en las secreciones intestinales se midió usando un ELISA en el día 10. Los valores
representan media ± error estándar. Diferencias significativas (test t de Student) respecto al control: *P=0,08, **P<0,05; ***P<0,01.
Ejemplo 4 -Efectos inmunoestimulantes después de la suplementación con LAB durante cuatro semanas
Los efectos inmunoestimulantes de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 y B. lactis HN019 fueron evaluados en ratones usando el siguiente protocolo experimental:
1.
Se usaron ratones BALB/c de seis a siete semanas de edad, que pesaban 20-30 g.
2.
Los ratones fueron distribuidos al azar (18/grupo) a diferentes grupos de tratamiento.
3.
Después de una aclimatación (durante 7 días), se les dio a los ratones 109 ufc (por día) de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019, en 50 �l de leche desnatada, durante 28 días (desde el día 0 hasta el día 28). Los ratones de control recibieron 50 �l de leche desnatada (sin ningún microorganismo) solamente.
4.
Se les ofreció a los ratones una dieta basada en leche desnatada en polvo y agua a voluntad, durante todo el experimento.
5.
Los efectos inmunoestimulantes fueron evaluados haciendo un seguimiento de la actividad fagocítica de los leucocitos sanguíneos y los macrófagos peritoneales, la actividad como células NK de los linfocitos esplénicos, las respuestas de proliferación linfocítica (células del bazo) a un mitógeno de las células T, la ConA (concanavalina A, un indicador de la inmunidad mediada por células) y las respuestas de anticuerpos a la vacuna del tétanos.
Como se ve en la Tabla 6, los leucocitos (neutrófilos, monocitos y macrófagos) de los ratones que recibieron L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 exhibieron una actividad fagocítica significativamente mayor (un indicador de la inmunidad natural) que los leucocitos de los ratones de control.
Tabla 6 -Efecto de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 y B. lactis HN019 dietéticos en ratones
Tratamiento
% de leucocitos sanguíneos con actividad fagocítica % de macrófagos peritoneales con actividad fagocítica
Control L.acidophilus HN017 L. rhamnosus HN001 B. lactis HN019
15,5 29,4** 24,2** 31,1** 72,67 82,2* 82,8** 83,0**
Se les dio a los ratones (18/grupo) 109 ufc (por día) de L. acidophilus HN017, L.
5 rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 en 50 �l de leche desnatada durante 28 días. La actividad fagocítica de los leucocitos sanguíneos/macrófagos peritoneales se determinó en el día 28 usando citometría de flujo y Escherichia coli marcada con isotiocianato de fluoresceína. Los valores son medias de mínimos cuadrados. Diferencias significativas (el análisis por SAS): *P<0,002, **P<0,0005.
10 El consumo de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 durante 28 días también dio como resultado un aumento en la actividad de las células NK, las respuestas de proliferación linfocítica a la ConA y las respuestas de anticuerpos a la vacuna del tétanos. Para todos estos indicadores de inmunocompetencia, los ratones que recibieron L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o
15 B. lactis HN019 tuvieron respuestas más altas que las de los ratones de control (Tabla 7). Juntos, estos resultados muestran que la suplementación durante periodos extensos con L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 es capaz de inducir una mejora sostenida en varios aspectos de la inmunidad natural y
20 adquirida.
Tabla 7 -Efecto de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 y B. lactis HN019 dietéticos sobre la actividad de las células NK y las respuestas de proliferación linfocítica a la ConA y las respuestas de anticuerpos a la vacuna del Tétanos.
Tratamiento con ConA
Actividad de las células NK (%) Proliferación linfocítica a la ConA (absorbancia) Respuestas de anticuerpos a la vacuna del Tétanos (unidades/ml)
Control L.acidophilus HN017 L. rhamnosus HN001 B. lactis HN019
8,8 9,9 11,5 10,5 1,4 ± 0,125 1,6 ± 0,44 1,8 ± 0,1* 1,7 ± 0,5* 402,5 ± 41,4 923,9 ± 116,0* 711,5 ± 127,2* 844,6 ± 134,7*
5 Se les dio a los ratones (18/grupo) 109 ufc (por día) de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 en 50 �l de leche desnatada durante 28 días (es decir, desde los días 0 a 28). La actividad como células NK de los linfocitos esplénicos se determinó en el día 28 usando citometría de flujo y células Yac-1 marcadas con D275. Las respuestas de proliferación linfocítica de los linfocitos esplénicos a la ConA
10 fueron evaluadas en el día 28 usando un kit comercial para la proliferación celular (Boehringer Mannheim, Alemania). Para las respuestas de anticuerpos, los ratones fueron inmunizados con la vacuna del tétanos (30 �l/dosis, CSL, Australia) en los días 7 y 21. La concentración de anticuerpos específicos se determinó usando un ELISA; se usó un antígeno suministrado por los fabricantes de la vacuna (CSL, Australia) para
15 revestir las placas. Los valores son medias de mínimos cuadrados de 18 ratones. Diferencias significativas (el análisis por SAS): *P<0,05. Ejemplo 5 -Mejora de la inmunidad natural y adquirida usando productos fermentados frente a no fermentados El objetivo era evaluar la eficacia inmunopotenciadora de un yogur preparado
20 (fermentado) usando la cepa probiótica L. rhamnosus HN001 comparado con un producto no fermentado que contenía L. rhamnosus HN001. Los efectos inmunopotenciadores fueron examinados determinando la función fagocítica (leucocitos de la sangre periférica y macrófagos peritoneales) y las respuestas proliferativas de linfocitos a un mitógeno de las células B (LPS).
25 Se uso el siguiente protocolo experimental:
1.
Se usaron ratones BALB/c de seis a siete semanas de edad, que pesaban 20-30 g.
2.
Los ratones fueron distribuidos al azar a diferentes grupos de tratamiento.
3.
Los ratones de control recibieron una dieta de leche entera en polvo durante todo el experimento.
4.
Los ratones de ensayo recibieron 2,5 g de yogur preparado usando L.
5 rhamnosus HN001 (109 ufc/día) o 2,5 g de leche entera que contenía L. rhamnosus HN001 (109 ufc/día) por día, así como una dieta basada en leche entera en polvo durante 14 días.
Resultados
Los ratones que recibieron el yogur preparado con L. rhamnosus HN001 o la
10 leche entera que contenía L. rhamnosus HN001 mostraron un nivel significativamente más alto de actividad fagocítica de los leucocitos de la sangre periférica que la que se observó en los ratones que recibieron la dieta de control (Fig. 1). Este aumento se vio con independencia de si el L. rhamnosus HN001 fue suministrado en el yogur (fermentado con L. rhamnosus HN001) o en el producto no fermentado que contenía
15 L. rhamnosus HN001. No hubo diferencia en el nivel de actividad fagocítica entre los ratones que recibieron el yogur fermentado preparado usando L. rhamnosus (HN001) comparado con el producto de leche entera en polvo no fermentado que contenía L. rhamnosus (HN001). Tanto el producto no fermentado como el fermentado con L. rhamnosus HN001
20 con que se alimentó a los ratones mostraron respuestas proliferativas linfocíticas al LPS más altas que los ratones de control (Tabla 8). No hubo diferencia significativa en la respuesta entre los ratones que recibieron el producto no fermentado que contenía
L. rhamnosus HN001 y los ratones que recibieron el producto fermentado con L. rhamnosus HN001.
25 Tabla 8 -Efecto del L. rhamnosus HN001 fermentado y no fermentado sobre las respuestas proliferativas linfocíticas en ratones
Tratamiento
Proliferación linfocítica a LPS (absorbancia)
Control (leche entera en polvo)
0,4699 ± 0,028
Leche entera en polvo fermentada con L. rhamnosus HN001
0,5361 ± 0,028
Leche entera en polvo no fermentada con L. rhamnosus HN001
0,5518 ± 0,028 *
Se alimentaron ratones BALB/c con dietas basadas en leche que contenían 109 ufc (por día) de L. rhamnosus HN001 bien en un producto no fermentado o bien en un yogur preparado con L. rhamnosus HN001 (producto fermentado) durante 14 días. Los ratones de control recibieron una dieta basada en leche sin ninguna LAB. Las respuestas proliferativas se midieron colorométricamente después de la incorporación de 5-bromo-2’-desoxiuridina durante las 16 h finales de la incubación de 96 h. Los valores son medias ± error estándar. Diferencias significativas (test t de Student) respecto al control: *P=0,05.
Juntos, estos resultados sugieren que la suplementación con L. rhamnosus HN001 mejora un intervalo de funciones inmunes, que incluyen la actividad fagocítica y la proliferación celular linfocítica. El L. rhamnosus HN001 presentado en un producto bien fermentado o bien no fermentado es eficaz en provocar la mejora de la función inmune, dando el producto fermentado una mayor respuesta para algunas funciones y siendo el producto no fermentado superior en otras. Ejemplo 6 -Mejora de la inmunidad natural y adquirida mediante L. rhamnosus HN067 Experimento 1.
Los efectos inmunopotenciadores de L. rhamnosus HN067 fueron examinados haciendo un seguimiento de la actividad fagocítica de los leucocitos de la sangre periférica y los macrófagos peritoneales (indicador de inmunidad no específica) y cuantificando las concentraciones de anticuerpos específicos a un antígeno de inmunización, la toxina del cólera (usada para imitar las respuestas a vacunas entéricas) en ratones.
Se usó el siguiente protocolo experimental:
1.
Se usaron ratones BALB/c de seis a siete semanas de edad. Fueron alimentados con una dieta basada en leche desnatada durante todo el experimento.
2.
A los ratones en el grupo de ensayo (n=6) se les administró por vía oral L.rhamnosus HN067 (109 ufc/día) en 50 �l de leche desnatada durante 10 días. Los ratones de control (n=6) recibieron 50 �l de leche desnatada en polvo (sin ninguna LAB) solamente.
Resultados
Los leucocitos sanguíneos y macrófagos peritoneales de los ratones que recibieron L. rhamnosus HN067 mostraron una actividad fagocítica significativamente mayor (función fagocítica mejorada) comparado con las células de los ratones de control. Los resultados se exponen en la Tabla 9 a continuación.
Tabla 9 -Efecto de L. rhamnosus HN067 dietético sobre la función fagocítica
Tratamiento
% de leucocitos sanguíneos con actividad fagocítica % de macrófagos peritoneales con actividad fagocítica
Control
13,1 ± 1,5 76,4 ± 1,9
L. rhamnosus HN067
23,7 ± 1,5** 87,2 ± 1,9*
5 Se alimentaron ratones BALB/c (6/grupo) con una dieta basada en leche con o sin administración oral de L. rhamnosus HN067 (109 ufc/día) durante 10 días. La actividad fagocítica de los leucocitos sanguíneos y macrófagos peritoneales se determinó usando citometría de flujo y Escherichia coli marcada con isotiocianato de fluoresceína. Los valores representan media de mínimos cuadrados ± error estándar.
10 Diferencias significativas (el programa SAS) respecto al control: *P=0,0005, **P=0,0001. La concentración de anticuerpos específicos contra la toxina del cólera, un antígeno usado para inmunización oral, en los sueros y en los lavados intestinales de los ratones que recibieron L. rhamnosus HN067 también fue significativamente más
15 alta que la de los ratones de control (Tabla 10).

Tabla 10 -Efecto de la suplementación dietética con L. rhamnosus HN067 sobre las respuestas de anticuerpos del suero y mucosos a la toxina del cólera
Tratamiento
Respuesta de anticuerpos del suero (unidades/ml) Respuesta de anticuerpos mucosos (unidades/ml)
Control
63,1 ± 43,2 1969,7 ± 279,5
L. rhamnosus HN067
246,5 ± 43,2** 2995,5 ± 465,2*
20 Se alimentaron ratones BALB/c con una dieta basada en leche con o sin L. rhamnosus HN067 (109 ufc/día) durante 10 días. Los ratones fueron inmunizados por vía oral con la toxina del cólera (10 �g/dosis), un antígeno usado para imitar la infección entérica, en los días 0 y 7. Los niveles de anticuerpos en el suero y las secreciones intestinales se midieron usando un ELISA en el día 10. Los valores
25 representan media de mínimos cuadrados ± error estándar LSM. Diferencias significativas (el programa SAS) respecto al control: *P=0,002; **P=0,0039.
Experimento 2.
Los efectos inmunoestimulantes del L. rhamnosus HN067 se evaluaron en ratones usando el siguiente protocolo experimental:
1. Se usaron ratones BALB/c de seis a siete semanas de edad, que pesaban
5 20-30 g. Se les ofreció una dieta basada en leche desnatada en polvo y agua a voluntad, durante todo el experimento.
2. Después de una aclimatación durante 7 días, a los ratones en el grupo 1 (n=20) se les administró por vía oral 109 ufc (por día) de L. rhamnosus (HN067) en 50 �l de leche desnatada (grupo 1, n=20) durante 14 días. Los
10 ratones de control (grupo 2, n=20) recibieron leche desnatada sin ningún microorganismo.
3. Los efectos inmunoestimulantes fueron evaluados haciendo un seguimiento de la actividad fagocítica de los leucocitos sanguíneos y los macrófagos peritoneales, y las respuestas de proliferación de los linfocitos del bazo a la
15 fitohemaglutinina (PHA) y el lipopolisacárido (LPS) (mitógenos de las células T y B, respectivamente). Resultados
Los leucocitos sanguíneos y macrófagos peritoneales de los ratones que recibieron L. rhamnosus HN067 exhibieron una actividad fagocítica significativamente 20 mayor (un indicador de la inmunidad natural) que los leucocitos y macrófagos de los
ratones de control (Tabla 11).

Tabla 11 -Efecto de L. rhamnosus HN067 dietético sobre la función fagocítica en ratones
Tratamiento
% de leucocitos sanguíneos con actividad fagocítica % de macrófagos peritoneales con actividad fagocítica
Control
13,7 ± 0,07 64,6 ± 2,1
L. rhamnosus HN067
22,5 ± 0,07** 75,8 ± 1,7*
25 Se alimentaron ratones BALB/c con una dieta basada en leche con o sin administración oral de L. rhamnosus HN067 (109 ufc/día) durante 14 días. La actividad fagocítica de los leucocitos sanguíneos/macrófagos peritoneales se determinó en el día 14 usando citometría de flujo y Escherichia coli marcada con isotiocianato de
30 fluoresceína. Los valores representan media de mínimos cuadrados ± error estándar
LSM. Diferencias significativas (el programa SAS) respecto al control: *P=0,002; **P=0,0001.
Los ratones que recibieron L. rhamnosus HN067 durante 14 días también
mostraron respuestas de proliferación linfocítica a PHA y LPS más altas comparado
con los ratones de control (Tabla 12).

Tabla 12 -Efecto de la suplementación de L. rhamnosus HN067 sobre las respuestas de proliferación linfocítica a PHA y LPS
Tratamiento con ConA
Proliferación linfocítica a PHA Proliferación linfocítica a LPS
Control
1,18 ± 0,08 0,99 ± 0,07
L. rhamnosus HN067
1,37 ± 0,07* 1,24 ± 0,06**
10 Se alimentaron ratones BALB/c con una dieta basada en leche con o sin administración oral de L. rhamnosus HN067 (109 ufc/día) durante 14 días. Las respuestas de proliferación linfocítica de las células del bazo a PHA y LPS fueron evaluadas en el día 14 usando un kit comercial de proliferación celular (Boehringer Mannheim, Alemania). Los valores representan media de mínimos cuadrados ± error
15 estándar LSM. Diferencias significativas (el programa SAS) respecto al control: *P<0,08; **P=0,01. En resumen, los ratones que recibieron L. rhamnosus HN067 mostraron una mejora significativa de un intervalo de respuestas inmunes del huésped, que incluyen la función fagocítica de los leucocitos, las respuestas de anticuerpos a la inmunización
20 oral y las respuestas de proliferación linfocítica a mitógenos de las células T y B. Los leucocitos sanguíneos (neutrófilos y monocitos) y los macrófagos son los principales causantes de la inmunidad natural, y juegan un papel principal en la protección contra las infecciones microbianas. También está bien documentada una correlación entre las respuestas de proliferación linfocítica in vitro a mitógenos (mitógenos de las células T y
25 B) y la inmunocompetencia de un individuo. Por lo tanto, estos resultados sugieren que la suplementación con L. rhamnosus HN067 es capaz de mejorar varios aspectos de la inmunidad natural y adquirida. Ejemplo 7 -Mejora de la inmunidad natural y adquirida usando L. rhamnosus HN001 vivos y muertos por calor
30 El objetivo del presente estudio era investigar los efectos inmunopotenciadores de la cepa probiótica L. rhamnosus HN001 cuando se presenta bien en forma viva o bien muertos por calor. El efecto sobre la función inmune fue evaluado determinando la actividad fagocítica de los leucocitos de la sangre periférica. El efecto de L. rhamnosus HN001 vivos y muertos por calor sobre la inmunidad humoral fue investigado inmunizando ratones con la toxina del cólera, y midiendo las concentraciones de los anticuerpos específicos producidos.
Se usó el siguiente protocolo experimental:
1.
Se usaron ratones BALB/c de seis a siete semanas de edad, que pesaban 20-30 g.
2.
Los ratones fueron distribuidos al azar a diferentes grupos de tratamiento.
3.
Los ratones de control recibieron una dieta basada en leche desnatada en polvo durante todo el experimento.
4.
Los ratones de ensayo recibieron bien 109 ufc/día de L. rhamnosus HN001 vivos o bien 109 ufc/día de L. rhamnosus HN001 muertos por calor por día, así como una dieta basada en leche desnatada en polvo durante 14 días.
5.
Los ratones fueron inmunizados por vía oral con la toxina del cólera en el día 0 y el día 7 de alimentación.
Resultados
La alimentación con L. rhamnosus HN001 mejoró significativamente el nivel de actividad fagocítica de los leucocitos de la sangre periférica comparado con los ratones que recibieron la dieta de control (Fig. 2). Este aumento se vio con independencia de si el L. rhamnosus HN001 fue administrado en la forma viva o muertos por calor. No hubo diferencia en el nivel de actividad fagocítica entre los ratones que recibieron L. rhamnosus HN001 vivos comparado con L. rhamnosus HN001 muertos por calor.
La alimentación con L. rhamnosus HN001 tanto vivos como muertos por calor indujo un aumento en las respuestas de anticuerpos tanto del suero como mucosos, comparado con los ratones de control. Sin embargo, el nivel de respuesta fue significativamente mayor en los ratones alimentados con el L. rhamnosus HN001 vivo (Tabla 13).

Tabla 13 -Efecto de L. rhamnosus HN001 vivos y muertos por calor sobre las respuestas de anticuerpos del suero y mucosos a la toxina del cólera en ratones
Tratamiento
Respuesta de anticuerpos del suero (unidades/ml) Respuesta de anticuerpos mucosos (unidades/ml)
Control
88,69 ± 18,52 708,6 ± 146,9
L. rhamnosus HN001 vivo
214,89 ± 62,33* 2054,5 ± 285,8***
L. rhamnosus HN001 muerto por calor
174,89 ± 44,78 1533,6 ± 319,3
Se alimentaron ratones BALB/c con dietas basadas en leche y se les
5 administró por vía oral 109 ufc (por día) de L. rhamnosus HN001 bien en forma viva o bien muertos por calor durante 14 días. Los ratones de control no recibieron LAB. Los ratones fueron inmunizados por vía oral con la Toxina del Cólera en los días 0 y 7. Las respuestas de anticuerpos (suero y secreciones intestinales) se midieron usando un ELISA en el día 14. Los valores son media ± error estándar. Diferencias significativas
10 (test t de Student) respecto al control: *P=0,05; ***P=0,0005. Estos resultados sugieren que el L. rhamnosus HN001, tanto vivo como muerto por calor, es capaz de mejorar aspectos de la inmunidad natural y adquirida en los ratones.
Ejemplo 8 -Propiedades antiinfecciosas de B. lactis HN019 y L. rhamnosus 15 HN001
Los objetivos del estudio actual fueron:
1. Evaluar la eficacia de protección de B. lactis HN019 y L. rhamnosus HN001 contra el patógeno gastrointestinal Salmonella typhimurium.
2. Determinar el papel de la inmunoestimulación inducida por B. lactis HN019 y 20 L. rhamnosus HN001 en la protección contra la infección por S. typhimurium en ratones.
Las propiedades antiinfecciosas fueron evaluadas mediante la medida de la translocación bacteriana al hígado y bazo. Los efectos inmunopotenciadores fueron examinados determinando la función fagocítica (leucocitos de la sangre periférica y
25 macrófagos peritoneales) y las respuestas proliferativas linfocíticas a un mitógeno de las células T (PHA). Se usó el siguiente protocolo experimental:
1.
Se usaron ratones BALB/c de seis a siete semanas de edad, que pesaban
20-30 g.
2.
Los ratones fueron distribuidos al azar a 4 diferentes grupos de tratamiento y fueron alojados individualmente.
3.
Todos los ratones recibieron una dieta basada en leche desnatada en polvo durante todo el experimento.
4.
Los ratones de ensayo comenzaron una alimentación diaria de B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 (109 ufc/día) 7 días antes del desafío, y continuaron con ella a lo largo de la duración de la prueba.
5.
Los ratones a los que se administró B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 y un grupo de control (sin LAB) fueron sometidos a un desafío por vía oral con Salmonella typhimurium (ATCC 1772), 8 x 105 ufc/día, durante 5 días, empezando en el día 7.
6.
Un grupo de control no infectado no recibió el desafío con S. typhimurium.
7.
En el día 6 después del desafío, se usaron los ratones para la medida de la translocación bacteriana al hígado y bazo, y para la evaluación de la función inmune.
Resultados
Tanto el B. lactis HN019 como el L. rhamnosus HN001 suplementados a los ratones mostraron niveles significativamente más bajos de translocación bacteriana en el hígado y el bazo que los ratones alimentados con S. typhimurium sola (Fig. 3).
La infección de desafío dio como resultado una supresión significativa de la función fagocítica (Fig. 4); la actividad fagocítica de los ratones de control sometidos al desafío con S. typhimurium fue significativamente más baja que la de los ratones no infectados. Sin embargo, la infección con S. typhimurium no tuvo efecto sobre la capacidad fagocítica de los leucocitos de la sangre periférica de los ratones suplementados con B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001. Esto fue mostrado por niveles similares de actividad fagocítica en los ratones suplementados con B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 y sometidos al desafío con S. typhimurium y los ratones de control no infectados normales.
Tanto los ratones suplementados con B. lactis HN019 como con L. rhamnosus HN001 mostraron respuestas proliferativas linfocíticas a PHA más altas que el control sometido al desafío con S. typhimurium (Fig. 5). No hubo diferencia significativa en la respuesta entre los ratones que recibieron B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 y los ratones de control no infectados.
Juntos, estos resultados sugieren que la suplementación con B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 es capaz de conferir protección contra patógenos entéricos tales como Salmonella typhimurium. La resistencia mejorada a la infección es acompañada por un aumento en el rendimiento inmune.

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una composición de un cultivo biológicamente puro de B. lactis HN019, con número de depósito en AGAL NM97/09513, de fecha 18 de agosto de 1997, en una concentración inmunoestimulante, con un excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.
  2. 2.
    Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, que contiene B. lactis HN019, con número de depósito en AGAL NM97/09513, de fecha 18 de agosto de 1997, y uno cualquiera o más de L. rhamnosus HN001, con número de depósito en AGAL NM97/09514, de fecha 18 de agosto de 1997, L. rhamnosus HN067, con número de depósito en AGAL NM97/01925, de fecha 11 de febrero de 1998 y L. acidophilus HN017, con número de depósito en AGAL NM97/09515, de fecha 18 de agosto de 1997.
  3. 3.
    Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho excipiente
    o diluyente fisiológicamente aceptable es un alimento.
  4. 4.
    Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicho alimento es uno cualquiera entre leche fermentada, yogur, queso, bebida láctea o leche en polvo.
  5. 5.
    Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que es una composición farmacéutica y en la que dicho excipiente o diluyente es un excipiente o diluyente farmacológicamente aceptable.
  6. 6.
    La composición de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en terapia.
  7. 7.
    La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para el uso en la mejora de la inmunidad natural y adquirida.
  8. 8.
    El uso de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de un medicamento para el uso en la mejora de la inmunidad natural y adquirida.
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