ES2399324T3 - Bacterias del ácido láctico que mejoran la inmunidad - Google Patents

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Abstract

Un cultivo biológicamente puro de L. rhamnosus HN001 AGAL número de depósito NM97/09514 fechado el 18 deagosto de 1.997.

Description

Bacterias del ácido láctico que mejoran la inmunidad
Campo técnico
Esta invención se refiere a nuevas cepas de bacterias del ácido láctico y su uso en la mejora de la inmunidad.
Técnica anterior
El consumo de productos que contienen bacterias del ácido láctico (BAL) está asociado a una serie de beneficios para la salud incluyendo la mejora de la inmunidad. Hay cientos de cepas de bacterias del ácido láctico pero sólo algunas cepas presentan propiedades que estimulan la salud. La capacidad de estas bacterias para tolerar ácidos y sales biliares, adheridas a células epiteliales de las mucosas y sobrevivir al paso por el tubo digestivo se considera un importante criterio para la selección de cepas que estimulan la salud. Sólo se han identificado hasta la fecha algunas cepas de bacterias del ácido láctico con beneficios para la salud demostrados.
Se conocen cepas de BAL que presentan buena adhesión a las células del epitelio mucosal del intestino delgado que se prestan de ese modo a aplicaciones terapéuticas a partir de la Patente de Nueva Zelanda 248057. Los microorganismos descritos en esta patente mejoran tanto la inmunidad natural (función de los fagocitos) como la inmunidad adquirida (respuestas de los anticuerpos y respuestas de proliferación de linfocitos).
Es deseable que haya otras bacterias BAL que mejoren un amplio espectro de respuestas inmunitarias incluyendo la función de los fagocitos.
Es un objeto de esta invención ir de algún modo a conseguir estas desideratas o al menos ofrecer al público una elección útil de bacterias del ácido láctico que mejoren la inmunidad.
Saxelin, M., 1.997, indica que la cepa Lactobacillus rhamnosus probiótica LGG (ATCC 53103) puede sobrevivir y adherirse a células en el tubo digestivo, tratar o evitar trastornos intestinales tales como los causados por rotavirus y se pueden usar con seguridad en alimentos funcionales y clínicos (Saxelin M. 1.997. Lactobacillus GG – una cepa probiótica humana con amplia documentación clínica. Food Rev. Int. 13 (2): 293-313).
Descripción de la invención
De acuerdo con esto, en un aspecto la invención se puede decir, en general, que consiste en un cultivo biológicamente puro de Lactobacillus rhamnosus HN001, AGAL número de depósito NM97/09514 fechado el 18 de agosto de 1.997.
En una realización dicha composición contiene dos o más cualesquiera de dichas cepas.
Preferiblemente dicho excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable es un alimento.
Preferiblemente dicho alimento es uno cualquiera de: leche cultivada, yogur, queso, bebida láctea o polvo lácteo.
Alternativamente, dicha composición es una composición farmacéutica y dicho excipiente o diluyente es excipiente o diluyente farmacológicamente aceptable.
En otra realización se puede decir, en general, que la invención consiste en un método para mejorar la inmunidad natural y adquirida que comprende administrar a un mamífero uno cualquiera de los cultivos biológicamente puros anteriores en una proporción de dosis inmunoestimulante.
En otra realización, están presentes cultivos sustancialmente biológicamente puros de dos o tres de las cepas ya definidas.
Preferiblemente dicho cultivo se administra en la forma de una composición con un excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.
Preferiblemente dicho excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable es un alimento.
Preferiblemente dicho alimento es: leche cultivada, yogur, queso, bebida láctea o polvo lácteo.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el efecto de enriquecimiento de ratones con producto fermentado con L. rhamnosus HN001 o producto no fermentado que contiene L. rhamnosus HN001 sobre la actividad de los fagocitos de leucocitos
sanguíneos periféricos como se describe en el ejemplo 5. Se alimentaron ratones BALB/c con dietas a base de leche que contenía 109 cfu (al día) de L. rhamnosus HN001 en producto fermentado o no fermentado durante 14 días. La actividad fagocítica de los leucocitos sanguíneos periféricos se determinó usando citometría de flujo y Escherichia coli marcada con isotiocianato de fluoresceína. Los valores son media ± error estándar. Diferencias significativas (ANOVA, el programa SAS) del control: **P<0,0001.
La Figura 2 muestra el efecto de enriquecimiento de ratones con L. rhamnosus HN001 vivos o L. rhamnosus HN001 matados por calor sobre la actividad fagocítica de leucocitos sanguíneos periféricos como se describe en el ejemplo
7. Se alimentaron ratones BALB/c con dietas a base de leche y se administraron por vía oral 109 cfu (al día) de L. rhamnosus HN001 vivos o matados por calor durante 14 días. La actividad fagocítica de los leucocitos sanguíneos periféricos y macrófagos peritoneales se determinó usando citometría de flujo y Escherichia coli marcada con isotiocianato de fluoresceína. Los valores son media ± error estándar. Diferencias significativas (ANOVA, el programa SAS) del control, **P<0,0001.
La Figura 3 muestra el efecto de enriquecimiento de ratones con L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 sobre traslocaciones de las bacterias en ratones expuestos a S. typhimurium como se describe en el ejemplo 8. Se expusieron ratones BALB/c no enriquecidos y enriquecidos con B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 por vía oral a
S. typhimurium después de enriquecimiento diario continuo. Seis días después se mataron humanitariamente los ratones expuestos y se recogieron los hígados y bazos para controlar la traslocación bacteriana. Después se cultivaron suspensiones de tejidos de los órganos recogidos en placas de agar MacConkey durante 24-48 h previas a enumeración. Los valores son media ± error estándar. Diferencias significativas (ANOVA, el programa SAS) del control: *P<0,05.
La Figura 4 muestra el efecto de enriquecimiento de ratones con L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 sobre la actividad fagocítica de leucocitos sanguíneos periféricos de ratones expuestos a S. typhimurium como se describe en el ejemplo 8. Se expusieron ratones BALB/c no enriquecidos y enriquecidos con B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 por vía oral a S. typhimurium después de enriquecimiento diario continuo. La actividad fagocítica de los leucocitos sanguíneos periféricos se determinó seis días después de exposición usando citometría de flujo y Escherichia coli marcada con isotiocianato de fluoresceína. Los valores son media ± error estándar. Valores (media ± error estándar) con diferentes sobreescritos son significativamente diferentes (ANOVA, el programa SAS): P<0,01.
La Figura 5 muestra el efecto de enriquecimiento de ratones con L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 sobre las respuestas proliferativas de los linfocitos del bazo de ratones expuestos a S. typhimurium como se describe en el ejemplo 8. Se expusieron ratones BALB/c no enriquecidos y enriquecidos con B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 por vía oral a S. typhimurium después de enriquecimiento diario continuo. Seis días después de exposición se midieron las respuestas proliferativas de los linfocitos del bazo de manera colorimétrica después de la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina durante las 16 h finales de la incubación de 96 h. Los valores (media ± error estándar) con diferentes sobreescritos son significativamente diferentes (ANOVA, el programa SAS): P<0,01).
Modos de llevar a cabo la invención
Se han depositado cultivos liofilizados de las cuatro cepas de bacterias en los Laboratorios Analíticos del Gobierno Australiano (AGAL, por sus siglas en inglés), El Laboratorio Regional de Nueva Gales del Sur, Calle Suakin 1, Pymble, NSW 2.073, Australia. Son detalles de los depósitos:
Cepa Número Fecha
L. acidophilus HN017 NM97/09515 18 de agosto de 1.997
L. rhamnosus HN001 NM97/09514 18 de agosto de 1.997
B. lactis HN019 NM97/09513 18 de agosto de 1.997
L. rhamnosus HN067 NM97/01925 11 de febrero de 1.998
Se ha encontrado que las cuatro cepas identificadas anteriormente mejoran un amplio espectro de respuestas inmunitarias incluyendo respuestas inmunitarias tanto naturales como adquiridas.
Ejemplo 1 – Morfología y propiedades generales
Se usaron análisis RAPD, secuenciación de ARNr 16S y análisis SDS-PAGE para confirmar la caracterización taxonómica de las cepas. También se encontró que L. acidophilus HN017 era genéticamente diferente de L. acidophilus (LC1) de la Patente de Nueva Zelanda Nº 248057.
Se usaron análisis RAPD, secuenciación de ARNr 16S y análisis SDS-PAGE para confirmar la caracterización taxonómica de L. rhamnosus HN067; cebadores específicos de las especies usados para caracterización de L. rhamnosus HN067 a nivel molecular incluido Pr I (directo) 5-CAGACTGAAAGTCTGACGG-3 y Pha II (inverso) 5-GCGATGCG AATTTCTATTATT-3.
La morfología y las propiedades de fermentación del azúcar de esta cepa se detallan en las Tablas 1 y 2. Tabla 1 – Morfología y otras características
L. acidophilus HN017
L. rhamnosus HN001 B. lactis HN019 L. rhamnosus HN067
Varillas cortas a medias con extremos redondos, que tienen lugar generalmente por separado o en pares o cadenas cortas, cuando se cultivan en caldo MRS. Varillas facultativamente anaerobias, catalasa negativas, que no forman esporas, gram positivas, con temperatura de crecimiento óptimo de 37±1°C y pH óptimo de 6,0-6,5. Estas son bacterias obligatoriamente homofermentativas y no se produce gas de glucosa.
Varillas cortas a medias con extremos cuadrados en cadenas, generalmente 0,7 x 1,1 x 2,0 – 4,0 μm, cuando se cultivan en caldo MRS. Varillas anaerobias facultativas, catalasa negativas, que no forman esporas, no móviles, gram positivas, con temperatura de crecimiento óptimo de 37±1°C y pH óptimo de 6,0-6,5. Estas son bacterias facultativamente heterofermentativas y no se produce gas de glucosa. Varillas microaerofílicas a anaerobias con formas características tales como células ensanchadas medias, disposición de células en “V” o empalizada cuando se cultivan sobre placas de agar TPY. En caldo MR5 con hidrocloruro de cisteína al 0,05%, forman células ensanchadas medias y células con forma de palo de golf (extremidades espatuladas). Varillas catalasa negativas, no móviles y que no forman esporas, gram positivas, con temperatura de crecimiento óptimo de 37±1°C y pH óptimo de 6,0-7,0. Fructosa6-fosfato-fosfo-cetolasa positivas. Varillas cortas a medias con extremos cuadrados en cadenas, generalmente 0,7 x 1,1 x 2,0 a 4,0 μm, cuando se cultivan en caldo MRS. Varillas anaerobias facultativas, que no forman esporas, no móviles, catalasa negativas, gram positivas, con temperatura de crecimiento óptimo de 37±1°C y pH óptimo de 6,0-6,5. Estas son bacterias facultativamente heterofermentativas y no se produce gas de glucosa.
Tabla 2 – Modelo de fermentación de carbohidratos de cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium seleccionadas.
Nº S1.
Nombre de la bacteria Puntuación*
1
L. acidophilus HN 017 5755546
2
L. rhamnosus HN001 5757177
3
B. lactis HN019 1051622
4
L. rhamnosus HN067 5757175
Se usó estuche de fermentación de azúcar API 50 CH para determinar el modelo de fermentación del azúcar. 10
* Las puntuaciones se basan en puntuaciones de 22 azúcares prominentes (manual de Bergey)
Ejemplo 2 – Adhesión a células intestinales
15 La capacidad de las cepas probióticas para adherirse a células epiteliales intestinales humanas (HT-29 y CaCo-2) se evaluó in vitro usando estirpes celulares diferenciadas. Se cultivaron monocapas de células HT-29 y CaCo-2 sobre placas de portaobjetos y se pusieron en placas de múltiples pozos. Después se añadieron 108 cfu/ml de BAL en 1 ml de sobrenadante de cultivo gastado a capas de células junto con 1 ml de medio DMEM y se incubaron durante 1 h a 37°C en 10% de CO2-90% de aire. Se lavaron las monocapas 4 veces con PBS, se fijaron en metanol, se tiñeron
20 con tinción de Gram y se determinó de manera microscópica el número de bacterias adheridas a células epiteliales. De promedio, se contaron 20 campos y los resultados se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3 – Adherencia a estirpes* celulares HT-29 y CaCo-2
CEPA
HT-29 CaCo-2
L acidophilus HN 017
98 ± 17 171 ±16
L. rhamnosus HN 001
161 ± 18 218 ± 35
B. lactis HN 019
188 ± 27 194 ± 25
25 * Número (media ± SEM) de bacterias/100 células epiteliales Ejemplo 3 – Mejora de la inmunidad natural y adquirida 4
Se examinaron los efectos que mejoran la inmunidad de las tres cepas L. rhamnosus HN001, L. acidophilus HN017 y B. lactis HN019 determinando la función de los fagocitos (leucocitos sanguíneos y macrófagos peritoneales) y cuantificando las concentraciones de anticuerpos específicos a antígenos proteicos usados para imitar respuestas a vacunas en ratones.
5 Se usó el siguiente protocolo experimental:
1. Se usaron ratones BALB/c de seis a siete semanas, que pesaban 20-30 g.
10 2. Se distribuyeron los ratones de manera aleatoria en diferentes grupos de tratamiento (Tabla 4).
3. Se alimentaron los ratones con L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 (109 cfu/día) en 50 μl de leche desnatada durante 10 días. Los ratones de control recibieron 50 μl de leche desnatada en polvo sólo.
15 4. Todos los ratones recibieron dieta a base de leche desnatada en polvo durante todo el experimento.
Los leucocitos sanguíneos y macrófagos de ratones que recibieron L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 mostraron una capacidad fagocítica significativamente mayor comparado con células de ratones de control (Tabla 4). La producción de radicales oxígeno (explosión oxidativa) por leucocitos de ratones de alimentación
20 probiótica también fue mayor que para los ratones de control (datos no mostrados).
Tabla 4 - El efecto de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 y B. lactis HN019 dietéticos sobre la función fagocítica en ratones
Tratamiento
% Leucocitos sanguíneos con actividad fagocítica % Macrófagos peritoneales con actividad fagocítica
Control
14,33 ± 0,87 66,1 ±3,5
L. acidophilus HN017
22,7 ± 1,21** 79,0 ± 1,0 **
L. rhamnosus HN001
24,84 ± 0,93 ** 80,5 ± 1,8 **
B. lactis HN019
23,19 ±0,95 ** 77,4 ± 2,6 *
25 Se administraron por vía oral a ratones BALB/c 109 cfu (al día) de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 durante 10 días. Se determinó la actividad fagocítica de leucocitos sanguíneos y macrófagos peritoneales usando citometría de flujo y Escherichia coli marcada con isotiocianato de fluoresceína. Los valores son media ± error estándar. Diferencias significativas (prueba t de Student) del control: *P < 0,05, **P < 0,01.
30 La concentración de anticuerpos IgG específicos en los sueros y en los lavados intestinales de ratones que recibieron L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 también fue mayor que la de ratones de control (Tabla 5).
35 Tabla 5 - El efecto de L. acidophilus HN017, L rhamnosus HN001 y B. lactis HN019 dietéticos sobre las respuestas de anticuerpos en suero y mucosas.
Tratamiento
Respuesta de anticuerpos en suero (unidades/ml) Respuesta de anticuerpos en mucosas (unidades/ml)
Control
80,2 ± 6,0 1.350 ± 96,0
L. acidophilus HN017
134,6 ± 25,2 * 1.548 ± 270,0
L. rhamnosus HN001
118,5 ± 12,5 ** 1.512 ± 198,0
B. lactis HN019
158,1 ±51,6*** 1.548 ± 234,0
Se administraron por vía oral a ratones BALB/c 109 cfu (al día) de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B.
40 lactis HN019 durante 10 días. Se inmunizaron los ratones con toxina de cólera (un antígeno usado para imitar la infección entérica) los días 0 y 7. La concentración de anticuerpos específicos en suero y secreciones intestinales se midió usando ELISA el día 10. Los valores representan media ± error estándar. Diferencias significativas (prueba t de Student) del control: *P = 0,08; **P<0,05; ***P<0,01.
45 Ejemplo 4 – Efectos de inmunoestimulación después de enriquecimiento con BAL durante cuatro semanas.
Los efectos inmunoestimulantes de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 y B. lactis HN019 se evaluaron en ratones usando el siguiente protocolo experimental:
50 1. Se usaron ratones BALB/c de seis a siete semanas, que pesaban 20-30 g.
2.
Se distribuyeron los ratones de manera aleatoria (18/grupo) en diferentes grupos de tratamiento.
3.
Después de aclimatización (durante 7 días), se les dieron a los ratones 109 cfu (al día) de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 en 50 μl de leche desnatada, durante 28 días (desde el día 0 al día 28). Los ratones de control recibieron 50 μl de leche desnatada (sin ningún microorganismo) sólo.
5 4. Se ofreció a los ratones una dieta a base de leche desnatada en polvo y agua a voluntad, durante todo el experimento.
5. Se evaluaron los efectos inmunoestimulantes por control de la actividad fagocítica de leucocitos sanguíneos y macrófagos peritoneales, actividad de las células-NK de linfocitos esplénicos, respuestas de proliferación de linfocitos (células del bazo) para un mitógeno de células-T, ConA (un indicador de inmunidad mediada por células) y respuestas de los anticuerpos a vacuna de tétanos.
Como se ve en la Tabla 6, los leucocitos (neutrófilos, monocitos y macrófagos) de ratones que recibieron L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 presentaron actividad fagocítica significativamente 15 mayor (un indicador de inmunidad natural) que los leucocitos de ratones de control.
Tabla 6 - El efecto de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 y B. lactis HN019 dietéticos en ratones.
Tratamiento
% Leucocitos sanguíneos con actividad fagocítica % Macrófagos peritoneales con actividad fagocítica
Control L. acidophilus HN017L. rhamnosus HN001B. lactis HN019
15,5 29,4** 24,2** 31,1** 72,67 82,2* 82,8** 83,0**
Se les dieron a los ratones (18/grupo) 109 cfu (al día) de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 en 50 μl de leche desnatada durante 28 días. Se determinó la actividad fagocítica de leucocitos sanguíneos/macrófagos peritoneales el día 28 usando citometría de flujo y E. coli marcada con isotiocianato de fluoresceína. Los valores son medias cuadradas mínimas. Diferencias significativas (el análisis SAS): *P < 0,002, **P < 0,0005.
25 El consumo de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 durante 28 días también dio como resultado un aumento en la actividad de las células-NK, respuestas de proliferación de linfocitos a ConA y respuestas de los anticuerpos a vacuna de Tétanos. Para todos estos indicadores de inmunocompetencia, los ratones que recibieron L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 presentaron mayores respuestas que los de los ratones de control (Tabla 7).
Además estos resultados muestran que el enriquecimiento durante periodos prolongados con L. acidophilus HN017,
L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 es capaz de inducir una mejora sostenida en diversos aspectos de inmunidad natural y adquirida.
35 Tabla 7 -El efecto de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 y B. lactis HN019 dietéticos sobre la actividad de las células-NK y respuestas de proliferación de linfocitos a ConA y respuestas de los anticuerpos a vacuna de Tétanos.
Tratamiento de ConA
Actividad de las células NK (%) Proliferación de los linfocitos para ConA Respuestas de los anticuerpos a vacuna
(absorbancia)
del Tétanos (unidades/ml)
Control
8,8 1,4 ±0,125 402,5 ±41,4
L. acidophilus HN017
9,9 1,6 ±0,44 923,9 ± 116,0*
L. rhamnosus HN001
11,5 1,8 ±0,1* 711,5 ±127,2*
B. lactis HN019
10,5 1,7 ±0,5* 844,6 ± 134,7*
Se dieron a los ratones (18/grupo) 109 cfu (al día) de L. acidophilus HN017, L. rhamnosus HN001 o B. lactis HN019 en 50 μl de leche desnatada durante 28 días (es decir, desde los días 0 a 28). La actividad de las células-NK de los linfocitos esplénicos se determinó el día 28 usando citometría de flujo y células Yac-1 marcadas con D275. Las respuestas de proliferación de los linfocitos de linfocitos esplénicos a ConA se evaluaron el día 28 usando un
45 estuche de proliferación de células comercial (Boehringer Mannheim, Alemania). Para las respuestas de los anticuerpos, se inmunizaron ratones con vacuna de Tétanos (50 μl/dosis, CSL, Australia) los días 7 y 21. La concentración de los anticuerpos específicos se determinó usando un ELISA; se usó antígeno suministrado por los fabricantes de vacunas (CSL, Australia) para placas de recubrimiento. Los valores son medias cuadradas mínimas de 18 ratones. Diferencias significativas (el análisis SAS): *P <0,05.
Ejemplo 5 – Mejora de la inmunidad natural y adquirida usando productos fermentados frente a no fermentados. 15
El objeto fue evaluar la eficacia inmunoestimuladora de yogur fabricado (fermentado) usando la cepa probiótica L. rhamnosus HN001 comparado con producto no fermentado que contiene L. rhamnosus HN001. Los efectos inmunoestimuladores se examinaron determinando la función fagocítica (leucocitos sanguíneos periféricos y macrófagos peritoneales) y respuestas proliferativas de los linfocitos a un mitógeno de células-B (LPS).
Se usó el siguiente protocolo experimental:
1.
Se usaron ratones BALB/c de seis a siete semanas, que pesaban 20-30 g.
2.
Se distribuyeron los ratones de manera aleatoria en diferentes grupos de tratamiento.
3.
Los ratones de control recibieron una dieta a base de leche entera en polvo durante todo el experimento.
4.
Los ratones del ensayo recibieron 2,5 g de yogur fabricado usando L. rhamnosus HN001 (109 cfu/día) o 2,5 g de leche completa que contenía L. rhamnosus HN001 (109 cfu/día) al día así como una dieta a base de leche entera en polvo durante 14 días.
Resultados
Los ratones que recibieron yogur fabricado con L. rhamnosus HN001 o leche entera que contenía L. rhamnosus HN001 mostraron un nivel significativamente mayor de actividad fagocítica de leucocitos sanguíneos periféricos que se observó en ratones que recibieron la dieta de control (Fig. 1). Este aumento visto con independencia de si se suministraba L. rhamnosus HN001 en el yogur (fermentado con L. rhamnosus HN001) o producto no fermentado que contenía L. rhamnosus HN001. No hubo diferencia en el nivel de actividad fagocítica entre ratones que recibían el yogur fermentado fabricado usando L. rhamnosus (HN001) comparado con producto WMP no fermentado que contenía L. rhamnosus (HN001).
Los ratones alimentados con producto tanto no fermentado como fermentado con L. rhamnosus HN001 mostraron mayores respuestas proliferativas de los linfocitos a LPS que los ratones de control (Tabla 8). No hubo diferencia significativa en la respuesta entre los ratones que recibieron producto no fermentado que contenía L. rhamnosus HN001 y los ratones que recibieron producto fermentado con L. rhamnosus HN001.
Tabla 8 - El efecto de L. rhamnosus HN001 fermentado y no fermentado sobre las respuestas proliferativas de los linfocitos en ratones
Tratamiento
Proliferación de linfocitos a LPS (absorbancia)
Control (WMP)
0,4699 ± 0,028
WMP Fermentado con L. rhamnosus HN001
0,5361 ± 0,028
WMP No fermentado con L. rhamnosus HN001
0,5518 ±0,028*
Se alimentaron ratones BALB/c sobre dietas a base de leche que contenían 109 cfu (al día) de L. rhamnosus HN001 en producto no fermentado o yogur fabricado con L. rhamnosus HN001 (producto fermentado) durante 14 días. Los ratones de control recibieron dieta a base de leche sin ninguna BAL. Se midieron de manera colorimétrica las respuestas proliferativas después de la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina durante las 16 h finales de la incubación de 96 h. Los valores son medias ± error estándar. Diferencias significativas (prueba t de Student) del control: *P=0,05.
Además estos resultados sugieren que el enriquecimiento con L. rhamnosus HN001 mejora una serie de funciones inmunitarias incluyendo actividad fagocítica y proliferación de células linfocíticas. L. rhamnosus HN001 presentada en producto fermentado o no fermentado es eficaz en la obtención de aumento de la función inmunitaria con producto fermentado dando una respuesta mayor para algunas funciones y siendo no fermentado superior en otros.
Ejemplo 6 – Mejora de inmunidad natural y adquirida por L. rhamnosus HN067
Experimento 1.
Los efectos inmunoestimulantes de L. rhamnosus HN067 se examinaron por control de la capacidad fagocítica de los leucocitos sanguíneos periféricos y macrófagos peritoneales (indicador de inmunidad no específica) y cuantificación de concentraciones de anticuerpos específicos para un antígeno de inmunización, toxina de cólera (usada para imitar las respuestas a vacunas entéricas) en ratones.
Se usó el siguiente protocolo experimental:
1.
Se usaron ratones BALB/c de seis a siete semanas, que pesaban 20-30 g. Se alimentaron con una dieta a base de leche desnatada durante todo el experimento.
2.
Se administró por vía oral a los ratones en el grupo de ensayo (n=6) L. rhamnosus HN067 (109 cfu/día) en 50 μl de
5 leche desnatada durante 10 días. Los ratones de control (n=6) recibieron 50 μl de leche desnatada en polvo (sin ninguna BAL) sólo.
Resultados
Los leucocitos sanguíneos y macrófagos peritoneales de los ratones que recibieron L. rhamnosus HN067 mostraron actividad fagocítica significativamente mayor (función fagocítica mejorada) comparado con células de los ratones de control. Los resultados se señalan en la Tabla 9 a continuación.
Tabla 9 - El efecto de L. rhamnosus HN067 dietético sobre la función de los fagocitos 15
Tratamiento
% Leucocitos sanguíneos con actividad fagocítica % Macrófagos peritoneales con actividad fagocítica
Control
13,1 ± 1,5 76,4 ± 1,9
L. rhamnosus HN067
23,7 ± 1,5** 87,2 ± 1,9*
Se alimentaron ratones BALB/c (6/grupo) con dieta a base de leche con o sin administración oral de L. rhamnosus HN067 (109 cfu/día) durante 10 días. La actividad fagocítica de leucocitos sanguíneos y macrófagos peritoneales se determinó usando citometría de flujo y E. coli marcada con isotiocianato de fluoresceína. Los valores representan media cuadrada mínima ± error estándar LSM. Diferencias significativas (el programa SAS) del control: *P=0,0005, **P=0,0001.
La concentración de anticuerpos específicos a toxina de cólera, un antígeno usado para inmunización oral, en los sueros y en los lavados intestinales de ratones que recibieron L. rhamnosus HN067 fue también significativamente
25 mayor que la de ratones de control (Tabla 10).
Tabla 10 -El efecto de enriquecimiento dietético con L. rhamnosus HN067 sobre las respuestas de los anticuerpos en suero y en mucosas a toxina de cólera.
Tratamiento
Respuesta de anticuerpos en suero (unidades/ml) Respuesta de anticuerpos en mucosa (unidades/ml)
Control
63,1 ±43,2 1.969,7 ± 279,5
L. rhamnosus HN067
246,5 ± 43,2** 2.995,5 ± 465,2*
Se alimentaron ratones BALB/c con dieta a base de leche con o sin L. rhamnosus HN067 (109 cfu/día) durante 10 días. Se inmunizaron ratones por vía oral con toxina de cólera (10 μg/dosis), un antígeno usado para imitar infección entérica, los días 0 y 7. Los niveles de anticuerpos en suero y secreciones intestinales se midieron usando ELISA el día 10. Los valores representan media cuadrada mínima ± error estándar LSM. Diferencias significativas (el
35 programa SAS) del control: *P=0,02; **P=0,0039.
Experimento 2.
Los efectos inmunoestimulantes de L. rhamnosus HN067 se evaluaron en ratones usando el siguiente protocolo experimental:
1. Se usaron ratones BALB/c de seis a siete semanas, que pesaban 20-30 g. Se les ofreció dieta a base de leche desnatada en polvo y agua a voluntad, durante todo el experimento.
45 2. Después de aclimatización durante 7 días, se les administró a los ratones en el grupo 1 (n=20) por vía oral 109 cfu (al día) de L. rhamnosus HN067 en 50 μl de leche desnatada (grupo 1 n=20) durante 14 días. Los ratones de control (grupo 2, n=20) recibieron leche desnatada sin ningún microorganismo.
3. Los efectos inmunoestimulantes se evaluaron por control de la actividad fagocítica de leucocitos sanguíneos y macrófagos peritoneales y respuestas de proliferación de linfocitos de bazo a fitohemaglutinina (PHA, por sus siglas en inglés) y lipopolisacárido (LPS) (mitógenos de células T y B, respectivamente).
55 Resultados
Los leucocitos sanguíneos y macrófagos peritoneales de ratones que recibieron L. rhamnosus HN067 presentaron actividad fagocítica significativamente mayor (un indicador de inmunidad natural) que los leucocitos y macrófagos de los ratones de control (Tabla 11).

Tabla 11 - El efecto de L. rhamnosus HN067 dietético sobre la función fagocítica en ratones.
Tratamiento
% Leucocitos sanguíneos con actividad fagocítica % Macrófagos peritoneales con actividad fagocítica
Control
13,7 ± 0,07 64,6 ± 2,1
L. rhamnosus HN067
22,5 ± 0,07** 75,8 ± 1,7*
Se alimentaron ratones BALB/c con dieta a base de leche con o sin administración oral de L. rhamnosus HN067 (109 cfu/día) durante 14 días. Se determinó la actividad fagocítica de leucocitos sanguíneos/macrófagos peritoneales el día 14 usando citometría de flujo y E. coli marcada con isotiocianato de fluoresceína. Los valores representan media
10 cuadrada mínima ± error estándar LSM. Diferencias significativas (el programa SAS): *P=0,002, **P=0,0001.
Los ratones que recibieron L. rhamnosus HN067 durante 14 días también mostraron mayores respuestas de proliferación de linfocitos a PHA y LPS comparado con ratones de control (Tabla 12).
15 Tabla 12 - El efecto de enriquecimiento de L. rhamnosus HN067 sobre las respuestas de proliferación de linfocitos a PHA y LPS.
Tratamiento de ConA
Proliferación PHA de linfocitos para Proliferación de linfocitos para LPS
Control
1, 18 ±0, 08 0, 99 ± 0, 07
L. rhamnosus HN067
1, 37 ±0, 07* 1, 24 ± 0, 06**
Se alimentaron ratones BALB/c con dieta a base de leche con o sin administración oral de L. rhamnosus HN067 (109
20 cfu/día) durante 14 días. Las respuestas de proliferación de linfocitos de células de bazo a PHA y LPS se evaluaron el día 14 usando un estuche de proliferación celular comercial (Boehringer Mannheim, Alemania). Los valores representan media cuadrada mínima ± error estándar LSM. Diferencias significativas (el programa SAS): *P<0,08, **P<0,01.
25 En resumen, los ratones que recibieron L. rhamnosus HN067 mostraron mejora significativa de una serie de respuestas inmunitarias del huésped incluyendo la función fagocítica de los leucocitos, las respuestas de los anticuerpos a inmunización oral y respuestas de proliferación de los linfocitos a mitógenos de células T y B. Los leucocitos sanguíneos (neutrófilos y monocitos) y macrófagos son efectores principales de inmunidad natural y desempeñan un papel principal en la protección frente a infecciones microbianas. También está documentada una
30 correlación entre respuestas de proliferación de linfocitos in vitro a mitógenos (mitógenos de células T y B) e inmunocompetencia de un individuo. Por lo tanto, estos resultados sugieren que el enriquecimiento con L. rhamnosus HN067 es capaz de mejorar diversos aspectos de la inmunidad natural y adquirida.
Ejemplo 7 – Mejora de la inmunidad natural y adquirida usando L. rhamnosus HN001 vivo y muerto por calor.
35 El objeto del presente estudio fue investigar los efectos inmunoestimuladores de la cepa probiótica L. rhamnosus HN001 cuando estaba presente en la forma viva o matada por calor. El efecto sobre la función inmunitaria se evaluó por determinación de la actividad fagocítica de los leucocitos sanguíneos periféricos. El efecto de L. rhamnosus HN001 vivos y matados por calor sobre la inmunidad humoral se investigó inmunizando ratones con toxina de cólera
40 y midiendo las concentraciones de los anticuerpos específicos producidos.
Se usó el siguiente protocolo experimental:
1. Se usaron ratones BALB/c de seis a siete semanas, que pesaban 20-30 g. 45
2.
Se distribuyeron los ratones de manera aleatoria en diferentes grupos de tratamiento.
3.
Los ratones de control recibieron una dieta a base de leche desnatada en polvo durante todo el experimento.
50 4. Los ratones del ensayo recibieron 109 cfu/día de L. rhamnosus HN001 vivo o 109 cfu/día de L. rhamnosus HN001 muerto por calor al día así como una dieta a base de leche desnatada en polvo durante 14 días.
5. Se inmunizaron por vía oral ratones con toxina de cólera el día 0 y el día 7 de alimentación.
55 Resultados
La alimentación de L. rhamnosus HN001 mejoró significativamente el nivel de actividad fagocítica de los leucocitos
sanguíneos periféricos comparado con ratones que recibieron la dieta de control (Fig 2). Este aumento fue visto con independencia de si se suministraba la L. rhamnosus HN001 en la forma viva o matada por calor. No hubo diferencia en el nivel de actividad fagocítica entre los ratones que recibieron L. rhamnosus HN001 vivo comparado con L. rhamnosus HN001 muerto por calor.
La alimentación de L. rhamnosus HN001 tanto vivo como muerto indujo un aumento en las respuestas de los anticuerpos tanto en sueros como en mucosas comparado con los ratones de control. Sin embargo, el nivel de respuesta fue significativamente mayor en los ratones alimentados con L. rhamnosus HN001 vivo (Tabla 13).
Tabla 13 - El efecto de L. rhamnosus HN001 vivo y muerto por calor sobre las respuestas de los anticuerpos en sueros y mucosas a Toxina del Cólera en ratones.
Tratamiento
Respuesta de anticuerpos en suero (unidades/ml) Respuesta de anticuerpos en mucosas(unidades/ml)
Control
88,69 ± 18,52 708,6 ± 146,9
L. rhamnosus HN001 vivo
214,89 ± 62,33* 2.054,5 ± 285,8***
L. rhamnosus HN001 Muerto por Calor
174,89 ± 44,78 1.533,6 ± 319,3
Se alimentaron ratones BALB/c con dietas a base de leche y se les administraron por vía oral 109 cfu (al día) de L. rhamnosus HN001 en forma tanto viva como matada por calor durante 14 días. Los ratones de control no recibieron BAL. Se inmunizaron los ratones por vía oral con Toxina de Cólera los días 0 y 7. Las respuestas de los anticuerpos (suero y secreciones intestinales) se midieron usando un ELISA el día 14. Los valores son media ± error estándar. Diferencias significativas (prueba t de Student) del control: *P=0,05, ***P=0,0005.
Estos resultados sugieren que L. rhamnosus HN001 tanto vivo como muerto por calor son capaces de mejorar aspectos de la inmunidad natural y adquirida en ratones.
Ejemplo 8 – Propiedades antiinfección de B. lactis HN019 y L. rhamnosus HN001
Los objetos del presente estudio fueron:
1.
Valorar la eficacia de la protección de B. lactis HN019 y L. rhamnosus HN001 frente al patógeno gastrointestinal Salmonella typhimurium.
2.
Determinar el papel de la inmunoestimulación inducida por B. lactis HN019 y L. rhamnosus HN001 en protección frente a infección por S. typhimurium en ratones.
Se evaluaron las propiedades antiinfección por medición de traslocaciones bacterianas para el hígado y bazo. Se examinaron los efectos inmunoestimuladores por determinación de la función de los fagocitos (leucocitos sanguíneos periféricos y macrófagos peritoneales) y respuestas proliferativas de los linfocitos a un mitógeno de células T (PHA).
Se usó el siguiente protocolo experimental:
1.
Se usaron ratones BALB/c de seis a siete semanas, que pesaban 20-30 g.
2.
Se distribuyeron los ratones de manera aleatoria en 4 diferentes grupos de tratamiento y se estabularon de manera individual.
3.
Todos los ratones recibieron una dieta a base de leche desnatada en polvo durante todo el experimento.
4.
Los ratones del ensayo comenzaron alimentación diaria de B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 (109 cfu/día) 7 días antes de exposición y se continuó durante la duración del estudio.
5.
Se expusieron por vía oral ratones a los que se había administrado B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 y un grupo de control (no BAL) a Salmonella typhimurium (ATCC 1772) 8 x 105 cfu/día durante 5 días empezando el día
7.
6.
Un grupo de control no infectado no recibió exposición a S. typhimurium.
7.
El día 6 después de exposición se usaron los ratones para la medición de la traslocación bacteriana al hígado y bazo y para valoración de la función inmunitaria.
Resultados Los ratones enriquecidos con tanto B. lactis HN019 como L. rhamnosus HN001 mostraron niveles significativamente menores de traslocación bacteriana en el hígado y bazo que los ratones alimentados con sólo S. typhimurium (Fig 3).
5 La infección por exposición dio como resultado una supresión significativa de la función fagocítica (Fig 4); la actividad fagocítica de ratones de control expuestos a S. typhimurium fue significativamente menor que la de los ratones no infectados. Sin embargo, la infección con S. typhimurium no tuvo efecto sobre la actividad fagocítica de los leucocitos sanguíneos periféricos de ratones enriquecidos con B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001. Esto se mostró por niveles similares de actividad fagocítica en ratones enriquecidos con B. lactis HN019 o L. rhamnosus
10 HN001 y expuestos a S. typhimurium y los ratones de control no infectados normales.
Los ratones enriquecidos tanto con B. lactis HN019 como L. rhamnosus HN001 mostraron mayores respuestas proliferativas de linfocitos para PHA que el control expuesto a S. typhimurium (Fig 5). No hubo diferencia significativa en la respuesta entre ratones que recibieron B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 y los ratones de control no
15 infectados.
Además estos resultados sugieren que el enriquecimiento con B. lactis HN019 o L. rhamnosus HN001 es capaz de conferir protección frente a patógenos entéricos tales como Salmonella typhimurium. La resistencia mejorada a la infección va acompañada de un aumento en realización inmunitaria.

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un cultivo biológicamente puro de L. rhamnosus HN001 AGAL número de depósito NM97/09514 fechado el 18 de
    agosto de 1.997. 5
  2. 2. Una composición de un cultivo biológicamente puro de L. rhamnosus HN001 AGAL número de depósito NM97/09514 fechado el 18 de agosto de 1.997 en una concentración inmunoestimuladora con un excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.
    10 3. Una composición según la reivindicación 2, que contiene L. rhamnosus HN001 AGAL número de depósito NM97/09514 fechado el 18 de agosto de 1.997 y uno o más cualesquiera de L. rhamnosus HN067 número de depósito NM97/01925 fechado el 11 de febrero de 1.998 y L. acidophilus HN017 AGAL número de depósito NM97/09515 fechado el 18 de agosto de 1.997.
    15 4. Una composición según la reivindicación 2 ó 3, en la que dicho excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable es un alimento o en la que la composición es una composición farmacéutica y dicho excipiente o diluyente es un excipiente o diluyente farmacológicamente aceptable.
  3. 5.
    Una composición según la reivindicación 4, en la que dicho alimento es uno o más cualesquiera de: leche 20 cultivada, yogur, queso, bebida láctea o polvo lácteo.
  4. 6. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en tratamiento.
  5. 7.
    Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para mejorar la inmunidad natural y 25 adquirida.
  6. 8. Uso de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la fabricación de un medicamento que mejorar la inmunidad natural y adquirida.
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