ES2352175T3 - Composiciones inhibidoras de tumores que comprenden nitroacridinas. - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende al menos un derivado de 1-nitroacridina y al menos otra sustancia inhibidora del crecimiento del tumor, en la que la sustancia es pancratistatina o combretastatina.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención está dirigida al uso de derivado(s) de 1–nitroacridina e inhibidor(es) de tumores para inhibir o prevenir el crecimiento tumoral, en particular, crecimiento de células tumorales de cáncer de próstata y metástasis, así como a las composiciones que comprenden derivado(s) de 1–nitroacridina e inhibidor(es) de tumores. En particular, el (los) inhibidor(es) tumorales puede(n) ser uno más agentes antiangiogénicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Cáncer de próstata

El cáncer de próstata es el cáncer más común en hombres de más de sesenta años en países desarrollados. Los cálculos actuales de nuevos casos de cáncer de próstata en Norteamérica son aproximadamente 300.000 por año, de los cuales aproximadamente 40.000 sucumbirán a la enfermedad. La etiología del cáncer de próstata todavía no se entiende bien, pero la progresión de hiperplasia benigna hacia el cáncer patente requiere la coordinación de cambios en el ciclo celular y apoptosis y desregulación de factores de regulación del crecimiento negativo. El cáncer de próstata primario se puede curar por medio de prostatectomía radical, pero la enfermedad metastática es resistente a las formas más comunes de terapia.

Sin embargo, la mayor parte de las muertes por cáncer de próstata se debe a que la enfermedad metastática, en general, no responde con índices de curación buenos, a quimioterapia o radiación. La depleción hormonal por castración física o química por medio del uso de análogos hormonales que liberan gonadotropina, estrógenos exógenos, antiandrógenos, agentes progestacionales o inhibidores de la síntesis de enzimas adrenales, tales como cetoconazol y aminoglutetimida, ha sido durante mucho tiempo el modo principal de tratamiento para el cáncer de próstata. Ya que varios órganos diferentes tales como el hipotálamo, pituitaria, glándula suprarrenal, testículos y la próstata están implicados en la modulación de los efectos bioquímicos de andrógenos, la eliminación de los testículos elimina solamente el 40% de la hormona secretora total y de tal forma la terapia anti–hormonal química es el modo preferido de tratamiento. El inconveniente principal, aparte de los efectos secundarios tóxicos, es la generación de células independientes de hormonas muy agresivas que son resistentes a la terapia anti–hormonal. Probablemente tengan más éxito las modalidades de tratamiento que se pueden dirigir tanto a células sensibles a hormonas como a células insensibles a hormonas y se trata de uno de los principales desafíos en la terapia de cáncer de próstata.

Otras clases de fármacos contra el cáncer de próstata están actualmente en uso (revisado por Osterlink y col., en Cancer: Principles and Practice of Oncology, DeVita, V.T.,

Hellman, S., Rosenberg, S.A., Lippincott–Raven, 1997, páginas 1322 – 1375). Algunos ejemplos incluyen inhibidores del factor de crecimiento tales como suramina o estramustina que afecta al ensamblaje tubular y afecta a la matriz nuclear, un determinante clave de la estructura de cromatina y forma nuclear. Las reseñas sobre la eficacia de suramina, un compuesto que afecta la unión del factor del crecimiento con su receptor y estereoidogénesis adrenal se mezclan y el inconveniente principal en su uso individualmente o en combinación con hidrocortisona parece que presenta toxicidades que varían desde mielopatía, queratopatía en vórtice y coagulopatía. Los alcaloides de la vinca que también dirigen el ensamblaje microtubular, vinblastina y navelbina, han mostrado actividades modestas mientras que los agentes de disgregación citoesqueletal, etopósido y paciltaxel no muestran mucha actividad como agentes individuales pero han mostrado sinergizarse con estramustina. Otras terapias de combinación que se están evaluando en la actualidad incluyen ciclofosfamida más GM–CSF y cetoconazol más doxurubicina.

También se han realizado intentos terapéuticos con mitoxantrona. La mitoxantrona tiene actividad modesta por sí sola en pacientes con cáncer de próstata avanzado, pero puede proporcionar una paliación significativa cuando se combina con prednisona en lo que se refiere al alivio del dolor y calidad de vida terminal (Wiseman, 1997, Drugs Aging 10:473 – 485 y Smith, 2000, J. Urol. 163:248). La mitoxantrona y prednisona son las únicas combinaciones de tratamiento aprobada por la FDA aprobadas para el cáncer de próstata refractario a hormonas. La mielosupresión y neutropenia son las toxicidades principales que están desarrolladas.

Otros enfoques actualmente en investigación incluyen enfoques inmunológicos que usan antígenos específicos de próstata (PSA) y citoquinas tales como IL–2, IL–6, IL–7, GM– CSF y TNF y el uso de inhibidores de angiogénesis. La neovasculatura en células endoteliales es una diana terapéutica para un agente antiangiogénico.

Acridinas

Se ha estudiado una serie de derivados de acridina para detectar la actividad antitumoral. Un trabajo anterior mostró que 1– nitro–9–alquilaminoalquilaminoacridinas tenían actividad antitumoral buena (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos nº 4.139.531, Gniazdowsk y col., 1995, Gen. Pharmacol. 26:473, Ledochowski, 1976, Mat. Med. Pol. 8:237, Mazerska y col., 1984, Eur. J. Med. Chem. 19:199, Pawlak y col., 1984, Cancer Res. 44:4829, documento EP 38572).

Se han formulado composiciones de acridinas y otros agentes antitumorales. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos nº 5.891.864 desvela composiciones anticancerígenas que comprenden derivados de acridina y un compuesto de guanosina. Los compuestos específicamente desvelados incluyen acriflavina neutral, acriflavina, naranja de acridina, amarillo de acridina G, diacridina, mostaza de anilina, guanosina, hidrato de guanosina e isoguanosina. Se afirma que los compuestos de acridina por sí solos tienen un efecto anticancerígeno pequeño y los compuestos de guanosina no tienen ninguno, por lo que los compuestos de guanosina refuerzan el efecto anticancerígeno de los derivados de acridina. Se observa que estas composiciones se pueden usar para tratar el cáncer de pulmón, hepatoma, leucemia, tumor sólido y carcinomas del tejido epitelial. También se menciona que las composiciones también pueden comprender una cantidad eficaz antitumoral potenciada de un immunomodulador, agente antitumoral o vehículo farmacéuticamente aceptable.

La patente de Estados Unidos nº 5.759.514 desvela un conjugado para terapia tumoral que comprende una proteína o polipéptido de fijación de diana celular del tumor y una molécula pequeña de fijación de diana del ácido nucleico marcada con radioisótopos. Este conjugado se puede unir a la superficie de la célula tumoral y se endocitosa posteriormente. Una vez endocitosado el conjugado, se puede descomponer líticamente a la molécula pequeña marcada con radioisótopos. Esta molécula pequeña marcada con radioisótopos puede entrar en el núcleo de la célula tumoral. La molécula pequeña se puede unir al ácido nucleico de la célula tumoral y la marca con radioisótopos puede descomponer los núcleos celulares del tumor. La proteína o polipéptido de fijación de diana celular del tumor incluye un anticuerpo o fragmento del mismo, hormona del polipéptido o factor del crecimiento. La molécula pequeña puede ser una fluoresceína, una acridina tal como 3–acetamido–5–yodo–6–aminoacridina o nitracrina, una diacridina, derivados de bromuro de etidio, fenantridinas, antraciclinas, y derivados de quinazolina. La marca con radioisótopos es un radioisótopo emisor de electrones Auger tales como 125I, 32P, 188Rh, 131I, 77Br, 225At, y 213Bi. Estos conjugados se analizan en células de carcinoma.

La patente de Estados Unidos nº 5.696.131 desvela el uso de acridina carboxamidas en combinación con otros fármacos citotóxicos para el tratamiento de leucemia, melanoma, cáncer testicular, cerebral, de ovario, de pulmón, de colon avanzado y de mama. De forma adicional, se describe que las acridina carboxamidas se pueden usar en combinación con otros fármacos citotóxicos, tales como un reactivo de ADN (como por ejemplo, cisplatina, ciclofosfamida, bleomicina y carboplatino), un inhibidor de la síntesis de ADN (5–fluorouracil, 5–fluorodesoxiuridina y metotrexato) o un agente que disgrega el aparato mitótico (taxol y alcaloides de la vinca) para salvar la resistencia al multifármaco. Además, se propone que estos compuestos se puedan usar con un tratamiento de “rescate” con un segundo fármaco que por sí mismo no es un agente activo si no que desplaza la acridina carboxamida del ADN.

La patente de Estados Unidos nº 5.604.237 desvela análogos de acridina con nitrógeno en la posición 1, una cetona en la posición 9 y opcionalmente metoxi en la posición 7. Además, la patente desvela composiciones que comprenden estos compuestos para mejorar o aumentar la eficacia de un fármaco antitumoral tal como alcaloides de la Vinca, antraciclinas, taxol y derivados de los mismos, podofilotoxinas, mitoxantrona, actinomicina, colchicina, gramicidina D, amsacrina, que aumentan o reestablecen la sensibilidad de un tumor a un fármaco antitumoral o invierten o reducen la resistencia de un tumor a un fármaco antitumoral. No se describe ningún sinergismo.

La patente de Estados Unidos nº 4.603.125 describe análogos de acridina antitumorales y composiciones farmacéuticas que contienen estos análogos, agentes isotónicos y de retraso de liberación y los similares.

La patente de Estados Unidos nº 3.694.447 desvela complejos del ácido fosfanílico y aminoacridinas. Estos complejos se pueden usar en forma de agentes antibacterianos y antifúngicos. La aminoacridina también puede tener un grupo nitro en el anillo de acridina.

Ceci y col., 1996, Inorg. Chem. 35:876 describe resultados de estudios de coordinación de 1–nitro–9–[2–(dialquilamino) etilamino]acridinas con platino. Este compuesto parece ser muy reactivo hacia el platino. Esto es debido a las interacciones estáticas graves entre el grupo 1–nitro y el grupo 9–alquilamino en las posiciones peri del sistema de anillo de acridina.

Gniazdowski y col., 1982, Cancer Letters 15:73 muestra que cinco derivados 1–nitro–9– aminoacridina sustituidos muestran un efecto inhibitorio dependiente de tiol irreversible en la síntesis de ARN en un sistema in vitro. En ausencia de compuestos de sulhidrilo no se observa ningún efecto inhibitorio.

Szumiel y col., 1980, Neoplasma 6:697 describe los resultados del tratamiento combinado con rayos X y nitracrina en células del linfoma murino. Parece que este tratamiento combinado proporcionó efectos aditivos.

La Solicitud Internacional nº WO 99/58126 desvela el uso de neomicina para tratar enfermedades relacionadas con la angiogenesis, opcionalmente junto con otro agente angiogénico o agente antineoplástico. Se proporcionan muchos ejemplos, incluyendo nitracina.

OBJECTOS DE LA INVENCIÓN

Es claramente ventajoso tratar un mamífero que tiene un tumor canceroso, en particular un paciente humano, con una composición que contiene sustancias que actúan en dianas separadas en los tumores. Sin embargo, siempre existe el riesgo de que una composición que comprende dos o más sustancias pueda contener una sustancia que puede modular el efecto de otra sustancia. Existe claramente una necesidad de desarrollar enfoques terapéuticos de combinación que pueden combinar fármacos o diferentes modalidades de tratamiento que puedan al menos actuar de una forma concertada.

Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar tales composiciones que comprenden agentes y modalidades de tratamiento que actúan de tal forma. En particular, es un objeto de la invención proporcionar composiciones que comprenden un agente que inhibe el crecimiento tumoral, en particular, una 1–nitroacridina y otra sustancia que actúa en otra área diana de la célula del tumor. En una realización específica, esta otra sustancia puede ser una sustancia que actúa para inhibir la vía de suministro del nutriente de la célula tumoral y de esa forma fija como diana la vascularización, por ejemplo un agente antiangiogénico.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención está dirigida a composiciones que comprenden un derivado(s) de 1– nitroacridina y una sustancia(s) inhibidora del tumor. El tumor incluye cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon, linfoma, sarcoma y leucemia.

La invención proporciona

i) una composición que comprende al menos un derivado de 1–nitroacridina y al menos otra sustancia que inhibe el crecimiento del tumor, en la que la sustancia es pancratistatina o combretastatina;

ii) una combinación medicamentosa que comprende

a) una composición que comprende un derivado de 1–nitroacridina; y

b) a una composición que comprende otra sustancia que inhibe el crecimiento

del tumor, en la que la sustancia es pancratistatina o combretastatina;

iii) uso de un derivado(s) de 1–nitroacridina y otra sustancia(s) que inhibe el crecimiento del tumor, en la que la sustancia es pancratistatina o combretastatina, para la fabricación de un medicamento o combinación de medicamentos para inhibir o prevenir el crecimiento del tumor y/o prevenir o inhibir la metástasis de dicho tumor en un mamífero; y

iv) una combinación de compuestos, que es

a) uno o más derivados de 1–nitroacridina, y

b) pancratistatina o combretastatina, para usar en la inhibición o prevención del crecimiento del tumor y/o prevenir o inhibir la metástasis de dicho tumor en un mamífero.

El derivado(s) de 1–nitroacridina y la sustancia(s) inhibidora del tumor de dicha composición o combinaciones que comprenden un derivado(s) de 1–nitroacridina y sustancia(s) inhibidora del tumor se pueden administrar cada una a un mamífero en cantidades eficaces para inhibir o prevenir el crecimiento de un tumor y/o inhibir o prevenir la metástasis

de dicho tumor.

En una realización una composición de la invención comprende al menos un derivado de 1–nitroacridina y al menos una sustancia angiogénica. En otra realización, la composición comprende al menos un derivado de 1–nitroacridina seleccionado del grupo que está constituido por una 1–nitro–9–hidroxialquilaminoacridina y un derivado de 1–nitro–9– alcoxialquilaminoacridina y al menos una sustancia inhibidora del tumor. En una realización más específica, una composición de la invención comprende al menos un derivado de 1– nitroacridina seleccionado del grupo que está constituido por una 1–nitro–9– hidroxialquilaminoacridina y un derivado de 1–nitro–9–alcoxialquilaminoacridina y al menos una sustancia angiogénica.

De este modo, la invención también proporciona

i) una composición que comprende un derivado de 1–nitroacridina, en la que dicho derivado de 1–nitroacridina es una 1–nitro–9–hidroxialquilaminoacridina o 1–nitro–9– alcoxialquilaminoacridina, y una sustancia que inhibe el crecimiento del tumor, en la que la sustancia que inhibe el crecimiento del tumor es combretastatina o doxorubicina;

ii) una combinación medicamentosa que comprende

a) una composición que comprende un derivado de 1–nitroacridina, en la que dicho derivado de 1–nitroacridina es una 1–nitro–9–hidroxialquilaminoacridina o 1–nitro–9– alcoxialquilaminoacridina; y

b) una composición que comprende otra sustancia que inhibe el crecimiento del tumor, en la que la sustancia que inhibe el crecimiento del tumor es combretastatina o doxorubicina;

iii) uso de un derivado(s) de 1–nitroacridina, en el que dicho derivado de 1– nitroacridina es una 1–nitro–9– hidroxialquilaminoacridina o 1–nitro–9– alcoxialquilaminoacridina, y otra sustancia que inhibe el crecimiento del tumor, en la que la otra sustancia es combretastatina o doxorubicina, para la fabricación de un medicamento o combinación de medicamentos para inhibir o prevenir el crecimiento del tumor y/o prevenir o inhibir la metástasis de dicho tumor en un mamífero; y también

iv) una combinación de compuestos que es a) una 1–nitro–9–hidroxialquilaminoacridina o 1–nitro–9– alcoxialquilaminoacridina, y b) combretastatina o doxorubicina, para usar en la inhibición o prevención del crecimiento del tumor y/o prevenir o inhibir la metástasis de dicho tumor en un mamífero.

Una composición o combinación de la invención se puede usa para inhibir o prevenir el

crecimiento de un tumor, en particular, un tumor de próstata, y/o inhibir o prevenir la metástasis de un tumor en un mamífero por medio de la administración a dicho mamífero de una cantidad del derivado(s) de 1–nitroacridina y sustancia(s) que inhibe el tumor o dicha composición o combinación que comprende el derivado(s) 1–nitroacridina y sustancia(s) que inhibe el tumor en cantidades eficaces para inhibir o prevenir el crecimiento del tumor y/o inhibir o la metástasis de dicho tumor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 imagen1 muestra la reducción de tumores MAT–LyLu imagen1 por medio de 1–nitro–9– hidroxietilaminoacridina imagen1 + el agente antiangiogénico, combretastatina. Control, mitroxantrona, 1–nitro–9–hidroxietilaminoacridina,

mitroxantrona + combretastatina,

combretastatina + 1–nitro– 9–hidroxietilaminoacridina. Los

animales se distribuyen aleatoriamente en grupos diferentes y son tratados con los fármacos siguientes: 1–nitro–9–hidroxietilaminoacridina, 0,6 mg/kg; mitroxantrona, 0,6 mg/kg; combretastatina, 10 mg/kg. El tratamiento se empieza cuando los tumores se hacen palpables (de 0,25 cm a 0,5 cm de diámetro) y se continúa dos veces por semana durante tres semanas.

La Figura 2 muestra la reducción en metástasis pulmonar por medio de 1–nitro–9– hidroxietilaminoacridina + agente antiangiogénico, combretastatina según se mide por medio

de recuentos de imagen1 nódulos pulmonares visibles.

imagen1 Control,

imagen1 mitroxantrona + combretastatina, combretastatina + 1–nitro–9– hidroxietilaminoacridina. Los animales se

tratan con las mismas dosificaciones anteriores.

La Figura 3 muestra el efecto de 9–(2’–hidroxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina + imagen2 ratones Balb/c/nu/nu.

Control,

9–(2’–hidroxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina, pancratistatina,

imagen3 9–(2’– hidroxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina + pancratistatina.

En este estudio se distribuyen aleatoriamente cinco animales/grupo. Los tumores se inician por inyección subcutánea de 2 x 106 células TSU vivas y el tratamiento se empieza siete días después de que el tumor es palpable (aproximadamente 0,5 cm). El tratamiento se lleva a cabo a una concentración 9–(2’–hidroxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina (0,6 mg/kg) y pancratistatina (5 mg/kg) dos veces por semana durante tres semanas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Las composiciones o combinaciones de la invención comprenden el derivado(s) de 1– nitroacridina y la sustancia(s) que inhibe el tumor se pueden usar para inhibir o prevenir el crecimiento del tumor y/o inhibir o prevenir metástasis.

Derivados de 1–Nitroacridina

Los derivados de 1–nitroacridina usados pueden ser aquellos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, el documento 5.604.237, la Patente de Estados Unidos nº 4.139.531, Gniazdowsk y col., 1995, Gen. Pharmacol. 26:473, Ledochowski, 1976, Mat. Med. Pol. 8:237,

5 Mazerska y col., 1984, Eur. J. Med. Chem. 19:199, Pawlak y col., 1984, Cancer Res. 44:4829). En una realización específica, pueden ser un derivado de 1–nitro–9–alquilaminoacridina (véase, por ejemplo, el documento nº EP 38572). En una realización más específica, el derivado es un 1–nitro–9–hidroxialquilaminoacridina, 1–nitro–9–alcoxialquilaminoacridina o 1– nitro–9–alquilcarboxialquilaminoacridina. En una realización más específica, el derivado 1–

10 nitroacridina se selecciona del grupo que está constituido por 1–nitro–9– hidroxietilaminoacridina, 9–(2’–hidroxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina, 9–(2’– hidroxietilamino)–7–metoxi–1–nitroacridina, 9–(2’–hidroxietilamino)–7–metoxi–4–metil–1– nitroacridina, 9–(2’–acetoxietilamino)–1–nitroacridina, 9–(2’–propionoxietilamino)–1– nitroacridina, 9–(3’–hidroxipropilamino)–7–metoxi–1–nitroacridina, 9–(3’–hidroxipropilamino)–4–

15 metil–1–nitroacridina, 9–(2’–acetoxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina, 9–(2’– propionoxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina, 9–(3’–acetoxipropilamino)–4–metil–1– nitroacridina, 9–(2’–propionoxipropilamino)–4–metil–1–nitroacridina, 9–(2’–hidroxietilamino)–4– metoxi–1–nitroacridina, 9–(3’–hidroxipropilamino)–4–metoxi–1–nitroacridina, 9–(4’– hidroxibutilamino)–4–metoxi–1–nitroacridina, 9–(4’–hidroxibutilamino)–7–metoxi–1–nitroacridina

20 y 9–(2’–acetoxietilamino)–7–metoxi–4–metil–1–nitroacridina. En otra realización específica, el derivado puede ser un compuesto de acridina nuevo que tiene la estructura I

25

30

imagen1

En la que cuando R1 es H, R2 es H o CO(CH2)nCH3, en la que n = 1 – 8, R3 es H, (CH2)nCH3, en la que n = 0 – 1 o O(CH2)nCH3, en la que n = 0 – 1 y R, es H, (CH2)nCH3, o O(CH2)nCH3, en la que n = 0 – 1; en la que cuandoR1 es O(CH2)nCH3, en la que n = 0 –1, yR2 es H, R3 yR4 es H y en la que cuando R1 es O(CH2)nCH3, en la que n = 0 – 1 y R2 es CO(CH2)nCH3, en la que n = 1

– 8 R3 es H, (CH2)nCH3, en la que n = 0 – 1 o O(CH2)nCH3, en la que n = 0 – 1, y R4 es H, (CH2)nCH3, o O(CH2)nCH3, en la que n = 0 – 1 o sales de los mismos.

Los compuestos de esta invención se preparan por medio de series de reacciones como se muestra en el Esquema 1

Esquema 1

imagen1

En las que R1 – R4 son como se define anteriormente en la presente memoria descriptiva y X es Cl, fenoxi o sal de piridinio.

El compuesto III que se puede emplear como material de partida en la práctica de la presente invención se puede preparar de acuerdo con la enseñanza que se expone en Ledochowski, A. Mat. Med. Pol. 1976, 3: 237 para derivados de 9–amino–1–nitroacridina (R1 = R3 = H); en Yekundi, K.G. y col. Chem. Ber. 1957, 90:2448 para 9–amino–7–metoxi–1– nitroacridinas (R1 = OCH3, R3 = H); y en Horowska, B.; Ledóchowski, A. Rocz. Chem. 1968, 42:1351 para 9–amino–4–metilo o 4–metoxi–1–nitroacridinas (R1 = H, R3 = OCH3 o CH3). Un procedimiento para obtener III (9–amino–7–metoxi–4–metil–1–nitroacridinas) se presenta en el Esquema 2.

Esquema 2

imagen1

Las 1–nitroacridinas sustituidas de esta invención de la formula general III se pueden preparar por condensación de un ácido o–halogenobenzoico sustituido apropiado y derivado de anilina o de forma alternativa, de ácido antranílico sustituido y derivado de halogenobenceno, estando afectada la condensación por el calentamiento de al menos cantidades equimolares de los reactivos en presencia de un aceptor ácido y cantidades catalíticas de cobre y/o sus sales. Preferiblemente, los derivados del ácido bezoico se pueden usar en forma de sus sales con metales alcalinos, tales como las sales de sodio o de potasio. El calentamiento de los reactivos tiene lugar sin un disolvente o en un disolvente adecuado a temperaturas desde 80ºC hasta 180°C. Los disolventes adecuados incluyen pero no están limitados a tales disolventes orgánicos como dimetilformamida, dimetilacetamida, éter difenílico, nitrobenzeno, alcoholes alifáticos superiores, tales como alcohol amílico. Los aceptores ácidos adecuados incluyen aminas terciarias y sales de metales alcalinos, tales como carbonatos de sodio y de potasio y similares. En caso conveniente, el disolvente de la reacción puede servir por sí mismo de aceptor ácido, tal como cuando se emplea la dimetilanilina en forma de disolvente. El producto de condensación deseado de la fórmula general VI se separa preferiblemente en forma de una solución de su sal en agua, y se precipita por medio de la adición de un ácido mineral, tal como acido clorhídrico. Después, el producto deseado se elimina de la mezcla acuosa por filtración, y opcionalmente, se purifica por medio de técnicas normales, tal como cristalización a partir de un disolvente orgánico. Los productos de condensación de la fórmula general VI se pueden ciclar al derivado de acridina por medio de procedimientos normales conocidos en la técnica (Acheson, R.M. Ed., Acridines, Interscience Publishers, NY, London, 1973). En una realización preferida de la ciclación, el derivado del ácido N–fenilantranílico se calienta en una solución de oxicloruro de fósforo a una temperatura de 60°C hasta reflujo, un exceso del reactivo se elimina por evaporación, y el producto se aísla por precipitación o extracción usando un disolvente adecuado. Los disolventes adecuados incluyen disolventes orgánicos tales como cloroformo, cloruro de metileno, benceno, tolueno o éter. El derivado de 9–cloroacridina III formado se aísla y se purifica adicionalmente por medio de técnicas normales. Cuando R3 es H, se forman dos isómeros. Los isómeros se pueden separar por medio del calentamiento de III cuando X = Cl para proporcionar sales de piridinio de III las cuales se pueden separar fácilmente. Dichos isómeros se calientan con fenol y proporcionan III, en donde X = OPh.

Un procedimiento de esta invención para obtener derivados de 1–nitro–9– (hidroxialquilamino)acridina o sus sales de la fórmula II, en la que los sustituyentes R1 y R3 son como se define anteriormente en la presente memoria descriptiva, comprende la reacción de un derivado de 9–cloro adecuado de la fórmula III o derivado de 9–fenoxi relacionado o sal de piridinio de acridinil–9 relacionado con un derivado apropiado de hidroxialquilamina en fenol a temperaturas desde 40ºC hasta 120°C. El producto deseado se aísla después por precipitación de su sal con un disolvente orgánico no polar. Los disolventes orgánicos adecuados incluyen éter etílico, benceno, tolueno, tetrahidrofurano.

De forma alternativa, el producto deseado se puede aislar por medio de la alcalización de la mezcla de la reacción y extracción del producto con un disolvente inmiscible en agua, adecuado. Los disolventes inmiscibles en agua, adecuados, incluyen éter etílico, benceno, tolueno, cloroformo, acetato de etilo y similares.

De forma alternativa, la condensación de derivados de 9–cloro adecuados de la fórmula III o derivados de 9–fenoxi relacionados o sal de piridinio de acridinil–9 relacionado con un derivado apropiado de hidroxialquilamina se puede llevar a cabo en un disolvente polar adecuado en presencia de un catalizador ácido. Los disolventes polares adecuados incluyen alcoholes, disolventes apróticos polares o hidroxialquilamina por sí misma. Los catalizadores ácidos adecuados incluyen ácidos minerales, ácidos orgánicos fuertes o fenol.

Un procedimiento de esta invención para obtener derivados de 1–nitro–9– (alcoxialquilamino)acridina o sus sales de la fórmula I, en la que los sustituyentes R1 – R5 son como se define anteriormente en la presente memoria descriptiva, comprende la reacción de un derivado de 1–nitro–9–(hidroxialquilamino)acridina adecuado con un agente de acilación adecuado. Un agente de acilación adecuado incluye pero no se limita a ácidos carboxílicos, cloruros de ácidos relacionados, anhídridos de ácidos u otros conocidos en la técnica. En una realización preferida de la reacción en la presente invención, el agente de acilación está formado a partir de ácido carboxílico in situ en la mezcla de la reacción. Preferiblemente, la reacción se lleva a cabo en disolventes adecuados. Los disolventes adecuados incluyen disolventes orgánicos tales como haloalcanos, por ejemplo, cloroformo, hidrocarburos aromáticos, por ejemplo, benceno y tolueno, éteres alifáticos o éteres cíclicos alifáticos, o ácidos carboxílicos, preferiblemente el mismo ácido que sirve de agente de acilación. La condensación se realiza de forma típica a baja temperatura, preferiblemente desde –30°C hasta temperatura ambiente, y los productos se aíslan por medio de procedimientos normales.

Sustancias inhibidoras del tumor

Una “sustancia inhibidora del tumor” es una sustancia química distinta a 1–nitroacridina descrita anteriormente que inhibe el crecimiento de un tumor. Dicha sustancia puede ser una sustancia antiangiogénica, por ejemplo interferón–gamma, endostatina, combretastatina (véase, por ejemplo, Petit y col., 1995, Anti–Cancer Drug Design 10:299–309, Dang y col.; 1997, Cancer Res. 57: 1829 – 1834, Patente de Estados Unidos nº 5.561.122 y 4.996.237), fenstatina (documento WO/9934788, Pettit y col., 1998, J. Med. Chem. 41:1688 – 1695), pancratistatina (Pettit y col., 1995, J. Nat. Prod. 58:57 – 43 y Patente de Estados Unidos nº

5.529.989 y 4.985.436), fumagilina (Figg y col., 2000, Expert Opin. Investig. Drugs 9:1383 – 1396) o TNP–470. Sin embargo, una composición o combinación de la invención debe incluir la combretastatina, pancratistatina o doxorubicina, como se especifica.

La sustancia inhibidora del tumor puede ser cualquier agente que inhiba la vasculatura del tumor o procedimientos bioquímicos que afecten el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos.

De forma alternativa, una sustancia inhibidora del tumor puede ser una citoquina tal como los elementos de la familia de las interleucinas (IL–1, IL2, IL–6, IL–7, IL–12, IL–15) GM– CSF y factor de la necrosis tumoral, factor del crecimiento tumoral alfa o beta, interferones alfa/beta o gamma, o inhibidor(es) de la síntesis de ácidos nucleicos, inhibidor(es) del ciclo célular, agente(s) antimicóticos o inhibidores del factor de crecimiento. Los ejemplos específicos incluyen alcaloides de la vinca, ciclofosfamida, doxorubicina, mitoxantrona, suramina o estramustina.

Una sustancia inhibidora del tumor también puede incluir péptidos sintéticos aleatorios generados a partir de bibliotecas combinatorias y pueden modular la vasculatura tumoral, inducir citoquinas, actuar en forma de agentes antimicóticos, modular el crecimiento celular, agentes citotóxicos, agentes citotáticos, y/o inducir apoptosis. Otras sustancias inhibidoras del tumor pueden ser esteroides o inhibidores hormonales.

Composiciones

Se puede administrar a un mamífero y específicamente a un paciente humano una composición que comprende un derivado de 1–nitroacridina, después posteriormente se administra una composición que comprende la sustancia específica inhibidora del tumor. En otra realización, se administra a un mamífero una composición que comprende la sustancia específica inhibidora del tumor y un derivado de 1–nitroacridina. Todavía en otra realización se administra a un mamífero las dos composiciones de forma simultánea. Una composición que comprende sustancia(s) específica(s) inhibidora(s) del tumor puede comprender una combinación de una sustancia que inhibe el crecimiento de tumores sólidos por medio de la fijación como diana de células epiteliales y una sustancia que fija como diana el, de células endoteliales de la vasculatura del tumor. Los cánceres específicos que se pueden tratar con la composición de la presente invención pueden incluir próstata, cáncer de colon, cáncer de mama, leucemia, sarcoma y/o linfoma.

En otra realización adicional, la composición de la presente invención puede comprender tanto la 1–nitroacridina como la(s) sustancia(s) inhibidora(s) del tumor. La composición combinada del derivado de 1–nitroacridina y la sustancia inhibidora del tumor de acuerdo con la presente invención se puede formular por medio de procedimientos convencionales para preparar preparaciones farmacéuticas. El (los) derivado(s) de 1– nitroacridina y la(s) sustancia(s) inhibidora(s) del tumor se mezclan en una relación adecuada, por ejemplo, aproximadamente desde 1:15 hasta aproximadamente 1:2 en un recipiente resistente a la luz.

La composición puede comprender adicionalmente vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, formulados en la formulación farmacéutica adecuada para la administración por vía tópica, parenteral u oral que se puede administrar por vía tópica, parenteral u oral para inhibir o prevenir el crecimiento de un tumor en un mamífero y particularmente un humano. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración

intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular.

Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable es un disolvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para distribuir uno o más de los compuestos de la presente invención a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, con la forma pensada de administración, de tal forma que se proporcione el grueso, consistencia, deseados, cuando se combina con el compuesto de la presente invención y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los vehículos farmacéuticos típicos incluyen, pero no se limitan a, agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o fosfato de hidrógeno de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de sílice coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio); disgregantes (por ejemplo, almidón, glicolato sódico de almidón); y agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato sódico).

Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas, sobres o comprimidos. Pueden ser convenientes los espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulgentes, adyuvantes dispersantes o ligantes.

Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, potenciadores de penetración, compuestos vehículo y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. .

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, nebulizadores, líquidos y polvos. Los vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares pueden ser necesarios o convenientes.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, soluciones, emulsions, y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una diversidad de componentes que incluyen, per o no se limitan a,

líquidos preformados, sólidos auto–emulgentes y semisólidos auto–emulgentes.

Las emulsiones son de forma típica sistemas heterogéneos de un líquido dispersado en otro en forma de gotitas que normalmente superan un diámetro de 0,1 µm. (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Volumen 1, pág. 245; Block en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 2, pág. 335; Higuchi y col., en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág. 301). Las emulsiones son con frecuencia sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles mezcladas en profundidad y dispersadas una con otra. En general, las emulsiones pueden ser agua en aceite (w/o) o de la variedad aceite en agua (o/w). Cuando una fase acuosa es divide finamente en y se dispersa en forma de gotitas diminutas en una fase oleosa voluminosa, la composición resultante se denomina emulsión agua en aceite (w/o). De forma alternativa, cuando una fase oleosa se divide finamente en y se dispersa en forma de gotitas diminutas en una fase acuosa voluminosa, la composición resultante se denomina emulsión aceite en agua (o/w). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersadas y el fármaco activo que puede estar presente en forma de solución, o bien en la fase acuosa, o bien en la fase oleosa, o por sí misma en forma de fase separada. Los excipientes farmacéuticos tales como emulgentes, estabilizantes, tintes, y antioxidantes también pueden estar presentes en emulsiones, según convenga. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que están comprendidas por más de dos fases tales como, por ejemplo, en el caso de emulsiones de aceite en agua en aceite (o/w/o) y agua en aceite en agua (w/o/w). Dichas formulaciones de complejos proporcionan con frecuencia ciertas ventajas que simples emulsiones binarias no tienen. Múltiples emulsiones en las que gotitas de aceite individuales de una emulsión de o/w encierran gotitas de agua pequeñas, constituyen una emulsión de w/o/w. De la misma forma, un sistema de gotitas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizada en una fase oleosa continua constituye una emulsión de o/w/o.

Como se usa en la presente invención, el término "liposoma" se refiere a una vesícula compuesta por lípidos anfifílicos dispuestos en una bifase o bifases esféricas. Los liposomas son vesículas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada a partir de un material lipofílico y un interior acuoso. La porción acuosa contiene la composición que se va a distribuir. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de ser capaces de condensarse a la pared celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no son capaces de condensarse de forma tan eficaz con la pared celular, se recogen por medio de macrófagos in vivo. Un tipo principal de composición liposomal incluye fosfolípidos distintos a fosfatidilcolina de origen natural. Las composiciones de liposomas neutrales, por ejemplo, se pueden formar a partir de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones de liposomas aniónicos por lo general están formados a partir de dimiristoil fosfatidilglicerol, mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos están formados principalmente a partir de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición liposomal está formado a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo, PC de la soja, y PC del huevo. Otro tipo está formado a partir de mezclas de fosfolípidos y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, que se pueden presentar de forma conveniente en forma de dosificación unitaria, se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar los ingredientes activos con el (los) vehículo(s) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, las formulaciones se preparan asociando de forma uniforme y profunda los ingredientes activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos

o ambos, y después, en caso necesario, se da forma al producto.

Las composiciones de la presente invención se pueden formular en cualquiera de las muchas formas farmacéuticas posibles tales como, comprimidos, cápsulas, siropes líquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también se pueden formular en forma de suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.

A pesar de que la cantidad eficaz de la composición de acuerdo con la presente invención se puede variar dependiendo de diversos factores, incluyendo el sujeto al que se va a administrar, la gravedad del cáncer que se va a tratar, etc. por lo general, en un hombre adulto (en base a un peso corporal de 60 kg), la dosificación puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,5 mg/kg hasta aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal para el derivado de 1–nitroacridina y de 0,5 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal para la sustancia inhibidora del tumor por día para administración oral, de aproximadamente 0,2 mg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, de 0,2 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día para la sustancia inhibidora del tumor, para administración intravenosa, y en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 0,5 mg/kg de peso corporal para el derivado de 1–nitroacridina y de 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal para la sustancia inhibidora del tumor

por día, para inyecciones intramusculares.

La composición de la presente invención puede incluir otros componentes medicinales que tienen actividad immunoadyuvante o actividad anticancerosa, o se puede administrar en combinación con otro immunoadyuvante o agente anticanceroso. En forma del immunoadyuvante que se puede incluir en, o combinarse con, la composición de acuerdo con la presente invención, se pueden mencionar los siguientes: anticuerpos monoclonales, immunoagitadores, immunoglobulinas o citoquinas humanas tales como interferones o interleucinas o proteínas específicas del azúcar tales como lectinas. En forma del agente anticanceroso que se puede usar a tal efecto, se pueden mencionar los siguientes: agentes anticancerosos sintéticos, por ejemplo, agentes alquilantes tales como clorambucil, melfalan, ciclofosfamida, compuestos de amina nitrosourea tales como mannomustina, etilendiaminas tales como uredepa; agentes anti–metabólicos, por ejemplo, antagonistas del ácido fólico tales como metotrexato o aminopterina, antagonistas de purina tales como mercaptopurina, antagonistas de pirimidina tales como proxuridina, o 6–azauridina, antagonistas basados en azúcar tales como mitobronitol, o cisplatina, picivanil, 5–fluorouracil (5–FU); antibióticos anticancerosos, por ejemplo, actinomicina, THP–adriamicina, mitomicina, etc.; antagonistas hormonales tales como tamoxifen; y componentes vegetales alcaloides tales como demecolcina. De forma adicional, la composición de la presente invención puede comprender más de un derivado de 1–nitroacridina.

EJEMPLOS

Síntesis de 1–Nitroacridinas

1–Nitro–9–Hidroxietilaminoacridina

En general, este compuesto se sintetiza usando los procedimientos descritos en el documento EP 38579. De forma específica, 2 g de clorhidrato de 2–aminoetanol se añade a 6,4 g de 1–nitro–9–fenoxiacridina disuelta en 20 g de fenol destilado recién preparado. La mezcla se calienta durante 40 minutos a una temperatura de 80°C y después se enfría, se diluye con éter. Después se vierte en éter seco que se acidificó con una solución etérea de cloruro de hidrógeno. El precipitado de color naranja de clorhidrato de 1–nitro–9–(2– hidroxietilamino)–acridina, obtenido de esta forma se filtra y se cristaliza a partir de etanol seco. El punto de fusión de los compuestos obtenidos era 170°C, con descomposición. Rendimiento al 91%. Análisis elemental para la fórmula: C15H14N3O3Cl: calculado: C al 56,47%, H al 4,42%, N al 13,17%; determinado: C al 56,44%, H al 4,40%, N al 13,03%.

9–(2’– hidroxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina

Se disuelve 4–metil–1–nitro–9–fenoxiacridina (0,33 g) en fenol (10 g), se añade clorhidrato de etanolamina (0,2 g) y la mezcla se calienta a 80°C durante 0,5 hora. La mezcla de la reacción se enfría a temperatura ambiente, se diluye con éter, se vierte lentamente en éter seco (200 ml) y se acidifica con solución etérea de cloruro de hidrógeno. El precipitado resultante se filtra, se lava con éter y se cristaliza a partir de etanol absoluto para proporcionar

monoclorhidrato de 9–(2’–hidroxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina en forma de cristales naranjas (0,27 g, 84%), punto de fusión 238 °C (descomp.) 1H RMN (d6DMSO): δ 2,45 (s, 3H, CH3), 3,48 (q, 2H, H–2’), 3,65 (t, 2H, H–1’), 4,3 (t, 1H, OH), 7,1 (t, 1H, H–7), 7,24 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H–2), 7,35 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H–3), 7,5 (t, 1H, H–6), 7,65 (d, 1H, J = 8 Hz, H–5), 7,75 (d, 1H, J = 8,0 Hz, H–8).

9–(2’– hidroxietilamino)–7–metoxi–4–methil–1–nitroacridina

Se disuelve 7–metoxi–4–metil–1–nitro–9–fenoxiacridina (0,72 g) en fenol (20 g). Se añade clorhidrato de etanolamina (0,2 g) y la mezcla se calienta a 80°C durante 1,5 horas. La mezcla de la reacción se enfría a temperatura ambiente, se diluye con éter, se vierte lentamente en éter seco (300 ml) y se acidifica con solución etérea de cloruro de hidrógeno. El precipitado resultante se filtra, se lava dos veces con éter y se cristaliza a partir de metanol absoluto para proporcionar monoclorhidrato de 9–(2’–hidroxietilamino)–7–metoxi–4–metil–1– nitroacridina en forma de cristales naranjas (0,6 g, 86%), punto de fusión 200°C (descomp.) 1H RMN (d6DMSO): δ 2,60 (s, 3H, CH3), 3,50 (s, 4H, H–1’, H–2’), 4,00 (s, 3H, OCH3), 7,66 (dd, 1 H, J1 = 9,3 Hz, J2 = 2,5 Hz, H–6), 7,85 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, H–3), 8,02 (s, 1 H, H–8), 8,15 (d, 1 H, J = 7,8 Hz, H–2), 8,22 (d, 1 H, J = 7,8 Hz, H–5).

9–(2’– hidroxietilamino)–7– metoxi –1–nitroacridina

Se disuelve 7–metoxi–1–nitro–9–fenoxiacridina (0,69 g) en fenol (20 g). Se añade clorhidrato de etanolamina (0,2 g) y la mezcla se calienta a 100°C durante 1,5 horas. La mezcla de la reacción se enfría a temperatura ambiente, se diluye con éter seco (100 ml), se vierte lentamente en éter seco (300 ml) y se acidifica con solución etérea de cloruro de hidrógeno. El precipitado resultante se filtra, se lava dos veces con éter y se cristaliza a partir de metanol–éter absoluto para proporcionar monoclorhidrato de 9–(2’– hidroxietilamino)–7– metoxi–1–nitroacridina (0,.58 g, rendimiento al 83%), punto de fusión 220°C (descomp.) 1H RMN (d6DMSO): δ3,45 (t, 2 H, H–2’), 3,65 (t, 2 H, H–1’), 3,80 (s, 3 H, OCH3), 7,30 (dd, 1 H, J1 = 9,3 Hz, J2 = 2,5 Hz, H–6), 7,35 (d, 1 H, J = 2,5 Hz, H–8), 7,40 (d, 1 H, J = 9,3 Hz, H–5), 7,7 (m, 2 H, H–3, H–4), 7,87 (m, 1H, H–2).

9–(2’–Acetoxietilamino)–1–nitroacridina

Se añade cloruro de tionilo (7,5 ml) a un ácido acético agitado, enfriado a –20°C (30 ml). Después, a la misma temperatura, se añade 9–(2’–hidroxietilamino)–1–nitroacridina (0,5 g) en porciones, y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se destila a presión reducida, el residuo se lavó varias veces con bicarbonato sódico acuoso al 10% y agua, se secó en vacío, y se cristalizó a partir de solución etérea de cloruro de hidrógeno en etanol absoluto para proporcionar 9–(2’–acetoxietilamino)–1–nitroacridina (0,4 g, rendimiento 80 %), punto de fusión 170°C – 172°C (descomp.). 1H RMN (d6DMSO): δ 1,6 (s, 3 H, CH3), 3,85 (t, 2 H, H–1’), 4,2 (t, 2 H, H–2’), 7,10 (t, 1 H, H–7), 7,25 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, H–2), 7,35 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H–5), 7,42 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, H–4), 7,50 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, H–3), 7,60 (d, 1 H, J = 7,8 Hz, H–6), 7,82 (d, 1 H, J = 7,8 Hz, H–8).

9–(3’–Hidroxipropilamino)–7–metoxy–1–nitroacridina

Se disuelve 7–metoxi–1–nitro–9–fenoxiacridina (0,69 g) en fenol (20 g), se añade clorhidrato de 3–aminopropanol y la mezcla se calienta a 100°C durante 1,5 horas. La mezcla de la reacción se enfría a temperatura ambiente, se diluye con éter seco (100 ml), y se vierte lentamente en éter seco a (300 ml) preacidificado con solución etérea de cloruro de hidrógeno. El precipitado resultante se filtra, se lava dos veces con éter y se cristaliza a partir de metanol– éter absoluto (3:1) para proporcionar monoclorhidrato de 9–(3’–hidroxipropilamino)–7–metoxi– 1–nitroacridina en forma de cristales naranjas (0,5 g, rendimiento 72%), punto de fusión 208ºC

– 210°C (descomp.) 1H RMN (d6DMSO): δ 1,75 (t, 2H, H–2’), 3,45 (q, 2 H, H–3’), 3,74 (t, 2 H, H–1’), 4,32 (t, 1 H, OH), 7,15 (dd, 1 H, J1 = 2,7 Hz, J2=9,0 Hz, H–6), 7,20 (d, 1 H, J = 9,5 Hz, H–2), 7,25 (d, 1 H, J = 9,3 Hz, H–5), 7,3 (d, 1 H, J = 7,7 Hz, H–8), 7,45 (t, 1 H, H–3).

9–(2’–Propionoxietilamino)–1–nitroacridina

Se añade cloruro de tionilo (8 ml) a un ácido propiónio agitado, enfriado a –20°C (60 ml). Después, a la misma temperatura, se añade 9–(2’–hidroxietilamino)–1–nitroacridina (0,5 g) en porciones, y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se destila a presión reducida, el residuo se lavó varias veces con bicarbonato sódico acuoso al 10% y agua, se secó en vacío, y se cristalizó a partir de solución etérea de cloruro de hidrógeno en etanol para proporcionar clorhidrato de 9–(2’–propionoxietilamino)–1– nitroacridina en forma de cristales amarillos (0,37 g, rendimiento 65%), punto de fusión 98ºC – 100°C. 1H RMN (RMN de la base libre) (d6DMSO): δ 1,00 (t, 3 H, H–3"), 2,30 (q, 2 H, H–2"), 3,90 (t, 2 H, H–1’), 4,20 (t, 2 H, H–2’), 7,10 (t, 1 H, H–7), 7,25 (d, J = 8,8 Hz, H–2), 7,30 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, H–5), 7,36 (d, 1 H, J = 9,3 Hz, H–4), 7,38, (t, 1 H, H–3), 7,51 (t, 1 H, H–6), 7,82 (d, 1 H, J = 7,3 Hz, H–8), 10,84 (s, 1 H, NH).

9–(2’–Hidroxietilamino)–4–metoxi–1–nitroacridina

Se disuelve 4–metoxi–1–nitro–9–fenoxiacridina (0,346 g) en fenol (30 g), se añade clorhidrato de etanolamina (0,12 g) y la mezcla se calienta a 80°C durante 1,5 horas. La mezcla de la reacción se enfría a temperatura ambiente, se diluye con éter seco (20 ml), se vierte lentamente en éter seco (200 ml) y se acidifica con solución etérea de cloruro de hidrógeno. El precipitado resultante se filtra, se lava varias veces con éter y se cristaliza a partir de etanol–éter absoluto (5:1) para proporcionar monoclorhidrato de 9–(2’–hidroxietilamino)–4– metoxi–1–nitroacridina en forma de cristales amarillos (0,27 g, rendimiento 77%), punto de fusión 210ºC – 212°C (descomp.) 1H RMN (para una base libre) (d6DMSO): δ 10,18 (s, 1 H, NH), 7,78 (d, 1 H, J = 7,8 Hz, H–8), 7,67 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, H–5), 7,47 (t, 1 H, J = 7,8 Hz, H– 6), 7,36 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 7,10 (m, 2 H, H–3, H–7), 4,31 (t, 1 H, J = 5,4 Hz, OH), 3,70 (t, 2 H, J = 6,4 Hz, H–1’), 3,64 (q, 2 H, J = 6,3 Hz, H–2’).

9–Cloro–7–metoxi–4–metil–1–nitroacridina

Se calienta ácido N–(2’–metil–5’–nitrofenil)–5–metoxiantranílico (7,2 g) en oxicloruro de fósforo (60 ml) a 120°C durante 1 hora. Se destiló el exceso de oxicloruro de fósforo a presión reducida, y el residuo se vertió lentamente en una mezcla agitada de cloroformo, hidróxido de amonio concentrado y hielo. La fase clorofórmica separada se lavó con agua y se secó usando sulfato de magnesio. Se evaporó el cloroformo hasta la sequedad, y el residuo se cristalizó a partir de benceno para proporcionar 9–cloro–7–metoxi–4–metil–1–nitroacridina (6,1 g, rendimiento 68%), punto de fusión 227ºC – 228°C. 1H RMN (d6DMSO): δ 8,23 (d, 1 H, J = 9,3 Hz), 8,13 (d, 1 H, J = 7,3 Hz), 7,79 (bd, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,71 (dd, 1H, J1 = 9,3 Hz, J2 = 2,9 Hz), 7,58 (d, 1 H, J = 2,9 Hz), 4,02 (s, 3 H), 2,85 (s, 3 H).

Ácido N–(2’–metil–5’–nitrofenil)–5–metoxiantranílico

Se agitan sal de potasio del ácido 2–bromo–5–metoxibenzoico (23 g) y 2–metil–5– nitroanilina (40 g) y se calientan a 110°C en presencia de 50 mg de cobre catalítico durante 50 minutos. Después, la mezcla de la reacción se vierte en solución de hidróxido de potasio al 5% en agua (600 ml) y se enfría. El precipitado formado se filtra, se lava con agua, y las soluciones recogidas se acidifican con ácido clorhídrico a pH 5. El sólido formado se filtra y se cristaliza a partir de metanol – acetona (2:1) para proporcionar ácido N–(2’–metil–5’–nitrofenil)–5–

1H

metoxiantranílico (11,2 g, rendimiento 56%), punto de fusión 219ºC – 221°C. RMN (d6DMSO): δ 9,20 (sa, 1H), 7,88 (d, 1 H, J = 1,9 Hz), 7,65 (dd, 1 H, J1 = 7,8 Hz, J2 = 1,9 Hz), 7,44 (d, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,43 (d, 1 H, J = 2,9 Hz), 7,26 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 7,19 (dd, 1 H, J1 = 8,8 Hz, J2 = 2,9 Hz), 3,68 (s, 3 H), 2,27 (s, 3 H).

9–(3’–hidroxipropilamino)–4–metil–1–nitroacridina

Se disuelve 4–metil–1–nitro–9–fenoxiacridina (0,66 g) en fenol (15 g), se añade clorhidrato de 3–aminopropanol y la mezcla se calienta a 80°C durante 1,5 horas. La mezcla de la reacción se enfría a temperatura ambiente, se diluye con éter seco (50 ml) y se acidifica con solución de etanol de cloruro de hidrógeno. El precipitado resultante se filtra, se lava varias veces con éter y se cristaliza a partir de etanol absoluto para proporcionar clorhidrato de 9–(3’– hidroxipropilamino)–4–metil–1–nitroacridina en forma de cristales amarillos (0,54 g, rendimiento 76%), punto de fusión 205ºC – 206°C, anal. C17H18N3O3Cl (C,H,N). 1H RMN (D2O): δ 1,65 (m, 2H, H – 2’), 2,40 (s, 3H, CH3), 3,20 (q, 2H, H – 3’), 3,40 (m, 2H, H – 1’), 7,22 (t, 1H, H – 7), 7,48 (d, 1H, J=7,8 Hz, H–3), 7,48 (d, 1H, J=7,8 Hz, H–3), 7,54 (d, 1H, J=8,3 Hz, H–6), 7,60 (t, 1H, H–5), 7,74 (t, 1H, H–8).

9–(2’–acetoxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina

Se añade cloruro de tionilo (8 ml) a un ácido acético agitado, enfriado a –20°C (30 ml). A la misma temperatura, se añade clorhidrato de 9–(2–hidroxietilamino)–4–metil–1– nitroacridina (0,6 g) en porciones. La mezcla de la reacción se agita a temperatura ambiente durante 20 horas. Después, el disolvente se destila a presión reducida, el residuo se lavó varias veces con bicarbonato sódico acuoso al 10% y agua, se secó en vacío, y se cristalizó a partir de solución metanol – éter seca para proporcionar 9–(2’–acetoxietilamino)–4–metil–1– nitroacridina (rendimiento 72%), punto de fusión 210ºC – 212°C, anal. C18H18N3O4Cl (C, H, N). 1H RMN (D2O): δ2,45 (s, 3H, CH3’), 2,6 (s, 3H CH3), 3,25 (t, 2H, H–1’), 3,65 (t, 2H, H–2’), 7,35 (t, 1H, H–7), 7,58 (d, 1H, J=8,8 Hz, H–2), 7,66 (d, 1H, J=8,3 Hz, H–3), 7,7 (t, 1H, H–6), 7,84 (d, 1H, J=7,8 Hz, H–5), 7,9 (d, 1H, J=8,1 Hz, H–8).

9–(2’–propionoxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina

Se añade cloruro de tionilo (10 ml) a un ácido propiónico agitado, enfriado a –20°C (50 ml) y a la misma temperatura, se añade 9–(2–hidroxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina (0,55 g) en porciones, y la mezcla de la reacción se agita a temperatura ambiente durante 20 horas. La mezcla de la reacción se destila a presión reducida, se lava varias veces con bicarbonato sódico acuoso al 10% y agua, se seca en vacío, y se cristaliza a partir de solución de cloruro de hidrógeno en metanol – etanol absoluto para proporcionar clorhidrato de 9–(2– propionoxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina con rendimiento del 68%, punto de fusión 228ºC – 230°C, anal. C19H19N3O4Cl (C, H, N). 1H RMN (d6DMSO): δ 1,20 (t, 3H, H–3"), 2,0 (q, 2H, H– 2"), 2,8 (s, 3H, CH3), 3,9 (t, 2H, H–1), 4,0 (t, 2H, H–2’), 7,4 (t, 1H, H–7), 7,5 (d, 1H, J=7,8 Hz, H–3), 7,6 (d, 1H, J=8,3 Hz, H–6), 8,0 (t, 1H, H–5), 8,4 (m, 1H, H–8).

9–(2’–acetoxipropilamino)–4–metil–1–nitroacridina

Se añade cloruro de tionilo (20 ml) a un ácido acético enfriado a –20°C y agitado (35 ml) y a la misma temperatura se añade 9–(3’–hidroxipropilamino)–4–metil–1–nitroacridina (0,5 g) en porciones. La mezcla de la reacción se agita a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se destila a presión reducida, el residuo se lava varias veces con bicarbonato sódico acuoso al 10% y agua, se seca en vacío, y se cristaliza a partir de etanol absoluto para proporcionar 9–(2’–acetoxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina con rendimiento del 67%, punto de fusión 150ºC – 152°C, anal. C19H19N3O4 (C, H, N). 1H RMN (d6DMSO): δ 1,20 (t, 3H, H–3"), 1,75 (t, 2H, H–2’), 2,4 (s, 3H, CH3), 4,0 (t, 2H, H–1’), 7,1 (t, 1H, H–7), 7,2 (d, 1H, J=7,8 Hz, H– 2), 7,4 (d, 1H, J=7,8 Hz, H–3), 748 (t, 1H, H–6), 7,65 (d, 1H, J=8,3 Hz, H–5), 7,7 (d, 1H, J=8,3 Hz, H–8).

9–(3’–propionoxipropilamino)–4–metil–1–nitroacridina

Se añade cloruro de tionilo (25 ml) a un ácido propiónico enfriado a –20°C y agitado (40 ml) y a la misma temperatura se añade clorhidrato de 9–(3– hidroxipropilamino)–4–metil–1– nitroacridina (0,6 g) en porciones. La mezcla de la reacción se agita a temperatura ambiente durante 20 horas. El disolvente se destila a presión reducida, el residuo (aceite) se lava varias veces con bicarbonato sódico acuoso al 10% y agua, se seca en vacío, y se cristaliza a partir de metanol seco acidificado con solución en etanol de cloruro de hidrógeno para proporcionar clorhidrato de 9–(3’–propionoxipropilamino)–4–metil–1–nitroacridina (rendimiento 78%), punto de fusión 161ºC – 163°C, anal. C20H22N3O1Cl (C, H, N). 1H RMN (d6DMSO): δ 1,0 (t, 3H, H–3"), 2,35 (q, 2H, H–2"), 2,5 (s, 3H, CH3), 4,30 (t, 2H, H–1’), 7,15 (t, 1H, H–7), 7,26 (d, 1H, J=7,8 Hz, H–2), 7,38 (d, 1H, J=7,8 Hz, H–3), 7,5 (t, 1H, H–6), 7,62 (d, 1H, J=8,0 Hz, H–5), 7,8 (d, 1H, J=8,2 Hz, H–8).

9–(3’–hidroxipropilamino)–4–metoxi–1–nitroacridina

Se disuelve 9–cloro–4–metoxi–1–nitro–9–acridina (0,4 g) en fenol (20 g), se añade 3– aminopropanol (1,5 g) y la mezcla se calienta a 80°C durante 1 hora. La mezcla de la reacción se enfría, se diluye con éter seco y se acidifica con solución en etanol de cloruro de hidrógeno.

El precipitado resultante se filtra, se lava varias veces con éter seco y se cristaliza a partir de metanol absoluto para proporcionar cristales de clorhidrato de 9–(3 hidroxipropilamino)–4– metil–1–nitroacridina (rendimiento 74%), punto de fusión 180ºC – 183°C, anal. C17H18N3O4Cl (C, H, N). 1H RMN (D2O): δ1,68 (s, 2H, H–2’), 3,40 (t, 2H, H–3’), 3,50 (q, 2H, H–1’), 4,0 (s, 3H, OCH3), 7,0 (d, 1H, J=8,8 Hz, H–3), 7,27 (t, 1H, H–7), 7,49 (d, 1H, J=8,3 Hz, H–5), 7,65 (t, 1H, H–6), 7,77 (d, 1H, J=8,3 Hz, H–8), 7,90 (d, 1H, J=8,3 Hz, H–2).

9–(4’–hidroxibutilamino)–4–metoxi–1–nitroacridina

Se disuelve 4–metoxi–1–nitro–9– fenoxiacridina (0,34 g) en 20 g de fenol, se añade clorhidrato de 4–hidroxiaminobutanol (0,15 g) y la mezcla se calienta a 110°C durante 1,5 horas. La mezcla de la reacción se enfría a temperatura ambiente, se diluye con éter seco, se acidifica con solución en etanol de cloruro de hidrógeno. El precipitado se filtra, se lava con éter seco y se cristaliza a partir de etanol absoluto para proporcionar clorhidrato de 9–(4’– hidroxibutilamino)–4–metoxi–1–nitroacridina (rendimiento 69%), punto de fusión 149ºC – 152°C, anal. C18H20N3O4Cl (C, H, N). 1H RMN (D2O): δ 1,25 (t, 2H, H–2’), 3,3 (q, 2H, H–4’), 3,4 (t, 2H, H–1’), 4,0 (s, 3H, OCH3), 7,1 (d, 1H, J=8,8 Hz, H–3), 7,5 (d, 1H, J=8,8 Hz, H–5), 7,6 (t, 1H, H–6), 7,7 (d, 1H, J=7,3 Hz, H–8), 7,9 (m, 1H, H–2).

Clorhidrato de 9–(4’– hidroxibutilamino)–4–metoxi–1–nitroacridina

Se calientan 9–cloro–7–metoxi–1–nitro–9–acridina (0,37 g), 10g de fenol y 4– hidroxiaminobutanol (0,15 g) a 120°C durante 1,5 horas. La mezcla de la reacción se enfría a temperatura ambiente, se diluye con éter seco y se acidifica con solución en etanol de cloruro de hidrógeno. El precipitado resultante se filtra, se lava con éter y se cristaliza a partir de metanol – éter (3:1), se acidifica con solución en etanol de cloruro de hidrógeno para proporcionar clorhidrato de 9–(4’–hidroxibutilamino)–7–metoxi–1–nitroacridina con rendimiento del 81%, punto de fusión 153ºC – 155°C, anal. C18H20N3O4Cl (C, H, N). 1H RMN (D2O): δ 1,68 (t, 2H, H–3’), 3,39 (t, 2H, H–1’), 3,50 (q, 2H, H–2’), 4,0 (s, 3H, OCH3), 7,04 (d, 1H, J=8,8 Hz, H– 3), 7,27 (t, 1H, H–7), 7,49 (d, 1H, J=8,3 Hz, H–5), 7,65 (t, 1H, H–6), 7,80 (d, 1H, J=8,3 Hz, H– 8), 7,90 (d, 1H, J=8,8 Hz, H–2).

9–(2’–acetoxietilamino)–7–metoxi–4–metil–1–nitroacridina

Se añade cloruro de tionilo (5 ml) a un ácido acético agitado, enfriado a –20°C (20 ml) y a la misma temperatura se añade clorhidrato de 9–(2’–hidroxietilamino)–7–metoxi–4–metil–1– nitroacridina (0,3 g) en porciones, y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 18 horas. El disolvente se destila a presión reducida, el residuo se lava varias veces con bicarbonato sódico acuoso al 10% y agua, se seca en vacío, y se cristaliza a partir de benceno para proporcionar 9–(2’– acetoxietilamino)–7–metoxi–4–metil–1–nitroacridina (rendimiento al 82%), punto de fusión 145ºC – 148°C, anal. C19H19N3O5Cl (C, H, N). 1H RMN (d6DMSO): δ 1,6 (t, 3H, H–2’), 2,6 (s, 3H, CH3), 3,4 (s, 4H, H–2’, H–1’), 4,0 (s, 3H, CH3), 7,66 (dd, 1H, J1=9,3 Hz, J2=2,5 Hz, H–6), 7,85 (d, 1H, J=8,2 Hz, H–3), 8,00 (s, 1H, H–8), 7,7 (t, 1H, H–6), 8,15 (d, 1H, J=7,8 Hz, H–2), 8,20 (d, 1H, J=7,8 Hz, H–5).

Composiciones de 1–nitroacridina antiangiogénica

1–Nitro–9–hidroxietilaminoacridina + Combretastatina

En el ejemplo, se describe la acción concentrada de 1–nitro–9–hidroxietilaminoacridina con un agente antiangiogénico de combretastatina.

Materiales y procedimientos

Se usan células Dunning G y MAT–LyLu. Las células Dunning G son células tumorales no metastáticas que producen cáncer de próstata derivadas de tumores espontáneos de ratas Copenhagen. MAT–LyLu es una variante metastática de las células Dunning G que es una línea celular muy agresiva. 10.000 células MAT–LyLu implantadas en animales sinérgicos producen los tumores en 2 – 3 semanas. Ambas líneas celulares se cultivan en cultivo. Se presentan experimentos in vivo con células MAT–LyLu.

Crecimiento de células de cáncer en cultivo

Las células Dunning G y MAT–LyLu (Yedavelli y col., 1999, Int. J. Mol. Med. 4:243 – 248) se cultivaron en RPMI 1640 que contiene suero fetal bovino (FBS) al 10% suplementado con penicilina (50 IU/ml), estreptomicina (50 µg/ml), L–glutamina 2 mM y dexametasona 2,5 mM. Las células se incorporan dos veces por semana y se tripsinizan con tripsina – EDTA al 0,05% con confluencia celular del 80% al 90%. Como las células tienen un crecimiento rápido, se asegura de que no alcancen el 100% de confluencia. Por lo general, las células inyectadas para cultivo en ratas Copenhagen se toman de matraces que tienen una confluencia entre el 50% y el 75%. Las células MAT–LyLu se lavan dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se tripsinizan y se suspenden en PBS a una concentración de

100.000 células por ml. Cada animal se inyecta con 0,1 ml de suspensión celular con una dosis eficaz de 10.000 células MAT–LyLu vivas o un millón de células Dunning G por rata. La viabilidad celular se determina siempre por medio de la prueba de exclusión de azul de triptano y se descartaron las muestras que presentaron menos del 98% de viabilidad. Las células se inyectan en el costado derecho del animal que previamente se ha rasurado para la inyección. Todas las inyecciones son intradérmicas (i.d.), usando una jeringa de insulina. Las células se mantuvieron a 4ºC durante todo el tiempo antes de las inyecciones. Todos los grupos experimentales y los animales de control se inyectan al mismo tiempo con el mismo lote de células.

Experimentos en animales

Se compraron ratas de cuatro a cinco semanas de edad en Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN, y se dejaron aclimatar durante una semana, alimentándose con pienso de ratas Purina 5001. Al final de la semana uno, las ratas se distribuyeron aleatoriamente en grupos experimentales diferentes. Los pesos corporales de los animales se midieron dos veces por semana. Se inyectaron células MAT–LyLu vivas (10.000 células/rata) en todos los animales. Los animales se inyectaron por vía intraperitoneal dos veces por semana con 1– nitro–9–hidroxietilaminoacridina (0,6 mg/kg de peso corporal), mitoxantrona (0,6 mg/kg de peso corporal), combretastatina (10 mg/kg de peso corporal). El tratamiento se comienza el día dieciocho para los animales inyectados con MAT–LyLu y el día 25 para los animales inyectados con células Dunning G. Todos los animales se alojaron en jaulas colgantes con tres/cuatro animales por jaula y tuvieron acceso ad libitum a comida y agua potable y se mantuvieron en un ciclo diurno de doce horas. Todas las inyecciones y mediciones del tumor se llevaron a cabo con anestesia ligera (inhalación de metofano). Las mediciones de valoración experimentales incluyen peso corporal, incidencia del tumor, velocidad de crecimiento del tumor, número de animales con metástasis pulmonar y número de nódulos metastáticos visibles por pulmón del tumor que lleva un animal y examen histopatológico de los tumores. El diámetro del tumor se mide usando pies de rey y los tumores se fijaron en formalina. El experimento se termina cuando el tamaño del tumor en los animales de control es de 3 cm de diámetro. Se realiza el sacrificio de los animales por medio de asfixia con dióxido de carbono. Los experimentos descritos con MAT–LyLu, una variante de la línea celular Dunning G que se metastatizan al ganglio linfático y pulmón cuando se implantan en ratas Copenhagen singénicas.

Preparación de solución madre de fármacos para estudios in vitro e in vivo

Se realiza la solución madre de 1–nitro–9–hidroxietilaminoacridina en dimetilsulfóxido a 4,2 mg/ml. La mitoxantrona usada es Novantrone 25 mg/12,5 ml (Immunex, Seattle, WA) que contiene como ingredientes inactivos cloruro de sodio al 0,8% p/v, acetato de sodio al 0,005 % p/v, y ácido acético al 0,046% p/v. La combretastatina es soluble en agua y se disuelve en una concentración de 10 mg/ml/kg de peso corporal. Todos los fármacos para inyección en animales se diluyen en PBS de tal forma que el volumen total inyectado está entre 0,1 ml y 0,2 ml.

Resultados

El cultivo de células MAT–LyLu en ratas Copenhagen es muy rápido y las células se metastatizan fácilmente al pulmón y ganglios linfáticos. Se examina la actividad antitumoral de 1–nitro–9–hidroxietilaminoacridina en combinación con combretastatina en la incidencia del tumor, crecimiento del tumor y metástasis pulmonar del crecimiento celular del tumor inducido por MAT–LyLu.

Los tumores se inician inyectando 10.000 células vivas por vía intradérmica en el costado derecho del animal. De forma previsible, los tumores alcanzan un tamaño palpable en estas ratas al final de los días catorce a veinte tras lo cual existe un crecimiento exponencial.

Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 1 y 2. En la Figura 1 es evidente que la combinación de 1–nitro–9–hidroxietilaminoacridina (0,6 mg/kg) y combretastatina (10 mg/kg) produce un efecto antitumoral muy significativo que produce una reducción en el diámetro del tumor en al menos el 90%.

Las combinaciones de 1–nitro–9–hidroxietilaminoacridina y combretastatina no mostraron ninguna toxicidad manifiesta y las dosis administradas se toleran bien. La única toxicidad visible es una diarrea ocasional en aproximadamente del 10% al 20% de los animales.

El efecto de los dos fármacos, mitoxantrona y 1–nitro–9–hidroxietilaminoacridina en combinación con el agente angiogénico combrestastatina es muy significativo en la reducción del número de nódulos pulmonares. La combrestastatina y 1–nitro–9–hidroxietilaminoacridina muestran una reducción estadísticamente significativa (P=0,05) en nódulos pulmonares en comparación con los de control así como MITX + combretastatina.

Tanto las figuras 1 como 2 sugieren que el uso de 1–nitro–9–hidroxietilaminoacridina con un agente antiangiogénico puede tener un efecto profundo sobre los tumores principales así como los metastáticos.

9–(2’–Hidroxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina + Pancratistatina.

Se describen los resultados de estudios de 9–(2’–hidroxietilamino)–4–metil–1– nitroacridina + con un agente antiangiogénico pancratistatina.

Materiales y procedimientos

Crecimiento de células cancerígenas en cultivo

En estos estudios, se usan células TSU. Las células TSU son células de cáncer de próstata humano (Iizumi y col., 1987, J. Urol. 137:1304 – 1306). Las células TSU se cultivan en medio RPMI–1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% y los antibióticos penicilina, (50 IU/ml), estreptomicina (50 µg/ml) y L–glutamina 2 mM. Las células se alimentan con medio recién preparado dos veces por semana y se tripsinizan usando tripsina – EDTA al 0,05%. Las células usadas para inyección siempre están en fase logarítmica de su crecimiento. El matraz confluente (70% – 80%) y la viabilidad celular se comprueban por medio de la prueba de exclusión de azul de triptano antes de la inyección. Solamente se usan células con una confluencia superior al 95%. En un experimento típico, las células TSU están suspendidas en una concentración de 20 x 106/ml y se inyecta 0,1 ml por vía subcutánea en el costado derecho de ratones Balb/c, nu/nu.

Preparación de solución madre de fármacos para estudios in vitro e in vivo

Se realiza la solución madre de 9–(2’–hidroxietilamino)–4–metil–1–nitroacridina en DMSO a 0,16 mg/ml. Pancratistatina se realiza en agua destilada y se disuelve en una concentración de 1 mg/ml. Todos los fármacos para inyección en animales se diluyen en PBS de tal forma que el volumen total inyectado es aproximadamente 0,1 ml.

Experimentos en animales

Se obtuvieron ratones Balb/c nu/nu de seis semanas de edad de Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine. Los animales se dejaron aclimatar durante 2 – 3 semanas y se mantuvieron en jaulas separadas con filtración con aire controlado. Se alimentan con pienso normal para roedores y se distribuyen aleatoriamente en grupos experimentales diferentes. Un grupo es el grupo de control inyectado por vía intraperitoneal con disolventes en los que se disuelven los fármacos. En el caso en que uno de los disolventes es agua destilada y el otro es DMSO, los animales de control se inyectaron con DMSO, 0,1 ml por vía intraperitoneal. Se inyectaron 2 x 106 células TSU por vía subcutánea en el costado derecho y los animales se monitorizaron diariamente para detectar la formación de tumores. Se obtienen tumores palpables 7 – 10 días después de la inyección de las células tumorales. El diámetro del tumor se mide usando pies de rey en animales con anestesia ligera. El tratamiento con 9–(2’–hidroxietilamino)–4–metil–1– nitroacridina (0,6 mg/kg) y pancratistatina (5,0 mg/kg) se empieza cuando los tumores tienen un diámetro aproximadamente de 0,6 cm y los fármacos se administran por vía intraperitoneal dos veces por semana durante tres semanas.

Resultados

La Figura 3 muestra el efecto de la combinación de 9–(2’–hidroxietilamino)–4–metil–1– nitroacridina (0,6 mg/kg) y pancratistatina (5,0 mg/kg) sobre el crecimiento de la línea celular de cáncer de próstata humano, TSU en Balb/c/nu/nu. Esta combinación parece tener un efecto

5 inhibidor del tumor significativo sobre el crecimiento de células tumorales del cáncer de próstata. Las realizaciones específicas descritas en la presente memoria descriptiva pretenden ser como ilustraciones de varios aspectos de la invención. Cualquier realización equivalente pretende estar incluida en el ámbito bde esta

10 invención. De hecho, diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en la presente memoria descriptiva serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción precedente. Tales modificaciones pretenden estar incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (19)

1. 
   
   
   29

   1.

   Una composición que comprende al menos un derivado de 1-nitroacridina y al menos otra sustancia inhibidora del crecimiento del tumor, en la que la sustancia es pancratistatina o combretastatina.

2. 2.

   Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho derivado de 1-nitroacridina es un derivado de 1– nitro–9–alquilaminoacridina.

3. 3.

   Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho derivado de 1-nitroacridina es una 1–nitro–9–hidroxialquilaminoacridina o 1–nitro–9– alcoxialquilaminoacridina.

4. 4.

   Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el derivado de 1nitroacridina se selecciona de 1-nitro-9-hidroxietilaminoacridina, 9-(2’-hidroxietilamino)-4-metil1-nitroacridina, 9-(2’-hidroxietilamino)-7-metoxi-1-nitroacridina, 9-(2’-hidroxietilamino)-7-metoxi4-metil-1-nitroacridina, 9-(2’-acetoxietilamino)-1-nitroacridina, 9-(2’-propionoxietilamino)-1nitroacridina, 9-(3’-hidroxipropilamino)-7-metoxi-1-nitroacridina, 9-(3’-hidroxipropilamino)-4metil-1-nitroacridina, 9-(2’-acetoxietilamino)-4-metil-1-nitroacridina, 9-(2’-propionoxietilamino)-4metil-1-nitroacridina, 9-(3’-acetoxipropilamino)-4-metil-1-nitroacridina, 9-(2’propionoxipropilamino)-4-metil-1-nitroacridina, 9-(2’-hidroxietilamino)-4-metoxi-1-nitroacridina, 9-(3’-hidroxipropilamino)-4-metoxi-1-nitroacridina, 9-(4’-hidroxibutilamino)-4-metoxi-1nitroacridina, 9-(4’-hidroxibutilamino)-7-metoxi-1-nitroacridina y 9-(2’-acetoxietilamino)-7metoxi-4-metil-1-nitroacridina.

5. 5.

   Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la sustancia es combretastatina.

6. 6. Una combinación medicamentosa que comprende:

   a) una composición que comprende un derivado de 1–nitroacridina; y

   b) a una composición que comprende otra sustancia que inhibe el crecimiento

   del tumor, en la que la sustancia es pancratistatina o combretastatina
7. 7. Una combinación medicamentosa de acuerdo con la reivindicación 6, en la que

   el derivado de 1–nitroacridina es como se especifica en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

8. 8.

   Una combinación medicamentosa de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la sustancia es combretastatina.

9. 9.

   Uso de un derivado (s) de 1–nitroacridina y otra sustancia inhibidora del crecimiento del tumor, en el que la sustancia es pancratistatina o combretastatina, para la fabricación de un medicamento o combinación medicamentosa para inhibir o prevenir el crecimiento del tumor y/o prevenir o inhibir la metástasis de dicho tumor en un mamífero.

10. 10.

    Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el tumor es cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon, linfoma, sarcoma o leucemia.

11. 11.

    Uso de acuerdo con la reivindicación 9 o reivindicación 10, en el que la sustancia es combretastatina.

12. 12. Una combinación de compuestos, que es a) uno o más derivados de 1–nitroacridina, y b) pancratistatina o combretastatina,

    para su usi en la inhibición o prevención del crecimiento del tumor y/o prevenir o inhibir la metástasis de dicho tumor en un mamífero.

13. 13.

    Una combinación de compuestos de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el tumor es cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon, linfoma, sarcoma o leucemia.

14. 14.

    Una combinación de compuestos de acuerdo con la reivindicación 12 o reivindicación 13, en la que la sustancia es combretastatina.

15. 15.

    Una composición que comprende un derivado de 1–nitroacridina, en el que dicho derivado de 1–nitroacridina es una 1–nitro–9–hidroxialquilaminoacridina o 1–nitro–9– alcoxialquilaminoacridina, y una sustancia inhibidora del crecimiento del tumor, en la que la sustancia que inhibe el crecimiento del tumor es combretastatina o doxorubicina.

16. 16. Una combinación medicamentosa que comprende:

    a) una composición que comprende un derivado de 1–nitroacridina, en la que dicho derivado de 1–nitroacridina es una 1–nitro–9– hidroxialquilaminoacridina o 1–nitro–9–alcoxialquilaminoacridina; y

    5 b) una composición que comprende otra sustancia que inhibe el crecimiento del tumor, en la que la sustancia que inhibe el crecimiento del tumor es combretastatina o doxorubicina;
17. 17. Uso de un derivado (s) de 1–nitroacridina, en el que dicho derivado de 1–

    10 nitroacridina es una 1–nitro–9–hidroxialquilaminoacridina o 1–nitro–9–alcoxialquilaminoacridina, y otra (s) sustancia (s) que inhibe(n) el crecimiento del tumor, en el que la otra sustancia es combretastatina o doxorubicina, para la fabricación medicamentosa o combinación medicamentosa para inhibir o prevenir el crecimiento del tumor y/o prevenir o inhibir la metástasis de dicho tumor en un mamífero.

    15
18. 18. Una combinación de compuestos, que es a) 1–nitro–9–hidroxialquilaminoacridina o 1–nitro–9–alcoxialquil-aminoacridina; y b) combretastatina o doxorubicina

    20 para su uso en la inhibición o prevención del crecimiento del tumor y/o prevenir o inhibir la metástasis de dicho tumor en un mamífero.
19. 19. Una combinación de compuestos de acuerdo con la reivindicación 18, en la que

    el tumor es cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon, linfoma, sarcoma o 25 leucemia.