ES2353059T3 - Procedimiento para la caracterización de polinucleótidos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para determinar la secuencia de un polinucleótido diana, que comprende las etapas siguientes: (i)tratar una muestra de un polinucleótido diana bicatenario para crear regiones protuberantes en cada extremo, una de las cuales debe secuenciarse, presentando cada región protuberante un número definido de bases, (ii)dividir la muestra en compartimientos de reacción y poner en contacto cada muestra separada con una secuencia polinucleótida de señal bicatenaria diferente y un polinucleótido adaptador bicatenario correspondiente, representando cada secuencia de señal una secuencia polinucleótida específica de la misma longitud que la de la región protuberante que debe secuenciarse, y que comprende una región protuberante que permite la hibridación y la ligación con el extremo del polinucleótido diana situado enfrente del que se está secuenciando, y comprendiendo cada adaptador una región protuberante que presenta una secuencia complementaria a la secuencia representada por la secuencia de señal, hibridándose el adaptador con la región protuberante en la muestra diana que debe secuenciarse únicamente en el caso de que la región protuberante del adaptador sea complementaria a la región protuberante que se está secuenciando, (iii)llevar a cabo la reacción de polimerasa de la muestra o muestras utilizando cebadores que se hibridan con los extremos de la secuencia de señal y de la secuencia adaptadora, en la que el producto de la reacción de polimerasa comprende un sitio de restricción que permite el corte del adaptador para formar una nueva región protuberante que debe secuenciarse, opcionalmente mediante la repetición de las etapas (i) a (iii) utilizando enzimas de restricción para crear las regiones protuberantes, e (iv)identificar qué secuencias de señal se encuentran presentes en los productos amplificados, y en qué orden, para determinar de este modo la secuencia del polinucleótido diana.
Description
Procedimiento para la caracterización de
polinucleótidos.
La presente invención se refiere a
procedimientos para convertir un polinucleótido diana en cadenas de
información legible, para la determinación posterior de la
secuencia del polinucleótido diana.
Los avances en el estudio de las moléculas han
sido impulsados, en parte, por la mejora de las tecnologías
utilizadas para caracterizar las moléculas o las reacciones
biológicas de las mismas. En particular, el estudio de los ácidos
nucleicos ADN y ARN se ha beneficiado de las tecnologías en
desarrollo utilizadas para el análisis de secuencias y del estudio
de los sucesos de hibridación.
El procedimiento principal utilizando en general
para la secuenciación de ADN a gran escala es el procedimiento de
terminación de cadena. Este procedimiento fue desarrollado por
primera vez por Sanger y Coulson (Sanger et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977) y se basa en la
utilización de derivados dideoxi de los cuatro nucleótidos que se
incorporan en la cadena polinucleótida naciente en una reacción de
polimerasa. Tras la incorporación, los derivados dideoxi terminan
la reacción de polimerasa y seguidamente los productos se separan
mediante electroforesis en gel y se analizan para revelar la
posición en la que se ha incorporado en la cadena el derivado
dideoxi particular.
Aunque dicho procedimiento ha sido utilizado
ampliamente y produce resultados fiables, se reconoce que resulta
lento, laborioso y caro.
El documento
US-A-5.302.509 da a conocer un
procedimiento para secuenciar un polinucleótido inmovilizado sobre
un soporte sólido. El procedimiento se basa en la incorporación de
bases A, G, C y T 3-bloqueadas que presentan un
marcaje fluorescente diferente al del polinucleótido inmovilizado,
en presencia de ADN polimerasa. La polimerasa incorpora una base
complementaria al polinucleótido diana, pero el grupo
3'-bloqueante impide adiciones posteriores. El
marcaje de la base incorporada seguidamente puede determinarse y
eliminarse el grupo bloqueante mediante corte químico, permitiendo
que se produzca la polimerización posterior. Sin embargo, la
necesidad de eliminar los grupos bloqueantes de esta manera
requiere mucho tiempo y debe realizarse con elevada eficiencia.
El documento
WO-A-00/39333 describe un
procedimiento para secuenciar un polinucleótido mediante la
conversión de la secuencia de un polinucleótido diana en un segundo
polinucleótido que presenta una secuencia definida e información
posicional contenidas en el mismo. La información de secuencia de la
diana se dice que se encuentra "magnificada" en el segundo
polinucleótido, permitiendo una mayor facilidad para distinguir
entre las bases individuales de la molécula diana. Esto se consigue
utilizando "etiquetas magnificadoras", que son secuencias de
ácidos nucleicos predeterminadas. Cada una de las bases adenina,
citosina, guanina y timina en la molécula diana se encuentra
representada por una etiqueta magnificadora individual, convirtiendo
la secuencia diana original en una secuencia magnificada. A
continuación, las técnicas convencionales pueden utilizarse para
determinar el orden de las etiquetas magnificadoras, determinando de
esta manera la secuencia específica del polinucleótido diana.
En un procedimiento de secuenciación preferente,
cada etiqueta magnificadora comprende un marcaje, por ejemplo un
marcaje fluorescente, que seguidamente puede identificarse y
utilizarse para caracterizar la etiqueta magnificadora.
Aunque el procedimiento dado a conocer en la
presente publicación de patente presenta muchas ventajas, todavía
existe una necesidad de procedimientos mejoradas para secuenciar los
polinucleótidos diana.
Según un primer aspecto de la presente
invención, un procedimiento para identificar características
específicas de un polinucleótido diana presente en una muestra
comprende las etapas siguientes:
- i)
- unir a un extremo de cada polinucleótido diana en la muestra una secuencia polinucleótida de señal que es específica de la característica a estudio,
- ii)
- poner en contacto los polinucleótidos diana con una molécula que interacciona con el polinucleótido diana en el caso de que la característica se encuentre presente,
- iii)
- separar aquellos polinucleótidos diana que interaccionan respecto de aquellos que no interaccionan,
- iv)
- opcionalmente repetir las etapas (i) a (iii), y
- v)
- identificar qué secuencias de señal se encuentran presentes en los polinucleótidos diana separados, y en qué orden, determinando de esta manera las características de cada polinucleótido diana.
El procedimiento de la presente invención
permite determinar múltiples características de un polinucleótido
diana de una manera simple que puede automatizarse fácilmente. En la
forma de realización preferida, el procedimiento se basa en la
incorporación de dos moléculas polinucleótidas en aquellas dianas
que presentan la característica específica, permitiendo llevar a
cabo una reacción de amplificación, incrementado selectivamente de
esta manera el número de polinucleótidos diana con la
característica deseada y eliminando efectivamente aquellas dianas
que no presentan dicha característica. El procedimiento resulta
particularmente adecuado para determinar la secuencia de un
polinucleótido diana.
Según un segundo aspecto de la invención, un
procedimiento para determinar la secuencia de un polinucleótido
diana comprende las etapas siguientes:
- i)
- tratar una muestra de un polinucleótido bicatenario diana para crear extremos protuberantes 5' y 3', cada uno con un número de bases definido,
- ii)
- dividir la muestra y poner en contacto cada muestra dividida con una secuencia polinucleótida bicatenaria de señal y con un polinucleótido bicatenario adaptador, representando cada secuencia de señal una secuencia polinucleótida específica presente en el extremo 5'-protuberante y que comprende un extremo protuberante que permite la hibridación y la ligación con el extremo 3' del polinucleótido diana, y comprendiendo cada adaptador un extremo protuberante cuya secuencia es complementaria al de la secuencia representada por la secuencia de señal,
- iii)
- llevar a cabo la reacción de polimerasa en la muestra o muestras utilizando cebadores que se hibridan con las secuencias de señal y de adaptador, en la que el producto de la reacción de polimerasa comprende un sitio de restricción que permite cortar y separar el adaptador y la parte del polinucleótido diana que formó el extremo 5'-protuberante para formar un nuevo extremo 5'-protuberante, repitiendo opcionalmente las etapas (i) a (iii) utilizando enzimas de restricción para crear los extremos protuberantes, y
- iv)
- identificar qué secuencias de señal se encuentran presentes en los productos amplificados, y en qué orden, determinando de esta manera la secuencia del polinucleótido diana.
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La invención se describe haciendo referencia a
las figuras adjuntas, en las que:
la figura 1 es una representación esquemática de
una secuencia de señal, que ilustra la conversión de parte de un
polinucleótido diana en una secuencia de señal definida,
la figura 2 es una representación esquemática de
un experimento de secuenciación de un polinucleótido que se ha
llevado a cabo utilizando la presente invención,
la figura 3 es una representación esquemática de
la utilización de diferentes compartimientos con secuencias de
señal específicas asociadas en un procedimiento de conversión,
la figura 4 muestra los resultados de la
conversión, llevando a cabo tres ciclos para formar una serie de
secuencias de señal que representan la secuencia de bases de un
polinucleótido diana,
la figura 5 es una representación esquemática de
un experimento de secuenciación de un polinucleótido, que se ha
llevado a cabo para determinar una secuencia de tres bases por
ciclo, y
la figura 6 muestra los resultados de la
conversión, que demuestra la incorporación de secuencias de señal
específicas en un polinucleótido diana.
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El procedimiento de la presente invención es una
adaptación del procedimiento de conversión dado a conocer en el
documento WO-A-00/39333. En resumen,
la presente invención permite identificar características
específicas de un polinucleótido diana basándose en la
incorporación de secuencias de señal específicas. Las secuencias de
señal se incorporan en la totalidad de los polinucleótidos diana
presentes en una muestra, aunque sólo las que comprenden la
característica específica se separan y caracterizan.
El procedimiento resulta particularmente
adecuado para determinar la secuencia de un polinucleótido diana.
Mediante la utilización del procedimiento, puede convertirse un
número definido de secuencias en un extremo del polinucleótido
diana en una secuencia de señal definida en el otro extremo del
polinucleótido diana. En una serie de etapas, el extremo
"secuenciado" de la diana se corta, mientras que el extremo de
secuencia de señal se construye, generando una serie definida de
secuencias de señal que puede determinarse mediante una etapa de
identificación posterior.
El término "polinucleótido" es bien
conocido de la técnica y se utiliza para referirse a una serie de
moléculas unidas de ácidos nucleicos, por ejemplo ADN o ARN. Los
miméticos de ácidos nucleicos, por ejemplo APN, LNA (ácidos
nucleicos bloqueados) y
2'-O-metil-ARN,
también se encuentran comprendidos dentro del alcance de la
invención.
Las referencias en la presente memoria a las
bases A, T(U), G y C, se refieren a las bases nucleótidas
adenina, timina (uracilo), guanina y citosina, tal como se
apreciará en la técnica. El uracilo sustituye a la timina en el
caso de que el polinucleótido sea ARN, o puede introducirse en ADN
utilizando dUTP, nuevamente tal como es bien conocido de la
técnica.
En la presente memoria se hace referencia a los
extremos 5' y 3' del polinucleótido diana. En determinadas formas
de realización, el polinucleótido diana es bicatenario, y por lo
tanto cada extremo comprende extremos tanto 5' como 3'. Sin
embargo, se hace referencia a los extremos 5' y 3' refiriéndose a la
cadena de la diana que se está estudiando o secuenciando. También
resultará evidente que, donde la memoria se refiere al extremo 5'
como el extremo que se secuencia, resultará posible modificar el
procedimiento de manera que es el extremo 3' que se secuencia, es
decir las secuencias de señal y adaptadores se ligan a extremos
opuestos a aquellos indicados en la presente memoria.
En su aspecto más amplio, la invención permite
la identificación de características específicas del polinucleótido
diana. Una característica puede ser la secuencia del polinucleótido.
Alternativamente, una característica puede ser la capacidad del
polinucleótido diana de unirse a otras moléculas, por ejemplo a
proteínas ligantes de ADN, o de hibridarse a polinucleótidos
complementarios. El procedimiento también puede utilizarse para
identificar y caracterizar sitios de enzima de restricción presentes
dentro de la secuencia del polinucleótido diana.
Cada característica se identifica llevando a
cabo una reacción con una molécula que interacciona con un
polinucleótido diana que presenta la característica y que es
discriminante respecto de los polinucleótidos que no presentan la
característica. Los polinucleótidos diana que interaccionan con la
molécula se marcan con una secuencia de señal que es específica
para la característica y que permite determinar la característica en
una etapa posterior de lectura.
La presente invención se basa en la
incorporación de una secuencia de señal en todos los polinucleótidos
diana en una muestra, representando la secuencia de señal una
característica específica a estudio. Los polinucleótidos diana
seguidamente se ponen en contacto con una molécula y aquellos que
interaccionan se separan. De esta manera, resulta posible
identificar la característica la identificar la secuencia de
señal.
La separación de aquellas moléculas diana que
interaccionan con la molécula puede llevarse a cabo de diversas
maneras. Por ejemplo, la molécula puede contener un grupo de unión
que permite la separación del complejo diana de
polinucleótido/molécula. Entre los grupos de unión adecuados se
incluyen anticuerpos y biotina/estreptavidina. Alternativamente,
puede llevarse a cabo una separación por tamaños, debido a que
resultará posible distinguir el complejo de diana/molécula de los
componentes no acomplejados.
La forma de realización preferida de la presente
invención se basa en la incorporación de una secuencia
polinucleótida de señal y de una secuencia polinucleótida
adaptadora en el polinucleótido diana, lo que permite llevar a cabo
una reacción de amplificación para amplificar aquellos
polinucleótidos diana que han reaccionado con una molécula
específica. Los productos resultantes de la reacción de polimerasa
pueden caracterizarse adicionalmente mediante la repetición de las
etapas de reacción de la diana con una molécula y de incorporación
de una secuencia de señal adicional que presenta la característica
a estudio.
El procedimiento de la invención preferentemente
se lleva a cabo utilizando múltiples compartimientos de reacción,
uno por cada característica putativa a estudio. Cada compartimiento
de reacción presenta una secuencia de señal asociada específica
para dicho compartimiento. La muestra que contiene los
polinucleótidos diana se divide entre los comportamientos de
reacción y se une una secuencia de señal, por ejemplo mediante
ligación, a un extremo de cada polinucleótido diana. La secuencia
de señal se une a la totalidad de los polinucleótidos diana en el
compartimiento, con independencia de si la diana presenta la
característica especificada. La etapa siguiente es realizar un
ensayo para la característica mediante la reacción de cada diana con
una molécula que interacciona específicamente con aquellas dianas
que comprenden la característica. Por lo tanto, la molécula puede
ser una proteína ligante de polinucleótido, enzima u otro
polinucleótido. Seguidamente, se separan aquellas dianas que
interaccionan con las moléculas. En la forma de realización
preferida, la molécula comprende una secuencia adaptadora. Por lo
tanto, al interaccionar la diana con la molécula, la molécula (que
comprende el adaptador) se une o se liga a la diana. A
continuación, se amplifican aquellas dianas que comprenden tanto
una secuencia de señal como un adaptador.
La reacción de amplificación puede llevarse a
cabo utilizando cualquier procedimiento adecuado. El procedimiento
preferente es utilizar una reacción convencional de polimerasa bajo
condiciones conocidas de la técnica. Se apreciará que también
pueden llevarse a cabo otra reacciones de amplificación, incluyendo
la PCR isotérmica y la amplificación en bacterias.
Una forma de realización preferida es la
utilización del procedimiento para secuencia el polinucleótido
diana. Esto se lleva a cabo mediante la identificación de un número
definido de bases, por ejemplo tres o cuatro bases, en un extremo
del polinucleótido diana, seguido de la conversión de dicha
información en una secuencia de señal en el extremo opuesto,
permitiendo de esta manera que se produzcan ciclos adicionales de
conversión, sin la eliminación de secuencias de señal incorporadas
en ciclos anteriores.
El procedimiento de secuenciación puede llevarse
a cabo mediante la obtención del polinucleótido diana y el
tratamiento de éste con una serie de enzimas de restricción para
formar regiones protuberantes definidas en cada extremo del
polinucleótido diana, lo que permite la incorporación de una
secuencia de señal y un adaptador durante cada etapa de
conversión.
Una "secuencia de señal" es un
polinucleótido monocatenario o bicatenario que comprende
"unidades" diferentes de secuencia de ácidos nucleicos. Cada
característica, por ejemplo cada una de las bases A, T(U), G
y C en la diana se encuentra representada por una unidad diferente
y predefinida, o por una combinación única de unidades. Cada unidad
preferentemente comprende dos o más bases nucleótidas,
preferentemente entre 2 y 50 bases, más preferentemente entre 2 y
20 bases, y todavía más preferentemente entre 4 y 10 bases, por
ejemplo 6 bases. Cada unidad contiene por lo menos dos bases
diferentes. En una forma de realización preferida, cada unidad
contiene tres bases diferentes. El diseño de las unidades permite
distinguir las diferentes unidades durante una etapa de
"lectura", por ejemplo que implique la incorporación de
nucleótidos marcados detectablemente en una reacción de
polimerización, o la hibridación de oligonucleótidos
complementarios. Por ejemplo, en el caso de que la característica a
estudiar sea la secuencia de la diana, cada base de la diana se
encontrará representada por una serie específica de bases dentro de
una
unidad.
unidad.
En una forma de realización preferida, cada
secuencia de señal comprende dos unidades de secuencia diferente
que representan la totalidad de las cuatro bases en la diana. Según
esta realización, las dos unidades pueden utilizarse como sistema
binario: una unidad representa "0" y la otra representa
"1". Cada base de la diana se caracteriza mediante una
combinación de las dos unidades. Por ejemplo, la adenina puede
representarse como "0" + "0", la citosina como "0" +
"1", la guanina como "1" + "0" y la timina como
"1" + "1", tal como se muestra en la figura 1. Resulta
necesario distinguir entre las unidades, de manera que pueda
incorporarse una señal de "parada" en cada unidad. También
resulta preferente utilizar unidades diferentes que representen
"1" y "0", dependiendo de si la base en el polinucleótido
diana (molde) se encuentra en una posición impar o par.
Lo expuesto anteriormente se demuestra de la
manera siguiente:
secuencia de molde en posición impar:
Secuencia de molde en posición par:
Las secuencias de señal adecuadas también se
describen en el documento
WO-A-00/39333.
El "adaptador" es un polinucleótido
monocatenario o bicatenario. El propósito del adaptador es
proporcionar la secuencia necesaria para que resulte posible la
amplificación. En una forma de realización preferida, el adaptador
es un polinucleótido bicatenario que comprende un extremo
protuberante definido que es capaz de hibridarse y de ligarse a una
región complementaria en el polinucleótido diana. La región
complementaria habitualmente se encuentra en el extremo de la
diana, enfrente de la región a la que se incorpora la secuencia de
señal. El adaptador proporciona el sitio de unión de cebador
necesario en la reacción de amplificación. En una forma de
realización preferida, el adaptador se diseña para hibridarse a
aquella parte del polinucleótido diana que se está secuenciando, es
decir, la parte 5'-protuberante del polinucleótido
diana. En el caso de que el extremo 5'-protuberante
de la diana presente 4 bases, el extremo protuberante complementario
en el adaptador también presentará 4 bases. Esto permite que se
produzca la ligación para formar un polinucleótido de doble cadena.
Dado que el extremo 5'-protuberante de la diana
presenta una secuencia desconocida, habitualmente resultará
necesario utilizar una combinación de adaptadores la totalidad de
los cuales presente permutaciones de la secuencia de (por ejemplo)
4 bases. Los adaptadores de diferente secuencia se utilizan en
reacciones separadas, tal como se comenta posteriormente.
En cada adaptador, habitualmente se incorpora un
sitio de reconocimiento de enzima de restricción, permitiendo su
corte durante una etapa posterior. Esto puede utilizarse para crear
un nuevo extremo 5'-protuberante.
El procedimiento de secuenciación de la forma de
realización preferida comprende las etapas generales siguientes:
En primer lugar, se trata una muestra del
polinucleótido diana con uno o más enzimas de restricción,
resultando en un extremo protuberante en la diana con un número
definido de bases, por ejemplo 3 bases, que se utiliza para la
ligación de secuencias de señal posteriormente en el procedimiento
(la región protuberante). También se crea una región protuberante
en el extremo opuesto del polinucleótido diana (el extremo
5'-protuberante). Es esta región protuberante la
que debe identificarse (representarse) con la secuencia de señal
durante el procedimiento de conversión y que debe ligarse al
adaptador.
La muestra con el polinucleótido diana se divide
uniformemente en compartimientos de reacción que representan todas
las permutaciones de la región protuberante que debe secuenciarse.
Por ejemplo, en el caso de que la región protuberante que debe
secuenciarse presente 4 bases, deben utilizarse 256 compartimientos
de reacción. En el primer compartimiento, el polinucléotido diana
se pone en contacto con una secuencia de señal que representa, por
ejemplo, AAAA (en el caso de que la región protuberante que debe
secuenciarse presente 4 bases), la secuencia de señal que se liga
al extremo 3'-protuberante en la totalidad de los
polinucleótidos diana. También se añade un polinucleótido adaptador
con la región protuberante TTTT, aunque ésta únicamente se ligará
específicamente a los polinucleótidos diana que contengan una
región protuberante AAAA, dejando los polinucleótidos con una
secuencia protuberante diferente con una región protuberante no
ligada. Se lleva a cabo el mismo procedimiento en los demás
compartimientos, representando cada uno una combinación diferente de
las posibles secuencias de 4 bases. En cada caso, el adaptador será
el complemento de la secuencia representada por la secuencia de
señal.
Aunque resulta preferible que la secuencia de
señal represente todas las bases de la región protuberante, resulta
posible secuenciar menos bases que las presentes en la región
protuberante. Por ejemplo, en el caso de que la región protuberante
comprenda 4 bases, puede utilizarse una secuencia de señal que
represente 3 de ellas. Esto se ilustra en los Ejemplos dados a
conocer posteriormente.
Tras la realización de las etapas de ligación,
pueden agruparse las muestras y llevarse a cabo una reacción de
polimerasa. La reacción de polimerasa se lleva a cabo utilizando
cebadores que presentan como diana los extremos de la secuencia de
señal y del adaptador, y por lo tanto únicamente se amplificarán
exponencialmente aquellas moléculas que se han ligado con éxito
tanto a la secuencia de señal como a la secuencia adaptadora,
mientras que aquellas moléculas que contienen únicamente una
secuencia de señal resultarán eliminadas como consecuencia de una
amplificación lineal. El resultado será una población de fragmentos
polinucleótidos convertidos, en la que la región protuberante de 4
bases que se generó inicialmente en un extremo del polinucleótido
diana ha sido sustituida por una secuencia de señal que representa
las 4 bases presentes en el otro extremo del polinucleótido
diana.
En una forma de realización preferida, la
reacción de polimerasa se lleva a cabo utilizando
metil-dCTP, que garantiza que los sitios nativos de
enzima de restricción permanezcan inactivos. Las moléculas
adaptadoras incorporan sitios de enzima de restricción adicionales,
permitiendo de esta manera que se lleven a cabo ciclos adicionales
de conversión. Los cebadores utilizados en la reacción de polimerasa
son específicos de secuencias presentes dentro de la secuencia de
señal y del adaptador, garantizando de esta manera que la etapa de
amplificación se produce únicamente en el caso de que tanto la
secuencia de señal como el adaptador se encuentren ligados al
polinucleótido
diana.
diana.
También resulta preferible que los sitios de
unión de cebador sean diferentes en diferentes conjuntos de
secuencia de señal y adaptador, es decir, la secuencia de señal y
el adaptador utilizados en un ciclo de conversión comprenderán
sitios de unión de cebador diferentes de aquellos utilizados en un
ciclo anterior. Esto garantiza que se amplifica la secuencia
correcta.
Las regiones protuberantes pueden producirse por
medios diferentes, aunque la realización preferente es la
utilización de enzimas de restricción, por ejemplo, enzimas de
restricción de clase II. Estas enzimas no muestran ninguna
especificidad para la secuencia que se corta y por lo tanto pueden
generar regiones protuberantes con todo tipo de composición de
bases. El sitio de unión de la enzima de restricción puede
localizarse de manera que se forme una región protuberante en el
interior del polinucleótido diana mismo. En la práctica, resulta
preferible seleccionar enzimas que generen regiones protuberantes de
3 ó 4 pares de bases.
Las endonucleasas de restricción de clase II son
conocidas y se identifican en el documento
WO-A-00/39333.
En una forma de realización, en primer lugar el
polinucleótido diana se trata con un polinucleótido adaptador que
incorpora una secuencia de reconocimiento para la enzima de
restricción BbvI, y posteriormente el polinucleótido se trata con
la enzima de restricción para generar una región protuberante
específica en el extremo 5'. Los sitios de reconocimiento para BbvI
se inactivan tratando en primer lugar el polinucleótido diana
mediante metilación. Tras la creación de la primera región
protuberante, las regiones protuberantes posteriores en el extremo
5' preferentemente se crean utilizando la enzima de restricción
SfaNI. Lo anterior se lleva a cabo ligando una secuencia de
adaptador específica en el extremo 5' que incorpora la secuencia de
reconocimiento de SfaNI.
La región protuberante inicial en el extremo 3'
preferentemente se crea mediante ligación de un polinucleótido que
incorpora una región protuberante definida. La región protuberante
definida permite que una primera secuencia de señal se hibride y se
ligue al extremo 3'. En otra forma de realización, en primer lugar
el polinucleótido diana se trata con un polinucleótido adaptador
que incorpora una secuencia de reconocimiento para las enzimas de
restricción MmeI y EarI (o su esquizómero Eam1104I). A
continuación, el polinucleótido se trata con la enzima de
restricción MmeI para extraer 20 pares de bases de la molécula diana
y asociarlos a un polinucleótido adaptador. Un segundo
polinucleótido adaptador, que contiene una secuencia de
reconocimiento para la enzima de restricción SfaNI,
seguidamente se liga con el polinucleótido diana asociado al
adaptador utilizando la región protuberante generada con MmeI. Se
lleva a cabo una amplificación por PCR para amplificar los
fragmentos que contienen el polinucleótido diana de 20 pb
flanqueado por dos polinucleótidos adaptadores. Para proteger
sitios internos de la digestión posterior con EarI y
SfaNI, se lleva a cabo la PCR con dCTP metilada en lugar de
dCTP normal en la mezcla de dNTP. La amplificación de
polinucleótidos diana flanqueados por regiones protuberantes
generadas con MmeI (es decir productos secundarios de la digestión)
pueden eliminarse mediante la utilización de segundos adaptadores
no fosforilados. La región protuberante específica en el extremo 5'
se genera mediante la digestión del producto de PCR con la enzima de
restricción SfaNI (o equivalentes). La región protuberante
definida en el extremo 3' se crea mediante la digestión del producto
de PCR con la enzima de restricción EarI (o
Eam1104I). La secuencia de señal incorpora un sitio de enzima
de restricción, que preferentemente es para la enzima de
restricción EarI. Los ciclos posteriores de corte e
incorporación se producen utilizando las enzimas de restricción
EarI y SfaNI, tal como se muestra en la
figura 2.
figura 2.
El ciclo de conversión se ilustra adicionalmente
en la figura 3, que muestra el destino de cinco fragmentos
diferentes en tres compartimientos de reacción seleccionados
arbitrariamente de entre los 256 compartimientos utilizados en el
procedimiento. En primer lugar, los fragmentos se distribuyen
uniformemente en los 256 compartimientos. En el compartimiento 56,
en donde la región protuberante "TCTA" debe identificarse, se
introduce una secuencia de señal que representa dicha composición
de bases y se liga al extremo 3'-protuberante de 3
bases situado en el extremo izquierdo del polinucleótido diana.
Esta ligación se produce con independencia de la composición del
extremo 5'-protuberante de 4 bases
situado en el lado derecho del polinucleótido. A continuación, se
introduce y se liga un adaptador específico, que únicamente se liga
a fragmentos que presentan regiones 3'-TCTA
5'-protuberantes. La ligación incorrecta del
adaptador puede reducirse llevando a cabo la ligación en presencia
de adaptadores "bloqueantes". Los adaptadores bloqueantes
presentan una secuencia de región protuberante diferente a la del
adaptador específico y por lo tanto se ligan a polinucleótidos diana
que presentan una región protuberante no complementaria al
adaptador específico. A continuación, una reacción de amplificación
final amplifica selectivamente los fragmentos que se han ligado al
adaptador específico y por lo tanto elimina los demás fragmentos,
que se han asociado a una secuencia de señal incorrecta. Se lleva a
cabo el mismo procedimiento en los compartimientos 141 y 194, con la
excepción de que la composición de las secuencias de señal y de los
adaptadores se ajusta de acuerdo con las regiones protuberantes que
deben identificarse en los pocillos
(3'-ATAG-5' y
3'-CAAT-5').
Los polinucleótidos diana de los 256
compartimientos preferentemente se agrupan en un tubo de reacción
común antes de que tenga lugar la reacción de amplificación,
evitando de esta manera el inconveniente de llevar a cabo 256
reacciones de amplificación separadas.
Tras la realización de ciclos de conversión
posteriores, se reduce la secuencia en el extremo 5' del
polinucleótido diana y las secuencias de señal introducidas en el
extremo 3' del polinucleótido diana se incrementan de una manera
definida, correspondiente al polinucleótido diana ahora
"secuenciado". La determinación del tipo y orden de las
secuencias de señal puede llevarse a cabo utilizando procedimientos
dados a conocer en el documento
WO-A-00/39333 o en la solicitud
copendiente de patente internacional presentada en nombre de
LingVitae y que reivindica prioridad de la patente GB
0308852.3.
La reacción de amplificación puede producir
artefactos no deseados y pueden adoptarse diversas medidas para
reducir o eliminar los mismos. Por ejemplo, resulta preferible que
el sitio de reconocimiento de cebador en diferentes señales de
secuencia (y opcionalmente también diferentes adaptadores) sea
diferente, con el fin de reducir la probabilidad de que los
cebadores se unan a secuencias de señal internas y amplifiquen
fragmentos de la diana convertida, de mayor tamaño.
También resulta preferible diseñar las
secuencias de señal de manera que secuencias de señal consecutivas
o posteriores comprendan secuencias de bases diferentes. Lo anterior
garantiza que los cebadores introducidos para hibridarse a la
secuencia de señal terminal no se hibriden a secuencias de señal
internas, lo que resultaría en la producción de fragmentos durante
la etapa de amplificación.
La digestión incompleta por parte de una o más
de las enzimas de restricción también puede ser una fuente de
artefactos. La utilización de enzimas de restricción que presenten
elevadas especificidad y actividad reducirá este problema.
Los artefactos también pueden eliminarse
mediante purificación en gel, o mediante inmovilización de los
productos previamente a la digestión con la enzima de restricción;
aquellos productos no digeridos por completo permanecerán
inmovilizados y pueden separarse de aquellos productos que han
experimentado una digestión completa.
La eliminación del exceso de adaptadores y
dianas previamente a la amplificación también reducirá la producción
de artefactos.
Los Ejemplos siguientes ilustran la
invención.
Ejemplo
1
Antes (o después) de la fragmentación del ADN,
el polinucleótido diana se metila con el fin de inactivar los
sitios de reconocimiento nativos. Mediante la utilización de BbvI
como la enzima de restricción, se utiliza M.Bbv (Megabase Research
Products) para inactivar sus sitios diana. El polinucleótido diana
se fragmenta aleatoriamente en trozos de 500 a 1.000 pares de bases
mediante rotura mecánica utilizando un dispositivo HydroShear
(GeneMachines). En combinación con la sonicación, pueden generarse
fragmentos incluso más cortos. Para incrementar la eficiencia de la
etapa posterior de ligación de adaptador de extremos romos, los
polinucleótidos fragmentados se tratan opcionalmente con ADN
polimerasa para rellenar o para eliminar regiones protuberantes
utilizando su función exonucleasa. Con este fin comúnmente se
utilizan ADN polimerasa de T4 y fragmento Klenow grande solos o en
combina-
ción.
ción.
Se ligan en extremo romo dos tipos de
polinucleótidos adaptadores a los fragmentos del polinucleótido
diana. Uno incorpora un sito BbvI y el otro incorpora una región
protuberante para la ligación posterior a una secuencia de señal.
Cada adaptador presenta una longitud de entre 10 y 20 pares de bases
y se añade en un exceso molar de 10X a los polinucleótidos diana.
Los adaptadores se fosforilan excepto una de las cadenas del
adaptador BbvI. Además, la cadena opuesta de este adaptador porta
un grupo 3'-desoxi para evitar la concatamerización
durante la ligación. La ligación se lleva a cabo bajo condiciones
optimizadas para la ligación de extremos romos siguiendo las
recomendaciones del fabricante.
Los fragmentos de polinucleótido ligados se
digieren con BbvI. Tras la digestión, se lleva a cabo una selección
según el tamaño (por ejemplo separación en gel o fraccionamiento en
columna) para eliminar el exceso de adaptadores, fragmentos
terminales cortados y fragmentos de polinucleótido inferior o
superior a determinado valor umbral (por ejemplo, una distribución
duplicada de tamaños).
Ejemplo
2
El polinucleótido diana se rompió aleatoriamente
en trozos de 500 a 1.000 pares de bases mediante rotura mecánica
utilizando un dispositivo HydroShear (GeneMachines). En combinación
con la sonicación pueden generarse fragmentos más cortos. Para
incrementar la eficiencia de la etapa posterior de ligación de
extremos romos del adaptador, los polinucleótidos fragmentados se
tratan opcionalmente con ADN polimerasa para rellenar o eliminar las
regiones protuberantes, tal como se comenta en el Ejemplo 1. Se
liga un exceso molar de 10X de un adaptador de extremos romos de 20
a 40 pb a los polinucleótidos diana fragmentados. La ligación se
lleva a cabo bajo condiciones optimizadas para la ligación de
extremos romos siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Únicamente se fosforiló la cadena antisentido del adaptador para
garantizar la ligación unidireccional (además, la cadena
antisentido incorpora un grupo 3'-dideoxi o un grupo
bloqueante para evitar la concatamerización). El adaptador porta en
su mismo extremo 3' un sitio de restricción para MmeI y un sitio de
restricción para EarI (o Eam1104I) cadena arriba. La
exclusión por tamaños o las columnas de afinidad de espín (por
ejemplo la PCR de lavado MinElute, de Qiagen) se utilizan
convenientemente para eliminar el exceso de adaptadores, así como
para cambiar el
tampón.
tampón.
La digestión con MmeI se llevó a cabo bajo
condiciones óptimas para cortar 20 pares de bases de la molécula
diana y asociarlas con el polinucléotido adaptador. Se utilizó una
columna de centrifugación para cambiar el tampón (por ejemplo
BioSpin-6, de BioRad). A continuación, se ligó un
segundo polinucleótido adaptador, que contenía una secuencia de
reconocimiento para la enzima de restricción SfaNI, al
polinucleótido diana asociado al adaptador mediante la región
protuberante generada con MmeI (debido a que MmeI generar un extremo
3'-protuberante de dos bases, el segundo adaptador
es un grupo de adaptadores presentando conjuntamente las 16
permutaciones de dos bases en el extremo
3'-protuberante). El sitio SfaNI se posiciona
para cortar dentro de las cuatro bases terminales de la secuencia
diana. El adaptador se mantiene no fosforilado para eliminar la
amplificación posterior de los polinucleótidos diana que contienen
dos regiones protuberantes generadas con MmeI (un producto
secundario de la digestión del polinucleótido diana). Se llevó a
cabo una amplificación por PCR para amplificar los fragmentos que
contenían el polinucleótido diana de 20 pb flanqueado por dos
polinucleótidos adaptadores. Para proteger los sitios internos de la
digestión posterior con EarI y SfaNI, se llevó a cabo
una PCR con dCTP metilada sustituyendo al dCTP normal en la mezcla
de dNTP.
Se utilizó una columna de centrifugación de PCR
de lavado para eliminar el exceso de cebadores y la ADN polimerasa,
y para cambiar el tampón.
El material amplificado por PCR se digiere con
EarI (o Eam1104I) y con SfaNI para generar las
regiones protuberantes necesarias para la ligación de secuencias de
señal y para la conversión bioquímica. Mediante la utilización de
cebadores biotinilados en la PCR, pueden eliminarse los fragmentos
terminales digeridos a partir de la afinidad (por ejemplo
utilizando perlas recubiertas de estreptavidina).
\newpage
Ejemplo
3
El principio de conversión cíclica de bases de
ácidos nucleicos en secuencias de señal legibles se demostró
mediante la conversión de una secuencia de 12 bases en un ADN diana
en su cadena de señal correspondiente. La conversión tuvo lugar en
etapas mediante un procedimiento cíclico, en el que se convirtieron
4 bases en cada ciclo durante un total de 3 ciclos. El producto
final fue una cadena de señal consistente de 12 componentes de
señal que representan la secuencia de bases relevante en el ADN
diana. El experimento se describe esquemáticamente en la figura
2.
Un fragmento de ADN diana de 240 pb, que
contiene sitios internos para SfaNI y Eam1104I se
amplificó por PCR a partir del genoma del bacteriófago lambda
(1507-1703) utilizando cebadores que contenían
sitios de restricción para Eam1104I y SfaNI (el
fragmento superior en la figura 2), respectivamente. Con el fin de
evitar el corte posterior de sitios internos, se llevó a cabo la
reacción de PCR con nucleótidos desoxicitosina metilada
(dCTP-m5) en lugar de la desoxicitosina (dCTP)
habitual. Condiciones de la PCR (50 \mul): KCl 10 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM, Tris-HCl 20
mM, Triton-X-100 al 0,1%, pH 8,8
(tampón Thermopol, New England Biolabs), Mg^{2+} 2 mM, dNTP
(-dCTP) 200 \muM y dCTP-m5 200 \muM (Amersham
Pharmacia Biotech), 20 pmoles del cebador nº 328 de Lambda
(5'-agactggc
gatccctggcatcacccctccagcgtgttttat-3'; SEC ID nº 1) y 20 pmoles de cebador nº 329 de Lambda (5'-gcactgataggcgt
cactcttcgctgtacgctglccagatgt-3'; SEC ID nº 2) (MWG Biotech), 10 ng de genoma de Lambda, 1U de polimerasa Vent (New England Biolabs). El ciclado de PCR se llevó a cabo con un termociclador PTC-200 (MJResearch). Inicio en caliente: 95ºC, 5 minutos, 35 ciclos consistentes de: 95ºC, 15 segundos; 58ºC, 20 segundos; 72ºC, 30 segundos. Etapa de extensión completa: 72ºC, 5 minutos.
gatccctggcatcacccctccagcgtgttttat-3'; SEC ID nº 1) y 20 pmoles de cebador nº 329 de Lambda (5'-gcactgataggcgt
cactcttcgctgtacgctglccagatgt-3'; SEC ID nº 2) (MWG Biotech), 10 ng de genoma de Lambda, 1U de polimerasa Vent (New England Biolabs). El ciclado de PCR se llevó a cabo con un termociclador PTC-200 (MJResearch). Inicio en caliente: 95ºC, 5 minutos, 35 ciclos consistentes de: 95ºC, 15 segundos; 58ºC, 20 segundos; 72ºC, 30 segundos. Etapa de extensión completa: 72ºC, 5 minutos.
Ciclo
1
Se introdujo el fragmento en el ciclo de
secuenciación (figura 2, A) y se cortó con Eam1104I y
SfaNI (debido a que los sitios internos se encuentran
metilados y protegidos frente al corte, éste tuvo lugar únicamente
en las áreas de cebador). Condiciones de la digestión: NaCl 100 mM,
Tris-HCl 50 mM, MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM, pH 7,9
(NEB3, New England Biolabs), 1 \mug de fragmento de PCR metilado,
20 U de Eam1104I, 3U de SfaNI e incubación durante
una hora a 37ºC. Las enzimas se inactivaron por calor a 65ºC durante
20 minutos. El fragmento cortado se lavó utilizando el sistema de
PCR de purificación de GibcoBRL (Gibco) y después se eluyó con
Tris-HCl 10 mM. El fragmento cortado corresponde a
la naturaleza de los fragmentos que se obtienen tras una
preparación inicial o un ciclo de conversión (descrito en el Ejemplo
1) en el aspecto de que presenta una región protuberante de 3 bases
para la ligación de cadena de señal y una región protuberante de 4
bases para la ligación a un adaptador específico en el lado
derecho.
La etapa de conversión, en la que se une el
marcador de selección (figura 2, B), se llevó a cabo mediante la
ligación del fragmento con el adaptador específico y su secuencia de
señal asociada: Tris-HCl 40 mM, MgCl_{2} 10 mM,
DTT 10 mM, ATP 0,5 mM, pH 7,8 (tampón de ligasa, Fermentas), 1,6
pmoles de adaptador 1
(5'-biotina-ggctaggtgctgatgaacgcatcg-3';
SEC ID nº 3 hibridado a
5'-tggacgatgcgttcatcagcacctagcc-3';
SEC ID nº 4 (MWG-Biotech), 1,9 pmoles de secuencia
de señal 1 (1), 7,5 Weiss-U de ADN ligasa de T4
(Fermentas). La incubación tuvo lugar a temperatura ambiente (22ºC)
durante 2,5 horas. La ligasa se inactivó por calor a 65ºC durante 10
minutos.
Las secuencias de señal utilizadas en el
experimento se prepararon de la manera siguiente: los componentes
de señal (cada uno representando a una base) se prepararon mediante
hibridación de oligonucleótidos (de aproximadamente 45 bases) que
se ligaron entre sí para crear las secuencias de señal deseadas (los
componentes de señal se construyeron con diferentes regiones
protuberantes que dictan la secuencia de la ligación). Las
secuencias de señal se amplificaron mediante PCR y se cortaron con
SapI con el fin de generar la región protuberante complementaria
necesaria para la ligación de la secuencia de señal al ADN diana.
Debido a que la totalidad de los fragmentos de ADN diana
presentaban la misma región protuberante para la ligación de la
secuencia de señal, todos los fragmentos en una reacción dada se
ligaron a la misma secuencia de señal, con independencia de la
secuencia de la región protuberante generada con SfaNI. Por
lo tanto, la especificidad y la selección se localizan en el
adaptador. Debido a que éste se liga al extremo del ADN diana que se
cortó con SfaNI, únicamente se ligan los fragmentos que
presentan una región protuberante complementaria al adaptador. Por
lo tanto, una conversión se basa en el supuesto de que el ADN diana,
además de ligarse a una secuencia de señal, también presenta una
región protuberante complementaria al adaptador para que la ligación
a ésta tenga lugar. En otras palabras, el adaptador garantiza una
selección específica de fragmentos que presentan una secuencia de
región protuberante correspondiente a la secuencia de señal
ligada.
ligada.
La etapa de selección de la conversión de bases
consiste de la selección y amplificación de fragmentos a los que se
ha ligado tanto una secuencia de señal como un adaptador específico
(figura 2, C). Lo anterior se llevó a cabo utilizando una PCR bajo
las condiciones siguientes (50 \mul): KCl 10 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM, Tris-HCl 20
mM, Triton-X-100 al 0,1%, pH 8,8
(tampón Thermopol, New England Biolabs), Mg^{2+} 2 mM, dNTP
(-dCTP) 200 \muM y dCTP-m5 200 \muM (Amersham
Pharmacia Biotech), 20 pmoles de adaptador1-cebador
nº 332
(5'-biotina-ggctaggtgctgatgaacgcatcg-3';
SEC ID nº 5) y 20 pmoles de secuencia de señal
1-cebador nº 340
(5'-taatacgactcactatagcatgactcgagcctcttcgcga-3';
SEC ID nº 5) (MWG-Biotech), aproximadamente 3,5
fmoles de ADN diana ligado y 1U de polimerasa Vent (New England
Biolabs). El ciclado de la PCR se llevó a cabo utilizando un
termociclador PTC-200 (MJResearch). Inicio en
caliente: 95ºC, 2 minutos; 20 ciclos consistentes de: 95ºC, 15
segundos; 66ºC, 20 segundos; 72ºC, 30 segundos. Etapa de extensión
completa: 72ºC, 5 minutos. El pocillo 2 en la figura 2 muestra los
resultados del ciclo inicial del procedimiento de secuenciación. Se
generó un fragmento correcto de 380 pb.
Ciclo
2
Con el fin de convertir las siguientes 4 bases,
se limpió el producto de PCR con el sistema de purificación
GibcoBRL (Gibco) y después se cortó con SfaNI y
Eam1104I. Lo anterior resulta posible debido a que la
secuencia de señal y el adaptador del ciclo inicial contienen un
sitio para Eam1104I y SfaNI, respectivamente. Debido
a que los sitios se encontraban localizados en la región del
cebador, no resultaron bloqueados por la metilación durante la PCR.
Para incrementar la eficiencia de la reacción de corte, los cortes
se llevaron a cabo en serie bajo condiciones de corte óptimas.
Corte con SfaNI: NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM,
MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM, pH 7,9 (NEB3, New England Biolabs), 1
\mug de fragmento de PCR metilado, 4U de SfaNI. Incubación
a 37ºC durante 1 hora. Inactivación por calor de la enzima a 65ºC
durante 10 minutos. Se utilizó una columna Micro
Bio-Spin 6 (BioRad) para limpiar el fragmento. Corte
con Eam1104I: Tris-acetato 33 mM, acetato de
magnesio 10 mM, acetato de potasio 66 mM, BSA 0,1 mg/ml, pH 7,9
(Tango Y^{+}, Fermentas), fragmento de PCR digerido con
SfaNI, 10U de Eam1104I. Incubación a 37ºC durante 1
hora, seguido de la inactivación por calor a 65ºC durante 20
minutos. El producto digerido se limpió mediante la utilización del
sistema de purificación GibcoBRL (Gibco). La etapa inicial de la
conversión se llevó a cabo correspondiente al ciclo inicial,
excepto en que se añadió una nueva secuencia de señal y su adaptador
específico asociado (correspondiente a las siguientes 4 bases de la
secuencia). Para reducir problemas potenciales de contaminación
cruzada, la secuencia de señal 2 se diseñó con una región
protuberante diferente de la de la secuencia de señal 1. Condiciones
de la ligación: Tris-HCl 40 mM, MgCl_{2} 10 mM,
DTT 10 mM, ATP 0,5 mM, pH 7,8 (tampón ligasa, Fermentas), 0,5
pmoles de adaptador 2
(5'-biotina-cgacagtacgacggaccagcatcc-3';
SEC ID nº 6 hibridada a
5'-acgcggatgctggtccgtcgtactgtcg-3';
SEC ID nº 7) (MWG-Biotech), 1 pmol de secuencia de
señal 2 (2), 1 Weiss-U de ADN ligasa de T4
(Fermentas). La incubación tuvo lugar a temperatura ambiente (22ºC)
durante 1,5 horas. La ligasa se inactivó por calor a 65ºC durante
10 minutos. La amplificación por PCR tuvo lugar bajo las mismas
condiciones que en el ciclo inicial, excepto en que se utilizó un
conjunto nuevo de cebadores (adaptador2-cebador nº
347:
5'-biotina-cgacagtacgacggaccagcatcc-3';
SEC ID nº 6' y secuencia de señal 2-cebador nº 343:
5'-taatacgactcactatagcatcgaatgaccgcctcttccact-3';
SEC ID nº 8). Son preferibles conjuntos de cebadores diferentes
para cada ciclo de secuenciación con el fin de minimizar el peligro
de amplificar cualquier residuo del ciclo de secuenciación anterior.
El resultado de la amplificación por PCR en el segundo ciclo se
muestra en el pocillo 3 en la figura 4. Se generó un fragmento
correcto de 523 pb.
Ciclo
3
La conversión de las siguientes 4 bases y la
amplificación por PCR siguieron el mismo patrón descrito para el
ciclo 2. Tras el corte en serie con SfaNI y Eam1104I,
el fragmento se ligó con la secuencia de señal 3 (3) y con el
adaptador 3
(5'-biotina-atcgagcctggcatagcagcatca-3';
SEC ID nº 9 hibridado con
5'-aaactgatgctatgccaggctcgat-3';
SEC ID nº 10) (MWG-Biotech). La amplificación por
PCR se llevó a cabo utilizando el conjunto de cebadores siguiente:
adaptador3-cebador nº 353
(5'-atcgagcctggcatagcagcatca-3'; SEC
ID nº 9) y la secuencia de señal 3-cebador nº 345
(5'-taatacgactcactatagcaccgggcaggatagactcttcaggt-3';
SEC ID nº 11). El resultado de la amplificación en el ciclo 3 se
muestra en el pocillo 4, en la figura 4. El pocillo 4 muestra que se
formaron dos bandas débiles y una relativamente fuerte. La banda
fuerte se aproximada a la longitud esperada, de 666 pb. Las bandas
débiles, del tamaño incorrecto, que pueden observarse en los
pocillos 4 (ciclo 3) y 3 (ciclo 2), muy probablemente son el
resultado de problemas de contaminación cruzada y del cebado
incorrecto. La banda débil en el pocillo 3 y las bandas débiles más
abajo, en el pocillo 4, corresponden al tamaño de un fragmento de
PCR del ciclo anterior. Una posible explicación es que fragmentos
no cortados por completo en un ciclo pueden funcionar como moldes
para el siguiente ciclo de la PCR. Aunque la utilización de
conjuntos nuevos de cebadores en cada ciclo reduce este problema en
cierto grado, todavía se encuentra presente el peligro de un cebado
incorrecto debido a los sitios de enzimas que presentan en común
los cebadores. Sin embargo, este tipo de cebado incorrecto puede
eliminarse mediante la utilización de condiciones de hibridación más
astringentes durante la PCR (por ejemplo Mg^{2+}, temperatura),
la utilización de polimerasas más discriminantes, el alejamiento del
sitio Eam1104I respecto del extremo 3' en el cebador de la
cadena de secuencia, la elección de nuevas secuencias o la
inmovilización de los fragmentos (por ejemplo el sistema
biotina-estreptavidina sobre microperlas) antes del
corte, de manera que se garantice que han sido cortados los
fragmentos que entran en el ciclo siguiente. La mejor solución para
otros tipos de cebado incorrecto sería seleccionar nuevas secuencias
de cebador y/o optimizar las condiciones de la PCR. Los sucesos de
cebado incorrecto causados por la presencia de material de ADN
superfluo (por ejemplo un exceso de adaptadores o de ADN no ligado)
puede eliminarse mediante la utilización de una estrategia de
tio-protección de la cadena retrasada del adaptador.
La digestión con una 5'-3' exonucleasa (por ejemplo
la exonucleasa de T7 o la exonucleasa de Lambda) previamente a la
PCR sólo dejará intacta una cadena de ADN ligada al adaptador. En
formas de realización en las que todas las secuencias diana son de
igual longitud, puede utilizarse la selección por tamaño para
eliminar los fragmentos de longitud incorrecta durante el
procedimiento de conversión bioquímica.
Ejemplo
4
El principio de conversión cíclica de las bases
de ácidos nucleicos en una secuencia de señal legible fue
demostrado mediante la conversión de una secuencia de 12 bases
presente en un ADN diana en su secuencia de señal correspondiente.
La conversión tuvo lugar en etapas, mediante un procedimiento
cíclico, en el que se convirtieron 3 bases en cada ciclo durante un
total de 4 ciclos. El producto final fue una secuencia de señal que
consistía de 12 componentes de señal que representaban la secuencia
de bases relevante en el ADN diana. El experimento se describe
esquemáticamente en la figura 5.
Se generó un fragmento de ADN diana sintético de
66 pb mediante la hibridación de los oligonucleótidos siguientes:
nº 003
(5'-PHO-GATCTTGGCTATTCGTCTCTTGGCTTTTCGTCTGATTGTAGACGCCAACGGGACATGAT
GATGAT-3'; SEC ID nº 12) y nº 004 (5'-[PHO-CATCATCATCATCATGTCCCGTTGGCGTCTACAATCAGAC
GAAAAGCCAAGAGACGAATAGCCAAG-3'; SEC ID nº 13). Tal como resulta evidente a partir de la secuencia, la molécula diana contiene en el extremo 3' cuatro tripletes ATP consecutivos. La molécula hibridada corresponde a la naturaleza de aquellos fragmentos que se obtienen tras una preparación inicial (descrita en el Ejemplo 2) en el aspecto de que presenta una región protuberante de 3 bases para la ligación de secuencia de señal y una región protuberante de 4 bases para la ligación a un adaptador específico.
GATGAT-3'; SEC ID nº 12) y nº 004 (5'-[PHO-CATCATCATCATCATGTCCCGTTGGCGTCTACAATCAGAC
GAAAAGCCAAGAGACGAATAGCCAAG-3'; SEC ID nº 13). Tal como resulta evidente a partir de la secuencia, la molécula diana contiene en el extremo 3' cuatro tripletes ATP consecutivos. La molécula hibridada corresponde a la naturaleza de aquellos fragmentos que se obtienen tras una preparación inicial (descrita en el Ejemplo 2) en el aspecto de que presenta una región protuberante de 3 bases para la ligación de secuencia de señal y una región protuberante de 4 bases para la ligación a un adaptador específico.
La etapa de conversión en la que se unía el
marcador de selección (figura 5, B) se llevó a cabo mediante la
ligación de 1 pmol del fragmento con el adaptador específico y su
secuencia de señal asociada: Tris-HCl 50 mM,
MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, 25 \mug/ml de
BSA, pH 7,5 (tampón ligasa, New England Biolabs), 1 pmol de
adaptador nº 005
(5'-GATGTAGATGCACTCCCGGACCTC-3'; SEC
ID nº 14 hibridada a nº 006:
5'-GAGGTCCGGGAGTGCATC
TA-3'; SEC ID nº 15) (MWG-Biotech), 1 pmol de secuencia de señal nº 001 (5'-TGTGTCCGCGTGGCTCTTCT
GATCTTGGCTTTTCGTCTCTTGGCTATTCGTCT-3'; SEC ID nº 16, hibridada a nº 002: 5'-PHO-ATCAGACGAA
TAGCCAAGAGACGAAAAGCCAAGATCAGAAGAGCCACGCGGACACA-3'; SEC ID nº 17) (MWG-Biotech), 100 unidades de ADN ligasa de T4 (New England Biolabs). La incubación tuvo lugar a 22ºC en un termociclador PTC-200 (MJResearch) durante 1 hora. La selección y amplificación de aquellas moléculas que se habían ligado con éxito tanto al adaptador como al adaptador de la secuencia de señal se llevaron a cabo utilizando una PCR bajo las condiciones siguientes (50 \mul): KCl 10 mM, (NH_{4})SO_{4} 10 mM, Tris-HCl 20 mM, Triton-X-100 al 0,1%, pH 8,8 (tampón Thermopol, New England Biolabs), Mg^{2+} 2 mM, 200 \muM de dNTP (Amersham Bioscience), 10 pmoles de cebador de adaptador nº 006 (5'-GAGGTCCGGGAGTGCATCTA-3'; SEC ID nº 18) (MWG-Biotech) y 10 pmoles del cebador del adaptador de señal, nº 007 (5'-TGTGTCCGCGTGGCTCTTCT-3'; SEC ID nº 19) (MWG-Biotech), aproximadamente 1 pmol de ADN diana ligado y 0,2U de polimerasa Vent (New England Biolabs). El ciclado de PCR se llevó a cabo con un termociclador PTC-200 (MJResearch). Inicio en caliente: 95ºC, 2 minutos, 25 ciclos que consisten en: 95ºC, 15 segundos; 59,3ºC, 20 segundos; 72ºC, 20 segundos. Etapa de extensión completa: 72ºC, 60 segundos. El pocillo 2, en la figura 6, muestra los resultados del ciclo inicial del procedimiento de secuenciación. Se generó el fragmento correcto de 142 pb.
TA-3'; SEC ID nº 15) (MWG-Biotech), 1 pmol de secuencia de señal nº 001 (5'-TGTGTCCGCGTGGCTCTTCT
GATCTTGGCTTTTCGTCTCTTGGCTATTCGTCT-3'; SEC ID nº 16, hibridada a nº 002: 5'-PHO-ATCAGACGAA
TAGCCAAGAGACGAAAAGCCAAGATCAGAAGAGCCACGCGGACACA-3'; SEC ID nº 17) (MWG-Biotech), 100 unidades de ADN ligasa de T4 (New England Biolabs). La incubación tuvo lugar a 22ºC en un termociclador PTC-200 (MJResearch) durante 1 hora. La selección y amplificación de aquellas moléculas que se habían ligado con éxito tanto al adaptador como al adaptador de la secuencia de señal se llevaron a cabo utilizando una PCR bajo las condiciones siguientes (50 \mul): KCl 10 mM, (NH_{4})SO_{4} 10 mM, Tris-HCl 20 mM, Triton-X-100 al 0,1%, pH 8,8 (tampón Thermopol, New England Biolabs), Mg^{2+} 2 mM, 200 \muM de dNTP (Amersham Bioscience), 10 pmoles de cebador de adaptador nº 006 (5'-GAGGTCCGGGAGTGCATCTA-3'; SEC ID nº 18) (MWG-Biotech) y 10 pmoles del cebador del adaptador de señal, nº 007 (5'-TGTGTCCGCGTGGCTCTTCT-3'; SEC ID nº 19) (MWG-Biotech), aproximadamente 1 pmol de ADN diana ligado y 0,2U de polimerasa Vent (New England Biolabs). El ciclado de PCR se llevó a cabo con un termociclador PTC-200 (MJResearch). Inicio en caliente: 95ºC, 2 minutos, 25 ciclos que consisten en: 95ºC, 15 segundos; 59,3ºC, 20 segundos; 72ºC, 20 segundos. Etapa de extensión completa: 72ºC, 60 segundos. El pocillo 2, en la figura 6, muestra los resultados del ciclo inicial del procedimiento de secuenciación. Se generó el fragmento correcto de 142 pb.
Ciclo
2
Con el fin de convertir las siguientes 3 bases,
se limpió el producto de PCR utilizando un kit de PCR de limpieza
MinElute (Qiagen) y después se cortó con Eam1104I y
SfaNI. Para incrementar la eficiencia de la reacción de
corte, los cortes se llevaron a cabo en serie bajo condiciones
óptimas de corte.
Corte de Eam1104I:
Tris-acetato 33 mM, acetato de magnesio 10 mM,
acetato de potasio 66 mM, BSA 0,1 mg/ml, pH 7,9 (Tango Y+,
Fermentas), 0,5 \mug de fragmento de PCR, 20 unidades de
Eam1104I en un volumen de reacción de 25 \mul. Incubación
a 37ºC durante 1 hora. Se utilizó una columna Micro
Bio-Spin 6 (BioRad) para limpiar el fragmento.
Corte con SfaNI: NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM,
MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM, pH 7,9 (NEB3, New England Biolabs), 0,5
\mug de fragmento de PCR, 2,5 unidades de SfaNI. Incubación
a 37ºC durante 15 minutos en un volumen de reacción de 50
\mul.
El producto digerido se limpió mediante PAGE
(electroforesis en gel de poliacrilamida) y se purificó a partir
del gel utilizando un procedimiento de trituración e inmersión. Las
partículas de gel se eliminaron utilizando una columna Micro
Bio-Spin 6 y el ADN se purificó utilizando una
columna de limpieza de reacción MinElute (Qiagen).
Se llevó a cabo la etapa de conversión
correspondiente al ciclo inicial utilizando la misma secuencia de
señal y su adaptador específico asociado. El resto del
procedimiento siguió el mismo patrón descrito para el ciclo 1,
excepto en que se utilizó un gel de agarosa y un kit de purificación
en gel (QiaexII, Qiagen) para purificar la muestra tras la
digestión. El resultado de la amplificación por PCR en el segundo
ciclo se muestra en el pocillo 3, en la figura 6. Se generó el
fragmento correcto de 172 pb.
Los ciclos 3 y 4 siguieron el mismo patrón
descrito para el ciclo 2. El resultado de la amplificación por PCR
se muestra en los pocillos 4 y 5, en los que se generaron los
fragmentos correctos de 202 pb y 232 pb.
Claims (9)
1. Procedimiento para determinar la secuencia de
un polinucleótido diana, que comprende las etapas siguientes:
- (i)
- tratar una muestra de un polinucleótido diana bicatenario para crear regiones protuberantes en cada extremo, una de las cuales debe secuenciarse, presentando cada región protuberante un número definido de bases,
- (ii)
- dividir la muestra en compartimientos de reacción y poner en contacto cada muestra separada con una secuencia polinucleótida de señal bicatenaria diferente y un polinucleótido adaptador bicatenario correspondiente, representando cada secuencia de señal una secuencia polinucleótida específica de la misma longitud que la de la región protuberante que debe secuenciarse, y que comprende una región protuberante que permite la hibridación y la ligación con el extremo del polinucleótido diana situado enfrente del que se está secuenciando, y comprendiendo cada adaptador una región protuberante que presenta una secuencia complementaria a la secuencia representada por la secuencia de señal, hibridándose el adaptador con la región protuberante en la muestra diana que debe secuenciarse únicamente en el caso de que la región protuberante del adaptador sea complementaria a la región protuberante que se está secuenciando,
- (iii)
- llevar a cabo la reacción de polimerasa de la muestra o muestras utilizando cebadores que se hibridan con los extremos de la secuencia de señal y de la secuencia adaptadora, en la que el producto de la reacción de polimerasa comprende un sitio de restricción que permite el corte del adaptador para formar una nueva región protuberante que debe secuenciarse, opcionalmente mediante la repetición de las etapas (i) a (iii) utilizando enzimas de restricción para crear las regiones protuberantes, e
- (iv)
- identificar qué secuencias de señal se encuentran presentes en los productos amplificados, y en qué orden, para determinar de este modo la secuencia del polinucleótido diana.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la región protuberante que se liga a la secuencia de señal
presenta por lo menos 3 bases.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que la región protuberante que debe secuenciarse presenta 4
bases.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la combinación de la
totalidad de las secuencias representadas por la secuencia de señal
en cada compartimiento de reacción corresponde a la totalidad de
las permutaciones de una secuencia que comprende el número de bases
en la región protuberante que debe secuenciarse.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el sitio de restricción es
específico para una enzima de clase II.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que la enzima es SfaNI o EarI.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la reacción de polimerasa se
lleva a cabo utilizando metil-dCTP como sustituto de
dCTP.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el adaptador se inmoviliza
sobre un material de soporte.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que secuencias de señal
secuenciales, y opcionalmente los adaptadores secuenciales,
comprenden sitios de reconocimiento para diferentes oligonucleótidos
cebadores.
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