ES2355128T3

ES2355128T3 - Anticuerpo contra la isozima de adenilato cinasa mitocondrial humana, formulación de diagnóstico y kit de diagnóstico para cardiopatía.

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Publication number: ES2355128T3
Application number: ES00955110T
Authority: ES
Inventors: Hyo Joon Kim; Key Seung Cho; Sang Min Lee
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-02-08
Filing date: 2000-08-10
Publication date: 2011-03-23
Anticipated expiration: 2020-08-10
Also published as: RU2262939C2; CA2366468A1; CN1368888A; BR0010712A; HK1049121A1; AU6734800A; CN1368888B; HK1049121B; JP2003522158A; CA2366468C; ATE493658T1; EP1165133A1; AU784153B2; KR20010077769A; EP1165133A4; US7514227B2; WO2001058482A1; EP1165133B1; JP3736798B2; DE60045444D1

Abstract

Un procedimiento para diagnosticar infarto de miocardio que comprende (i) producir un complejo inmunitario poniendo en contacto una inmunoglobulina específica de la isozima de adenilato cinasa humana (AK3) con una muestra biológica; y (ii) detectar el complejo inmunitario obtenido en la etapa (i), en el que la detección de dicho complejo inmunitario es indicativa de infarto de miocardio.

Description

Campo técnico

La presente invención se refiere a una formulación inmunitaria y a un kit de diagnóstico para cardiopatías que usan las isozimas de la adenilato cinasa mitocondrial humana, más particularmente a una formulación inmunitaria y a un kit de diagnóstico para cardiopatías caracterizados por usar la isozima de adenilato cinasa AK3 que tiene una expresión 5 específica en el músculo cardiaco como indicador diagnóstico de cardiopatías tales como infarto de miocardio y angina de pecho, posibilitando por tanto un diagnóstico más correcto y sencillo de cardiopatías sin diagnóstico erróneo debido a una excelente discriminación de diagnóstico.

Antecedentes de la técnica

Las cardiopatías tales como infarto de miocardio agudo, como una de las enfermedades en adultos que aparecen 10 predominantemente en los últimos 40 años de vida, y los pacientes que mueren de cardiopatías están aumentando gradualmente en el mundo. Se inician una media de 200 o más pruebas de diagnóstico mensuales en un hospital general nacional. Cada año, varios millones de personas que padecen dolor de pecho acuden a las urgencias de un hospital en los Estados Unidos de América.

Un procedimiento general para diagnosticar una cardiopatía en el pasado en una persona que padece dolor de pecho es 15 usar un electrocardiograma (“ECG” o sonografía cardiaca). Cuando se diagnostica un infarto de miocardio usando ECG, el infarto de miocardio se ha determinado por los cambios de una onda ST-T anormal y la onda Q del ECG. Sin embargo, un 50% o más de los pacientes con infarto de miocardio que acudieron a un hospital se diagnosticaron erróneamente, aproximadamente un 5% de dichos pacientes volvieron a sus casas y un 16% de dichos pacientes se diagnosticaron erróneamente y murieron. 20

Frithz y col. (Upsala J. Med. Sci. 81: 155-158, 1976) describen actividades adenilato cinasa elevadas en el suero y la orina de pacientes que padecen infarto de miocardio. Se usa un ensayo enzimático para detectar la adenilato cinasa, y se afirma explícitamente que la adenilato cinasa no es específica del corazón. Se encuentra que un 45% de los pacientes con infarto de miocardio son positivos para la adenilato cinasa.

Nobumoto y col. (J. Biochem. 123, 128-135, 1998) dan a conocer isozimas de adenilato cinasa, más específicamente 25 AK2 y AK3. Las isozimas se aíslan del hígado. No se hace referencia al infarto de miocardio.

Russell y col. (Journal of Biological Chemistry, 249, nº 6, 1874-1879, 1974) dan a conocer isoenzimas adenilato cinasa frente a las que se han creado antisueros. Las isoenzimas se dan a conocer como específicas de órgano.

Kurokawa y col. (Enzyme 1990; 43: 57-71) dan a conocer anticuerpos contra adenilato cinasa 1.

Ronquist y col. (Upsala J. Med. Sci. 88: 51-59, 1983) dan a conocer cuatro isozimas diferentes de adenilato cinasa en 30 pacientes con infarto de miocardio. No se hace mención a la adenilato cinasa mitocondrial 3.

Para resolver estos problemas, se han desarrollado marcadores biológicos para infarto de miocardio. Se prefiere que los marcadores biológicos ideales para infarto de miocardio tengan los siguientes requisitos.

En primer lugar, deben existir solo en células de músculo cardiaco y liberarse en la sangre con la necrosis de los miocitos. 35

En segundo lugar, deben liberarse rápidamente en la sangre tras la herida en el músculo cardiaco, ya que esto depende de la distribución celular y el tamaño molecular del marcador biológico.

En tercer lugar, la relación entre la extensión de la lesión cardiaca y la cantidad liberada de marcador biológico debe ser lineal.

En cuarto lugar, no deben requerirse un adiestramiento ni técnicas especiales para el ensayo, y el coste de los reactivos 40 necesarios para la detección debe ser económico continuadamente.

En quinto lugar, la concentración patológica de marcador bioquímico en la sangre debe aumentar después de que los pacientes sientan el dolor en el pecho.

En sexto lugar, los marcadores biológicos liberados deben retirarse rápidamente para confirmar el infarto de miocardio continuo. Sin embargo, desgraciadamente, no existen aún marcadores biológicos que satisfagan todos estos requisitos.

Actualmente, se emplean un ensayo de masa de creatina cinasa (CK) y una prueba de troponina como marcadores bioquímicos para diagnosticar infarto de miocardio. Puesto que la CK es de tipo MM en tejido muscular, de tipo BB en cerebro y médula ósea y de tipo MB híbrido en músculo esquelético o músculo cardiaco, sus concentraciones séricas se 5 usan como indicador de lesión de tejido cardiaco. Específicamente, la CK-MB se reconoce como una enzima que indica la extensión de infarto de miocardio agudo, y muestra un intervalo de cambio de aproximadamente un 5% de concentración sanguínea en todas las lesiones musculares tales como quemaduras, traumatismos, enfermedades musculares cardiacas y esqueléticas. Sin embargo, el diagnóstico de infarto que miocardio que emplea CK-MB tenía un problema de detección limitada y aproximadamente un 20% de señal falsa que reduce la exactitud de la detección, con 10 lo que no podía ser un diagnóstico fiable. Actualmente, los estándares de diagnóstico para infarto de miocardio estipulados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) son los siguientes: (1) el dolor de pecho tradicional, (2) una onda Q anormal del ECG y (3) los marcadores bioquímicos deben estar por encima del intervalo de referencia. Si al menos dos estándares de entre ellos son aplicables a una persona, se diagnostica definitivamente como paciente con infarto de miocardio. Los marcadores bioquímicos deben incluirse como parte de la triada de diagnóstico de IMA. 15

Como alternativa, Boyce N. y col. han desarrollado una prueba de troponina cardiaca T (cTnT) para reducir el diagnóstico erróneo usando creatina cinasa (CK-MB) como marcador de lesión cardiaca convencional [véase Clinical Laboratory News, 22(1), 1-14(1996)]. Esta prueba se ha reconocido oficialmente por la Oficina federal estadounidense de fármacos y alimentos (FDA) , y se comercializa como producto de Boehringer Manheim Diagnostics Co., Ltd. de Alemania. En los Estados Unidos, se ha usado el producto desde noviembre de 1996, pero ahora se usa la prueba de 20 troponina I, puesto que se ha confirmado que reacciona de forma cruzada con troponina T derivada de músculo esquelético. Sin embargo, cTnT y cTnI se liberan al cabo de 12-24 h después del dolor del pecho, y por tanto no pueden usarse como marcadores tempranos. [Véase Eisenbrey y col., (1995) The Journal of American Medical Association, 74, 1343-1344]. Por lo tanto, estas pruebas no podían ser pruebas alternativas satisfactorias. En consecuencia, se emplean solo como medios auxiliares de la prueba de CK-MB. Dichos procedimientos de diagnóstico se emplean limitadamente 25 solo en unos pocos hospitales generales, puesto que requieren equipos de ensayo costosos, un cardiólogo especialista y personal muy adiestrado, lo que aumenta por tanto el coste de un diagnóstico costoso. Adicionalmente, los pacientes que requieren una detección continua apenas usan la troponina, porque, en Corea, el seguro médico únicamente permite una prueba de troponina.

Como se menciona anteriormente, el marcador biológico convencional para diagnosticar cardiopatías no es satisfactorio 30 con vistas a la exactitud de diagnóstico y en el momento del diagnóstico una vez iniciado el IMA. En consecuencia, se ha demandado un nuevo indicador diagnóstico para lesión de músculo cardiaco que posibilite un diagnóstico más exacto y rápido sin equipos de ensayo costosos en una clínica pequeña y por parte de una persona para diagnosticar cardiopatías.

Divulgación de la invención 35

La presente invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar infarto de miocardio, a una adenilato cinasa humana 3 y a una inmunoglobulina específica de adenilato cinasa humana 3, como se define en las reivindicaciones adjuntas. Se da a conocer también una formulación inmunitaria y un kit de diagnóstico de cardiopatía e infarto de miocardio que usa isozimas de adenilato cinasa mitocondrial que posibilitan una excelente exactitud y sensibilidad, caracterizado porque el material candidato a indicador diagnóstico que satisface todos los requisitos de indicadores 40 diagnósticos ideales para infarto de miocardio existe específicamente en tejido de músculo cardiaco, y porque se usan anticuerpos dirigidos contra AK que reconocen específicamente isozimas de adenilato cinasa mitocondrial humana que tienen diferentes distribuciones subcelulares.

Se da a conocer también una inmunoglobulina específica de isozimas de adenilato cinasa (AK) mitocondrial humana y una porción de la misma, caracterizada porque la inmunoglobulina que se produce en una especie animal es reactiva 45 con el inmunógeno que incluye una isozima de adenilato cinasa (AK) mitocondrial humana y una porción de la misma.

Se da conocer también una formulación inmunitaria constituida por una combinación de una inmunoglobulina y un marcador de detección.

Se da a conocer también un kit de diagnóstico de cardiopatías que comprende una inmunoglobulina según la presente invención que se une a un marcador de detección y a un portador farmacéuticamente aceptable. 50

Se da a conocer también un procedimiento para detectar una isozima de adenilato cinasa 3 mitocondrial humana (AK3) en una muestra de detección, que comprende las siguientes etapas (a), (b) y (c):

(a) producir un complejo inmunitario haciendo reaccionar una muestra de detección y una muestra de control con anticuerpo contra la isozima de adenilato cinasa 3 (AK3) o una porción del mismo, respectivamente; 5

(b) detectar el complejo inmunitario obtenido en dicha etapa (a), y

(c) comparar los resultados detectados entre la muestra de detección y la muestra de control.

Breve descripción de los dibujos

El objeto anterior, otros rasgos y ventajas de la presente invención resultarán más evidentes mediante la descripción de la realización preferida de la misma con referencia a los dibujos adjuntos, en los que: 10

La Fig. 1 es un dibujo esquemático que ilustra la distribución subcelular de las isozimas de adenilato cinasa en la célula;

la Fig. 2 es un dibujo que ilustra una electroforesis del producto de PCR de la isozima de adenilato cinasa 3 (AK3);

la Fig. 3 es un mapa génico de PCR2.1-AK3; 15

la Fig. 4 es un dibujo que ilustra una cartografía de plásmido mediante digestión con enzima de restricción específica;

la Fig. 5 es un dibujo que ilustra un patrón de digestión con enzima de restricción;

la Fig. 6 es un mapa génico de pQE 30-AK3;

la Fig. 7a es un dibujo que ilustra el resultado de la PAGE-SDS para AK3; 20

la Fig. 7b es un dibujo que ilustra el resultado del análisis de transferencia Western para AK3;

la Fig. 8a es un dibujo que ilustra el resultado de la PAGE-SDS para AK1;

la Fig. 8b es un dibujo que ilustra el resultado del análisis de transferencia Western para AK1;

la Fig. 9a es un dibujo que ilustra el resultado de la PAGE-SDS para AK2;

la Fig. 9b es un dibujo que ilustra el resultado del análisis de transferencia Western para AK2; 25

la Fig. 10 es una gráfica que ilustra el comportamiento de purificación de anticuerpo dirigido contra K3 de conejo;

la Fig. 11 es un dibujo que ilustra isozimas de AK recombinantes purificadas;

la Fig. 12 es un dibujo que ilustra el resultado de un ensayo de reactividad cruzada entre anticuerpos contra isozimas de AK purificados; 30

la Fig. 13 es un dibujo que ilustra una distribución en tejido de isozimas de AK;

la Fig. 14 es un dibujo que ilustra los resultados del análisis de transferencia Western obtenidos usando un anticuerpo dirigido contra AK2 y un anticuerpo dirigidos contra AK3 del suero de pacientes con infarto de miocardio en condiciones de sustitución o no sustitución;

la Fig. 15 es un dibujo que ilustra un patrón de migración de electroforesis en gel nativo para AK y suero 35 humano;

la Fig. 16 es un dibujo que ilustra el resultado del análisis de transferencia Western para detectar AK3 en el suero de pacientes; y

la Fig. 17 es un dibujo que ilustra el resultado del análisis de transferencia Western de AK3 del ejemplo 6.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Se describirán con detalle las realizaciones preferidas de la presente invención con referencia a los dibujos adjuntos.

El término “muestra biológica” significa en la presente memoria un fluido corporal o porción del mismo, por ejemplo, orina, sangre, suero y plasma sanguíneo, separado del cuerpo humano. 5

El término “marcador de detección” significa en la presente memoria un marcador para detectar un complejo inmunitario, por ejemplo, un marcador isotópico radiactivo, partícula de oro, enzima, compuesto luminiscente, fluoresceína, ficobiliproteína, quelato de tierras raras, material fluorescente tal como rodamina, cofactor enzimático, biotina y estreptavidina.

El término “monoclonal” significa en la presente memoria una célula inmunitaria derivada de un sistema celular de 10 hibridoma clonado único y un sistema que posibilita producir un solo tipo de anticuerpo, que se producen mediante fusión celular tal como una línea celular de hibridoma.

El término “policlonal” significa en la presente memoria un sistema que posibilita producir inmunoglobulinas derivadas de muchas clases de células que tienen una poliafinidad general por un inmunógeno, en el que una “inmunoglobulina” significa en general aquella sintetizada en el organismo de un animal que tiene inmunidad adquirida. 15

El término “isozima de adenilato cinasa mitocondrial” significa en la presente memoria una isozima de adenilato cinasa mitocondrial per se tal como isozima de adenilato cinasa mitocondrial 2 (AK2) e isozima de adenilato cinasa mitocondrial 3 (AK3), su proteína recombinante génica y mutantes artificiales y naturales.

El término “una porción de la isozima de adenilato cinasa mitocondrial” significa en la presente memoria un fragmento peptídico digerido o truncado de la isozima de adenilato cinasa mitocondrial, incluyendo una porción reactiva con 20 anticuerpo de la isozima de adenilato cinasa mitocondrial.

La adenilato cinasa (AK) es una enzima que mantiene un equilibrio dinámico rápido entre los nucleótidos de adenina al catalizar una reacción de transferencia de ácido fosfórico reversible de XTP, ADP y AMP en una célula como se muestra en la reacción siguiente:

XTP + AMP  XDP + ADP 25

(en la que XTP representa ATP o GTP).

Dicha enzima es una de las enzimas necesarias para la reacción de fosforilación relacionada con la actividad de metabolismo celular y transferencia de señal. Es también conocida por participar en el metabolismo de la energía, apoptosis, tumorigénesis, y se ha notificado que incluye aproximadamente 40 clases de isozimas en un sistema biológico [véase Matsuura, S., Igarashi, M., Tanizawa, Y., Yamada, M., Kishi, F., Kajii, T., Fujii, H., Miwa, S., Sakurai, M. 30 y Nakazawa, A. (1989) J. Biol. Chem., 264, 10148-10152].

Como se muestra en la Fig. 1, las células de vertebrados tienen 3 subtipos de isozimas, concretamente, AK1 (EC 2.7.4.3) en el citoplasma, AK2 en el espacio intermembrana mitocondrial y AK3 (EC 2.7.4.10) en la matriz mitocondrial [véanse Kuby, S.A., Palmieri, R. H., Frischat, A., Wu, L. H., Maland, L. y Manship, M. (1984) Biochemistry 23, 2392-2399; Sachsenheimer, W. y Schulz, G. E. (1997) J. Mol. Biol. 114, 23-36; Egner, U., Tomasselli, A. G. y Schulz, G. E. 35 (1978) J. Mol. Biol. 195, 649-658]. Se ha identificado una presunta AK3 humana basándose en su similitud con la AK3 bovina y de murino. Sin embargo, el ADNc de la AK3 humana está relacionado más estrechamente con los genes de AK4 de murino recién identificados, y el gen de AK3 humana se ha renombrado, por lo tanto, AK4 [Yoneda, T., Sato, M., Maeda, M., Takagi, H. (1998) “Identification of a novel adenylate kinase system in brain; cloning of the fourth adenylate kinase”. Mol. Brain. Res., 62, 187-195]. 40

En este documento, se usará el nombre AK3 en lugar de AK4 porque la AK4 de murino es una isozima de tipo cerebral pero la AK3 no se expresa en cerebro humano. En el ser humano, la AK5 se ha identificado recientemente como una isozima de tipo cerebral.

Se han clonado dos subtipos de genes, AK2A y AK2B, en un gen AK2 humano (hAK2). Adicionalmente, se ha confirmado el ARNm de hAK1 y hAK2 en muchas clases de tejidos tales como músculo cardiaco, músculo esquelético e 45

hígado [véase Lee, Y., J. W. Kim, I., A. Lee, H. B. Kang, Y. K. Choe, H.G. Lee, J. S. Lim, H. J. Kim, C. K. Park e I. S. Choe, (1996) Biochem. Mol. Biol. International, 39(4), 833-842]. Estos productos genéticos tienen un aspecto de expresión específico de tejido. Se ha notificado que la AK1 se expresa tanto en músculo cardiaco como en músculo esquelético, pero la AK2 no se expresa en músculo esquelético [véase Lee, Y., J. W. Kim, S. M. Lee, H. J. Kim, K. S. Lee, C. Park e l.S. Choe (1998) J. Biochem.-Tokyo, 123, 47-54]. 5

La isozima de adenilato cinasa humana 3 (AK3) es una enzima de transferencia de ácido fosfórico constituida por 223 aminoácidos, y se denomina también “trifosfato de nucleósido adenilato fosfotransferasa”. La disposición del gen de AK3 humana y la disposición primaria de aminoácidos se han confirmado por Xu y col. [véase Xu, G., O’Connell, P., Stevens, J. y White, R. (1992) “Characterization of human adenylate kinase 3 (AK3) cDNA and mapping of the AK3 pseudogene to an intron of the NF1 gene”. Genomics 13; 537-542]. Se muestra una secuencia aminoacídica de AK3 humana en la 10 secuencia nº 1 de la lista de secuencias adjunta a la presente.

La isozima de adenilato cinasa humana 3 cataliza la reacción 2 siguiente:

GTP + AMP  GDP + ADP

[véanse Chiga, M., Rogers, A. E., Paut, G. W. E. (1961) J. Biol. Chem., 236, 1800; Albrecht, G. J., (1970) Biochemistry, (9:2426)]. 15

La búsqueda de la enzima AK3 no se ha iniciado con fuerza en comparación con otras enzimas, y no se ha notificado todavía la especificidad de tejido de la enzima AK3 en el cuerpo humano.

Se ha encontrado que el defecto genético de enzima AK en el cuerpo humano causa anemia hemolítica hereditaria (véase Matsuura, S., Igarashi, M., Tanizawa, Y., Yamada, M., Kishi, F., Kajii, T., Fujii, H., Miwa, S., Sakurai, M. y Nakazawa, A. (1989) J. Biol. Chem. 264, 10148-10152)] y que el pirofosfato de tiamina se biosintetiza mediante la 20 cooperación de creatina cinasa y AK en tejido muscular y cerebral.

Por primera vez, los presentes inventores han encontrado que la AK3 se expresa también en músculo cardiaco al igual que AK2, pero que no se expresa en músculo esquelético, y han aplicado estos hechos al diagnóstico de cardiopatías tales como infarto de miocardio.

Los presentes inventores han clonado las isozimas mitocondriales, los genes de AK2 (hAK2) y AK3 (hAK3) de tejido 25 muscular humano, para construir los vectores de expresión pQE-AK2 y pQE-AK3, y han aislado y purificado entonces AK2 y AK3 recombinantes genéticas en gran cantidad mediante la incubación de bacilos coliformes transformados para conseguir un sistema de expresión de E. coli recombinante de 1,1 mg de AK2/l de caldo y 9,8 mg de AK3/l de caldo.

La isozima de hAK recombinante se ha confirmado mediante análisis de la composición aminoacídica. Se ha confirmado que la actividad específica y el valor de pI de la hAK2 son de 1.000 U/mg y 6,6, respectivamente, y que el valor 30 específico y valor de pI de la hAK3 son de 400 mU/mg y >11,7, respectivamente. Dichas propiedades fisicoquímicas son similares a las notificadas para la isozima AK3 aislada de hígado de ganado bovino.

Para revisar el aspecto de expresión específica de tejido para encontrar la función fisiológica de la isozima de AK, se derivó antisuero policlonal de conejo usando hAK1, hAK2 y hAK3, y se consiguieron anticuerpos dirigidos contra hAK1, hAK2 y AK retirando los anticuerpos que reconocían de forma cruzada las isozimas entre ellas. Como resultado de la 35 inmunohistoquímica para tejidos embebidos en parafina usando dichos anticuerpos, se detectó hAK1 en todos los tejidos, pero se detectó hAK2 solo en hígado, cerebro, músculo cardiaco, riñón y pulmón, y se detectó hAK3 solo en hígado, músculo cardiaco, riñón y pulmón. Específicamente, se confirmó que la AK1 se detectaba en ambos tejidos incluso por análisis de transferencia Western de cerebro, músculo cardiaco y músculo esquelético, pero AK2 y AK3 no se expresaban en músculo esquelético y mostraban una expresión específica de corazón. Por lo tanto, el diferente 40 patrón de distribución de la isozima de adenilato cinasa dependiente de los órganos humanos, especialmente entre músculo cardiaco y músculo esquelético, prueba que la posibilidad de usarla como marcador clínico para lesión de células cardiacas es muy alta.

La inmunoglobulina según la presente invención se caracteriza por estar producida mediante un sistema animal reactivo con inmunógeno que comprende la isozima de adenilato cinasa mitocondrial humana (AK) y una porción de la misma. 45 Dichas isozimas de adenilato cinasa mitocondrial humana son preferiblemente la isozima de adenilato cinasa mitocondrial humana 2 (AK2) y la isozima de adenilato cinasa mitocondrial humana 3 (AK3). Dichas inmunoglobulinas (monoclonales o policlonales) usadas en la presente invención están limitadas a IgA, IgG, IgM, IgD, IgE o IgY, y puede

usarse toda la inmunoglobulina. No es necesario usar un anticuerpo completo, pero puede usarse un fragmento de anticuerpo que incluya una región de unión a antígeno, por ejemplo fragmentos Fab, Fab’ o F(ab)’2.

Dichas inmunoglobulinas específicas de isozima de adenilato cinasa se obtienen a partir de un suero animal inmunizado con una isozima de adenilato cinasa purificada, a partir de una célula de hibridoma producida mediante la fusión de linfocito esplénico y célula de mieloma, o a partir de linfocitos transformados in vitro. Más específicamente, el anticuerpo 5 monoclonal específico de isozima de adenilato cinasa puede producirse mediante un procedimiento bien conocido en esta técnica [véase Kohler y Milstein (1976) European Journal of Immunology 6: 511-519]. Dicho anticuerpo monoclonal se ha depositado en la autoridad de depósitos Korean Cell Line Research Foundation (KCLRF) del Cancer Research Center en la Medical College of Seoul National University (dirección: Youn-geon-dong, Chongro-ku, Seúl, Corea) como depósito nº KCLRF-BP-00030 el 19 de mayo de 2000. En el procedimiento anteriormente mencionado, se usa un grupo 10 de los dos grupos de células fusionadas para producir “hibridoma”, que secreta anticuerpo, como célula de un hospedador animal inmunológicamente adecuado tal como un ratón inyectado con la isozima de adenilato cinasa, y el otro grupo de células se fusiona como línea celular cancerosa o de mieloma. Dichos dos grupos celulares se fusionan mediante un procedimiento bien conocido en esta técnica usando un polietilenglicol. Después, se hacen proliferar células productoras de anticuerpo mediante incubación de tejido estándar. Se obtiene un grupo celular homogéneo 15 mediante subclonación con una técnica de dilución limitante, y se incuba entonces un hibridoma que puede producir inmunoglobulina específica de la isozima de adenilato cinasa in vivo o in vitro mediante una técnica estándar en gran cantidad.

El anticuerpo monoclonal obtenido en el procedimiento anterior puede usarse sin purificación, pero puede usarse preferiblemente después de purificación a alta pureza mediante un procedimiento convencional. Dicho procedimiento de 20 purificación incluye, por ejemplo, precipitación salina, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía por afinidad.

El anticuerpo policlonal usado en la presente invención puede producirse mediante un procedimiento convencional en el que se inyecta la isozima de adenilato cinasa 2 o la isozima de adenilato cinasa 3 purificadas en un animal, y se obtiene entonces el suero que incluye un anticuerpo recogido del animal. Dicho anticuerpo policlonal puede purificarse mediante uno cualquiera de los procedimientos convencionales de esta técnica, y puede producirse a partir de un hospedador 25 animal de uno cualquiera de cabra, conejo, oveja, mono, caballo, cerdo, vaca, perro y similares.

Según la presente invención, las isozimas de adenilato cinasa pueden usarse después del aislamiento de las mismas mediante un procedimiento convencional o biosintetizarse muchas clases de fragmentos mediante una técnica de ingeniería genética convencional. Como alternativa, los péptidos de la isozima de adenilato cinasa 3 pueden sintetizarse químicamente mediante un procedimiento de síntesis orgánica de proteína. 30

En otra realización de la presente invención, se proporciona una formulación inmunitaria que une una inmunoglobulina de la presente invención con un marcador de detección. Para esta formulación inmunitaria, el marcador de detección puede seleccionarse del grupo constituido por indicador radiactivo, partícula de oro, enzima, compuesto quimioluminiscente, material fluorescente, cofactor enzimático, estreptavidina y biotina.

Según la presente invención, se usa un anticuerpo específico de isozima de adenilato cinasa para detectar una isozima 35 de adenilato cinasa en una muestra biológica, incluyendo sangre u otro fluido corporal. Específicamente, la isozima de adenilato cinasa (AK) en una muestra biológica puede confirmarse detectando el contacto con la muestra biológica de dicha inmunoglobulina unida en la formulación inmunitaria de la presente invención. El procedimiento de detección usado en la presente invención no está limitado específicamente, por ejemplo hay dos procedimientos, uno es un ensayo de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) en el que se une un anticuerpo a una placa de microvaloración o 40 placa de 96 pocillos para hacer reaccionar una muestra de suero, y se une el anticuerpo secundario al mismo para desarrollar color enzimáticamente; y el otro es el ensayo en el que la proteína aislada por electroforesis en gel de poliacrilamida se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o PVDF para hacer reaccionar el anticuerpo.

Según la presente invención, el kit para diagnóstico de cardiopatía comprende una inmunoglobulina de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Puesto que solo el componente de proteína tiene que 45 reemplazarse para preparar un kit de diagnóstico, el kit de la presente invención puede producirse como tipo parche o tira. Por ejemplo, el kit de diagnóstico de cardiopatía de la presente invención puede incluir el anticuerpo específico de una isozima de adenilato cinasa y una isozima de adenilato cinasa contenida en cada muestra de la prueba, respectivamente. Puede fijarse en la fase sólida de las membranas una isozima de adenilato cinasa y un anticuerpo específico de isozima de adenilato cinasa y marcarse. Cuando se emplea un marcaje enzimático, el kit de la presente 50 invención puede comprender el sustrato enzimático. En el caso de ensayo usando el segundo anticuerpo que marca el complejo inmunitario, el kit de la presente invención puede comprender anticuerpo contra la isozima de adenilato cinasa

o un segundo anticuerpo específico de la isozima de adenilato cinasa. El kit de la presente invención puede incluir adicionalmente un patrón adecuado, control positivo o negativo, y otras instrucciones de uso.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un procedimiento para detectar una isozima de adenilato cinasa (AK) en una muestra de prueba, que comprende las etapas siguientes:

(a) producir un complejo inmunitario haciendo reaccionar una muestra de detección y una muestra de control 5 con un anticuerpo contra la isozima adenilato cinasa (AK) o porción del mismo, respectivamente;

(b) detectar el complejo inmunitario obtenido en dicha etapa (a); y

(c) comparar el resultado detectado en la muestra de detección con el resultado detectado en la muestra de control.

En este procedimiento, puede iniciarse dicha etapa de detección mediante un procedimiento de inmunofluorescencia de 10 anticuerpo, procedimiento de desarrollo de color por sustrato enzimático, procedimiento de unión de compuesto quimioluminiscente o procedimiento de complejo con partícula de oro. Para dicha muestra de control, puede usarse el suero que se detectó positivamente mediante un procedimiento de inmunofluorescencia de anticuerpo, procedimiento de desarrollo de color por sustrato enzimático, procedimiento de unión de compuesto quimioluminiscente o procedimiento de complejo con partículas de oro. Sin embargo, el procedimiento de detección para usar en la presente invención no 15 está limitado a dichos procedimientos, sino que puede usarse uno cualquiera de los procedimientos de detección convencionales.

Se describirán con detalle ahora las realizaciones preferidas de la presente invención mediante los siguientes ejemplos, sin limitar en modo alguno el alcance de la invención.

Ejemplo 1: Clonación del gen de AK3 20

(Extracción del ARN total de músculo esquelético humano)

Para aislar el ARN se añadió 1 ml de RNAzol (tiocianato de guanidina 4 M, citrato de sodio 25 mM, 0,5% de sarcosilo, 2-mercaptoetanol 0,1 M) a 100 mg de un tejido muscular, se homogeneizó a continuación y se añadieron 100 µl de cloroformo, se agitó durante 15 segundos y se dejó sobre hielo durante 15 minutos. Se centrifugó la disolución de lisado celular a 12.000 x g durante 15 minutos para retirar los desechos celulares insolubles. Se transfirió el sobrenadante a un 25 tubo reciente, se añadió al mismo una cantidad igual de isopropanol y se mezclaron entre sí dando una mezcla que se incubó a una temperatura de -70ºC durante 15 minutos. Se centrifugó a continuación la mezcla a una temperatura de 4ºC, a 12.000 x g durante 15 minutos, para precipitar los sedimentos de ARN. Se lavaron los sedimentos de ARN con etanol al 75%, se secaron y se añadieron a continuación a los mismos 100 µl de agua tratada con DEPC para extraer el ARN total. 30

(Preparación de ADNc de AK3 por PCR-TI)

Se mezclaron 10,5 µl del ARN total anteriormente aislado con 1 µl de oligodT 500 ng/µl, 1,5 µl de dNTP 2,5 mM, 1 µl de DTT 100 mM, 1 µl de transcriptasa inversa de MMLV a 200 unidades/µl, 6 µl de tampón de transcriptasa inversa 5x y 9 µl de agua tratada con DEPC para completar un volumen total de 30 µl, se hizo reaccionar a una temperatura de 42ºC durante 30 minutos y se inactivó a continuación a una temperatura de 75ºC durante 30 minutos. Para la composición de 35 la mezcla de reacción de PCR, se usó el ADNc anteriormente sintetizado como ADNc de molde. Se añadieron 8 µl de dNTP 2,5 mM, 1 µl de ADN polimerasa Ex taq a 5 unidades/µl, 10 µl de tampón de ADN polimerasa 10x, 1 µl de cebador de sentido directo y 1 µl de cebador de sentido contrario (100 pmol/µol) y se añadió agua destilada hasta completar 100 µl de volumen total. Se desnaturalizó la mezcla a una temperatura de 98ºC durante 10 segundos, se asoció a una temperatura de 55ºC durante 30 segundos, se extendió a una temperatura de 72ºC durante 40 segundos y 40 se repitió esta reacción en cadena de la polimerasa durante 35 ciclos. En este procedimiento, se usaron dos cebadores, concretamente 5’-GGATCCATGGCTTCCAAACTCCTGC-3’ (de sentido directo) y 5’-CAGGGTCAATATGCTTCTTTGG-3’ (de sentido contrario), y se detectó el producto de PCR en gel de agarosa al 1% (véase la Fig. 2).

[Construcción del vector de subclonación de AK3 (pCR2.1-AK3)]

Se purificó producto AK3 de PCR que tenía 680 pb a partir de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel, y se 45 clonó usando el kit de clonación de PCR pCR2.1 (Invitrogen) (véase la Fig. 3). Para la mezcla de ligadura, se mezclaron vector 1 µl/50 ng de pCR2.1 linealizado, 5 µl de producto de PCR, 1 µl de ADN ligasa de T4 a 4 unidades/µl, 1 µl de

tampón ligasa 10x y 2 µl de H2Od para un volumen total de 10 µl, y se hicieron reaccionar a continuación a una temperatura de 16ºC durante 12 horas. Se usó la cepa JM109 de E. coli como célula hospedadora para transformar el plásmido pCR2.1-AK3 construido. Se añadieron 2 µl de mezcla de ligadura a 50 µl de células JM 109 competentes, se dejaron sobre hielo durante 30 minutos, se sometieron a choque térmico a una temperatura de 42ºC durante 45 segundos y se sumergieron en hielo durante 2 minutos. Se añadieron 250 µl de medio de cultivo SOC, se incubó a una 5 temperatura de 37ºC y a una velocidad de rotación de 225 rpm durante 1 hora. Se sembraron 100 µl del medio cultivado sobre placa de LB/ampicilina que comprendía X-gal e IPTG, y se incubó a una temperatura de 37ºC durante una noche. Se seleccionaron 10 colonias entre las colonias blancas producidas, se añadieron al medio de cultivo LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina respectivamente y se incubaron a continuación a una temperatura de 37ºC durante una noche. Para el producto de incubación, se aisló ADN de plásmido usando un kit de preparación de plásmido. Se mezclaron 5 µl 10 de ADN de plásmido aislado con 1 µl de EcoRI, 1 µl de tampón de reacción de EcoRI y 3 µl de H2Od, se hicieron reaccionar durante 1 hora y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se confirmó que el producto de PCR se había subclonado (véase la Fig. 4). Se confirmó la secuencia de bases del plásmido insertado en el producto de PCR usando un secuenciador de ADN automático para conocer la subclonación correcta. En ese momento, se usaron como cebadores el cebador inverso de M13 (cebador de sentido directo) y el cebador de promotor T7 (cebador de 15 sentido contrario).

Ejemplo 2: Construcción de vector de expresión de AK3 y aislamiento y purificación de AK3 recombinante

Después de la doble digestión con BamHI y XhoI del vector pCR2.1-AK3 que subclona el gen de AK3, se eluyó un inserto del gel de agarosa. Se digirió también el plásmido pQE30 (fabricado por Qiagene) con BamHI y SaII, y se eluyó un fragmento grande del gel de agarosa para construir el vector de expresión de AK3. Se realizó la ligadura de los 20 fragmentos de ADN con la mezcla de 3 µl de fragmento grande de pQE30, 5 µl de fragmento de AK3 digerido, 1 µl de ADN ligasa T4 y 1 µl de tampón de reacción de ligasa 10x mediante incubación a una temperatura de 16ºC durante una noche. Como célula hospedadora usada en la transformación, se usó M15 de E. coli. Se incubó durante una noche en el medio de cultivo LB la colonia obtenida sembrando en la placa que contiene ampicilina y kanamicina. Se aisló el plásmido y se digirió con EcoRI, y se confirmó a continuación la existencia de inserto (véanse las Fig. 5 y 6). Se incubó 25 la colonia en que se había confirmado la inserción del gen durante una noche en 50 ml de medio de cultivo que contenía ampicilina 100 µg/ml y se inocularon 50 ml de producto incubado en 1 l de otro medio de cultivo LB. Después de 1 hora de incubación a 37ºC con agitación, se detectó el crecimiento de los bacilos recombinantes mediante absorbancia de luz visible a 600 nm de 0,5 a 0,7 unidades. En ese momento, se añadió IPTG hasta una concentración final 1 M y se indujo la expresión de proteína recombinante durante 4 horas adicionales de incubación. Se centrifugó el caldo inducido a 30 4000 x g durante 20 minutos para obtener sedimentos celulares, y se suspendió en 50 ml de tampón (tampón de unión: imidazol 5 mM, NaCl 0,5 M, Tris/HCl 20 mM que contiene 0,1% de Tween 20, pH 7,9) y se mantuvo a continuación a una temperatura de -20ºC. Se aplicaron 5 veces a la suspensión descongelada 30 segundos de desestabilización ultrasónica, seguida de un ciclo de pausa de 1 minuto. Se centrifugó el producto a 10.000 x g a una temperatura de 4ºC durante 30 minutos. Se tomó el sobrenadante líquido para obtener extracto bruto que contenía proteínas solubles. 35

Se purificó la AK3 expresada usando una resina de quelato (Pharmacia) que se empaquetó en columna a un volumen de lecho de 5 ml y se lavó con 5 volúmenes de columna de agua destilada. Se retiró el etanol, se unió Ni+ a la resina de quelato usando 5 volúmenes de columna de tampón de carga (NiSO4 50 mM que contenía 0,1% de Tween 20), se lavó con 3 volúmenes de columna de agua destilada y se equilibró a continuación con 5 volúmenes de columna de tampón de unión. Se cargó el extracto bruto anteriormente preparado, se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón de 40 unión, se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón de lavado (Tris/HCl 20 mM, pH 7,9, que contiene imidazol 60 mM, NaCl 0,5 M y 0,1% de Tween 20) para retirar la unión no específica, y se eluyó con 5 volúmenes de columna de tampón de elución (Tris/HCl 10 mM, pH 7,9, que contiene NaCl 0,5 M, imidazol 1 M y 01% de Tween 20). En ese momento, el caudal en todas las etapas era de 1 ml/min. Se retiraron las sales de la AK3 eluida en tampón de diálisis (Tris/HCl 10 mM que contiene 0,1% de Tween 20, pH 7,9) cambiando el tampón 3 veces durante 12 horas, y se 45 concentró a continuación con PEG 8000. Se midió cuantitativamente la concentración de proteína usando un kit de análisis cuantitativo de proteína BCA, se enumeran los rendimientos de purificación calculados en la Tabla 1, y se usó la AK3 purificada en el ensayo de análisis de PAGE-SDS (Fig. 7) o la purificación y producción de anticuerpo.

Tabla 1

(Purificación de AK3 recombinante)

Etapas de purificación: Proteína total (mg) Rendimiento de purificación (%)

Homogeneizado: 949,05 100

Fracción soluble: 178,75 18

Cromatografía por afinidad en quelato de Ni: 14,3 1,5

Ejemplo 3: Producción y purificación de anticuerpo de conejo dirigido contra AK3

Se mezclaron 1 ml de proteína AK3 purificada y 1 ml de adyuvante completo de Freund (FCA) mediante emulsificación por jeringuilla dando una emulsión. Se inyectó la emulsión por vía intravenosa o intradérmica a un conejo NZW (macho) 5 de 2 kg de peso corporal. Durante la primera semana, se inyectó por vía intradérmica para sensibilización emulsión antigénica 50 a 100 µg/ml en varias regiones del conejo. A partir de la siguiente inyección, se inyectó por vía intradérmica como recuerdo antígeno emulsionado con adyuvante incompleto de Freund (IFA) 100 µg/ml dos veces a intervalos de dos semanas. Una semana después de la inoculación final, se recogió sangre de la vena de la oreja del conejo para detectar la inducción de anticuerpo, y se detectó la producción de anticuerpo mediante análisis dot-blot. En 10 la 5ª semana, se inyectaron 100 µg de proteína por vía intradérmica. En la 6ª semana, se inyectó la disolución de proteína (20 µg/ml) sin adyuvante por vía intravenosa como recuerdo. Y a continuación, después de hacer ayunar al conejo durante 24 horas, se recogió sangre del corazón por punción cardiaca y se preparó suero a partir de ella.

Se dejó la sangre recogida en un recipiente de vidrio a temperatura ambiente durante 1 h para que se coagulara, y se mantuvo a una temperatura de 4ºC durante 6 horas. Se retiró la porción coagulada mediante centrifugación a una 15 temperatura de 4ºC y 2.500 x g durante 30 minutos, y se aisló el suero. Se obtuvieron anticuerpos policlonales dirigidos contra AK3 purificados del suero aislado mediante el procedimiento de purificación de anticuerpo siguiente para eliminar los anticuerpos de reacción cruzada con las isozimas AK1 y AK2 que tienen una alta homología con AK3. Se almacenaron alícuotas de 500 µl de suero cada una a una temperatura de -80ºC y se usaron en análisis bioquímico para el cribado de suero del paciente. 20

Los procedimientos de purificación de anticuerpo policlonal dirigido contra AK3 son como siguen. Se aplicó el suero de conejo aislado a una cromatografía por afinidad CM affi-gel Blue que tiene una alta tasa de recuperación de anticuerpo. Se lavó la resina CM Affi-gel Blue con ácido acético 0,1 M (pH 3,0) que contenía NaCl 1,4 M y 40% de isopropanol y agua bidestilada, se empaquetó en una columna de vidrio y se equilibró la columna con PBS. Se agrupó el eluyente del pico entero que aparecía por primera vez después de cargar el antisuero en la columna. Se precipitaron las 25 inmunoglobulinas en el eluyente anterior mediante el procedimiento de precipitación con sulfato de amonio en condiciones de concentración de saturación de sulfato de amonio de un 45%. Para obtener el anticuerpo dirigidos contra AK3 que tiene especificidad por AK3 y no tiene reactividad cruzada con AK1 y AK2 entre dichas inmunoglobulinas, se acoplaron las AK1 (Fig. 8) y AK2 (Fig. 9) purificadas con Affi-gel 15 (Bio-Rad), y se acopló AK3 con Affi-gel 10 (Bio-Rad), para preparar una cromatografía en columna de afinidad. Se cargaron las columnas de cromatografía de afinidad 30 con AK1, AK2 y AK3, respectivamente, se conectaron en orden y se equilibraron con tampón fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,5) que contenía NaCl 0,5 M. Para retirar los anticuerpos de unión no específica, se lavó con tampón fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,5) que contenía KCl 1 M. Finalmente, se eluyeron los anticuerpos específicos de AK3 con glicina/HCl 0,1 M (pH 2,5) (véase la Fig. 10). Se añadió directamente el eluyente a 1/20 volúmenes de Tris/HCl 2 M (pH 7,5) para neutralizar la fuerte acidez. Se dializó el anticuerpo policlonal específico de AK3 anteriormente purificado en PBS, se 35 almacenó a una temperatura de 4ºC y se usó en análisis de transferencia Western. Se sometieron los antígenos AK1, AK2 y AK3 de los anticuerpos de isozima de adenilato cinasa preparados (Ab dirigido contra AK1, Ab dirigido contra AK2 y Ab dirigido contra AK3) a un análisis de transferencia Western según el procedimiento siguiente y se confirmó que no tenían reactividad cruzada entre sí (véanse las Fig. 11 y Fig. 12). En caso de electroforesis de AK recombinante purificada, se inició un PAGE-SDS genérico del procedimiento de Laemmli y, en caso de no sustitución, se inició una 40 electroforesis en gel nativo modificada. Después de completar la PAGE-SDS de electroforesis en gel nativo modificada, se realizó la transferencia en una disposición tal que se pone una fibra en un soporte de gel después de completar la PAGE-SDS o electroforesis en gel nativo modificada, se pone un papel de filtro sobre la misma, se coloca una película de PVDF pretratada con etanol sobre el mismo, se coloca gel sobre la misma y se cubre con una fibra. Se situó el

apilamiento de transferencia en un tanque de tampón equipado con un dispositivo de enfriamiento y se aplicó una electricidad constante (90 V, 0,8 A) durante 2 horas. Se sacó la película de PVDF del soporte de gel después de detectar la transferencia del marcador preteñido, se sumergió en disolución de bloqueo de TBST que contenía 5% de leche desnatada desecada y se agitó a continuación ligeramente durante 2 minutos. Se sumergió la película de PVDF con transferencia de proteína en una disolución de anticuerpo dirigido contra AK3 que tenía una concentración 5 adecuada y se agitó a continuación a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavó la película con anticuerpo unido dos veces con TBST para retirar los anticuerpos no unidos específicamente. Se trató la membrana de PVDF lavada con disolución de anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 1 hora a 37ºC. Se lavó a continuación concienzudamente la membrana con TBST. Después de retirar completamente el TBST de la película, se hizo reaccionar usando el kit de análisis de transferencia Western ECL y se reveló a continuación exponiéndolo a una 10 película de rayos X.

Ejemplo 4: Detección de AK3 en suero de paciente

A partir de la distribución en tejido de AK3 en músculo esquelético y músculo cardiaco según el análisis de transferencia Western, se confirmó que la AK1 existe tanto en músculo esquelético como en músculo cardiaco, y que AK2 y AK3 existen solo en músculo cardiaco (véase la Fig. 13). Debido a la especificidad de tejido cardiaco de AK2 y AK3, se 15 muestra la posibilidad de usarse como marcadores biológicos que pueden diagnosticar una enfermedad tal como infarto de miocardio. Se confirmó si AK2 y AK3 pueden detectarse o no en un suero de paciente con infarto de miocardio mediante análisis de transferencia Western después de electroforesis en condiciones reductoras y no reductoras respectivamente (véase la Fig. 14). Así, la presencia de AK2 y AK3 no pudo confirmarse según el análisis de transferencia Western en estas condiciones de sustitución debido a la unión no específica a proteínas de suero. La 20 presencia de AK2 no pudo confirmarse según el análisis de transferencia Western en condiciones de PAGE-SDS. Para AK3, la banda pudo confirmarse en el suero de pacientes con infarto de miocardio en la misma región que la AK3 purificada debido a la superposición con bandas no específicas. Sin embargo, puesto que muchas bandas no específicas se detectan siempre, se desarrolló un nuevo procedimiento de electroforesis que puede detectar solo AK3. El nuevo procedimiento de electroforesis es uno en el que la electricidad fluye en dirección opuesta diferente a la 25 dirección general cuando se inicia una electroforesis en gel de acrilamida convencional, estando constituido el gel nativo por 2 ml de disolución monomérica (40% de T 5% de Cbis), 2,5 ml de tampón de gel de aislamiento 4x (Tris 158 mM, H3PO4 0,256 N, pH 6,9), 9,25 ml de H2O, 1,25 ml de catalizador (0,06% de sulfato de amonio, 0,02% de fosfato de riboflavina) y 20 µl de TEMED. Se cargó la muestra mezclando 1 µl de suero, 8 µl de DW y 1 µl de tampón de muestra (50% de sacarosa, 0,1% de azul de bromofenol), y se hicieron circular 20 mA de electricidad por el tanque de tampón 30 (Tris 25 mM, 5,5% de glicina) durante 2 horas con el procedimiento en dirección inversa.

Se identificó la dirección de migración de AK1, AK2 y AK3 cargando las AK purificadas, el suero del paciente y el suero normal en el gel según el procedimiento anteriormente mencionado. Se confirmó que la AK3 fuertemente básica se propagaba en el gel, y que AK1 y AK2 se difundían en el tampón del tanque (véase la Fig. 15).

Ejemplo 5: Producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra AK2 y dirigidos contra AK3 35

Para los anticuerpos monoclonales dirigidos contra AK3 y dirigidos contra AK2, se inyectó en primer lugar una emulsión (0,1 ml) obtenida mezclando 50 µg de una disolución de proteína antigénica y el mismo volumen de adyuvante completo de Freund en ambas almohadillas de las patas de un ratón Balb/C (haplotipo H-2d) de 4 semanas de edad, y se inocularon dos veces con un intervalo de 10 días. A partir de la segunda inyección de recuerdo, se usó un adyuvante inmunitario, el adyuvante incompleto de Freund. Después de confirmar que el anticuerpo se producía en el suero del 40 ratón, se tomó un nódulo linfático, se realizó una suspensión celular con caldo de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero fetal de ternero, IL-2, penicilina-estreptomicina y linfocitos B en esta suspensión celular y se fusionó la línea celular de mieloma Sp2/0-Ag14 anteriormente preparada, que es una célula tumoral de la misma cepa de ratón que el anterior, mediante tratamiento con PEG. Se tomaron 1,5 x 108 células inmunitarias y células Sp2 cada vez, se centrifugaron en un tubo de centrífuga a 400 x g durante 10 minutos para formar sedimentos, se retiraron los 45 sobrenadantes, se añadió 1 ml de PEG 1500 al 50% a 37ºC, se mezcló con la punta de una pipeta durante 1 minuto y se agitó muy cuidadosamente. Se añadió 1 ml del medio de cultivo que no contenía suero fetal de ternero a 37ºC durante 1 minuto, y se añadió continuamente medio exento de suero con agitación y dilución gradual para que las células no se disolvieran por PEG. Finalmente, se añadieron 7 ml de medio exento de suero y se agitó durante aproximadamente 3 minutos. Después de lavar las células, se dispersaron suficientemente añadiendo 20 ml de caldo, 50 se repartió 0,1 ml de la dispersión cada vez en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos y se incubó en incubadora a 7% de CO2 a 37ºC durante 24 horas para crear una placa maestra. Se clasificaron las células híbridas usando la viabilidad en medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT). Al día siguiente de la fusión celular, se añadió 0,1 ml de medio

HAT a cada pocillo. Los días 2, 3, 5, 8 y 11, se aspiró la mitad de cada medio de caldo y se cambió parcialmente por 0,1 ml de medio HAT reciente. Después de ese tiempo, con un intervalo de 3 o 4 días, se repitió el mismo procedimiento que anteriormente, se seleccionaron separadamente los pocillos que albergaban las células supervivientes después de 4 semanas, se recogió su sobrenadante y se realizó un ELISA usando una placa de microvaloración de 96 pocillos recubierta con AK3. En este análisis, se seleccionaron solo los pocillos que tenían una absorbancia de luz de 0,3 o más 5 a 405 nm usando 1 ml de cultivo. Se transfirieron las células seleccionadas a una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos y se dejaron proliferar a escala de 1 ml con células de alimentación derivadas de Balb/C (suspensión celular tratada con mitomicina después de la disolución de células esplénicas de Balb/C con eritrocitos) en medio HT en lugar de HAT durante 15 días mediante cultivo de 2 ml y 10 ml, respectivamente. En este proceso, se intentó la clonación de la célula de hibridoma mediante un procedimiento de dilución limitante. Se diluyeron 36 pocillos a una densidad de 5 10 células/pocillo, otros 36 pocillos a una densidad de 1 célula/pocillo y los 24 pocillos restantes a una densidad de 0,5 células/pocillo en una placa de microvaloración de 96 pocillos. Se realizó el pase celular 5 y 12 días después de la incubación, y se dejaron proliferar a continuación como anteriormente a escala de cultivo de 1 ml. Se seleccionó el sobrenadante incubado del pocillo del que parece derivar un anticuerpo monoclonal y se realizó un ELISA para cribado de anticuerpo. En este proceso, se retiraron los clones que indicaban reactividad cruzada con AK1 y AK2, se 15 seleccionaron estrictamente las células de hibridoma que reconocían específicamente solo AK3, y se clasificaron como líneas celulares productoras de anticuerpo monoclonal dirigido contra AK3. Se transfirió el hibridoma seleccionado finalmente a un matraz de incubación de 5 ml y se incubó para proliferación. Para la producción de anticuerpo monoclonal (mAb) a partir de la línea celular creada, se cultivaron células de hibridoma en RPMI 1640 con suplementos (10% de suero fetal bovino, HAT, penicilina y G418), secretando mAb en el medio de cultivo. Se aisló y purificó el 20 anticuerpo monoclonal (25 µg de anticuerpo por ml de cultivo) a partir del medio de cultivo. Como alternativa, se indujo mAb a partir de ascitis de murino. Se cultivaron las células de hibridoma en presencia de dióxido de carbono al 5% en caldo DMEM, 3 días después se recogieron 2 x 106 células de fusión en estado sano y se inyectaron por vía intraperitoneal en un ratón Balb/c, causando proliferación tumoral y derivando el anticuerpo de ascitis. Se aisló y purificó el anticuerpo mediante cromatografía en columna de afinidad con AK3 con un rendimiento de 0,8 mg/ml. 25

Ejemplo 6: Diagnóstico de infarto de miocardio usando anticuerpo de AK3 y uso de AK3 como marcador bioquímico de infarto de miocardio

Respecto a la Fig. 13, el aspecto de la expresión de AK3 para tejidos musculares era específico del músculo cardiaco. Considerando la posibilidad de que AK3 se liberara en la sangre debido a una lesión del músculo cardiaco, se realizó en este ejemplo un experimento para el uso de AK3 como indicador diagnóstico de infarto de miocardio usando una 30 muestra de suero recogida de un paciente ambulatorio en la sala de urgencias de un hospital general.

Se usaron 30 individuos para la muestra de suero, y los nombres de sus enfermedades se indican en la Tabla 2. Entre los 5 pacientes con infarto de miocardio, los pacientes agudos son 4 personas y el paciente crónico es una persona. Se detectaron las unidades de CK-MB en cada suero en un laboratorio de patología clínica. Las unidades de CK-MB de la persona sana estaban por debajo de 7, lo que se designa como normal. 35

Se probaron los sueros de 29 pacientes mediante análisis de transferencia Western como anteriormente usando anticuerpo dirigido contra AK3. Como resultado, para el paciente de infarto de miocardio, se detectó que la concentración de AK3 era idéntica a la de CK-MB (véase la Fig. 16). Sin embargo, para el paciente que tenía una operación por fractura de un hueso de la pierna, la CK-MB era de 44 unidades y un falso positivo, pero no se detectó AK3 (véase la Fig. 16, panel B, hilera 8). Para el paciente que experimentó una operación por hemorragia cerebral 40 (paciente nº 22 en la Tabla 2), el valor de CK-MB era muy alto, del orden de 56,3, pero no se detectó una anormalidad cardiaca. En este ejemplo, no se detectó AK3. El resultado de este experimento prueba que la detección de AK3 usando anticuerpo dirigido contra AK3 es un diagnóstico más correcto de infarto de miocardio que la CK-MB. En consecuencia, en el diagnóstico de infarto de miocardio agudo o crónico, era más correcta una formulación inmunitaria o kit de diagnóstico que usara anticuerpo dirigido contra AK3 que el diagnóstico usando mioglobulina de CK-MB. En 45 consecuencia, era evidente que un kit de diagnóstico que use el anticuerpo según la presente invención era clínicamente específico de miocardio.

Tabla 2

Nº de paciente: Nombres de las enfermedades Sexo/ edad Valores de CK-MB Detección de AK3

0: Control normal M/26 -

1: Angina estable M/62 2,7 -

2: Angina inestable M/53 4,6 -

3: Operación de peritonitis M/54 7,3 -

4: Infarto de miocardio agudo M/56 22,1 +

5: Operación de tiflitis F/32 3,0 -

6: Fibrilación auricular M/45 3,3 -

7: Enfermedad isquémica de miocardio (la persona tiene historial de infarto de miocardio) M/78 2,8 -

8: Cáncer de esófago M/55 1,1 -

9: Operación por fractura de un hueso de la pierna M/25 44,0 -

10: Angina inestable M/67 3,6 -

11: Operación por defecto septal interventricular M/34 8,5 -

12: Asma M/76 9,2 -

13: Infarto de miocardio agudo M/40 40,4 +

14: Angina inestable M/67 2,5 -

15: Angina inestable M/58 5,8 -

16: Operación por defecto septal interventricular M/34 12,8 -

17: Operación por peritonitis M/85 5,6 -

18: Infarto de miocardio M/41 18,0 +

19: Miastenia grave F/45 6,2 -

20: Angina inestable M/67 0,7 -

21: Cáncer de pulmón M/79 2,7 -

22: Operación por hemorragia cerebral M/25 56,3 -

23: Operación por estallido intestinal M/64 4,3 -

24: Engrosamiento del miocardio, diabetes M/67 2,9 -

25: Arritmia F/52 2,7 -

26: Fractura múltiple de costillas M/18 3,9 -

27: Diabetes, hipertensión, fibrilación auricular F/91 2,4 -

28: Trastorno de somatización (enfermedad mental) M/28 3,1 -

29: Infarto de miocardio agudo M/34 56,3 +

La Fig.16 es un dibujo que muestra el resultado del análisis de transferencia Western para la detección de AK3 en el

suero del paciente. La información del suero de prueba de la Fig. 16 se proporcionó en las Tablas 3 y 4 siguientes.

Tabla 3

[Información sobre el suero de prueba de la Fig. 16 (instrucciones del panel A)

Hilera nº: Nombres de las enfermedades Unidades de CK-MBa) Nº de paciente en la tabla 2

1: Infarto de miocardio agudo 22,1 4

2: Infarto de miocardio agudo 40,4 13

3: Infarto de miocardio agudo 18 18

4: Infarto de miocardio agudo 56,3 29

S: Muestra de tejido cardiaco humano

N: Suero normal

AK2: AK2 recombinante purificada

P: AK3 recombinante purificada

a) la CK-MB de suero normal era menor de 7 unidades

Tabla 4

Información sobre el suero de prueba de la Fig. 16 (instrucciones del panel B)

5: Angina inestable 2,7 1

6: Cáncer de esófago 1,1 8

7: Fibrilación auricular 3,3 6

8: Fractura de un hueso de la pierna 44,0 9

9: Operación por defecto septal interventricular 12,8 16

10: Operación de peritonitis 5,6 17

11: Cáncer de pulmón 2,7 21

N: Suero normal n.d.a)

P: AK3

a) n.d.: no determinado

Ejemplo 7: Diagnóstico de infarto de miocardio usando anticuerpo dirigido contra AK3 y prueba de especificidad clínica 5 para infarto de miocardio

En este experimento, para confirmar la especificidad clínica de AK3 como marcador bioquímico para el diagnóstico de una cardiopatía, se recogieron los sueros de prueba de pacientes ingresados que se admitieron en el servicio de medicina interna del aparato circulatorio del Hospital General Guro, afiliado a la Universidad de Corea, y diagnosticados definitivamente como infarto de miocardio. Se midió la concentración de CK-MB y se realizaron un análisis de 10 transferencia Western ECL y ELISA en sándwich frente a AK3.

Según el ELISA, se unió el anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra AK3 purificado por afinidad (450 ng/pocillo) con la placa de microvaloración de 96 pocillos, se añadieron 100 µl de suero y se hicieron reaccionar a una temperatura de 30ºC durante 1 hora. Se lavó suficientemente el reactivo con disolución salina fisiológica tamponada con ácido fosfórico (PBS), se hizo reaccionar en segundo lugar con anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra AK3 biotinilado, 15 se trató para unión a HRP, se fusionó con estreptavidina y se trató con sustrato cromofórico. Se determinó a

continuación la absorbancia de luz mediante un detector ELISA. En este experimento, se usó como material patrón la AK3 recombinante genética aislada y purificada por los presentes inventores. Los resultados del diagnóstico de infarto de miocardio agudo (IMA) usando CK-MB y anticuerpo dirigido contra AK3 se muestran a continuación en la Tabla 5.

Tabla 5

: ID de muestra Nombres de las enfermedades CK-MBa) (ng/ml) AK3 Observa-ciones (edad/ sexo)

Análisis de transferencia Westernd): ELISA en sándwichb) (µg/ml)

1: 417 Infarto de miocardio 406,6 ++ 2,0 75/M

2: 436 “ 123,8 ++ 10,0 58/M

3: 464 “ 230,9 +++ 4,7 67/M

4: 474 “ 47,23 ++ 11,6 65/M

5: 481 “ 378,6 + 2,0 53/M

6: 487 “ + 3,0

7: 503 “ 51,1 + 7,3 56/M

8: 514 “ 33,2 ++ 7,6 53/M

9: 526 “ 2,15 ++ 3,3 57/F

10: 547 “ 314,2 +++ 7,0 60/M

11: 548 “ 71,79 + 4,2 63/M

12: 553 “ 175,4 ++ 5,8 52/M

13: 565(6) “ >500,0 +++ 4,7 61/M

14: 578 “ 176,7 + 8,1 57/M

15: 606 “ 1,55 + 1,2 64/M

16: 607 “ +++ 10,0

17: 614 “ 19,84 + n.d.c) 62/M

18: 616 “ 97,93 ++ n.d. 45/M

19: 621 “ 1,79 + n.d. 66/M

20: 625 “ 1,85 + n.d. 51/M

21: 626 “ 1,62 ++ 5,0 41/M

a) El análisis de CK-MB se realizó en el Hospital General de Ansan, dependiente de la Universidad de Corea b) Absorbancia de luz para el suero de la persona sana en ELISA en sándwich: A490 < 0,02, en los casos de las 6 muestras extraídas de las personas sanas, mostraron valores por debajo del valor de referencia c) No se realizó la prueba debido a la falta de suero d) Todos son positivos de AK3

5

Las Figs. 17a y Fig. 17b muestran los resultados del análisis de transferencia Western de AK3 usando sustrato ECL.

Como se observa en la Tabla 5 anterior, a partir del análisis de indicador diagnóstico de CK-MB y AK3 usando las

muestras de suero recogidas de los 60 pacientes totales, incluyendo 21 muestras recogidas de pacientes que se diagnosticaron definitivamente como infarto de miocardio en el servicio de medicina interna del aparato circulatorio del Hospital General Guro, dependiente de la Universidad de Corea, y 10 muestras recogidas de pacientes con infarto de miocardio admitidos en el Hospital General afiliado a la Universidad de Hanyang en Corea, se confirmó que la AK3 se detectaba con 100% de exactitud. Incluso en todos los pacientes que se habían diagnosticado como falsos negativos en 5 la prueba de CK-MB, que se usaron ahora como indicador óptimo representativo del diagnóstico de infarto de miocardio, pudo decidirse que eran positivos por el análisis de AK3. Por lo tanto, una formulación inmunitaria según la presente invención es más exacta en el diagnóstico así como tiene una alta especificidad por análisis patobiológico y una alta especificidad clínica.

Aplicabilidad industrial 10

Como resulta evidente a partir de la descripción anterior, las isozimas de adenilato cinasa mitocondrial humana, especialmente la AK3 que se usa de forma característica en la presente invención, tienen las siguientes características:

(1) se libera a la sangre en circulación por lesión específica del músculo cardiaco;

(2) se libera inmediatamente después de la lesión del músculo cardiaco;

(3) como tiene una vida útil sustancial en circulación, los valores crecientes continuos muestran la 15 continuidad de la lesión muscular cardiaca (en el caso de la muestra nº 7, la AK3 no se detectó en el suero de la persona que tenía historial de infarto de miocardio). Por tanto, las concentraciones patológicas anormales de AK3 frente al tiempo después del inicio del IMA mostraban una relación lineal; y

(4) se confirma un aumento de la concentración sérica al cabo de 2 horas después del inicio del dolor de pecho (Fig. 16, hilera 3). 20

En consecuencia, la formulación inmunitaria o kit de diagnóstico según la presente invención posibilita un diagnóstico temprano de cardiopatía tal como infarto de miocardio, no requiere una técnica ni adiestramiento especiales para obtener el resultado de un análisis clínico adecuado y facilita la automatización del análisis. Además, las muestras de análisis son estables y económicas y no tienen alteraciones ni interferencias. Tienen también una exactitud mayor que un indicador diagnóstico estándar por CK-MB, que se usa predominantemente en la patología clínica. Además, el kit de 25 diagnóstico según la presente invención puede aplicarse tanto en kits de tipo parche como de tipo tira, y por tanto proporciona un diagnóstico rápido y sencillo. Como los procedimientos de diagnóstico previos requieren un equipo costoso y un alto nivel de técnicas de diagnóstico o los kits rápidos POCT requieren probar simultáneamente marcadores múltiples con varias pruebas repetidas con costes elevados, pueden realzarse solo limitadamente en unos pocos hospitales generales, mientras que el kit de diagnóstico según la presente invención es económico y puede 30 usarse fácilmente incluso en un hospital pequeño y por un individuo. Además, puede esperarse un efecto de ahorro en la importación de los costosos reactivos y kits de diagnóstico del extranjero.

<110> KIM, Hyo, Joon

CHO, Key, Seung

LEE, Sang, Min

<120> ANTICUERPO CONTRA LA ISOZIMA ADENILATO CINASA MITOCONDRIAL HUMANA, FORMULACIÓN DE DIAGNÓSTICO Y KIT DE DIAGNÓSTICO PARA CARDIOPATÍA 5

<130> 00-pct-3

<150> KR 2000-5808

<151> 08-02-2000

<160> 1

<170> KOPATIN 1.5 10

<210> 1

<211> 223

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1 15

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto. 5

Documentos de patente citados en la descripción

• KR 20005808 [0076]

10

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

• Frithz et al. Upsala J Med Sci, 1976, vol. 81, 155-158 [0004]

• Nobumoto et al. J. Biochem., 1998, vol. 123, 128-135 [0005]

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• Kurokawa et al. Enzyme, 1990, vol. 43, 57-71 [0007]

• Ronquist et al. Upsala J. Med. Sci., 1983, vol. 88, 51-59 [0008]

• Clinical Laboratory News, 1996, vol. 22 (1), 1-14 [0017]

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para diagnosticar infarto de miocardio que comprende

(i) producir un complejo inmunitario poniendo en contacto una inmunoglobulina específica de la isozima de adenilato cinasa humana (AK3) con una muestra biológica; y

(ii) detectar el complejo inmunitario obtenido en la etapa (i), en el que la detección de dicho complejo 5 inmunitario es indicativa de infarto de miocardio.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo constituido por orina, sangre, suero y plasma sanguíneo.
3. Un uso in vitro de la isozima de adenilato cinasa mitocondrial humana 3 (AK3) como marcador para el diagnóstico de infarto de miocardio. 10
4. Un uso in vitro de una inmunoglobulina específica de la isozima de adenilato cinasa mitocondrial humana (AK3) para el diagnóstico de infarto de miocardio.