ES2360344T3 - Oligonucleótidos para la detección de salmonella. - Google Patents
Oligonucleótidos para la detección de salmonella. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2360344T3 ES2360344T3 ES04078201T ES04078201T ES2360344T3 ES 2360344 T3 ES2360344 T3 ES 2360344T3 ES 04078201 T ES04078201 T ES 04078201T ES 04078201 T ES04078201 T ES 04078201T ES 2360344 T3 ES2360344 T3 ES 2360344T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- salmonella
- enterica
- type
- sequence
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 54
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 title description 55
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 claims abstract description 77
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 101150105846 hilA gene Proteins 0.000 claims abstract 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 55
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 54
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 51
- 241000533331 Salmonella bongori Species 0.000 claims description 48
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 47
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 36
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 36
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 27
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 15
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 11
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 8
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 6
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 claims description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 3
- 241001467018 Typhis Species 0.000 abstract description 15
- 101150000726 iagB gene Proteins 0.000 abstract description 14
- 230000009545 invasion Effects 0.000 abstract description 11
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 abstract description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 71
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 51
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 description 49
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 238000011161 development Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 7
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 101150049246 KHDRBS3 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 101150070528 khdrbs2 gene Proteins 0.000 description 5
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 4
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 3
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 3
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 2
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 2
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 2
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 2
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000588749 Klebsiella oxytoca Species 0.000 description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 2
- 101150017238 Magt1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 2
- 241001646725 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Species 0.000 description 2
- 108700035964 Mycobacterium tuberculosis HsaD Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 2
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- 108010052418 (N-(2-((4-((2-((4-(9-acridinylamino)phenyl)amino)-2-oxoethyl)amino)-4-oxobutyl)amino)-1-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-1-oxoethyl)-6-(((-2-aminoethyl)amino)methyl)-2-pyridinecarboxamidato) iron(1+) Proteins 0.000 description 1
- ZXVONLUNISGICL-UHFFFAOYSA-N 4,6-dinitro-o-cresol Chemical compound CC1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O ZXVONLUNISGICL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 101000946068 Caenorhabditis elegans Ceramide glucosyltransferase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101100098985 Caenorhabditis elegans cct-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 1
- 241001494522 Citrobacter amalonaticus Species 0.000 description 1
- 241000588917 Citrobacter koseri Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000607473 Edwardsiella <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 1
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- -1 N-hydroxysuccinimide-D-biotinyl-amino-aminocaproic acid Chemical compound 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241000086242 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Poona Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000607618 Vibrio harveyi Species 0.000 description 1
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 1
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 101150067249 ipgF gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Par de cebadores oligonucleotídicos caracterizado porque consiste en dos oligonucleótidos de por lo menos 9 nucleótidos que hibridan en condiciones astringentes con la secuencia nucleotídica que corresponde a la parte Cterminal del gen iagA definda entre las posiciones 1318 y 1755 de la secuencia iagA representada en la figura 1, siendo dicho par capaz de amplificar una secuencia de ADN o de ADNc de Salmonella enterica y de Salmonella bongori comprendida en la secuencia iagA.
Description
El género Salmonella contiene dos especies, Salmonella enterica, especie dividida en seis subespecies basándose en características bioquímicas y de homología a nivel del ADN, y Salmonella bongori. El género se subdivide en más de 2.000 serovariedades definidas con ayuda de antígenos somáticos y flagelares. Las bacterias del género Salmonella son generalmente patógenas para el animal o para el ser humano. Así se sabe que las Salmonella se encuentran entre los agentes responsables de las intoxicaciones alimentarias más frecuentes en los países desarrollados: por esta razón, son importantes métodos de detección rápidos y fiables de las subespecies de
Salmonella.
Las salmonelas responsables de las toxiinfecciones alimentarias pertenecen principalmente a la subespecie I (también denominada grupo I) de S. enterica.
No obstante, las toxiinfecciones no son las únicas patologías provocadas por infecciones de Salmonella.
Por ejemplo, Salmonella enterica subespecie enterica serovariedad typhi (a continuación denominada Typhi) es el agente que causa la fiebre tifoidea humana.
Teniendo en cuenta la naturaleza de las infecciones provocadas por las salmonelas y la necesidad especialmente de estudiar su presencia en las muestras biológicas obtenidas de los pacientes o en los alimentos, parece indispensable disponer de medios rápidos y sensibles para detectar su presencia.
Los métodos habituales de cultivo ampliamente utilizados hasta la fecha para la detección de las salmonelas requieren un tiempo importante y no están adaptados por ejemplo para hacer un seguimiento de la contaminación de productos alimentarios. Para vencer las desventajas de estos métodos, ya se han propuesto varios métodos basados en técnicas de biología molecular tales como pruebas de hibridación y las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa. Se han utilizado diferentes sondas de ADN en varios protocolos de hibridación y de PCR para detectar las subespecies de Salmonella en la alimentación. Sin embargo, ninguna de estas técnicas es completamente satisfactoria, ya que las secuencias utilizadas no se conocen completamente o no están exclusivamente presentes en el género Salmonella y de esta forma, pueden conducir a reacciones cruzadas entre la sonda y secuencias de ADN de otras enterobacterias o pueden conducir a un gran número de falsos negativos o de falsos positivos.
Los inventores han buscado medios que permiten la detección específica y sensible del conjunto de las salmonelas de las especies S. enterica y/o S. Bongori. Desde este punto de vista, se han interesado por la cepa de Salmonella enterica subespecie enterica serovariedad typhi (S. typhi) y por el gen que participa en la invasión de células por S. typhi.
Además, han definido determinadas condiciones que permiten la detección específica de grupos determinados de salmonelas, por ejemplo, bacterias del grupo I.
En el estado anterior de la técnica, ya se ha demostrado que la cepa Typhi puede adherirse a monocapas de células HeLa y de entrar en estas células (Yabuuchi et al, 1986). Sin embargo, hasta la fecha, no se han identificado claramente los determinantes genéticos implicados en este proceso de adhesión y de entrada en las células. Elsinghorst et al. (1989) han clonado un fragmento cromosómico de Typhi, que confiere a bacterias de tipo Escherichia coli la capacidad de penetrar en las células Henle 407. Recientemente, se han identificado y clonado otra región cromosómica implicada en la invasión de las células HeLa por la cepa Typhi Ty2 (Popoff y Dion, 1990).
Los inventores de la presente solicitud han identificado en un fragmento de ADN de 2,4 kb de S. typhi contenido en la secuencia HindIII de 7,9 kb descrita por Popoff y Dion (1990), regiones susceptibles de participar en la actividad de invasión de Salmonella enterica subespecie enterica serovariedad Typhi en células, y en participar en cultivos celulares de tipo HeLa, siendo estas regiones susceptibles además de ser utilizadas en reacciones para la realización de un diagnóstico generalizado de todos los representantes de las especies S. enterica y/o S. bongori o probablemente en condiciones de detección particulares, para el diagnóstico específico del grupo I de S. enterica.
Los inventores han identificado una secuencia denominada IagA y una secuencia denominada IagB y las han caracterizado por su participación en la invasión celular manifestándose durante una infección por Salmonella enterica subespecie enterica serovariedad Typhi.
La especificidad de estas secuencias en el seno de S. typhi ha hecho que los inventores propongan su utilización para definir unos medios para el diagnóstico de una infección por S. typhi, incluso para el diagnóstico de una infección por Salmonella de las especies S. enterica y/o S. bongori o en determinados casos para poner en evidencia S. enterica de grupos específicos.
Estos medios que se pueden utilizar para el diagnóstico de una infección por Salmonella enterica y/o Salmonella bongori comprenden unos oligonucleótidos susceptibles de ser utilizados en reacciones de amplificación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, reacciones en cadena de la polimerasa. La solicitud describe asimismo unas sondas para la detección de ácidos nucleicos de S. enterica y/o S. bongori, siendo estos ácidos nucleicos, si procede, unos fragmentos amplificados.
La invención tiene asimismo por objeto un kit y un método de detección de la presencia de Salmonella enterica y Salmonella bongori en muestras biológicas y por ejemplo, en productos alimentarios o en cualquier muestra que sea el objeto de un diagnóstico clínico. Otros métodos y kits de detección son específicos de las cepas del grupo I de S. enterica.
Estos otros métodos permiten, por el contrario, investigar la presencia de bacterias S. enterica o S. bongori del género Salmonella. El género Salmonella incluye así seis subespecies o grupos I, II, III, IV, V o VI. Las subespecies I, II, III, IV y VI pertenecen a la especie S. enterica y la subespecie V pertenece a la especie S. bongori.
La solicitud describe asimismo las secuencias de nucleótidos que participan en la invasión de células por Salmonella enterica subespecie enterica serovariedad Typhi, caracterizadas porque se trata de una de las secuencias iagA o iagB comprendidas respectivamente entre los nucleótidos 97 y 1755 de la secuencia representada en la figura 1 (IagA) y entre los nucleótidos 1776 y 2255 de la secuencia representada en la figura 1 (IagB).
La solicitud describe asimismo unas secuencias de nucleótidos modificadas con respecto a iagA o iagB pero que presentan sin embargo las mismas propiedades al tratarse de la invasión de las células, o que se hibridan en condiciones astringentes con una de dichas secuencias.
La presente solicitud describe asimismo unas proteínas IagA e IagB que responden a las secuencias presentadas en la figura 1 o unas variantes de estas secuencias obtenidas por mutación, deleción o adición de aminoácidos por cuanto que la secuencia así obtenida es reconocida por unos anticuerpos dirigidos contra una de dichas secuencias IagA o IagB.
De manera general, la solicitud describe cualquier secuencia de aminoácidos codificada por los genes iagA e iagB representados en la figura 1.
La solicitud describe por otra parte cualquier fragmento de una de estas secuencias, en particular cualquier fragmento en forma purificada, suficiente para conservar en S. typhi sus propiedades de adhesión y de infección de las células, y en particular de las células HeLa en cultivo.
El procedimiento de infección de las células HeLa en cultivo es el procedimiento habitual que se ha descrito en particular en la solicitud de patente internacional publicada con el número WO 92/01056.
La invención se refiere a unos medios para la detección de la presencia de S. enterica y S. bongori y en su caso, para la cuantificación de S. enterica y S. bongori en muestras biológicas.
Por muestra biológica, se entiende cualquier muestra extraída para la realización de análisis in vitro en el animal o en el ser humano o extraída a partir de productos alimenticios con independencia de la naturaleza o a partir de cualquier medio líquido, sólido o gaseoso susceptible de contener los agentes patogénicos buscados.
La invención tiene por objeto en este contexto, un par de cebadores tal como se define en la reivindicación 1.
Las condiciones de hibridación a las que se ha hecho referencia anteriormente se definen en función de la especificidad deseada de la hibridación y se facilitan unas condiciones apropiadas a modo indicativo en los ejemplos de la presente solicitud.
La invención utiliza unos oligonucleótidos procedentes de la parte C-terminal de la secuencia iagA representada en la figura 1.
Las secuencias de tipo oligonucleótidos se pueden seleccionar para ser utilizadas como cebadores o bien para la detección tras amplificación, del ADN genómico o del ADNc de Salmonella de la especie S. enterica y/o de la especia S. bongori perteneciente a los otros grupos I a VI. En particular, se puede tratar de secuencias de nucleótidos obtenidas por síntesis química según los métodos conocidos por el experto en la materia.
Unos oligonucleótidos preferidos, que se pueden utilizar para la amplificación de ácido nucleico característico de bacterias que pertenecen a uno de los grupos I, II, IIIa, IIIb, IV, V o VI del género Salmonella y en particular del ADN genómico o del ADNc de S. enterica y/o de S. bongori son, por ejemplo, los siguientes (indicándose su posición en el seno de la secuencia IagA representada en la figura 1):
- Posición
- Iag1: 5’-TA TTA AGT ATG CAG GTT ATG -3’
- 1424-1443
- Iag2: 5’-AGA GAA TTT CTG GAA AGT GAA-3 ’
- 1585-1605
- Iag3: 5’-ATA TCC ACG CAG GAA ATA ACA GGA CTT -3’
- 1495-1521
- Iag4: 5’-GAG CGT GCC TTA CCG ACG ATA-3’
- 1564-1584
- Iag5: 5’-GCA GGG ATC ACT AAG CTG TG-3’
- 1318-1337
- Iag6: 5’-CGT GGG CAA CCA GCA CTA ACG-3’
- 1637-1657.
- Además, se dan a conocer los oligonucleótidos
- Slm1: 5’-CG GGT TAA AGG TTA TCA CGT-3’
- 709-728
- Slm2: 5’-AG CAT GGC GCA AAT GGG-3’
- 1014-1031
Slm3: 5’-GCA CCA GGA AAG CAT TAA GTT GAT AGA ACA C-3’ 732-762 Slm4: 5’-CTT CGC TGG GAC ACA AAG CA-3’ 823-842 y SS28: 5’-TAA TGC TTT CCT GGT GC-3’
Se han definido otros oligonucleótidos susceptibles de ser utilizados como cebadores para la amplificación del ADN
o del ADNc del gen iagB del conjunto de las cepas Salmonella de las especies S. enterica y/o S. bongori a partir de la secuencia iagB representada en la figura 1.
La presente solicitud describe por lo tanto los oligonucleótidos que responden a los encadenamientos siguientes:
Iag7: 5’-T ACG GCA TGG GCT GAT TGC T-3’
Iag8: 5’-T TAC GCT ATC GCC CAG CAG CAG GA-3’
Iag9: 5’-T GGT CAT AAC CGA GAT GGT TCA ACC GAT C-3’
Iag10: 5’-A CAG TTG TTA CAG GAT CCC T-3’
Estos oligonucleótidos se pueden utilizar asimismo como sondas, por ejemplo, para la detección de los productos de amplificación del ADN y/o del ADNc de S. enterica y/o de S. bongori.
Un par de cebadores preferido para realizar la amplificación del ácido nucleico de S. enterica y/o de S. bongori, con independencia del grupo al que pertenece la bacteria, está formado por ejemplo por los cebadores Iag5 (sentido) e Iag6 (antisentido).
Este par de cebadores dirige la amplificación de un fragmento de ácido nucleico de 340 pb.
Otro par de cebadores está formado por los cebadores Slm1 (sentido) y Slm2 (antisentido). Estos cebadores son susceptibles de hibridarse con el ADN o el ADNc de bacterias S. enterica y/o de S. bongori de uno de los grupos I, II, III, IV, V o VI.
Unos oligonucleótidos que se pueden utilizar como cebadores para la detección específica de Salmonella enterica grupo I cuando las condiciones de detección tras la amplificación del ADN o del ADNc son las descritas en el ejemplo I.
Dichos cebadores se caracterizan por su capacidad para amplificar secuencias de ácido nucleico de las cepas de S. enterica o de S. bongori representativas de los grupos I, II, III, IV, V y VI, pero para las cuales las condiciones de detección son las expuestas en el ejemplo I, permitiendo sólo la detección de las bacterias del grupo I.
Un par de oligonucleótidos que se pueden utilizar para estos fines, como cebadores específicos para la detección de secuencias de ADN o ADNc de S. enterica del grupo I está constituido por ejemplo por las siguientes secuencias:
SS2 5’-CCGGGCAGATGATACCC-3’ y SS28 ’-TAATGCTTTCCTGGTGC-3’.
Los oligonucleótidos definidos por los inventores permiten abordar el diagnóstico de S. enterica y de S. bongori en condiciones satisfactorias de sensibilidad, de rapidez, de facilidad y de especificidad.
Asimismo, la invención tiene por objeto un kit para la detección de S. enterica y de S. bongori mediante la amplificación del ADN genómico o complementario de S. enterica y/o de S. bongori, caracterizado porque comprende:
-unos oligonucleótidos tales como los definidos anteriormente, capaces de hibridar en condiciones rigurosas con el ADN genómico o el ADNc de S. enterica y de S. bongori,
-una sonda para la detección de los fragmentos amplificados que responden a una de las definiciones facilitadas en las páginas anteriores,
-los reactivos necesarios para la realización de la reacción de amplificación.
La presente solicitud describe la utilización de los oligonucleótidos citados anteriormente, para la amplificación de una secuencia de ADN o de ADNc de Salmonella enterica y/o de Salmonella bongori, comprendida en una de las secuencias iagA o iagB tales como las descritas en las páginas anteriores o complementarias de una secuencia de este tipo, o también la utilización de estos oligonucleótidos como sonda para la detección de una secuencia de nucleótidos amplificada.
La invención tiene por tanto por objeto en particular la utilización de un par de cebadores oligonucleotídicos tal como se define en la reivindicación 1 para la amplificación de una secuencia de ADN o de ADNc de Salmonella enterica y Salmonella bongori o también la utilización de este par de cebadores oligonucleotídicos como sonda para la detección de una secuencia de nucleótidos amplificada.
Por ejemplo, los oligonucleótidos iag5 e Iag6 se pueden utilizar respectivamente como cebadores sentido y antisentido para la detección de S. enterica y de S. bongori del grupo I, II, III, IV, V o VI.
Fuera del alcance de las reivindicaciones, el par de cebadores Slm1 y Slm2 se puede utilizar para la detección de bacterias de la especie S. enterica y/o de S. bongori de uno de estos grupos en una muestra biológica.
Se da a conocer la utilización de los oligonucleótidos SS2 y SS28 para la detección específica in vitro en una muestra biológica de S. enterica del grupo I.
La detección es específica cuando los cebadores utilizados para la amplificación de las secuencias de nucleótidos buscadas permiten la amplificación de bacterias S. enterica y de S. bongori que pertenecen a uno de los otros grupos II, III, IV, V o VI, pero las condiciones utilizadas no permiten la detección de las bacterias de estos mismos grupos o de organismos diferentes susceptibles de estar presentes en la muestra biológica probada.
La solicitud describe así un conjunto de oligonucleótidos que se pueden utilizar para la detección de bacterias S. enterica y/o de S. bongori, tras la amplificación del ADN genómico o complementario de S. enterica y/o de S. bongori, caracterizado porque comprende:
-un par de oligonucleótidos que responden a las definiciones descritas anteriormente, capaces de hibridar en unas condiciones astringentes con el ADN genómico o el ADNc de S. enterica y/o de S. bongori,
-una sonda que responde a las características indicadas anteriormente.
Un primer conjunto de oligonucleótidos que se pueden utilizar para la detección in vitro en una muestra biológica, de cepas de Salmonella enterica y de S. bongori que pertenecen a uno de los grupos I, II, III, IV, V o VI, se caracteriza porque contiene los siguientes oligonucleótidos:
-la secuencia Iag5 (5’-GCA GGG ATC ACT AAG CTG TG-3’ y la secuencia Iag6 (5’-CGT GGG CAA CCA GCA CTA ACG-3’) que se pueden utilizar como cebadores para la amplificación, y
-la secuencia Iag3 (5’-ATA TCC ACG CAG GAA ATA ACA GGA CTT-3’) que se puede utilizar como sonda de
revelado y la secuencia Iag4 (5’-GAG CGT GCC TTA CCG ACG ATA-3’) que se puede utilizar como sonda de
captura.
Otro conjunto de oligonucleótidos que se pueden utilizar para la detección específica in vitro en una muestra biológica de S. enterica del grupo I, se caracteriza porque comprende los siguientes oligonucleótidos:
SS2 (5’-CCGGGCAGATGATACCC-3’ y
SS28 (’-TAATGCTTTCCTGGTGC-3’).
Por otra parte, la presente solicitud describe una proteína iagA codificada por la secuencia de nucleótidos iagA representada en la figura 1, así como una proteína iagB codificada por la secuencia de nucleótidos iagB representada en la figura 1.
Las proteínas iagA e iagB tienen respectivamente las secuencias de aminoácidos representadas en la figura 1.
La solicitud describe asimismo un procedimiento para la detección in vitro en una muestra biológica de secuencias de nucleótidos Salmonella enterica y/o de S. bongori, previamente amplificadas, por ejemplo, mediante PCR, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
-desnaturalizar la secuencia de S. enterica y/o de S. bongori amplificada,
-poner en contacto las secuencias de nucleótidos amplificadas desnaturalizadas de S. enterica y/o de S. bongori, con una sonda de captura y una sonda de revelado obtenidas a partir de los oligonucleótidos definidos anteriormente en condiciones que permiten la hibridación de dichas sondas de captura y de revelado con dicha secuencia de nucleótidos amplificada de S. enterica y/o de S. bongori, estando la sonda de captura fijada en la superficie de un pocillo de una placa de microtitulación y estando la sonda de revelado marcada y libre en un tampón de hibridación apropiado;
-incubar la mezcla de reacción, durante un tiempo suficiente para permitir la reacción de hibridación;
-lavar para eliminar los oligonucleótidos que no han reaccionado;
-revelar las sondas de revelado que han hibridado a las secuencias de nucleótidos amplificadas.
El procedimiento de detección descrito anteriormente puede caracterizarse de manera ventajosa porque la detección se realiza según las siguientes etapas:
-desnaturalizar un volumen de 10 µl de la secuencia amplificada mediante la adición volumen a volumen de una disolución de NaOH 200 mM, EDTA 40 mM,
-hibridar previamente las microplacas, de las que la superficie de los pocillos está revestida por la sonda de captura, en un tampón de hibridación apropiado,
-liberar la microplaca y rellenar cada uno de los pocillos con 200 µl de tampón de hibridación que encierra el fragmento amplificado desnaturalizado y la sonda de revelado marcada con la peroxidasa a la concentración de 10 ng/µl,
-incubar la mezcla durante una hora a 37ºC con agitación,
-lavar la mezcla que ha reaccionado con una disolución de lavado 10X (Tris 100mM, NaCl 3M, Tween 20 al 1%, pH 7,4),
-detectar la actividad de la peroxidasa unida a la sonda mediante colorimetría en presencia de un sustrato coloreado.
El revelado de la actividad de la peroxidasa presente en la sonda de revelado se puede obtener poniendo en práctica las siguientes etapas:
- -
- depositar 200 µl de una disolución de citrato trisódico 40 mM, 0,03% de H2O al 30%, 7,5 mg/ml de
- ortofenilendiamina (OPD) en cada uno de los pocillos que contienen la mezcla de reacción,
- -
- incubar la microplaca durante 30 min. en la oscuridad y a 37ºC,
- -
- bloquear la reacción mediante la adición de 50 µl/pocillo de una disolución de H2SO4 4N,
- -
- determinar la densidad óptica a una longitud de onda de 492 nm (referencia a 620 nm).
De manera interesante, la sonda de captura utilizada es el oligonucleótido Iag4 y la sonda de revelado es el oligonucleótido Iag3.
De esta forma, los medios permiten la detección cualitativa o cuantitativa de la presencia de bacterias de tipo S. enterica y/o de S. bongori, ya sea una detección no específica en el seno de uno de los grupos I, II, III, IV, V o VI de
S. enterica y de S. bongori.
En condiciones específicas de realización de la etapa de detección, tal como se exponen en el ejemplo I, los cebadores SS2, SS28 y la sonda SS40 permiten por el contrario la detección específica de bacterias del grupo I de
S. enterica.
Otras características y ventajas de la invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de los ejemplos siguientes y en las figuras:
Figura 1: Secuencia de nucleótido de un fragmento de ADN de 2,4 kb de la región de invasión de Salmonella ser. typhi.
Están subrayados los sitios potenciales de unión al ribosoma.
Figura 2: Porcentaje de la actividad obtenida con diferentes cepas de Salmonella que pertenecen a diferentes serovariedades mediante hibridación intercalada ("sándwich").
Serovariedades de los diferentes aislados de Salmonella ensayados:
a: S. enterica subespecie enterica (I), ref.: C53
b: S. enterica subespecie salamae (II), ref.: 975-71
c: S. enterica subespecie salamae (II), ref.: 3975-83
d: S. enterica subespecie arizonae (IIIa), ref.: 1600 K
e: S. enterica subespecie arizonae (IIIa), ref.: So 20-20
f: S. enterica subespecie diarizonae (II), ref.: 5250-85
g: S. enterica subespecie diarizonae (IIIb), ref.: 8013-93
h: S. enterica subespecie houtenae (IV), ref.: 1357-73
i: S. bongori, ref.: 2790-79
k: S. enterica subespecie indica (VI), ref.: 4355-84 -7, 6, 5, 4, y 3: log (cantidad de las moléculas de ADN).
Figura 3: Alineación de las secuencias de los fragmentos amplificados (nucleótidos 1345 a 1644) de los 6 grupos de salmonelas.
Figura 4: Amplificación gracias a los cebadores Iag5 e Iag6 en dos representantes de cada uno de los grupos de salmonelas.
Figura 5: Autorradiografía de la transferencia Southern de los productos amplificados de las salmonelas.
Figura 6: Determinación del número mínimo de moléculas de ADN cromosómico que se puede detectar. Autorradiografía de la transferencia Southern e hibridación sobre microplaca.
Figura 7: Localización de los oligonucleótidos seleccionados en el seno del gen IagA.
Clonación y secuenciación del fragmento de ADN de 2,4 kb
Este fragmento de ADN se ha subclonado utilizando un fragmento de restricción obtenido mediante corte con las enzimas HindIII, a partir de la secuencia HindIII de 7,9 kb descrita en la publicación de Popoff y Dion, 1990, en derivados del vector m13 (Messing y Vieira, 1982).
Después de la realización de esta clonación, se pone en práctica el método de la terminación de cadena didesoxi utilizando la ADN polimerasa de T7 modificada (Sequenase, USB Corp.) y oligonucleótidos sintéticos universales como cebadores. Todos los extremos de los fragmentos de restricción utilizados se superponían entre sí. La secuenciación del ADN se ha realizado por lo menos 2 veces en cada una de las hebras. La secuencia de nucleótidos se ha analizado utilizando el programa de Lipan y Pearson, 1985.
Como muestra la secuencia presentada en la figura 1, están contenidos dos marcos de lectura abiertos en el fragmento secuenciado; se designan mediante los términos iagA (abreviatura de "invasion associate gene") e iagB. Los dos marcos de lectura abiertos se transcriben en la misma orientación. Se supone que el primer codón ATG (pb 97) de la fase abierta de lectura de iagA, que está precedido por la secuencia 5’-AGAGA-3’, se corresponde con el sitio de iniciación de la traducción del gen iagA. El gen iagA codifica para un polipéptido que incluye 553 residuos de aminoácidos con un peso molecular calculado de 63.026 Da. Se ha detectado una homología significativa entre el dominio N-terminal de la proteína IagA y el dominio correspondiente a la proteína de regulación de la transcripción PhoB (24% de identidad y 52% de similitud para una superposición de 108 aminoácidos) y la proteína PhoP (25% de identidad y 69% de similitud para 100 aminoácidos alineados) de E. coli. El codón de iniciación ATG del gen iagB (pb 1776) está precedido asimismo por un sitio potencial de unión al ribosoma (5’-AGGAAG-3’). El gen iagB codifica para un polipéptido que incluye 160 aminoácidos y que tiene un peso molecular calculado de 18.369 Da. La comparación de la secuencia de la proteína IagB con las secuencias traducidas contenidas en el banco de datos Genbank ha demostrado una homología significativa con la proteína IpgF (43% de identidad y 66% de similitud para 151 aminoácidos alineados).
La proteína IpgF está codificada por el gen ipgF que está situado sobre el plásmido asociado a la virulencia de Shigella flexneri, en el extremo 5’ del locus mxi-spa (Allaoui et al, 1993).
Las proteínas puestas en evidencia de Salmonella enterica subespecie enterica serovariedad Typhi tendrían, por tanto, un papel en la infección por estas bacterias, y en particular en la adhesión y la penetración en las células.
Detección específica de S. Enterica del grupo I
Se ha desarrollado un protocolo de detección de las subespecies de Salmonella mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se ha definido un par de oligonucleótidos utilizados como cebador para amplificar un fragmento de 93 pb de un gen requerido para la invasión de las células HeLa por S. typhi, cepa Ty2. Se ha analizado el producto de amplificación mediante una hibridación no radiactiva intercalada sobre placas de microtitulación utilizando dos oligonucleótidos diferentes según el procedimiento descrito por Chevrier et al, 1993, Mol. Cell. Probes 7, 187-197. El oligonucleótido de captura se ha fosforilado en su extremo 5’ y se ha unido de manera covalente a pocillos que llevan grupos aminados de una placa de microtitulación. El oligonucleótido de detección se ha aminado en su extremo 5’ y después se ha marcado con un éster de biotinil-N-hidroxisuccinimida. Tras la hibridación, las moléculas híbridas han sido detectadas mediante avidina conjugada con fosfatasa alcalina y con un sustrato cromógeno. Este método requiere solamente la utilización de un ciclador térmico y de un lector de microtitulación convencional y puede ponerse en práctica a gran escala.
Materiales y métodos
Cepas bacterianas
En este estudio se han utilizado doscientos veintiocho aislados clínicos (tabla 1) incluyendo S. bongori (Sambrook et al, 1989, Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), S. enterica subespecie I (116), II (56), IIIa (11), IIIb (30), IV(5) y VI(5) y 16 cepas de enterobacterias no salmonelas (tabla 2) que representan 9 géneros diferentes. La cepa C53 de S. ser. typhimurium se ha utilizado como control positivo y la cepa HB101 de E. coli se ha utilizado como control negativo en las pruebas de PCR.
Extracción del ADN
Se han cultivado las cepas en un medio LB a 37ºC. Con el fin de proceder a la extracción rápida del ADN, se han centrifugado 2 ml del cultivo mantenido durante toda la noche y se han resuspendido en 1 ml de TE (tampón Tris-HCl 10 mM a pH 8 que contiene EDTA 1 mM). Se han centrifugado las células, se ha resuspendido el residuo de centrifugación en 500 µl de agua destilada estéril y se ha calentado a 100ºC durante 10 minutos. Por último, se ha centrifugado la disolución y se ha conservado el sobrenadante para experimentos con PCR.
Cebadores oligonucleotídicos y sondas
Los oligonucleótidos se han sintetizado en un sintetizador de ADN de tipo ciclón (Millipore-Waters) utilizando la tecnología de fosforamidita.
Las secuencias de los cebadores de oligonucleótidos fueron las siguientes:
SS2: 5’-CCGGGCAGATGATACCC-3’ y
SS28: 5’-TAATGCTTTCCTGGTGC-3’.
La sonda oligonucleotídica de captura SS40: 5’-CCCGAACTATCTCGATCTGTACAATATTATCATT-3’ se ha fosforilado en su extremo 5’ con la polinucleótido cinasa de T4 (Boehringer) según la descripción hecha por Sambrooket al, 1989, (Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). La sonda de detección octadecanucleotídica SS41 (5’-GCAGGTGATAACCTTTAA-3’) se ha sintetizado con una función amino en su extremo 5’ utilizando el método de la fosforamidita en fase sólida en un sintetizador de ADN Applied Biosystem 380B y después se ha marcado con el éster de N-hidroxisuccinimida-ácido D-biotinil-Σ-aminocaproico (Boehringer) según la descripción hecha por Tham et al, 1990, (FEMS Microbiol. Lett. 69, 109-116). Se han purificado tanto los oligonucleótidos de captura como de detección sobre una columna de desalación rápida HR 10/10 con el sistema FPLC (Pharmacia).
Experimentos de PCR
Las reacciones de amplificación se han realizado en un volumen total de 100 µl en un tampón Tris-HCl 50 mM pH 8,5, que contiene MgCl2 4 mM, 100 µg/ml de albúmina sérica bovina, 1 µM de cada cebador, 200 µM de cada dNTP y 1 U de Taq ADN polimerasa (Amersham). La mezcla de amplificación se ha recubierto con 100 µl de aceite mineral y se ha sometido a 10 ciclos de amplificación según la siguiente descripción: las muestras se han incubado a 94ºC durante 10 segundos para desnaturalizar el ADN, a 60ºC durante 10 segundos para aparear los cebadores al ADN y a 72ºC durante 30 segundos para realizar la reacción de extensión de los cebadores apareados, a lo que le siguen 30 ciclos según el protocolo siguiente: desnaturalización a 87ºC durante 10 segundos, apareamiento a 60ºC durante 10 segundos y extensión a 72ºC durante 30 segundos. Los ciclos térmicos se han realizado en un conjunto calentador programable (Thermal reactor Hybaid, RU).
Los experimentos de PCR se han realizado con 5 µl de disolución de ADN. Cada experimento incluía controles negativos (5 µl de tampón TE) para cada grupo de 10 muestras y al final de cada serie.
Pruebas de hibridación intercalada sobre bandas CovaLink NH®
Chevrier et al (1993, Mol. Cell. Probes 7, 187-197) ya han descrito dos protocolos de hibridación no radiactiva sobre bandas CovaLink NH®. En el presente caso, se ha utilizado una técnica de hibridación intercalada en la medida en que permitía una mejor sensibilidad de la detección. La reacción se ha realizado sobre micropocillos recubiertos por el oligonucleótido SS40 utilizando un procedimiento de enlace covalente tal como describen detalladamente Chevrier et al o Rasmussen, S.R. et al (1991, Anal. Biochem. 198, 138-142).
El fragmento de ADN sometido a la reacción de PCR se ha desnaturalizado directamente en los pocillos añadiendo de manera secuencial 95 µl de agua destilada, 5 µl de muestra de PCR, 40 µl de sonda de detección y 14 µl de NaOH 1 N por pocillo. Después de 10 minutos, se ha efectuado la neutralización añadiendo 21 µl de NaH2PO4 1 M que contenían el 1% de sarcosilo. Todas las muestras se han realizado por duplicado. Después de la neutralización, la banda se ha depositado sobre una superficie metálica y se ha mantenido en una estufa durante la noche a 40ºC. La concentración final de la sonda de detección biotinilada SS41 era de 0,5 nM. Durante la incubación en la estufa, se prefiere no dejar los pocillos no utilizados vacíos, sino rellenarlos con agua de manera que se obtengan intercambios térmicos homogéneos. Los micropocillos se han lavado 5 veces a temperatura ambiente con TBS-Tw (NaCl 0,15 M, tampón Tris HCl 10 mM a pH 8, 1% de Tween 20). Se han añadido por pocillo 100 µl de conjugado fosfatasa alcalina-extravidina (Sigma) diluidos a 1 µg/ml en TBS-Tw que contiene 1% de albúmina sérica bovina. Después, se ha incubado la banda a temperatura ambiente durante 1 hora, se ha lavado 5 veces con TBS-Tw y por último se han añadido 200 µl de dietanolamina 1M a pH 9,8 que contiene 1 mM de MgCl2 y 1 mM de paranitrofenilfosfato. La reacción de la enzima se ha llevado a cabo durante 30 minutos a 2 horas. Se ha medido la absorbancia a 405 nm utilizando un lector de microplaca (Dynatech). Se ha considerado que la señal obtenida con la disolución habitual del fragmento de ADN amplificado (800 fm/pocillo) de S. ser. typhimurium cepa C53 representa el 100% y se ha utilizado como referencia para cada prueba de hibridación. Los valores de los blancos corresponden a la absorbancia media medida en pocillos recubiertos por el oligonucleótido SS40 incubado solamente con 0,5 nM de sonda oligonucleotídica SS41 biotinilada.
Resultados
Optimización del método
Los cebadores y las sondas se han elegido en la secuencia iagA. Se han ensayado diferentes pares de cebadores para optimizar la técnica de hibridación intercalada sobre microplacas CovaLink. El par de cebadores elegido (SS2 y SS28) permite la amplificación específica de la región de 93 pb del ADN genómico de Salmonella. Utilizando este par de cebadores, se ha puesto en evidencia que una concentración estándar de MgCl2 (1,5-2 mM) conduce a un resultado de amplificación relativamente no interesante y que una concentración de 4 mM en MgCl2 era necesaria para obtener una amplificación eficaz. Se han utilizado oligonucleótidos internos, SS40 y SS41, en una prueba de hibridación no radiactiva a modo de sonda de captura y de sonda de detección respectivamente.
Especificidad de la técnica
La especificidad del método para la detección de las salmonelas se ha evaluado con 228 cepas de Salmonella (tabla 1) y 16 cepas de bacterias heterólogas (tabla 2). Los resultados se resumen en la tabla 3. Edwardsiella tarda, Klebsiella pneumoniae, especies de Enterobacter y Acinetobacter, Pasteurella, Vibrio harveyi, Serratia marcescens y de manera más importante especies de Citrobacter y todas las E. coli han dado una señal de hibridación inferior al 20%. Basándose en este valor, se ha concluido que todas las cepas de Salmonella que pertenecen a la subespecie I se podían detectar mediante el presente método. Además, solamente una cepa (cepa 3975-83) de las 56 cepas de la subespecie II y 3 cepas de las 11 cepas de la subespecie IIIa, dieron una señal positiva. Salmonella bongori y las cepas que pertenecen a las subespecies IIIb, IV y VI no eran detectables.
Nivel de detección de la técnica con las bacterias enteras
Se han realizado diluciones 1/10ª de una suspensión de la cepa C53 de S. ser. typhimurium (de 109 a 10−2 células/ml) para estimar el número mínimo de bacterias que podía detectarse mediante PCR seguida de la técnica de hibridación no radiactiva. El ADN se ha extraído de cada suspensión calibrada, utilizando la técnica de extracción rápida por ebullición. Los resultados obtenidos muestran claramente que la técnica de extracción rápida del ADN mediante la sencilla ebullición de la suspensión antes de la reacción de PCR, es una técnica eficaz. En efecto, permite la detección de solamente una unidad ufc.
Tabla 1 Subespecies de Salmonella utilizadas para evaluar la especificidad de los ensayos de hibridación del ADN Microorganismo probado Nº de aislados Nº de serovar Salmonella enterica subsp enterica I 116 43
serovar Adelaïde Agona Altona Angoda Bardo Blockley Bovismorbificans Braenderup Brandenburg Bredeney Broughton Cerro Chester Coeln Concord Dakar Derby Enteridis Georgia Hadar Heidelberg Ibadan Indiana Infantis Lexington London Mbandaka Montevideo Moscow Ohio Orion Panama Paratyphi B Saintpaul Typhimurium Typhisuis Vaertan Veneziana Vinohrady Virchow Wien Woodinville Yolo
Salmonella enterica subsp salamae II 56 Salmonella enterica subsp arizonae IIIa 11 Salmonella enterica subsp diarizonae IIIb 30 Salmonella enterica subsp houtenae IV 5 Salmonella enterica subsp indica VI 5 Salmonella bongori 5 (inicialmente S. enterica subsp. bongori V)
1 2 1 1 2 1 3 4 1 1 2 1 1 1 1 1 2 28 1 1 4 2 1 5 1 1 1 6 1 1 1 3 2 1 13 1 1 1 1 10 1 1 1 56 29 5 5 5 5
Tabla 2
Bacterias heterólogas utilizadas en la prueba de hibridación del ADN
- Género Escherichia
- Especies Coli Número de aislados 4
- Edwarsiella
- tarda 1
- Citrobacter
- amalonaticus 1
- freundii
- 1
- Klebsiella Enterobacter
- pneumoniae agglomerans asburiae 1 1 1
- hormoechei
- 1
- Pasteurella
- multocida 1
- Acinetobacter
- iwoffii 1
- Vibrio Serratia
- haemolyticus harveyi marcescens 1 1 1
Tabla 3
Cepas clínicas de bacterias y controles probados en un ensayo de hibridación intercalada ("sándwich")
enterica S. S. entericaS. entericaS. entericaS. entericaS. entericaS. bongori NoControl sinsubesp.subesp.subesp.subesp.subesp.subesp. Indica Salmonella ADN Enterica Salamae Arizonae Diarizonae houtenae
Actividad (%)100%-20% 116 13 00 00 00 19% 051 812 44580 > blanco<blanco 0 4 018 1 1 0 723
Total 116 56 11 30 5 5 5 15 23
Hibridación cuantitativa con el ADN genómico purificado
El procedimiento de hibridación no radiactiva utilizado en las pruebas indicadas en la presente memoria se puede utilizar fácilmente en los estudios cuantitativos. Para comparar las señales de hibridación obtenidas con diferentes cepas de Salmonella, el ADN se extrae de 10 cepas que representan las 6 subespecies de Salmonella enterica y la especie Salmonella bongori, y después cantidades calibradas de ADN se han sometido a reacciones de PCR seguidas de una hibridación intercalada. Los resultados se describen en la figura 2. Se ha demostrado que la señal de hibridación obtenida con 107 moléculas de ADN de Salmonella bongori o de las subespecies II, IIIa, IIIb, IV y VI de Salmonella enterica es más débil que la señal de hibridación observada con 103 moléculas de ADN de las cepas de la subespecie I. Sin embargo, es importante destacar que el aislado 3975-83 (subespecie II) ha dado la misma señal de hibridación que las cepas que pertenecen a las subespecies I.
Discusión
La amplificación mediante PCR permite una detección muy sensible de secuencias de ADN específicas. La sensibilidad de la amplificación depende esencialmente del número de copias del ADN diana, de la pureza de la muestra que se debe analizar, del método de extracción del ADN, y de la sensibilidad del método utilizado para detectar los productos de PCR. La visualización de los productos de PCR mediante una coloración con bromuro de etidio en un gel de electroforesis no es compatible con la utilización de forma rutinaria de la técnica y no es lo suficientemente sensible. La sensibilidad se puede mejorar mediante la utilización de la PCR doble o de sondas de ADN con una hibridación en transferencia Dot o Southern. Sin embargo, la PCR doble es muy sensible a la contaminación por ADN y las técnicas de hibridación con transferencia Dot o Southern no son apropiadas para la automatización. Por tanto, la hibridación sobre microplaca ofrece una técnica apropiada para la detección y la cuantificación de fragmentos amplificados mediante PCR. El enlace covalente simple de los ácidos nucleicos a micropocillos representa una variante interesante para la adsorción pasiva y una mejora importante para la detección de fragmentos amplificados por PCR sobre micropocillos.
Es conocido que las cepas de Salmonella que provocan infecciones en el ser humano pertenecen esencialmente a la subespecie I. En efecto, más del 95% de los aislados clínicos en el ser humano pertenecen a esta subespecie (Rowe, B., 1987, Salmonella surveillance. Reports received from centers participating in the WHO programme. World Health Organization London). Además, en 1991, el "Centre national d'Etudes Vétérinaires et Alimentaires" de París (Francia) informaba [Corbion, B. et al, 1991, Inventory of Salmonella] que en los años anteriores, la mayoría de las cepas aisladas en animales en la alimentación o en el medio ambiente en 1988 y 1989 (es decir, 18832 cepas) pertenecen a la subespecie I (99,2%).
Los resultados indicados en la presente memoria han permitido definir un método basado en la amplificación mediante PCR para la detección de cepas patogénicas de Salmonella. Un par de cebadores, SS2 y SS28, y un par de sondas, SS40 y SS41, se han seleccionado a partir de un gen necesario para la invasión de las células HeLa por Salmonella ser. typhi cepa Ty2. Utilizando la combinación entre la técnica de PCR y la hibridación intercalada no radiactiva sobre microplaca, se han detectado todas las Salmonella de la subespecie I.
El límite de detección era inferior a un umbral representado por 10 células por tubo de PCR, lo cual está de acuerdo con los resultados obtenidos por otras técnicas de PCR similares. Dado el parentesco de los ácidos nucleicos entre los miembros de las enterobacterias, era importante controlar la especificidad de estos nuevos cebadores y sondas con los géneros de enterobacterias más susceptibles de conducir a reacciones de tipo "falso positivo". A partir de los resultados obtenidos, se puede concluir que no puede tener lugar ninguna reacción de falso positivo cuando se siguen las condiciones de PCR y de hibridación descritas anteriormente.
Es interesante observar que la cepa Salmonella 3975-83 (subespecie II) presentaba una señal de hibridación idéntica a la obtenida con los aislados que pertenecen a la subespecie I. Esta cepa se aisló en 1983 a partir de las heces de un paciente humano en Gran Bretaña. Basándose en las características bioquímicas, esta nueva serovariedad se ha clasificado en la subespecie II pero se ha considerado como una cepa atípica ya que no se ha detectado su presencia en la gelatinasa (Le Minor, L. et al, 1984, Supplement No. XXVII, 1983, to Kauffmann-White Scheme, Ann. Microbiol. (Institut Pasteur) 135 B, 45-51). A la luz de los resultados indicados en la presente memoria, la posición taxonómica de la cepa 3975-83 debería estudiarse de nuevo utilizando la técnica de hibridación ADN-ADN.
Los datos presentados en la presente memoria indican que el método de hibridación basado en la utilización de un gen necesario para la invasión de las células HeLa por Salmonella ser. typhi cepa Ty2 puede distinguir las cepas de la subespecie I de las Salmonella de las otras bacterias entéricas, incluida E. coli. La hibridación no radiactiva sobre una microplaca Covalink NH es sensible y apropiada para el análisis de un gran número de muestras.
Detección del ADN de salmonella amplificado mediante hibridación intercalada Secuencia de los oligonucleótidos Los fragmentos de ADN elegidos son los siguientes (véase la posición en la secuencia de la figura 1):
- Parte C-terminal
- posición
- Iag1: 5’-TA TTA AGT ATG CAG GTT ATG -3’
- 1424-1443
- Iag2: 5’-AGA GAA TTT CTG GAA AGT GAA-3 ’
- 1585-1605
- Iag3: 5’-ATATCCACGCAGGAAATAACAGGACTT -3’
- 1495-1521
- Iag4: 5’-GAG CGT GCC TTA CCG ACG ATA-3’
- 1564-1584
- Iag5: 5’-GCA GGG ATC ACT AAG CTG TG-3’
- 1318-1337
- Iag6: 5’-CGT GGG CAA CCA GCA CTA ACG-3’
- 1637-1657
- Slm1: 5’-CG GGT TAA AGG TTA TCA CCT-3’
- 709-728
- Slm2: 5’-AG CAT GGC GCA AAT GGG-3’
- 1014-1031
Slm3: 5’-GCA CCA GGA AAG CAT TAA GTT GAT AGAACA C-3’ 732-762 Slm4: 5’-CTT CGC TGG GAC ACA AAG CA-3’ 823-842
Preferentemente, el par de cebadores Iag5 (sentido) e Iag6 (antisentido) dirige la amplificación de un fragmento de 340 pb, el par Slm1 (sentido) y Slm2 (antisentido) dirige la amplificación de un fragmento de 323 pb (figura 3).
La figura 4 muestra la eficacia de la amplificación del par de cebadores Iag5 e Iag6 sobre 2 representantes de cada uno de los grupos de salmonelas.
Procedimiento de detección
Se ha utilizado un formato de detección mediante hibridación intercalada.
Se hibridan dos oligonucleótidos simultáneamente al fragmento amplificado desnaturalizado. Uno de ellos denominado sonda de captura se fija de manera pasiva (pero también puede fijarse de manera covalente) a la superficie de un pocillo de placa de microtitulación de 96 pocillos. El otro, denominado sonda de revelado, está marcado por un elemento fácil de poner en evidencia. La sonda de revelado está libre en el tampón de hibridación.
Las sondas de captura y de revelado son complementarias de 2 regiones diferentes situadas en el interior del fragmento amplificado.
La sonda de detección en este caso se une a un marcador enzimático, en particular una peroxidasa y va a servir de sonda de revelado. Es el caso preferentemente de los oligonucleótidos Iag3 y Slm3. Pueden fijarse otros oligonucleótidos a un soporte sólido de tipo microplaca, un soporte particulado o membranario y servir como sonda de captura, particularmente para los oligonucleótidos Iag4 y Slm4.
Condiciones experimentales
1) Preparación del ADN de las salmonelas
Mediante el método de ebullición en presencia de Chelex (Chelex 6%, SDS 0,1%, NP40 1%, Tween 20 1%), se obtienen las secuencias de ADN. Este reactivo está comercializado por Biorad y se utiliza según el protocolo del fabricante (ref. Walsh et al. 1991. BioTechniques 10: 506-513).
2) Amplificación
Según el método inicialmente descrito por Saiki y tal como se expone por ejemplo en la patente europea EP 0 201 184.
La PCR se realiza utilizando la siguiente mezcla de reacción:
KCl 50 mM Tris-HCl 10mM pH 8,3 MgCl2 1,5 mM desoxirribonucleótidos (dCTP, dATP, dGTP) 125 µM 250 µM de UTP 25 pmoles de cada uno de los cebadores 10 ngde ADN
1 unidad de Uracilo N Glucosilasa
1 unidad de Taq polimerasa.
La mezcla de reacción se ha realizado utilizando 10 µl de la disolución que contiene el ADN que se va a simplificar
con un volumen de 100 µl. El dUTP y la UNG se han utilizado en sistema de descontaminación (Brevet Life
Technologies European Patent Application 0 401 037). El termociclador utilizado es el 9600 de Perkin Elmer.
Después de una incubación a 50ºC durante 2 minutos para permitir la acción de la UNG y una desnaturalización a
95ºC durante 5 minutos, los ciclos de temperaturas utilizados son los siguientes:
-5 ciclos (95ºC durante 15 segundos, 50ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 15 segundos)
-35 ciclos (95ºC durante 15 segundos, 57ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 15 segundos)
3) Visualización de la reacción de amplificación
3-1) Marcado de la sonda de revelado
Las sondas se marcan con peroxidasa de rábano picante (ref. PCR protocols: a guide to methods and application;
Academic press (1990), 15, p4513-4534) y se revela la actividad de la enzima mediante colorimetría.
3-2) Gel de agarosa coloreado con BET e hibridación sobre membrana
Después de la amplificación, se depositan 10 µl del producto de amplificación sobre gel de agarosa y se transfiere el
ADN sobre membrana según las técnica clásicas (Maniatis). La membrana se hibrida previamente durante 30
minutos a 68ºC en tampón de hibridación (10X Denhart, 6X SSC, 0,1% de SDS) y después se hibrida a 42ºC
durante 3 horas con 60 ng de sonda por ml de tampón de hibridación.
Después se realiza un lavado según las siguientes etapas:
-2 veces durante 10 minutos en 2 X SSC -0,1% de SDS a temperatura ambiente,
-1 vez durante 30 minutos en 0,1 X SSC -0,1% de SDS a 42ºC,
-2 veces durante 10 minutos en 2 X SSC a temperatura ambiente.
Revelado: la membrana se escurre entre dos hojas de papel absorbente (papel Whatman 3MM) y se pone en un
recipiente limpio y seco.
El reactivo de detección Amersham (reactivo de detección ECL RPN 2105) se prepara extemporáneamente volumen
a volumen; 30 ml de volumen total para una membrana de 5 x 8 cm. Se obtiene un casete para autorradiografía
fijando una hoja de papel absorbente (papel Whatman 3MM) en el fondo. Todas estas etapas pueden realizarse con
luz. Después en cuarto oscuro.
Se baña la membrana en el reactivo de detección durante 1 minuto, el lado del ADN hacia arriba, se escurre
rápidamente la membrana, se coloca en el casete, el lado del ADN hacia arriba, se pone encima una hoja de plástico
transparente (si no la membrana se pega sobre la película) y se coloca una película radiográfica por encima (película
X-OMAT KODAK).
La exposición se realiza durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se revela la película mediante las
técnicas de revelado clásico (revelador, agua, fijador).
3-3) Microplaca
3-3-1) Recubrimiento del oligonucleótido de captura
Se puede realizar mediante adsorción (Cook et al, NAR, 16: 4077-4095 (1988) o acoplamiento covalente
(Rasmussen, S.R. et al, 1991. Analytical Biochemistry 198, 138-142).
3-3-2) Hibridación en microplaca y lectura
Se han desnaturalizado 10 µl del producto de amplificación mediante la adición volumen a volumen de una
disolución de NaOH 200 mM, EDTA 40 mM.
Se han hibridado anteriormente las microplacas de las que la superficie de los pocillos está revestida con la sonda
de captura, en un tampón de hibridación que contiene 10X Denhart, 6X SSC, SDS al 0,1%.
Después se ha vaciado la microplaca y cada uno de los pocillos ha recibido 200 µl de tampón de hibridación que
contiene el fragmento amplificado desnaturalizado y la sonda de revelado a la concentración de 10 ng/µl. La
incubación ha tenido lugar durante una hora a 37ºC y con agitación.
Después del lavado (disolución de lavado 10X: Tris 100 mM, NaCl 3M, 1% de Tween 20, pH 7,4), se ha detectado la actividad de la peroxidasa unida a la sonda mediante colorimetría en presencia de un sustrato coloreado.
5 Para ello, se han distribuido 200 µl de una disolución de citrato trisódico 40 mM, 0,03% de H2O al 30%, 7,5 mg/ml de ortofenilendiamina (OPD) en cada uno de los pocillos. Se ha incubado la microplaca durante 30 minutos en oscuridad y a 37ºC. Se han añadido 50 µl/pocillo de una disolución de H2SO4 4N para bloquear la reacción.
10 Se ha determinado la densidad óptica a una longitud de onda de 492 nm (referencia en 620 nm).
4) Secuenciación de los productos de PCR y alineación manual de las secuencias.
Según las técnicas clásicas, utilizando por ejemplo un autómata "373 DNA sequencer" de Applied Biosystem y el kit 15 "dye terminator" de Applied.
Resultados
El modelo ejemplificado es preferentemente el siguiente sistema de oligonucleótidos:
20 Iag5 cebador sentido-Iag6 cebador antisentido Iag3 sonda de revelado e Iag4 sonda de captura.
(se debe observar que Iag4 también puede marcarse y utilizarse como sonda de revelado). 25 Estudio de especificidad
Se ha realizado sobre el conjunto de las cepas bacterianas enumeradas en las tablas 4 y 5.
30 La amplificación del ADN extraído de las 45 cepas de salmonelas probadas ha generado un fragmento del tamaño esperado (véase la figura 5). Se han hibridado las transferencias Southern del conjunto de los productos amplificados con la sonda oligonucleotídica interna Iag 3 marcada con peroxidasa. Ninguna de las cepas no salmonelas ha dado lugar a una hibridación con una sonda peroxidasa realizada sobre membrana según el protocolo descrito anteriormente.
35 Se han ensayado los mismos productos de amplificación en formato de microplaca.
El corte se fija arbitrariamente en 0,050. Todos los representantes de cada uno de los grupos de salmonelas dan un valor de densidad óptica superior a 0,050 (tabla 6). 40 Sensibilidad
Para determinar el número mínimo de moléculas de ADN cromosómico de salmonelas que se pueden detectar, se ha amplificado una gama de dilución de ADN cromosómico purificado. Son visibles 5 moléculas en la 45 autorradiografía de transferencia Southern y se detectan mediante hibridación en microplaca: el valor obtenido en colorimetría es superior al corte (figura 6).
Los oligonucleótidos seleccionados para la realización de este ejemplo se han localizado en la secuencia del gen IagA (figura 7). 50 Tabla 4
- CEPAS DE SALMONELAS ESTUDIADAS
- N˚
- Cepas Serotipo Grupo
- 1
- Salmonella Marseille I
- 2
- Salmonella Nyanza I
- 3
- Salmonella Poona I
- 4
- Salmonella Kampala I
- 5
- Salmonella Taksony I
- 6
- Salmonella Teshie I
- 7
- Salmonella Indiana I
- 8
- Salmonella enteritidis I
- 9
- Salmonella Kentucky I
- 10
- Salmonella Napoli I
Tabla 4 (continuación)
- CEPAS DE SALMONELAS ESTUDIADAS
- N˚
- Cepas Serotipo Grupo
- 11
- 841 11:a:d:en 215 II
- 12
- 1703 K 41: 2: 15 II
- 13
- 950-7143:d:z39 II
- 14
- 10-65 44 : 24, 223 : II
- 15
- 3209-81 45: z 23 II
- 16
- 5331 / 86 62: z 29 : - IIIa
- 17
- 3064-4 / 252 41: k : - IIIa
- 18
- 594-54 38: z 54: - IIIa
- 19
- 1694 cdai 426 63: z 4, z32: - IIIa
- 20
- So 50 / 16 62: f, z 51: - IIIa
- 21
- 5251-85 58: r : z 53 IIIb
- 22
- 1758-76 6,14 : z 10 : enx 215 IIIb
- 23
- 453-68 16 : liv : z53 IIIb
- 24
- 4305-57 16 : li(v) : z 35 IIIb
- 25
- 1698-75 11 : liv : z IIIb
- 26
- 8275-94 47 : r : enx 215 IIIb
- 27
- 8283-94 53 : z 10 : z IIIb
- 28
- cdc 456-5 / 93 40 : i : 1, 5, 7 IIIb
- 29
- 8284-94 60: i : z IIIb
- 30
- 1693 K 38 : k : z 55 IIIb
- 31
- 1707 48 : f: z 51 : IV
- 32
- 7231 / 89 45 : z 36. z 38 IV
- 33
- 6887 / 60 48 : f, z 51 : IV
- 34
- 1357 /73 43 : z4, z 24 : IV
- 35
- 1550 K 16 :z 4, z 23 : IV
- 36
- Salmonella Bongor 261 -66 48 : z35 : V
- 37
- Salmonella Camdeni 2022 -77 44 : r : V
- 38
- 4985 -85 48 : z 39 : V
- 39
- 7688 -9166 : z 39 : V
- 40
- 1387 -7340 : a : V
- 41
- 1941 -77 6.7 : z 41: 1,7 VI
- 42
- · 1449 K45 : a enx VI
- 43
- 4355 · 84 1,6. 14,25 : a :e,n,x VI
- 44
- 1711 K 11 : b: enx VI
- 45
- 1688 K 1,6. 14,25 : Z 10 : 1,12,7 VI
Tabla 5
- CEPAS NO SALMONELAS
- N˚
- Nombre Identificación
- 1
- Klebsiella oxytoca 0059 SDP
- 2
- Klebsiella pneumoniae 0054 SDP
- 3
- Acinetobacter baumanii 0033 SDP
- 4
- Proteus mirabilis RP402
- 5
- Serratia marcescens 0042 SDP
- 6
- Enterobacter agglomerans 0067 SDP
- 7
- Citrobacter diversus 0068 SDP
- 8
- Pseudomonas aeruginosa 0011 SDP
- 9
- Enterobacter aerogenes 0066 SDP
- 10
- Escherichia coli 0131 SDP
- 11
- Enterocoque faecalis 76117
- 12
- Proteus mirabilis AP03
- 13
- Enterocoque faecalis 76117
- 14
- Enterobacter cloacae 0060 SDP
- 15
- Mycobacterium avium 6
- 16
- Mycobacterium tuberculosis H 37 RV
- 17
- Listeria monocytogenes 1/2 LG3
Tabla 6
- DETECCIÓN EN MICROPLACA
- MUESTRAS
- DO a 420 nm
- 2 Nyanza gpe I
- 3,029
- 3 Poona gpe I
- 3,103
- 11 gpe II
- 3,155
- 12 gpe II
- 0,751
- 18 gpe III a
- 3,139
- 20 gpe III a
- 3,068
- 21 gpe III b
- 3,161
- 30 gpe III b
- 3,201
- 31 gpe IV
- 0,272
- 35 gpe IV
- 0,527
- 36 gpe V
- 1,868
- 40 gpe V
- 3,347
- 45 gpe VI
- 0,900
- Klebsiella oxytoca
- 0,022
- Klebsiella pneumoniae
- 0,017
- Acinetobacter baumanii
- 0,024
- Proteus mirabilis
- 0,019
- Serratia marcescens
- 0,019
- Enterobacter agglomerans
- 0,023
- Mycobacterium avium n˚ 6
- 0,025
- Mycobacterium tuberculosis H 37 RV
- 0,020
- Listeria monocytogenes 1/2 LG3
- 0,015
- Control de agua
- 0,018
- Control de agua
- 0,022
5
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
(i) SOLICITANTE: INSTITUT PASTEUR
INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE 10 (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: OLIGONUCLEÓTIDOS PARA LA DETECCIÓN DE SALMONELA
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 29
(iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
- (A)
- DIRECCIÓN: ERNEST GUTMANN -YVES PLASSERAUD S.A. 15 (B) CALLE: 3 rue Chauveau-Lagarde
- (C)
- CIUDAD: PARIS
- (D)
- ESTADO:
- (E)
- PAÍS: FRANCE
- (F)
- CP: 75008 20
(v) MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
(A) TIPO DE MEDIO: Disquete
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM 25 (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
(vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
30 (A) NÚMERO DE SOLICITUD: xxxxxxxxxxxx
- (B)
- FECHA PRESENTACIÓN: 15-ENE-1996
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: 35
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: FR 9500410
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 16-ENE-1995
(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 96 400 098.8
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-ENE-1996
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 2406 pares de bases
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO FILAMENTO: doble
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: SALMONELLA SER. TYPHI
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 97..1755
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /product= "iagA"
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1776..2255
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /product= "iagB"
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 1:
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 9: CGTGGGCAAC CAGCACTAAC G 21
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 10: CGGGTTAAAG GTTATCACCT 20
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 11:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 11: AGCATGGCGC AAATGGG 17
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 12:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 12: GCACCAGGAA AGCATTAAGT TGATAGAACA C 31
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 13:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 13: CTTCGCTGGG ACACAAAGCA 20
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 14:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 14: TAATGCTTTC CTGGTGC 17
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 15:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 15: TACGGCATGG GCTGATTGCT 20
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 16:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 16: TTACGCTATC GCCCAGCAGC AGGA 24
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 17:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 17: TGGTCATAAC CGAGATGGTT CAAACGATC 29
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 18:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 18:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 22:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:
- 5
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) LONGITUD: 553 aminoácidos
- (B) TIPO: aminoácido (D) TIPOLOGÍA: lineal
- 10
- (ii) TIPO MOLECULAR: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 2:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3
- 5
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) LONGITUD: 160 aminoácidos
- (B) TIPO: aminoácido (D) TIPOLOGÍA: lineal
- 10
- (ii) TIPO MOLECULAR: proteína
- (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 3:
- 15
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- 20
- (A) LONGITUD: 20 pares de bases
- (B) TIPO: ácido nucleico
- (C) TIPO FILAMENTO: sencillo (D) TIPOLOGÍA: lineal
- (ii) TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 4:
- TATTAAGTAT GCAGGTTATG
- 20
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO FILAMENTO: sencillo (D) TIPOLOGÍA: lineal
- (ii) TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 5:
- AGAGAATTTC TGCAAAGTGA A
- 21
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6:
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO FILAMENTO: sencillo (D) TIPOLOGÍA: lineal
- (ii) TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 6:
- ATATCCACGC AGGAAATAAC AGGACTT
- 27
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7:
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO FILAMENTO: sencillo (D) TIPOLOGÍA: lineal
- (ii) TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 7:
- GAGCGTGCCT TACCGACGAT A
- 21
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8:
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO FILAMENTO: sencillo (D) TIPOLOGÍA: lineal
- (ii) TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 8:
- GCAGGGATCA CTAAGCTGTG
- 20
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9:
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) LONGITUD: 21 pares de bases
- ACAGTTGTTA CAGGATCCCT
- 20
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 19:
- 5
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) LONGITUD: 17 pares de bases
- (B) TIPO: ácido nucleico
- 10
- (C) TIPO FILAMENTO: sencillo
- (D) TIPOLOGÍA: lineal
- (ii) TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 19:
- 15
- CCGGGCAGAT GATACCC
- 17
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 20:
- 20
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) LONGITUD: 300 pares de bases
- (B) TIPO: ácido nucleico
- 25
- (C) TIPO FILAMENTO: doble (D) TIPOLOGÍA: lineal
- (ii) TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
- (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 20:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 21:
- 35
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) LONGITUD: 300 pares de bases
- (B) TIPO: ácido nucleico
- 40
- (C) TIPO FILAMENTO: doble (D) TIPOLOGÍA: lineal
- (ii) TIPO MOLECULAR: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 21:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 300 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO FILAMENTO: doble
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico) 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 22:
- 15
- (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 23:
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) LONGITUD: 300 pares de bases
- 20
- (B) TIPO: ácido nucleico
- (C) TIPO FILAMENTO: doble
- (D) TIPOLOGÍA: lineal
- 25
- (ii) TIPO MOLECULAR: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 23:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 24:
- 30
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) LONGITUD: 300 pares de bases
- (B) TIPO: ácido nucleico
- 35
- (C) TIPO FILAMENTO: doble (D) TIPOLOGÍA: lineal
- (ii) TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
- (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 24:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 25:
- 5
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) LONGITUD: 300 pares de bases
- (B) TIPO: ácido nucleico
- 10
- (C) TIPO FILAMENTO: doble (D) TIPOLOGÍA: lineal
- (ii) TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
- (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 25:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 26:
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- 20
- (A) LONGITUD: 300 pares de bases
- (B) TIPO: ácido nucleico
- (C) TIPO FILAMENTO: doble (D) TIPOLOGÍA: lineal
- 25
- (ii) TIPO MOLECULAR: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 26:
- 30
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 27:
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- 35
- (A) LONGITUD: 300 pares de bases
- (B) TIPO: ácido nucleico
- (C) TIPO FILAMENTO: doble
- (D) TIPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 27:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 28:
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- 10
- (A) LONGITUD: 34 pares de bases
- (B) TIPO: ácido nucleico
- (C) TIPO FILAMENTO: doble (D) TIPOLOGÍA: lineal
- 15
- (ii) TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 28:
- CCCGAACTAT CTCGATCTGT ACAATATTAT CATT
- 34
- 20
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 29:
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- 25
- (A) LONGITUD: 18 pares de bases
- (B) TIPO: ácido nucleico
- (C) TIPO FILAMENTO: doble (D) TIPOLOGÍA: lineal
- 30
- (ii) TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 29:
- GCAGGTGATT ACCTTTAA
- 18
- 35
Claims (6)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Par de cebadores oligonucleotídicos caracterizado porque consiste en dos oligonucleótidos de por lo menos 9 nucleótidos que hibridan en condiciones astringentes con la secuencia nucleotídica que corresponde a la parte C-terminal del gen iagA definda entre las posiciones 1318 y 1755 de la secuencia iagA representada en la figura 1, siendo dicho par capaz de amplificar una secuencia de ADN o de ADNc de Salmonella enterica y de Salmonella bongori comprendida en la secuencia iagA.
-
- 2.
- Par de cebadores según la reivindicación 1, caracterizado porque las condiciones de hibridación astringentes son 50ºC en la mezcla de reacción siguiente: KCl 50 mM, Tris-HCl 10mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, dCTP, dATP y dGTP 125 µM, 250 µM de dUTP, 25 pmoles de cada uno de los cebadores, 1 unidad de Uracilo N Glucosilasa y 1U de Taq.
-
- 3.
- Kit para la detección de la presencia de Salmonella enterica y/o de Salmonella bongori en muestras biológicas, que comprende:
-un par de cebadores oligonucleotídicos según la reivindicación 1 ó 2, -una sonda para la detección de los fragmentos amplificados, y -los reactivos necesarios para la realización de la reacción de amplificación. -
- 4.
- Utilización de un par de cebadores según la reivindicación 1 para la amplificación de secuencias de nucleótidos de bacterias del género Salmonella especies enterica y bongori.
-
- 5.
- Utilización de un par de cebadores oligonucleotídicos según la reivindicación 1, para la detección tras la amplificación del ADN genómico o del ADNc, de bacterias del género Salmonella especies enterica y bongori.
-
- 6.
- Utilización según la reivindicación 4 ó 5, en la que las condiciones de hibridación astringentes son 50ºC en la mezcla de reacción siguiente: KCl 50 mM, Tris-HCl 10mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, dCTP, dATP y dGTP 125 µM, 250 µM de dUTP, 25 pmoles de cada uno de los cebadores, 1 unidad de Uracilo N Glucosilasa y 1U de Taq.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9500410 | 1995-01-16 | ||
| FR9500410A FR2729392B1 (fr) | 1995-01-16 | 1995-01-16 | Oligonucleotides pour la detection de salmonella |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2360344T3 true ES2360344T3 (es) | 2011-06-03 |
Family
ID=9475150
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES96400098T Expired - Lifetime ES2243948T3 (es) | 1995-01-16 | 1996-01-15 | Oligonucleotidos para la deteccion de salmonella. |
| ES04078201T Expired - Lifetime ES2360344T3 (es) | 1995-01-16 | 1996-01-15 | Oligonucleótidos para la detección de salmonella. |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES96400098T Expired - Lifetime ES2243948T3 (es) | 1995-01-16 | 1996-01-15 | Oligonucleotidos para la deteccion de salmonella. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5824795A (es) |
| EP (2) | EP0721989B1 (es) |
| JP (2) | JP4615635B2 (es) |
| CN (1) | CN1185346C (es) |
| AT (2) | ATE497545T1 (es) |
| CA (1) | CA2167354C (es) |
| DE (2) | DE69638329D1 (es) |
| DK (2) | DK1538222T3 (es) |
| ES (2) | ES2243948T3 (es) |
| FR (1) | FR2729392B1 (es) |
| PT (2) | PT1538222E (es) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2729392B1 (fr) * | 1995-01-16 | 1997-03-28 | Pasteur Institut | Oligonucleotides pour la detection de salmonella |
| DE19734940A1 (de) * | 1997-08-12 | 1999-02-18 | Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh | Nucleinsäuremolekül-Satz für Salmonella-Nachweis, Nucleinsäuren, Kit und Verwendung |
| US7241566B2 (en) * | 2001-06-22 | 2007-07-10 | Marshfield Clinic | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella sp., E. coli O157:H7, and Listeria monocytogenes |
| JP2003289869A (ja) * | 2002-04-02 | 2003-10-14 | Tosoh Corp | 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 |
| US20060240442A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-10-26 | Vevea Dirk N | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes |
| US20060246463A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-11-02 | Vevea Dirk N | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes |
| ES2300174B1 (es) * | 2006-01-27 | 2009-05-01 | Universidad Del Pais Vasco-Euskal-Herrico Unibertsitatea | Deteccion y tipificacion de salmonella en muestras alimentarias mediante pcr multiple. |
| EP1895014A1 (en) | 2006-09-01 | 2008-03-05 | Bio-Rad Pasteur | Detection of salmonella by real-time multiplex PCR |
| DE602006008150D1 (de) * | 2006-10-12 | 2009-09-10 | Bio Rad Pasteur | Doppelsträngige Sonden zur Fluoreszenzdetektion von Nukleinsäuren |
| US8461314B2 (en) * | 2007-03-31 | 2013-06-11 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Nucleic acid sequences for biosynthesis of non-MccJ25-related lariat peptides |
| AU2009229157B2 (en) | 2008-03-28 | 2015-01-29 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
| WO2009120374A2 (en) | 2008-03-28 | 2009-10-01 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sample preparation |
| JP2011521665A (ja) | 2008-06-03 | 2011-07-28 | ヘルス プロテクション エージェンシー | サルモネラ検出アッセイ |
| US10287638B2 (en) | 2014-03-26 | 2019-05-14 | Texas Tech University System | Molecular discrimination of regulated and non-regulated Salmonella serotypes |
| CN106397605B (zh) * | 2016-08-31 | 2019-05-21 | 深圳市欣扬生物科技有限公司 | 一种融合蛋白质及其在检测沙门氏菌中的应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
| FR2664614B1 (fr) * | 1990-07-11 | 1992-10-16 | Pasteur Institut | Sequences nucleiques issues du genome de salmonella typhi, et leurs utilisations notamment pour le diagnostic in vitro de la presence de bacteries du genre salmonella dans les produits alimentaires. |
| AU2509592A (en) * | 1991-08-22 | 1993-03-16 | Washington University | Polynucleotide probes for salmonella |
| CA2131369A1 (en) * | 1992-03-02 | 1993-09-16 | Stanley Falkow | Microorganisms having attenuated invasiveness |
| GB9312508D0 (en) * | 1993-06-17 | 1993-08-04 | Bioteknologisk Inst | Compounds |
| FR2729392B1 (fr) * | 1995-01-16 | 1997-03-28 | Pasteur Institut | Oligonucleotides pour la detection de salmonella |
-
1995
- 1995-01-16 FR FR9500410A patent/FR2729392B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-01-15 AT AT04078201T patent/ATE497545T1/de active
- 1996-01-15 AT AT96400098T patent/ATE296897T1/de active
- 1996-01-15 ES ES96400098T patent/ES2243948T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-15 PT PT04078201T patent/PT1538222E/pt unknown
- 1996-01-15 DE DE69638329T patent/DE69638329D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-15 DK DK04078201.3T patent/DK1538222T3/da active
- 1996-01-15 EP EP96400098A patent/EP0721989B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-15 DK DK96400098T patent/DK0721989T3/da active
- 1996-01-15 EP EP04078201A patent/EP1538222B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-15 DE DE69634790T patent/DE69634790T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-15 PT PT96400098T patent/PT721989E/pt unknown
- 1996-01-15 ES ES04078201T patent/ES2360344T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-16 CA CA2167354A patent/CA2167354C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-16 CN CNB961043938A patent/CN1185346C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-16 JP JP00462296A patent/JP4615635B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-16 US US08/586,272 patent/US5824795A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-05-22 US US09/082,969 patent/US6080545A/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-09-12 JP JP2007237206A patent/JP2008067706A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1538222B1 (fr) | 2011-02-02 |
| US5824795A (en) | 1998-10-20 |
| DK0721989T3 (da) | 2005-10-03 |
| DE69638329D1 (de) | 2011-03-17 |
| PT721989E (pt) | 2005-10-31 |
| ATE497545T1 (de) | 2011-02-15 |
| JP4615635B2 (ja) | 2011-01-19 |
| CA2167354A1 (fr) | 1996-07-17 |
| JPH08317798A (ja) | 1996-12-03 |
| US6080545A (en) | 2000-06-27 |
| CA2167354C (fr) | 2011-11-08 |
| ATE296897T1 (de) | 2005-06-15 |
| EP0721989A1 (fr) | 1996-07-17 |
| DK1538222T3 (da) | 2011-05-23 |
| EP1538222A1 (fr) | 2005-06-08 |
| FR2729392A1 (fr) | 1996-07-19 |
| PT1538222E (pt) | 2011-05-09 |
| DE69634790D1 (de) | 2005-07-07 |
| CN1148625A (zh) | 1997-04-30 |
| FR2729392B1 (fr) | 1997-03-28 |
| DE69634790T2 (de) | 2006-05-04 |
| CN1185346C (zh) | 2005-01-19 |
| ES2243948T3 (es) | 2005-12-01 |
| EP0721989B1 (fr) | 2005-06-01 |
| JP2008067706A (ja) | 2008-03-27 |
| HK1080291A1 (en) | 2006-04-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2360344T3 (es) | Oligonucleótidos para la detección de salmonella. | |
| Song et al. | Detection of Salmonella typhi in the blood of patients with typhoid fever by polymerase chain reaction | |
| ES2112824T5 (es) | Sondas de acidos nucleicos para deteccion y/o cuantificacion de organismos no virales. | |
| Luk et al. | Selective amplification of abequose and paratose synthase genes (rfb) by polymerase chain reaction for identification of Salmonella major serogroups (A, B, C2, and D) | |
| Hashimoto et al. | Development of nested PCR based on the ViaB sequence to detect Salmonella typhi | |
| Grimont et al. | DNA probe specific for Legionella pneumophila | |
| HU196242B (en) | Process and reagent combination for identifying microorganisms by sandwich-hybridization of nucleic acids | |
| Hoorfar et al. | A PCR-based strategy for simple and rapid identification of rough presumptive Salmonella isolates | |
| PT528306E (pt) | Iniciadores e sondas de micobacterias | |
| JPS62228096A (ja) | カンピロバクタ−検出用プロ−ブ | |
| Iida et al. | Evidence for genetic linkage between the ure and trh genes in Vibrio parahaemolyticus | |
| PT687737E (pt) | Deteccao de treponema pallidum e haemophilus ducreyi | |
| Nguyen et al. | Amplification of Salmonella chromosomal DNA using the polymerase chain reaction | |
| JPH05507206A (ja) | レジオネラ種の検出用ｐｃｒプライマーおよびハイブリダイゼーションアッセイにおける光学的強度の調整方法 | |
| Chevrier et al. | Rapid detection of Salmonella subspecies I by PCR combined with non-radioactive hybridisation using covalently immobilised oligonucleotide on a microplate | |
| US5786147A (en) | Detection of enterobacteria | |
| Wagenaar et al. | Rapid and specific detection of pathogenic Leptospira species by amplification of ribosomal sequences | |
| WO1990011370A1 (en) | Polynucleotide probe, method and kit for the identification and detection of gram-negative bacteria | |
| Rich et al. | Identification of human enterovirulent Escherichia coli strains by multiplex PCR | |
| Jayarao et al. | Application of randomly amplified polymorphic DNA fingerprinting for species identification of bacteria isolated from bovine milk | |
| JPH05276999A (ja) | カンピロバクター属細菌検出用オリゴヌクレオチド、カンピロバクター属細菌の検出法及び検出用試薬キット | |
| Calva et al. | Distinctive IS200 insertion between gyrA and rcsC genes in Salmonella typhi | |
| JPH11332599A (ja) | 腸管出血性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| Mansy et al. | Amplification ofProteus mirabilischromosomal DNA using the polymerase chain reaction | |
| JPH05276996A (ja) | コレラ毒素産生菌検出用オリゴヌクレオチド、コレラ毒素産生菌の検出法及び検出用試薬キット |