ES2361664T3 - Anticuerpo recombinante para tumor específico y su utilización. - Google Patents

Abstract

Proteína de fusión anticuerpo-IL2 anti-MAC Epitelial recombinante que comprende la cadena pesada de la SEQ ID No.:41 y la cadena ligera de la SEQ ID No.:42.

Description

Campo de la invención

La presente invención hace referencia en general a los anticuerpos recombinantes. Más específicamente, la invención hace referencia a anticuerpos recombinantes que específicamente se unen a la molécula de adhesión celular epitelial humana, y a su utilización como agentes de diagnóstico, prognosis y terapéuticos.

Antecedentes de la invención

Ha habido un progreso significativo en el desarrollo de terapias basadas en anticuerpos a lo largo de los años. Por ejemplo, los investigadores han identificado no sólo una variedad de marcadores específicos de cáncer, sino también un variedad de anticuerpos que se unen específicamente a dichos marcadores. Los anticuerpos pueden utilizarse para distribuir ciertas moléculas, por ejemplo, una toxina o una fracción inmunoestimulante, por ejemplo, una citoquina, a una célula cancerígena que expresa el marcador para destruir en forma selectiva la célula cancerígena (véase, por ejemplo las Patentes estadounidenses Nº 5541087 y 5650150).

El anticuerpo KS-1/4 es un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra la Molécula de Adhesión Celular Epitelial (MAC Epitelial, del inglés EpCAM) La MAC epitelial se expresa a niveles muy bajos en la superficie apical de ciertas células epiteliales. Por ejemplo, la MAC epitelial se expresa en células intestinales en la superficie celular enfrentada a los alimentos ingeridos y lejos de la circulación, donde no sería accesible para la mayoría de las proteínas y células del sistema inmunológico (Balzar et al. [1999] J. Mol. Med. 77: 699-712).

EP 0338 767 (Beavers et al.) revela diferentes versiones de anticuerpos KS 1/4 quiméricos y murinos. Beiboer et al.

(J. Mol. Biol, (2000) 296, 833-849) revela un anticuerpo humano dirigido a una MAC epitelial obtenido mediante la técnica de expresión en fago llamada “phage display” utilizando “selección guiada” para mejorar la afinidad.

Sin embargo, en ciertas circunstancias, la MAC epitelial se expresa en un alto grado en ciertas células, por ejemplo, células tumorales de origen epitelial. Normalmente, estas células tumorales han perdido su polaridad; como consecuencia, la MAC epitelial se expresa sobre toda la superficie de la célula. De este modo, la MAC epitelial es un conveniente marcador tumoral específico para dirigir fracciones inmunoestimulantes basadas en anticuerpos a células tumorales (Simon et al. [1990] Actas de la Academia Nacional de Ciencia de EEUU. 78:2755-2759; Perez et al. [1989] J Immunol. 142:3662-3667).

Sin embargo, los anticuerpos pueden tener una inmunogenicidad asociada en el mamífero huésped. Es más probable que esto ocurra cuando los anticuerpos no son autoanticuerpos. En consecuencia, la efectividad de las terapias basadas en anticuerpos a menudo es por una respuesta inmunogénica dirigida contra el anticuerpo. La respuesta inmunogénica normalmente se incrementa cuando el anticuerpo es en su totalidad o en parte derivado de un mamífero distinto del mamífero huésped, por ejemplo, cuando el anticuerpo es derivado de ratón y el receptor es un ser humano. Por consiguiente, puede ser útil modificar los anticuerpos derivados de ratón para ser más similares a los anticuerpos humanos, con el propósito de reducir o minimizar la inmunogenicidad del anticuerpo derivado de ratón.

Si bien se ha desarrollado una variedad de enfoques, incluyendo, por ejemplo, los anticuerpos quiméricos, la humanización de anticuerpos y modificación superficial (veneering), en consecuencia, existe una necesidad en el arte de anticuerpos que se unan a marcadores de cáncer específicos y que tengan inmunogenicidad reducida al ser administrados a humanos. Además, existe una necesidad en el arte de anticuerpos que distribuyan toxinas o fracciones inmunoestimulantes, por ejemplo, como las proteínas de fusión o los inmunoconjugados a un marcador de cáncer específico para destruir la célula tumoral en forma selectiva.

Resumen de la invención

La presente invención se basa en parte en la identificación de un anticuerpo recombinante que se une específicamente a la MAC epitelial humana, pero es menos inmunogénico en humanos que el anticuerpo anti-MAC epitelial del modelo murino. En particular, la invención hace referencia con una proteína de fusión inmunocitoquina que comprende dicho anticuerpo como se indicó el cual se fusiona con una molécula IL2. De este modo, en particular, la invención proporciona un anticuerpo KS recombinante con una cadena ligera con región variable modificada como especifica SEQ ID NO: 9 y una cadena pesada con región variable modificada como especifica SEQ ID NO: 18, y una proteína de fusión recombinante KS – IL2 que tiene una cadena ligera como especifica SEQ ID NO: 42 y una cadena pesada como especifica SEQ ID NO: 41.

Como se utilizan en la presente invención, los términos "anticuerpo" e “inmunoglobulina” hacen referencia a (i) un anticuerpo intacto (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal), (ii) regiones de unión al antígeno de éste, que incluyen, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento, un fragmento Fab', un fragmento (Fab’)2, un fragmento Fv, un sitio de unión al anticuerpo de cadena sencilla, un sFv, (iii) anticuerpos biespecíficos y regiones de unión al antígeno de éstos, y (iv) anticuerpos multiespecíficos y regiones de unión al antígeno de éstos.

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Como se utilizan en la presente invención, los términos “unir específicamente”, “une(n) específicamente” y “unión específica” significan que el anticuerpo tiene una afinidad de unión hacia un antígeno en particular de al menos aproximadamente 106 M-1, más preferentemente de al menos aproximadamente 107 M-1, mas preferentemente aún de al menos aproximadamente 108 M-1, y más preferentemente de al menos aproximadamente 1010 M-1.

Como se utilizan en la presente invención, los términos “Regiones Determinantes de Complementariedad” y “región/regiones CDR” significan las regiones de hipervariabilidad o curvas de regiones variables de inmunoglobulina que interactúan principalmente con un antígeno. La región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (VH) y la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (VL), ambas contienen tres regiones CDR interpuestas entre las regiones variables (regiones FW), como se muestra en la Figura 1. Por ejemplo, con referencia a la secuencia de aminoácidos que define la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina del anticuerpo KS1/4 como se muestra en SEQ ID NO: 1, las regiones CDR se definen por las secuencias de aminoácidos desde Ser24 hasta Leu33 (región CDR1), de Asp49 a Ser55 (región CDR2), y de His88 a Thr96 (región CDR3). Con referencia a la secuencia de aminoácidos que define la variable de la cadena pesada de inmunoglobulina del anticuerpo KS-1/4 como se muestra en SEQ ID NO: 2, las regiones CDR se definen por las secuencias de aminoácidos desde Gly24 hasta Asn35 (región CDR1), de Trp50 a Gly66 (región CDR2), y de Phe99 a Tyr105 (región CDR3). Las correspondientes regiones CDR de los otros anticuerpos descriptos en la presente invención se muestran en las Figuras 1A-1C después de alinearse con la correspondiente secuencia de cadena pesada o ligera del KS-1/4.

Como se utilizan en la presente invención, los términos “Regiones Variables” y “Regiones FW” significan las regiones de una región variable de inmunoglobulina adyacente a las Regiones Determinantes de Complementariedad. Tanto la región variable (VH) de la cadena pesada de inmunoglobulina como la región variable de la cadena ligera (VL) de inmunoglobulina contienen cuatro regiones FW, como se muestra en la Figura 1. Por ejemplo, con referencia a la secuencia de aminoácidos que define la variable de la cadena ligera de inmunoglobulina del anticuerpo KS-1/4 como se muestra en SEQ ID NO: 1, las regiones FW se definen por las secuencias de aminoácidos desde Gln1 hasta Cys23 (región FW1), de Trp34 a Phe 48 (región FW2), de Gly56 a Cys87 (región FW3), y de Phe97 a Lys106 (región FW4). Con referencia a la secuencia de aminoácidos que define la variable de la cadena pesada de inmunoglobulina del anticuerpo KS-1/4 como se muestra en SEQ ID NO: 2, las regiones FW se definen por las secuencias de aminoácidos de Gln1 a Ser25 (región FW1), de Trp36 a Gly49 (región FW2), de Arg67 a Arg98 (región FW3), y desde Trp106 hasta Ser116 (región FW4). Las regiones FW de los otros anticuerpos descriptos en la presente invención se muestran en las Figuras X e Y después de alinearse con la correspondiente secuencia de la cadena pesada o ligera del KS-1/4.

Como se utiliza en la presente invención, el término “anticuerpo KS” significa un anticuerpo que se une específicamente al mismo antígeno MAC epitelial humano enlazado por el anticuerpo murino KS-1/4 expresado por un hibridoma (véase, por ejemplo, Res. Cáncer 1984, 44 ((2):681-7). El anticuerpo KS comprende preferentemente

(i) una secuencia de aminoácidos de SASSSVSY (aminoácidos 24-31 de SEQ ID NO: 1) que define al menos una porción de una secuencia de la región CDR1 de cadena ligera de inmunoglobulina, (ii) una secuencia de aminoácidos de DTSNLAS (aminoácidos 49-55 de SEQ ID NO: 1 ) que define al menos una porción de una secuencia de la región CDR2 de cadena ligera de inmunoglobulina, (iii) una secuencia de aminoácidos de HQRSGYPYT (aminoácidos 88-96 de SEQ ID NO: 1) que define al menos una porción de una secuencia de la región CDR3 de cadena ligera de inmunoglobulina, (iv) una secuencia de aminoácidos de GYTFTNYGMN (aminoácidos 26-35 de SEQ ID NO: 2) que define al menos una porción de una secuencia de la región CDR1 de cadena pesada de inmunoglobulina, (v) una secuencia de aminoácidos de WINTYTGEPTYAD (aminoácidos 50-62 de SEQ ID NO: 2) que define al menos una porción de una secuencia de la región CDR2 de cadena pesada de inmunoglobulina, o (vi) una secuencia de aminoácidos de SKGDY (aminoácidos 101-105 de SEQ ID NO: 2) que define al menos una porción de una secuencia de la región CDR3 de cadena pesada de inmunoglobulina, o cualquiera combinación de las anteriores.

En otra realización, el dominio VL de la inmunoglobulina comprende una secuencia de región FW1 seleccionada del grupo que consiste en: (i) residuos de aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO: 9; y (ii) residuos de aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO: 8. En otra realización, los dominios VH de la inmunoglobulina comprenden una secuencia de región FW definida por los residuos de aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 18 y/o una secuencia de región FW definida por los residuos de aminoácidos 67-98 de SEQ ID NO: 18.Más preferentemente, el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos definida por los aminoácidos 1-106 de SEQ ID NO: 9 y/o el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos definida por los aminoácidos 1-116 de SEQ ID NO: 18.

Además, el anticuerpo puede incluir opcionalmente una secuencia de aminoácidos que define al menos una porción de una secuencia de una región CDR que incluye por ejemplo, (i) residuos de aminoácidos 24-31 de SEQ ID NO: 1;

(ii) residuos de aminoácidos 49-55 de SEQ ID NO: 1; y/o residuos de aminoácidos 88-96 de SEQ ID NO: 1. De manera similar, el anticuerpo puede incluir opcionalmente una secuencia de aminoácidos que define al menos una porción de una secuencia de una región CDR que incluye por ejemplo, (i) residuos de aminoácidos 26-35 de SEQ ID NO: 2; (ii) residuos de aminoácidos 50-62 de SEQ ID NO: 2; y/o residuos de aminoácidos 101-105 de SEQ ID NO: 2.

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En otra realización, el anticuerpo comprende la porción dirigida al antígeno de una proteína de fusión de anticuerpocitoquina. La citoquina es una interleucina y más preferentemente es interleucina-2. Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de esta proteína de fusión se representan en SEQ ID NOs 41 y 42.

Descripción de los dibujos

Las Figuras 1A, 1B y 1C muestran una alineación de variantes de cadena pesada y ligera y secuencias de consenso de anticuerpos KS. Las Regiones Variables de Inmunoglobulina (Región FW-Región FW4) se indican con un -. Las “Regiones Determinantes de Complementariedad” de inmunoglobulina (región CDR1- región CDR3) se indican con un *. Los segmentos de la región V de la cadena ligera del anticuerpo individual KS se indican como "VK", donde K hace referencia al hecho de que la cadena ligera es una cadena kappa. Los segmentos de la región V de la cadena pesada del anticuerpo individual KS se indican como "VH". Los aminoácidos sustituibles se indican con una “X” en las secuencias de consenso.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo recombinante que une específicamente la Molécula de Adhesión Celular Epiteliales humana (MAC Epitelial). Los anticuerpos preferentes de la invención tienen regiones variables alteradas que producen como resultado una inmunogenicidad reducida en los seres humanos.

El anticuerpo preferente de la invención tiene regiones variables alteradas que producen como resultado una inmunogenicidad reducida en los seres humanos, y se fusiona con JL-2.

Las regiones variables del anticuerpo de la invención son particularmente útiles para dirigir anticuerpos y proteínas de fusión de un anticuerpo a tejidos tumorales que sobre-expresan la MAC epitelial en pacientes humanos.

Secuencias de proteína de la invención

La presente invención revela una familia de secuencias de región variable o región V de anticuerpo que, cuando se heterodimerizan apropiadamente, se unen a la molécula de adhesión celular epitelial (MAC Epitelial) también conocida como antígeno KS o KSA. Las proteínas preferentes de la invención son útiles para el tratamiento de pacientes humanos como se describe en la presente invención. Por lo tanto, las variantes preferentes del anticuerpo KS son humanizadas, desinmunizadas, o ambas, para reducir su inmunogenicidad cuando se administran a un humano. De acuerdo con la invención, los anticuerpos murinos KS pueden ser desinmunizados o humanizados, por ejemplo, mediante la utilización de métodos de desinmunización en los que epítopos potenciales de las células T son eliminados o debilitados mediante la introducción de mutaciones que reducen la unión de un epítopo de péptido a una molécula MHC clase II (véase, por ejemplo, WO98/52976 y WO00/34317), o mediante la utilización de métodos en los que epítopos no humanos de células T son mutados para que correspondan con auto-epítopos humanos presentes en anticuerpos humanos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense Nº 5712120).

El anticuerpo recombinante anti-MAC Epitelial, de acuerdo con la invención tiene una secuencia de cadena ligera de región variable de inmunoglobulina de SEQ ID NO: 9.

El anticuerpo recombinante anti MAC-Epitelial, de acuerdo con la invención tiene una secuencia de cadena pesada de región variable de inmunoglobulina de SEQ ID NO: 18.

La presente invención también revela métodos para realizar ensayos de la expresión de anticuerpos KS de células tales como células de mamíferos, células de insectos, células de levadura, otras células eucariotas o procariotas (véase el Ejemplo 1). En un método preferente, las regiones V del anticuerpo KS se expresan como componentes de un anticuerpo humano intacto, y la expresión del anticuerpo de una línea celular eucariota sometido a ensayo mediante una ELISA que detecta la región Fc humana. Para cuantificar en forma precisa la unión de un anticuerpo KS a una MAC Epitelial, puede utilizarse un ensayo Biacore.

Tratamiento de enfermedades humanas con proteínas de fusión de un anticuerpo KS

La presente invención también revela las secuencias de proteínas de fusión de anticuerpo KS-IL2 que son útiles en el tratamiento de enfermedades humanas, tales como el cáncer. Determinadas proteínas de fusión del anticuerpo KS-IL2 (véase, por ejemplo, el Constructo 3 en el Ejemplo X), pueden ser utilizadas para el tratamiento de pacientes humanos con cáncer, con una sorpresiva respuesta inmune baja contra el anticuerpo.

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Se ha descubierto que durante el tratamiento de cáncer humano con KS-1/4(VH2/VK1)-IL2 se encontró aún menos inmunogenicidad que con KS-1/4(Constructo 3)-IL2. Específicamente, durante una prueba clínica, los pacientes con anticuerpos anti-idiotípicos y anticuerpos dirigidos contra la unión anticuerpo-IL2 o contra la fracción IL2 se vieron a una frecuencia aún menor que con KS-1/4(Constructo 3)-IL2.

Ejemplos

Ejemplo 1. Métodos y reactivos para la expresión de anticuerpos KS y análisis de su actividad de unión al antígeno

1 A. Cultivo celular y transfección

Las siguientes técnicas generales se utilizaron en los ejemplos siguientes. Para la transfección transitoria, se introdujo ADN plásmido en 293 células de riñón humano por coprecipitación de ADN plásmido con fosfato de calcio [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: Un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor, NY].

A fin de obtener clones establemente transfectados, se introdujo ADN plásmido en las células de mieloma NS/0 de ratón por electroporación. Se cultivaron células NS/0 en el medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero fetal bovino al 10%. Se lavaron aproximadamente 5x106 células una vez con tampón fosfato salino (PBS) y se colocaron nuevamente en suspensión en 0,5ml de PBS. Después se encubaron diez µg de ADN plásmido linearizado con las células en una cubeta Gene Pulser (0,4cm de distancia entre electrodos, BioRad) durante 10 minutos en hielo. La electroporación se realizó utilizando un Gene Pulser (BioRad) con ajustes de 0,25 V y 500µF. Se permitió que las células se recuperaran durante diez minutos en hielo, después de lo cual se colocaron nuevamente en suspensión en el medio de cultivo y después se colocaron en dos placas de 96 pocillos. Los clones transfectados de forma estable fueron seleccionados por crecimiento en presencia de 100nM de metotrexato (MTX), que se introdujo dos días post-transfección. Las células se alimentaron cada 3 días dos a tres veces más, y los clones resistentes a la MTX aparecieron en de 2 a 3 semanas. Los sobrenadantes de clones se analizaron mediante el ensayo ELISA Fc antihumano para identificar los grandes productores [Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:191]. Los clones de gran producción se aislaron y propagaron en un medio de cultivo que contenía 100nM de MTX.

1B. ELISA

Se utilizaron tres diferentes ensayos ELISA para determinar las concentraciones de productos proteicos en los sobrenadantes de clones resistentes a MTX y otras muestras de prueba. El ensayo ELISA anti-huFc se utilizó para medir la cantidad de regiones humanas Fc que contenían proteínas, tales como anticuerpos quiméricos. El ELISA anti-hu kappa se utilizó para medir la cantidad de cadena ligera kappa (de inmunoglobulinas quiméricas o humanas). El ELISA anti-muFc se utilizó para medir la cantidad de proteínas que contenían muFc en las muestras de prueba (véase el Ejemplo 1C más adelante).

El ELISA anti-huFc se describe en detalle más adelante.

A. Placas recubiertas

Se recubrieron las placas ELISA con AffiniPure de cabra anti-humano IgG (H+L) (Jackson Immuno Research) a 5µg/ml en PBS, y 100µl/pocillo en placas de 96 pocillos (placa Nunc-Immuno Maxisorp). Las placas recubiertas se taparon e incubaron a 4°C durante la noche. Después, se lavaron las placas 4 veces con 0.05% Tween (Tween 20) en PBS, y se bloquearon con 1% de seroalbúmina bovina ( BSA)/1% suero de cabra en PBS, 200µl/pocillo. Después de la incubación con tampón de bloqueo a 37°C durante 2 horas, se lavaron las placas 4 veces con 0,05% Tween en PBS y se secaron en toallas de papel.

B. Incubación con muestras de prueba y anticuerpo secundario

Se diluyeron las muestras de prueba a las concentraciones apropiadas en el tampón de muestra, que contenía 1% de seroalbúmina bovina (BSA)/1% suero de cabra/0,05% Tween en PBS. Se preparó una curva estándar con un anticuerpo quimérico (con una región humana Fc), cuya concentración se conocía. Para preparar una curva estándar, se hacen diluciones seriadas en el tampón de muestras para lograr una curva estándar entre 125ng/ml y 3,9ng/ml. Se agregaron a la placa las muestras y los estándares diluidos, 100µl/pocillo, y la placa se incubó a 37°C durante 2 horas.

Después de la incubación, se lavó la placa 8 veces con 0,05% Tween en PBS. A cada pocillo después se le agregó 100µl del anticuerpo secundario, la peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado anti-humano IgG (Jackson Immuno Research), diluido aproximadamente 1:120.000 en el tampón de muestras. La dilución exacta del anticuerpo secundario debió determinarse para cada lote del conjugado anti-humano IgG de peroxidasa de rábano picante. Después de la incubación a 37°C durante 2 horas, se lavó la placa 8 veces con 0,05% Tween en PBS.

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C. Revelado

La solución de sustrato se agregó a la placa a 100µl/pocillo. Se preparó la solución de sustrato disolviendo 30mg de ofenilenediamina dihidrocloruro (OPD) (1 tableta) en 15ml de 0,025M de ácido cítrico/0,05M Na2HPO4 tampón, pH 5, que contenía 0,03% de H2O2 recién agregado. Se permitió que el color se revelara durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. El tiempo de desarrollo estuvo sujeto a cambios, dependiendo de la variabilidad de las placas recubiertas de lote a lote, del anticuerpo secundario, etc. Se observó el revelado del color en la curva estándar para determinar cuándo detener la reacción. La reacción se detuvo adhiriendo 4NH2SO4, 100µl/pocillo. Un

lector de placa leyó la placa, que se fijó a 490nm y 650nm y se programó para sustraer la densidad óptica (DO) de fondo en 650nm de la DO en 490nm.

El ELISA anti-hu kappa siguió el mismo procedimiento descrito anteriormente, excepto en que el anticuerpo secundario utilizado fue conjugado de cabra anti-hu kappa con peroxidasa de rábano picante (Southern Biotechnology Assoc. Inc., Birmingham, AL), utilizado en una dilución 1:4000.

El procedimiento para el ELISA anti-muFc también fue similar, excepto en que las placas ELISA se recubrieron con AffiniPure de cabra anti-murino IgG (H+L) (Jackson Immuno Research) a 5µg/ml en PBS, y 100µl/pocillo; y el anticuerpo secundario fue conjugado de cabra anti-muIgG, Fc (Jackson Immuno Research) con peroxidasa de rábano picante, utilizado en una dilución 1:5000.

1C. Clonación del antígeno KS (KSA, MAC epitelial) y expresión de la forma soluble como MAC epitelial humana -Fc murina

Se preparó el ARN mensajero (ARNm) de las células LnCAP utilizando el Dynabeads mRNA Direct Kit (Dynal, Inc., Lake Success, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la síntesis de la primera cadena de ADN complementario (ADNc) con oligo (dT) y la transcriptasa inversa, el total de la composición del ADNc que codifica la molécula de adhesión celular epitelial (también conocido como antígeno KS o KSA), fue clonado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias de cebadores de PCR se basaron en la secuencia publicada descrita en Perez y Walker (1989) J. Immunol. 142:3662-3667. La secuencia del cebador homosentido es TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGCA (SEQ ID NO: 27), y la secuencia del cebador antisentido es CTCGAGTTATGCATTGAGTTCCCT (SEQ ID NO: 28), donde la traducción del codón de iniciación y del anti-codón del codón de terminación de traducción se indican con negrita, y los sitios de restricción XbaI (TCTAGA) y XhoI (CTCGAG) están subrayados. El producto de reacción en cadena de la polimerasa fue clonado y la secuencia correcta KSA fue confirmada mediante la secuenciación de varios clones independientes. La secuencia de ADNc de la KSA de LnCAP fue esencialmente idéntica a la secuencia publicada de KSA de células UCLA-P3 (Perez and Walker, 1989). Sin embargo, en el residuo de aminoácido número 115, la secuencia de nucleótidos de LnCAP fue ATG en lugar de ACG (Met en lugar de Thr), y en el residuo de aminoácido número 227, la secuencia de nucleótidos de LnCAP fue ATA en lugar de ATG (Ile en lugar de Met).

La unión del anticuerpo KS-1/4 al KSA recombinante se demostró por inmunotinción. La expresión superficial de KSA se obtuvo al transfectar células, por ejemplo, CT26, B16, etc., con KSA completo en un vector de expresión de mamíferos apropiado (pdCs, como se describió en patente estadounidense Nº 5541087), seguido de inmunotinción con el anticuerpo KS-1/4. Para la expresión de KSA como un antígeno soluble, se borró la porción del ADNc que codifica el dominio transmembrana del KSA. Para facilitar la expresión, detección y purificación, se expresó el KSA soluble como un KSA-muFc, la construcción del mismo se describe a continuación. El fragmento de restricción 780 bp XbaI-EcoRI que codifica el KSA soluble se ligó al fragmento AflII-XhoI que codifica el muFc (patente estadounidense Nº 5726044) por medio de un linker-adaptor (adaptador de conector):

5' AA TTC TCA ATG CAG GGC 3' (SEQ ID NO: 29)

3' G AGT TAC GTC CCG AAT T 5' (SEQ ID NO: 30)

El fragmento XbaI-XhoI que codifica el KSA-muFc soluble fue ligado al vector pdCs. El vector de expresión resultante, pdCs-KSA-muFc, se utilizó para transfectar células y por medio del ELISA anti-muFc se identificaron clones estables que expresaban KSA-muFc.

1D. Medición de la unión al antígeno

El KSA-muFc en medio condicionado se purificó primero por la cromatografía de Proteína A de acuerdo con el protocolo del proveedor (Repligen, Cambridge, MA). El KSA-muFc purificado fue utilizado para recubrir placas de 96-pocillos (placa Nunc-Immuno, Maxisorp) a 5µg/ml en PBS, y 100µl/pocillo. El ensayo fue similar al procedimiento ELISA descrito en el Ejemplo 1B. Las placas recubiertas fueron tapadas e incubadas a 4°C durante la noche. Después, las placas se lavaron y bloquearon. Se diluyeron las muestras de prueba a las concentraciones apropiadas en el buffer de muestra, agregadas a la placa a 100µl/pocillo, y se incubó la placa a 37°C durante una hora. Después de la incubación, se lavó la placa 8 veces con 0,05% Tween en PBS. A cada pocillo después se agregaron 100µl del anticuerpo secundario, conjugado anti-humano IgG (Jackson Immuno Research) con peroxidasa de rábano picante, se diluyó a aproximadamente 1:120000 en el tampón de muestras. La placa después se desarrolló y se leyó de acuerdo con lo descrito en Ejemplo 1B.

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1E. Medición de las constantes de disociación y de afinidad de los anticuerpos KS-1/4 de la MAC epitelial utilizando un ensayo Biacore

Se midió la afinidad de las moléculas de KS-1/4 y KS-IL2 con el antígeno MAC epitelial por medio del análisis de resonancia de plasmones superficiales de la interacción anticuerpo-antígeno, utilizando una máquina Biacore (Biacore International AB, Uppsala, Suecia). Se combinó MAC epitelial-Fc murino con un chip sensor CM5 utilizando un protocolo de acoplamiento amino provisto por el fabricante. Después se pasaron por el chip los KS-1/4 y KS-IL2 en concentraciones que oscilaban entre los 25nm y 200nm donde se observó la unión con el chip. Utilizando las rutinas incorporadas de ajuste de curvas del software Bitacore, se calcularon las constantes de afinidad y disociación.

1F. Medición de las afinidades de unión de los anticuerpos KS-1/4 utilizando líneas celulares que expresan MAC epitelial

Los anticuerpos purificados KS-1/4 fueron ionizados con 125I utilizando técnicas estándares, y se incubaron concentraciones en aumento de la proteína etiquetada con la línea celular PC-3 de MAC epitelial positivo. Se generaron curvas de saturación de la unión y se determinaron las constantes de disociación por medio del análisis Scatchard.

Ejemplo 2. Clonación de ADNc que codifica VH y VK de KS-1/4 de ratón y construcción de vector para la expresión de anticuerpo derivado de hibridoma KS-1/4

Se transcribió en forma inversa el ARN mensajero preparado a partir del hibridoma que expresaba KS-1/4 de ratón (obtenido de R. Reisfeld, Scripps Research Institute) con oligo (dT) y después se utilizó como plantillas para la reacción en cadena de la polimerasa a los fines de amplificar las secuencias que codifican la región variable de la cadena pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VK). Los cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa se diseñaron en base a las secuencias publicadas (Beavers et al., ibid.). Los cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa para VH tuvieron las siguientes secuencias:

El cebador directo para VH (5') GACTCGAGCCCAAGTCTTAGACATC (3') (SEQ ID NO:

31)

El cebador inverso para VH (5') CAAGCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGACGTTC (3') (SEQ ID NO:

32)

donde las secuencias CTCGAG y AAGCTT representan los sitios de restricción XhoI e Hindi, respectivamente

utilizados para ligar el VH en el vector de expresión (véase abajo); y el TAC en el cebador inverso introduciría GTA, la secuencia de consenso de ensamblaje del donante, en la cadena homosentido del producto reacción en cadena de la polimerasa.

Los cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa para VK tuvieron las siguientes secuencias:

El cebador directo para VK (5') GATCTAGACAAGATGGATTTTCAAGTG (3') (SEQ ID NO: 33)

El cebador inverso para VK (5') GAAGATCTTACGTTTTATTTCCAGCTTGG (3') (SEQ ID NO: 34)

donde las secuencias TCTAGA y AGATCT representan los sitios de restricción XbaI y BglII, respectivamente, utilizados

para ligar VK en el vector de expresión (véase abajo); y el ATG es el codón de iniciación de la traducción de la cadena ligera, y el TAC en el cebador inverso introduciría GTA, la secuencia de consenso de ensamblaje del donante, en la cadena homosentido del producto de reacción en cadena de la polimerasa.

Se clonaron los productos de la reacción en cadena de la polimerasa que codifican la VH y VK del anticuerpo KS-1/4 de ratón en vectores pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se ordenaron en secuencia varios clones VH y VK y se determinó la secuencia de consenso de cada uno. Las secuencias VH y VK se insertaron de manera escalonada dentro del vector de expresión pdHL7. Las ligaduras sacaron ventaja de los sitios únicos de XhoI y HindIII para la VH, y los sitios únicos XbaI y BglII/BamHI para la VK (el único BglII en el inserto VK y el único BamHI en el vector tienen extremos salientes compatibles). El constructo resultante se denominó hibridoma pdHL7 chKS-1/4, que ya contenía

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elementos reguladores de la trascripción y secuencias de región constante lg humana para la expresión de anticuerpos 5 quiméricos (Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:191).

El vector de expresión pdHL7 fue derivado de pdHL2 [Gillies et al. (1991) Hybridoma 10:347-356], con las siguientes modificaciones: en el vector de expresión pdHL2, las unidades transcripcionales para la cadena ligera y la cadena pesada de citoquina consistían en el potenciador de genes de la cadena pesada de inmunoglobulina y del promotor de metalotioneína. En pdHL7, estas dos unidades transcripcionales consistían en el activador-promotor de CMV [Boshart et

10 al. (1985) Cell 41:521-530].El ADN que codificaba el activador-promotor de CMV se derivó del fragmento AflIII-HindIII del pcDNAI comercialmente disponible (Invitrogen Corp., San Diego, CA).

Ejemplo 3. Estudios de expresión de anticuerpos KS-1/4 murinos

Este ejemplo analiza los estudios de expresión que fueron realizados utilizando un plásmido de expresión de

anticuerpo que codifica las secuencias de la región V reveladas en la patente estadounidense Nº 4975369.

15 3A. Construcción de plásmidos

Para comparar directamente los anticuerpos quiméricos codificados por la secuencia Hibridoma KS-1/4 y aquellas secuencias descritas en la patente estadounidense Nº 4975369, se sintetizó el ADN que codificaba la secuencia VH descrita en la patente estadounidense Nº 4975369. Esto después se ligó con el vector de expresión pdHL7 que ya contenía la VK de KS-1/4. A los fines de construir la secuencia VH descripta en la patente estadounidense Nº 4975369,

20 se obtuvo una parte que codifica el fragmento NdeI-HindIII de la secuencia VH mediante síntesis química total. Los oligonucleótidos superpuestos se sintetizaron químicamente y se ligaron. El dúplex ligado después fue subclonado en un vector XbaI-Hindlll pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA).

Este ADN codifica la secuencia de proteína IQQPQNMRTM de la patente estadounidense Nº 4975369.

Inmediatamente 3' a la secuencia de codificación está el sitio de ensamblaje del donante que comienza con gta. El

25 ctag en el extremo 5' de la cadena superior es el extremo saliente del sitio de clonación XbaI. El sitio XbaI fue creado sólo para clonar en el poliligador del vector pBluescript. Le siguió inmediatamente el sitio de restricción (CATATG). El agct en el extremo 5' de la cadena inferior es el extremo saliente del sitio de clonación HindIII. Este extremo cohesivo HindIII después se liga con el sitio HindIII en el intrón que precede el gen C1 [Gillies et al. (1991) Hybridoma 10:347-356].

30 Después de la secuencia de verificación, se aisló el fragmento de restricción NdeI-HindIII. Esto, junto con el fragmento XhoI-NdeI que codifica la mitad N-terminal de VH se ligó al vector de expresión pdHL7 digerido XhoI-HindIII que contiene la VK de KS-1/4. El constructo resultante pdHL7-'369 chKS-1/4, contenía la VK y VH descritas en la patente

estadounidense Nº 4975369 (mencionada como chKS-1/4 de US 4975369).

3B. Comparación de anticuerpos hibridoma chKS-1/4 y chKS-1/4 de US 4975369

35 Se introdujeron los ADNs plásmidos pdHL7-hibridoma chKS-1/4 y pdHL7-'369 chKS-1/4 en paralelo en un riñón humano 293 células por el procedimiento de coprecipitación de fosfato de calcio mencionado con anterioridad. Cinco días después de la transfección, se analizó el medio condicionado por medio de ELISA anti-huFc y ELISA kappa (véase el Ejemplo 1 para procedimientos ELISA) y los resultados se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1

Anticuerpo ELISA huFc ELISA Kappa

Hibridoma chKS-1/4 254ng/mL 200ng/mL chKS-1/4 de US 4975369 14ng/mL 0ng/mL

Los resultados indicaron que el hibridoma chKS-1/4 era expresado y secretado con normalidad y que el anticuerpo secretado consistía en cantidades aproximadamente equimolares de cadenas pesada y ligera, dentro de la precisión de los dos ELISA diferentes. Por otro lado, solo se detectó un bajo nivel de cadena pesada en el medio condicionado para el anticuerpo chKS-1/4 de US 4975369 y no se asoció con éste ninguna cadena ligera kappa.

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Los análisis Western blot se realizaron en el total de los lisados celulares y en los medios condicionados de las dos líneas celulares transfectadas transitoriamente. Se siguieron los procedimientos de análisis Western blot según lo descrito en (Sambrook et al. (1989), supra).A los fines de analizar el total de los lisados celulares, las células transfectadas fueron lisadas, centrifugadas para eliminar desechos, y el lisado del equivalente a 5x105 células se

5 aplicó por calle. Para analizar el medio condicionado, el producto proteico de 300µl del medio condicionado primero se purificó por medio de cromatografía de Proteína A Sefarosa previo a SDS-PAGE bajo condiciones reductoras. Después de la transferencia de Western blot, se hibridizó el blot con un conjugado de cabra anti-humano IgG, Fc(Jackson ImmunoResearch) con peroxidasa de rábano picante, utilizado en una dilución 1:2000.

La transferencia de Western blot mostró que bajo las condiciones utilizadas, se detectó la cadena pesada en el

10 medio condicionado y en las células lisadas de la transfección con pdHL7-hibridoma chKS-1/4. Este resultado indica que la cadena pesada del anticuerpo chKS-1/4 se produjo en las células y se secretó de manera eficiente (junto con la cadena ligera). Por otro lado, la cadena pesada de la transfección con pdHL7-'369 chKS-1/4 se detectó sólo en el lisado celular, pero no en el medio condicionado. Este resultado indica que si bien se produjo un nivel comparable de cadena pesada dentro de la célula, éste no fue secretado. Esta conclusión es consistente con los datos de ELISA,

15 que mostró que no había cadena ligera kappa asociada con la pequeña cantidad de la cadena pesada secretada en el anticuerpo chKS-1/4 de US 4975369. Se entiende que las cadenas pesadas de inmunoglobulina normalmente no son secretadas en ausencia de cadenas ligeras de inmunoglobulina [Hendershot et al. (1987) Immunology Today 8:111].

Además de lo anterior, se transfectaron células NS/0 por electroporación con los plásmidos pdHL7-Hibridoma chKS-1/4

20 y pdHL7-chKS-1/4 de US 4975369 en paralelo. Se seleccionaron los clones estables en presencia de 100nm de MTX, como se describe en el Ejemplo 1, y se ensayó el medio condicionado de los clones resistentes al MTX en las placas de 96 pocillos mediante ELISA anti-huFc, como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2

Anticuerpo Nº total de clones Modo* Nivel de expresión más analizados alto*

Hibridoma chKS-1/4 80 0,1-0,5µg/mL (41) 10-50µg/mL (4) chKS-1/4 de US 4975369 47 0-10ng/mL (36) 0,1-0,4µg/mL (4)

(* Los números entre paréntesis indican la cantidad de clones en el modo o el número que expresó los niveles más altos del producto, según se determinó mediante ELISA anti-Fc.)

25

Cuando se analizó en el paso de 96 pozos, la mayoría de los clones obtenidos con el constructo pdHL7-hibridoma chKS-1/4 produjo aproximadamente de 100ng/mL a 500ng/mL del anticuerpo, donde los mejores clones produjeron entre 10-50µ/mL. Por otro lado, la mayoría de los clones obtenidos con el constructo pdHL7-‘369 chKS-1/4 produjo aproximadamente de 0ng/mL a 10ng/mL de anticuerpo, donde los mejores produjeron aproximadamente de 300 a 30 400ng/mL. Para examinar la composición y las propiedades de unión del anticuerpo chKS-1/4 de US4975369, fue necesario cultivar los clones que producían de 300 a 400ng/mL. Se seleccionaron dos de estos clones para la expansión. Sin embargo, se determinó que sus niveles de expansión eran muy inestables. Para cuando los cultivos habían crecido a 200mL, los niveles de expresión de ambos clones habían descendido a aproximadamente 20ng/mL, como se analizó mediante anti-Fc ELISA. Cuando se analizaron los mismos medios condicionados

35 mediante anti-kappa ELISA, no se detectó ninguna cadena ligera kappa, como en el caso de la expresión transitoria en 293 células.

El siguiente experimento indicó que ninguna cadena ligera kappa estaba asociada con la cadena pesada del anticuerpo chKS-1/4 de US 4975369. Brevemente, se concentraron 50mL por cada uno de los medios condicionados de cada uno de los clones mediante cromatografía de Proteína A. Los elementos eluidos se

40 evaluaron mediante anti-fc ELISA y anti-kappa ELISA. Como control, se trató un medio condicionado de un hibridoma chKS-1/4 que produce clones de la misma manera y se probó al mismo tiempo. Los resultados del ELISA se resumen en la Tabla 3.

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Tabla 3 Anticuerpo huFc ELISA Kappa ELISA

Hibridoma chKS-1/4 42µg/mL 44µg/mL

US4975369 chKS-1/4-clon 1 253ng/mL 0ng/mL

US4975369 chKS-1/4-clon 2 313ng/mL 0ng/mL

Los resultados mostraron que no había cadena ligera kappa detectable asociada con la cadena pesada US4975369

5 chKS-1/4-clon 1. Además, se mostró que el anticuerpo hibridoma chKS-1/4 se une al antígeno KS a 10-20ng/mL, mientras que el anticuerpo de US4975369 de ambos clones y concentrado a 253 y 313ng/mL, no se une al antígeno KS (véase el Ejemplo 9 para medir la unión al antígeno KS).

Ejemplo 4. Expresión y caracterización de variantes de anticuerpos KS

Se cree que las mutaciones que reducen considerablemente la expresión o afinidad de un anticuerpo para una

10 molécula diana serán menos efectivas para fines terapéuticos en humanos. Algunos enfoques para la reducción de inmunogenicidad, tales como “modificación superficial” (veneering), “humanización” y “desinmunización” involucran la introducción de muchas sustituciones de aminoácidos, y pueden dañar el enlace de un anticuerpo a un antígeno (véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5639641 y 5585089 y la publicación PCT Nº WO 98/52976, WO 00/34317). Existe una necesidad en el arte de secuencias de anticuerpo que se enlacen con la molécula de

15 adhesión celular epitelial, pero que sean diferentes de los anticuerpos monoclonales de ratón originales que reconocen este antígeno.

Se probaron varias combinaciones de regiones variables (“V”) de cadena liviana y pesada KS-1/4 para evaluar su capacidad de expresión, y su capacidad de unión con MAC Epitelial. Los resultados se resumen en las Tablas 4-6 y se describen a continuación.

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Tabla 5. Secuencias de variantes de anticuerpo KS-1/4 y variantes de cadena pesada de región CDR3 con inserciones de aminoácidos individuales Sec. parcial VH2: … ATYFCVRF I S K GDYWGQG… (residuos de amino ácidos 92109 de SEQ ID NO: 22 VH2.1: … ATYFCVRF IIS K GDYWGQG… (SEQ ID NO: 36) VH2.2: …ATYFCVRF IVS K GDYWGQG… (SEQ ID NO: 37) VH2.3: …ATYFCVRF I SAK GDYWGQG… (SEQ ID NO: 38) VH2.4: …ATYFCVRF I S KTGDYWGQG… (SEQ ID NO: 39)

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Tabla 6. Niveles de expresión y actividad de enlace de variantes de anticuerpos KS-1/4 (continuación)

Constructo

Expresión Afinidad MAC Epitelial

Transitorio (*) (en ng/mL)

Estable (*) (en µg/mL) Enlace relativo (**) Kd (nM)

Grupo 1

VK0/VH0 (Hibridoma chKS-1/4)

10 - 50 1x 1.0 x 10-9

VK0/VH’369 (’369 chKS-1/4)

0.1 - 0.4(***) >>30x

VK8/VH7 (Constructo 3)

10 - 50 1.0 x 10-9

VK6/VH6 (Constructo 1)

300 n.d

VK7/VH7 (Constructo 2)

30

VK8/VH7-IL2

10 - 50 1.0 x 10-9

VK1/VH1-IL2

10 - 50 7.9 x 10-9

VK1/VH2-IL2

10 - 50 3.1 x 10-9

Grupo 2

VK8/VH7 (Constructo 3; control)

1500 1x

VK0/VH1

1500 8x

VK1/VH7

1500 1x

VK1/VH1

1500 2x

VK1/VH2

1500 1x-2x

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Constructo

Expresión Afinidad MAC Epitelial

Transitorio (*) (en ng/mL)

Estable (*) (en µg/mL) Enlace relativo (**) Kd (nM)

VK1/VH1-IL2

1500 5x

VK1/VH2-IL2

1500 1.5x

VK1/VH2.5-IL2

1500 3x-4x

Grupo 3

VK8/VH7-IL2 (control)

760 1x

VK1/VH1-IL2

350 2x

VK1/VH2.1-IL2

290 >10x

VK1/VH2.2-IL2

270 >10x

VK1/VH2.3-IL2

190 7x

VK1/VH2.4-IL2

210 3x

(*) Niveles normalmente alcanzables. (**) “Enlace relativo” se expresa como el incremento de x veces en la concentración de proteína requerida para alcanzar un nivel equivalente de enlace. Por lo tanto, un número más alto refleja una menor afinidad para MAC Epitelial. (***) La cadena ligera kappa no fue detectable mediante ELISA (equivalente al fondo); por lo tanto, los anticuerpos funcionales no se expresaron. (*****) n.d.: no detectable. En el Grupo 2 y el Grupo 3, la actividad de enlace relativo de cada proteína se normalizó con respecto al control que se muestra en el primer cuadro de ese grupo. El ensayo ELISA es principalmente un reflejo de constantes de disociación, en base a la cantidad de proteína unida después de varias rondas de lavado. Se utiliza como un método de reconocimiento rápido para eliminar aquellos con poca capacidad de unión, pero no es una medición precisa de afinidad. En el Grupo 3, las variantes de VH2 VH2.1-VH2.4 se compararon con VH1 para determinar si las inserciones de aminoácidos podrían producir un enlace relativo mejorado.

Las secuencias se relacionan de la siguiente manera. Como se describe en los ejemplos, las secuencias VH0 y VK0 se derivan de la amplificación PCR de una línea celular hibridoma que expresa el KS-1/4 derivado de ratón original (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:2). VH-’369 es la secuencia VHA revelada en la patente estadounidense Nº 4975369. Las secuencias VH1, VH2, VH2.1-2.4, VK1 y VK2 se derivaron utilizando ya sea tecnología de desinmunización donde los epítopos de células T potenciales se eliminaron o debilitaron mediante la introducción de mutaciones para reducir el enlace de un epítopo de péptido a una molécula Clase II MHC, o cambiando epítopos de células T no humanas de modo tal que correspondan con auto-epítopos humanos presentes en anticuerpos humanos. El diseño de estos constructos se describe y analiza a continuación. Los constructos de la Tabla 6 se generaron mediante transfección de células de mamíferos con combinaciones de ácidos nucleicos que expresaban las regiones V de cadena ligera y pesada correspondientes. Las secuencias VH6, VH7, VK6, VK7 y VK8 se generaron mediante el cambio de residuos superficiales del hibridoma KS-1/4 a equivalentes humanos como se describe a continuación, con el objetivo de eliminar epítopos de células B potenciales. Los constructos 1 a 3 se generaron mediante la

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5 transfección de células de mamíferos con combinaciones de ácidos nucleicos que expresaban las regiones V de cadena ligera y pesada VH6, VH7, VK6, VK7 y VK8 como se describe en la Tabla 4 y a continuación.

4A. Caracterización de anticuerpos KS con menos epitópos de células T humanas

Las secuencias VH2.1-VH2-5 se realizaron para evaluar si ciertas inserciones de aminoácidos y sustituciones en la región del CDR3 de la cadena pesada de KS-1/4 podían ser toleradas. Se construyeron los vectores de expresión

10 para las combinaciones de cadena pesada y ligera VKO/VH1, VK1/VH7, VK1/VH2, VK1/VH1-IL2, VK1/VH2-IL2 y VK1/VH2.5-IL2 y los anticuerpos y proteínas de fusión de anticuerpo-IL2 se expresaron y evaluaron mediante los métodos que se describen en los ejemplos precedentes.

Específicamente, las secuencias VH1, VH2, VK1 y VK2 se obtuvieron mediante síntesis química total. Para cada una de las secuencias, una serie de oligonucleótidos superpuestos que abarcan todas las cadenas codificadoras y

15 complementarias de estas regiones se sometió a síntesis química, fosforilación y ligación. Las moléculas dúplex ligadas se amplificaron mediante PCR con cebadores apropiados a los extremos de fragmentos, se introdujeron en un vector pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se verificaron las secuencias. Estos fragmentos de ADNA se introdujeron en el vector de expresión pdHL7 en lugares apropiados para generar la cadena pesada (“H”) y ligera (“L”) completas, respectivamente.

20 La secuencia VH2.5 se derivó de VH2 mediante la modificación de un solo codón para obtener un Thr en lugar de un Gln en la posición 108 (Tabla 4), utilizando técnicas estándares de biología molecular.

Los anticuerpos se evaluaron mediante ELISA (Tabla 6) y utilizando resonancia de plasmones superficiales (máquina y software Biacore) para comparar su capacidad de unirse a MAC Epitelial. Se consideró que los resultados de los experimentos ELISA reflejaron principalmente constante de disociación y no constante de afinidad,

25 y fueron en general menos precisos, de modo tal que un resultado de ELISA escaso se utilizó en general para excluir ciertos constructos en futuras consideraciones. Sin embargo, fue necesario caracterizar más a los anticuerpos que mostraron un buen enlace en el ensayo ELISA.

Los resultados del análisis de resonancia de plasmones superficiales fueron los siguientes:

Proteína de fusión kon(M-1s-1) koff(s-1) KD(M)

VK8/VH7-IL2 3.1 x 105 3.2 x 10-4 1.0 x 10-9

VK1/VH2-IL2 1.7 x 105 5.3 x 10-4 3.1 x 10-9

VK1/VH1-IL2 2.8 x 105 2.2 x 10-3 7.9 x 10-9

Debido a que la constante de disociación de VK1/VH1-IL2 fue mucho más rápida que para VK1/VH2-IL2 o VK8/VH730 IL2, VK1/VH1-IL2 se consideró una proteína de fusión menos útil.

Teniendo en cuenta que VK1/VH1-IL2 y VK1/VH2-IL2 difieren sólo por la diferencia metionina/isoleucina en la posición VH 100 en CDR3, la constante de disociación mejorada de VK1/VH1-IL2 comparada con VK1/VH2-IL2 sugiere que esta posición hace un contacto hidrofóbico con MAC Epitelial, y que la cadena lateral metionina apenas más larga hace un contacto menos efectivo. En el campo de las interacciones de proteína y con proteína,

35 generalmente se considera que las interacciones hidrofóbicas juegan un rol primordial en la determinación de constantes de disociación pero un rol mucho menos importante en la determinación de constantes de afinidad.

4B. Caracterización de variantes de KS-1/4 con inserciones de aminoácidos individuales

La importancia de las secuencia CDR3 en la región V de cadena pesada para la afinidad del anticuerpo KS con MAC Epitelial se determinó con una serie de variantes que contenían una inserción o sustitución de aminoácido en esta

40 región. Se generaron secuencias de VH2.1, VH2.2, VH2.3 y VH2.4 mediante la manipulación de un vector de expresión que codifica VH2 y VK1 utilizando técnicas de ADN recombinante estándares. Los vectores de expresión resultantes se transfectaron en células NS/0 y secretaron proteínas de anticuerpos purificadas como se describe en los ejemplos precedentes.

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Se encontró que la variante VH1 fue subóptima en comparación con la variante VH2, que indica que la isoleucina en CDR3 no pudo sustituirse con metionina. El siguiente objetivo era probar si la inserción de un amino ácido en CDR3 podía producir una región V de cadena pesada de KS-1/4 con mejores características de unión que VH1. Los datos en la Tabla 6 comparan la unión de VK1/VH2.1, VK1/VH2.2, VK1/VH2.3 y VK1/VH2.4, con VK1/VH1. Se encontró que ninguno de los constructos con inserción de amino ácidos en CDR3 de VH de KS-1/4 mostró una unión al antígeno mejorada en comparación con VH1, en cambio, la actividad de unión al antígeno de los mutantes de inserción se vio reducida un poco o en gran medida.

Estos resultados indican que la inserción de aminoácidos en CDR3 generalmente es perjudicial para la actividad de unión al antígeno de las regiones V de cadena pesada de KS-1/4. Al analizar esta información, surgen algunas conclusiones generales. Específicamente, el segmento de amino ácidos VH de KS-1/4 en las posiciones de 84 a 108, que consiste en Asn-Asn-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp-Met-Ala-Thr-Tyr-Phe-Cys-Val-Arg-Phe-Ile-Ser-Lys-Gly-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln, es importante para la unión al antígeno de KS-1/4. Este segmento incluye un segmento marco, Asn-Asn-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp-Met-Ala-Thr-Tyr-Phe-Cys-Val-Arg, que en general es tolerante para sustituciones de amino ácidos individuales y múltiples, pero no para inserciones de aminoácidos, que pueden tener un efecto perjudicial sobre la expresión o ensamblaje. Además, la información sugiere que para los aminoácidos en las posiciones 86, 91, 93, 94 y 95, es preferible tener amino ácidos hidrofóbicos para un anticuerpo que se expresa y une con MAC Epitelial de manera eficiente.

La inserción de un amino ácido en el segmento CDR3 VH, que consiste en Phe-Ile-Ser-Lys-Gly-Asp-Tyr, generalmente es perjudicial para la función de unión al antígeno MAC Epitelial de un anticuerpo KS-1/4, aunque ciertas inserciones pueden tolerarse con sólo una pérdida parcial de actividad. De manera similar, la sustitución de estas posiciones también es perjudicial en general para la unión del antígeno MAC Epitelial, aunque algunas inserciones pueden tolerarse con sólo una pérdida parcial de actividad.

4C. Construcción de derivados activos de anticuerpos KS-1/4 con residuos superficiales de ratón convertidos en sus equivalentes humanos

Se prepararon anticuerpos mediante la sustitución de aminoácidos dentro del anticuerpo KS-1/4 con aminoácidos que se encuentran comúnmente en anticuerpos humanos para minimizar la inmunogenicidad de las regiones V derivadas de ratón. Los derivados KS preferentes también retuvieron la afinidad a la unión específica con MAC Epitelial humana.

Constructo 1. Se encontró que la cadena ligera de KS-1/4 se asemejaba mucho al subgrupo III de consenso humano y la cadena pesada se asemejaba mucho al subgrupo I. En base a estas similitudes, se generó una secuencia conceptual que consistía en los aminoácidos del subgrupo de consenso humano y regiones CDR derivadas de KS1/4 y aminoácidos de no consenso. Para este y los siguientes constructos se generó un modelo tridimensional utilizando una estación de trabajo Silicon Graphics y software de diseño molecular BioSym.

La inspección de los modelos tridimensionales reveló que ciertos aminoácidos derivados de humanos estaban cerca de las regiones CDR y probablemente podían influir en su conformación. En base a este análisis, en la cadena ligera, se cambió Ser22, Arg44 y Phe66 humanos por Thr, Lys y Tyr, respectivamente. En la cadena pesada, se consideró que tales cambios eran innecesarios. En el diseño final del Constructo 1, la cadena ligera tenía 18 aminoácidos humanos no encontrados en la cadena ligera de ratón, y la cadena pesada tenía 22 aminoácidos humanos no encontrados en la cadena pesada de ratón.

Se crearon ADNs para la expresión del Constructo 1 utilizando oligonucleótidos sintéticos. La proteína del constructo 1 se expresó de manera eficaz pero se encontró que era 10 veces menos activa en un ensayo de unión a MAC Epitelial.

Constructo 2. Se tomó después un enfoque menos agresivo, y se introdujeron sólo los siguientes cambios:

Cadena ligera: K18P, A79P

Cadena pesada: P9A, L11V, A76T, N88S, M91T

Se creó ADN para la expresión del Constructo 2 utilizando oligonucleótidos sintéticos y técnicas de ADN recombinante estándares. La proteína del Constructo 2 no se expresó de manera eficaz. Se encontró también que la combinación de la cadena ligera del Constructo 2 y la cadena pesada de KS-1/4 de ratón no se expresó de manera eficaz, mientras que la combinación de la cadena pesada del Constructo 2 y la cadena ligera de KS-1/4 de ratón se expresó de manera eficaz. Por lo tanto, el defecto de expresión parecía yacer en la cadena ligera del Constructo 2.

Constructo 3. En base al defecto de expresión aparente en la cadena ligera del Constructo 2, se construyó una nueva cadena ligera mediante la fusión de la parte N-terminal de la cadena ligera del Constructo 1 con la parte Cterminal de la cadena ligera de ratón. Se utilizó el sitio Kpnl, que codifica los aminoácidos en las posiciones 35 y 36. Cuando se combinó esta cadena ligera con la cadena pesada del Constructo 2, se observó una expresión eficiente y ninguna pérdida significativa de unión.

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Debido a que el Constructo 3 dio como resultado un anticuerpo con propiedades superiores en términos de expresión de proteínas y afinidad para el antígeno en comparación con el Constructo 1 ó 2, las secuencias de ADN del Constructo 3 se insertan en pdHL7s-IL2, lo cual da como resultado pdHL7s-VK8/VH7-IL2, que se revela como la SEQ ID NO:40. A los fines de la expresión, se introdujo ADN plásmido en las células de mieloma NS/0 de ratón por electroporación. El medio de cultivo tomado de clones estables se analizó para determinar la expresión de anticuerpo en un ensayo ELISA recubierto de Fc humano, como se describe en el Ejemplo 1B. Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera para esta proteína de fusión de anticuerpo se muestran en la SEQ ID NO:41 y SEQ ID NO:42, respectivamente.

Además, la unión de VK8/VH7 yodado y VK8/VH7-IL2 con MAC Epitelial expresada en la superficie de las células tumorales PC-3 se comparó con la unión de VK0/VH0-IL2 yodado, utilizando los métodos que se describen en el Ejemplo 1F. Dentro del error experimental, se encontraron afinidades esencialmente idénticas para VK8/VH7 y VK0/VH0, y para VK8/VH7-IL2 y VK0/VH0-IL2.

4D. Relaciones estructura-función útiles en la construcción de anticuerpos KS-1/4 activos

Consideradas en conjunto, las actividades de unión al antígeno de los anticuerpos KS-1/4 y las proteínas de fusión con las secuencias de la región V divulgadas proporcionan una guía para el diseño de secuencias de anticuerpos KS-1/4 a la MAC Epitelial, y una buena expresión y secreción de anticuerpos KS-1/4. En particular, las regiones V de cadena pesada y ligera de KS-1/4 puede tolerar múltiples sustituciones de aminoácidos y retener actividad, siempre que estas sustituciones de amino ácidos estén fuera de las regiones CDR. Las regiones V de cadena pesada y ligera de KS-1/4 generalmente no parecen tolerar las inserciones de aminoácidos, en especial dentro de las regiones CDR o regiones FW entre regiones CDR.

Por ejemplo, si la secuencia de hibridoma KS-1/4 se toma como una secuencia inicial “tipo salvaje”, los datos indican que la región V de cadena pesada puede tolerar sustituciones de aminoácidos en las posiciones 9, 11, 16, 17, 38, 40, 69, 70, 71, 72, 76, 79, 80, 83, 88, 91 y 111 con poca o sin actividad. En forma similar, la cadena ligera puede tolerar sustituciones de aminoácidos en las posiciones 1, 3, 10, 11, 12, 13, 17, 18, 19, 21, 41, 42, 59, 71, 73, 75, 77, y 103 con poca o sin actividad. Estos cambios se producen fuera de las regiones CDR de las regiones V de cadena pesada y ligera de KS-1/4. Las 17 sustituciones de amino ácidos de cadena pesada claramente aceptables representan aproximadamente el 21% de las posiciones de aminoácidos fuera de las regiones CDR, y aproximadamente el 68% de las posiciones de aminoácidos fuera de las regiones CDR para las cuales se intentó una sustitución de aminoácidos. De manera similar, las dieciocho sustituciones de amino ácidos de cadena ligera claramente aceptables representan aproximadamente el 23% de las posiciones de aminoácidos fuera de las regiones CDR, y aproximadamente el 72% de las posiciones de aminoácidos fuera de las regiones CDR para las cuales se intentó una sustitución de aminoácidos. Sólo hubo dos ejemplos de una sustitución de aminoácidos fuera de una región CDR que dio como resultado una proteína considerablemente menos útil: la sustitución Ala79Pro en la cadena ligera, que pareció tener un impacto negativo en la expresión; y la sustitución Q108T en la cadena pesada, que tuvo un impacto negativo en la unión al antígeno. Por lo tanto, puede insertarse una sustitución de aminoácido en una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo KS-1/4 fuera de una región CDR, y existe una alta probabilidad de que la sustitución de cómo resultado una proteína activa.

Las mutaciones que involucran la sustitución de un aminoácido en una región CDR a menudo tienen un impacto negativo en la unión al antígeno. Por ejemplo, la sustitución I100M en la cadena pesada reduce la unión aproximadamente 8 veces. Las mutaciones que involucran la inserción de un aminoácido generalmente tienen un impacto negativo en la utilidad de una secuencia KS-1/4. Por ejemplo, la región V de cadena pesada VH2-’369 es incapaz de ensamblarse en un anticuerpo apropiado con una cadena ligera, como se describe en la presente invención. Las mutaciones VH2.1 a 2.4 tienen una inserción de un aminoácido en la región CDR3 de la región V de cadena pesada, y cada una de estas mutaciones tiene un impacto negativo sobre la unión al antígeno.

Ejemplo 5. Inmunogenicidad de una proteína de fusión de anticuerpo KS (Constructo 3)-IL2 en humanos

En un ensayo clínico humano, veintidós pacientes recibieron uno o más regímenes de tratamiento, y cada régimen de tratamiento comprendía tres infusiones intravenosas de 4 horas diarias consecutivas del anticuerpo KS (Constructo 3)-IL2. Cada régimen de tratamiento se realizó a un mes de distancia del otro (Weber et al. (2001). Proc. Am. Soc. Clin. Oncology 20:259a.). Se tomaron muestras de suero de cada paciente antes y después de cada régimen de tratamiento y se analizaron para determinar la reactividad del anticuerpo contra tola la molécula de anticuerpo KS (Constructo 3)-IL2 o el componente Fc-IL2 (sin la región Fv). No se observó reactividad en ninguno de los sueros pre-inmunes. Los resultados indican que sólo 4 pacientes experimentaron un respuesta inmune importante contra sólo las regiones Fv o contra las regiones Fv y el componente Fc-IL2. Además, estas respuestas no parecieron verse promovidas por subsiguiente exposición a huKS-IL2.

imagen16

Se cree que la utilización de la proteína de fusión de anticuerpo-IL2 constituye una prueba particularmente estricta de la inmunogenicidad en la región V, ya que la fracción de interleucina-2 tiene un efecto adyuvante. Por lo tanto, los resultados indican que el anticuerpo KS (Constructo 3) puede administrarse a humanos y sólo un pequeño número de receptores desarrolla aparentemente una respuesta de anticuerpo a la proteína de fusión de anticuerpo KS (Constructo 3)-IL2. Estos resultados son particularmente alentadores teniendo en cuenta el hecho de que el anticuerpo KS (Constructo 3) contiene una región variable de origen casi completamente murino pero donde sólo se reemplazaron pocos residuos de aminoácidos con los residuos de aminoácidos humanos correspondientes.

Por lo tanto, las realizaciones precedentes han de considerarse en todo sentido ilustrativas y no limitativas de la invención descrita en la presente invención.

Listado de secuencias

<110> Gillies, Stephen Lo, Kin-Ming Qian, Xiugi Lexigen Pharmaceuticals Corp.

<120> Anticuerpo recombinante para tumor específico y su utilización

<130> LEX-019PC

<150> US 60/288564

<151> 2001-05-03

<160> 42

<170> PatentIn versión 3.0

<210> 1

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Ratón KS VK

<400> 1

imagen17

imagen18

<210> 2

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Ratón KS VH

<400> 2

imagen18

imagen19

imagen18

<210> 3

<211> 106

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia de cadena ligera variable en el anticuerpo MAC Epitelial

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (1) .. (1)

<223> en donde Xaa en la posición 1 es un ácido glutámico

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3) 15 <223> en donde Xaa en la posición 3 es una valina

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> en donde Xaa en la posición 10 es una treonina o serina 20 <220>

imagen20

<221> misc_feature

<222> (11).. (11)

<223> en donde Xaa en la posición 11 es una leucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> en donde Xaa en la posición 12 es una alanina

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> en donde Xaa en la posición 13 es una leucina o valina

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> en donde Xaa en la posición 17 es una glutamina

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> en donde Xaa en la posición 18 es una arginina

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> en donde Xaa en la posición 19 es una alanina

<220> <221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> en donde Xaa en la posición 21 es una leucina o isoleucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> en donde Xaa en la posición 32 es una isoleucina

<220> <221> misc_feature

imagen21

<222> (36)..(36)

<223> en donde Xaa en la posición 36 es una leucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (41)..(41)

<223> en donde Xaa en la posición 41 es una glutamina

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> en donde Xaa en la posición 42 es una alanina o prolina

<220>

<221> misc_feature

<222> (45)..(45)

<223> en donde Xaa en la posición 45 es una leucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(46)

<223> en donde Xaa en la posición 46 es una leucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (48).. (48)

<223> en donde Xaa en la posición 48 es una tirosina

<220>

<221> misc_feature

<222> (57)..(57)

<223> en donde Xaa en la posición 57 es una isoleucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (59)..(59)

<223> en donde Xaa en la posición 59 es una serina

imagen22

<220>

<221> misc_feature

<222> (69).. (69)

<223> en donde Xaa en la posición 69 es un ácido aspártico o una treonina

<220>

<221> misc_feature

<222> (71)..(71)

<223> en donde Xaa en la posición 71 es una treonina

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> en donde Xaa en la posición 73 es una treonina

<220>

<221> misc_feature

<222> (75)..(75)

<223> en donde Xaa en la posición 75 es una asparagina

<220>

<221> misc_feature

<222> (77)..(77)

<223> en donde Xaa en la posición 77 es una leucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (79)..(79)

<223> en donde Xaa en la posición 79 es una prolina

<220>

<221> misc_feature

<222> (82)..(82)

<223> en donde Xaa en la posición 82 es un fenilalanina

<220>

<221> misc_feature

<222> (84)..(84)

imagen23

<223> en donde Xaa en la posición 84 es una valina

<220>

<221> misc feature

<222> (103)..(103)

<223> en donde Xaa en la posición 103 es una valina

<400> 3

imagen18

<210> 4

<211> 116 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia de cadena pesada variable en el anticuerpo de MAC Epitelial

<220> 15 <221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> en donde Xaa en la posición 2 es una isoleucina o una valina

<220>

<221> misc_feature 20 <222> (9)..(9)

imagen24

<223> en donde Xaa en la posición 9 es una prolina o una alanina

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> en donde Xaa en la posición 11 es una leucina o valina

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> en donde Xaa en la posición 16 es un ácido glutámico o una serina

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> en donde Xaa en la posición 17 es una treonina o serina

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(38)

<223> en donde Xaa en la posición 38 es una lisina o arginina

<220>

<221> misc_feature

<222> (40)..(40)

<223> en donde Xaa en la posición 40 es una treonina o alanina

<220>

<221> misc_feature

<222> (43)..(43)

<223> en donde Xaa en la posición 43 es una lisina o glutamina

<220> <221> misc_feature

<222> (46)..(46)

<223> en donde Xaa en la posición 46 es una lisina o ácido glutámico

<220>

<221> msic_feature

<222> (63)..(63)

imagen25

<223> en donde Xaa en la posición 63 es un ácido aspártico o una lisina

<220>

<221> misc_feature

<222> (65)..(65)

<223> en donde Xaa en la posición 65 es una lisina o una glutamina

<220>

<221> misc_feature

<222> (68)..(68)

<223> en donde Xaa en la posición 68 es una fenilalanina o una valina

<220>

<221> misc_feature

<222> (69)..(69)

<223> en donde Xaa en la posición 69 es una alanina, una treonina o una valina

<220>

<221> misc_feature

<222> (70)..(70)

<223> en donde Xaa en la posición 70 es una fenilalanina o isoleucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (71)..(71)

<223> en donde Xaa en la posición 71 es una serina o treonina

<220>

<221> misc_feature

<222> (72)..(72)

<223> en donde Xaa en la posición 72 es una leucina o alanina

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> en donde Xaa en la posición 73 es un ácido glutámico o ácido aspártico

<220>

<221> misc_feature <222> (76)..(76)

imagen26

<223> en donde Xaa en la posición 76 es una alanina o treonina

<220>

<221> misc_feature

<222> (79)..(79)

<223> en donde Xaa en la posición 79 es una alanina o leucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (80)..(80)

<223> en donde Xaa en la posición 80 es una fenilalanina o tirosina

<220>

<221> misc_feature

<222> (83)..(83)

<223> en donde Xaa en la posición 83 es una isoleucina o una leucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (84)..(84)

<223> en donde Xaa en la posición 84 es una asparagina o serina

<220>

<221> misc_feature

<222> (85)..(85)

<223> en donde Xaa en la posición 85 una asparagina o serina

<220>

<221> misc_feature

<222> (88)..(88)

<223> en donde Xaa en la posición 88 una asparagina, una alanina o serina

<220>

<221> misc_feature

<222> (91)..(91)

<223> en donde Xaa en la posición 91 es una metionina o treonina

<220> <221> misc_feature

imagen27

<222> (93)..(93)

<223> en donde Xaa en la posición 93 es una treonina o valina

<220> 5 <221> misc_feature

<222> (100)..(100)

<223> en donde Xaa en la posición 100 es una isoleucina o metionina

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (108)..(108)

<223> en donde Xaa en la posición 108 es una glutamina o treonina

<220>

<221> misc_feature

<222> (111)..(111) 15 <223> en donde Xaa en la posición 111 es una serina o treonina

<400> 4 <210> 5

imagen18

imagen28

imagen18

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia de consenso liviana

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> en donde Xaa en la posición 1 es una glutamina o ácido glutámico

<220>

<221> misc_feature

<222> (3) ..(3)

<223> en donde Xaa en la posición 3 es una leucina o valina

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> en donde Xaa en la posición 10 es una isoleucina o treonina

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> en donde Xaa en la posición 11 es una metionina o leucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> en donde Xaa en la posición 13 es una alanina o leucina <220>

imagen29

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> en donde Xaa en la posición 18 es una lisina o arginina

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> en donde Xaa en la posición 21 es una metionina o leucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (41)..(41)

<223> en donde Xaa en la posición 41 es una serina o glutamina

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> en donde Xaa en la posición 42 es una serina o alanina

<220>

<221> misc_feature

<222> (45)..(45)

<223> en donde Xaa en la posición 45 es una prolina o leucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(46)

<223> en donde Xaa en la posición 46 es una triptófano o leucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (57)..(57)

<223> en donde Xaa en la posición 57 es una fenilalanina o isoleucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (69)..(69)

imagen30

<223> en donde Xaa en la posición 69 es una serina o un ácido aspártico

<220>

<221> misc_feature

<222> (71)..(71)

<223> en donde Xaa en la posición 71 es una serina o una treonina

<220>

<221> misc_feature

<222> (73).. (73)

<223> en donde Xaa en la posición 73 es una isoleucina o una treonina

<220>

<221> misc_feature

<222> (77)..(77)

<223> en donde Xaa en la posición 77 es una metionina o una leucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (79)..(79)

<223> en donde Xaa en la posición 79 es una alanina o una prolina

<220>

<221> misc_feature

<222> (82)..(82)

<223> en donde Xaa en la posición 82 es una alanina o una fenilalanina

<220>

<221> misc_feature

<222> (84)..(84)

<223> en donde Xaa en la posición 84 es una treonina o una valina

<400> 5 <210> 6

imagen31

imagen18

<211> 116

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia pesada consenso

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (2)..(2)

<223> en donde Xaa en la posición 2 es una isoleucina o una valina

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9) 15 <223> en donde Xaa en la posición 9 es una prolina o una alanina

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> en donde Xaa en la posición 11 es una leucina o una valina 20 <220>

imagen32

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> en donde Xaa en la posición 17 es una treonina o una serina

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(38)

<223> en donde Xaa en la posición 38 es una lisina o una arginina

<220>

<221> misc_feature

<222> (40)..(40)

<223> en donde Xaa en la posición 40 es una treonina o una alanina

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(46)

<223> en donde Xaa en la posición 46 es una lisina o ácido glutámico

<220>

<221> misc_feature

<222> (63)..(63)

<223> en donde Xaa en la posición 63 es un ácido aspártico o una lisina

<220>

<221> misc_feature

<222> (65)..(65)

<223> en donde Xaa en la posición 65 es una lisina o una glutamina

<220>

<221> misc_feature

<222> (68)..(68)

<223> en donde Xaa en la posición 68 es una fenilalanina o una valina

<220>

<221> misc_feature

<222> (69)..(69)

<223> en donde Xaa en la posición 69 es una alanina o una treonina

imagen33

<220>

<221> misc_feature

<222> (70)..(70)

<223> en donde Xaa en la posición 70 es una fenilalanina o una isoleucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> en donde Xaa en la posición 73 es un ácido glutámico o ácido aspártico

<220>

<221> misc_feature

<222> (76)..(76)

<223> en donde Xaa en la posición 76 es una alanina o una treonina

<220>

<221> misc_feature

<222> (80)..(80)

<223> en donde Xaa en la posición 80 es una fenilalanina o una tirosina

<220>

<221> misc_feature

<222> (83)..(83)

<223> en donde Xaa en la posición 83 es una isoleucina o una leucina

<220>

<221> misc_feature

<222> (84)..(84)

<223> en donde Xaa en la posición 84 es una asparagina o una serina

<220>

<221> misc_feature

<222> (85)..(85)

<223> en donde Xaa en la posición 85 es una asparagina o una serina

<220>

<221> misc_feature

<222> (88)..(88)

imagen34

<223> en donde Xaa en la posición 88 es una asparagina, una alanina o una serina

<220>

<221> misc_feature

<222> (91)..(91) 5 <223> en donde Xaa en la posición 91 es una metionina o una treonina

<220>

<221> misc_feature

<222> (93)..(93)

<223> en donde Xaa en la posición 93 es una treonina o una valina 10 <220>

<221> misc_feature

<222> (108)..(108)

<223> en donde Xaa en la posición 108 es una glutamina o una treonina

<400> 6

15

imagen18

<210> 7

imagen35

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vk6 cadena ligera

<400> 7

imagen18

<210> 8 10 <211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VK7 cadena ligera 15 <400> 8

imagen18

imagen36

imagen18

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VK8 cadena ligera

<400> 9

imagen37

<210> 10

imagen38

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> KS VK superficialmente modificado

<400> 10

imagen18

<210> 11 10 <211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VK1 desinmunizado de KS 15 <400> 11

imagen39

imagen18

<210> 12

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VK2 desinmunizado de KS

<400> 12

imagen37

imagen40

<210> 13

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VK3 desinmunizado de KS

<400> 13

imagen18

10 <210> 14

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> VK4 desinmunizado de KS

<400> 14

imagen41

imagen18

<210> 15

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> KS desinmunizado VK5

<400> 15

imagen37

imagen42

<210> 16

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Ratón KS VK

<400> 16

imagen18

<210> 17 10 <211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VH6 cadena pesada 15 <400> 17

imagen43

imagen18

<210> 18

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VH7 cadena pesada

<400> 18

imagen44

imagen18

<210> 19

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VH2.5 cadena pesada

<400> 19

imagen45

imagen18

<210> 20

<211> 116 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VH de KS superficialmente modificado

<400> 20

10

imagen46

imagen18

<210> 21

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VH1 desinmunizado de KS

<400> 21

imagen37

imagen47

imagen18

<210> 22

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VH2 desinmunizado de KS

<400> 22

imagen18

10 <210> 23

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

15 <223> VH3 desinmunizado de KS <400> 23

imagen48

imagen18

<210> 24 5 <211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VH4 desinmunizado de KS 10 <400> 24

imagen49

imagen18

<210> 25

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VH5 desinmunizado de KS

<400> 25

imagen37

imagen50

imagen18

<210> 26

<211> 116 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> KS VH de ratón

<400> 26

10

imagen51

imagen18

<210> 27

<211> 25

<212> DNA 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> KSA cebador homosentido

<400> 27

tctagagcag catggcgccc ccgca 25 10 <210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

15 <223> cebador antisentido KSA

<400> 28 ctcgagttat gcattgagtt ccct 24

<210> 29

<211> 17

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> linker-adapter

<400> 29 aattctcaat gcagggc 17

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> linker-adapter

<400> 30 gagttacgtc ccgaatt 17

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador directo VH

<400> 31 gactcgagcc caagtcttag acatc 25

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador inverso VH

<400> 32 caagcttacc tgaggagacg gtgactgacg ttc 33

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

5 <223> cebador directo VK

imagen52

imagen53

<400> 33 gatctagaca agatggattt tcaagtg 27

<210> 34

<211> 29 10 <212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador inverso VK

<400> 34 15 gaagatctta cgttttattt ccagcttgg 29

<210> 35

<211> 117

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20 <220>

<223> VH369 cadena pesada

<400> 35

imagen54

imagen18

<210> 36

<211> 19 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VH2.1 secuencia parcial

<400> 36

10

imagen18

<210> 37

<211> 19

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

imagen55

<223> VH2.2 secuencia parcial

<400> 37

imagen18

5 <210> 38

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> VH2.3 secuencia parcial

<400> 38

imagen18

<210> 39 15 <211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VH2.4 secuencia parcial 20 <400> 39

imagen18

<210> 40

<211> 10494

imagen56

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia pdHL7s-VK8/VH7-IL2

<400> 40

imagen18

imagen57

imagen18

imagen18

imagen18

imagen18

imagen18

imagen18

<210> 41

<211> 579

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cadena pesada-IL2

<400> 41

imagen58

imagen18

imagen18

imagen18

<210> 42

<211> 213

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cadena ligera

<400> 42

imagen59

imagen18

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Proteína de fusión anticuerpo-IL2 anti-MAC Epitelial recombinante que comprende la cadena pesada de la SEQ ID No.:41 y la cadena ligera de la SEQ ID No.:42.

2. 2.

   Utilización de la proteína de fusión anticuerpo según la reivindicación 1 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

3. 3.

   Proteína de fusión anticuerpo-IL2 anti-MAC Epitelial recombinante según la reivindicación 1 para su utilización para el tratamiento del cáncer.