ES2362667T3 - ANTICUERPOS FRENTE A MAdCAM. - Google Patents

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ES2362667T3
ES2362667T3 ES05711290T ES05711290T ES2362667T3 ES 2362667 T3 ES2362667 T3 ES 2362667T3 ES 05711290 T ES05711290 T ES 05711290T ES 05711290 T ES05711290 T ES 05711290T ES 2362667 T3 ES2362667 T3 ES 2362667T3
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ES
Spain
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antibody
madcam
binding part
monoclonal antibody
antigen binding
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES05711290T
Other languages
English (en)
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Nicholas Pullen
Elizabeth Molloy
Sirid-Aimee Kellermann
Larry L. Green
Mary Haak-Frendscho
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Ltd Great Britain
Pfizer Inc
Amgen Fremont Inc
Original Assignee
Pfizer Ltd Great Britain
Pfizer Inc
Amgen Fremont Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

Una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal humano que se une específicamente a la molécula de adhesión de Célula Mucosa Adresina (MAdCAM), en la que el hibridoma es el hibridoma Nº de Acceso de ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2).

Description

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/535.490 presentada el 9 de enero de 2004.
Antecedentes de la invención
La molécula de adhesión celular mucosa adresina (MAdCAM) es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina de receptores de adhesión celular. La selectividad de dirección de linfocitos a tejido linfoide especializado y sitios de mucosa del tracto gastrointestinal se determina por la expresión endotelial de MAdCAM (Berlin, C. et al., Cell, 80:413-422(1994); Berlin, C., et al., Cell, 74:185-195 (1993); y Erle, D.J., et al., J. Immunol., 153: 517-528 (1994)). MAdCAM se expresa únicamente en la superficie celular de vénulas endoteliales altas de tejido linfoide intestinal organizado, tales como placas de Peyer y ganglios linfáticos mesentéricos (Streeter et al., Nature, 331: 41-6 (1988); Nakache et al., Nature, 337: 179-81 (1989); Briskin et al., Am. J. Pathol. 151-97-110 (1997)), pero también en otros órganos linfoides, tales como páncreas, vesícula biliar y vénulas del bazo y senos marginales de la pulpa blanca del bazo (Briskin et al (1997), mencionado anteriormente; Kraal et al., Am. J. Path., 147: 763-771 (1995)).
Aunque MAdCAM desempeña un papel fisiológico en la vigilancia inmunológica del intestino, parece facilitar una extravasación excesiva de linfocitos en enfermedad inflamatoria del intestino en condiciones de inflamación del tracto gastrointestinal crónica. TNFa y otras citocinas proinflamatorias aumentan la expresión de MAdCAM endotelial y, en muestras de biopsia tomadas de pacientes con enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, hay un aumento de aproximadamente 2-3 veces focal en expresión de MAdCAM en los sitios de inflamación (Briskin et al. (1997), Souza et al., Gut, 45: 856-63 (1999); Arihiro et al., Pathol Int., 52: 367-74 (2002)). Se han observado patrones similares de expresión elevada en modelos experimentales de colitis (Hesterberg et al., Gastroenterology, 111:1373-1380 (1997); Picarella et al., J. Immunol., 158: 2099-2106 (1997); Connor et al., J Leukoc Biol., 65:349-55 (1999); Kato et al., J Pharmacol Exp Ther., 295:183-9 (2000); Hokari et al., Clin Exp Immunol., 26:259-65 (2001); Shigematsu et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol., 281:G1309-15 (2001)). En otros modelos preclínicos para afecciones inflamatorias, tales como diabetes insulino dependiente (Yang et al. Diabetes, 46: 1542-7 (1997); Hänninen et al., J Immunol., 160: 6018-25 (1998)), enfermedad de injerto contra hospedador (Fujisaki et al., Scand J Gastroenterol.,
38: 437-42 (2003), Murai et al., Nat Immunol., 4: 154-60 (2003)), enfermedad hepática crónica (Hillan et al., Liver, 19: 509-18 (1999); Grant et al., Hepatology, 33: 1065-72 (2001)), encefalopatía inflamatoria (Stalder et al., Am J Pathol.,
153: 767-83 (1998); Kanawar et al., Immunol Cell Biol., 78: 641-5 (2000)), y gastritis (Barrett et al., J Leukoc Biol., 67: 169-73 (2000); Hatanaka et al., Clin Exp Immunol., 130: 183-9 (2002)), también existe una reactivación de la expresión de MAdCAM fetal y participación de linfocitos 47+ activados en patogénesis de enfermedad. En estos modelos inflamatorios así como modelo de colitis de ratón mediada por hapteno (por ejemplo, TNBS, DSS, etc.) o transferencia adoptiva (CD4+CD45Rbalta), el anticuerpo monoclonal (mAb) de rata anti MAdCAM de ratón, MECA367, que bloquea la unión de linfocitos 47+ a MAdCAM, reduce el reclutamiento de linfocitos, la extravasación tisular, inflamación y gravedad de la enfermedad. También se han presentado anticuerpos monoclonales de ratón (mAb) contra MAdCAM humana (véase, por ejemplo el documento WO 96/24673 y documento WO 99/58573).
Dado el papel de MAdCAM en enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) y otras enfermedades inflamatorias asociadas con el tracto gastrointestinal u otros tejidos, es deseable un medio para inhibir la unión de 47y reclutamiento de leucocitos mediado por MAdCAM. Sería deseable además tener tales medios terapéuticos con propiedades ventajosas incluyendo pero sin limitación la ausencia de interacciones no deseadas con otras medicaciones en pacientes y propiedades fisicoquímicas favorables tales como valores de pK/pD en seres humanos, solubilidad, estabilidad, periodo de caducidad y semivida in vivo. Una proteína terapéutica, tal como un anticuerpo, estaría ventajosamente sin modificaciones postraduccionales no deseadas o formación de agregados. En consecuencia, existe una necesidad crítica de anticuerpos anti-MAdCAM terapéuticos.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona:
Realización (“R”) 1. Una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal humano que se une específicamente a molécula de adhesión celular mucosa adresina (MAdCAM), en la que el hibridoma es el hibridoma de Número de Acceso ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2).
R.2. Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a MAdCAM e inhibe la unión de MAdCAM humana a 47, en el que la cadena pesada del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende la secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y en el que la cadena ligera del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende las secuencia de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de Número de Acceso de ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2).
R3. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con R2, en el que el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de Número de Acceso ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2).
R4. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con R3, en el que el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo es el anticuerpo monoclonal humano producido por el hibridoma de Número de Acceso ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2) o una parte de unión a antígeno del mismo.
R5. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con R4, en el que se escinde la lisina C-terminal de cadena pesada.
R6. Un anticuerpo monoclonal o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MAdCAM e inhibe la unión de MAdCAM humana a 47, en el que la cadena pesada del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 en SEC ID Nº: 2 y la cadena ligera del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 en SEC ID Nº: 4.
R7. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con R6, en el que el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de aminoácidos expuestas en SEC ID Nº: 2 y 4 sin las secuencias señal.
R8. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con R2 ó 6, en el que el anticuerpo o parte comprende una cadena pesada que utiliza un gen VH 3-15 humano.
R9. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con R2 ó 6, en el que el anticuerpo o parte comprende una cadena ligera que utiliza un gen VK A3 humano.
R10. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con R2 en el que dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende una o más de las secuencias de aminoácidos FR1, FR2, FR3 y FR4 del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de Número de acceso ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2).
R11. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con R6, en el que dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende una o más de las secuencias de aminoácidos FR1, FR2, FR3 y FR4 en SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4.
R12. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con R2, en el que la cadena pesada y la cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos del comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 de la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de Número de Acceso ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2).
R13. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con R6, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos del comienzo de CDR1 hasta el final de CDR3 en SEC ID Nº: 2 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos del comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 en SEC ID Nº: 4.
R14. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con R2, en el que los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprenden las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo monoclonal producido por hibridoma de Número de Acceso ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2).
R15. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con R6, en el que la cadena pesada del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada en SEC ID Nº: 2 y la cadena ligera del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera en SEC ID Nº: 4.
R16. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de R2, 6 u 8 a 15 que es una molécula de inmunoglobulina G (IgG), una IgM, una IgE, una IgA o una IgD o un anticuerpo biespecífico.
R17. La parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de R2 a 4 ó 6 a 15 que es un fragmento de Fab, un fragmento de F(ab’)2, un fragmento Fv o un anticuerpo de cadena sencilla.
R18. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de R2 a 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
R19. La composición farmacéutica de acuerdo con R18 que comprende adicionalmente uno o más agentes antiinflamatorios o inmunomoduladores adicionales.
R20. La composición farmacéutica de acuerdo con R19, en la que el o los agentes antiinflamatorios o inmunomoduladores adicionales se seleccionan del grupo que consiste en corticosteroides, aminosalicilatos, azatioprina, metotrexato, ciclosporina, FK306, IL-10, f3M-CSF, rapamicina, agentes anti-TNF y antagonistas de molécula de adhesión.
R21. Una vacuna que comprende el anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de R2 a 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
R22. La vacuna de acuerdo con R21, siendo la vacuna mucosa.
R23. Un kit de diagnóstico que comprende el anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de R2 a 17.
R24. Una línea celular aislada que produce el anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de R2 a 17.
R25. La línea celular de acuerdo con R24 que produce el anticuerpo de R3 ó 7.
R26. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de R2 a 16.
R27. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con R26.
R28. Un vector de acuerdo con R27, comprendiendo el vector una secuencia de control de la expresión unida operativamente a la molécula de ácido nucleico.
R29. Una célula hospedadora que comprende el vector de acuerdo con R27 o la molécula de ácido nucleico de acuerdo con R26.
R30. Una célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada y una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo monoclonal o una parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de R2 a 16.
R31. Un método para producir un anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MAdCAM, que comprende cultivar la célula hospedadora de acuerdo con R29 o R30 o la línea celular de acuerdo con R1 ó 24 en condiciones adecuadas y recuperar el anticuerpo o parte de unión a antígeno.
R32. Un animal transgénico no humano o planta transgénica que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada y una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo
o una parte de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de R2 a 16, en el que los polipéptidos de cadena pesada y cadena ligera codificados por las moléculas de ácido nucleico se expresan.
R33. Un método para aislar un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MAdCAM, que comprende la etapa de aislar el anticuerpo del animal transgénico no humano o planta transgénica de acuerdo con R32.
R34. Un anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de R2 a 17, en el que el anticuerpo o parte inhibe la unión de MAdCAM a 47, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesite.
R35. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de R34, en el que la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal.
R36. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de R35; en el que la enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad diverticular, gastritis, enfermedad hepática, esclerosis biliar primaria y colangitis esclerosante.
R37. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de R35, en el que la enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal es enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa.
R38. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de R34, en el que la enfermedad inflamatoria es diabetes insulinodependiente o enfermedad de injerto contra hospedador.
R39. Un anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de R32 a 17, en el que el anticuerpo o parte se marca de forma detectable, para su uso en detección de inflamación en un sujeto.
R40. Un anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de R2 a 17 para su uso en la determinación de si existe un aumento en el nivel de leucocitos que expresan 47 en circulación y de este modo detectar el efecto de la administración de un anticuerpo inhibidor anti-MAdCAM o parte de unión a antígeno del mismo a un sujeto.
R41. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con R40, en el que los leucocitos son linfocitos.
R42. El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con R40, en el que el aumento en el nivel de leucocitos que expresan 47 en circulación se determina por análisis de FACS.
R43. Un anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de R2 a 17 para su uso como un medicamento.
R44. Un método para diagnosticar un trastorno caracterizado por MAdCAM humana soluble en circulación que comprende las etapas de: (1) poner en contacto una muestra biológica con el anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de R2 a 17 y (2) detectar la unión del anticuerpo o parte a MAdCAM.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un alineamiento de las secuencias de aminoácidos predichas de las regiones variables de cadena ligera kappa y pesada de doce anticuerpos monoclonales anti-MAdCAM humanos con la secuencia de aminoácidos de línea germinal de los genes humanos correspondientes.
La Figura 1A muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena pesada para los anticuerpos 1.7.2 y 1.8.2 (restos 20-138 de SEC ID Nº: 2 y 6, respectivamente) con el producto del gen VH 3-15 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 113).
La Figura 1B muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 6.14.2 (restos 20-141 de SEC ID Nº: 10) con el producto del gen VH 3-23 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 114).
La Figura 1C muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 6.22.2 (restos 20-139 de SEC ID Nº: 14) con el producto del gen VH 3-33 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 115).
La Figura 1D muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 6.34.2 (restos 20-143 de SEC ID Nº: 18) con el producto del gen VH 3-30 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 116).
La Figura 1E muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 6.67.1 (restos 20-144 de SEC ID Nº: 22) con el producto del gen VH 4-4 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 117).
La Figura 1F muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 6.73.2 (restos 20-145 de SEC ID Nº: 26) con el producto del gen VH 3-23 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 118).
La Figura 1G muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 6.77.1 (restos 20-146 de SEC ID Nº: 30) con el producto del gen VH 3-21 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 119).
La Figura 1H muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena pesada para los anticuerpos 7.16.6 y 7.26.4 (restos 20-144 de SEC ID Nº: 34 y 42, respectivamente) con el producto del gen VH 1-18 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 120).
La Figura 1I muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 7.20.5 (restos 20-146 de SEC ID Nº: 38) con el producto del gen VH 4-4 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 121).
La Figura 1J muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 9.8.2 (restos 20-136 de SEC ID Nº: 46) con el producto del gen VH 3-33 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 122).
La Figura 1K muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena ligera kappa para los anticuerpos 1.7.2 y 1.8.2 (restos 21-132 de SEC ID Nº: 4 y 8, respectivamente) con el producto del gen A3 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 123).
La Figura 1L muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 6.14.2 (restos 23-130 de SEC ID Nº: 12) con el producto del gen 012 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 124).
La Figura 1M muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 6.22.2 (restos 20-127 de SEC ID Nº: 16) con el producto del gen A26 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 125).
La Figura 1N muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 6.34.2 (restos 23-130 de SEC ID Nº: 20) con el producto del gen 012 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 126).
La Figura 1O muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 6.67.1 (restos 21-135 de SEC ID Nº: 24) con el producto del gen B3 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 127).
La Figura 1P muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 6.73.2 (restos 23-132 de SEC ID Nº: 28) con el producto del gen 012 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 128).
La Figura 1Q muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 6.77.1 (restos 21-133 de SEC ID Nº: 32) con el producto del gen A2 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 129).
La Figura 1R muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena ligera kappa para los anticuerpos 7.16.6 y 7.26.4 (restos 21-133 de SEC ID Nº: 36 y 44, respectivamente) con el producto del gen A2 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 130).
La Figura 1S muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 7.20.5 (restos 21-132 de SEC ID Nº: 40) con el producto del gen A3 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 131).
La Figura 1T muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 9.8.2 (restos 25-132 de SEC ID Nº: 48) con el producto del gen 018 humano de línea germinal (SEC ID Nº: 132).
La Figura 2 son alineamientos de CLUSTAL de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera kappa y pesada predichas de anticuerpos anti-MAdCAM humanos.
La Figura 2A es un alineamiento de CLUSTAL (restos 1-132 de SEC ID Nº: 4, 8 y 40, restos 1-133 de SEC ID Nº: 36, 44 y 32, restos 1-135 de SEC ID Nº: 24, restos 1-130 de SEC ID Nº: 20, restos 1-132 de SEC ID Nº: 28, restos 1-130 de SEC ID Nº: 12, restos 1-132 de SEC ID Nº: 48 y restos 1-127 de SEC ID Nº: 16, todos respectivamente en orden de aparición) y árbol radial de las secuencias de aminoácidos de cadena ligera kappa predichas, que muestra el grado de similitud entre las cadenas ligeras kappa de anticuerpo anti-MAdCAM.
La Figura 2B es un alineamiento de CLUSTAL (restos 20-144 de SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 133, restos 20-138 de SEC ID Nº: 4 y 6, restos 20-122 de SEC ID Nº: 10, restos 20-145 de SEC ID Nº: 26, restos 20-146 de SEC ID Nº: 30, restos 20-139 de SEC ID Nº: 14, restos 20-143 de SEC ID Nº: 18, restos 20-136 de SEC ID Nº: 46, restos 20-146 de SEC ID Nº: 38 y restos 20-144 de SEC ID Nº: 22, todos respectivamente en orden de aparición) y árbol radial de las secuencias de aminoácidos pesadas predichas, que muestran el grado de similitud entre las cadenas pesadas del anticuerpo anti-MAdCAM.
La Figura 3 es un alineamiento de CLUSTAL de secuencias de aminoácidos de los 2 dominios N-terminal de MAdCAM de cynomolgus (SEC ID Nº: 50) y humana (restos 1-225 de SEC ID Nº: 107) que forman el dominio de unión 47. Las cadenas  se alinean de acuerdo con Tan et al., Structure (1998) 6: 793-801.
La Figura 4 es un gráfico que representa los efectos de dosis de 1.7.2 y 7.16.6 biotinilados purificados en la adhesión de linfocitos de sangre periférica humanas a secciones de endotelio de hígado humano congelado que expresa MAdCAM.
La Figura 5 muestra una representación gráfica bidimensional basada en los datos capturados en la Tabla 7 de la diversidad de epítopos de MAdCAM a los que los anticuerpos anti-MAdCAM, 1.7.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2 se unen. Los anticuerpos anti-MAdCAM dentro del mismo círculo muestran el mismo patrón de reactividad, pertenecen al mismo conjunto de epítopos y probablemente reconocen el mismo epítopo en MAdCAM. Los clones de anticuerpo anti-MAdCAM dentro de círculos solapantes son incapaces de unirse simultáneamente y, por lo tanto, probablemente reconozcan un epítopo solapante en MAdCAM. Los círculos no integrantes representan clones de anticuerpo anti-MAdCAM con distinta separación espacial de epítopos.
La Figura 6 muestra datos de ELISA de tipo sándwich con anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2 y un 7.16.6 marcado con Alexa 488, que muestran que dos anticuerpos que son capaces de detectar diferentes epítopos en MAdCAM podrían usarse para detectar MAdCAM soluble para fines de diagnóstico.
La Figura 7 muestra el efecto de un anticuerpo inhibidor anti-MAdCAM (1 mg/kg) en el número de linfocitos 47+ periféricos circulantes, expresados como un aumento de veces sobre el mAb IgG2a control o vehículo, usando mAb anti-MAdCAM 7.16.6 en un modelo de mono cynomolgus.
Descripción detallada
Definiciones y técnicas generales
A no ser que se defina de otro modo en la presente memoria, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que se entienden habitualmente por los expertos en la materia. Además, a no ser que se requiera de otro modo por el contexto, los términos singulares incluirán plurales y los términos plurales incluirán los singulares. Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, química de proteínas y ácido nucleico e hibridación descritas en la presente memoria son las bien conocidas y habitualmente usadas en la técnica. Los procedimientos y técnicas de la presente invención generalmente se realizan de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la materia y como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se nombran y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva a no ser que se indique de otro modo. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realiza habitualmente en la técnica o como se describe en la presente memoria. Se usan técnicas convencionales para síntesis químicas, análisis químicos, reparación farmacéutica, formulación y suministro y tratamiento de pacientes.
Se entenderá que los siguientes términos, a no ser que se indique de otro modo, tienen los siguientes significados:
El término “polipéptido” abarca proteínas nativas o artificiales, fragmentos proteicos y análogos polipeptídicos de una secuencia de proteína. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico.
La expresión “proteína aislada” o “polipéptido aislado” es una proteína o un polipéptido que en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociado con componentes asociados de forma natural que lo acompañan en su estado nativo, (2) está sin otras proteínas de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente o (4) no se produce en la naturaleza. Por lo tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula de la que se origina de forma natural estará “aislado” de sus componentes asociados de manera natural. Una proteína también puede hacerse sustancialmente sin componentes asociados de forma natural por aislamiento, usando técnicas de purificación proteica bien conocidas en la materia.
Una proteína o polipéptido es “sustancialmente puro”, “sustancialmente homogéneo” o “sustancialmente purificado” cuando al menos aproximadamente 60 a 75 % de una muestra presenta una especie única de polipéptido. El polipéptido o proteína puede ser monomérico o multimérico. Un polipéptido o proteína sustancialmente puro típicamente comprenderá aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % P/P de una muestra proteica, más habitualmente aproximadamente 95 % y preferiblemente estará por encima de 99 % de pureza. La pureza u homogeneidad proteica puede indicarse por varios medios bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra proteica, seguido de visualización de una banda polipeptídica única tras teñir el gel con una tinción bien conocida en la técnica. Para ciertos fines, puede proporcionarse una mayor resolución usando HPLC u otro medio bien conocido en la técnica para la purificación.
La expresión “fragmento polipeptídico” como se usa en la presente memoria se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural. En algunas realizaciones, los fragmentos son de al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, los fragmentos son de al menos 14 aminoácidos de longitud, más preferiblemente al menos 20 aminoácidos de longitud, habitualmente al menos 50 aminoácidos de longitud, incluso más preferiblemente al menos 70, 80, 90,100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud.
La expresión “análogo polipeptídico” como se usa en la presente memoria se refiere a un polipéptido que comprende un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con una parte de una secuencia de aminoácidos y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a MAdCAM en condiciones de unión adecuadas, (2) capacidad para inhibir integrina 47 y/o unión de L-selectina a MAdCAM o (3) capacidad para reducir la expresión en superficie celular de MAdCAM in vitro o in vivo. Típicamente, los análogos polipeptídicos comprenden una sustitución de aminoácidos conservativa (o inserción o deleción) con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos típicamente son de al menos 20 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud o más largos y con frecuencia pueden ser tan largos como un polipéptido de origen natural de longitud completa.
Las sustituciones de aminoácidos preferidas son las que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión o (5) confieren o modifican otras propiedades físico-químicas o funcionales de tales análogos.
Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica de origen natural. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos sencillas o múltiples (preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural (preferiblemente en la parte del polipéptido fuera del dominio o dominios que forman contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservativa no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo un aminoácido de reemplazo no debería tender a romper una hélice que aparece en la secuencia parental o interrumpir otros tipos de estructuras secundarias que caracterizan a la secuencia parental). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidos en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman y Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al., Nature, 354: 105 (1991).
Habitualmente se usan análogos no peptídicos en la industria farmacéutica como fármacos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan “miméticos peptídicos” o “peptidomiméticos”. Fauchere, J. Adv. Drug Res., 15:29(1986); Veber y Freidinger, TINS, p.392(1985); y Evans et al.,
J. Med. Chem., 30:1229(1987). Tales compuestos se desarrollan con frecuencia con la ayuda de modelos moleculares informáticos. Los miméticos peptídicos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto equivalente terapéutico o profiláctico. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigmático (es decir un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica deseada), tal como un anticuerpo humano, pero que tiene uno o más enlaces peptídicos opcionalmente reemplazados por un enlace tal como -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, CH=CH- (cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-, por métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un aminoácido D del mismo tipo (por ejemplo D-lisina en lugar de L-lisina) también puede usarse para generar péptidos más estables. Además, pueden generarse péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992); por ejemplo, añadiendo restos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que hacen al péptido cíclico.
Una “inmunoglobulina” es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina de origen natural, cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kDa) y una “pesada” (aproximadamente 50-70 kDa). La parte aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. La parte carboxi terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras . Las cadenas pesadas se clasifican como , , ,  o  y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante se unen por una región “J” de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región “D” de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Véase generalmente, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión a anticuerpo de modo que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión.
Las cadenas de inmunoglobulina muestran la misma estructura general de regiones flanqueantes (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean por las regiones flanqueantes para formar un sitio de unión específico de epítopo. De N-terminal a C-terminal, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917(1987); Chothia et al, Nature, 342: 878-883(1989).
Un “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una parte de unión a antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto para unión específica. En algunas realizaciones, un anticuerpo es una parte de unión a antígeno del mismo. Puede producirse partes de unión a antígeno por técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las partes de unión a antígeno incluyen, entre otras, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, dAb, y fragmentos de regiones determinantes de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una parte de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específico al polipéptido. Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd consiste en los dominios VH y CH1, un fragmento Fv consiste en los dominios VL y VH de una rama sencilla de un anticuerpo; y un fragmento de dAb (Ward et al., Nature, 341: 544-546(1989)) consiste en un dominio VH.
Como se usa en la presente memoria, un anticuerpo que se denomina, por ejemplo, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.2, 7.16.6, 720.5, 7.26.4 o 9.8.2, es un anticuerpo monoclonal que se produce por el hibridoma del mismo nombre. Por ejemplo, el anticuerpo 1.7.2 se produce por el hibridoma 1.7.2. Un anticuerpo que se denomina 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod es un anticuerpo monoclonal cuya secuencia se ha modificado de su parental correspondiente por mutagénesis dirigida.
Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) es un anticuerpo en el que las regiones VL y VH se emparejan para formar una molécula monovalente mediante un enlazador sintético que les permite formarse como una cadena proteica sencilla (Bird et al, Science, 242: 423-426 (1988) y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los que se expresan dominios VH y VL y en una cadena polipeptídica sencilla, pero que usan un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, obligando de este modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) y Poljak, R. J., et al., Structure, 2: 1121-1123 (1994)). Una o más CDR de un anticuerpo de la invención pueden incorporarse a una molécula de forma covalente o no covalente para convertirla en una inmunoadhesina que se une específicamente a MAdCAM. Una inmunoadhesina puede incorporar la CDR o las CDR como parte de una cadena polipeptídica mayor, puede enlazar covalentemente la CDR o las CDR a otra cadena polipeptídica o puede incorporar la CDR o las CDR de forma no covalente. Las CDR permiten que la inmunoadhesina se una específicamente a un antígeno particular de interés.
Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si existe más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina de origen natural tiene dos sitios de unión idénticos, un anticuerpo de cadena sencilla o fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo “biespecífico” o “bifuncional” (diacuerpo) tiene dos sitios de unión diferentes.
Un “anticuerpo aislado” es un anticuerpo que (1) no está asociado con componentes asociados de forma natural, incluyendo otros anticuerpos asociados de forma natural, que lo acompañan en su estado nativo, (2) está sin otras proteínas de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente o (4) no se produce en la naturaleza. Los ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo anti-MAdCAM que se ha purificado para afinidad usando MAdCAM, un anticuerpo anti-MAdCAM que se ha producido por un hibridoma u otra línea celular in vitro y un anticuerpo humano anti-MAdCAM derivado de un mamífero o planta transgénicos.
Como se usa en la presente memoria, la expresión “anticuerpo humano” significa un anticuerpo en el que las secuencias de región variable y constantes son secuencias humanas. La expresión abarca anticuerpos con secuencias derivadas de genes humanos, pero que se han cambiado, por ejemplo, para reducir la posible inmunogenicidad, aumentar la afinidad, eliminar cisteínas o sitios de glucosilación que podrían provocar plegamiento indeseado, etc. La expresión abarca tales anticuerpos producidos de forma recombinante en células no humanas que podrían transmitir glucosilación no típica de células humanas. La expresión también abarca anticuerpos que se han inducido en un ratón transgénico que comprende algunos o todos los loci de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado es un anticuerpo que deriva de una especie no humana, en el que ciertos aminoácidos en el armazón y dominios constantes de las cadenas pesada y ligera se han mutado para evitar o anular una respuesta inmune en seres humanos. En algunas realizaciones, puede producirse un anticuerpo humanizado fusionando los dominios constantes de un anticuerpo humano con los dominios variables de una especie no humana. Los ejemplos de cómo hacer anticuerpos humanizados pueden hallarse en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.054.297, 5.886.152 y
5.877.298. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado anti-MAdCAM de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de una o más regiones flanqueantes de uno o más anticuerpos humanos anti-MAdCAM de la invención.
En otro aspecto, la invención incluye un “anticuerpo quimérico”. En algunas realizaciones el anticuerpo quimérico se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos adicionales. En una realización preferida, una o más de las CDR derivan de un anticuerpo humano anti-MAdCAM de la invención. En una realización más preferida, todas las CDR derivan de un anticuerpo humano anti-MAdCAM de la invención. En otra realización preferida, las CDR de más de un anticuerpo humano anti-MAdCAM de la invención se mezclan y emparejan en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo humano anti-MAdCAM, puede combinarse con CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo humano anti-MAdCAM y las CDR de la cadena pesada pueden derivar de un tercer anticuerpo anti-MAdCAM. Además, las regiones flanqueantes pueden derivar de uno de los mismos anticuerpos anti-MAdCAM, de uno o más anticuerpos diferentes, tales como un anticuerpo humano o de un anticuerpo humanizado.
Un “anticuerpo neutralizador”, “un anticuerpo inhibidor” o anticuerpo antagonista es un anticuerpo que inhibe la unión de 47 o células que expresan 47 o cualquier otro ligando afín o células que expresan ligando afín, con MAdCAM en al menos aproximadamente 20 %. En una realización preferida, el anticuerpo reduce la inhibición de la unión de integrina 47 o células que expresan 47 a MAdCAM en al menos 40 % más preferiblemente 60 %, incluso más preferiblemente 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %. La reducción de la unión puede medirse por cualquier medio conocido para un experto en la materia, por ejemplo, según se mide en un ensayo de unión competitiva in vitro. Un ejemplo de medición de la reducción en unión de células que expresan 47 a MAdCAM se presenta en el Ejemplo I.
Pueden prepararse fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos por los expertos en la materia siguiendo las enseñanzas de la presente memoria descriptiva. Los extremos amino y carboxi terminales preferidos de fragmentos
o análogos aparecen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse por comparación de los datos de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con bases de datos de secuencia pública o patentada. Preferiblemente, se usan métodos de comparación informáticos para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación proteica predichos que aparecen en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida (Bowie et al., Science, 253: 164 (1991)).
La expresión “resonancia de plasmón superficial”, como se usa en la presente memoria; se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.). Para descripciones adicionales, véase Jonsson, U., et al., Ann. Biol. Clin., 51: 19-26 (1993); Jonsson, U., et al., Biotechniques, 11: 620-627 (1991); Johnsson, B., et al.,
J. Mol. Recognit., 8: 125-131 (1995); y Johnnson, B., et al., Anal. Biochem., 198: 268-277 (1991).
El término “koff·” se refiere a la constante de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.
El término “Kd” se refiere a la constante de disociación de una interacción anticuerpo/antígeno particular. Se dice que un anticuerpo se une a un antígeno cuando la constante de disociación es  1 M, preferiblemente  100 nM y más preferiblemente  10 nM.
El término “epítopo” incluye cualquier determinante proteico capaz de unión específica a una inmunoglobulina o receptor de linfocitos T o interacción distinta con una molécula. Los determinantes epitópicos habitualmente consisten en agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de carbohidratos y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser “lineal” o “conformacional”. En un epítopo lineal, todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula de interacción (tales como un anticuerpo) se producen linealmente a lo largo de la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción se producen entre restos aminoacídicos en la proteína que están separados entre sí.
Como se usa en la presente memoria, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2ª Edición, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinaner Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, aminoácidos D) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos ,  disustituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, -carboxiglutamato, -N,N,N-trimetil lisina, -N-acetil lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5hidroxilisina, s-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación polipeptídica usada en la presente memoria, la dirección hacia la izquierda es la dirección amino terminal y la dirección hacia la derecha es la dirección carboxi terminal, de acuerdo con el uso convencional y la convención.
El término “polinucleótido” como se indica en la presente memoria significa una forma polimérica de polinucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas mono y bicatenarias de ADN.
La expresión “polinucleótido aislado” como se usa en la presente memoria significará un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos que en virtud de su origen el “polinucleótido” aislado (1) no está asociado con toda o una parte de un polinucleótido en el que el “polinucleótido aislado” se encuentra en la naturaleza, (2) está unido operativamente a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza o
(3) no aparece en la naturaleza como parte de una secuencia mayor.
El término “oligonucleótido” referido en la presente memoria incluye nucleótidos de origen natural y modificados unidos entre sí por enlazadores oligonucleotídicos de origen natural y no natural. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que comprende generalmente una longitud de 200 bases o menos. Preferiblemente los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud y más preferiblemente de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son habitualmente monocatenarios, por ejemplo, para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, por ejemplo, para su uso en la construcción de un mutante génico. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido.
La expresión “nucleótido de origen natural” referido en la presente memoria incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. La expresión “nucleótidos modificados” referida en la presente memoria incluye nucleótidos con grupos de azúcares modificados o sustituidos y similares. La expresión “enlaces oligonucleotídicos” referida en la presente memoria incluye enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem Soc. 106: 6077(1984); Stein et al, Nucl. Acids Res.,
16: 3209(1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogue: A Practical Approach, pág. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991)); Stec et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.151.510; Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews, 90: 543(1990). Un oligonucleótido puede incluir un marcador para la detección, si se desea.
Las secuencias “unidas operativamente” incluyen secuencias de control de la expresión que son contiguas al gen de interés y secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. La expresión “secuencia de control de la expresión” como se usa en la presente memoria se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de secuencias codificantes a las que se ligan. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias de inicio, terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción apropiadas; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de corte y empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (es decir, secuencias consenso Kozak); secuencias que potencian la estabilidad proteica; y, cuando se desea, secuencias que potencian la secreción proteica. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen un sitio de unión ribosómica, promotor y secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. La expresión “secuencias de control” pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero de fusión.
El término “vector” como se usa en la presente memoria, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora y por lo tanto se replican junto con el genoma hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se unen operativamente. Tales vectores se denominan en la presente memoria “vectores de expresión recombinantes” (o simplemente, “vectores de expresión”). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están con frecuencia en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” pueden usarse de forma intercambiable puesto que el plásmido es la forma más habitualmente usada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectivos en replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que sirven funciones equivalentes.
La expresión “célula hospedadora recombinante” (o simplemente “célula hospedadora”), como se usa en la presente memoria pretende referirse a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debería entenderse que tales términos pretenden referirse no solamente a la célula sujeto particular sino a la descendencia de dicha célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha descendencia puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero aún se incluye dentro del alcance de la expresión “célula hospedadora” como se usa en la presente memoria.
La expresión “hibridar selectivamente” referida en la presente memoria significa unir específicamente y de forma detectable. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos de acuerdo con la invención hibridan selectivamente con cadenas de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan las cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de “alta rigurosidad”
o “altamente rigurosas” para conseguir condiciones de hibridación selectivas como se conocen en la técnica y se analizan en la presente memoria. Un ejemplo de condiciones de “alta rigurosidad” o “altamente rigurosas” es un método de incubar un polinucleótido con otro polinucleótido, en el que un polinucleótido puede fijarse a una superficie sólida tal como una membrana, en un tampón de hibridación de SSPE o SSC 6X, formamida 50 %, reactivo de Denhardt 5X, SDS 0,5 %, ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado 100 g/ml a una temperatura de hibridación de 42 ºC durante 12-16 horas, seguido de lavado dos veces a 55 ºC usando un tampón de lavado de SSC 1X, SDS 0,5 %. Véase también Sambrook et al., mencionado anteriormente, pág. 9.50-9.55.
La expresión “porcentaje de identidad de secuencia” en el contexto de secuencias de nucleótidos se refiere a los restos en dos secuencias que son iguales cuando se alinean para máxima correspondencia. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser sobre un tramo de al menos aproximadamente 9 nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 32 nucleótidos y preferiblemente al menos aproximadamente 36, 48 o más nucleótidos. Existen varios algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, la secuencias de polinucleótidos pueden compararse usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en Wisconsin Package Versión 10.3, Accelrys, San Diego, CA. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de búsqueda y consulta (Pearson, Methods Enzymol., 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol., 132; 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol., 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol., 276: 71-84 (1998). A no ser que se especifique de otro modo, se usan los parámetros por defecto para un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de nucleótidos puede determinarse usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) o usando Gap con sus parámetros por defecto como se proporciona en Wisconsin Package Versión 10.3.
Una referencia a secuencia de nucleótidos abarca su complemento a no ser que se especifique de otro modo. Por lo tanto, una transferencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia particular debería entenderse que abarca su hebra complementaria con su secuencia complementaria.
En la técnica de biología molecular, los investigadores usan las expresiones “porcentaje de identidad de secuencia”, “porcentaje de similitud de secuencia” y “porcentaje de homología de secuencia” de forma intercambiable. En la presente solicitud, estas expresiones tendrán el mismo significado con respecto a las secuencias de nucleótidos solamente. La expresión “similitud sustancial” o “similitud de secuencia sustancial”, cuando se refieren a un ácido nucleico o fragmento del mismo indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), existe una identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente 85 %, preferiblemente al menos aproximadamente 90 % y más preferiblemente al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, según se mide por cualquier algoritmo buen conocido de identidad de secuencia, tales como FASTA, BLAST o Gap, como se ha analizado anteriormente.
Como se aplica a polipéptidos, la expresión “identidad sustancial” significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tales como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten al menos 75 % u 80 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferiblemente al menos 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Una “sustitución de aminoácido conservativa” es una en la que un resto aminoacídico se sustituye con otro resto aminoacídico que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud pueden ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los expertos en la materia conocen bien medios para realizar este ajuste. Véase, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol., 24: 307-31 (1994). Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifático: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilanalina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; y 6) las cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilanalina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparaginaglutamina.
Como alternativa, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 desvelada en Gonnet et al., Science, 256: 1443-45 (1992). Un reemplazo “moderadamente conservativo” es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La similitud de secuencia para polipéptidos se mide típicamente usando software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustitución de aminoácidos conservativa. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como “Gap” y “Bestfit” que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos cercanamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, Wisconsin package Versión 10.3. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en Wisconsin package Versión 10.3. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de búsqueda y consulta (Pearson (1990); Pearson (2000)). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando los parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997).
La longitud de las secuencias polipeptídicas comparadas con respecto a homología generalmente será de al menos aproximadamente 16 restos aminoacídicos, habitualmente al menos aproximadamente 20 restos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 restos, típicamente al menos aproximadamente 28 restos y preferiblemente más de aproximadamente 35 restos. Cuando se busca en una base de datos que contiene secuencias de un gran número de organismos diferentes, es preferible comparar secuencias de aminoácidos.
Como se usa en la presente memoria, los términos “marcador” o “marcado” se refieren a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. En una realización, el marcador es un marcador detectable, por ejemplo, incorporación de un aminoácido radiomarcado o unión a un polipéptido de restos biotinilados que pueden detectarse por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por métodos ópticos o colorimétricos). En otra realización, el marcador o indicador puede ser terapéutico, por ejemplo, un conjugado de fármaco o toxina. Se conocen en la técnica y pueden usarse diversos métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero sin limitación, los siguientes radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H,14C, 15N, 35S, 90Y, 99TC, 111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánido), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano, -galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilados, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias en pareja de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcadores epitópicos), agentes magnéticos, tales como quelados de gadolinio, toxinas tales como toxina de pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. En algunas realizaciones, se unen marcadores por ramas espaciadoras de diversas longitudes para reducir el impedimento histérico potencial.
El término “agente” se usa en la presente memoria para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto preparado a partir de materiales biológicos. La expresión “agente o fármaco farmacéutico” como se usa en la presente memoria se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra de forma apropiada a un paciente. Otros términos químicos en la presente memoria se usan de acuerdo con el uso convencional en la técnica, como se ejemplifica en The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985).
La expresión agente “antiinflamatorio” o “inmunomodulador” se usa en la presente memoria para referirse a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir la inflamación, incluyendo enfermedad inflamatoria en un sujeto, incluyendo en un ser humano. En diversas realizaciones de la presente invención, la enfermedad inflamatoria puede ser, pero sin limitación enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad diverticular, gastritis, enfermedad hepática, esclerosis biliar primaria, colangitis esclerosante. Las enfermedades inflamatorias también pueden incluir pero sin limitación enfermedad abdominal (incluyendo peritonitis, apendicitis, enfermedad del tracto biliar), mielitis transversa aguda, dermatitis alérgica (incluyendo piel alérgica, eccema alérgico, atopia cutánea, eccema atópico, dermatitis atópica, inflamación cutánea, eccema inflamatorio, dermatitis inflamatoria, piel con pulgas, dermatitis biliar, eccema biliar, piel con ácaros del polvo), espondilitis anquilosante (síndrome de Reiters), asma, inflamación de las vías respiratorias, aterosclerosis, arteriosclerosis, atresia biliar, inflamación de la vejiga, cáncer de mama, inflamación cardiovascular (incluyendo vasculitis, infartos unguales reumatoides, úlceras de la pierna, polimiositis, inflamación vascular crónica, pericarditis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica), pancreatitis crónica, inflamación perineural, colitis (incluyendo colitis amébica, colitis infecciosa, colitis bacteriana, colitis de Crohn, colitis isquémica, colitis ulcerosa, protocolitis idiopática, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis pseudomembranosa), trastornos vasculares de colágeno (artritis reumatoide, SLE, esclerosis sistémica progresiva, enfermedad de tejido conectivo mixta, diabetes mellitus), enfermedad de Crohn (enteritis regional, ileitis granulomatosa, ileocolitis, inflamación del sistema digestivo), enfermedad desmielinizante (incluyendo mielitis, esclerosis múltiple, esclerosis diseminada, encefalomielitis diseminada aguda, desmielinización perivenosa, deficiencia de vitamina B12, síndrome de Guillain Barre, retrovirus asociado con MS), dermatomiositis, diverticulitis, diarrea exudativa, gastritis, hepatitis granulomatosa, inflamación granulomatosa, colecistitis, diabetes mellitus insulinodependiente, enfermedades inflamatorias del hígado (fibrosis hepática, cirrosis biliar primaria, hepatitis, colangitis esclerosante), inflamación de los pulmones (fibrosis pulmonar idiopática, granuloma eosinófilo del pulmón, histiocistosis pulmonar X, inflamación peribronquiolar, bronquitis aguda), linfogranuloma venéreo, melanoma maligno, enfermedad de la boca/dientes (incluyendo gingivitis, enfermedad periodontal), mucositis, inflamación del sistema musculoesquelético (miositis), esteatohepatitis no alcohólica (enfermedad del hígado graso no alcohólica), inflamación ocular y orbital (incluyendo uveítis, neuritis óptica, ulceración reumatoide periférica, inflamación corneal periférica), osteoartritis, osteomielitis, inflamación faríngea, poliartritis, proctitis, psoriasis, lesión por radiación, sarcoidosis, necropatía falciforme, tromboflebitis superficial, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, tiroiditis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de injerto contra hospedador, lesión de quemadura aguda, síndrome de Behcet, síndrome de Sjögren.
Los términos paciente y sujetos incluyen sujetos humanos y veterinarios.
Anticuerpos humanos Anti-MAdCAM y Caracterización de los mismos
Se describen anticuerpos anti-MAdCAM que comprenden secuencias CDR humanas. Se describen anticuerpos humanos anti-MAdCAM. En algunas descripciones, se producen anticuerpos humanos anti-MAdCAM por inmunización de un animal transgénico no humano, por ejemplo, un roedor, cuyo genoma comprende genes de inmunoglobulina humana de modo que el animal transgénico produce anticuerpos humanos. En algunas descripciones, el anticuerpo anti-MAdCAM no se une al complemento.
En una descripción el anticuerpo anti-MAdCAM es 1.7.2. En otra descripción, el anticuerpo anti-MAdCAM comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 ó 68 (con o sin la secuencia señal) o la región variable de una cualquiera de dichas secuencias de aminoácidos, o una o más CDR de estas secuencias de aminoácidos. En otra 5 descripción, el anticuerpo anti-MAdCAM comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 64 (con o sin la secuencia señal) o la secuencia de aminoácidos de la región variable o de una o más CDR de dichas secuencias de aminoácidos. También se describen anticuerpos humanos anti-MAdCAM que comprenden la secuencia de aminoácidos del comienzo de la CDR1 al final de la CDR3 de una cualquiera de las secuencias anteriormente
10 mencionadas. Se describe adicionalmente un anticuerpo anti-MAdCAM que comprende una o más regiones FR de cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente
Adicionalmente se describe un anticuerpo anti-MAdCAM que comprende una de las secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas en las que se han realizado una o más modificaciones. En algunas descripciones, las cisteínas en el anticuerpo, que pueden ser químicamente reactivas, se sustituyen con otro resto, tal como, sin
15 limitación, alanina o serina. En una descripción, la sustitución es en una cisteína no canónica. La sustitución puede realizarse en una CDR o región flanqueante de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. En algunas descripciones, la cisteína es canónica.
En algunas descripciones, se realiza una sustitución de aminoácidos para eliminar sitios proteolíticos potenciales en el anticuerpo. Tales sitios pueden aparecer en una región CDR o flanqueante de un dominio variable o en el dominio
20 constante de un anticuerpo. La sustitución de restos de cisteína y retirada de sitios proteolíticos puede reducir la heterogeneidad en los productos de anticuerpo. En algunas descripciones, los pares de asparagina-glicina, que forman sitios de desamidación potencial, se eliminan alterando uno o ambos de los restos. En algunas descripciones, se realiza una sustitución de aminoácidos para añadir o retirar sitios de glucosilación potenciales en la región variable de un anticuerpo de la invención.
25 En algunas descripciones, la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo anti-MAdCAM de la invención se escinde. En diversas descripciones, las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos anti-MAdCAM pueden incluir opcionalmente una secuencia señal.
Se describen doce anticuerpos monoclonales humanos anti-MAdCAM y las líneas de células de hibridoma que los producen. La Tabla 1 enumera los identificadores de secuencia (SEC ID Nº:) de los ácidos nucleicos que codifican
30 las cadenas pesada y ligera de longitud completa (incluyendo secuencia señal) y las secuencias de aminoácidos deducidas de longitud completa correspondientes.
Tabla 1
ANTICUERPOS HUMANOS ANTI-MAdCAM
Anticuerpo Monoclonal
IDENTIFICADOR DE SECUENCIA (SEC ID Nº)
Longitud Completa
Pesada
Ligera
ADN
Proteína ADN Proteína
1.7.2
1 2 3 4
1.8.2
5 6 7 8
6.14.2
9 10 11 12
6.22.2
13 14 15 16
6.34.2
17 18 19 20
6.67.1
21 22 23 24
6.73.2
25 26 27 28
6.77.1
29 30 31 32
7.16.6
33 34 35 36
ANTICUERPOS HUMANOS ANTI-MAdCAM
Anticuerpo Monoclonal
IDENTIFICADOR DE SECUENCIA (SEC ID Nº)
Longitud Completa
Pesada
Ligera
ADN
Proteína ADN Proteína
7.20.5
37 38 39 40
7.26.4
41 42 43 44
9.8.2
45 46 47 48
Se describe la versión modificada de ciertos anticuerpos monoclonales humanos anti-MAdCAM anteriormente identificados. La Tabla 2 enumera los identificadores de secuencia para las secuencias proteicas y de ADN de los anticuerpos modificados.
Tabla 2
ANTICUERPOS HUMANOS ANTI-MAdCAM
Anticuerpo Monoclonal Modificado
IDENTIFICADOR DE SECUENCIA (SEC ID Nº)
Longitud Completa
Pesada
Ligera
ADN
Proteína ADN Proteína
6.22.2-mod
51 52 53 54
6.34.2-mod
55 56 57 58
6.67.1-mod
59 60 61 62
6.77.1-mod
63 64 65 66
7.26.4-mod
41 42 67 68
Clase y Subclase de anticuerpos anti-MAdCAM
El anticuerpo puede ser una molécula de IgG, IgM, IgE, IgA o IgD. En una realización preferida el anticuerpo es una clase IgG y es una subclase IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una realización más preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM
10 es de subclase IgG2 o IgG4. En otra realización preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM es de la misma clase y subclase que el anticuerpo 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod que es IgG2, o 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 o 9.8.2, que es IgG4.
La clase y subclase de anticuerpos anti-MAdCAM puede determinarse por cualquier método conocido en la técnica. En general, la clase y subclase de un anticuerpo puede determinarse usando anticuerpos que son específicos para 15 una clase y subclase particular de anticuerpo. Tales anticuerpos están disponibles en el mercado. ELISA, Transferencia de Western así como otras técnicas pueden determinar la clase y subclase. Como alternativa, la clase y subclase pueden determinarse por secuenciación de todos o una parte de los dominios constantes de las cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos conocidas de diversas clases y subclases de inmunoglobulinas y determinando la clase y subclase de
20 los anticuerpos como la clase que muestra la mayor identidad de secuencia.
Selectividad de Moléculas y Especies
En otra descripción el anticuerpo anti-MAdCAM demuestra selectividad tanto de especies como de moléculas. En una descripción, el anticuerpo anti-MAdCAM se une a MAdCAM humano, de cynomolgus o de perro. En algunas descripciones, el anticuerpo anti-MAdCAM no se une a una especie de mono del Nuevo Mundo tal como un tití. Siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva, puede determinarse la selectividad de especie para el anticuerpo anti-MAdCAM usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede determinarse la selectividad de especies usando transferencia de Western, FACS, ELISA o inmunohistoquímica. En una realización preferida, puede determinarse la selectividad de especies usando inmunohistoquímica.
En algunas descripciones, un anticuerpo anti-MAdCAM que se une específicamente a MAdCAM tiene selectividad para MAdCAM frente a VCAM, fibronectina o cualquier otro antígeno que es de al menos 10 veces, preferiblemente al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ó 90 veces, más preferiblemente al menos 100 veces. En una descripción, el anticuerpo anti-MAdCAM no muestra ninguna unión apreciable a VCAM, fibronectina o cualquier otro antígeno distinto de MAdCAM. Puede determinarse la selectividad del anticuerpo anti-MAdCAM para MAdCAM usando métodos bien conocidos en la técnica siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva. Por ejemplo, puede determinarse la selectividad usando transferencia de Western, FACS, ELISA o inmunohistoquímica.
Afinidad de Unión de anticuerpos Anti-MAdCAM a MAdCAM
En una descripción, los anticuerpos anti-MAdCAM se unen específicamente a MAdCAM con alta afinidad. En una descripción, el anticuerpo anti-MAdCAM se une específicamente a MAdCAM con una Kd de 3 x 10-8 M o menos, según se mide por resonancia de plasmón superficial, tal como BIAcore. En una descripción, el anticuerpo se une específicamente a MAdCAM con una Kd de 1 x 10-8 o menos o 1 x 10-9 M o menos. En una descripción, el anticuerpo se une específicamente a MAdCAM con una Kd de o 1 x 10-10 M o menos. En otras descripciones, un anticuerpo se une específicamente a MAdCAM con una Kd de 2,66 x 10-10 M o menos, 2,35 x 10-11 M o menos o 9 x 10-12 M o menos. En otra descripción, el anticuerpo se une específicamente a MAdCAM con una Kd de 1 x 10-11 M o menos. En otra descripción, el anticuerpo se une específicamente a MAdCAM con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo seleccionado de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.7332, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. Un anticuerpo con “sustancialmente la misma Kd” como un anticuerpo de referencia tiene una Kd que es  100 pM, preferiblemente  50 pM, más preferiblemente  20 pM, aún más preferiblemente  10 pM,  5 pM o  2 pM, en comparación con la Kd del anticuerpo de referencia del mismo experimento. En otra descripción, el anticuerpo se une a MAdCAM sustancialmente con la misma Kd que un anticuerpo que comprende uno más dominios variables o una o más CDR de un anticuerpo seleccionado de 1.7.2, 1.8.2, 6.14, 2,6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripción más, el anticuerpo se une a MAdCAM con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12,14,16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 o 68 (con
o sin la secuencia señal), o el dominio variable de las mismas. En otra descripción, el anticuerpo se une a MAdCAM con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo que comprende una o más CDR de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8,10, 12,14,16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, S2, 54, 56, 58, 62, 64, 66 o 68.
La afinidad de unión de un anticuerpo anti-MAdCAM con MAdCAM puede determinarse por cualquier método conocido en la técnica. En una descripción, la afinidad de unión puede medirse por ELISA competitivos, RIA o resonancia de plasmón superficial, tal como BIAcore. En otra descripción, la afinidad de unión se mide por resonancia de plasmón superficial. En otra, la afinidad de unión y la tasa de disociación se miden usando un BIAcore. Un ejemplo para determinar la afinidad de unión se describe posteriormente en el Ejemplo II.
Semivida de los Anticuerpos anti-MAdCAM
De acuerdo con otro objeto de la invención, el anticuerpo anti-MAdCAM tiene una semivida de al menos un día in vitro o in vivo. En una descripción, el anticuerpo o parte del mismo tiene una semivida de al menos tres días. En otra descripción, el anticuerpo o parte del mismo tiene una semivida de cuatro días o más. En otra descripción, el anticuerpo o parte del mismo tiene una semivida de ocho días o más. En otra descripción, el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo se deriva o modifica de modo que tenga una semivida más larga, como se analiza posteriormente. En otra descripción, el anticuerpo puede contener mutaciones puntuales para aumentar la semivida en suero, tal como se describe en el documento WO 00/09560, publicado el 24 de febrero de 2000.
La semivida del anticuerpo puede medirse por cualquier medio conocido por un experto en la materia. Por ejemplo, la semivida del anticuerpo puede medirse por transferencia de Western, ELISA o RIA durante un periodo apropiado de tiempo. La semivida del anticuerpo puede medirse en cualquier animal apropiado, tal como un primate, por ejemplo, mono cynomolgus o un ser humano.
Identificación de Epítopos de MAdCAM Reconocidos por Anticuerpo Anti-MAdCAM
También se describe un anticuerpo humano anti-MAdCAM que se une al mismo antígeno o epítopo que un anticuerpo humano anti-MAdCAM proporcionado en la presente memoria. Se describe adicionalmente un anticuerpo humano anti-MAdCAM que compite o compite de manera cruzada con un anticuerpo humano anti-MAdCAM. En una descripción, el anticuerpo humano anti-MAdCAM es 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1,
7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripción, el anticuerpo humano anti-MAdCAM comprende uno o más dominios variables o una o más CDR de un anticuerpo seleccionado de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripción más el anticuerpo humano anti-MAdCAM comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 o 68 (con o sin la secuencia señal) o un dominio variable de las mismas. En otra descripción, el anticuerpo humano anti-MAdCAM comprende una o más CDR de un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 o 68. En una descripción altamente preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM es otro anticuerpo humano.
Puede determinarse si un anticuerpo anti-MAdCAM se une al mismo antígeno que otro anticuerpo anti-MAdCAM usando una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo conocido anti-MAdCAM para capturar el antígeno, eluir el antígeno del anticuerpo anti-MAdCAM y después determinar si el anticuerpo de ensayo se unirá al antígeno eluído. Puede determinarse si un anticuerpo compite con un anticuerpo anti-MAdCAM por unión del anticuerpo anti-MAdCAM con MAdCAM en condiciones de saturación y midiendo después la capacidad del anticuerpo de ensayo para unirse a MAdCAM. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a la MAdCAM al mismo tiempo que el anticuerpo anti-MAdCAM, entonces el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente que el anticuerpo anti-MAdCAM. Sin embargo, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse a la MAdCAM al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de ensayo compite con el anticuerpo anti-MAdCAM humano. Este experimento puede realizarse usando ELISA o resonancia de plasmón superficial o, preferiblemente, BIAcore. Para ensayar si un anticuerpo anti-MAdCAM compite de manera cruzada con otro anticuerpo anti-MAdCAM puede usarse el método de competición descrito anteriormente en dos direcciones, es decir determinando si el anticuerpo conocido bloquea al anticuerpo de ensayo y viceversa.
Uso de Gen de Cadena Ligera y Pesada
También se describe un anticuerpo anti-MAdCAM que comprende una región variable de cadena ligera codificada por un gen  humano. En una descripción, la región variable de cadena ligera está codificada por una familia de genes V A2, A3, A26, B3, O12 u O18. En diversas descripciones, la cadena ligera comprende no más de once, no más de seis o no más de tres sustituciones de aminoácidos de la secuencia humana de línea germinal Vx, A2, A3, A26, B3, O12 u O18. En una descripción, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservativas. Las SEC ID Nº: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 y 48 proporcionan las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras kappa de longitud completa de doce anticuerpos anti-MAdCAM, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2. Las Figuras 1K-1T son alineamientos de las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena ligera de doce anticuerpos anti-MAdCAM con las secuencias de línea germinal de las que derivan. La Figura 2A muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena ligera de las cadenas ligeras Kappa de doce anticuerpos anti-MAdCAM entre sí. Siguiendo las enseñanzas de la presente memoria descriptiva, un experto en la materia podría determinar las diferencias entre las secuencias de línea germinal y las secuencias de anticuerpos de anticuerpos anti-MAdCAM adicionales. Las SEC ID Nº: 54, 58, 62, 66 ó 68 proporciona la secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras kappa de longitud completa de cinco anticuerpos anti-MAdCAM adicionales, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod, modificadas por sustitución de aminoácidos de sus anticuerpos parentales anti-MAdCAM, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 o 7.26.4, respectivamente.
En una descripción, la VL del anticuerpo anti-MAdCAM contiene las mismas mutaciones, en relación con la secuencia de aminoácidos de línea germinal, que una cualquiera o más de las VL de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. Se describe también un anticuerpo anti-MAdCAM que utiliza los mismos genes V y Jk humano como un anticuerpo ejemplificado. En algunas descripciones, el anticuerpo comprende una o más de las mismas mutaciones de la línea germinal que uno o más anticuerpos ejemplificados. En algunas descripciones, el anticuerpo comprende diferentes sustituciones en una o más de las mismas posiciones que uno o más de los anticuerpos ejemplificados. Por ejemplo, la VL del anticuerpo anti-MAdCAM puede contener una o más sustituciones de aminoácidos que son la misma que las presentes en el anticuerpo 7.16.6 y otra sustitución de aminoácidos que es la misma que el anticuerpo 7.26.4. De esta manera, pueden mezclarse y emparejarse diferentes características de unión de anticuerpos para alterar, por ejemplo, la afinidad del anticuerpo por MAdCAM o su tasa de disociación del antígeno. En otra descripción, las mutaciones se realizan en la misma posición que las encontradas en una cualquiera o más de la VL de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.205, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 726.4-mod, pero se realizan sustituciones de aminoácidos conservativas en lugar de usar el mismo aminoácido. Por ejemplo, si la sustitución de aminoácidos comparada con la línea germinal en uno de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod es glutamato, puede sustituirse de forma conservativa aspartato. De forma similar, si la sustitución de aminoácidos es serina, se puede sustituir conservativamente treonina.
En otra descripción, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de la VL de 1:7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.25.4, 9.8.2,
6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripción, la cadena ligera comprende secuencias de aminoácidos que son las mismas que las regiones CDR de la cadena ligera de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod
o 7.26.4-mod. En otra descripción, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos cuando al menos una región CDR de la cadena ligera de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 634.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripción, la cadena ligera comprende secuencias de aminoácidos con CDR de diferentes cadenas ligeras que usan los mismos genes VK y JK. En una descripción más preferida, las CDR de diferentes cadenas ligeras se obtienen de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 622.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra realización preferida, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 64, 66 ó 68 con o sin la secuencia señal. En otra descripción, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEC ID Nº: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ó 67 (con o sin la secuencia señal) o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene 1-11 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos de la misma. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservativas. En otra realización, el anticuerpo o parte del mismo comprende una cadena ligera lambda.
También se describe un anticuerpo anti-MAdCAM o parte del mismo que comprende una secuencia de gen VH humano o una secuencia derivada de un gen VH humano. En una descripción, la secuencia de aminoácidos de cadena pesada deriva de una familia de genes humanos VH 1-8, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 ó 4-4. En diversas descripciones, la cadena pesada comprende no más de quince, no más de seis o no más de tres cambios de aminoácidos de la secuencia génica humana de línea germinal VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 ó 4-4.
Las SEC ID Nº: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 y 46 proporcionan las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de longitud completa de doce anticuerpos anti-MAdCAM. Las Figuras 1A-1J son alineamientos de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de doce anticuerpos anti-MAdCAM con las secuencias de línea germinal de las que derivan. La Figura 2B muestra los alineamientos de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de doce anticuerpos anti-MAdCAM entre sí. Siguiendo las enseñanzas de la presente memoria descriptiva y las secuencias de nucleótidos de la invención, un experto en la materia podría determinar la secuencia de aminoácidos codificada de las doce cadenas pesadas anti-MAdCAM y las cadenas pesadas de línea germinal y determinar las diferencias entre las secuencias de línea germinal de las secuencias de anticuerpo. Las SEC ID Nº: 52, 56, 60 y 64 proporcionan las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de longitud completa de los anticuerpos anti-MAdCAM, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod y 6.67.1-mod, modificados por sustitución de aminoácidos de sus anticuerpos parentales anti-MAdCAM, 6.22.2, 6.34.2 y 6.67.1 respectivamente. Un anticuerpo anti-MAdCAM modificado adicional, 7.26.4-mod, tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de longitud completa que es SEC ID Nº: 42.
En una descripción preferida, la VH del anticuerpo anti-MAdCAM contiene las mismas mutaciones, en relación con la secuencia de aminoácidos de línea germinal, como una cualquiera o más de las VH de los anticuerpos 1.72, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67,1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. De forma similar a la analizada anteriormente, el anticuerpo comprende una o más de las mismas mutaciones de línea germinal que uno o más anticuerpos ejemplificados. En algunas descripciones, el anticuerpo comprende diferentes sustituciones en una o más de las mimas posiciones que uno o más de los anticuerpos ejemplificados. Por ejemplo, la VH del anticuerpo anti-MAdCAM puede contener una o más sustituciones de aminoácidos que son las mismas que las presentes en el anticuerpo 7.16.6 y otra sustitución de aminoácidos que es la misma que el anticuerpo 7.26.4. De esta manera pueden mezclarse y emparejarse diferentes características de unión de anticuerpos para alterar, por ejemplo, la afinidad del anticuerpo por MAdCAM o su tasa de disociación del antígeno. En otra realización, una sustitución de aminoácidos en comparación con la línea germinal se realiza en la misma posición que una sustitución de la línea germinal como se encuentra en una cualquiera o más de las VH del anticuerpo de referencia 1.72, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2. 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod, pero la posición se sustituye con un resto diferente, que es una sustitución conservativa en comparación con el anticuerpo de referencia.
En otra descripción, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de la VH de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod. 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripción, la cadena pesada comprende secuencias de aminoácidos que son las mismas que las regiones CDR de la cadena pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.15.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.57.1-mod, 6.77.1-mod
o 7.26.4-mod. En otra descripción, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos una región CDR de la cadena pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.4, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripción, la cadena pesada comprende secuencias de aminoácidos con CDR de diferentes cadenas pesadas. En una realización más preferida, las CDR de cadenas pesadas diferentes se obtienen de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripción, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 64 con o sin la secuencia señal. En otra descripción, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEC ID Nº: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ó 63, o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene 1-15 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos de la misma. En otra realización, las sustituciones son sustituciones de aminoácidos conservativas.
Métodos para Producir Anticuerpos y Líneas Celulares productoras de Anticuerpos
Inmunización
En una realización de la presente invención, se producen anticuerpos humanos inmunizando a un animal no humano que comprende algunos o todos los loci de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana con un antígeno de MAdCAM. En una realización preferida, el animal no humano es un animal XENOMOUSE, que es una estirpe de ratón modificado por ingeniería genética que comprende grandes fragmentos de los loci de inmunoglobulina humana y es deficiente en producción de anticuerpos de ratón. Véase, por ejemplo, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) y las Patentes de Estados Unidos 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001,
6.114.598 y 6.130.364. Véanse también los documentos WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/4503 y WO 96/33735, WO 98/16654. WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00 09560 y WO 00/037504. El animal XENOMOUSE produce un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos completamente humanos y genera mAb humanos específicos de antígeno. Un animal XENOMOUSE de segunda generación contiene aproximadamente 80 % del repertorio del gen de anticuerpo V humano a través de la introducción de fragmentos YAC de configuración de línea germinal con tamaño de megabases de los loci de cadena pesada y loci de cadena ligera  humanos. En otras realizaciones, los ratones XENOMOUSE contienen aproximadamente todos los locus de cadena pesada y cadena ligera  humanos. Véase See Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green y Jakobovits, J. E.xp. Med. 188: 483-495 (1998).
La invención también proporciona un método para preparar anticuerpos anti-MAdCAM de animales no humanos, no ratones inmunizando animales transgénicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humana. Pueden producirse tales animales usando los métodos descritos inmediatamente antes. Los métodos descritos en los presentes documentos pueden modificarse como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.994.619 (la “patente 619”). La patente 619 describe métodos para producir nuevas líneas celulares y células de masa celular interna cultivada (CICM) derivadas de cerdos y vacas y células CICM transgénicas en las que se ha insertado ADN heterólogo. Las células transgénicas CICM pueden usarse para producir embriones, fetos y descendencia transgénicos clonados. La patente 619 también describe métodos para producir animales transgénicos que son capaces de transmitir el ADN heterólogo a sus descendientes. En una realización preferida, los animales no humanos pueden ser ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos.
En otra realización, el animal no humano que comprende el loci de inmunoglobulina humana son animales que tienen un “minilocus” de inmunoglobulinas humanas. En el enfoque de minilocus, un locus de Ig exógeno se imita a través de la inclusión de genes individuales del locus de Ig. Por lo tanto, uno o más genes de VH, uno o más genes de DH, uno o más genes de JH, un dominio o dominios  constantes y un segundo dominio o dominios constantes (preferiblemente un dominio o dominios constantes gamma) se forman en una construcción para inserción en un animal. Este enfoque se describe, entre otros, en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.545.807, 5.545.806, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215 y
5.643.763.
Una ventaja del enfoque de minilocus es la rapidez con la que las construcciones que incluyen partes del locus de Ig pueden generarse e introducirse en animales. Sin embargo, una desventaja potencial del enfoque de minilocus es que puede no haber suficiente diversidad de inmunoglobulinas para soportar el desarrollo de linfocitos B completo, de modo que puede haber una producción de anticuerpos menor.
Para producir un anticuerpo anti-MAdCAM humano, un animal no humano que comprende algunos o todos los loci de inmunoglobulina humana se inmuniza con un antígeno de MAdCAM y un anticuerpo o la célula productora de anticuerpos se aísla del animal. El antígeno de MAdCAM puede ser MAdCAM aislada y/ purificada y es preferiblemente una MAdCAM humana. En otra realización, el antígeno de MAdCAM es un fragmento de MAdCAM, preferiblemente el domino extracelular de MAdCAM. En otra realización, el antígeno de MAdCAM es un fragmento que comprende al menos un epítopo de MAdCAM. En otra realización, el antígeno de MAdCAM es una célula que expresa MAdCAM en su superficie celular, preferiblemente una célula que sobreexpresa MAdCAM en su superficie celular.
La inmunización de animales puede realizarse por cualquier método conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press (1990). Se conocen bien en la técnica métodos para inmunizar animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, vacas y caballos. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane y Patente de Estados Unidos Nº 5.994.619. En una realización preferida, el antígeno de MAdCAM se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Tales adyuvantes incluyen adyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Tales adyuvantes pueden proteger el polipéptido de dispersión rápida por secuestro en un depósito local o pueden contener sustancias que estimulan al hospedador para que secrete factores que son quimiotácticos para macrófagos y otros componentes del sistema inmune. Preferiblemente, si se administra un polipéptido, el programa de inmunización implicará dos o más administraciones del polipéptido, extendidas a lo largo de varias semanas.
El Ejemplo I proporciona un protocolo para inmunizar un animal XENOMOUSE con MAdCAM humana de longitud completa en solución salina tamponada con fosfato.
Producción de Anticuerpos y Líneas Celulares Productoras de Anticuerpos
Después de la inmunización de un animal con un antígeno de MAdCAM, pueden obtenerse anticuerpos y/o células productoras de anticuerpos del animal. Un suero que contiene anticuerpos anti-MAdCAM se obtiene del animal por sangrado o sacrificio del animal. El suero puede usarse como se obtiene del animal, puede obtenerse una fracción de inmunoglobulina del suero o pueden purificarse los anticuerpos anti-MAdCAM del suero.
En otra realización, pueden prepararse líneas celulares inmortalizadas que producen anticuerpos del animal inmunizado. Después de la inmunización, el animal se sacrifica y se inmortalizan los linfocitos B usando métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos de inmortalización de células incluyen, pero sin limitación, transfectarlas con oncogenes, infectarlas con un virus oncogénicos y cultivarlas en condiciones que seleccionen células inmortalizadas, someterlas a compuestos carcinogénicos o mutantes, fusionarlas con una célula inmortalizada, por ejemplo, una célula de mieloma e inactivar un gen supresor de tumores. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, mencionado anteriormente. En realizaciones que implican a las células de mieloma, las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea celular no secretora). Después de inmortalización y selección por antibióticos, las células inmortalizadas o sobrenadantes de cultivo de las mismas, se exploran usando MAdCAM, una parte de la misma o una célula que expresa MAdCAM. En una realización preferida, la exploración inicial se realiza usando un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), preferiblemente un ELISA. Un ejemplo de exploración con ELISA se proporciona en la publicación de PCT Nº WO 00/37504.
En otra realización, las células productoras de anticuerpos pueden prepararse a partir de un ser humano que tiene un trastorno autoinmune y que expresa anticuerpos anti-MAdCAM. Las células que expresan los anticuerpos anti-MAdCAM pueden aislarse aislando glóbulos blancos y sometiéndolos a separación de células activadas por fluorescencia (FACS) o seleccionando en placas recubiertas con MAdCAM o una parte de la misma. Estas células pueden fusionarse con un mieloma no secretor humano para producir hibridomas humanos que expresan anticuerpos humanos anti-MAdCAM. En general, esta es una realización menos preferida debido a que es probable que los anticuerpos anti-MAdCAM tengan una baja afinidad para MAdCAM.
Las células productoras de anticuerpo anti-MAdCAM, por ejemplo, hibridomas se seleccionan, clonan y exploran adicionalmente con respecto a características deseables, incluyendo crecimiento celular robusto, alta producción de anticuerpos y características de anticuerpos deseables, como se analiza adicionalmente a continuación. Los hibridomas pueden cultivarse y expandirse in vivo en animales singénicos, en animales que carecen de sistema inmune, por ejemplo, ratones desnudos o en cultivo celular in vitro. Los métodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas se conocen bien por los expertos en la materia.
Preferiblemente, el animal inmunizado es un animal no humano que expresa genes de inmunoglobulina humana y los linfocitos B de bazo se fusionan con un mieloma derivado de la misma especie que el animal no humano. Más preferiblemente, el animal inmunizado es un animal XENOMOUSE y la línea celular de mieloma es un mieloma de ratón no secretor, tal como la línea celular de mieloma P3-X63-AG8-653 (ATCC). Véase, por ejemplo, el Ejemplo I.
De este modo, en una realización, la invención proporciona métodos para producir una línea celular que produce un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento del mismo dirigido a MAdCAM que comprende (a) inmunizar un animal transgénico no humano descrito en el presente memoria con MAdCAM, una parte de MAdCAM o una célula o tejido que expresa MAdCAM; (b) permitir al animal transgénico montar una respuesta inmune a MAdCAM; (c) aislar células productoras de anticuerpo de animal transgénico; (d) inmortalizar las células productoras de anticuerpos; (e) crear poblaciones monoclonales individuales de las células productoras de anticuerpos inmortalizadas; y (f) explorar las células productoras de anticuerpos inmortalizadas o los sobrenadantes de cultivo de las mismas para identificar un anticuerpo dirigido a MAdCAM.
En un aspecto, la invención proporciona hibridomas que producen anticuerpos humanos anti-MAdCAM. En una realización preferida, los hibridomas son hibridomas de ratón, como se ha descrito anteriormente. En otra realización, los hibridomas se producen en una especie no humana, no de ratón tal como ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos. En otra realización, los hibridomas son hibridomas humanos, en los que un mieloma no secretor humano se fusiona con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-MAdCAM.
Ácidos nucleicos, Vectores, Células Hospedadoras y Métodos Recombinantes para Preparar Anticuerpos
Ácidos nucleicos
Se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-MAdCAM de la invención. En una realización, la molécula de ácido nucleico codifica una cadena pesada y/o ligera de una inmunoglobulina antiMAdCAM. En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico sencilla codifica una cadena pesada de una inmunoglobulina anti-MAdCAM y otra molécula de ácido nucleico codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina anti-MAdCAM. En una realización más preferida, la inmunoglobulina modificada es una inmunoglobulina humana, preferiblemente una Ig humana. La cadena ligera codificada puede ser una cadena  o una cadena , preferiblemente una cadena .
En una realización preferida la molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de línea germinal de un gen humano V A2, A3, A26, B3, O12 u O18 o una variante de dicha secuencia. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera comprende una secuencia derivada de un gen humano J1, J2, J3, J4, o J5. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera codifica no más de once cambios de aminoácidos del gen V de línea germinal A2, A3, A26, B3, O12 u O18, preferiblemente no más de seis cambios de aminoácidos e incluso más preferiblemente no más de tres cambios de aminoácidos. En una realización más preferida, el ácido nucleico que codifica la cadena ligera es la secuencia de línea germinal.
Se describe una molécula de ácido nucleico que codifica una región variable de la cadena ligera (VL) que contiene hasta once cambios de aminoácidos en comparación con la secuencia de línea germinal, en la que los cambios de aminoácidos son idénticos a los cambios de aminoácidos de la secuencia de línea germinal de la VL de uno de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. También se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 5.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. También se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDR de una cualquiera de las cadenas ligeras de 1.7.2,1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En una descripción, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de todas las CDR de una cualquiera de las cadenas ligeras de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripción, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una de SEC ID Nº: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 o comprende una secuencia de nucleótidos de una de SEC ID Nº: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ó 67. En otra descripción, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDR de una cualquiera de SEC ID Nº: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 o comprende una secuencia de nucleótidos de una o más de las CDR de una cualquiera de SEC ID Nº: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65, ó 67. En una descripción, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de todas las CDR de una cualquiera de SEC ID Nº: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 o comprende las secuencias de nucleótidos de todas las CDR de una cualquiera de SEC ID Nº: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65, ó 67.
También se describe una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de una VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una VL descrita anteriormente, particularmente a una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de una de SEC ID Nº: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 ó 68. También se describe una secuencia que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de una de SEC ID Nº: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ó 67.
Se describe una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones altamente rigurosas con una molécula de ácido nucleico que codifica una VL como se ha descrito anteriormente, particularmente una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4, 8,12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 ó 68. También se proporciona una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones altamente rigurosas con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de una de SEC ID Nº: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ó 67.
También se describe una molécula de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada (VH) que utiliza un gen de VH humano 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 ó 4-4. En algunas descripciones, la molécula de ácido nucleico que codifica el gen VH utiliza además un gen de la familia humana JH4 o JH6. En algunas descripciones, la molécula de ácido nucleico que codifica el gen de VH utiliza el gen humano JH4b o JH6b. En otra descripción, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia derivada de un gen humano D 3-10, 4-23, 5-5, 6-6 ó 6-19. En otra descripción, la molécula de ácido nucleico que codifica la VH no contiene más de quince cambios de aminoácidos de los genes de línea germinal VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 ó 4-4, preferiblemente no más de seis cambios de aminoácidos e incluso más preferiblemente no más de tres cambios de aminoácidos. En otra descripción, la molécula de ácido nucleico que codifica la VH contiene al menos un cambio de aminoácidos en comparación con la secuencia de línea germinal, en la que el cambio de aminoácidos es idéntico a un cambio de aminoácidos de la secuencia de línea germinal de la cadena pesada de uno de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod
o 7.26.4-mod. En otra descripción, la VH contiene no más de quince cambios de aminoácidos en comparación con las secuencias de línea germinal, en la que los cambios son idénticos a los cambios de la secuencia de línea germinal de la VH de uno de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1- mod o 7.26.4-mod.
En una descripción, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la VH de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5; 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripción, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDR de la cadena pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En una descripción, la molécula de ácido nucleico comprende secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de todas las CDR de la cadena pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,
6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripción, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una de SEC ID Nº: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 64 o que comprende una secuencia de nucleótidos de una de SEC ID Nº: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ó 63. En otra descripción, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDR de una cualquiera de SEC ID Nº: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 64 o comprende una secuencia de nucleótidos de una o más de las CDR de una cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ó 63. En una descripción, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica las secuencias de aminoácidos de todas las CDR de una cualquiera de SEC ID Nº: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 64 o comprende una secuencia de nucleótidos de todas las CDR de una cualquiera de SEC ID Nº: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41 45, 51, 55, 59 ó
63. En una descripción, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región contigua desde el comienzo de CDR1 hasta el final de CDR3 de una cadena pesada o ligera de cualquiera de los anticuerpos anti-MAdCAM anteriormente mencionados.
En otra descripción, la molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos de una VH que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una de las secuencias de aminoácidos que codifican una VH como se ha descrito inmediatamente antes, particularmente a una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de una de las SEC ID Nº: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45, 52, 56, 60 ó 64. También se proporciona una secuencia de nucleótidos que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %. 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de una de las SEC ID Nº: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ó 63.
En otra descripción, la molécula de ácido nucleico que codifica una VH es una que hibrida en condiciones altamente rigurosas con una secuencia de nucleótidos que codifica una VH como se ha descrito anteriormente, particularmente una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de una de SEC ID Nº: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 64. También se proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica una VH que hibrida en condiciones altamente rigurosas con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de una de SEC ID Nº: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ó 63.
La secuencia de nucleótidos que codifica una o ambas de las cadenas pesada y ligera completas de un anticuerpo anti-MAdCAM o las regiones variables de las mismas puede obtenerse de cualquier fuente que produzca un anticuerpo anti-MAdCAM. Los métodos para aislar ARNm que codifica un anticuerpo se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). El ARNm puede usarse para producir ADNc para su uso en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o clonación de ADNc de genes de anticuerpo. En una realización de la invención, las moléculas de ácido nucleico pueden obtenerse de un hibridoma que expresa un anticuerpo anti-MAdCAM, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente un hibridoma que tiene como uno de sus compañeros de fusión una célula de animal transgénico que expresa genes de inmunoglobulina humana, tal como un animal XENOMOUSE™, un animal transgénico ratón no humano o un animal transgénico no humano, no ratón. En otra realización, el hibridoma deriva de un animal no transgénico, no humano, que puede usarse, por ejemplo, para anticuerpos humanizados.
Una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada completa de un anticuerpo anti-MAdCAM puede construirse por fusión de una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable completo de una cadena pesada o un dominio de unión a antígeno de la misma con un dominio constante de una cadena pesada. De forma similar, una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-MAdCAM puede construirse por fusión de una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de una cadena ligera o un dominio de unión a antígeno de la misma con un dominio constante de una cadena ligera. Las moléculas de ácido nucleico que codifican las regiones VH y VL pueden convertirse a genes de anticuerpo de longitud completa insertándolas en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera, respectivamente, de modo que el segmento VH está unido operativamente al segmento o segmentos de región constante de cadena pesada (CH) dentro del vector y el segmento VL está unido operativamente al segmento de región constante de cadena ligera (CL) dentro del vector. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas VH o VL se convierten a genes de anticuerpo de longitud completa uniendo, por ejemplo, ligando, la molécula de ácido nucleico que codifica una cadena VH a una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena CH usando técnicas de biología molecular convencionales. Lo mismo puede conseguirse usando moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas VL y CL. Las secuencias de los genes de región constante de cadena pesada y ligera humanos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed., NIH Publ. Nº. 91-3242 (1991). Las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y/o ligera de longitud completa pueden expresarse después a partir de una célula en la que se han introducido y aislarse el anticuerpo anti-MAdCAM.
En una descripción, el ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada codifica la región variable de las secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 64 y la molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de las cadenas ligeras codifica la región variable de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 ó 68.
En una realización, una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM o una parte de unión a antígeno del mismo o la cadena ligera de un anticuerpo anti-MAdCAM o una parte de unión a antígeno del mismo puede aislarse de un animal no humano, no ratón que expresa genes de inmunoglobulina humana y se ha inmunizado con un antígeno de MAdCAM. En otra realización, la molécula de ácido nucleico puede aislarse de una célula productora de anticuerpo anti-MAdCAM derivada de un animal no transgénico o de un paciente humano que produce anticuerpos anti-MAdCAM. Puede aislarse ARNm de las células productoras de anticuerpo anti-MAdCAM por técnicas convencionales, clonarse y/o amplificarse usando PCR y técnicas de construcción de bibliotecas y explorarse usando protocolos convencionales para obtener moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera anti-MAdCAM.
Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para expresar de forma recombinante grandes cantidades de anticuerpos anti-MAdCAM, como se describe posteriormente. Las moléculas de ácido nucleico también pueden usarse para producir anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, inmunoadhesinas, diacuerpos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpo, como se describe adicionalmente a continuación. Si las moléculas de ácido nucleico derivan de un animal no transgénico, no humano, las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para humanización de anticuerpos, también como se describe posteriormente.
En otra realización, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden usarse como sondas o cebadores de PCR para secuencias de anticuerpo específicas. Por ejemplo, puede usarse una sonda de molécula de ácido nucleico en métodos de diagnóstico o puede usarse un cebador de PCR de molécula de ácido nucleico para amplificar regiones de ADN que podrían usarse, entre otras, para aislar secuencias de nucleótidos para su uso en la producción de dominios variables de anticuerpos anti-MAdCAM. En una realización preferida, las moléculas de ácido nucleico son oligonucleótidos. En una realización más preferida, los oligonucleótidos son de regiones altamente variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de interés. En una realización aún más preferida, los oligonucleótidos codifican todas o una parte de una o más de las CDR.
Vectores
La invención proporciona vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican la cadena pesada o la parte de unión a antígeno de la misma. La invención también proporciona vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican la cadena ligera o parte de unión a antígeno de la misma. La invención también proporciona vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpo y sondas de los mismos.
Para expresar los anticuerpos o partes de anticuerpos de la invención, se insertan ADN que codifican cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o parcial, obtenidas como se ha descrito anteriormente, en vectores de expresión de modo que los genes se unen operativamente a secuencias de control transcripcional y traduccional. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), virus vegetales tales como virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco, cósmidos, YAC, episomas derivados de EBV y similares. El gen del anticuerpo está ligado en un vector de modo que las secuencias de control transcripcional y traduccional dentro del vector sirven su función pretendida de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se seleccionan para ser compatibles con la célula hospedadora de expresión usada. El gen de cadena ligera de anticuerpos y el gen de cadena pesada de anticuerpos pueden insertarse en vectores separados. En una realización preferida, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpos se insertan en el vector de expresión por métodos convencionales (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y vector o ligación de extremos romos si no están presentes sitios de restricción).
Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados modificados por ingeniería genética de modo que cualquier secuencia VH o VL pueda insertarse y expresarse fácilmente, como se ha descrito anteriormente. En tales vectores, el corte y empalme sucede habitualmente entre el sitio donador de corte y empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de corte y empalme que precede a la región C humana y también en las regiones de corte y empalme que aparecen dentro de los exones CH humanos. La poliadenilación y la terminación de la transcripción se producen en sitios cromosómicos nativos cadena abajo de las regiones codificantes. El vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido señal que facilite la secreción de la cadena de anticuerpos de una célula hospedadora. El gen de cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de modo que el péptido señal se una en fase con el extremo amino terminal del gen de cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulina).
Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpos en una célula hospedadora. Se apreciara por los expertos en la materia que el diseño del vector de expresión incluyendo la selección de secuencias reguladoras puede depender de tales factores como la selección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresión de células hospedadoras de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión proteica en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador de CMV), Virus de Simio 40 (SV40) (tales como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores de mamífero fuertes tales como promotores de actina e inmunoglobulina nativa. Para una descripción adicional de elementos reguladores virales y secuencias de los mismos véase por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 5.168.062, 4.510.245 y 4.968.615. Se conocen en la técnica métodos para expresar anticuerpos en plantas, incluyendo una descripción de promotores y vectores, así como transformación de plantas. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 6.517.529. También se conocen bien en la técnica métodos para expresar polipéptidos en células bacterianas o células fúngicas, por ejemplo, células de levadura.
Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospedadoras en las que el vector se ha introducido (véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células hospedadoras dhfr- con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección de G418) y el gen de la glutamato sintetasa.
Células Hospedadoras No de Hibridoma y Métodos para Producir Proteína de Forma Recombinante
Pueden usarse moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada o una parte de unión a antígeno de la misma y/o la cadena ligera o una parte de unión a antígeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM y vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, para transformación de una célula hospedadora de mamífero, planta, bacteriana o de levadura adecuada. La transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedadora. Los métodos para introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero se conoce bien en la técnica e incluye transfección mediada por dextrano, precipitación de fosfato cálcico, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del polinucleótido o polinucleótidos en liposomas, inyección biolística y microinyección directa del ADN en núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en células de mamífero por vectores virales. Los métodos para transformar células se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455. Se conocen bien en la técnica métodos para transformar células vegetales, incluyendo, por ejemplo, transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística, inyección directa, electroporación y transformación viral. También se conocen bien en la técnica métodos para transformar células bacterianas y de levadura.
Las líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para expresión se conocen bien en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster Chino (CHO), NSO, células SP2, células HEK-293T, células NIH-3T3, células HeLa, células de riñón de hámster recién nacido (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, células 3T3 y varias otras líneas celulares. Las células hospedadoras de mamífero incluyen células humanas, de ratón, de rata, de perro, de mono, de cerdo, de cabra, bovinas, de caballo y de hámster. Se seleccionan líneas celulares de preferencia particular a través de la determinación de las líneas celulares que tienen altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que pueden usarse son líneas celulares de insecto, tales como células Sf9, células de anfibio, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican la cadena pesada o la parte de unión a antígeno de la misma, la cadena ligera y/o parte de unión a antígeno de la misma se introducen en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se dejan crecer las células hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales. Las células hospedadoras vegetales incluyen, por ejemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lenteja acuática, maíz, trigo, patata, etc. Las células hospedadoras bacterianas incluyen E. coli y especies de Streptomyces. Las células hospedadoras de levadura incluyen Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris.
Además, la expresión de anticuerpos de la invención (u otros restos de los mismos) de las líneas celulares de producción pueden potenciarse usando varias técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS) es un enfoque habitual para potenciar la expresión en ciertas condiciones. El sistema GS se realiza en su totalidad o en parte con relación a las Patentes Europeas Nº 0 216 846, 0 256 055, 0 338 841 y 0 323 997.
Es probable que los anticuerpos expresados por líneas celulares diferentes o en animales transgénicos tengan diferente glucosilación entre sí. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente memoria son parte de la presente invención, independientemente de la glucosilación de los anticuerpos.
Animales Transgénicos y Plantas
La invención también proporciona animales no humanos transgénicos y plantas transgénicas que comprenden una o más de las moléculas de ácido nucleico de la invención que pueden usarse para producir anticuerpos de la invención. Los anticuerpos pueden producirse en y recuperarse de tejido o fluidos corporales, tales como leche, sangre u orina, de cabras, vacas, caballos, cerdos, ratas, ratones, conejos, hámsteres u otros mamíferos. Véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 y 5.741.957. Como se ha descrito anteriormente, los animales transgénicos no humanos que comprende loci de inmunoglobulina humanos pueden inmunizarse con MAdCAM o una parte de la misma. Se describen métodos para preparar anticuerpos en plantas, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.046.037 y 5.959.177.
En otra realización, se producen animales transgénicos no humanos y plantas transgénicas introduciendo una o más moléculas de ácido nucleico de la invención en el animal o la planta por técnicas transgénicas convencionales. Véase Hogan, mencionado anteriormente. Las células transgénicas usadas para preparar al animal transgénico pueden ser células madre embrionarios, células somáticas u óvulos fertilizados. El organismo no humano transgénico puede ser quimérico, heterocigoto no quimérico y homocigoto no quimérico. Véase, por ejemplo, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ª ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al, Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); y Pinkert, Transgenic Animal Technology. A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). En otra realización, el organismo no humano transgénico puede tener una interrupción diana y reemplazo que codifica una cadena pesada y/o una cadena ligera de interés. En una realización preferida, los animales o plantas transgénicas comprenden y expresan moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesada y ligera que se combinan para unirse específicamente a MAdCAM, preferiblemente MAdCAM humana. En otra realización, los animales o plantas transgénicas comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos anti-MAdCAM pueden realizarse en cualquier animal transgénico. En una realización preferida, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos. El animal transgénico no humano expresa dichos polipéptidos codificados en sangre, leche, orina, saliva, lágrimas, mucus u otros fluidos corporales.
Bibliotecas de Presentación de Fagos
La invención proporciona un método para producir un anticuerpo anti-MAdCAM o parte de unión a antígeno del mismo que comprende las etapas de sintetizar una biblioteca de anticuerpos humanos en fagos, explorar la biblioteca con una MAdCAM o una parte de la misma, aislar fagos que se unen a MAdCAM y obtener el anticuerpo del fago. Un método para preparar la biblioteca de anticuerpos comprende las etapas de inmunizar a un animal hospedador no humano que comprende un locus de inmunoglobulina con MAdCAM o una parte antigénica de la misma para crear una respuesta inmune, extraer células del animal hospedador, las células que son responsables de la producción de anticuerpos; aislar ARN de las células extraídas, transcribir de formar inversa el ARN para producir ADNc, amplificar el ADNc usando un cebador e insertar el ADNc en un vector de presentación de fagos de modo que los anticuerpos se expresan en el fago. Pueden obtenerse de esta manera anticuerpos anti-MAdCAM recombinantes de la invención.
Los anticuerpos humanos anti-MAdCAM recombinantes de la invención además de los anticuerpos anti-MAdCAM descritos en la presente memoria pueden aislarse por exploración de una biblioteca de anticuerpos combinatoria recombinante, preferiblemente una biblioteca de presentación de fagos scFv, preparada usando ADNc de VL y VH humanas preparados a partir ARNm aislado de linfocitos humanos. Se conocen en la técnica metodologías para preparar y explorar tales bibliotecas. En el mercado hay disponibles kits para generar bibliotecas de presentación de fagos (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, nº de catálogo 27-9400-01; y el kit de presentación de fagos Stratagene SurfZAP™, nº de catálogo 240612). También existen otros métodos y reactivos que pueden usarse para generar y explorar bibliotecas de presentación de anticuerpos (véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 5.223.409; Publicación de PCT Nº WO 92/18619; Publicación de PCT Nº WO 91/17271; Publicación de PCT Nº WO 92/20791; Publicación de PCT Nº WO 92/15679; Publicación de PCT Nº WO 93/01288; Publicación de PCT Nº WO 92/01047; Publicación de PCT Nº WO 92/09690; Fuchs et al. (1991), Biotechnology, 9: 1369-1372; Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3:81-85 (1992); Huse et al., Science, 246: 12751281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrad et al., Biotechnology, 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc Acid Res,
19: 4133-4137 (1991); y Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991).
En una realización preferida, para aislar anticuerpos humanos anti-MAdCAM con las características deseadas, un anticuerpo humano anti-MAdCAM como se ha descrito en la presente memoria se usa primero para seleccionar secuencias de cadena pesada y ligera humanas que tienen actividad de unión similar hacia MAdCAM, usando los métodos de impronta de epítopos descritos en Hoogenboom et al., Publicación de PCT Nº WO 93/06213. Las bibliotecas de anticuerpos usadas en este método son preferiblemente bibliotecas de scFv preparadas y exploradas como se ha descrito en McCafferty et al., Publicación de PCT Nº WO 92/01047, McCafferty et al., Nature, 348: 552554 (1990); y Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Las bibliotecas de anticuerpos scFv se exploran preferiblemente usando MAdCAM humana como antígeno.
Una vez que se seleccionan los segmentos VL y VH humanos iniciales, se realizan experimentos de “mezclar y emparejar”, en los que se exploran diferentes pares de los segmentos VL y VH inicialmente seleccionados con respecto a unión a MAdCAM, para seleccionar combinaciones de pares VL/VH preferidas. Adicionalmente, para mejorar más la calidad del anticuerpo, los segmentos VL y VH del par o pares VL/VH pueden mutarse aleatoriamente, preferiblemente dentro de la región CDR3 de VH y/o VL, en un proceso análogo al proceso de mutación somática in vivo responsable de la maduración de afinidad de los anticuerpos durante una respuesta inmune natural. Esta maduración de afinidad in vitro puede conseguirse amplificando las regiones VH y VL usando cebadores de PCR complementarios a la VH CDR3 o VL CDR3, respectivamente, cuyos cebadores se han “añadido” a una mezcla aleatoria de las cuatro bases nucleotídicas en ciertas posiciones de modo que los productos de PCR resultantes codifican segmentos VH y VL en los que se ha introducido mutaciones aleatorias en las regiones VH y/o VL CDR3. Estos segmentos VH y VL mutados de forma aleatoria pueden volver a explorarse con respecto a unión a MAdCAM.
Después de la exploración y aislamiento de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención de una biblioteca de presentación de inmunoglobulina recombinante, puede recuperarse el ácido nucleico que codifica el anticuerpo seleccionado del envase de presentación (por ejemplo, del genoma de fago) y subclonarse en otros vectores de expresión por técnicas de ADN recombinante convencionales. Si se desea, el ácido nucleico puede manipularse adicionalmente para crear otras formas de anticuerpo de la invención como se describe posteriormente. Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado por exploración de una biblioteca combinatoria, el ADN que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresión recombinante y se introduce en células hospedadoras de mamífero, como se ha descrito anteriormente.
Cambio de Clase
Otra descripción es para proporcionar uno por el que la clase de un anticuerpo anti-MAdCAM puede cambiarse con otra. En un aspecto de la invención, se aísla una molécula de ácido nucleico que codifica que codifica VL o VH usando métodos bien conocidos en la técnica de modo que no incluya ninguna secuencia de nucleótidos que codifique CL o CH. La molécula de ácido nucleico que codifica VL o VH se une operativamente después a una secuencia de nucleótidos que codifica una CL o CH de una clase diferente de molécula de inmunoglobulina. Esto puede conseguirse usando un vector o molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de CL
o CH, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-MAdCAM que originalmente era IgM puede cambiarse de clase a una IgG. Además, el cambio de clase puede usarse para convertir una subclase IgG a otra, por ejemplo, de IgG4 a IgG2. Un método preferido para producir un anticuerpo de la invención que comprende una isotipo o subclase de anticuerpo deseado comprende las etapas de aislar un ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM y un ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-MAdCAM, obteniendo la región variable de la cadena pesada, ligando la región variable de la cadena pesada con el dominio constante de una cadena pesada del isotipo deseado, expresando la cadena ligera y la cadena pesada ligada en una célula y recogiendo el anticuerpo anti-MAdCAM con el isotipo deseado.
Derivados de Anticuerpo
Se pueden usar las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente para generar derivados de anticuerpo usando técnicas y métodos conocidos para los expertos en la materia.
Anticuerpos Humanizados
La inmunogenicidad de anticuerpos no humanos puede reducirse en cierto grado usando técnicas de inmunización, potencialmente empleando técnicas de presentación que usan bibliotecas apropiadas. Se apreciará que los anticuerpos murinos o anticuerpos de otras especies pueden humanizarse o primatizarse usando técnicas bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Winter y Harris, Immunol Today, 14:43-46 (1993) y Wright et al, Crit. Reviews in Immunol, 12125-168 (1992). El anticuerpo de interés puede obtenerse por ingeniería genética mediante técnicas de ADN recombinante para sustituir CH1. CH2. CH3, dominios bisagra y/o el dominio flanqueante con la secuencia humana correspondiente (véase el documento WO 92/02190 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.530.101, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.792, 5.714.350 y 5.777.085). En otra realización, puede humanizarse un anticuerpo no humano anti-MAdCAM sustituyendo el CH1, dominio bisagra, CH2, CH3 y/o los dominios flanqueantes con la secuencia humana correspondiente de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención.
Anticuerpos Mutados
En otra realización, las moléculas de ácido nucleico, vectores y células hospedadoras pueden usarse para preparar anticuerpos mutados anti-MAdCAM. Los anticuerpos pueden mutarse en los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligera para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, puede realzarse una mutación en una o más de las regiones CDR para aumentar o reducir la Kd del anticuerpo para MAdCAM. Se conocen bien en la materia técnicas de mutagénesis dirigida. Véase, por ejemplo, Sambrook et al y Ausubel et al., mencionado anteriormente. En una descripción las mutaciones se realizan en un resto aminoacídico que se sabe que cambia en comparación con la línea germinal en una región variable de un anticuerpo anti-MAdCAM. En otra realización de la descripción, se realizan una o más mutaciones en un resto aminoacídico que se sabe que cambia en comparación con la línea germinal de una región variable o región CDR de uno de los anticuerpos anti-MAdCAM 1.72, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.342, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripción, se realizan una o más mutaciones en un resto aminoacídico que se sabe que cambia en comparación con la línea germinal en una región variable o región CDR cuya secuencia de aminoácidos se presenta en SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 o 68, o cuya secuencia de nucleótidos se presenta en SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65 o 67. En otra realización, las moléculas de ácido nucleico se mutan en una o más de las regiones flanqueantes. Puede realizarse una mutación en una región flanqueante o dominio constante para aumentar la semi-vida del anticuerpo anti-MAdCAM. Véase, por ejemplo, el documento WO 00/09560, publicado el 24 de febrero de 2000. En una realización, pueden existir una, tres o cinco o diez mutaciones puntuales y no más de quince mutaciones puntuales. Una mutación en una región flanqueante o dominio constante también puede realizarse para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proporcionar un sitio para unión covalente o no covalente a otra molécula o para alterar tales propiedades como fijación de complemento. Pueden realizarse mutaciones en cada una de las regiones flanqueantes, el dominio constante y las regiones variables en un anticuerpo mutado sencillo. Como alternativa, pueden realizarse mutaciones en solamente una de las regiones flanqueantes, las regiones variables o el dominio constante en un anticuerpo mutado sencillo.
En una realización, no existen más de quince cambios de aminoácidos en las regiones VH o VL del anticuerpo mutado anti MAdCAM en comparación con el anticuerpo anti-MAdCAM antes de la mutación. En una realización más preferida, no existen más de diez cambios de aminoácidos en las regiones VH o VL del anticuerpo mutado anti-MAdCAM, más preferiblemente no más de cinco cambios de aminoácidos o incluso más preferiblemente no más de tres cambios de aminoácidos. En otra realización, no existen más de quince cambios de aminoácidos en los dominios constantes, más preferiblemente, no más de diez cambios de aminoácidos, incluso más preferiblemente, no más de cinco cambios de aminoácidos.
Anticuerpos Modificados
En otra realización, puede realizarse un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que comprende todo o una parte de un anticuerpo anti-MAdCAM unido a otro polipéptido. En una realización preferida, solamente las regiones variables del anticuerpo anti-MAdCAM se unen al polipéptido. En otra realización preferida, el dominio VH de un anticuerpo anti-MAdCAM se une a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo anti-MAdCAM se une a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de una manera en la que los dominios VH y VL puede interaccionar entre sí para formar un sitio de unión a anticuerpo. En otra realización preferida, el dominio VH se separa del dominio VL por un enlazador de modo que los dominios VH y VL pueden interaccionar entre sí (véase posteriormente bajo Anticuerpos de Cadena Sencilla). El anticuerpo VH-enlazador-VL se une después al polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión es útil para dirigir un polipéptido a una célula o tejido que expresa MAdCAM. El polipéptido puede ser un agente terapéutico, tal como una toxina, factor de crecimiento u otra proteína reguladora o puede ser un agente de diagnóstico, tal como una enzima que puede visualizarse fácilmente, tal como peroxidasa de rábano rusticano. Además, pueden crearse anticuerpos de fusión en los que se unen dos (o más) anticuerpos de cadena sencilla entre sí. Esto es útil si se quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente en una cadena polipeptídica sencilla o si se quiere crear un anticuerpo biespecífico.
Para crear un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se unen operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3 (SEC ID Nº: 147) de modo que las secuencias VH y VL puedan expresarse como una proteína de cadena sencilla contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)). El anticuerpo de cadena sencilla puede ser monovalente, si sólo se usa un VH y VL sencillo, bivalente, si se usan dos VH y VL, o polivalente, si se usan más de dos VH y VL.
En otra realización, pueden prepararse otros anticuerpos modificados usando moléculas de ácido nucleico que codifican anti-MAdCAM. Por ejemplo pueden prepararse “cuerpos Kappa” (I11 et al., Protein Eng, 10: 949-57(1997)), “Minicuerpos” (Martin et al., EMBO J, 13: 5303-9(1994)), “Diacuerpos” (Holliger et al., PNAS USA, 90: 64446448(1993)) o “Janusins” (Traunecker et al., EMBO J, 10:3655-3659 (1991) y Traunecker et al., “Janusin : new molecular design for bispecific reagents," Int J Cancer Suppl, 7:51-52 (1992)) usando técnicas de biología molecular convencionales siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva.
En otro aspecto, puede generarse anticuerpos quiméricos y biespecíficos. Puede realizarse un anticuerpo quimérico que comprende CDR y regiones flanqueantes de diferentes anticuerpos. En una realización preferida, las CDR del anticuerpo quimérico comprenden todas las CDR de la acción variable de una cadena ligera o cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM, mientras que las regiones flanqueantes derivan de uno o más anticuerpos diferentes. En una realización más preferida, las CDR del anticuerpo quimérico comprenden todas las CDR de las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo humano anti-MAdCAM. Las regiones flanqueantes pueden ser de otra especie y pueden, en una realización preferida, humanizarse. Como alternativa, las regiones flanqueantes pueden ser de otro anticuerpo humano.
Puede generarse un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a MAdCAM a través de un dominio de unión y a una segunda molécula a través de un segundo dominio de unión. El anticuerpo biespecífico puede producirse a través de técnicas de biología molecular recombinantes o pueden conjugarse físicamente juntos. Además, puede generarse un anticuerpo de cadena sencilla que contiene más de un VH y VL que se une específicamente a MAdCAM y a otra molécula. Tales anticuerpos biespecíficos pueden generarse usando técnicas que se conocen bien por ejemplo, en relación con (i) y (ii) véase, por ejemplo, Fanger et al., Immunol Methods 4: 7281 (1994) y Wright y Harris, mencionado anteriormente y en relación con (iii), véase, por ejemplo, Traunecker et al., Int. J Cancer (Supl) 7: 51-52 (1992). En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico se une a MAdCAM y a otra molécula expresada a alto nivel en células endoteliales. En una realización más preferida, la otra molécula es VCAM, ICAM o L-selectina.
En diversas descripciones, los anticuerpos modificados descritos anteriormente se preparan usando una o más de las regiones variables o una o más de la regiones CDR de uno de los anticuerpos seleccionados de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.222, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 720.5, 7, 26.4, 9.8.2, 6.222-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripción, los anticuerpos modificados se preparan usando una o más de las regiones variables o una o más de las regiones CDR cuya secuencia de aminoácidos se presenta en SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 o 68 o cuya secuencia de nucleótidos se presenta en SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, S1, 53, 55, 57, 61, 63, 65 ó 67.
Anticuerpos Derivatizados y Marcados
Un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invención puede derivatizarse o unirse a otra molécula (por ejemplo, otro péptido o proteína). En general, los anticuerpos o partes de los mismos se derivatizan de modo que la unión a MAdCAM no se vea afectada de forma negativa por la derivatización o el marcaje. En consecuencia, se pretende que los anticuerpos y partes de anticuerpos de la invención incluyan formas tanto intactas como unificadas de los anticuerpos humanos anti-MAdCAM descritos en la presente memoria. Por ejemplo, un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invención puede unirse funcionalmente (por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) con una o más entidades moleculares adicionales, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente de detección, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que pueda mediar la asociación del anticuerpo o parte de anticuerpo con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina o un marcador de polihistidina).
Un tipo de anticuerpo derivatizado se produce por entrecruzamiento de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o tipos diferentes, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los agentes de entrecruzamiento adecuados incluyen los que son heterobifuncionales que tienen dos grupos claramente reactivos separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster) u homobifuncional (por ejemplo, disuccinimidil suberato). Tales enlazadores están disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.
Otro tipo de anticuerpo derivatizado es un anticuerpo marcado. Los agentes de detección útiles con los que un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invención puede derivatizarse incluyen compuestos fluorescentes incluyendo fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, rodamina, cloruro de 5-dimetilamin-1- naftalenosulfonilo, ficoeritrina, fósforos de lantánido y similares. Un anticuerpo también puede marcarse con enzimas que son útiles para detección, tales como peroxidasa de rábano rusticano, -galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. Cuando se marca un anticuerpo con una enzima detectable, se detecta por adición de reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reacción que pueda apreciarse. Por ejemplo, cuando el agente peroxidasa de rábano rusticano está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y de diaminobenzidina conduce a un producto de reacción coloreado, que es detectable. Un anticuerpo también puede marcarse con biotina y detectarse a través de medición indirecta de unión a avidina o estreptavidina. Un anticuerpo puede marcarse con un agente magnético, tal como gadolinio. Un anticuerpo también puede marcarse con un epítopo polipeptídico predeterminado reconocido por un indicador secundario (por ejemplo, secuencia de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcadores epitópicos). En algunas realizaciones, los marcadores se unen por ramas espaciadoras de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.
Un anticuerpo anti-MAdCAM también puede marcarse con un aminoácido radiomarcado. El radiomarcador puede usarse para fines tanto diagnósticos como terapéuticos. Por ejemplo, el radiomarcador puede usarse para detectar tejidos que expresan MAdCAM por rayos X u otras técnicas de diagnóstico. Además, el radiomarcador puede usarse terapéuticamente como una toxina para tejido enfermo o tumores que expresan MAdCAM. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero sin limitación, los siguientes radioisótopos o radionúclidos: 3H, 14C, 15N,35S, 90Y, 99Tc, 111In, 12I, 131I.
También puede derivatizarse un anticuerpo anti-MAdCAM con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo o un grupo carbohidrato. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la semi-vida en suero o para aumentar la unión a tejido. Esta metodología también se aplicaría a cualquier fragmento de unión a antígeno o versiones de anticuerpos anti-MAdCAM.
Composiciones y Kits Farmacéuticos
En un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo humano anti-MAdCAM y métodos para tratar sujetos con tales composiciones. En algunas realizaciones, el sujeto de tratamiento es un ser humano. En otras realizaciones, el sujeto es un sujeto veterinario. En algunas realizaciones, el sujeto veterinario es un perro o un primate no humano.
El tratamiento puede implicar la administración de uno o más anticuerpos monoclonales anti-MAdCAM inhibidores de la invención o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, solos o con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Pueden administrarse anticuerpos inhibidores anti-MAdCAM de la invención y composiciones que los comprenden en combinación con uno o más agentes terapéuticos, de diagnóstico o profilácticos adicionales. Los agentes terapéuticos adicionales incluyen agentes antiinflamatorios o inmunomoduladores. Estos agentes incluyen, pero sin limitación, los corticosteroides tópicos y orales tales como prednisolona, metilprednisolona, NCX-1015 o budesonida; los aminosalicilatos tales como mesalazina, olsalazina, balsalazida o NCX-456; la clase de inmunomoduladores tales como azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, ciclosporina, FK506, IL-10 (Ilodecakina), IL-11 (Oprelevkina), IL12, antagonistas de MIF/CD74, antagonistas de CD40, tales como TNX-100/5-D12, antagonistas de OX40L, GMCSF, pimecrolimus o rapamicina; la clase de agentes anti-TNF tales como infliximab, adalimumab, CDP-870, onercept, etanercept; la clase de agentes antiinflamatorios, tales como inhibidores de PDE-4 (roflumilast, etc.), inhibidores de TACE (DPC-333, RDP-58, etc) e inhibidores de ICE (VX-740, etc.) así como antagonistas del receptor de IL-2, tales como daclizumab, la clase de antagonistas de moléculas de adhesión selectiva, tales como natalizumab, MLN-02 o alicaforsen, clases de agentes analgésicos tales como, pero sin limitación, inhibidores de COX-2, tales como rofecoxib, valdecoxib, celecoxib, moduladores del canal sensible a voltaje de tipo P/Q29 (2), tales como gabapentina y pregabalina, antagonistas del receptor de NK-1, moduladores del receptor cannabinoide y agonistas del receptor delta opioide, así como agentes anti-neoplásicos, anti-tumorales, anti-angiogénicos o quimioterapéuticos. Tales agentes adicionales pueden incluirse en la misma composición o administrarse por separado. En algunas realizaciones, uno o más anticuerpos inhibidores anti-MAdCAM de la invención pueden usarse como una vacuna o como adyuvantes a una vacuna. En particular, debido a que MAdCAM se expresa en tejido linfoide, los antígenos de vacuna pueden dirigirse de forma ventajosa a tejido linfoide conjugando el antígeno con un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención.
Como se usa en la presente memoria, “vehículo farmacéuticamente aceptable” significa todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y potenciadores de la absorción o retardantes y similares que son fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, tampón de acetato con cloruro sódico, dextrosa, glicerol, Polietilenglicol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Son ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables tensioactivos, agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian el periodo de caducidad o eficacia del anticuerpo.
Las composiciones de la presente invención pueden estar en una diversidad de formas, por ejemplo, formas de dosificación líquida, semi-sólida y sólida, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones de suspensiones, comprimidos, píldoras, torta liofilizada, polvos secos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo pretendido de administración y aplicación terapéutica. Las composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para inmunización pasiva de seres humanos. El modo preferido de administración es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular, intradérmico). En una realización preferida, el anticuerpo se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra por inyección intramuscular, intradérmica o subcutánea.
Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, torta liofilizada, polvo seco, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada a alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse por incorporación del anticuerpo anti-MAdCAM en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado en vacío y liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente estéril del mismo. Generalmente, se prepararon dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. Las características deseadas de una solución pueden mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de tensioactivos y el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión por el uso de tensioactivos, fosfolípidos y polímeros. Puede proporcionarse absorción prolongada de composiciones inyectables mediante la inclusión en la composición de un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato, materiales poliméricos, aceites y gelatina.
Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse por una diversidad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la vía/modo preferido de administración es la infusión subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa. Como se apreciará por el experto en la materia, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados.
En ciertas realizaciones, las composiciones de anticuerpo pueden prepararse con un vehículo que protegerá al anticuerpo contra una liberación rápida, tal como una formación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biocompatibles biodegradables, tales como etilenvinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o se conocen generalmente por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1978)).
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también pueden incluirse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en comprimidos o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto de la invención por una administración distinta de la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para evitar su inactivación.
Las composiciones de la invención pueden incluir una “cantidad terapéuticamente eficaz” o una “cantidad profilácticamente eficaz” de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de la invención. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o parte de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo o parte del anticuerpo para inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o parte de anticuerpo se compensa por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Típicamente, puesto que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz puede ser menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, puede administrarse una embolada sencilla, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en formas unitarias de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa en la presente memoria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención se dicta por y depende directamente de (a) las características únicas del anticuerpo anti-MAdCAM o parte del mismo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a conseguir y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la formación de compuestos de un anticuerpo tal para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Un intervalo ejemplar no limitante para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invención es de 0,025 a 50 mg/kg, más preferiblemente de 0,1 a 50 mg/kg, más preferiblemente 0,1-25, 0,1 a 10 o 0,1 a 3 mg/kg. En algunas realizaciones, una formulación contiene 5 mg/ml de anticuerpo en un tampón de acetato sódico 20 mM, pH 5,5, NaCl 140 mM y polisorbato 80 0,2 mg/ml. Debe observarse que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y gravedad de la afección a aliviar. Debe entenderse adicionalmente que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deberían ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones y que los intervalos de dosificación expuestos en la presente memoria son solamente ejemplares y no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reivindicada.
Otro aspecto de la presente invención proporciona kits que comprenden un anticuerpo anti-MAdCAM o parte de anticuerpo de la invención o una composición que comprende dicho anticuerpo. Un kit puede incluir, además del anticuerpo o composición, agentes de diagnóstico o terapéuticos. Un kit también incluir instrucciones para su uso en un método de diagnóstico o terapéutico. En una realización preferida, el kit incluye el anticuerpo o una composición que lo comprende y un agente de diagnóstico que puede usarse en un método descrito posteriormente. En otra realización preferida, el kit incluye el anticuerpo o una composición que lo comprende y uno o más agentes terapéuticos que pueden usarse en un método descrito posteriormente.
Terapia Génica
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden administrarse a un paciente que lo necesite mediante terapia génica. La terapia puede ser in vivo o ex vivo. En una realización preferida, se administran moléculas de ácido nucleico que codifican tanto una cadena pesada como una cadena ligera a un paciente. En una realización más preferida, las moléculas de ácido nucleico se administran de modo que se integran de forma estable en los cromosomas de linfocitos B debido a que estas células están especializadas para producir anticuerpos. En una realización preferida, los linfocitos B precursores se transfectan o infectan ex vivo y se vuelven a trasplantar a un paciente que lo necesite. En otra realización, los linfocitos B precursores u otras células se infectan in vivo usando un virus recombinante que se sabe que infecta el tipo celular de interés. Los vectores típicos usados para terapia génica incluyen liposomas, plásmidos y vectores virales. Los vectores virales ejemplares son retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados. Después de la infección in vivo o ex vivo, los niveles de expresión de anticuerpo pueden controlarse tomando una muestra del paciente tratado y usando cualquier inmunoensayo conocido de la técnica o analizado en la presente memoria.
En una realización preferida, el método de terapia génica comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una parte de unión a antígeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM y que expresa la molécula de ácido nucleico. En otra realización, el método de terapia génica comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena ligera o una parte de unión a antígeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM y que expresa la molécula de ácido nucleico. En un método más preferido, el método de terapia génica comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una parte de unión a antígeno de la misma y una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena ligera o la parte de unión a antígeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención y que expresa las moléculas de ácido nucleico. El método de terapia génica también puede comprender la etapa de administrar otro agente antiinflamatorio o inmunomodulador.
Métodos Diagnósticos de Uso
Los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para detectar MAdCAM en una muestra biológica in vitro o in vivo. Los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse en un inmunoensayo convencional, incluyendo, sin limitación, un ELISA, un RIA, FACS, inmunohistoquímica de tejido, transferencia de Western o inmunoprecipitación. Los anticuerpos anti-MAdCAM de la invención pueden usarse para detectar MAdCAM de seres humanos. En otra realización, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para detectar MAdCAM de primates del Viejo Mundo tales como cynomolgus y monos Rhesus, chimpancés y simios. La invención proporciona un método para detectar MAdCAM en una muestra biológica que comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención y detectar del anticuerpo unido a MAdCAM. En una realización, el anticuerpo anti-MAdCAM se derivatiza directamente con un marcador detectable. En otra realización, el anticuerpo anti-MAdCAM (el primer anticuerpo) no está marcado y un segundo anticuerpo u otra molécula que puede unirse con el anticuerpo anti-MAdCAM está marcado. Como se conoce bien por un experto en la materia, se selecciona un segundo anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a la especie y clase específicas del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el anticuerpo anti-MAdCAM es una IgG humana, entonces el anticuerpo secundario puede ser un anti-IgG humana. Otras moléculas que pueden unirse a anticuerpos incluyen, pero sin limitación, proteína A, y proteína G, ambas de las cuales están disponibles en el mercado, por ejemplo, de Pierce Chemical Co.
Se han descrito marcadores adecuados para el anticuerpo o secundario anteriormente e incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, agentes magnéticos y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, -galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriacinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; un ejemplo de un agente magnético incluye gadolinio; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.
En una realización alternativa, MAdCAM puede ensayarse en una muestra biológica por un inmunoensayo de competición utilizando patrones de MAdCAM marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-MAdCAM no marcado. En este ensayo, la muestra biológica, los patrones de MAdCAM marcados y anticuerpo anti-MAdCAM se combinan y la cantidad de patrón de MAdCAM marcado unido al anticuerpo no marcado se determina. La
5 cantidad de MAdCAM en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de patrón de MAdCAM marcado unido al anticuerpo anti-MAdCAM.
Se pueden usar los inmunoensayos descritos anteriormente para varios fines. En una realización, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para detectar MAdCAM en células en cultivo celular. En una realización preferida, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para determinar el nivel de expresión de MAdCAM en superficie celular 10 después del tratamiento de las células con diversos compuestos. Este método puede usarse para ensayar compuestos que pueden usarse para activar o inhibir MAdCAM. En este método, se trata una muestra de células con un compuesto de ensayo durante un periodo de tiempo mientras que otra muestra se deja sin tratar, la expresión en superficie celular podría después determinarse por citometría de flujo, inmunohistoquímica, transferencia de Western, ELISA o RIA. Además, los inmunoensayos pueden cambiarse de escala para exploración
15 de alto rendimiento para ensayar una gran variedad de compuestos con respecto a activación o inhibición de MAdCAM.
Los anticuerpos anti-MAdCAM de la invención también pueden usarse para determinar los niveles de MAdCAM en un tejido o en células derivadas del tejido. En una realización preferida, el tejido es un tejido enfermo. En una realización más preferida el tejido es tracto gastrointestinal inflamado o una biopsia del mismo. En una realización
20 preferida del método, un tejido o una biopsia del mismo se escinde de un paciente. El tejido o biopsia se usa después en un inmunoensayo para determinar, por ejemplo, los niveles de MAdCAM, los niveles en superficie celular de MAdCAM o la localización de MAdCAM por los métodos analizados anteriormente. El método puede usarse para determinar si un tejido inflamado expresa MAdCAM a un alto nivel.
El método de diagnóstico anteriormente descrito puede usarse para determinar si un tejido expresa altos niveles de
25 MAdCAM, lo que puede ser indicativo de que el tejido responderá bien al tratamiento con anticuerpo anti-MAdCAM. Además, el método de diagnóstico también puede usarse para determinar si el tratamiento con anticuerpo anti-MAdCAM (véase posteriormente) está provocando que un tejido exprese niveles inferiores de MAdCAM y por lo tanto pueda usarse para determinar si el tratamiento es exitoso.
Los anticuerpos de la presente invención pueden también usarse in vivo para localizar tejidos y órganos que
30 expresan MAdCAM. En una realización preferida, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para localizar tejido inflamado. La ventaja de los anticuerpos anti-MAdCAM de la presente invención es que no generarán una respuesta inmune tras su administración. El método comprende las etapas de administrar un anticuerpo anti-MAdCAM o una composición farmacéutica del mismo a un paciente que necesite un ensayo de diagnóstico tal y someter al paciente a análisis de imágenes para determinar la localización de los tejidos que expresan MAdCAM. El análisis de
35 imágenes se conoce bien en la técnica médica e incluye, sin limitación, análisis de rayos X, gammagrafía, imagen de resonancia magnética (MRI), tomografía de emisión de positrones o tomografía computerizada (CT). En otra realización del método, se obtiene una biopsia del paciente para determinar si el tejido de interés expresa MAdCAM en vez de someter al paciente a análisis de imágenes. En una realización preferida, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden marcarse con un agente detectable que puede detectarse en un paciente. Por ejemplo, el anticuerpo puede
40 marcarse con un agente de contraste, tal como bario, que puede usarse para análisis de rayos X o un agente de contraste magnético, tal como un quelado de gadolinio, que puede usarse para MRI o CT. Otros agentes de marcaje incluyen, sin limitación, radioisótopos tales como 99Tc. En otra realización, el anticuerpo anti-MAdCAM no estará marcado y se detectará administrando un segundo anticuerpo u otra molécula que es detectable y que puede unirse al anticuerpo anti-MAdCAM.
45 Los anticuerpos anti-MAdCAM de la invención también pueden usarse para determinar los niveles de MAdCAM soluble presente en sangre, suero, plasma u otro biofluido del donante, incluyendo, pero sin limitación, heces, orina, esputo o muestra de biopsia. En una realización preferida, el biofluido es plasma. El biofluido puede usarse después en un inmunoensayo para determinar los niveles de MAdCAM soluble. MAdCAM soluble podría ser un marcador sustituto para inflamación gastrointestinal en curso y el método de detección podría usarse como un marcador de
50 diagnóstico para medir la gravedad de la enfermedad.
El método de diagnóstico anteriormente descrito puede usarse para determinar si un individuo expresa altos niveles de MAdCAM soluble, que pueden ser indicativos de que el individuo responderá bien al tratamiento con un anticuerpo anti-MAdCAM. Además, el método de diagnóstico también puede usarse para determinar si el tratamiento con anticuerpo anti-MAdCAM (véase posteriormente) u otro agente farmacéutico de la enfermedad está provocando
55 que un individuo exprese niveles menores de MAdCAM y por lo tanto puede usarse para determinar si el tratamiento es exitoso.
Inhibición de adhesión dependiente de 47/MAdCAM por anticuerpo anti-MAdCAM
Se describe un anticuerpo anti-MAdCAM que se une a MAdCAM e inhibe la unión y adhesión de células que portan integrina 47 a MAdCAM u otros ligandos afines, tales como L-selectina, a MAdCAM. En una descripción, la MAdCAM es humana y está en forma soluble o se expresa en la superficie de una célula. En otra descripción, el anticuerpo anti-MAdCAM es un anticuerpo humano. En otra descripción, el anticuerpo o parte del mismo inhibe la unión entre 47 y MAdCAM con un valor de CI50 de no más de 50 nM. En una descripción, el valor de CI50 no es mayor de 5 nM. En una descripción, el valor de CI50 es menor de 5 nM. En una descripción, el valor de CI50 es menor de 0,05 g/ml, 0,04 g/ml o 0,03 g/ml. En otra descripción, el valor de CI50 es menor de 0,5 g/ml, 0,4 g/ml o 0,3 g/ml. El valor de CI50 puede medirse por cualquier método conocido en la técnica. Típicamente, un valor de CI50 puede medirse por ELISA o ensayo de adhesión. En una descripción, el valor de CI50 se mide por ensayo de adhesión usando células o tejido que expresan de forma nativa MAdCAM o células o tejido que pueden modificarse por ingeniería genética para expresar MAdCAM.
Inhibición de reclutamiento de linfocitos a tejido linfoide asociado a intestino por anticuerpos anti-MAdCAM.
En otra se describe un anticuerpo anti-MAdCAM que se une a MAdCAM expresada de forma nativa e inhibe la unión de linfocitos a tejido linfoide gastrointestinal especializado. En una descripción, la MAdCAM expresada de forma nativa es MAdCAM humana o de primate y está en una forma soluble o se expresa en la superficie de una célula. En otra descripción, el anticuerpo anti-MAdCAM es un anticuerpo humano. En otra descripción, el anticuerpo o parte del mismo inhibe el reclutamiento de linfocitos 47+ tróficos para intestino a tejidos que expresan MAdCAM con un valor de CI50 de no más de 5 mg/kg. En una descripción, el valor de CI50 no es mayor de 1 mg/kg. En una descripción, el valor de CI50 es menor de 0,1 mg/kg. En una descripción, el valor de CI50 puede determinarse midiendo la relación de efecto de dosis del reclutamiento de linfocitos de sangre periférica marcados con tecnecio al tracto gastrointestinal usando gammagrafía o tomografía computerizada por emisión de fotones individuales. En otra descripción, el valor de CI50 puede determinarse midiendo el aumento en linfocitos 47+ tróficos para intestino, tales como, pero sin limitación, linfocitos T de memoria CD4+ 47+, en la circulación periférica usando citometría de flujo como una función de la dosis de anticuerpo anti-MAdCAM.
Para que la presente invención pueda entenderse mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son para fines de ilustración solamente y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención de ninguna manera.
Ejemplo 1:
Generación de hibridomas productores de anti-MAdCAM
Los anticuerpos de la invención se prepararon, ensayaron y seleccionaron de acuerdo con el presente Ejemplo
Preparación de Inmunógeno Primario:
Se prepararon dos inmunógenos para inmunización de los ratones XenoMouse: (i) una proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc y (ii) membranas celulares preparadas a partir de células transfectadas de forma estable con MAdCAM.
(i) Proteína de Fusión MAdCAM-IgG1 Fc
Construcción del vector de expresión:
Se escindió un fragmento de ADNc EcoRI/BgIII que codificaba el dominio de tipo inmunoglobulina extracelular maduro de MAdCAM de un clon pINCY Incyte (3279276) y se clonó en los sitios EcoRI/BamHI del vector pIG1 (Simmons, D. L. (1993) en Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, ed. Hartley, D. A. (Oxford Univ. Press, Oxford), pág 93-127) para generar una fusión en fase IgG1 Fc. El inserto resultante se escindió con EcoRI/NotI y se clonó en pCDNA3.1+ (Invitrogen). Se confirmó la secuencia del ADNc de MAdCAM-IgG1 Fc en el vector. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc se muestra a continuación:
Proteína de Fusión MAdCAM-IgG1 Fc: Subrayado: péptido señal
imagen1
imagen1
Negrita: dominio extracelular de MAdCAM
Expresión/Purificación de Proteína Recombinante:
Se transfectaron células CHO-DGFR con vector pCDNA3.1+ que contenía ADNc de la proteína de fusión MAdCAMIgG1 Fc y clones estables que expresaban la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc seleccionados en medio de Iscove que contenía G418 600 g/ml y metotrexato 100 ng/ml. Para la expresión proteica, se sembraron en un biorreactor de fibra hueca células CHO que expresaban de forma estable MAdCAM-IgG1 Fc en medio de Iscove que contenía suero bovino fetal de IgG bajo 10 % (Gibco), aminoácidos no esenciales (Gibco), glutamina 2 mM (Gibco), piruvato sódico (Gibco), G418 100 g/ml y metotrexato 100 ng/ml y se usaron para generar sobrenadantes de medios concentrados. La proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc se purificó a partir del sobrenadante recolectado por cromatografía de afinidad. Brevemente, se aplicó el sobrenadante a una columna de Sepharose de proteína G HiTrap (5 ml, Pharmacia) (2 ml/min), se lavó con Tris 25 mM pH 8, NaCl 150 mM (5 volúmenes de columna) y se eluyó con glicina 100 mM pH 2,5 (1 ml/min), neutralizando inmediatamente las fracciones a pH 7,5 con Tris 1 M pH
8. Las fracciones que contenían proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc se identificaron por SDS-PAGE, se agruparon juntas y se aplicaron a una columna de Sephacryl S100 (Pharmacia), preequilibrada con Bis Tris 35 mM pH 6,5, NaCl 150 mM. La filtración en gel se realizó a 0,35 ml/min, recogiendo un pico de proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc en fracciones de aproximadamente 3 x 5 ml. Estas muestras se agruparon y se aplicaron a una columna de Resource Q (6 ml, Pharmacia), preequilibrada en Bis Tris 35 mM pH 6,5. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de Bis Tris 35 mM pH 6,5, NaCl 150 mM (6 ml/min) y se eluyó la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc en una fracción de 4-6 ml con Bis Tris 35 mM pH 6,5 NaCl 400 mM. En esta etapa la proteína era 90 % pura y migró como una banda sencilla a aproximadamente 68 kD por SDS-PAGE. Para su uso como un inmunógeno y todos los ensayos posteriores, se intercambió el tampón del material a HEPES 25 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 1mM, NaCl 100 mM, glicerol 50 % y se almacenó como alícuotas a -80 ºC.
(ii) Membranas celulares que expresan de forma estable MAdCAM
Se amplificó por PCR un fragmento de SacI/NotI que comprendía los nucleótidos 645-1222 de la secuencia de MAdCAM publicada (Shyjan AM, et al., J Immunol., 156, 2851-7 (1996)) de una biblioteca de ADNc de colon y se clonó en sitios SacI/NotI del vector pIND-Hygro (Invitrogen). Se subclonó un fragmento de SacI, que comprendía la secuencia codificante 5’ adicional en esta construcción de pCDNA3.1 MAdCAM-IgG1 Fc, para generar el ADNc de MAdCAM de longitud completa. Se clonó después un fragmento de KpnI/NotI que contenía el ADNc de MAdCAM en los sitios correspondientes en un vector pEF5FRTV5GWCAT (Invitrogen) y se reemplazó la secuencia codificante de CAT. Se verificó la secuencia del inserto de ADNc y se usó en transfecciones para generar clones sencillos que se expresan de forma estable en células Flpln NIH 3T3 (Invitrogen) por tecnología Flp recombinasa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se seleccionaron clones que se expresaban de forma estable por su capacidad para soportar la unión de una línea de células linfoblastoides B humanas 47+ JY (Chan BM, et al, J. Biol. Chem., 267:8366-70 (1992)), descrita posteriormente. Se prepararon clones estables de células CHO que expresaban MAdCAM de la misma manera, usando células Flpln CHO (Invitrogen).
Se cultivaron células Flpln NIH-3T3 que expresaban MAdCAM en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco), que contenía L-glutamina 2 mM, suero de ternero donante 10 % (Gibco) e Higromicina B 200g/ml (Invitrogen) y se expandieron en frascos rotatorios. Las células Flpln CHO que expresaban MAdCAM se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco/F12 de Ham (Gibco), que contenía L-glutamina 2 mM, suero de ternero donante 10 % (Gibco) e Higromicina B 350 g/ml (Invitrogen) y se expandieron en frascos rotatorios. Las células se recolectaron mediante el uso de una solución de disociación celular no enzimática (Sigma) y raspado, lavando en solución salina tamponada con fosfato por centrifugación. Las membranas celulares se prepararon a partir del sedimento celular por dos ciclos de homogeneización de politron en Bis Tris 25 mM pH 8, MgCl2 10 mM, aprotinina 0,015 % (p/v), bacitracina 100 U/ml y centrifugación. El sedimento final se resuspendió en el mismo tampón y se separaron en alícuotas 50 x 106 equivalentes celulares en eppendorfs de pared gruesa y se centrifugaron a más de 100.000 g para generar sedimentos de membrana celular para inmunizaciones de ratones XenoMouse. Se decantó el sobrenadante y se almacenaron las membranas en eppendorfs a -80 ºC hasta que se necesitaran. Se determinó la confirmación de expresión de proteínas en las membranas celulares por SDS-PAGE y transferencia de Western con un anticuerpo anti-péptido de conejo inducido contra los restos N-terminales de MAdCAM ([C]-KPLQVEPPEP) (SEC ID Nº: 134).
Inmunización y generación de hibridoma:
Se inmunizaron ratones XENOMOUSE de ocho a diez semanas de edad por vía intraperitoneal o en sus almohadillas plantares traseras con la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc recombinante purificada (10 g/dosis/ratón) o membranas celulares preparadas a partir de células NIH 3T3 o CHO que expresan de forma estable MAdCAM (10 x 106 células/dosis/ratón). Esta dosis se repitió de cinco a siete veces durante un periodo de tres a ocho semanas. Cuatro días antes de la fusión, los ratones recibieron una inyección final del dominio extracelular de MAdCAM humana en PBS. Se fusionaron linfocitos de ganglio linfático y bazo de ratones inmunizados con la línea celular de mieloma no secretor P3-X63-Ag8.653 y se sometieron a selección de HAT como se ha descrito previamente (Galfre y Milstein, Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981)). Se recuperó y subclonó un panel de hibridomas que secretaban anticuerpos IgG2 e IgG4 humanos específicos de MAdCAM. Se recuperaron doce subclones de hibridoma, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2., 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2, que producían anticuerpos monoclonales específicos para MAdCAM y se detectaron con ensayos descritos posteriormente. Las líneas parentales 1.7,1.8,6.14, 6.22,6.34, 6.67, 6.73, 6.77, 7.16, 7.20, 7.26 y 9.8, de las que derivaron las líneas de hibridoma subclonadas, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2, tenían todas actividad anti-MAdCAM.
Ensayos de ELISA:
La detección de anticuerpos específicos de antígeno en suero de ratón y sobrenadante de hibridoma se determinó por ELISA como se ha descrito (Coligan et al., unidad 2.1 "Enzyme-linked immunosorbent assays," in Current ProtocolsIinImmunology (1994)) usando proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc para capturar los anticuerpos. Para animales que se inmunizaron con proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc, se exploraron los anticuerpos con respecto a reactividad no específica frente a IgG1 humana y con respecto a la capacidad para unirse a células de MAdCAM Flpln CHO por citometría de flujo.
En un ensayo ELISA preferido, se usan las siguientes técnicas:
Se recubrieron placas de ELISA durante una noche a 4 ºC con 100 l/pocillo de fusión MAdCAM-IgG1 Fc (4,5 g/ml) en placa que contenía tampón (tampón de bicarbonato/carbonato sódico 100 mM pH 9,6). Después de la incubación, se retiró el tampón de recubrimiento y la placa se bloqueó con tampón de bloqueo 200 l/pocillo (BSA 5 %, Tween 20 0,1, en solución salina tamponada con fosfato) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se retiró el tampón de bloqueo y se añadieron 50 l/pocillo de sobrenadante de hibridoma u otro suero o sobrenadante (por ejemplo, control positivo) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación la placa se lavó con PBS (3 x 100 l/pocillo) y se detectó la unión del mAb de hibridoma con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (es decir IgG2-HRP anti ser humano de ratón 1:1000 (SB cat. nº 9060-05) para anticuerpos IgG2 o IgG4-HRP anti ser humano de ratón 1:1000 (Zymed cat. nº 3840) para anticuerpos IgG4) diluidos en PBS. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, se lavaron en PBS (3 x 100 l/pocillo) y se desarrollaron finalmente con 100 l de OPD (o-fenilendiamina (DAKO S2405) + 5 l de H2O2 30 %/12 ml). Se permitió que las placas se desarrollaran durante 10-20 minutos, deteniendo la reacción con 100 l de H2SO4 2 M. Las placas se leyeron a 490 nm.
Ensayos de adhesión
Los anticuerpos que demostraron unión a proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc por ELISA, se evaluaron con respecto a actividad antagonista en ensayos de adhesión con células 47+ JY y (i) proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc o (ii) células MAdCAM-CHO.
(i) Ensayo de fusión de MAdCAM-IgG1
Se adsorbieron 100 l de una solución de proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc purificada 4,5 g/ml en PBS de Dulbecco a placas de fondo en u Microfluor “B” negras de 96 pocillos (Dynex nº 7805) durante una noche a 4 ºC. Las placas recubiertas con MAdCAM se invirtieron después y se separó por transferencia el exceso de líquido, antes de bloquear a 37 ºC durante al menos 1 hora en PBS/BSA 10 %. Durante este tiempo las células JY cultivadas se contaron usando exclusión de azul de tripano (deberían ser aproximadamente 8 x 105 células/ml) y se pipetearon 20 x 106 células/placa de ensayo en un tubo de centrífuga de 50 ml. Se cultivaron células JY en medio RPMI1640 (Gibco), que contenía L-glutamina 2 mM y suero bovino fetal inactivado por calor 10 % (Life Technologies nº 10108165) y se sembraron a 1-2 x 105 /ml cada 2-3 días para evitar que se diferenciara el cultivo. Las células se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 (Gibco) que contenía L-glutamina 2 mM (Gibco) por centrifugación (240g), resuspendiendo el sedimento celular final a 2 x 106 células/ml en RPMI 1640 para carga de calceína AM. Se añadió Calceína AM (Molecular Probes nº C-3099) a las células como una dilución 1:200 en DMSO (concentración final de aproximadamente 5 M) y las células se protegieron de la luz durante el transcurso de la incubación (37 ºC durante 30 minutos). Durante esta etapa de incubación de las células los anticuerpos a ensayar se diluyeron como sigue: para ensayo de dosis sencilla, los anticuerpos se compusieron hasta 3 g/ml (1 g/ml, final) en BSA 0,1 mg/ml (Sigma nº A3059) en PBS; para curvas completas de CI50, los anticuerpos se diluyeron en BSA/PBS 0,1 mg/ml, siendo 3 g/ml (1 g/ml final) la concentración máxima, doblando después las diluciones (relación 1:2) en toda la placa. El pocillo final de la fila se usó para determinar la unión total, de modo que se usó BSA en PBS 0,1 mg/ml.
Después de bloquear, los contenidos de la placa se retiraron y se añadieron 50 l de anticuerpos/controles a cada pocillo y la placa se incubó a 37 ºC durante 20 minutos. Durante este tiempo, las células JY cargadas con calceína se lavaron una vez con medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10 % y una vez con BSA/PBS 1 mg/ml por centrifugación, resuspendiendo el sedimento celular final a 1 x 106 ml en BSA/PBS 1 mg/ml. Se añadieron 100 l de células a cada pocillo de la placa de fondo en U, se selló la placa, se centrifugó brevemente (1000 rpm durante 2
minutos) y la placa se incubó después a 37 ºC durante 45 minutos. Al final de este periodo, las placas se lavaron con un lavador de placa Skatron y se midió la fluorescencia usando un Lector Multimarcador Wallac Victor2 1420 (conteo desde la parte superior a  de excitación 485 nm,  de emisión 535 nm, 8 mm desde el fondo de la placa, durante 0,1 segundos con apertura de emisión normal). Para cada concentración de anticuerpos, se expresó la adhesión 5 porcentual como un porcentaje de respuesta de fluorescencia máxima en ausencia de cualquier anticuerpo menos la fluorescencia asociada con la unión no específica. El valor de CI50 se define como la concentración de anticuerpo anti-MAdCAM a la que la respuesta de adhesión se reduce a 50 % de la respuesta en ausencia de anticuerpo anti-MAdCAM. Se consideró que los anticuerpos que fueron capaces de inhibir la unión de células JY a fusión MAdCAMIgG1 Fc con un valor de CI50  0,1 g/ml, tenían actividad antagonista potente y se llevaron al ensayo de adhesión de
10 MAdCAM-CHO. Los doce AB ensayados mostraron potente actividad antagonista (Tabla 3). Los anticuerpos monoclonales 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5 y 7.26.4 derivaron de linajes IgG2 y los anticuerpos monoclonales 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 y 9.8.2 derivaron de linajes IgG4.
(ii) Ensayo de adhesión de células MAdCAM-CHO.
Las células JY se cultivaron como anteriormente. Se generaron células CHO que expresaban MAdCAM con la
15 construcción de ADNc de MAdCAM pEF5FRT y usando la tecnología de Flp recombinasa (Invitrogen) como se ha descrito anteriormente. Se seleccionaron clones estables sencillos de células CHO que expresaban MAdCAM basándose en su capacidad para soportar la adhesión de células JY y la unión, por citometría de flujo, del anticuerpo de conejo anti-péptido, inducido contra el extremo N-terminal de MAdCAM y descrito anteriormente. Las células CHO que expresaban MAdCAM se cultivaron en un medio DMEM/F12 (Gibco nº 21331-020) que contenía L
20 glutamina 2 mM, suero bovino fetal 10 % (Gibco) e Higromicina B 350 g/ml (Invitrogen), dividiendo 1:5 cada 2/3 días. Para el ensayo de adhesión, se sembraron células CHO que expresaban MAdCAM a 4 x 104 células/pocillo en placas negras de 96 pocillos-fondo claro (Costar nº 3904) en 200 l de medio de cultivo y se cultivaron durante una noche a 37 ºC/CO2 5 %.
El día siguiente, se diluyó el sobrenadante de hibridoma o anticuerpo monoclonal purificado a partir de una
25 concentración de partida de 30 g/ml (equivalente a una concentración final de 10 g/ml) en BSA/PBS 1 mg/ml, como se ha descrito anteriormente. Para las placas de MAdCAM CHO, los contenidos de la placa se retiraron y se añadieron 50 l de anticuerpos/controles a cada pocillo y la placa se incubó a 37 ºC durante 20 minutos. El pocillo final de la fila se usó para determinar la unión total, de modo que se usó BSA 0,1 mg/ml en PBS. Se prepararon células JY cargadas con calceína AM a una concentración final de 1 x 106/ml en BSA/PBS 1 mg/ml como
30 anteriormente, después se añadieron 100 l a la placa después del periodo de incubación de 20 minutos con el anticuerpo. La placa se incubó después a 37 ºC durante 45 minutos, después se lavó en un lavador de placa Tecan (PW 384) y se midió la fluorescencia usando el lector de placa Wallac como se ha descrito anteriormente. Para cada concentración de anticuerpo, se expresó el porcentaje de adhesión como un porcentaje de respuesta de fluorescencia máxima en ausencia de cualquier anticuerpo menos la fluorescencia asociada con unión no específica.
35 Se consideró que los anticuerpos que fueron capaces de inhibir la unión de células JY a células MAdCAM CHO con un valor de CI50  1 g/ml tenían actividad antagonista potente. Como antes, el valor de CI50 se define como la concentración de anticuerpo anti-MAdCAM a la que la respuesta de adhesión se ha reducido a 50 % de la respuesta en ausencia de anticuerpo anti-MAdCAM. Las potencias de CI50 para 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2 en el presente ensayo se describen a continuación en la Tabla 3.
40 Tabla 3. Valores de CI50 de anticuerpos anti-MAdCAM ejemplificados
Clon
CI50 Media (g/ml) de fusión MAdCAM IgG 1 Fc n CI50 Media (g/ml) de Ensayo de Flpln CHO MAdCAM n
1.7.2
0,030  0,011 6 0,502  0,280 9
1.8.2
0,027  0,011 4 0,424  0,107 8
7.16.6
0,019  0,009 7 0,389  0,093 16
7.20.5
0,025  0,027 7 0,387  0,202 9
7.26.4
0,021  0,040 4 0,574  0,099 15
6.14.2
0,011  0,005 4 0,291  0,096 6
6.22.2
0,018  0,011 4 0,573  0,168 7
6.34.2
0,013  0,008 4 0,285  0,073 7
Clon
CI50 Media (g/ml) de fusión MAdCAM IgG 1 Fc n CI50 Media (g/ml) de Ensayo de Flpln CHO MAdCAM n
6.67.1
0,013  0,070 4 0,298  0,115 8
6.73.2
0,020  0,010 4 0,369  0,103 8
6.77.1
0,022  0,004 4 0,520  0,100 4
9.8.2
0,020  0,050 4 0,440  0,342 8
IgG2
IgG4
Para medir la potencia antagonista de mAb anti-MAdCAM en ensayos basados en flujo en condiciones de tensión de cizallamiento que se diseñan para imitar el ambiente microvascular en las vénulas endoteliales altas que sirven al 5 tejido linfoide asociado a intestino, se sembraron células CHO que expresaban MAdCAM en microportaobjetos de vidrio (50 x 4 mm) y se permitió que se adhirieran hasta formar una monocapa confluyente (aproximadamente 2,5 x 105 células). Las células se incubaron después con mAb purificado para afinidad sobre un intervalo de concentraciones (0,1-10 g/ml) durante 20 minutos a 37 ºC, antes de conectarse al sistema de ensayo de flujo. Se usó un mAb IgG2 o IgG4 de isotipo coincidente (10 g/ml) como un control negativo. Se perfundieron linfocitos de 10 sangre periférica de donante normal (PBL) sobre la monocapa celular a una tensión de cizallamiento constante de 0,05 Pa. Los experimentos se filmaron y se calculó la adhesión total de linfocitos (rodantes + adhesión firme). Se mostró que todos los anticuerpos monoclonales ensayados eran antagonistas potentes en las condiciones descritas.
(iii) Ensayos de Stamper-Woodruff
Para visualizar vasos MAdCAM+, se generó mAb anti-MAdCAM biotinilado en 1-2 mg de proteína purificada para
15 afinidad, usando un exceso 20 molar de biotina-NHS (Pierce) en solución salina tamponada con fosfato, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se permitió que la reacción se asentara a temperatura ambiente (30 minutos) y se desalara con una columna de PD-10 (Pharmacia) y la concentración de proteína determinada.
Se retiró el ganglio linfático de hígado normal de un órgano de donante, se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -70 ºC hasta su uso. Se cortaron secciones de cryostat de 10 m, se secaron al aire en
20 portaobjetos recubiertos de poli-L lisina y se fijaron en acetona antes del ensayo. Las secciones se bloquearon usando un sistema de bloqueo de avidina-biotina (DAKO) y después se incubaron con mAb anti-MAdCAM biotinilado sobre un intervalo de concentraciones (1-50 g/ml) a temperatura ambiente (2 horas). Se usó un mAb IgG2 o IgG4 de isotipo coincidente (50 g/ml) como un control negativo y un anticuerpo anti-7 de bloqueo (50 g/ml) como un control positivo.
25 Se marcaron linfocitos de sangre periférica, tomados de donantes normales, con un mAb anti CD2 humano de ratón (DAKO) para permitir la visualización posterior de células adherentes. Se añadieron 5 x 105 PBL a cada sección de ganglio linfático y se incubaron durante 30 minutos antes de aclararse suavemente para evitar la separación de células adherentes. Las secciones se volvieron a fijar después en acetona y se volvieron a incubar con mAb anti-MAdCAM biotinilado (10 g/ml), seguido de mAb anti ratón de cabra biotinilado (para reconocer PBL marcadas con
30 CD2 y vasos MAdCAM+ no teñidos) y después complejo streptAB/HRP (DAKO). Finalmente se visualizaron vasos MAdCAM+ y PBL marcadas con CD2 por adición de sustrato DAB (DAKO) a las secciones, mostrando un producto de reacción marrón áreas de tinción positiva. La adhesión de linfocitos se cuantificó contando el número de linfocitos que se adhieren a 50 vasos MAdCAM-1+ de tractos portales, venas o sinusoides. Los datos, expresados como valores medios se normalizaron después a porcentaje de adhesión, usando la adhesión de PBL en ausencia de
35 cualquier anticuerpo tomado como 100 %. Los datos se compilaron basándose en n=3 donantes de PBL diferentes y para diferentes donantes de ganglio linfático de hígado. Se presentan datos representativos para anticuerpos monoclonales purificados biotinilados 1.7.2 y 7.16.6 en la Figura 4 en comparación con un control de anticuerpo anti7 de bloqueo.
Ensayos de selectividad:
40 VCAM y fibronectina son homólogos cercanos de secuencia y estructurales de MAdCAM. Se evaluaron mAb anti-MAdCAM purificados por afinidad con respecto a especificidad de MAdCAM determinando su capacidad para bloquear la unión de linfocitos T Jurkat 41+/51+ (ATCC) a su molécula de adhesión celular afín. Se adsorbieron
100 l de una solución de 4,5 g/ml de fragmento de unión a células de Fibronectina (110 Kd, Europa Bioproducts Ltd, Cat. Nº UBF4215-18) o VCAM (Panvera) en PBS de Dulbecco a placas de fondo en u Microfluor “B” Negras de 96 pocillos (Dynex nº 7805) durante una noche a 4 ºC. Las placas recubiertas se invirtieron después y se retiró por transferencia el exceso de líquido, antes de bloquear a 37 ºC durante al menos 1 hora en BSA/PBS 10 %. Durante 5 este tiempo los linfocitos T Jurkat cultivados se contaron usando exclusión de azul de tripano y se cargaron con colorante calceína AM como se ha descrito previamente para células JY anteriormente. Los anticuerpos a ensayar, se diluyeron a partir de una concentración superior de 10 g/ml en BSA 0,1 mg/ml en PBS. El pocillo final de la fila se usó para determinar la unión total, de modo que se usó BSA en PBS 0,1 mg/ml. Se usó equistatina (Bachem, Cat. nº H-9010) preparada en PBS a una concentración superior de 100 nM para bloquear la interacción
10 51/Fibronectina. Se usó un anticuerpo anti-CD106 (Clon 51-10C9, BD Pharmingen Cat. nº 555645) a una concentración superior de 1 g/ml para bloquear la interacción 41/VCAM.
Después de bloquear, los contenidos de la placa se retiraron y se añadieron 50 l de anticuerpos/controles a cada pocillo y se incubó la placa a 37 ºC durante 20 minutos. Los linfocitos T Jurkat cargados con calceína se lavaron una vez como anteriormente, resuspendiendo el sedimento celular final a 1 x 106/ml en BSA/PBS 1 mg/ml. Se añadieron 15 100 l de células a cada pocillo de la placa de fondo en U, se selló la placa, se centrifugó brevemente (1000 rpm durante 2 minutos) y la placa se incubó después a 37 ºC durante 45 minutos. Al final de este periodo, las placas se lavaron con un lavador de placa Skatron y se midió la fluorescencia usando un lector de multiplaca Wallac Victor2 1420 (conteo desde la parte superior  de excitación 485 nm,  de emisión 535 nm, 8 mm desde el fondo de la placa, durante 0,1 segundos con apertura de emisión normal). Para cada anticuerpo, el grado de inhibición se
20 expresa a continuación gráficamente, en la Tabla 4 (- inhibición insignificante de adhesión, *** inhibición completa de adhesión). Todos los mAb ejemplificados son antagonistas anti-MAdCAM potentes y selectivos, que demuestran selectividad sustancialmente mayor de 100 veces para MAdCAM frente a VCAM y fibronectina.
Tabla 4. Selectividad comparativa de anticuerpo anti-MAdCAM para MAdCAM sobre otras moléculas de adhesión celular, Fibronectina y VCAM.
Clon
Inhibición en ensayo de 51/Fibronectina (10 g/ml) Inhibición en ensayo de 41/VCAM (10 g/ml) Inhibición en ensayo de 47/MAdCAM (0,1 g/ml)
1.7.2
- - ***
1.8.2
- - ***
7.16.6
- - ***
7.20.5
- - ***
7.26.4
- - ***
6.14.2
- - ***
6.22.2
- - ***
6.34.2
- - ***
6.67.1
- - ***
6.73.2
- - ***
6.77.1
- - ***
9.8.2
- - ***
IgG2
IgG4
Los hibridomas se depositaron en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), H.P.A en CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG el 9 de septiembre de 2003 con los siguientes números de depósito:
Hibridoma
Nº de Depósito
1.7.2
03090901
1.8.2
03090902
6.14.2
03090903
6.22.2
03090904
6.34.2
03090905
6.67.1
03090906
6.73.2
03090907
6.77.1
03090908
7.16.6
03090909
7.20.5
03090910
7.26.4
03090911
9.8.2
03090912
Ejemplo II:
Determinación de Constantes de Afinidad (Kd) de Anticuerpos Monoclonales Anti-MAdCAM Completamente Humanos por BIAcore
Los inventores realizaron medidas de afinidad de anticuerpos purificados por resonancia de plasmón superficial 5 usando el instrumento BIAcore 3000, siguiendo los protocolos del fabricante.
Protocolo 1
Para realizar análisis cinéticos, se preparó una superficie de anticuerpo anti humano (IgG2 e IgG4) de ratón de alta densidad sobre una microplaca sensora de BIAcore CM5 usando un acoplamiento de amina rutinario. Se diluyeron los sobrenadantes de hibridoma 10, 5, 2 veces en tampón de ejecución HBS-P (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 10 mM, tensioactivo P20 0,005 %) que contenía BSA 100 g/ml y carboximetildextrano 10 g/ml o se usaron puros. Cada mAb se capturó en una superficie separada usando un tiempo de contacto de 1 minuto y un lavado de 5 minutos para estabilización de la cantidad inicial de mAb. Se inyectó después proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc (141 nM) sobre todas las superficies durante 1 minuto, seguido de una disociación de 3 minutos. Los datos se normalizaron para la cantidad de anticuerpo capturado en cada superficie y se evaluaron con ajuste global de
15 Langmuir 1:1, usando modelos de deriva de medida inicial disponibles en el software BIAevaluation proporcionado por BIAcore.
Protocolo 2
Se inmovilizaron mAb purificados para afinidad sobre la capa de dextrano de una microplaca biosensora CM5 usando acoplamiento de amina. Se prepararon las microplacas usando tampón acetato pH 4,5 como el tampón de 20 inmovilización y se consiguieron densidades proteicas de 2,5-5,5 kRU. Se prepararon muestras de proteína de fusión de MAdCAM-IgG1 Fc en tampón de ejecución a concentraciones que variaban de 0,2 a 55 nM (se incluyó una solución de 0 nM que comprendía solamente tampón de ejecución como una referencia cero). Las muestras se seleccionaron aleatoriamente y se inyectaron por duplicado durante 3 minutos cada una a través de 4 celdas de flujo usando HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 0,005 %) como tampón de
25 ejecución. Se usó un caudal de 100 l/minuto para minimizar las limitaciones de transporte de masa. Se controló la disociación de proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc durante 180 minutos, se regeneró la superficie por una inyección de 6 segundos de H3PO4 25 mM (50 l/minuto) o 10 mM (6.22.2), 20 mM (6.67.1, 6.73.2, 6.77.1) a 25 mM (6.34.2) y NaOH 45 mM (6.14.2) y se analizaron los datos usando el paquete de software BIAevaluation (versión 3.1).
La Tabla 5 enumera mediciones de afinidad para anticuerpos anti-MAdCAM representativos de la presente 30 invención:
Tabla 5. Determinación de la constante de afinidad, Kd, por resonancia de plasmón superficial (BIAcore)
CLON
Protocolo 1 Protocolo 2
kon (I/Ms)
koff (l/s) KD (pM) kon (I/MS) koff(l/s) KD (pM)
1.7.2
2,4 x105 1 x 10-5 42 5,5 x 103 1,3 x 10-7 23,6
1.8.2
2,9 x 105 1 x 10-5 35 1,8 x 105 2,3 x 10-5 128
7.16.6
1,5 x106 2,2 x 10-6 1,5 2,9 x105 1,4 X10-6 4,8
7.20.5
4,5 x 105 1,9 x 10-5 42,2 1,6 x105 1,2 x10-5 75
7.26.4
9,6 x 105 1,3 x 105 2,6 x 10-4 1 x 10-5 271 7,7 1,5 x 105 5 x 105 1,2 x10-5 < 5x10-6 80 < 10
6.14.2
1,5 x 106
1,4 x 10-5 9,3 2,3 x 105 8,7 x10-7 3,8
6.22.2
1,2 x 106 5,9 x 105 1,4 x 105
1,9x 10-5 1 x 10-5 1,3 x 10-4 15,8 17 93 3,3 x105 2,4 x 105 < 5 x 10-6 < 5 x 10-6 <15 <20
6.34.2
6.67.1
6.73.2
1,5 x 105 2,3 x 106
1 x 10-5 2,3 x 10-4 6,7 100 4,4 x105 1,4 x10-5 32,5
6.77.1
9.8.2
IgG2
IgG4
El análisis cinético indica que los anticuerpos preparados de acuerdo con la invención poseen altas afinidades y fuertes constantes de unión para el dominio extracelular de MAdCAM.
Ejemplo III:
Identificación de selectividad de epítopo y reactividad cruzada de especies de los mAb anti-MAdCAM
5 Los anticuerpos reconocen epítopos expuestos en superficie en antígenos como regiones de secuencia lineal (primaria) o secuencia estructural (secundaria). Se usaron agrupación de epítopos Luminex, agrupación de BIAcore y análisis inmunohistoquímico de especies en sintonía, para definir el paisaje de epítopo funcional de los anticuerpos anti-MAdCAM.
Agrupación de Epítopos basado en Luminex:
10 Se acoplaron perlas conjugadas con MxhlgG 2,3.4 (Calbiochem M1 1427) al anticuerpo anti-MAdCAM desconocido primario. Los inventores añadieron 150 l de dilución de anticuerpo desconocido primario (0,1 g/ml diluidos en medio de hibridoma) al pocillo de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos. La reserva de perlas se agitó por vórtex suavemente y se diluyó en sobrenadante hasta una concentración de 0,5 105 perlas/ml. Las perlas se incubaron en el sobrenadante en un agitador durante una noche en oscuridad a 4 ºC.
15 Cada pocillo de una placa de filtro de microtitulación de 96 pocillos (Millipore nº MABVN1250) se pre humectó añadiendo 200 l de tampón de lavado (PBS que contenía Tween 20 0,05 %) y se retiró por aspiración. A continuación, se añadieron 50 l/pocillo de la reserva de 0,5 x 105 perlas/ml a la placa de filtro y se lavaron los pocillos con tampón de lavado (2 x 100 l/pocillo). Se añadieron 60 l/pocillo de antígeno de MAdCAM-IgG1 Fc diluido en medio de hibridoma (0,1 g/ml). Las placas se cubrieron y se incubaron a temperatura ambiente con
20 agitación suave durante una hora. Los pocillos se lavaron dos veces mediante adición de tampón de lavado 100 l/pocillo seguido de aspiración. A continuación, los inventores añadieron 60 l/pocillo de anticuerpo anti-MAdCAM desconocido secundario diluido en medio de hibridoma (0,1 g/ml). Las placas se agitaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante dos horas. A continuación, los pocillos se lavaron dos veces por adición de tampón de lavado 100 l/pocillo seguido de aspiración. A continuación, se añadieron 60 l/pocillo de MxhIgG 2,3,4 (0.5 g/ml)
25 biotinilado. Las placas se agitaron a temperatura ambiente en oscuridad durante una hora. Los pocillos se lavaron dos veces mediante adición de tampón de lavado 100 l/pocillo seguido de aspiración. A cada pocillo, se añadieron 60 l de MxhIgG 2,3,4 Estreptavidina-PE (Pharmacia nº 554061) 1 g/ml diluido en medio de hibridoma. Las placas se agitaron a temperatura ambiente en oscuridad durante veinte minutos. Los pocillos se lavaron dos veces mediante adición de tampón de lavado 100 l/pocillo seguido de aspiración. A continuación, cada pocillo se
30 resuspendió en 80 l de tampón de bloqueo (PBS con albúmina de suero bovino 0,5 %, TWEEN 0,1 % y Timerosal 0,01 %) pipeteado arriba y abajo con cuidado para resuspender las perlas.
Usando Luminex 100 y su software adjunto (Luminex Corporation) las placas se leyeron para determinar lecturas de luminiscencia. Basándose en los datos de luminiscencia obtenidos para los diversos anticuerpos anti-MAdCAM ensayados, los anticuerpos anti-MAdCAM se agruparon de acuerdo con sus especificidades de unión. Los 35 anticuerpos anti-MAdCAM que se ensayaron quedan en una serie de grupos de epítopos, representados en la Tabla
8.
Agrupación de BIAcore:
En un método similar al descrito anteriormente, también puede usarse BIAcore para determinar la exclusividad de epítopos de los anticuerpos anti-MAdCAM ejemplificados por la presente invención. Se inmovilizaron nueve clones 40 de anticuerpos anti-MAdCAM, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.26.4 y 7.16.6 sobre la capa de dextrano de celdas de flujo separadas de una microplaca biosensora CM5 usando acoplamiento de amina. El tampón de inmovilización fue tampón acetato 10 mM pH 4,5 (clones 6.22.2, 6.34.2, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.26.4 y 7.16.6) o tampón de acetato 10 mM pH 5,5 (clones 6.67.1 y 6.77.1). Se consiguió una densidad proteica de aproximadamente 3750 RU en todos los casos. La desactivación de ésteres de N-hidroxisuccinimida no 45 reaccionados se realizó usando clorhidrato de etanolamina 1 M, pH 8,5. Se diluyó proteína de fusión [0230] MAdCAM-IgG1 Fc a una concentración de 1,5 g/ml (aproximadamente 25 nM) en tampón de ejecución HBS-EP (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, polisorbato 20 0,005 %). Se inyectó después a través de una primera celda de flujo en un volumen de 50 l a una velocidad de 5 l/minuto. Después de completarse la inyección, se añadió la primera sonda de anticuerpo a la misma celda de flujo. Todos los anticuerpos de ensayo se diluyeron a 50 una concentración de aproximadamente 20 g/ml en HBS-EP y también se inyectaron en un volumen de 50 l a un caudal de 5 l/minuto. Cuando no se observó unión del anticuerpo de ensayo, se inyectó el siguiente clon de ensayo inmediatamente después. Cuando se produjo unión, la superficie sensora se regeneró para retirar tanto la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc como el anticuerpo de ensayo. Se usó una diversidad de soluciones de regeneración dependiendo del anticuerpo inmovilizado y el anticuerpo de ensayo presente. Se representa un compendio de las
condiciones de regeneración usadas en la Tabla 6. Tabla 6. Compendio de condiciones de regeneración usadas para realizar mapeo de epítopos por BIAcore
Anticuerpo inmovilizado
Sonda de anticuerpo a retirar Solución de regeneración Volumen de inyección
7.16.6
6.22.2 Ácido Fosfórico 40 mM 20 l
6.34.2
Ácido Fosfórico 40 mM 40 l
7.20.5
Ácido Fosfórico 40 mM 20 l
6.77.1
9.8.2 Ácido Fosfórico 40 mM 10 l
1.7.2
Ácido Fosfórico 40 mM 5 l
7.16.6
Ácido Fosfórico 40 mM 10 l
1.7.2
6.77.1 Ácido Fosfórico 25 mM 5 l
9.8.2
Ácido Fosfórico 25 mM 5 l
7.20.5
Ácido Fosfórico 25 mM 5 l
6.22.2
Ácido Fosfórico 25 mM 5 l
6.34.2
Hidróxido Sódico 25 mM 5 l
6.67.1
Hidróxido Sódico 25 mM 5 l
6.22.2
9.8.2 Hidróxido Sódico 25 mM 20 l
7.26.4
Hidróxido Sódico 25 mM 5 l
6.34.2
9.8.2 Hidróxido Sódico 25 mM 70 l
1.7.2
Hidróxido Sódico 40 mM 5 l
7.26.4
Hidróxido Sódico 40 mM 5 l
6.67.1
9.8.2 Hidróxido Sódico 40 mM 5 l
1.7.2
Hidróxido Sódico 40 mM 5 l
7.20.5
9.8.2 Ácido Fosfórico 25 mM 5 l
1.7.2
Ácido Fosfórico 25 mM 5 l
7.26.4
Ácido Fosfórico 25 mM 5 l
7.26.4
9.8.2 Hidróxido Sódico 40 mM 20 l
6.22.2
Ácido Fosfórico 75 mM 20 l
7.20.5
Ácido Fosfórico 75 mM 20 l
7.16.6
Ácido Fosfórico 75 mM 20 l
9.8.2
9.8.2
Ácido Fosfórico 25 mM 15 l
6.22.2
Ácido Fosfórico 25 mM 10 l
7.20.5
Ácido Fosfórico 25 mM 20 l
7.16.6
Ácido Fosfórico 25 mM 10 l
(El caudal fue de 50 l/minuto durante todos los procedimientos de regeneración) 42
Después de la regeneración, la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc se unió de nuevo y se inyectaron anticuerpos
de ensayo adicionales. Estos procedimientos se llevaron a cabo hasta que se hubo inyectado el panel completo de
clones sobre la superficie del anticuerpo inmovilizado, con la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc unida. Se usó
después una nueva celda de flujo con un anticuerpo inmovilizado diferente y MAdCAM unido para ensayar con los
5 nueve clones de ensayo. Se esperaba que los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2 y 1.8.2 reconocieran el mismo
epítopo de MAdCAM, basándose en la homología de secuencia de aminoácidos primaria cercana de sus cadenas
ligera kappa y pesada, SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8 respectivamente. En consecuencia, solamente se evaluó 1.7.2 a través
de la matriz de respuesta BIAcore. Los anticuerpos 6.14.2 y 6.73.2 se omitieron de este análisis, pero todas las
demás combinaciones de pares de anticuerpos anti-MAdCAM se ensayaron de esta manera. Se seleccionó un nivel 10 arbitrario de 100 RU como el umbral entre unión/no unión y se creó una matriz de respuesta (Tabla 7) basándose en
si se observó unión.
Tabla 7. Matriz de respuesta de agrupación de epítopos por BIAcore
Anticuerpo
Anticuerpo secundario
inmovilizado
6.22.2
6.34.2 6.67.1 6.77.1 7.20.5 9.8.2 1.7.2 7.26.4 7.16.6
6.22.2
- - - - - X X X X
6.34.2
- - - - - X X X X
6.67.1
- - - - - X X - -
6.77.1
- - - - - X X - X
7.20.5
- - - - - X X X X
9.8.2
X X X X X X - - X
1.7.2
X X X X X X - - X
7.26.4
X X - - X X - - X
7.17.6
X X - - X - - - -
Matriz de respuesta para todas las combinaciones de pares de anticuerpos. – indica no unión de la sonda de anticuerpo, x indica que se observó unión (por encima de un nivel de umbral seleccionado de 100 RU).
15 La diagonal de la matriz en la Tabla 7 (sombreada en gris) contiene los datos de unión para pares de sondas idénticas. En todos los casos, excepto para los dos clones 7.16.6 y 9.8.2, los anticuerpos eran autobloqueantes. Los anticuerpos 7.16.6 y 9.8.2 no compiten de forma cruzada. La falta de autobloqueo podría deberse a un cambio conformacional inducido por mAb en la proteína de fusión que permite unión adicional de mAb a un segundo sitio en MAdCAM-IgFc.
20 La agrupación de los clones que muestran el mismo patrón de reactividad da lugar al menos a seis conjuntos de epítopos diferentes, como se muestra en la representación gráfica, (Figura 5).
Puede determinarse una identificación precisa adicional de las secuencias de epítopos de MAdCAM con las que interacciona un anticuerpo anti-MAdCAM por cualquiera de varios métodos, incluyendo, pero sin limitación, análisis de Western de series de bibliotecas peptídicas de aplicación puntual (Reineke et al., Curr. Topics in Microbiol. and
25 Immunol 243: 23-36 (1999), M. Famulok, E-L Winnacker, C-H Wong eds., Springer-Verlag, Berlín), presentación de biblioteca de expresión de fagos o flagelina bacteriana/fliC o análisis de MALDI-TOF sencillo de fragmentos proteicos unidos después de proteólisis limitada.
Ensayos inmunohistoquímicos:
Se usaron OCT o muestras de ensayo de tejido congelado incluidas en sacarosa de íleon (placas de Peyer), ganglio
30 linfático mesentérico, bazo, estómago, duodeno, yeyuno y colon como controles de tinción positiva para los mAb anti-MAdCAM. Para teñir secciones humanas con mAb de IgG2 humanos, se generaron derivados biotinilados de los mAb anti-MAdCAM. Se cortaron secciones de tejido congelado de 10 m en portaobjetos recubiertos con poli Llisina, se colocaron directamente en acetona 100 % 4 ºC (10 minutos), después peróxido de hidrógeno 3 % en metanol (10 minutos), lavando entre etapas con PBS. Los portaobjetos se bloquearon con sistema de bloqueo de
35 biotina (DAKO Cat. nº X0590), antes de incubación con el anticuerpo primario (1:100 - 1:1000) en PBS (1 hora), se lavaron con PBS-Tween 20 (0,05 %) y después se desarrolló la unión con HRP-Estreptavidina (BD Bioscience Cat. nº 550946, 30 minutos) y sustrato DAB (Sigma Cat nº D5905). Para mAb de IgG4, se usó secundario anti IgG4 humano de ratón conjugado con HRP (Zymed Cat nº 3840). Los portaobjetos se contratiñeron con Haemalum de Mayer (1 minuto), se lavaron y después se montaron en DPX.
La afinidad de unión se comparó para varias especies (tejido de ratón, rata, conejo, perro, cerdo, cynomolgus y ser humano). No hubo reactividad para tejidos rata, conejo y cerdo por inmunohistoquímica y no hubo reactividad cruzada de los anticuerpos anti-MAdCAM para MAdCAM recombinante de ratón, cuando se analizaron por ELISA. Los datos para tejido de ser humano, cynomolgus y perro se presentan en forma de tabla, Tabla 8 a continuación:
Tabla 8. Patrón de reactividad cruzada de anticuerpos anti-MAdCAM con ortólogos de especies de MAdCAM
Reactividad cruzada de IHC
CLON
Agrupación de Luminex Íleon Íleon de Íleon de Íleon de
humano
cyno tití perro
1.7.2
3a
1.8.2
3a
7.16.6
3b
7.20.5
2b n.d
7.26.4
3b n.d
6.14.2
2 n.d
6.22.2
2 n.d
6.34.2
6 n.d
6.67.1
5 n.d
6.73.2
3 n.d n.d
6.77.1
1 n.d
9.8.2
3a n. d
IgG2
Sin unión
IgG4
Unión
n.d: no determinado
La unión anti-MAdCAM con estructuras endoteliales especializadas y tejido linfoide se indica por el sombreado, de acuerdo con la clave. El grupo de epítopos basándose en el análisis de epítopos de Luminex y el patrón de
10 reactividad cruzada de MAdCAM se indican para cada anticuerpo. Los datos de agrupación de epítopos de Luminex para anticuerpos anti-MAdCAM 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.3 y 6.77.1 (cursiva) se derivó de experimentos separados de los de 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2 (en negrita), como se indica por la diferencia en la fuente tipográfica.
Todos los anticuerpos anti-MAdCAM ensayados tuvieron la capacidad de reconocer un epítopo de MAdCAM
15 humano expresado en compartimientos endoteliales vasculares del tracto gastrointestinal. Aparte de 1.7.2 y 1.8.2, todos los demás anticuerpos anti-MAdCAM ensayados fueron capaces de unirse específicamente a los compartimentos endoteliales vasculares del tracto gastrointestinal de cynomolgus. Ciertos anticuerpos anti-MAdCAM distintos, concretamente 6.14.2 y 6.67.1 también tuvieron la capacidad de reconocer específicamente el ortólogo de MAdCAM de perro así como MAdCAM de cynomolgus.
20 Generación de una línea celular de CHO que expresa MAdCAM de ser humano/cynomolgus quimérica funcionalmente activa:
Las diferencias en afinidad de unión de ciertos anticuerpos anti-MAdCAM para MAdCAM de ser humano y cynomolgus condujo a los investigadores a determinar si podría hacerse una base estructural para esta observación.
Basándose en la secuencia de aminoácidos publicada para MAdCAM de macaco (Shyjan AM, et al., J Immunol.,
25 156, 2851-7 (1996)), se diseñaron cebadores para amplificar por PCR la secuencia de dominio de unión 47 de MAdCAM de cynomolgus. Se preparó ARN total a partir de ganglio linfático mesentérico de cynomolgus escindido congelado (aproximadamente 200 mg) usando el método de Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 1-2 g se cebaron con oligo-dT y se transcribieron de forma inversa con transcriptasa inversa AMV (Promega). Se sometió una proporción del producto transcrito inverso a PCR con cebadores directo 5’-AGC ATG GAT CGG GGC CTG GCC-3’ (SEC ID Nº: 111) e inverso 5’-GTG CAG GAC CGG GAT GGC CTG-3’ (SEC ID Nº:
5 112) con polimerasa GC-2 en fusión de GC 1 M (Clontech) y a una temperatura de hibridación de 62 ºC. Se escindió un producto de RT-PRC del tamaño apropiado y se purificó a partir de un gel de agarosa 1 % después de electroforesis, después se clonó con TOPO-TA (Invitrogen) entre sitios EcoRI de pCR2.1. Se confirmó la secuencia del inserto. El nucleótido y las secuencias de aminoácidos traducidas predichas se muestran en SEC ID Nº: 49 y 50, respectivamente.
10 Las secuencias de aminoácidos de MAdCAM de cynomolgus y ser humano predichas para el dominio de unión 47 muestran un alto grado de identidad de secuencia (90,8 %) cuando se alinean (la Figura 3 proporciona este alineamiento de secuencia). Para generar una línea celular que exprese MAdCAM de cynomolgus funcionalmente activa, que imite el patrón de unión anti-MAdCAM representado por la Tabla 8, se subclonó un fragmento de SacI correspondiente a la secuencia de dominio de unión de 47 de cynomolgus en pCR2.1, directamente en la
15 construcción de MAdCAM pIND-Hygro humana C-terminal que contenía dominio transmembrana y tallo de mucina carboxi terminal, descrito anteriormente. Se verificó la secuencia y la orientación, después se clonó un fragmento de KpnI/NotI en vector pEF5FRTV5GWCAT (Invitrogen), reemplazando la secuencia codificante de CAT y se usó en transfecciones para generar clones que se expresan de forma estable sencillos en células Flp In CHO (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
20 La unión de clones de anticuerpo anti-MAdCAM a las células CHO que expresan quimera MAdCAM de cynomolgus/ser humano se evaluó por citometría de flujo y se determinó la actividad funcional de anticuerpos anti-MAdCAM usando un ensayo de adhesión de células JY muy similar al que se ha descrito anteriormente. La unión y actividad funcional de anticuerpos anti-MAdCAM se expresa en la Tabla 9.
Tabla 9. Correlación entre la actividad funcional en el ensayo de adhesión de MAdCAM-CHO/JY de cynomolgus/ser
25 humano y unión de células MAdCAM CHO de cynomolgus/ser humano, según se mide por FACS, para un intervalo de anticuerpos anti-MAdCAM.
CLON
CI50 Funcional (g/ml) Unión de FACS
ser humano
cyno/humano
1.7.2
inactivo
1.8.2
inactivo
7.16.6
0,72
7.20.5
0,62
7.26.4
0,96
6.14.2
0,53
6.22.2
0,83
6.34.2
0,47
6.67.1
0,75
6.73.2
inactivo
6.77.1
0,64
9.8.2
0,83
IgG2
IgG4
No unión
Unión

Tomados juntos existe una buena correlación entre la capacidad de un anticuerpo anti-MAdCAM dado para unirse a MAdCAM de ser humano o cynomolgus, según se detectó por inmunohistoquímica (Tabla 8), con actividad funcional y de unión basada en células recombinantes (Tabla 9). Los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 y 6.73.2, por ejemplo, demostraron una falta consistente de unión a tejido de cynomolgus y células que expresan una proteína MAdCAM de cynomolgus/ser humano quimérica. Los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 y 6.73.2 tampoco tenían la capacidad de detectar actividad de bloqueo funcional en el ensayo de adhesión de MAdCAM/JY de cynomolgus/ser humano.
Podrían usarse enfoques similares para definir el epítopo de los anticuerpos anti-MAdCAM 6.14.2 y 6.67.1 que reconocen MAdCAM de perro.
Ejemplo IV:
Uso de mAb anti-MAdCAM en la detección de MAdCAM soluble en circulación como un método de diagnóstico de enfermedad
Los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para detección de MAdCAM soluble en circulación (sMAdCAM). La detección de sMAdCAM en plasma líquido, muestras de suero u otro biofluido, tales como, pero sin limitación, heces, orina, esputo es probablemente un biomarcador de enfermedad sustituto útil para enfermedad subyacente, incluyendo, pero sin limitación, enfermedad inflamatoria del intestino.
Basándose en los datos de agrupación de epítopos (Tabla 7 y 8), los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2 y 7.16.6 parecen reconocer diferentes epítopos en MAdCAM humana. Las placas de ELISA se recubrieron durante una noche a 4 ºC con 100 l/pocillo de una solución de 50 g/ml de 1.7.2 en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de la incubación la placa se bloqueó durante 1,5 horas con un tampón de bloqueo de PBS que contenía leche 10 % (200 l/pocillo). Después de la incubación la placa se lavó con PBS (2 x 100 l/pocillo) y se añadieron diluciones en serie de proteína de fusión MAdCAM-IgGI Fc, a partir de una concentración superior de 50 g/ml bajando hasta aproximadamente 5 ng/ml en PBS, a un volumen final de 100 l, a la placa para incubación de 2 horas a temperatura ambiente. En un enfoque similar la proteína MAdCAM-IgGI Fc puede diluirse en plasma o suero o algún otro biofluido relevante similar y usarse para determinar la expresión de MAdCAM soluble en una muestra clínica, como se describe posteriormente. Como un control negativo, solamente se añadió tampón a los pocillos que contenían el anticuerpo primario anti-MAdCAM. Después de este tiempo, la placa se lavó con PBS (3 x 100 l/pocillo) y la placa se incubó después en oscuridad con un 7.16.6 marcado con Alexa488 (100 l, 5 g/ml). El
7.16.6 marcado con Alexa488 se generó usando un kit disponible en el mercado (Molecular Probes, A-20181), siguiendo los protocolos del fabricante.
La placa se lavó con PBS que contenía Tween 20 0,05 % y se determinó la unión de 7.16.6 marcado a MAdCAM soluble capturada mediante la medición de la fluorescencia (Lector de Multimarcador Wallac Victor2 1402, conteo desde la parte superior de  de excitación 485 nm,  de emisión 5535 nm, 3 mm desde el fondo de placa, durante 0,1 segundos con apertura de emisión normal). Cuando se representa la fluorescencia como una función de la concentración de la proteína de fusión MAdCAM-IgGI Fc, Figura 6, indica que 1.7.2 y un 7.16.6 marcados pueden usarse para fines de diagnóstico para determinar el nivel de MAdCAM soluble en circulación expresado en un biofluido o muestra clínica. Este enfoque de ELISA de tipo sándwich no se restringe al uso de 1.7.2 y 7.16.6, sino a cualquier combinación de anticuerpos anti-MAdCAM que reconozcan diferentes epítopos en MAdCAM, como se describe por los datos e interpretación de la Tabla 7 y Figura 5. Podrían aplicarse estrategias similares al desarrollo de ensayos similares, tales como inmunohistoquímica y transferencia de Western, con los otros anticuerpos anti-MAdCAM descritos, usando diferentes compañeros, variantes, marcadores, etc.
Ejemplo V:
Estructura de aminoácidos de mAb anti-MAdCAM preparados de acuerdo con la invención
En el siguiente análisis, se proporciona información estructural relacionada con los mAb anti-MAdCAM preparados de acuerdo con la invención.
Para analizar las estructuras de mAb producidos de acuerdo con la invención, los inventores clonaron los genes que codifican los fragmentos de cadena pesada y ligera fuera del clon de hibridoma específico. La clonación de genes y la secuenciación se consiguió como sigue:
Se aisló ARNm Poly(A)+ de aproximadamente 2 x 105 células de hibridoma derivadas de ratones XenoMouse inmunizados usando un kit Fast-Track (Invitrogen). La generación de ADNc con cebadores aleatorios se siguió de PCR. Se usaron cebadores específicos de familia V o VH humana (Marks et al., ’Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genese and design of family-specific oligonucleotide probes’; Eur. J. Immunol., 21, 985-991 (1991)) o un cebador VH humano universal, MG-30 (5’-CAG GTG CAG CTG GAG CAG TCI GG-3 (SEC ID Nº: 108)) junto con cebadores específicos para el C2 humano, MG40-d (5’-GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA-3 (SEC ID Nº: 109)) o la región constante de C4, MG-40d (5’GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA CTG T -3 (SEC ID Nº: 110)) o región constante de C (hP2; como se ha descrito previamente en Green et al., 1994). Se obtuvieron secuencias de los transcritos de cadena kappa y pesada derivada de mAb de hibridomas por secuenciación directa de productos de PCR generados a partir de ARN poli (A+) usando los cebadores descritos anteriormente. Los productos de PCR se clonaron en pCR2.1 usando un kit de clonación TOPO-TA (Invitrogen) y se secuenciaron ambas hebras usando kits de secuenciación de terminador de
5 colorante Prism y una máquina de secuenciación ABI 377. Todas las secuencias se analizaron por alineamientos con el ‘directorio de secuencias V BASE’ (Tomlinson, et al, J. Mol. Biol., 227, 776-798 (1992); Hum. Mol. Genet., 3, 853-860 (1994); EMBO J., 14,4628-4638 (1995)).
Además se sometió a cada uno de los anticuerpos, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod, a secuenciación de ADN de
10 longitud completa. Para esto, se aisló ARN total de aproximadamente 3-6 x 106 células de hibridoma usando un kit RNeasy (Qiagen). El ARNm se transcribió de forma inversa usando un sistema de transcriptasa inversa basado en AMV y oligo-dT (Promega). Se usó V BASE para diseñar cebadores de amplificación específicos de 5’, que contenían una secuencia Kozak óptima y un codón de inicio ATG (subrayado) y cebadores inversos 3’ para las cadenas kappa y pesada específicas como se representa en la Tabla 10.
15 Tabla 10: Pares de cebadores de PCR para amplificación de ADNc a partir de hibridomas que expresan mAb anti-MAdCAM y cebadores usados en la construcción de versiones modificadas de anticuerpos anti-MAdCAM.
Oligo secuencia
VH1-18
5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGACTGGACCTGGAGCATCCTT 3' (SEC ID Nº: 70)
VH3-15
5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGATT 3' (SEC ID Nº: 71)
VH3-21
5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTGGGTT 3' (SEC ID Nº: 72)
VH3-23
5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTT 3' (SEC ID Nº: 73)
VH3-30
5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTT 3' (SEC ID Nº: 74)
VH3-33
5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTT 3' (SEC ID Nº: 75)
VH4-4
5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAACACCTGGGTTCTTCCTC 3' (SEC ID Nº: 76)
A2/A3
5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTG 3' (SEC
ID Nº: 77)
A26
5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGTTGCCATCACAACTCATTGGG 3' (SEC ID
Nº: 78)
B3
5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTC 3' (SEC
ID Nº: 79)
012
5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAG 3' (SEC
ID Nº: 80)
018
5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCTCCTCAG 3' (SEC
ID Nº: 81)
InvIgG2 InvIgG4 InvKappa
5' TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG 3' (SEC ID Nº: 82) 5' TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC 3' (SEC ID Nº: 83) 5' TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCAGAGACAGGGAGAG 3' (SEC ID Nº: 84)
6.22.2VK_F1
5'-GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACC CTC ACC ATC AAT AGC CTG GAA GC-3'(SEC ID Nº: 85)
Oligo secuencia
6.22.2VK_R1
5'-GCT TCC AGG CTA TTG ATG GTG AGG GTG AAA TCT GTC CCA GAT CC-3'(SEC ID Nº:
86)
6.22.2VH_F1
5'-GCA GCG TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC-3'(SEC ID Nº: 87)
6.22.2VH R1
5'-GCT ACT GAA GGT GAA TCC AGA CGC TGC-3'(SEC ID Nº: 88)
6.22.2VH_CS*
5'-CGG AGG TGC TTC TAG AGC AGG GCG-3'(SEC ID Nº: 89)
6.34.2VK_F1
5'-GCA AGT CAG AGT ATT AGT AGC TAT TTA AAT TGG TAT CAG CAG AAA CC-
3’ (SEC ID Nº: 90)
6.34.2VK_R1
5'-GGT TTC TGC TGA TAC CAA TTT AAA TAG CTA CTA ATA CTC TGA CTT GC
3’ (SEC ID Nº: 91)
6.34.2VK_F2
5'-CCA TCA GTT CTC TGC AAC CTG AGG ATT TTG CAA CTT ACT ACT GTC ACC-
3’ (SEC ID Nº: 92)
6.34.2VK_R3
5'-GGT GAC AGT AGT AAG TTG CAA AAT CCT CAG GTT GCA GAG AAC TGA TGG
3’ (SEC ID Nº: 93)
6.34.2VH_F16.34
5'-GCA AAT GAA CAG CCT GCG CGC TGA GGA CAC G-3'(SEC ID Nº: 94)
2VH_R1
5'-CGT GTC CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT TTG C-3'(SEC ID Nº: 95)
6.67.1VK_F1
5'-CAA TAA GAA CTA CTT AGC TTG GTA CCA ACA GAA ACC AGG ACA GCC- 3’ (SEC ID Nº: 96)
6.67.1VK_R1
5'-GGC TGT CCT GGT TTC TGT TGG TAC CAA GCT AAG TAG TTC TTA TTG-3 ' (SEC ID Nº: 97)
6.67.1VH_F1
5' -CCC TCA GGG GTC GAG TCA CCA TGT CAG TAG ACA CGT CCA AGA ACC-3' (SEC ID Nº: 98)
6.67.1VH_R1
5'-GGT TCT TGG AC G TGT CTA CTG ACA TGG TGA CTC GAC CCC TGA GGG-3'(SEC ID Nº: 99)
6.67.1VH_CS*
5'-ATT CTA GAG CAG GGC GCC AGG-3'(SEC ID Nº: 100)
6.77.1VK_F1
5'-CCA TCT CCT GCA AGT CTA GTC AGA GCC TCC-3'(SEC ID Nº: 101)
6.77.1VK_R1
5'-GGA GGC TCT GAC TAG ACT TGC AGG AGA TGG-3'(SEC ID Nº: 102)
6.77.1VK_F2
5'-GGT TTA ITA CTG CAT GCA AAG TAT ACA GCT TAT GTC CAG TTT TGG CC –
3’ (SEC ID Nº: 103)
6.77.1VK_R2
5'-GGC CAA AAC TGG ACA TAA GCT GTA TAC TTT GCA TGC AGT AAT AAA CC –
3’ (SEC ID Nº: 104)
7.26.4K_F1
5'-CCT GCA AGT CTA GTC AGA GCC TCC-3'(SEC ID Nº: 105).
7.26.4K_R1
5'-GGA GGC TCT GAC TAG ACT TGC AGG-3'(SEC ID Nº: 106)

Los pares de cebadores se usaron para amplificar los ADNc usando Taq polimerasa de alta afinidad de expansión (Roche) y los productos de PCR se clonaron en pCR2.1 TOPO-TA (Invitrogen) para secuenciación posterior.
48
Después los clones verificados para secuencia de cadena ligera kappa y pesada se clonaron en vectores pEE6.1 y pEE12.1 (LONZA) usando sitios de XbaI/EcoRI y HindIII/EcoRI.
Análisis de Utilización de Genes La Tabla 11 presenta la utilización de gen de cadena ligera kappa y pesada para cada hibridoma descrito en la invención.
Tabla 11: Utilización de Gen de cadena ligera Kappa y pesada
CLON
Cadena Pesada Cadena ligera Kappa
VH
D JH V J
1.7.2 1.8.2 7.16.6 7.20.5 7.26.4
VH3-15 VH3-15 VH1-18 VH4-4 VH1-18 VH3-23 VH3-33 VH3-30 VH4-4 VH3-23 VH3-21 VH3-33 D6-19 D6-19 D6-6 D3-10 D6-6 D5-5 D5-12 D4-23 D3-10 D6-19 D6-19 D3-10 o D3-16 JH4b JH4b JH6b JH6b JH6b JH4b JH6b JH6b JH4b JH6b JH6b JH4b A3 JK5 A3 JK5 A2 JK1 A3 JK4 A2 JK1 O12 JK5 A26 JK4 O12 JK3 B3 JK4 O12 JK2 A2 JK2 O18 JK5
6.14.2
6.22.2
6.34.2
6.67.1
6.73.2
6.77.1
9.8.2
IgG2
IgG4

Análisis de Secuencia
10 Para examinar adicionalmente la estructura de anticuerpo se obtuvieron secuencias de aminoácidos predichas de los anticuerpos a partir de los ADNc obtenidos de los clones.
Los números de identificador de secuencia (SEC ID Nº:) 1-48 y 51-68 proporcionan las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de las cadenas ligera kappa y pesada de los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2 (SEC ID Nº: 1-4), 1.8.2 (SEC ID Nº: -5-8), 6.14.2 (SEC ID Nº: 9-12), 6.22.2 (SEC ID Nº: 13-16), 6.34.2 (SEC ID Nº: 17-20), 6.67.1 (SEC ID 15 Nº: 21-24), 6.73.2 (SEC ID Nº: 25-28), 6.77.1 (SEC ID Nº: 29-32), 7.16.6 (SEC ID Nº: 33-36), 7.20.5 (SEC ID Nº: 3740), 7.26.4 (SEC ID Nº: 41-44), 9.8.2 (SEC ID Nº: 45-48) y los anticuerpos anti-MAdCAM modificados 6.22.2-mod (SEC ID Nº: 51-54), 6.34.2-mod (SEC ID Nº: 55-58), 6.67.1-mod (SEC ID Nº: 59-62) and 6.77.1-mod (SEC ID Nº: 6366) y 7.26.4-mod (SEC ID Nº: 41-42, 67-68). Para cada secuencia de anticuerpo anti-MAdCAM clonada, las secuencias de la secuencia de péptido señal (o las bases que codifican la misma) se indican en minúscula y
20 subrayadas.
Las Figuras 1A-1J proporcionan alineamientos de secuencia entre las secuencias de aminoácidos de cadena pesada predichas de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2 y la secuencia de aminoácidos de los productos génicos de línea germinal respectivos. Las posiciones de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de los anticuerpos están subrayadas, las diferencias entre la secuencia expresada
25 y la secuencia de línea germinal correspondiente se indican en negrita y cuando existen adiciones en la secuencia expresada en comparación con la línea germinal estas se indican como un (-) en la secuencia de línea germinal.
Las Figuras 1K-1T proporcionan alineamientos de secuencia entre las secuencias de aminoácidos de cadena ligera kappa predichas de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2 y la secuencia de aminoácidos de los productos génicos de línea germinal respectivos. Las posiciones de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de los anticuerpos están subrayadas, las diferencias entre la secuencia expresada y la línea germinal correspondiente se indican en negrita y cuando existen adiciones en las secuencias expresada en comparación con la línea germinal estas se indican como un (-) en la secuencia de línea germinal.
Presencia de modificación post-traduccional: glucosilación y desamidación:
El efecto de algunos de los cambios en la secuencia de anticuerpo anti-MAdCAM expresada, en comparación con la secuencia de línea germinal derivada, es introducir restos que potencialmente podrían someterse a glucosilación ligada a N (Asn-X-Ser/Thr) y/o desamidación (Asn-Gly) (véase Tabla 12). Las secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera kappa de los anticuerpos anti-MAdCAM 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 y 9.8.2, (SEC ID Nº: 16, 20, 24, 28, 32, 44 y 48) y el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo 6.14.2 (SEC ID Nº: 10), predicen la presencia de glucosilación ligada a N. La presencia de esta modificación post-traduccional se investigó usando una combinación de SDS-PAGE y tinción de Glucoproteína Emerald 488 Pro-Q (Molecular Probes) con los mAb 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 y 9.8.2.
Brevemente, se cargaron 2 g anticuerpo anti-MAdCAM reducido en un gel de SDS-poliacrilamida 4-12 % usando un tampón MOPS. Después de electroforesis, el gel se fijó en MeOH 50 %, ácido acético 5 % y se lavó en ácido acético 3 %. Cualquier carbohidrato en el gel se oxidó después con ácido peryódico y se tiñó usando un Kit de Tinción de Glucoproteína Emerald 488 Pro-Q (Molecular Probes). Después de una etapa de lavado final se visualizó la tinción de glucoproteína usando un escáner de fluorescencia ajustado a una longitud de onda de 473 nm.
Después de la tinción de glucoproteínas, el gen se tiñó para proteína total usando tinción de gel de proteínas SYPRO Ruby y se analizó usando un escáner de fluorescencia ajustado a una longitud de onda de 473 nm. Las cadenas ligeras kappa de los anticuerpos anti-MAdCAM, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 y 9.8.2, se tiñeron todas positivamente para la presencia de glucosilación. Como una confirmación adicional, se sometió el anticuerpo anti-MAdCAM 7.26.4 a digestión tríptica/quimiotríptica, el análisis de CL-EM/EM confirmó la presencia de un péptido tríptico modificado y proporcionó confirmación adicional de glucosilación de cadena ligera kappa.
Secuencias de Asn-Gly específicas en las regiones CDR1 de anticuerpos anti-MAdCAM, 1.7.2, 1.8.2, 6.22.2 y 7.20.5, hacen a estas regiones sensibles a desamidación. La desamidación a pH neutro introduce una carga negativa y puede conducir también a -isomerización, lo que puede afectar a las propiedades de un anticuerpo. Para anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 y 7.20.5, la presencia de restos de Asn-isoaspartato desamidados se evaluó por espectroscopia de masas después de atrapamiento de la cadena lateral de isoaspartato con MeOH.
En breve, para el anticuerpo anti-MAdCAM 1.7.2, el estado del péptido tríptico/Asp-N SSQSLLQSNGYNYL (SEC ID Nº: 69) (1573,7 Da) se seleccionó para control por CL-EM/EM. El anticuerpo anti-MAdCAM 1.7.2 se redujo en DTT 10 mM, se alquiló en yodacetato Na 5 mM y se intercambió el tampón posteriormente a tampón de digestión de tripsina (Tris-HCl 50 mM, CaCl2 1 mM, pH 7,6). El anticuerpo se mezcló después con tripsina modificada de uso en secuenciación (Promega) en una relación de proteasa:proteína de 1:20. La proteína se digirió en tripsina durante 15 horas a 30 ºC y los péptidos resultantes se separaron por HPLC usando un C-18 RPC en un sistema Ettan LC. El péptido que contenía 33Asn (4032 Da) se recogió de la columna y se diluyó en tampón de digestión de Asp-N (tampón de fosfato sódico 50 mM, pH 8,0). Se añadieron después endoproteinasa Asp-N (Roche) a una relación aproximada de péptido:enzima de 10:1.
Se añadió cloruro de acetilo (100 l) a una muestra de metanol (1 ml, 20 ºC), se calentó la mezcla a temperatura ambiente. La digestión de tríptico+Asp-N se secó en un Speed-Vac y después se añadieron 5 l del metanol/cloruro de acetilo (45 minutos, temperatura ambiente), después se secó de nuevo en un Speed-Vac. El resto resultante se reconstituyó en TFA 0,1 % y se analizaron los péptidos inicialmente en el espectrómetro de masas Voyager-DE STR MALDI-TOF usando el método de preparación de muestras en capa fina de nitrocelulosa o purificación de fase inversa usando C18 ZipTips (Millipore) seguido de mezcla en gotas con matriz -ciano. La mezcla de péptido metilado se analizó también usando CL-EM/EM en un Espectrómetro de Masas de Trampa Iónica Deca XP Plus como anteriormente. La elución se introdujo directamente en la EM de Trampa Iónica y los péptidos se analizaron posteriormente por EM y EM/EM. La EM se ajustó para analizar todos los iones entre 300 y 2000 Da. El ion más fuerte en cualquier exploración particular se sometió después a análisis de EM/EM.

Tabla 12. Modificación post-traduccional de anticuerpos anti-MAdCAM
CLON
Cadena Pesada Cadena ligera kappa
Glucosilación (NXS/T)
Confirmado Glucosilación (NXS/T) Confirmado Desamidación (NG) Confirmado
1.7.2
TFNNSAMT N.D CKSNQLLY SGTNFTLTI ASQNISSYL SSNNKTYLA RASQNITN SCNSSQSL HSDNLSIT EM/PAGE PAGE PAGE PAGE PAGE PAGE PAGE LQSNGYN LQSNGYN HGNGYNY LTINGLEA EM EM EM N.D
1.8.2
7.16.6
7.20.5
7.26.4
6.14.2
6.22.2
6.34.2
6.67.1
6.73.2
6.77.1
9.8.2
IgG2
IgG4

5 La Tabla 12 describe las SEC ID Nº: 135-146 respectivamente en orden de izquierda a derecha, y de arriba abajo.
Estudios de Mutagénesis:
La secuencia de aminoácidos primaria de los anticuerpos anti-MAdCAM ejemplificados en la presente invención pueden modificarse, por mutagénesis dirigida, para retirar sitios potenciales de modificación post-traduccionales (por ejemplo, glucosilación, desamidación) o para alterar el fondo de isotipo o para obtener por ingeniería genética otros 10 cambios que puedan mejorar la utilidad terapéutica. Como ejemplo, se usó PCR para obtener por ingeniería genética cambios en los anticuerpos anti-MAdCAM 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 y 7.26.4, para revertir ciertas secuencias flanqueantes a la línea germinal, para retirar sitios de glucosilación potenciales y/o para cambiar el fondo de isotipo a IgG2 humano. ADNc clonados en pCR2.1 TOPO-TA (100 ng), correspondientes a las SEC ID Nº: 13, 17, 21 y 29 de nucleótidos de cadena pesada y SEC ID Nº: 15, 19, 23, 31 y 43 de nucleótidos de cadena ligera kappa se
15 usaron como un molde en una serie de PCR usando extensión de solapamiento y un panel de conjuntos de cebadores descritos en la Tabla 10.
Cadena pesada de 6.22.2: Se usaron conjuntos de cebadores de PCR 6.22.2_VH_F1 y 6.22.2VHCS* (1) y VH3-33 y 6.22.2_VH_R1 (2) para generar productos de PCR separados (1) y (2), usando una Taq polimerasa de Expansión y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 13. Los 20 productos (1) y (2) se purificaron y combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno) junto con los cebadores VH3-33 y VK6.22.2_CS*, para generar el dominio V de cadena pesada de 6.22.2 modificado. Esta versión modificada contiene una mutación His/Phe en FR1 e introduce un sitio de restricción XbaI para permitir la clonación en fase en un vector derivado de pEE6.1, denominado pEE6.1CH, que contiene el dominio constante IgG2 humano correspondiente. El fragmento de PCR final se clonó en el sitio de XbaI de pEE6.1CH, se
25 comprobó con respecto a orientación y se verificó la secuencia completa insertada. La secuencia de nucleótidos para la cadena pesada de 6.22.2 modificada se encuentra en SEC ID Nº: 51 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEC ID Nº: 52. Se indican los cambios en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos en comparación con la parental.
Cadena ligera kappa de 6.22.2: Se usaron los conjuntos de cebadores de PCR 6.22.2_VK_F1 e invKappa (1), y A26 y 6.22.2_VK_R1 (2) para generar productos de PCR separados (1) y (2), usando una Taq polimerasa de expansión y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 15. Los productos (1) y (2) se purificaron y combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno) junto con cebadores A26 e invKappa, para generar el dominio V de cadena ligera kappa de 6.22.2 modificado. Esta versión modificada contiene cambios Asn/Asp y Gly/Ser a la secuencia FR3. El producto de PCR resultante se clonó en pEE12.1 usando sitios HindIII/EcoRI y se verificó la secuencia completamente. La secuencia de nucleótidos para la cadena ligera kappa de 6.22.2 modificada se encuentra en SEC ID Nº: 53 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEC ID Nº: 54. Los cambios en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos en comparación con la parental se indican.
Cadena pesada de 6.34.2: Se usaron los conjuntos de cebadores de PCR 6.34.2_VH_F1 y 6.22.2VH_CD* (1) y VH3-30 y 6.34.2_VH_R1 (2) para generar productos de PCR separados (1) y (2), usando una Taq polimerasa de Expansión y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 17. Se purificaron los productos (1) y (2) y se combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno) junto con los cebadores VH3-30 y VK6.22.2_CS*, para generar el dominio V de cadena pesada de 6.34.2 modificado. Esta versión modificada contiene una mutación de Ser/Arg en FR3 e introduce un sitio de restricción de XbaI para permitir la clonación en fase en un vector derivado de pEE6.1, denominado pEE6.1 CH, que contiene el dominio constante de IgG2 humano correspondiente. El fragmento de PCR final se clonó en el sitio XbaI de pEE6.1CH, se comprobó con respecto a orientación y se verificó la secuencia completa del inserto. La secuencia de nucleótidos para la cadena pesada de 6.34.2 modificada se encuentra en SEC ID Nº: 55 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEC ID Nº: 56. Se indican los cambios en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos en comparación con la parental.
Cadena ligera kappa de 6.34.2: Se usaron los conjuntos de cebadores de PCR O12 y 6.34.2_VK_R1 (1), 6.34.2_VK_F1 y 6.34.2_VK_R2 (2), así como 6.34.2_VK_F2 e invKappa (3) para generar los productos de PCR (1),
(2) y (3), usando una Taq polimerasa de Expansión y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 19. Los productos (1), (2) y (3) se purificaron y (1) y (2) se combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno), junto con los cebadores 012 y 6.34.2_VK_R2, para generar el producto de PCR (4). Los productos de PCR (2) y (3) se combinaron en una cuarta etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno), junto con 6.34.2_VK_F1 e invKappa, para generar el producto de PCR (5). Los productos de PCR (4) y (5) se purificaron y se combinaron juntos (aproximadamente 50 ng cada uno) con los cebadores O12 e invKappa para generar el dominio V de cadena ligera kappa de 6.34.2 modificado. Esta versión modificada contiene un cambio Asn/Ser en CDR1, un cambio Phe/Tyr en FR2 y cambios Arg-Thr/Ser-Ser, Asp/Glu y Ser/Tyr a la secuencia FR3. El producto de PCR resultante se clonó en pEE12.1 usando sitios HindIII/EcoR1 y se verificó la secuencia completamente. La secuencia de nucleótidos para la cadena ligera kappa de
6.34.2 modificada se encuentra en SEC ID Nº: 57 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEC ID Nº: 58. Se indican los cambios en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos en comparación con la parental.
Cadena pesada de 6.67.1: Se usaron los conjuntos de cebadores de PCR 6.67.1_VH_F1 y 6.67.1 VH_CS* (1) y VH4-4 y 6.67.1_VH_R1 (2) para generar productos de PCR separados (1) y (2), usando una Taq polimerasa de Expansión y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 21. Los productos (1) y (2) se purificaron y se combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng de cada uno) junto con los cebadores VH4-4 y VK6.67.1_CS*, para generar el dominio V de cadena pesada de
6.67.1 modificado. Esta versión modificada contiene una conversión de Ile-Leu-Ala/Met-Ser-Val en FR3 e introduce un sitio de restricción XbaI para permitir la clonación en fase en un vector derivado de pEE6.1 denominado pEE6.1 CH, que contiene el dominio constante de IgG2 humano correspondiente. El fragmento de PCR final se clonó en el sitio de XbaI de pEE6.1CH, se comprobó con respecto a orientación y se verificó la secuencia completa del inserto. La secuencia de nucleótidos para la cadena pesada de 6.67.1 modificada se encuentra en SEC ID Nº: 59 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEC ID Nº: 60. Se indican los cambios en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos en comparación con la parental.
Cadena ligera kappa de 6.67.1: Se usaron conjuntos de cebadores de PCR 6.67.1_VK_F1 e invKappa (1) y B3 and 6.67.1_VK_R1 (2) para generar productos de PCR separados (1) y (2), usando una Taq polimerasa de Expansión y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 23. Los productos (1) y (2) se purificaron y combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno) junto con cebadores B3 e invKappa, para generar el dominio V de cadena ligera kappa de 6.67.1. Esta versión modificada contiene un cambio de Thr/Asn en CDR1 y un cambio de Arg/Gly en FR2. El producto de PCR resultante se clonó en pBE12.1 usando sitios HindIII/EcoR1 y se verificó la secuencia completamente. La secuencia de nucleótidos para la cadena ligera kappa de 6.67.1 modificada se encuentra en SEC ID Nº: 61 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEC ID Nº: 62. Se indican los cambios en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos en comparación con el parental.
Cadena pesada de 6.77.1: Se usaron los conjuntos de cebadores de PCR VH 3-21 and 6.22.2VH_CS* para generar un producto de PCR sencillo usando una Taq polimerasa de Expansión y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 29. Los productos de PCR se digirieron con XbaI, se purificaron en gel y se clonaron en el sitio de XbaI de pEE6.1CH, comprobando la orientación. Se verificó completamente la secuencia del inserto. La secuencia de nucleótidos para la cadena pesada de 6.77.1 modificada se encuentra en SEC ID Nº: 63 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEC ID Nº: 64. Se indican los cambios en las secuencias de aminoácidos y nucleótidos en comparación con la parental.
Cadena ligera kappa de 6.77.1: Se usaron los conjuntos de cebadores de PCR A2 y 6.77.1_VK_R1 (1), 6.77.1_VK_VK_F1 y 6.77.1_R2 (2), así como 6.77.1_VK_F2 e invKappa (3) para generar productos de PCR separados (1), (2) y (3), usando una Taq polimerasa de Expansión y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 31. Los productos (1), (2) y (3) se purificaron y (1) y (2) se combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng de cada uno) junto con los cebadores A2 y 6.77.1_VK_R2, para generar el producto de PCR (4). Los productos de PCR (2) y (3) se combinaron en una cuarta etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno) junto con los cebadores 6.77.1_VK_F1 e invKappa, para generar el producto de PCR 5. Los productos de PCR (4) y (5) se purificaron y combinaron juntos (aproximadamente 50 ng cada uno) con los cebadores A2 y JK2 para generar el dominio V de cadena ligera kappa de 6.77.1 modificado. Esta versión modificada contiene un cambio de Asn/Lys en CDR1, un cambio de Ser/Tyr en FR3 y un cambio de restos Cys/Ser en la secuencia de CDR3. El producto de PCR resultante se clonó en pEE12.1 usando sitios HindIII/EcoR1 y se verificó la secuencia completamente. La secuencia de nucleótidos para la cadena ligera kappa de 6.77.1 modificada se encuentra en SEC ID Nº: 65 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEC ID Nº: 66. Se indican los cambios en la secuencias de nucleótidos y aminoácidos en comparación con la parental.
Cadena ligera kappa de 7.26.4: se usaron los conjuntos de cebadores de PCR 7.26.4_VK_F1 e invKappa (1), y A2 y 7.26.4_VK_R1 (2) para generar productos de PCR separados (1) y (2), usando una Taq polimerasa de Expansión y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 43. Los productos (1) y (2) se purificaron y combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno) junto con los cebadores A2 e invKappa, para generar el dominio V de cadena ligera kappa de 7.26.4 modificado. Esta versión modificada contiene un cambio de Asn/Ser en CDR1. El producto de PCR resultante se clonó en pEE12.1 usando sitios HindIII/ECoR1 y se verificó la secuencia completamente. La secuencia de nucleótidos para la cadena ligera kappa de 7.26.4 modificada se encuentra en SEC ID Nº: 67 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEC ID Nº: 68. Se indican los cambios en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos en comparación con la parental.
Se ensambló un vector de expresión eucariota funcional para cada una de las versiones modificadas de 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 y 7.26.4, denominadas 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod, y que representan respectivamente las secuencias de nucleótidos de cadena pesada SEC ID Nº: 51, 55, 59, 63 y 41 y las secuencias de aminoácidos correspondientes SEC ID Nº: 52, 56, 60, 64 y 42 así como las secuencias de nucleótidos de cadena ligera kappa SEC ID Nº: 53, 57, 61, 65 y 67 y las secuencias de aminoácidos correspondientes SEC ID Nº: 54, 58, 62, 66 y 68 como sigue: los insertos de ADNc de cadena pesada que corresponden a 6.22.2-mod, 6.34.2mod, 6.67.1-mod y 6.77.1-mod se escindieron del vector pEE6.1 CH con NotI/SalI, la versión parental de las cadenas pesadas de 7.26.4 se escindió del vector pEE6.1 con NotI/SalI y los fragmentos purificados se clonaron en sitios idénticos en el vector pEE12.1 correspondiente que contenía las versiones modificadas de las secuencias de cadena ligera kappa 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod. Las secuencias de los vectores se confirmaron y se usaron cantidades purificadas en transfecciones transitorias con células HEK 293T. Brevemente, 9 x 106 células HEK 293T, sembradas en un matraz T165 el día antes de la transfección y lavadas en Optimem, se transfectaron transitoriamente con ADNc del vector correspondientes a 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1mod y 7.26.4-mod (40 g) usando Lipofectamine PLUS (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se incubaron durante 3 horas, después el medio de transfección se reemplazó con medio DMEM (Invitrogen 21969-035) que contenía suero de ternero fetal de IgG ultrabajo 10 % (Invitrogen 16250-078) y L-Glutamina (50 ml). El sobrenadante del medio se recogió 5 días después, se esterilizó por filtro y el anticuerpo anti-MAdCAM se purificó usando cromatografía de afinidad en sepharose de proteína G, de una manera similar a la descrita anteriormente. La cantidad de anticuerpo recuperado (20-100 g) se cuantificó por un ensayo de Bradford.
La actividad anti-MAdCAM del anticuerpo purificado por afinidad correspondiente a 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod se evaluó en el ensayo de fusión de MAdCAM-IgG1 Fc como se ha descrito previamente. Los valores de CI50 de estos anticuerpos anti-MAdCAM en comparación con los anticuerpos anti-MAdCAM parentales de los que derivaban se presentan en la Tabla 13. Existe un efecto mínimo de las sustituciones de aminoácidos descritas anteriormente sobre la actividad de los anticuerpos anti-MAdCAM modificados en comparación con sus parentales. Los anticuerpos también mantuvieron su unión a células CHO que expresaban MAdCAM humana recombinante o la quimera de MAdCAM de cynomolgus/ser humano.
Tabla 13. Actividad de versiones modificadas de anticuerpos anti-MAdCAM, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod en comparación con sus parentales.
CLON
CI50 Media del Ensayo de fusión de MAdCAM IgG1 Fc (mg/ml)
Parental
Modificado
6.22.2 6.34.2 6.67.1 6.77.1 7.26.4
0,018 0,013 0,013 0,022 0,021 0,058 0,049 0,037 0,077 0,033

5 Ejemplo VI
Aumento en linfocitos 7+ en la circulación periférica por bloqueo de anticuerpos anti-MAdCAM
Se desarrolló un ensayo para identificar y correlacionar un efecto de mecanismo de un anticuerpo anti-MAdCAM y su nivel en circulación en sangre. Un anticuerpo inhibidor anti-MAdCAM debería tener el efecto de inhibir el reclutamiento de leucocitos que expresan la interina 47 en el tracto gastrointestinal. Las clases de leucocitos que
10 portan integrina 47 deberían, por lo tanto, restringirse a la circulación periférica.
Esto se demostró con un mAb anti-MAdCAM humana completamente humano 7.16.6 en cynomolgus.
Se evaluaron mAb anti-MAdCAM humana purificado 7.16.6 (1 mg/kg) o vehículo (NaAcetato 20 mM, polisorbato 80, 0,2 mg/ml, manitol 45 mg/ml y EDTA 0,02 mg/ml a pH 5,5) de una manera similar por administración intravenosa a través de la vena safena a dos grupos de monos cynomolgus (n=4/grupo). El día 3 después de la dosificación se
15 recogieron muestras de sangre en tubos de EDTA por venipuntura femoral. Los anticuerpos específicos para LPAM, que reaccionan de forma cruzada con la integrina 47 de cynomolgus, no están disponibles en el mercado, de modo que se usó un anticuerpo anti-7 (que reconoce integrina 47 y E7) en su lugar. Se añadieron anticuerpos (30 l), de acuerdo con la siguiente tabla, tabla 15, a tubos que contenían 100 l de sangre de cynomolgus, se mezclaron por agitación en vórtex suave y se incubaron durante 20-30 minutos a 4 ºC.
20 Tabla 15. Anticuerpos (BD Pharmingen) usados en inmunofenotipación de sangre de cynomolgus
Número de Catálogo
Anticuerpo o Isotipo
555748
mIgG1, k-FITC
555844
mIgG2a, k-PE
559425
mIgG1 - PerCP
555751
mIgG1, k-APC
555728
CD 28-FITC
555945
7-PE
558814
CD 95-APC
550631
CD 4-PerCP

A cada tubo, se añadió 1 ml de solución FACSlyse 1:10 (BD nº 349202), se mezcló por vórtex suave y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 12 minutos en oscuridad hasta que se completó la lisis de glóbulos rojos. Después se añadieron 2 ml de tampón de tinción BD (nº 554656) a cada tubo, se mezclaron y centrifugaron a 25 250 x g durante 6-7 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se decantó y el sedimento se resuspendió en 3 ml de tampón de tinción, se mezcló de nuevo y se centrifugó a 250 x g durante 6-7 minutos a temperatura ambiente. Se añadió tampón Cytofix (BD nº 554655) que contenía paraformaldehído p/v (100 l) a los sedimentos celulares de sangre periférica de mono y se mezclaron exhaustivamente por velocidad baja/moderada del agitador vorticial. Las muestras se mantuvieron a 4 ºC en la oscuridad hasta que se adquirieron en el FACSCalibur. Justo antes de la adquisición, se añadió PBS (100 l) a todos los tubos inmediatamente antes de la adquisición. Los 5 números de células absolutos de CD4+7+CD95loCD28+ (vírgenes), CD4+7+CD95hiCD28+ (memoria central), CD4+7-CD95hiCD28+ (memoria central), CD4+7+CD95hiCD28 (memoria efectora) se adquirieron por selección apropiada y análisis de cuadrantes. Otros subconjuntos de linfocitos T, por ejemplo, linfocito T CD8+ de memoria central (7+CD8+CD28+CD95+) y cualquier otro leucocito que porte un ligando MAdCAM, también pueden analizarse por este método con los anticuerpos apropiados. En comparación con el control de vehículo, mAb anti-MAdCAM
10 7.16.6 provocó un aumento de aproximadamente 3 veces en los niveles de linfocitos T de memoria central CD4+7+CD95hiCD28+ en circulación, como se muestra en la Figura 7. No hubo efectos sobre la población de linfocitos T de memoria central CD4+7-CD95ChiCD28+ en circulación, lo que indica que el efecto del mAb anti-MAdCAM 7.16.6 es específico para linfocitos T que se dirigen al intestino. Los efectos de mAb anti-MAdCAM 7.16.6, en cynomolgus, en poblaciones de linfocitos (4)7+ en circulación indican que esta es una prueba sustituta sólida de
15 biomarcador del mecanismo, particularmente en el contexto de aplicación práctica en una situación clínica.
Secuencias
SEC ID Nº: 1-48 y 51-68 proporcionan secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas pesada y ligera kappa para doce anticuerpos anti-MAdCAM humanos, secuencias de nucleótidos y aminoácidos de secuencias de dominio de unión a 47 de MAdCAM de cynomolgus y secuencias de nucleótidos y aminoácidos de cinco
20 anticuerpos anti-MAdCAM humanos modificados.
SEC ID Nº: 1-48 proporcionan las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de cadena ligera kappa y pesada de doce anticuerpos anti-MAdCAM monoclonales humanos: 1.7.2 (SEC ID Nº: 1-4), 1.8.2 (SEC ID Nº: 5-8), 6.14.2 (SEC ID Nº: 9-12), 6.22.2 (SEC ID Nº: 13-16), 6.34.2 (SEC ID Nº: 17-20), 6.67.1 (SEC ID Nº: 21-24), 6.73.2 (SEC ID Nº: 25-28), 6.77.1 (SEC ID Nº: 29-32), 7.16.6 (SEC ID Nº: 33-36), 7.20.5 (SEC ID Nº: 37-40), 7.26.4 (SEC ID Nº: 41-44)
25 y 9.8.2 (SEC ID Nº: 45-48).
SEC ID Nº: 49-50 proporcionan la secuencias de nucleótidos y aminoácidos de un dominio de unión a 47 de MAdCAM de cynomolgus.
SEC ID Nº: 51-68 proporcionan las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de cadena ligera kappa y pesada para los anticuerpos anti-MAdCAM monoclonales modificados: 6.22.2 (SEC ID Nº: 51-54), 6.34.2 modificado (SEC ID Nº:
30 55-58), 6.67.1 modificado (SEC ID Nº: 59-62), 6.77.1 modificado (SEC ID Nº: 63-66) y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de cadena ligera kappa de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal modificado: 7.26.4 modificado (SEC ID Nº: 67-68).
SEC ID Nº: 70-106 y 108-110 proporcionan diversas secuencias de cebadores.
Clave:
35 Secuencia señal: minúsculas subrayado
Cambios de aminoácidos en secuencia de anticuerpos anti-MAdCAM modificados en comparación con parentales: mayúsculas subrayado
SEC ID Nº 1
Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 1.7.2 imagen1
SEC ID Nº 2 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 1.7.2 imagen1
SEC ID Nº 3 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 1.7.2 imagen1
SEC ID Nº 4
Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 1.7.2 imagen1
SEC ID Nº 5 Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 1.8.2 imagen1
SEC ID Nº 6 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 1.8.2 imagen1
10 SEC ID Nº 7 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 1.8.2 imagen1
SEC ID Nº 8 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 1.8.2 imagen1
SEC ID Nº 9 Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 6.14.2 imagen1
SEC ID Nº 10 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 6.14.2 imagen1
SEC ID Nº 11 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 6.14.2 imagen1
SEC ID Nº 12 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 6.14.2 imagen1
SEC ID Nº 13 Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 6.22.2 imagen1
SEC ID Nº 14 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 6.22.2 imagen1
SEC ID Nº 15 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 6.22.2 imagen1
SEC ID Nº 16
Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 6.22.2 imagen1
SEC ID Nº 17 Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 6.34.2 imagen1
SEC ID Nº 18 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 6.34.2 imagen1
10 SEC ID Nº 19 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 6.34.2 imagen1
SEC ID Nº 20 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 6.34.2 imagen1
SEC ID Nº 21 Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 6.67.1 imagen1
SEC ID Nº 22 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 6.67.1 imagen1
SEC ID Nº 23 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 6.67.1 imagen1
SEC ID Nº 24 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 6.67.1 imagen1
SEC ID Nº 25 Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 6.73.2 imagen1
SEC ID Nº 26 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 6.73.2 imagen1
SEC ID Nº 27 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 6.73.2 imagen1
SEC ID Nº 28
Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 6.73.2 imagen1
SEC ID Nº 29 Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 6.77.1 imagen1
SEC ID Nº 30 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 6.77.1 imagen1
10 SEC ID Nº 31 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 6.77.1 imagen1
SEC ID Nº 32 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 6.77.1 imagen1
SEC ID Nº 33 Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 7.16.6 imagen1
SEC ID Nº 34 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 7.16.6 imagen1
SEC ID Nº 35 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 7.16.6 imagen1
SEC ID Nº 36 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa 7.16.6 imagen1
SEC ID Nº 37 Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 7.20.5 imagen1
SEC ID Nº 38 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 7.20.5 imagen1
SEC ID Nº 39 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 7.20.5 imagen1
SEC ID Nº 40 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 7.20.5 imagen1
SEC ID Nº 41 Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 7.26.4 imagen1
SEC ID Nº 42 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 7.26.4 imagen1
10 SEC ID Nº 43 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 7.26.4 imagen1
SEC ID Nº 44 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 7.26.4 imagen1
SEC ID Nº 45 Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 9.8.2 imagen1
SEC ID Nº 46 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 9.8.2 imagen1
SEC ID Nº 47 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 9.8.2 imagen1
SEC ID Nº 48 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 9.8.2 imagen1
SEC ID Nº 49 Secuencia de Nucleótidos de cadena de unión a 47 de MAdCAM de cynomolgus imagen2
SEC ID Nº 50 Secuencia de aminoácidos de dominio de unión a 47 de MAdCAM de cynomolgus SEC ID Nº 51 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Pesada de 6.22.2 Modificada imagen1 imagen1
SEC ID Nº 52 Secuencia de Aminoácidos de Cadena Pesada de 6.22.2 Modificada imagen1
SEC ID Nº 53 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 6.22.2 Modificada SEC ID Nº 54 Secuencia de Aminoácidos de Cadena Ligera kappa de 6.22.2 Modificada imagen1 imagen1
SEC ID Nº 55 Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 6.34.2 Modificada imagen1
SEC ID Nº 56 Secuencia de Aminoácidos de Cadena Pesada de 6.34.2 Modificada SEC ID Nº 57 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 6.34.2 Modificada imagen1 imagen1
SEC ID Nº 58 Secuencia de Aminoácidos de Cadena Ligera Kappa de 6.34.2 Modificada imagen1
SEC ID Nº 59 Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 6.67.1 Modificada SEC ID Nº 60 Secuencia de Aminoácidos de Cadena Pesada de 6.67.1 Modificada imagen1 imagen1
SEC ID Nº 61 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 6.67.1 Modificada SEC ID Nº 62 imagen1
Secuencia de Aminoácidos de Cadena Ligera Kappa de 6.67.1 Modificada imagen1
SEC ID Nº 63 Secuencia de Nucleótidos de la Cadena Pesada de 6.67.1 Modificada imagen1
SEC ID Nº 64 Secuencia Proteica de Cadena Pesada de 6.67.1 Modificada imagen1
10 SEC ID Nº 65 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 6.67.1 Modificada SEC ID Nº 66 Secuencia de Aminoácidos de Cadena Ligera Kappa 6.67.1 Modificada imagen1 imagen1
SEC ID Nº 67 Secuencia de Nucleótidos de Cadena Ligera Kappa de 7.26.4 Modificada imagen1
SEC ID Nº 68 Secuencia de Aminoácidos de Cadena Ligera Kappa de 7.26.4 Modificada imagen2
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> PFIZER INC. ABGENIX, INC. PFIZER LIMITED
5 <120> ANTICUERPOS PARA MAdCAM
<130> ABX-PF6 PCT
<140> PCT/US05/000370
<141> 07-01-2005
<150> 60/535.490 10 <151> 09-01-2004
<160> 147
<170> PatentIn ver. 33
<210> 1
<211> 1392 15 <212> ADN
<213> Homosapiens
<400> 1 imagen1
<210> 2
<211> 463
<212> PRT
<213> Homosapiens
<400> 2 imagen1 imagen1
<210> 3
<211> 720
<212> ADN
<213> Homosapiens
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<210> 4
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<212> PRT
<213> Homosapiens
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<211> 1392
<212> ADN
<213> Homosapiens
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<211> 463
<212> PRT
<213> Homosapiens
<400> 6 imagen1 imagen1
<210> 7
<211> 720
<212> ADN
<213> Homosapiens
<400> 7 imagen1
<210> 8
<211> 238
<212> PRT
<213> Homosapiens
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<212> ADN
<213> Homosapiens
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<212> PRT
<213> Homosapiens
<400> 10 imagen1 imagen1
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<211> 711
<212> ADN
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<213> Homosapiens
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<400> 16 imagen1
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<223> Descripción de secuencia artificial: péptido enlazador sintético
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Claims (43)

  1. REIVINDICACIONES
    1.Una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal humano que se une específicamente a la molécula de adhesión de Célula Mucosa Adresina (MAdCAM), en la que el hibridoma es el hibridoma Nº de Acceso de ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2).
  2. 2.Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a MAdCAM e inhibe la unión de MAdCAM humana a 4,7, en el que la cadena pesada del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y en el que la cadena ligera del anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, del anticuerpo monoclonal producido por hibridoma Nº de Acceso de ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2).
  3. 3.El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 2, comprendiendo el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal producido por hibridoma Nº de Acceso de ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2).
  4. 4.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 3, siendo el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo el anticuerpo monoclonal humano producido por el hibridoma Nº de Acceso de ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2) o una parte de unión a antígeno del mismo.
  5. 5.El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 4, en el que se escinde la lisina C-terminal de la cadena pesada.
  6. 6.Un anticuerpo monoclonal o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MAdCAM e inhibe la unión de MAdCAM humana con 47, en el que la cadena pesada del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 en SEC ID Nº: 2 y la cadena ligera del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 en SEC ID Nº: 4.
  7. 7.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 6, comprendiendo el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo las secuencias de aminoácidos expuestas en SEC ID Nº: 2 y 4 sin las secuencias señal.
  8. 8.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 2 ó 6, comprendiendo el anticuerpo o parte una cadena pesada que utiliza un gen VH 3-15 humano.
  9. 9.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 2 ó 6, comprendiendo el anticuerpo o parte una cadena ligera que utiliza un gen VK A3 humano.
  10. 10.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 2, comprendiendo dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo una o más de las secuencias de aminoácidos FR1, FR2, FR3 y FR4 del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma Nº de Acceso de ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2).
  11. 11.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 6, comprendiendo dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo una o más de las secuencias de aminoácidos FR1, FR2, FR3 y FR4 en SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4.
  12. 12.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la cadena pesada y la cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos desde el comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 de la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma Nº de Acceso de ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2).
  13. 13.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos desde el comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 en SEC ID Nº: 2 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos desde el comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 en SEC ID Nº: 4.
  14. 14.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 2, en el que los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprenden las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma Nº de Acceso de ECACC 03090901 (designación interna 1.7.2).
  15. 15.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la cadena pesada del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada en SEC ID Nº: 2 y la cadena ligera del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera en SEC ID Nº: 4.
  16. 16.El anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2, 6 u 8 a 15 que es una molécula de inmunoglobulina G (IgG), una IgM, una IgE, una IgA o una IgD o un anticuerpo biespecífico.
  17. 17.La parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 ó 6 a 15 que es un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv o un anticuerpo de cadena sencilla.
  18. 18.Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  19. 19.La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 18 que comprende adicionalmente uno o más agentes antiinflamatorios o inmunomoduladores adicionales.
  20. 20.La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19, en la que el o los agentes antiinflamatorios o inmunomoduladores adicionales se seleccionan del grupo que consiste en: corticosteroides, aminosalicilatos, azatioprina, metotrexato, ciclosporina, FK506, IL-10, GM-CSF, rapamicina, agentes anti-TNF y antagonistas de molécula de adhesión.
  21. 21.Una vacuna que comprende el anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  22. 22.La vacuna de acuerdo con la reivindicación 21, siendo la vacuna mucosa.
  23. 23.Un kit de diagnóstico que comprende el anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17.
  24. 24.Una línea celular aislada que produce el anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17.
  25. 25.La línea celular de acuerdo con la reivindicación 24 que produce el anticuerpo de la reivindicación 3 ó 7.
  26. 26.Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16.
  27. 27.Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 26.
  28. 28.Un vector de acuerdo con la reivindicación 27, comprendiendo el vector una secuencia de control de la expresión unida operativamente a la molécula de ácido nucleico.
  29. 29.Una célula hospedadora que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 27 o la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 26.
  30. 30.Una célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada y una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo monoclonal o una parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16.
  31. 31.Un método para producir un anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MAdCAM, que comprende cultivar la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 29 ó 30
    o la línea celular de acuerdo con la reivindicación 1 ó 24 en condiciones adecuadas y recuperar el anticuerpo o parte de unión a antígeno.
  32. 32.Un animal transgénico no humano o planta transgénica que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada y una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, en el que se expresan los polipéptidos de cadena pesada y cadena ligera codificados por las moléculas de ácido nucleico.
  33. 33.Un método para aislar un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MAdCAM, que comprende la etapa de aislar el anticuerpo del animal transgénico no humano o planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 32.
  34. 34.Un anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17, inhibiendo el anticuerpo o parte la unión de MAdCAM a 47, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesite.
  35. 35.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de la reivindicación 34, en el que la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal.
  36. 36.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de la reivindicación 35, en el que la enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad diverticular, gastritis, enfermedad del hígado, esclerosis biliar primaria y colangitis esclerosante.
  37. 37.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de la reivindicación 35, en el que la enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal es enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa.
  38. 38.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de la reivindicación 34, en el que la enfermedad 5 inflamatoria es diabetes insulinodependiente o enfermedad de injerto contra hospedador.
  39. 39.Un anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17, estando el anticuerpo o parte marcado de forma detectable, para su uso en la detección de inflamación en un sujeto.
  40. 40.Un anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a
    10 17 para su uso en la determinación de si existe un aumento en el nivel de leucocitos que expresan 47 en circulación y detectando de este modo el efecto de la administración de un anticuerpo inhibidor anti-MAdCAM o parte de unión a antígeno del mismo a un sujeto.
  41. 41.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 40, en el que los leucocitos son linfocitos.
    15 42.El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 40, en el que el aumento en el nivel de leucocitos que expresan 47 en circulación se determina por análisis de FACS.
  42. 43.Un anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17 para su uso como un medicamento.
  43. 44.Un método para diagnosticar un trastorno caracterizado por MAdCAM humana soluble en circulación, que
    20 comprende las etapas de: (1) poner en contacto una muestra biológica con el anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17 y (2) detectar la unión del anticuerpo
    o parte a MAdCAM.
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