ES2363023T3

ES2363023T3 - Mimeticuerpos de unión a receptor de melanocortina, composiciones, procedimientos y usos.

Info

Publication number: ES2363023T3
Application number: ES05819741T
Authority: ES
Inventors: Mark Cunningham; Vedrana Stojanovic-Susulic; Karyn O'neil; Chichi Huang; Jeffrey Luo
Original assignee: Centocor Ortho Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2004-10-25
Filing date: 2005-10-25
Publication date: 2011-07-19
Anticipated expiration: 2025-10-25
Also published as: TNSN07157A1; ZA200704260B; PL1812046T3; DK1812046T3; ME01234B; JP2008517605A; IL182683A0; BRPI0518411A2; PT1812046E; CA2585287A1; CN101437540A; WO2006047535A3; CN101437540B; US20060105951A1; AU2005299440A1; SI1812046T1; HK1106445A1; CY1111486T1; EP1812046B1; AU2005299440B2

Abstract

Un polipéptido de acuerdo con fórmula (I): (Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3) (t) (I) en la que Mp es una molécula de unión a receptor de melanocortina, Lk es engarce químico o polipeptídico, V2 es una parte de un extremo C terminal de una región variable de inmunoglobulina, Hg es al menos una parte de una región bisagra variable de inmunoglobulina, CH2 es una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina y CH3 es una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina y t es independientemente un número entero de 1 a 10.

Description

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a mimeticuerpos de unión a receptor de melanocortina, polinucleótidos que los codifican, células que comprenden los polinucleótidos o que expresan los mimeticuerpos y procedimientos para preparar y usar los anteriores.

Antecedentes de la Invención

La obesidad es una enfermedad crónica manifestada por un exceso de masa grasa en proporción al tamañocorporal. En la actualidad, uno de cada tres americanos se considera con sobrepeso (Índice de Masa Corporal (BMI) >25 kg/m2), instando por ello a los Centros de Estados Unidos para Control y Prevención de Enfermedades (CDC) a declarar que la obesidad está alcanzando proporciones epidémicas (Cummings y Schwartz, Annu. Rev. Med. 54: 453-471((2003)). La importancia de tratar la obesidad se enfatiza por el hecho de que esta enfermedad es la causa subyacente o un factor de riesgo, para el desarrollo de enfermedades tales como Diabetes Tipo 2, insuficiencia cardiaca congestiva, osteartritis y apnea del sueño entre otros.

Adicionalmente, la obesidad está ligada a “Síndrome Metabólico” que es una afección médica caracterizada por obesidad, dislipidemia aterogénica, presión sanguínea elevada y resistencia a insulina. El Síndrome Metabólico afecta a un número creciente de personas en los Estados Unidos. De forma importante, se ha mostrado que incluso una disminución modesta en el peso corporal (5-10% del peso corporal inicial) puede mejorar significativamente las afecciones de Síndrome Metabólico y disminuir los factores de riesgo para desarrollar enfermedad asociada a obesidad (Wing y col., Arch. Intern. Med. 147: 1749-1753 (1987); Tuomilehto y col., New Engl. J. Med. 344: 13431350 (2001); Knowler y col., New Engl. J Med. 346: 393-403 (2002); Franz y col., Diabetes Care 25: 148-198 (2002)). Adicionalmente, el tratamiento de la obesidad puede ser importante desde una perspectiva de salud mental debido al estigma social que con frecuencia está unido a individuos obesos en algunas culturas.

Los receptores de melanocortina desempeñan un papel principal en la regulación del equilibrio energético global y la obesidad en humanos y roedores. La hormona estimuladora de alfa melanocitos (alfa-MSH) es una hormona peptídica de 13 aminoácidos que es un componente importante del sistema de melanocortina. Alfa-MSH se produce por el procesamiento proteolítico de propiomelanocortina (POMC) liberada por la glándula hipófisis. Alfa-MSH se une con alta afinidad al receptor de melanocortina 4 (MC4R), pero también se une al receptor de melanocortina 3 (MC3R) y receptor de melanocortina 5 (MC5R) con menor afinidad. MC4R es un receptor de proteína acoplado a G hallado en el cerebro que, cuando se estimula por unión con alfa-MSH, causa una disminución de la ingesta de comida y aumento de la oxidación de grasas. En última instancia, la estimulación de los receptores de melanocortina tales como MC4R da como resultado pérdida de peso.

En humanos y roedores, las mutaciones de pérdida de función en los diferentes componentes del sistema de melanocortina están estrechamente relacionadas con la obesidad y afecciones relacionadas. En ratones, las mutaciones dentro de POMC o MC4R y MC3R producen obesidad, resistencia a insulina e hiperfagia (Goodfellow y Saunders, Curr. Topics Med. Chem. 3: 855-883 (2003); Huszar y col., Cell 88: 131-141 (1997); Yaswen y col., Nat. Med. 5: 1066-1070 (1999)). En el hombre las mutaciones dentro de POMC o MC4R conducen al desarrollo de obesidad asociada con ingesta de alimentos aumentada (Krude y col., Nat. Genet. 19: 155-157 (1998); Yeo y col., Nature Genetics 20: 111-112 (1998); Branson y col., New Engl. J. Med. 348: 1096-1103 (2003); Vaisse y col., J. Clin. Invest. 106: 253-262 (2000); Ho y MacKenzie, J. Biol. Chem. 275: 35816-35822 (1999)).

La pérdida de peso puede resultar de la estimulación farmacológica de la actividad del sistema de melanocortina. En roedores la estimulación farmacológica de receptores de melanocortina tales como MC4R conduce a una disminución de la ingesta de comida, aumento del gasto de energía y pérdida de peso (Pierroz y col., Diabetes 51: 1337-1345 (2002)). En el hombre la administración intranasal de alfa-MSH para estimular MC4R en hombres no obesos da como resultado una disminución del peso corporal debido a la pérdida de grasa pero no de masa corporal magra (Fehm y col., J. Clin. Endo. Metabol. 86: 1144-1148 (2001)).

La obesidad actualmente se trata, solo con éxito limitado, por varias estrategias diferentes. Estas estrategias principalmente implican cambios de “estilo de vida” (por ejemplo dieta y ejercicio), terapias farmacéuticas basadas en moléculas pequeñas o retirada quirúrgica de una parte del estómago (cirugía de derivación gástrica). Adicionalmente, los péptidos de unión a receptor de melanocortina estimuladores de pérdida de peso tales como alfa-MSH son de uso limitado como agentes farmacéuticos debido a la semivida extremadamente corta en suero de tales péptidos. Por lo tanto, existe una necesidad para tratamientos de obesidad adicionales y en particular para moléculas de unión a receptor de melanocortina que superen la corta semivida en suero de los péptidos de unión a receptor de melanocortina tales como alfa-MSH.

Breve Descripción de los Dibujos

La Figura 1 muestra elementos de un polipéptido de mimeticuerpo de unión a receptor de melanocortina,

La Figura 2 muestra un dibujo de un mimeticuerpo de unión a receptor de melanocortina. La Figura 3 muestra las secuencias de aminoácidos (SEC ID Nº: 62) y ADNc (SEC ID Nº: 61) de un mimeticuerpo de alfa-MSH de unión al receptor de melanocortina. Las partes aminoterminales de elementos mimeticuerpos individuales están subrayadas. La Figura 4 muestra unión de mimeticuerpo de alfa-MSH a MC4R en un ensayo de unión competitiva. La Figura 5 muestra activación de mimeticuerpo de alfa-MSH de MC4R en células que expresan un alto nivel de MC4R. La Figura 6 muestra la activación de mimeticuerpo de alfa-MSH de MC4R en células que expresan un bajo nivel de MC4R. La Figura 7 muestra disminución mediada por mimeticuerpo de alfa-MSH en ingesta de comida animal. La Figura 8 muestra disminución mediada por el mimeticuerpo de alfa-MSH en peso corporal animal.

Sumario de la Invención

Un aspecto de la invención es un polipéptido de acuerdo con fórmula (I):

(Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3) (t) (I)

en la que Mp es una molécula de unión a receptor de melanocortina, Lk es engarce químico o polipeptídico, V2 es una parte de un extremo C terminal de una región variable de inmunoglobulina, Hg es al menos una parte de una región bisagra variable de inmunoglobulina, CH2 es una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina y CH3 es una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina y t es de forma independiente un número entero de 1 a 10.

Otro aspecto de la invención es un polipéptido en el que Mp es un fragmento biológicamente activo de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ó 18; o Mp tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ó 18.

Otro aspecto de la invención es un polipéptido, uniéndose el polipéptido al menos a un receptor de melanocortina.

Otro aspecto de la invención es un polipéptido que comprende SEC ID Nº: 60 ó 62.

Otro aspecto de la invención es un polinucleótido que comprende SEC ID Nº: 59 o SEC ID Nº: 61 o un polinucleótido complementario a SEC ID Nº: 59 o SEC ID Nº: 61.

Otro aspecto de la invención es un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEC ID Nº: 60 o SEC ID Nº: 62.

Otro aspecto de la invención es un polipéptido de la invención para su uso en medicina.

Otro aspecto de la invención es un polipéptido de la invención para modular al menos una afección mediada por receptor de melanocortina.

Descripción Detallada de la Invención

La presente invención proporciona polipéptidos que tienen las propiedades de unión a receptor de melanocortina y mimetizar diferentes isotipos de molécula de inmunoglobulina de anticuerpos tales como IgA, IgD, IgE, IgG o IgM y cualquier subclase de las mismas, tales como IgA1, IgA2, 19G1, IgG2, IgG3 o IgG4, o combinaciones de las mismas, denominadas generalmente en lo sucesivo en el presente documento “mimeticuerpos”. En algunas realizaciones, los polipéptidos mimeticuerpos de la invención contienen una secuencia de péptido hormonal estimulante de alfa melanocitos (alfa-MSH) y se designa mimeticuerpo de alfa-MSH de unión a receptor de melanocortina: Tales polipéptidos mimeticuerpos de alfa-MSH pueden unirse al receptor de melanocortina 4 (MC4R) y, con igual o menor afinidad, con MC3R y MC5R respectivamente. Un resultado de dicha unión a receptor de melanocortina puede ser la estimulación o inhibición de la actividad del receptor de melanocortina. La estimulación puede causar pérdida de peso mientras que la inhibición puede causar ganancia de peso.

En una realización los polipéptidos de la invención tienen la fórmula genérica (I):

(Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3) (t) (I)

Como se usa en el presente documento, “molécula de unión a receptor de melanocortina” significa una molécula que puede unirse al menos a un receptor de melanocortina tal como MC4R de Homo sapiens (SEC ID Nº: 77). Los ejemplos de otros receptores de melanocortina de Homo sapiens incluyen MCR1 (SEC ID Nº: 71), MCR2 (SEC ID Nº: 73), MCR3 (SEC ID Nº: 75) y MCR5 (SEC ID Nº: 79). Una cadena peptídica dada es un “receptor de melanocortina” si tiene al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 85% con una secuencia de receptor de melanocortina conocida o la forma madura de un receptor de melanocortina conocido y puede actuar como un receptor acoplado a proteína G. El porcentaje de identidad entre dos cadenas peptídicas puede determinarse por alineamiento por parejas usando los ajustes por defecto del módulo AlignX de Vector NTI versión

9.0.0 (Invitrogen Corp., Carslbad, CA). Una molécula de unión a receptor de melanocortina ejemplar es el péptido de alfa-MSH de 13 aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en (SEC ID Nº: 2). Otras moléculas de unión a receptor de melanocortina incluyen fragmentos biológicamente activos de SEC ID Nº: 2 y otras secuencias de aminoácidos que pueden unirse a un receptor de melanocortina. La expresión “fragmento biológicamente activo” como se usa en el presente documento, se refiere a una parte de un péptido de alfa-MSH que puede unirse con un receptor de melanocortina tal como MC4R. La secuencia peptídica HFRW (SEC ID Nº: 81) es un “fragmento biológicamente activo” ejemplar de la secuencia peptídica alfa-MSH SYSMEHFRWGKPV (SEC ID Nº: 2). El fragmento HFRW se ha incorporado en la estructura de la molécula activadora del receptor de melanocortina sintética melanotan II (MTII) (Fan y col., Nature 385: 165-168 (1997)).

La incorporación de moléculas de unión al receptor de melanocortina en los polipéptidos mimeticuerpos de la invención posibilita la unión a receptores de melanocortina con un amplio intervalo de afinidades. Los polipéptidos mimeticuerpos de la invención pueden unirse a un receptor de melanocortina con una Kd menor o igual a aproximadamente 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 ó 10-12 M. El intervalo de valores de CI50 obtenidos para un péptido aMSH, péptido MTII y MSHMMB fueron 260-400 nM, 5-30 nM y 200-300 nM respectivamente. La afinidad de un polipéptido mimeticuerpo por un receptor de melanocortina puede determinarse experimentalmente usando cualquier procedimiento adecuado. Tales procedimientos pueden utilizar instrumentación Biacore o KinExA, ensayos de ELISA o de unión competitiva. Los polipéptidos mimeticuerpos que se unen específicamente a receptores de melanocortina con una afinidad deseada pueden seleccionarse de bibliotecas de variantes o fragmentos por técnicas conocidas para los expertos en la materia.

Un péptido alfa-MSH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 2 puede modificarse para obtener otras moléculas de unión a receptor de melanocortina. Tales modificaciones pueden comprender la incorporación de motivos C-[X]n-C en el péptido para restringir de forma conformacional el péptido a través de la formación de enlaces disulfuro. En un motivo C-[X]n-C, C es un resto de cisteína, X es un resto de aminoácido y n es un número entero necesario para conseguir la restricción conformacional requerida. En este caso n puede ser desde 1 resto hasta 50. Se muestran secuencias peptídicas modificadas C-[X]n-C ejemplares en la SEC ID Nº: 4, 6, 8 y 10.

La modificación también puede comprender la comparación de un motivo Wa-[X]n-Wa en el péptido para restringir de forma conformacional el péptido a través de la formación de una cremallera de triptófano. En un motivo Wa-[X]n-Wa W es un resto de triptófano, X es un aminoácido, a es un número entero, habitualmente 2, pero que puede ser de 1 a 10, y n es un número entero necesario para conseguir la restricción conformacional requerida. En este caso n puede ser desde 1 resto hasta 50. Se muestran péptidos Wa-[X]n-Wa ejemplares en SEC ID Nº: 12, 14, 16 y 18. Además, la secuencia HFRW (SEC ID Nº: 81) presente en el péptido alfa-MSH también pueden modificarse sustituyendo cualquier resto en esta secuencia por uno cualquiera de F, H, W y M; por ejemplo, HFRW (SEC ID Nº: 81) pueden sustituirse por FHWM (SEC ID Nº: 83).

En los polipéptidos de la invención, la parte de engarce (Lk) proporciona flexibilidad estructural permitiendo al mimeticuerpo tener propiedades de unión y orientaciones alternativas. Los engarces ejemplares incluyen engarces químicos no peptídicos o de uno a 20 aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, seleccionándose los aminoácidos de los 20 aminoácidos de origen natural u otros aminoácidos (por ejemplo aminoácidos D, aminoácidos de origen no natural o aminoácidos de origen natural poco habituales). La parte de engarce puede incluir una mayoría de aminoácidos que no tienen impedimento estérico, tales como glicina, alanina y serina y puede incluir GS, poli GS (por ejemplo GSGS (SEC ID Nº: 20)), GGSG (SEC ID Nº: 22), GSGGGS (SEC ID Nº: 24), GSGGGSG (SEC ID Nº: 26), GSSG (SEC ID Nº: 28), o GSGGGS (SEC ID Nº: 30) o GGGS (SEC ID Nº: 85) o cualquier combinación o polímero de los mismos. Otros engarces ejemplares dentro del alcance de la invención pueden ser mayores de 20 restos y pueden incluir restos distintos de glicina, alanina y serina.

En los polipéptidos de la invención, V2 es una parte de un dominio carboxi terminal de una región variable de inmunoglobulina tal como una región variable de cadena pesada. Las secuencias de aminoácidos V2 ejemplares son GTLVTVSS (SEC ID Nº: 32) y TLVAVSS (SEC ID Nº: 34).

En los polipéptidos de la invención, Hg es una parte del domino de bisagra de una región variable de inmunoglobulina tal como una región variable de cadena pesada. Las secuencias de aminoácidos de Hg ejemplares incluyen EPKSCDKTHTCPPCP (SEC ID Nº: 36), EPKSADKTHTCPPCP (SEC ID Nº: 38), ESKYGPPCPSCP (SEC ID Nº: 40), ESKYGPPCPPCP (SEC ID Nº: 42), CPPCP (SEC ID Nº: 44) y CPSC (SEC ID Nº: 46).

En los polipéptidos de la invención, CH2 es una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina. Las secuencias de aminoácidos de CH2 ejemplares incluyen:

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y

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En los polipéptidos de la invención, CH3 es una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina. Las secuencias de aminoácidos de CH3 ejemplares incluyen:

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5 y

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se reconocerá por los expertos en la materia que la región CH3 de los polipéptidos de la invención pueden tener su aminoácidos C terminal escindido cuando se expresan en ciertos sistemas recombinantes.

En los polipéptidos mimeticuerpos de la invención Hg, CH2 o CH3 pueden ser de la subclase IgG1 o IgG4. Una

10 secuencia es de la subclase IgG1 o IgG4 si se forma o desarrolla a partir de una cadena pesada 1 o 4 respectivamente. Una cadena peptídica dada es una cadena pesada 1 o 4 si es al menos 80% idéntica a una secuencia de cadena pesada 1 o 4 conocida de una especie dada. El porcentaje de identidad entre dos cadenas peptídicas puede determinarse por alineamiento en parejas usando los ajustes por defecto del módulo AlignX de Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).

15 En los polipéptidos mimeticuerpos de la invención Hg, CH2 o CH3 pueden ser individualmente de la subclase IgG1 o IgG4. Los mimeticuerpos de la invención también pueden comprender combinaciones de elementos Hg, CH2 o CH3 de cada subclase. Por ejemplo, Hg puede ser de la subclase IgG4 mientras que CH2 y CH3 son de la subclase IgG1. Como alternativa Hg, CH2 y CH3 pueden ser todos de la subclase IgG4 o IgG1. El polipéptido EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

20 EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID Nº: 65) es ejemplar de un polipéptido en el que Hg (restos 1-15 de SEC ID Nº: 65), CH2 (restos 16-125 de SEC ID Nº: 65) y CH3 (restos 126-232 de SEC ID Nº: 65) son todos de la subclase IgG1.

Las subclases IgG1 e IgG4 difieren en el número de cisteínas en la región bisagra. La mayoría de los anticuerpos de

25 tipo IgG tales como IgG1, son moléculas homodiméricas compuestas de dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos cadenas ligeras (L) idénticas típicamente abreviadas H2L2. De este modo, estas moléculas son generalmente bivalentes con respecto a unión a antígenos debido a la formación de enlaces disulfuro entre cadenas pesadas y ambas ramas de unión a antígeno (Fab) de la molécula de IgG tienen idéntica especificidad de unión. Las cadenas pesadas de isotipo IgG4, por el contrario, contienen un motivo CPSC (SEC ID Nº: 46) en sus regiones bisagra capaz

30 de formar enlaces disulfuro dentro de o entre las cadenas pesadas, es decir, los dos restos Cys en el motivo CPSC pueden unirse por enlace disulfuro con los restos Cys correspondientes en la otra cadena H (inter) o los dos restos de Cys dentro de un motivo CPSC dado pueden unirse con enlace disulfuro entre sí (intra). Puesto que los pares de HL en esas moléculas IgG4 con enlaces dentro de las cadenas pesadas en la región bisagra no están asociadas covalentemente entre sí, pueden disociarse en monómeros HL que se reasocian después con monómeros HL derivados de otras moléculas de IgG4 que forma moléculas de IgG4 heterodiméricas biespecíficas. Las enzimas isomerasa in vivo pueden facilitar este proceso. En un anticuerpo IgG biespecífico las dos “ramas” Fab de la molécula de anticuerpo difieren en los epítopos a los que se unen. La sustitución de restos de Ser en la región bisagra de IgG4 con Pro da como resultado un “comportamiento de tipo IgG1”, es decir, las moléculas forman enlaces disulfuro estables entre cadenas pesadas y, por lo tanto, no son susceptibles de intercambiar HL con otras moléculas de IgG4.

Los polipéptidos mimeticuerpos de la invención pueden hacerse más de tipo IgG4 o tipo IgG1 por la modificación de sitios que están implicados en la formación de enlaces disulfuro y están presentes en la parte Hg-CH2-CH3 de los polipéptido mimeticuerpos. Tales sitios pueden modificarse por retirada, deleción, inserción o sustitución con otros aminoácidos. Típicamente, los restos de cisteína presentes en motivos asociados a enlaces disulfuro se retiran o sustituyen. La retirada de estos sitios puede evitar la unión por enlaces disulfuro covalentes con otras proteínas que contienen cisteína presentes en la célula huésped productora de mimeticuerpos o unión por enlaces disulfuro dentro de cadenas pesadas en construcciones basadas en IgG4 permitiendo aún la dimerización no covalente de dominios de mimeticuerpo Hg-CH2-CH3. La modificación de tales sitios puede permitir la formación de polipéptidos mimeticuerpos biespecíficos con dos partes M diferentes o evitar la formación de tales especies biespecíficas.

Las subclases IgG1 e IgG4 también difieren en su capacidad para mediar citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). CDC es el lisado de una célula diana en presencia de complemento. La ruta de activación de complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) con una molécula que forma complejo con un antígeno afín. IgG1 es un inductor fuerte de la cascada de complemento y actividad de CDC posterior, mientras que IgG4 tiene poca actividad inductora de complemento. ADCC es el procedimiento mediado por células en el que células citotóxicas no específicas que expresan receptores de Fc (FcR) implicados en ADCC (por ejemplo, células citolíticas (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente causan lisis de la célula diana. La subclase IgG1 se une con alta afinidad a receptores de Fc implicados en ADCC y contribuye a ADCC, mientras que IgG4 se une solamente de forma débil a tales receptores y tiene poca actividad inductora de ADCC. La incapacidad relativa de IgG4 para activar funciones efectoras tales como ADCC es deseable puesto que es posible el suministro del polipéptido mimeticuerpo a células sin matar a la célula.

La actividad CDC y ADCC de los polipéptidos mimeticuerpos de la invención pueden modificarse alterando sitios implicados en CDC y ADCC presentes en la parte Hg-CH2-CH3 del polipéptido mimeticuerpo. Tales sitios pueden modificarse por retirada, deleción, inserción o sustitución con otros aminoácidos. En los mimeticuerpos de la invención los sitios implicados en CDC, tales como el sitio de unión a C1q, típicamente se retiran o se modifican de otro modo para minimizar la actividad de CDC. Adicionalmente, los sitios de unión a receptor de Fc implicados en ADCC pueden modificarse de forma similar en los mimeticuerpos de la invención. En general, dicha modificación retirará los sitios de unión a receptor de Fc implicados en la actividad ADCC de los mimeticuerpos de la invención. La sustitución de restos de Leu con restos de Ala en la parte CH2 de los polipéptidos de la invención es un ejemplo de una modificación que puede minimizar la actividad ADCC en los polipéptidos de la invención. La secuencia de aminoácidos de CH2 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (SEC ID Nº: 52) es ejemplar de una sustitución de Leu a Ala tal en los restos 4 y 5 (en la secuencia anterior). Además, el dominio V1 puede retirarse de modo que el extremo N terminal del péptido esté libre después de la escisión del péptido señal y es accesible a y podría modificarse por enzimas tales como acetilasas.

Los anticuerpos de los isotipos tanto IgG4 como IgG1 contienen sitios de unión al receptor de recuperación FcRn. El receptor de recuperación de FcRn ayuda a mantener los niveles de anticuerpo IgG en el cuerpo reciclando o transportando anticuerpos de tipo IgG a través de capas celulares endoteliales tales como las que revisten el interior de las cavidades corporales y vasos sanguíneos.

El receptor recuperador de FcRn hace esto uniendo IgG que han entrado en células endoteliales por pinocitosis no específica y evitando que estas moléculas de anticuerpo IgG se degraden en el lisosoma de la célula. El resultado de dicha actividad del receptor FcRn es que la semivida en suero de una molécula con un sitio de unión a FcRn se prolonga en relación con una molécula idéntica en lo demás que carece de dicho sitio.

Es deseable que la parte Hg-CH2-CH3 de los mimeticuerpos de la invención contengan un sitio de unión de FcRn en el punto de unión de las regiones CH2 y CH3. Se espera que tales sitios FcRn aumenten la semivida en suero de los mimeticuerpos de la invención así como que mejoren otras propiedades farmacocinéticas en relación con una molécula de unión a receptor de melanocortina, tal como alfa-MSH sola. En los mimeticuerpos de la invención los sitios de FcRn pueden modificarse o añadirse por retirada, deleción, inserción o sustitución de aminoácidos. Típicamente, tales modificaciones se usan para mejorar la unión de un sitio dado al FcRn. Un ejemplo de sitio de unión a FcRn es la secuencia MISRTPTVLHQHNHY (SEC ID Nº: 69) hallada en anticuerpos IgG1 e IgG4. Otros sitios de unión a FcRn se conocen bien por los expertos en la materia.

Los anticuerpos con diferentes isotipos, tales como IgG4 e IgG1, pueden contener sitios de glucosilación. La glucosilación de estos sitios puede alterar las propiedades y actividades de moléculas de anticuerpo. Las moléculas de anticuerpo pueden estar N glucosiladas u O-glucosiladas. La N glucosilación de cadenas laterales de restos aminoacídicos de anticuerpo que contienen átomos de nitrógeno (por ejemplo Asn) pueden modular funciones efectoras de Fc de anticuerpo tales como ADCC confiriendo una actividad citolítica a moléculas de anticuerpo N glucosiladas. Esta actividad citolítica asociada a ADCC provoca la lisis de células efectuada por tales anticuerpos N glucosilados. Como alternativa, una molécula de anticuerpos puede estar O-glucosilada por modificación de cadenas laterales de restos de aminoácidos que contienen átomos de oxígeno (por ejemplo, Ser o Thr).

La O-glucosilación puede disminuir la semivida en suero de una molécula de anticuerpo a través de aumento del aclaramiento mediado por lectina de moléculas de anticuerpo O-glucosiladas del suero. Adicionalmente, la O glucosilación puede causar aumentos no deseables de la heterogeneidad de anticuerpos debido a diferentes alcances de la O glucosilación entre diversas moléculas de anticuerpo. Por último, tanto la O glucosilación como la N glucosilación pueden alterar las propiedades dependientes de estructura de moléculas de anticuerpos tales como afinidad de unión e inmunogenicidad.

Como las moléculas de anticuerpo que imitan, los polipéptidos mimeticuerpos de la invención también pueden modificarse postraduccionalmente por N glucosilación y O glucosilación. En la mayoría de los casos, es deseable limitar la N glucosilación de los mimeticuerpos de la invención para minimizar la actividad citolítica. La N glucosilación puede limitarse por la retirada o sustitución de restos aminoacídicos tales como Asn, que típicamente están N glucosilados. También es deseable limitar la O glucosilación de mimeticuerpos para minimizar el aclaramiento mediado por lectina, heterogeneidad de mimeticuerpos y la alteración de propiedades de mimeticuerpos dependientes de estructura tales como afinidad de unión e inmunogenicidad. Una forma de minimizar la glucosilación ligada a O en los mimeticuerpos de la invención es sustituir restos de Thr con restos de Ala en la parte V2 de los polipéptidos de la invención.

La secuencia de aminoácidos V2 TLVAVSS (SEC ID Nº: 34) es ejemplar de una sustitución de Thr a Ala tal; esta sustitución de V2 particular también puede obtenerse por una sustitución de Thr a Ala en la posición 47 de SEC ID Nº: 62. Los expertos en la materia también reconocerán otros modos para controlar la glucosilación ligada a N y ligada a O incluyendo modulación de actividad de enzima glucosilasa.

La estructura monomérica Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3 de los polipéptidos mimeticuerpos de la invención puede ligarse a “t” otros monómeros siendo t un número entero de1 a 10. Dicho enlace puede producirse a través de interacciones no covalentes o enlaces covalentes tales como enlace disulfuro Cys-Cys. De este modo pueden formarse estructuras multiméricas tales como dímeros y multímeros de mayor orden de los polipéptidos de la invención. Se espera que la dimerización de los polipéptidos de la invención aumente la afinidad de estos polipéptidos por receptores de melanocortina tales como MC4R. El término “multímeros” como se usa en el presente documento significa moléculas que tienen estructura cuaternaria y están formadas por la asociación de dos o más subunidades.

Los polipéptidos de la invención pueden comprender opcionalmente en el extremo amino terminal, una parte amino terminal de una región variable de inmunoglobulina, designada V1 como se muestra en la Fórmula II:

(V1-Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3) (t) (II)

Las secuencias de aminoácidos V1 ejemplares incluyen QIQ y QVQ.

Los polipéptidos de la invención también pueden comprender señales secretoras necesarias para facilitar la secreción de proteínas u otras señales necesarias para el tráfico de proteínas en la célula. Un ejemplo de secuencia señal secretora es MAWVWTLL-FLMAAAQSIQA (SEC ID Nº: 69). Los expertos en la materia reconocerán otras señales secretoras.

En una realización los polipéptidos de la invención comprenden SEC ID Nº: 60 ó 62. SEC ID Nº: 62 representa un polipéptido alfa-MSH de unión a receptor de melanocortina (V1-Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t) de fórmula genérica (II) que tiene la señal secretora MAWVWTLLFLMAAAQSIQA (SEC ID Nº: 69) fusionada en su extremo amino terminal. La SEC ID Nº: 60 representa un polipéptido alfa-MSH de unión a receptor de melanocortina (Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3) (t) de la fórmula genérica (I). No está presente señal secretora en SEC ID Nº: 60.

Otro aspecto de la presente invención es un polinucleótido que comprende, es complementario a o que tiene identidad significativa con, un polinucleótido que codifica al menos un mimeticuerpo de unión a receptor de melanocortina. Otros aspectos de la presente invención incluyen vectores que comprenden al menos una molécula polinucleotídica que codifica un mimeticuerpo de unión a receptor de melanocortina. En un aspecto diferente la invención proporciona una célula que comprende un vector de la invención o una célula que expresa un polipéptido mimeticuerpo de la invención. Los polinucleótidos, vectores y células pueden usarse para producir los polipéptidos mimeticuerpos de la invención.

En una realización, los polinucleótidos de la invención comprenden SEC ID Nº: 59 o SEC ID Nº: 61 o un polinucleótido complementario a SEC ID Nº: 59 o SEC ID Nº: 61. SEC ID Nº: 59 es un ADNc que codifica un polipéptido alfa-MSH de unión a receptor de melanocortina (Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3) (t) de la fórmula genérica (I) que carece de una secuencia señal. SEC ID Nº: 61 es un ADNc que codifica un polipéptido alfa-MSH de unión a receptor de melanocortina (V1-Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3) (t) de la fórmula genérica (II) que tiene una señal secretora fusionada en su extremo amino terminal.

En una realización, los polinucleótidos de la invención comprenden un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEC ID Nº: 60 o SEC ID Nº: 62. Las secuencias de ácidos nucleicos ejemplares que codifican las secuencias polipeptídicas mostradas en SEC ID Nº: 60 o SEC ID Nº: 62 se muestran en SEC ID Nº: 59 o SEC ID Nº: 61, respectivamente. También se proporcionan polinucleótidos que son sustancialmente idénticos a los polinucleótidos anteriormente descritos.

La expresión “sustancialmente idéntica” en el contexto de polinucleótidos significa que una secuencia polinucleotídica dada es idéntica a una secuencia polinucleotídica de la invención, o parte de la misma, en al menos 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 95-98% de los nucleótidos. El porcentaje de identidad entre dos secuencias polinucleotídicas puede determinarse por alineamiento por parejas usando los ajustes por efecto del módulo AlignX de Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).

Típicamente, los polinucleótidos de la invención se usan en vectores de expresión para la preparación de los polipéptidos mimeticuerpos de la invención. Los vectores dentro del alcance de la invención proporcionan elementos necesarios para expresión eucariota e incluyen vectores dirigidos por promotores virales, tales como vectores dirigidos por promotor de CMV, por ejemplo, pcDNA3.1, pCEP4 y sus derivados, vectores de expresión de Baculovirus, vectores de expresión de Drosophila y vectores de expresión que están dirigidos por promotores de genes de mamífero, tales como promotores de genes de Ig humanos. Otros ejemplos incluyen vectores de expresión procariotas, tales como vectores dirigidos por promotor T7, por ejemplo, pET41, vectores dirigidos por el promotor de la lactosa y vectores dirigidos por el promotor del gen de la arabinosa.

La presente invención también se refiere a una célula que expresa un mimeticuerpo de la invención o comprende un vector de la invención. Una célula tal puede ser procariota o eucariota. Las células eucariotas ejemplares son células de mamífero, tales como, pero sin limitación, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, HepG2, 653, SP2/0, NS0 293, HeLa, células de mieloma, de linfoma o cualquier derivado de las mismas. Más preferentemente, la célula eucariota es una célula HEK293, NS0 SP2/0 o CHO. E. coli es una célula procariota ejemplar. Una célula de acuerdo con la invención puede generarse por transfección, fusión celular, inmortalización o cualquier procedimiento que se conozca bien en la técnica. Los polinucleótidos transfectados en una célula pueden ser extracromosómicos o estar integrados de forma estable en el cromosoma de la célula.

Los mimeticuerpos de la invención pueden hacerse más compatibles con una célula huésped dada por modificación de la parte Hg-CH2-CH3 del polipéptido. Por ejemplo, cuando un mimeticuerpo de la invención se expresa de forma recombinante en una célula bacteriana tal como E. coli, la secuencia Pro-Ala en el elemento Hg puede retirarse para evitar la digestión por la enzima de E. coli prolina iminopeptidasa. De forma similar, una parte del elemento Hg puede delecionarse o sustituirse con otros aminoácidos en los mimeticuerpos de la invención para evitar heterogeneidad en los productos expresados en una célula huésped seleccionada.

La presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento para producir un polipéptido mimeticuerpo que comprende las etapas de cultivar una célula de la invención y purificar un polipéptido mimeticuerpo expresado de la invención. Los componentes celulares, tales como los necesarios para transcripción y traducción in vitro también pueden usarse para expresar los polipéptidos de la invención. La presente invención abarca mimeticuerpos producidos por ambos procedimientos. Los polipéptidos mimeticuerpos expresados pueden recuperarse y purificarse de células o sistemas basados en componentes celulares por procedimientos bien conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, purificación de proteína A, precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. También puede emplearse cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para purificación. Típicamente la purificación requerirá una combinación de varios procedimientos diferentes.

Otro aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de al menos un polipéptido mimeticuerpo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La expresión “cantidad eficaz” generalmente se refiere a la cantidad de mimeticuerpo necesaria para terapia eficaz, es decir, el alivio parcial

o completo del síntoma o trastorno para el que se buscó tratamiento. La composición puede comprenden opcionalmente al menos un compuesto, proteína o composición adicional útil para tratar la obesidad y las otras afecciones descritas posteriormente. El vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en las composiciones puede ser una solución, suspensión, emulsión, coloide o polvo. Los expertos en la materia reconocerán otro vehículo y diluyentes farmacéuticamente aceptables.

Otro aspecto de la presente invención es un polipéptido de la invención para su uso en medicina. El polipéptido puede ser para su uso en un procedimiento para modificar la actividad biológica de un receptor de melanocortina en una célula, tejido u órgano que comprende poner en contacto las composiciones farmacéuticas de la invención con la célula, tejido u órgano. El polipéptido de la invención puede ser para su uso en un procedimiento para modificar la actividad del receptor de melanocortina en el cerebro, tejido cerebral o células cerebrales. Como alternativa, el polipéptido de la invención puede ser para su uso en un procedimiento para modificar la actividad del receptor de melanocortina en otras células periféricas o tejidos tales como músculo, u otros órganos tales como el estómago. Los expertos en la materia reconocerán otras células, tejidos u órganos que pueden usarse.

Otro aspecto de la invención es un polipéptido de la invención para modular al menos una afección mediada por receptor de melanocortina que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención a un paciente que la necesite. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por cualquier vía adecuada. Tales vías pueden ser intratecal, intranasal, periférica (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa) o por cualquier otro medio conocido en la técnica. Como se ha descrito previamente, se ha implicado una actividad del receptor de melanocortina anómala en varias afecciones patológicas, tales como obesidad y diabetes Tipo 2. Los polipéptidos mimeticuerpos de la invención también pueden usarse para modular otras afecciones mediadas por receptor de melanocortina tales como disfunción eréctil masculina y femenina, inflamación, insuficiencia cardiaca congestiva, trastornos del sistema nervioso central, daño neuronal, enfermedad infecciosa, enfermedad pulmonar, enfermedad cutánea, fiebre y dolor.

La presente invención se describe adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son meramente para ilustrar aspectos de la presente invención y no se pretende que sean limitaciones de la presente invención.

Ejemplo 1

Mimeticuerpo de alfa-MSH y Construcción de Vector de Expresión

Se diseñó una proteína mimeticuerpo de alfa-MSH que comprende una secuencia de señal secretora, una secuencia peptídica de alfa-MSH, una secuencia de engarce, una secuencia VH, una secuencia bisagra, una secuencia CH2 de IgG1 humana y una secuencia CH3 de IgG1 humana (Figura 3 y SEC ID Nº: 62). Los datos analíticos, por ejemplo, espectroscopía de masas, han confirmado que se genera un polipéptido maduro (61.344,6 para la forma G1/G1). Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican esta proteína mimeticuerpo de alfa-MSH (Figura 3; SEC ID Nº: 61) se generaron usando técnicas de biología molecular convencionales. Las secuencias de ácido nucleico que codifican la secuencia de mimeticuerpo de alfa-MSH se subclonaron en el vector de expresión p2389 para generar un vector de expresión de mimeticuerpo de alfa-MSH (SEC ID Nº: 63).

Ejemplo 2

Expresión de Mimeticuerpo de alfa-MSH

El mimeticuerpo de alfa-MSH se expresó de forma transitoria en células HEK293E. Las células se cultivaron usando condiciones convencionales y se transfectaron de forma transitoria con el vector de expresión de mimeticuerpo de alfa-MSH usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) como se indica por el fabricante. 24 h después de la transfección se transfirieron las células a una formulación de medio sin suero y se cultivaron durante 5 días. El medio de cultivo se retiró después y se centrifugó para retirar los residuos. El medio clarificado se incubó con Proteína A-Sepharose™ (HiTrap rProtein A FF, Amersham Biosciencies, Piscataway, NJ) y se eluyeron las proteínas del conjugado de Proteína A-Sepharose™ como se indicó por el fabricante. La solución de proteína eluída se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño de Superose™ 12 (Superose 12 10/300 GL, Amersham Biosciencies, Piscataway, NJ) usando procedimientos convencionales. El eluyente de la columna se sometió después a SDS-PAGE y se visualizó por tinción de azul de Coomassie y plata. Se prepararon después transferencias de Western y se ensayaron las manchas de transferencia con un anticuerpo primario específico de Fc

o un anticuerpo primario específico de alfa-MSH. Juntos, los resultados de transferencia de Western y tinción de SDS-PAGE indicaron que se había obtenido un mimeticuerpo de alfa-MSH purificado, compuesto de dos cadenas polipeptídicas, de las células HEK293 transfectadas de forma transitoria.

Ejemplo 3

El Mimeticuerpo de alfa-MSH se Une a MC4R

El mimeticuerpo de alfa-MSH se une a MC4R y puede competir con moléculas agonistas de [Nle(4), D-Phe(7)]-alfa-MSH (NDP-alfa-MSH) radiomarcadas por unión a MC4R (Figura 4). MC4R es un receptor para alfa-MSH. La unión de alfa-MSH con MC4R expresado de forma recombinante en membranas celulares de HEK293 (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA) se examinó por ensayos de unión competitiva en los que se añadieron cantidades crecientes de agonistas de MC4R no marcados (controles positivos) y el dominio Fc de un anticuerpo humano (control negativo) a cócteles de ensayo que contenían [125I]-NDP-alfa-MSH como se indica en la Figura 4. Los agonistas de MC4R no marcados fueron melanotan II (MTII; un análogo de alfa MSH), alfa-MSH y NDP-alfa-MSH. El mimeticuerpo de alfa-MSH que se une a MC4R fue estable después de dos semanas de almacenamiento a 4ºC, -20ºC y -80ºC en PBS (solución salina tamponada con fosfato) como se evaluó por ensayos de unión competitiva.

Se realizaron ensayos de unión competitiva usando Scintillation Proximity Assays® (Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ) como se indicó por el fabricante del ensayo. Los cócteles de ensayo contenían [125I]-NDP-alfa-MSH a CE80, es decir, 0,5 nM, 0,1 g de membranas de MC4R, MgSO4 1 mM, CaCl2 1,5 mM, Hepes 25 mM, BSA 0,2%, 1,10-fentrolina 1 mM, una cantidad recomendada por el fabricante del ensayo de cóctel inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) y perlas de SPA. Se midió la emisión de luz de las perlas de Scintillation

5 Proximity Assay® con un Instrumento Packard Top Count NXT (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA) durante 5 minutos.

Ejemplo 4

El Mimeticuerpo de alfa-MSH Activa MC4R

El mimeticuerpo de alfa-MSH puede activar señalización de MC4R para aumentar la producción de AMPc en células

10 CHOK1 que expresan MC4R (Figura 5 y Figura 6). MC4R es un receptor acoplado a proteína G de siete transmembranas (7TM). La activación de MC4R por ligando o agonista da como resultado un aumento de niveles de AMP cíclico (AMPc).

Los ensayos de activación del receptor MC4R se realizaron usando dos líneas celulares CHOK1 clonales diferentes transfectadas de forma estable con un vector de expresión de MC4R y que expresaban MC4R. El clon 1 (Figura 5) 15 expresó MC4R a altos niveles en relación con el Clon 2 (Figura 6). Las células del Clon 1 y Clon 2 se cultivaron como una monocapa usando condiciones de cultivo convencionales hasta una densidad de aproximadamente

100.000 células/pocillo y después se incubaron con cantidades crecientes (0-100 M) de alfa-MSH, MTII o mimeticuerpo de alfa-MSH durante 15 minutos como se indica en la Figura 5 y la Figura 6. Las células se lisaron después y se realizaron ensayos de AMPc usando el Sistema de Inmunoensayo Quimioluminiscente cAMP-Screen

20 Direct™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) como se indicó por el fabricante. Los valores de CE50 de los ensayos de AMPc usando Clon 1 (Figura 5) y Clon 2 (Figura 6) se enumeran en la Tabla 1 a continuación

Tabla 1

Clon 1: Clon 2

Péptido alfa-MSH (control positivo): CE50 = 3,29 nM CE50 = 9,46 nM

MT II (control positivo): CE50 = 0,52 nM CE50 = 0,52 nM

Mimeticuerpo de alfa-MSH: CE50 = 14,36 nM CE50 = 52,4 nM

Ejemplo 5

25 La Administración de Mimeticuerpo de alfa-MSH Reduce la Ingesta de Comida Animal y el Peso Corporal

La administración de mimeticuerpo de alfa-MSH a ventrículos cerebrales de Rattus norvegicus reduce la ingesta de comida del animal (Figura 7) y el peso corporal (Figura 8). Se proporcionó mimeticuerpo de alfa-MSH a los ventrículos cerebrales por inyecciones intracerebroventriculares (ICV) mediante una cánula insertada quirúrgicamente en el ventrículo lateral izquierdo del cerebro.

30 Las cánulas se insertaron quirúrgicamente en ratas Sprague-Dawley o Wistar que pesaban de 250 g a 350 g. Las coordenadas de colocación de la cánula fueron como sigue: -0,8 mm del bregma, -4,5 mm ventral y -1,5 posterior-anterior. Los animales se recuperaron durante 7 a 10 días después de la cirugía. Los animales se aclimataron a los procedimientos experimentales por manipulación diaria e inyección de simulación, para minimizar la tensión. Además se sometió a los animales a la inversión del ciclo oscuridad-luz.

35 Se confirmó la colocación apropiada de la cánula por un ensayo de angiotensina II. El ensayo confirmó la colocación apropiada de la cánula si la administración ICV de 10 ng de angiotensina II mediante la cánula provocó que las ratas bebieran 5-10 ml de agua en 30 minutos. Solamente los animales que pasaron el ensayo de angiotensina II se usaron para experimentos de ingesta de comida.

Los animales se sometieron a ayuno durante 18-24 horas y se administraron después mimeticuerpo de alfa-MSH,

40 alfa-MSH (control positivo) o PBS (control negativo) a los ventrículos cerebrales mediante la cánula a la tasa de inyección de 9 l/minuto. Cada grupo de tratamiento tuvo un mínimo de 7 animales. Los tratamientos y dosificaciones fueron como se indican en la Figura 7 y la Figura 8.

Se proporcionó alimento y agua a los animales después de la inyección. La cantidad de alimento y agua consumida se midió a 0 h, 4 h, 24 h, 48 h y 72 h (Figura 7) después de la inyección. El peso corporal a las 72 horas después de

45 la inyección se midió como se muestra en la Figura 8.

Habiéndose ahora descrito completamente la presente invención, resultará evidente para un experto en la materia que pueden realizarse muchos cambios y modificaciones a la misma sin alejarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Centocor, Inc.

<120> Mimeticuerpos de Unión a Receptor de Melanocortina, Composiciones, Procedimientos y Usos

<130> CEN5080 PCT

<140> A asignar

<141> 25-10-2005

<150> 60/621.960

<151> 25-10-2004

<160> 85

<170> PatetIn versión 3 - 2

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<210> 49

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 49

imagen4

<210> 50

<211> 110

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 51

<210> 52

<211> 110

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

imagen1

imagen4

<400> 52

imagen1

<210> 53

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 53

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10

<210> 54

<211> 110

<212> PRT

<213>: Homo sapiens 15 <400> 54

<210> 55

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56

<211> 107

<212> PRT

<213>: Homo sapiens 15 <400> 56

<210> 57

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 107

<212> PRT

<213>: Homo sapiens 15 <400> 58

imagen1

10 10

imagen1

imagen5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Mimeticuerpo de alfa-MSH de unión a receptor de melanocortina sin señal secretora 10 <400> 59 <210> 60

imagen6

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Mimeticuerpo de alfa-MSH de unión a receptor de melanocortina sin señal secretora

<400> 60 10

imagen1

<210> 61

<211> 843

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Mimeticuerpo de alfa-MSH de unión a receptor de melanocortina con señal secretora y V1.

<400> 61

imagen4

<210> 62

<211> 281

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 62

imagen1

<210> 63

<211> 11978 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector de expresión

imagen7

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<210> 64

<211> 696

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 64

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<210> 65

<211> 232

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

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<210> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 66

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5 <210> 67

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67 10

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<210> 68

<211> 57 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 68

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<210> 69 20 <211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

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<210> 70

<211> 951

<212>: ADN 30 <213> Homo sapiens

<400> 70

<210> 71

<211> 317

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 71

<210> 72

<211> 891

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 72

<210> 73

<211> 297

<212>: PRT 10 <213> Homo sapiens

imagen1

imagen10

<400> 73

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<210> 74

<211> 1080

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 74

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<210> 75

<211> 360

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 75

imagen1

<210> 76

<211> 999

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 76

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10

<210> 77

<211> 332

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <400> 77

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<210> 78

<211> 975

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 78

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<210> 79

<211> 325

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

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<210> 80

<211> 12

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 80

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<210> 81 10 <211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 81

imagen3

<210> 82

<211> 12

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Modificación de núcleo de HFRW de alfa-MSH

<400> 82

imagen1

<210> 83

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Modificación de núcleo de HFRW de alfa-MSH

<400> 83

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<210> 84

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido flexible

<400> 84

imagen1

<210> 85

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido flexible

<400> 85

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de acuerdo con fórmula (I):

(Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3) (t) (I)

en la que Mp es una molécula de unión a receptor de melanocortina, Lk es engarce químico o polipeptídico, V2 es una parte de un extremo C terminal de una región variable de inmunoglobulina, Hg es al menos una parte de una región bisagra variable de inmunoglobulina, CH2 es una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina y CH3 es una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina y t es independientemente un número entero de 1 a 10.
2.

El polipéptido de la reivindicación 1 en el que Mp es un fragmento biológicamente activo de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ó 18; o Mp tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, ó 18.
3.

El polipéptido de la reivindicación 1 en el que el polipéptido se une al menos a un receptor de melanocortina.
4.

El polipéptido de la reivindicación 3 en el que el receptor de melanocortina es un receptor de melanocortina
5.

Un polipéptido que comprende SEC ID Nº: 60 ó 62.
6.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7.

Un polinucleótido que comprende SEC ID Nº: 59 o SEC ID Nº: 61 o un polinucleótido complementario a SEC ID Nº: 59 o SEC ID Nº: 61.
8.

Un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEC ID Nº: 60 o SEC ID Nº: 62.
9.

Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 7 u 8.
10.

El vector de la reivindicación 9 que comprende SEC ID Nº: 63.
11.

Una célula que expresa un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
12.

Una célula que comprende el vector de la reivindicación 9.
13.

La célula de la reivindicación 12 siendo la célula una célula derivada de HEK293.
14.

Un procedimiento para producir un polipéptido que comprende las etapas de cultivar la célula de la reivindicación 11 y purificar el polipéptido expresado.
15.

Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de al menos un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
16.

Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en medicina.
17.

Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para modular al menos una afección mediada por receptor de melanocortina.
18.

El polipéptido de la reivindicación 17 en el que la afección mediada por receptor de melanocortina es la obesidad.