ES2369629T3 - Uso de op-1 para tratar defectos del cartílago. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que consiste en OP-1 y un material de administración para liberación sostenida o eliminación retardada para su uso en la reparación de un defecto de cartílago en un paciente, en donde el cartílago está rodeado por fluido sinovial; en donde la composición farmacéutica debe administrarse en el fluido sinovial que rodea al cartílago; en donde la composición es una disolución líquida o una suspensión líquida y se formula como una formulación de liberación sostenida o como una formulación de eliminación retardada.

Description

Uso de OP-1 para tratar defectos del cartílago

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la reparación de tejido ortopédico. Más particularmente, se refiere a la reparación

o a la regeneración de cartílago.

Antecedentes de la invención

La reparación y regeneración de cartílago es uno de los mayores obstáculos en las técnicas ortopédicas actuales. La importancia es enorme ya que la lesión de cartílago y trastornos degenerativos tales como la osteoartritis, la degeneración de disco intervertebral y los desgarros de menisco son una causa importante de discapacidad entre la población adulta de los Estados Unidos.

El cartílago es un tejido conectivo compuesto de condrocitos embebidos en un matriz extracelular de fibras de colágeno, proteoglicanos y otras proteínas no colagenosas. Existen dos formas de cartílago, articular y no articular. El cartílago articular es una capa fina de tejido conectivo, que cubre los extremos de los huesos en las articulaciones. El cartílago no articular incluye fibrocartílago y cartílago elástico, e incluye los discos intervertebrales, los meniscos, la tráquea, la laringe, la nariz, las orejas y las costillas.

La función del cartílago es la de amortiguar el peso, resistir el desgaste y permitir un movimiento casi sin fricción en las articulaciones. Los defectos en el tejido de cartílago, a menudos provocados por un trauma, un desgaste anormal

o una enfermedad, pueden conducir a dolor y rigidez, y si no se tratan pueden progresar y requerir finalmente una sustitución de toda la articulación. Por ejemplo, los defectos de cartílago articular a menudo conducen a una degradación prematura de la superficie articular y finalmente pueden dar como resultado defectos osteocondrales, osteoartritis o ambos.

La osteoartritis se considera un proceso de intento de reparación de la matriz extracelular de cartílago dañado, pero que falla gradualmente, ya que el equilibrio entre la síntesis y la eliminación de componentes de la matriz se ve afectado y desplazado hacia el catabolismo.

La capacidad del tejido cartilaginoso para regenerarse por sí mismo está muy limitada debido a su naturaleza avascular. La reparación de defectos osteocondrales, que implica tanto tejido cartilaginoso como el hueso subyacente, se produce en una extensión limitada promovida por la presencia de células madre y de factores de crecimiento y diferenciación llevados al defecto por la sangre y/o la médula. En estudios con animales, dichos defectos alcanzan cierto grado de reparación con la formación de una nueva capa de hueso y cartílago, pero la organización macromolecular y las características bioquímicas de la matriz de cartílago son imperfectas. El tejido reparado está constituido por colágeno de Tipo I, más que por colágeno de Tipo II, y proteoglicanos que no son específicos de cartílago, y dan como resultado fibrilaciones y cambios degenerativos con el tiempo. Y en los defectos de cartílago que no penetran en el hueso subcondronal ni siquiera se produce reparación, ni en una extensión limitada.

Además, el tratamiento quirúrgico de defectos cartilaginosos es complejo y se ha demostrado que tiene un éxito limitado. Por ejemplo, los defectos de cartílago articular se tratan con un metodología artroscópica mediante la cual se eliminan los cuerpos sueltos y se suavizan las áreas de transición. Sin embargo, este método por sí solo frecuentemente no proporciona un alivio duradero de los síntomas. Las sustituciones de rodilla a menudo requieren la resección de cantidades significativas de hueso y a menudo requieren múltiples sesiones quirúrgicas.

El menisco es un pequeño tejido con forma de pezuña de caballo situado entre los extremos óseos del interior de la articulación de la rodilla, que actúa como amortiguador de impactos. Existen dos meniscos en cada rodilla, uno a cada lado de la rodilla. Normalmente son fuertes en gente joven y con la edad se vuelven más quebradizos y se desgarran con mayor facilidad. Los desgarros son extremadamente comunes en lesiones de ligamento cruzado anterior (LCA). El fibrocartílago meniscal, como el cartílago hialino articular, tiene una capacidad limitada para curarse, particularmente en las regiones media e interior avasculares. El tratamiento actual para los desgarros pequeños es dejarlo tal cual si no causa muchas molestias. Las opciones quirúrgicas para tratar desgarros meniscales dependen de una serie de factores que incluyen la naturaleza y la extensión de la lesión y, más importante, de su localización. Los desgarros en la región vascularizada, que está integrada con el sinovio altamente vascularizado, se han reparado con éxito mediante sutura. La meniscectomía parcial o total es el tratamiento quirúrgico normal para los desgarros sintomáticos en los dos tercios avasculares del menisco. Los desgarros en estas regiones del menisco son los tipos más comunes observados clínicamente. Independientemente de si se emplea una meniscectomía abierta, artroscópica, total o parcial, la osteoartritis es una secuela frecuente en estos pacientes a los pocos años de la cirugía. Por lo tanto, la forma habitual de reparación es eliminar sólo parcialmente los trozos desgarrados y reparar el cartílago mediante grapas. Desafortunadamente, el proceso de curación después de este procedimiento es lento. Además, si la reparación no ha tenido éxito entonces el menisco afectado debe ser retirado al completo posteriormente.

La principal causa de dolor persistente y a menudo debilitante es la degeneración del disco intervertebral (DIV). Al degenerarse los discos hacen que la unión de las vértebras se comprima, dando como resultado a menudo un dolor severo.

El DIV como sindesmosis proporciona articulación entre cuerpos vertebrales adyacentes y actúa como un amortiguador de la carga de peso que disipa las cargas espinales aplicadas axialmente. Estas funciones biomecánicas son posibles gracias a la estructura única del DIV que está compuesto de un anillo fibroso exterior rico en colágeno que rodea un núcleo pulposo central gelatinoso rico en proteoglicano hidratado. Unas capas cartilaginosas en la parte superior y en la inferior, capas delgadas de cartílago tipo hialino, cubren las interfaces de los cuerpos vertebrales dentro del disco.

La degeneración del disco lumbar representa una carga social y económica sustancial para la comunidad, que se manifiesta principalmente como un dolor lumbar (LBP, del inglés “low back pain”). Se estima que hasta el 80% de la población experimenta al menos un episodio significativo de LBP durante su vida, y aproximadamente el 2,5% de la población en edad de trabajar tomará algún tipo de baja médica al año como resultado del LBP. Los costes directos del LBP en los países occidentales modernos se han estimado en 9.000 millones de dólares de EE.UU., la mayor parte de los cuales se destinan a la consulta de medicina general, terapia física y otras medicinas conservadoras (Williams DA y col., (1998), Health care and indemnity costs across the natural history of disability in occupational low back pain, Spine 23: 2329-36). El gasto indirecto total, que incluye el tratamiento quirúrgico, puede ser diez veces superior (Maetzel y Li (2002), The economic burden of low back pain: a review of studies published between 1996 and 2001, Best Prac Res Clin Rheumatol 16: 23-30: Walker y col., (2003), The economic burden, Proceedings of the Spine Society of Australia Annual Scientific Meeting, Canberra, Australia).

La degeneración discal en un fenómeno natural que se produce, en la mayoría de los casos, a partir del momento de la madurez esqueletal (Vernon-Roberts (1992), Age-related and degenerative pathology of intervertebral discs and apophyseal joints, en: The lumbar spine and back pain. Cuarta edición, Jayson MIV, Ed. Churchill, Livingstone, Edimburgo, Capítulo 2, 17-41). Es consistente con el avance de la edad, pero en muchos casos también está asociada a dolor, particularmente en la espina lumbar, y a una movilidad restringida. Los síntomas de LBP a menudo se solucionan espontáneamente con el tiempo cuando los pacientes modifican su estilo de vida para acomodarse a una movilidad restringida. Sin embargo, en muchos casos sigue siendo un factor significativo que requiere una intervención quirúrgica. El tratamiento quirúrgico tradicional “estándar dorado” para el LBP crónico ha sido la fusión espinal para inmovilizar el único nivel de dolor o el más doloroso. La fusión es cara debido a que requiere una hospitalización prolongada y atención médica quirúrgica especializada, y aunque la mayoría de los pacientes experimentarán un alivio del dolor a corto plazo, hoy día existen evidencias de que la fusión no proporciona los mejores resultados. Estudios a largo plazo sugieren que la fusión espinal en realidad promociona la degeneración a niveles adyacentes a la zona de fusión (Lee (1998), Accelerated degeneration of the segment adjacent to a lumbar fusion, Spine 13: 375-7). Del mismo modo que se desarrollaron las prótesis artificiales hace 50 años para restaurar la función de caderas y rodillas artríticas y fracturadas, ahora se están desarrollando prótesis con el objetivo de restaurar la función mecánica completa de los discos que se han convertido en dolorosos y artríticos debido a una degeneración crónica (Szpaalski y col. (2002), V Spine arthroplasty: a historical review, Eur Spine J 11: S65-S84). Sin embargo, es demasiado pronto para saber si cualquiera de los múltiples modelos que están siendo sometidos a ensayos proporcionará un beneficio a largo plazo.

Ahora se ha identificado una clase de proteínas que son competentes para actuar como auténticos morfógenos de tejido óseo y cartilaginoso, capaces por sí mismas de inducir la proliferación y la diferenciación de células progenitoras en tejido óseo, cartilaginoso, tendinoso y/o ligamentoso. Estas proteínas, denominadas en la presente memoria “proteínas osteogénicas” o “proteínas morfogénicas” o “morfógenos”, incluyen miembros de la familia de proteínas morfogenéticas de hueso (BMP, del inglés “bone morphogenetic proteins”) identificadas inicialmente por su capacidad para inducir la morfogénesis ósea ectópica, endocronal. Las proteínas osteogénicas generalmente se clasifican en la técnica como un subgrupo de la superfamilia TGF-β de factores de crecimiento (Hogan (1996), Genes & Development 10: 1580-1594). Los miembros de la familia de proteínas morfógenas incluyen la proteína-1 osteogénica de mamífero (OP-1, también conocida como BMP-7, y el homólogo de Drosophila 60A), la proteína-2 osteogénica (OP-2, también conocida como BMP-8), la proteína-3 osteogénica (OP-3), la BMP-2 (también conocida como BMP-2A ó CBMP-2A, y el homólogo de Drosophila DPP), la BMP-3, la BMP-4 (también conocida como BMP2B ó CBMP-2B), la BMP-5, la BMP-6 y su homólogo murino Vgr-1, la BMP-9, la BMP-10, la BMP-11, la BMP-12, la GDF3 (también conocida como Vgr2), la GDF8, la GDF9, la GDF10, la GDF11, la GDF12, la BMP-13, la BMP-14, la BMP-15, la BMP-16, la BMP-17, la BMP-18, la GDF-5 (también conocida como CDMP-1 ó MP52), la GDF-6 (también conocida como CDMP-2), la GDF-7 (también conocida como CDMP-3), el homólogo de Xenopus Vg1 y NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP y NEURAL. Los miembros de esta familia codifican cadenas de polipéptido secretadas que comparten características estructurales comunes, que incluyen el procesado a partir de una “proforma” precursora para producir una cadena de polipéptido madura competente para dimerizar, y que contiene un dominio activo carboxiterminal de aproximadamente 97-106 aminoácidos. Todos los miembros comparten un modelo conservado de cisteínas en este dominio y la forma activa de dichas proteínas puede ser tanto el homodímero enlazado por disulfuro de un único miembro de la familia como el heterodímero de dos miembros diferentes (véase, por ejemplo, Massague (1990) Annu. Rev. Cell Biol. 6: 597; Sampath y col. (1990) J. Biol. Chem. 265: 13198). Véase también las patentes de EE.UU. 5.011.691 y 5.266.683, Ozkaynak y col. (1990) EMBO J. 9: 2085-2093, Wharton y col. (1991) PNAS 88: 9214-9218); Ozkaynak (1992) J. Biol. Chem. 267: 25220-25227 y la patente de EE.UU.

5.266.683); (Celeste y col. (1991) PNAS 87: 9843-9847); (Lyons y col. (1989) PNAS 86: 4554-4558). Estas referencias describen las secuencias de aminoácidos y de ADN, así como las características químicas y físicas de estas proteínas osteogénicas. Véase también Wozney y col. (1988) Science 242: 1528-1534); BMP 9 (WO93/00432, publicada el 7 de enero de 1993); DPP (Padgett y col. (1987) Nature 325: 81-84; y Vg-1 (Weeks (1987) Cell 51: 861867).

Los métodos preferidos actualmente para reparar defectos en cartílagos incluyen la limpieza de trozos, la microfractura, el trasplante celular autólogo, la mosaicoplastia y la sustitución articular. Sin embargo, ninguno de estos métodos de lugar a una reparación real o sustitución del tejido cartilaginoso. Estos métodos producen un tejido reparado imperfecto con características de cicatriz.

Por tanto, sigue existiendo una necesidad por composiciones y métodos para reparar y regenerar defectos en cartílagos que eviten los problemas asociados a los métodos y composiciones disponibles actualmente.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que consiste en OP-1 y un material de administración para una liberación sostenida o una eliminación retardada, para su uso en la reparación de un defecto de cartílago en un paciente, en el que el cartílago está rodeado de líquido sinovial; en donde la composición farmacéutica debe administrarse al líquido sinovial que rodea al cartílago; en donde la composición es una disolución líquida o una suspensión líquida y está formulada como una formulación de liberación sostenida o como una formulación de eliminación retardada.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que consiste en OP-1 y un material de administración para una liberación sostenida o una eliminación retardada, para su uso en la regeneración o producción de cartílago en una zona de defecto de cartílago en un paciente, en donde el cartílago está rodeado por fluido sinovial; en donde la composición farmacéutica debe administrarse en el fluido sinovial que rodea al cartílago; en donde la composición es una disolución líquida o una suspensión líquida y está formulada como una formulación de liberación sostenida o como una formulación de eliminación retardada.

La presente invención además se refiere a una composición farmacéutica que consiste en OP-1 y un material de administración para una liberación sostenida o una eliminación retardada, para su uso para promover el crecimiento de cartílago o para acelerar la formación de cartílago en una zona de defecto de cartílago en un paciente, en donde el cartílago está rodeado de fluido sinovial; en donde la composición farmacéutica debe administrarse en el fluido sinovial que rodea al cartílago; en donde la composición es una disolución líquida o una suspensión líquida y está formulada como una formulación de liberación sostenida o como una formulación de eliminación retardada.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que consiste en OP-1 y un material de administración para una liberación sostenida o una eliminación retardada, para su uso para prevenir la degradación de cartílago o para tratar una lesión de cartílago o una enfermedad o trastorno degenerativo del cartílago, en donde el cartílago está rodeado de fluido sinovial; en donde la composición farmacéutica debe administrarse en el fluido sinovial que rodea al cartílago; en donde la composición es una disolución líquida o una suspensión líquida y está formulada como una formulación de liberación sostenida o como una formulación de eliminación retardada.

En algunas realizaciones, la lesión de tejido o la enfermedad degenerativa incluyen osteoartritis, desgarros de menisco y lesión en el LCA.

En algunas realizaciones, el cartílago es cartílago articular. En otras realizaciones, el cartílago es cartílago no articular. En algunas realizaciones, el cartílago no articular es un menisco.

En algunas realizaciones, la composición de OP-1 usada en la presente invención es una disolución acuosa. La composición de OP-1 se formula como una formulación de liberación sostenida o como una formulación de eliminación retardada (es decir, una formulación mediante la cual la eliminación de OP-1 se retrasa respecto a la eliminación normal). En algunas realizaciones, la composición de OP-1 se formula como una formulación inyectable.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un esquema de una articulación que muestra la zona de lesiones de impacto bilateral.

La Figura 2 es un gráfico que muestra el número de leucocitos en el fluido sinovial para animales tratados con OP-1 y para animales de control.

Las Figuras 3A y 3B son secciones histológicas de articulaciones de control y tratadas con OP-1.

La Figura 4 es un gráfico que muestra los niveles de sGAG en cartílago de cóndilo femoral medio para animales tratados con OP-1 y para animales de control.

La Figura 5 muestra resultados representativos de ovejas de control y tratadas con OP-1 en el modelo de osteoartritis. Las ovejas de control fueron tratadas sólo con colágeno. Las ovejas tratadas con OP-1 recibieron 350 µg de masilla de OP-1 en el momento de la cirugía y se inyectó una segunda dosis en el espacio articular 1 semana después.

La Figura 6 es una sección histológica de agujero 6 semanas después del tratamiento con masilla de OP-1.

La Figura 7 es una sección histológica de control de defecto de agujero de 6 semanas.

La Figura 8 es una sección histológica de control de defecto de agujero de 12 semanas.

La Figura 9 es una sección histológica de agujero 12 semanas después del tratamiento con masilla de OP-1.

La Figura 10 es una sección histológica de un defecto de desgarro meniscal 6 semanas después del tratamiento con masilla de OP-1.

La Figura 11 presenta el esquema de disección zonal para separar el disco en cuadrantes de anillo fibroso (AF) y el núcleo pulposo (NP) y la localización y extensión de la lesión anular anterolateral en el cuadrante 1 en secciones horizontal y vertical a través de discos intervertebrales ovinos lumbares. La localización de la lesión AF en las secciones horizontales 3 y 6 meses después de la cirugía queda bien ilustrada en la margen izquierda de esta figura. Las secciones histológicas verticales a lo largo del disco intervertebral y el cuerpo vertebral adyacente y los platos de crecimiento vertebral superior e inferior también demuestran la naturaleza focal de la lesión de AF (flecha) asociada a cambios en el colágeno del AF exterior (tricromo de Masson) y en la organización colagenosa (rojo de toluidina) en la zona de la lesión que penetra aproximadamente 4 mm en el disco (margen derecha de la figura).

La Figura 12 presenta puntos ROM de flexión-extensión correspondientes a unidad espinal funcional (FSU, del inglés “functional spinal unit”) de oveja intacta y lesionada (lesión anular anterior).

La Figura 13 presenta la secuencia de aminoácidos correspondiente a la OP-1 humana.

Descripción detallada de la invención

Con el objetivo de que la invención descrita en la presente memoria pueda comprenderse en plenitud se presenta la siguiente descripción detallada.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que les daría comúnmente el especialista en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí para la práctica o los ensayos de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos, y no pretenden ser limitantes.

A lo largo de esta especificación, la palabra “comprender”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, debe entenderse como que implica la inclusión de un integrante dado o grupo de integrantes, pero no la exclusión de cualquier otro integrante o grupo de integrantes.

A fin de definir adicionalmente la invención, se proporcionan aquí los siguientes términos y definiciones.

El término “cartílago” se refiere a un tipo de tejido conectivo que contiene condrocitos o células de tipo condrocito (que tienen muchas de las características de los condrocitos, aunque no todas) y material intracelular (por ejemplo, colágeno de Tipo I, II, IX y XI), proteoglicanos (por ejemplo, proteoglicanos de sulfato de condroitina, sulfato de queratano y sulfato de dermatano) y otras proteínas. Cartílago incluye cartílago articular y no articular.

El “cartílago articular”, también denominado cartílago hialino, se refiere a un tejido conectivo avascular no mineralizado que recubre las superficies articulares de los huesos en las articulaciones y que actúa como interfaz reductora de la fricción entre dos superficies óseas opuestas. El cartílago articular permite el movimiento en las articulaciones sin que exista un contacto directo hueso a hueso. El cartílago articular no tiene tendencia a la osificación. La superficie cartilaginosa macroscópicamente tiene apariencia suave y perlada, y vista a gran aumento es finamente granular. El cartílago articular deriva nutrientes parcialmente de los vasos de la membrana sinovial circundante y parcialmente de los vasos del hueso que recubre. El cartílago articular está asociado a la presencia de colágeno de Tipo II y de Tipo IX y de varios proteoglicanos bien caracterizados, y a la ausencia de colágeno de Tipo X, que está asociado a la formación ósea endocronal. Para una descripción detallada de la microestructura de cartílago articular, véase, por ejemplo, Aydelotte y Kuettner, Conn. Tiss. Res., 18, página 205 (1988); Zanetti y col.,

J. Cell Biol., 101, página 53 (1985); y Poole y col., J. Anat., 138, página 13 (1984).

“Cartílago no articular” se refiere a cartílago que no recubre superficies articulantes e incluye fibrocartílago (que incluye fibrocartílago interarticular, disco fibrocartilaginoso, fibrocartílago conector y fibrocartílago cincunferencial) y cartílago elástico. En el fibrocartílago, la red de micropolisacáridos está entrelazada con lazos prominentes de colágeno y los condrocitos están dispersos más ampliamente que en el hialino o cartílago articular. El fibrocartílago interarticular se encuentra en articulaciones que están expuestas a contusiones y sometidas a movimiento frecuente, por ejemplo el menisco de la rodilla. Los ejemplos de dichas articulaciones incluyen, aunque sin limitación, las articulaciones temporo-mandibular, esterno-clavicular, acromio-clavicular, muñeca y rodilla. Mediante discos de fibrocartílago se forma articulaciones cartilaginosas secundarias. Dichos discos fibrocartilaginosos, que se adhieren íntimamente a ambas superficies opuestas, están compuestos por anillos concéntricos de tejido fibroso, con láminas cartilaginosas interpuestas. Un ejemplo de dichos discos cartilaginosos es el disco intervertebral de la espina. El fibrocartílago conector se interpone entre las superficies óseas de las articulaciones que permiten una ligera movilidad, como entre los cuerpos de las vértebras y entre los huesos del pubis. El fibrocartílago cincunferencial rodea el margen de algunas cavidades articulares tales como la cavidad cotiloidea de la cadera y la cavidad glenoidea del hombro.

El cartílago elástico contiene fibras de colágeno que son histológicamente similares a fibras de elastina. Este tipo de cartílago se encuentra en la aurícula del oído externo, en las trompas de Eustaquio, en la laringe cornícula y en la epiglotis. Como con todos los cartílagos, el cartílago elástico también contiene condrocitos y una matriz, estando esta última extendida por todas direcciones, mediante una red de fibras elásticas amarillas, que se ramifican y anastomosizan en todas las direcciones excepto inmediatamente alrededor de cada célula, en donde existe una cantidad variable de sustancia intercelular hialina no fibrilada.

La expresión “fluido sinovial” se refiere a una sustancia lubricante fina dentro de la cavidad sinovial que reduce la fricción dentro de la articulación.

El término “defecto” o “zona de defecto” se refiere a una disrupción del tejido condral u osteocondral. Un defecto puede asumir la configuración de un “vacío”, por el que se entiende un defecto tri-dimensional tal como, por ejemplo, un hueco, cavidad, agujero y otra disrupción sustancial de la integridad estructural del tejido condral u osteocondral. Un defecto también puede ser una separación del cartílago de su punto de unión con el hueso o con ligamentos. En determinadas realizaciones, el defecto es tal que es incapaz de una reparación endógena o espontánea. Un defecto puede ser el resultado de un accidente, una enfermedad y/o una manipulación quirúrgica. Por ejemplo, los defectos de cartílago pueden ser el resultado de un trauma en una articulación, tal como el desplazamiento de tejido de menisco rasgado dentro de la articulación. Los defectos de cartílago también pueden ser el resultado de enfermedades degenerativas de la articulación, tales como la osteoartritis.

El término “reparar” se refiere a la formación de nuevo cartílago que es suficiente para rellenar al menos parcialmente el vacío o la discontinuidad estructural en la zona del defecto. La reparación no significa, sin embargo, un proceso de curación completa o tratamiento que es 100% efectivo para restaurar un defecto a su estado fisiológico/estructural/mecánico pre-defecto.

La expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a una cantidad efectiva para reparar, regenerar, promover, acelerar, prevenir la degradación, o para formar tejido cartilaginoso.

El término “paciente” se refiere a un animal que incluye un mamífero (por ejemplo, un humano).

La expresión “proteína morfogénica” se refiere a una proteína que tiene actividad morfogénica. Preferiblemente, una proteína morfogénica de esta invención comprende al menos un polipéptido que pertenece a la familia de proteínas BMP. Las proteínas morfogénicas incluyen proteínas osteogénicas. Las proteínas morfogénicas pueden ser capaces de inducir a células progenitoras a proliferar y/o a iniciar mecanismos de diferenciación que conduzcan a la formación de tejido cartilaginoso, óseo, tendinoso, ligamentoso o de otro tipo, dependiendo del entorno local, y de por tanto las proteínas morfogénicas pueden comportarse de forma diferente en diferentes entornos. Por ejemplo, una proteína morfogénica puede inducir tejido óseo en una zona de tratamiento y tejido cartilaginoso en una zona de tratamiento diferente.

La expresión “proteína morfogénica ósea (BMP)” se refiere a una proteína que pertenece a la familia BMP de la superfamilia de proteínas TGF-β (familia BMP) en base a homología de secuencia de ADN y de aminoácidos. Una proteína pertenece a la familia BMP de acuerdo con esta invención cuanto tiene al menos un 50% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos un miembro conocido de la familia de BMP dentro del dominio conservado C-terminal rico en cisteína, que es característico de la familia de proteínas BMP. Preferiblemente, la proteína tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos un miembro conocido de la familia BMP en el dominio conservado C-terminal rico en cisteína. Los miembros de la familia BMP pueden tener menos del 50% de identidad global de secuencia de ADN o de aminoácidos. La proteína osteogénica tal como se define también en la presente memoria es competente para inducir la formación de cartílago articular en una localización avascular apropiada in vivo.

La expresión “homología de secuencia de aminoácidos” se entiende que incluye tanto identidad como similitud de secuencia de aminoácidos. Las secuencias homólogas comparten residuos de aminoácidos idénticos y/o similares, en donde los residuos similares son sustituciones conservadoras, o “mutaciones puntuales permitidas”, correspondientes a residuos de aminoácido en una secuencia de referencia alineada. Por tanto, una secuencia de polipéptido candidata que comparte un 70% de homología de aminoácido con una secuencia de referencia es aquella en la que el 70% de los residuos alineados son idénticos o sustituciones conservadoras de los correspondientes residuos en una secuencia de referencia. Algunos polipéptidos morfogénicos particularmente preferidos comparten al menos un 60%, y preferiblemente un 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos C-terminales 102-106, que definen el dominio conservado de siete cisteínas de la OP-1 humana y proteínas relacionadas.

Se puede determinar la homología de secuencia de aminoácidos mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar el porcentaje de homología de una secuencia de aminoácidos candidata con respecto a la secuencia del dominio de siete cisteínas, primero se alinean las dos secuencias. El alineamiento se puede hacer con, por ejemplo, el algoritmo de programación dinámica descrito en Needleman y col., J. Mol. Biol., 48, página 443 (1970), y el programa Align, un paquete de software comercial producido por DNAstar, Inc. Un alineamiento inicial puede refinarse mediante la comparación con un alineamiento multi-secuencia de una familia de proteínas relacionadas. Una vez que el alineamiento ha sido ejecutado y refinado, se calcula una puntuación de porcentaje de homología. Los residuos de aminoácido alineados de las dos secuencias se comparan secuencialmente para determinar la similitud entre otros. Los factores de similitud incluyen un tamaño, forma y carga eléctrica similares. Un método particularmente preferido para determinar similitudes de aminoácidos es la matriz PAM250 descrita en Dayhoff y col., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, páginas 345-352 (1978 y Sup.). Primero se calcula una puntuación de similitud como la suma de las puntuaciones de similitudes de aminoácidos alineadas par a par. Para los propósitos de porcentaje de homología e identidad, se ignoran las inserciones y las eliminaciones. Por consiguiente, en este cálculo no se emplean penalizaciones por huecos. La puntuación obtenida es normalizada a continuación dividiéndola por la media geométrica de las puntuaciones de la secuencia candidata y el dominio de siete cisteínas. La media geométrica es la raíz cuadrada del producto de estas puntuaciones. La puntuación normalizada sin refinar es el porcentaje de homología.

La expresión “sustituciones conservadoras” se refiere a residuos que son física o funcionalmente similares a los correspondientes residuos de referencia. Es decir, una sustitución conservadora y su residuo de referencia tienen similar tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas que incluyen la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares. Las sustituciones conservadoras preferidas son aquellas que cumplen los criterios definidos para una mutación puntual aceptada en Dayhoff y col., ver más arriba. Los ejemplos de sustituciones conservadoras son sustituciones que entran en los siguientes grupos: (a) valina, glicina; (b) glicina, alanina; (c) valina, isoleucina, leucina; (d) ácido aspártico, ácido glutámico; (e) asparagina, glutamina; (f) serina, treonina; (g) lisina, arginina, metionina; y (h) fenilalanina, tirosina. La expresión “variante conservadora” o “variación conservadora” también incluye el uso de un residuo de aminoácido sustituyente en lugar de un residuo de aminoácido presente en una secuencia de aminoácidos original dada, en donde los anticuerpos específicos para la secuencia original también son específicos, es decir dan lugar a “reacción cruzada” o “reacción inmune”, para la secuencia de polipéptido sustituida resultante.

La expresión “proteína osteogénica (PO)” se refiere a una proteína morfogénica que es capaz de inducir que una célula progenitora forme cartílago y/o hueso. El hueso puede ser hueso intramembranoso o hueso endocronal. La mayoría de las proteínas osteogénicas son miembros de la familia de proteínas BMP y por tanto también son BMPs. Tal como se ha descrito en otro punto de la presente memoria, la clase de proteínas está tipificada por la proteína osteogénica humana (hOP-1). La proteína osteogénica útil para la práctica de la invención es una forma osteogénicamente activa de la OP-1 y las variantes de secuencia de aminoácidos de la misma. La OP-1 adecuada para su utilización en la invención de los solicitantes puede ser identificada por medio de experimentación rutinaria usando el bioensayo reconocido en la técnica descrito por Reddi y Sampath (Sampath y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 84, páginas 7109-13).

Composiciones para el crecimiento y la reparación de cartílago y sus usos

Las composiciones pueden usarse para la reparación de cartílago (por ejemplo, en una articulación o un menisco). Las composiciones que comprenden OP-1 descritas en la presente memoria permitirán al médico correspondiente tratar una serie de lesiones de tejido, afecciones y trastornos degenerativos o de enfermedad de tejido que pueden aliviarse o remediarse mediante una regeneración o reparación de tejido localizada estimulada.

La invención proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de lesiones de tejido cartilaginoso y de enfermedades o trastornos degenerativos de cartílagos que incluyen, aunque sin limitación, osteoartritis, desgarros de menisco y lesiones de LCA.

En algunas realizaciones, la invención proporciona composiciones para su uso para reparar o regenerar cartílago en una zona de defecto de cartílago en un paciente. La invención también proporciona composiciones para uso para producir cartílago, promover el crecimiento de cartílago acelerando la formación de cartílago en una zona de defecto de cartílago, y para uso en la prevención de la degradación de cartílago en un paciente.

La composición para uso en la presente invención está destinada a ser administrada en el fluido sinovial que rodea al cartílago. En algunas realizaciones, el cartílago es cartílago articular. En otras realizaciones, el cartílago es cartílago no articular. En algunas realizaciones, el cartílago no articular incluye, aunque sin limitación, menisco interarticular.

Familia de proteínas morfogénicas de hueso

La familia BMP, llamada así por los miembros representativos de familia de proteínas morfogénicas/osteogénicas, pertenece a la superfamilia de proteínas TGF-β. De las “BMPs” conocidas (BMP-1 a BMP-18), aisladas principalmente en base a homología de secuencia, todas excepto la BMP-1 están clasificadas como miembros de la familia BMP de proteínas morfogénicas (Ozkaynak y col., EMBO J., 9, páginas 2085-93 (1990)).

La familia BMP incluye otros miembros estructuralmente relacionados que son proteínas morfogénicas, que incluyen los productos de complejo génico decapentaplégico (DPP) de drosophila, el producto Vg1 de Xenopus laevis y su homólogo murino, Vgr-1 (véase, por ejemplo, Massagué, Annu. Rev. Cell Biol., 6, páginas 597-641 (1990)).

Los dominios C-terminales de BMP-3, BMP-5, BMP-6 y OP-1 (BMP-7) son idénticos en aproximadamente un 60% al de la BMP-2, y los dominios C-terminales de BMP-6 y OP-1 son idénticos en un 87%. LABMP-6 es probablemente el homólogo humano de la Vgr-1 murina (Lyons y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, páginas 4554-59 (1989)); las dos proteínas son idénticas en un 92% en general a nivel de secuencia de aminoácidos (Patente de EE.UU. Nº 5.459.047). La BMP-6 es idéntica en un 58% al producto Vg-1 de Xenopus.

Propiedades bioquímicas estructurales y funcionales de las proteínas morfogénicas de hueso

Los morfógenos óseos naturales comparten una homología de secuencia de aminoácidos sustancial en sus regiones (dominios) C-terminales. Habitualmente, las proteínas osteogénicas naturales mencionadas anteriormente son traducidas como un precursor, que tiene una secuencia de péptido señal N-terminal típicamente de menos de aproximadamente 30 residuos, seguida de un dominio “pro” que es separado para producir el dominio C-terminal maduro de aproximadamente 97-106 aminoácidos. El péptido señal es separado rápidamente en la traducción, en una zona de ruptura que puede predecirse para una secuencia dada usando el método de Von Heijne, Nucleic Acids Research, 14, páginas 4683-4691 (1986). El dominio pro típicamente es aproximadamente tres veces más grande que el domino C-terminal maduro completamente procesado.

Otra característica de los miembros de la familia de proteínas BMP es su aparente capacidad para dimerizar. Se han encontrado varias proteínas osteogénicas (OPs) derivadas de hueso y BMPs en forma de homo y heterodímeros en sus formas activas. La capacidad de las OPs y de las BMPs para formar heterodímeros puede conferir capacidades inductivas morfogénicas adicionales o alteradas en las proteínas morfogénicas. Los heterodímeros pueden exhibir afinidades de unión cualitativa o cuantitativamente diferentes a los homodímeros para las moléculas receptoras de OP y BMP. Unas afinidades de unión alteradas pueden conducir a su vez a una activación diferencial de los receptores que median en diferentes mecanismos de señalización, lo que en definitiva conduce a diferentes actividades o productos biológicos. Las afinidades de unión alteradas también pueden manifestarse de un modo específico del tipo de tejido o célula, induciendo de este modo que sólo unos tipos concretos de células progenitoras se vean sometidas a proliferación y/o diferenciación.

El polipéptido de OP-1, tal como se usa en la presente memoria, comparte una relación definida con una secuencia presente en la OP-1 humana osteogénicamente activa, la SEC ID Nº: 1 (Véase la Figura 1). La OP-1, tal como se usa en la presente memoria, comparte una relación definida con al menos el dominio C-terminal de seis cisteínas de la OP-1 humana, los residuos 335-431 de la SEC ID Nº: 1, en particular con al menos el dominio C-terminal de siete cisteínas de la OP-1 humana, los residuos 330-431 de la SEC ID Nº: 1.

Se ha descrito la proteína osteogénica OP-1 (véase, por ejemplo, Oppermann y col., Patente de EE.UU. Nº 5.354.557). La proteína de origen natural en su forma nativa madura es un dímero glicosilado que típicamente presenta un peso molecular aparente de aproximadamente 30-36 kDa, según se determina mediante SDS-PAGE. Cuando se reduce, la proteína de 30 kDa da lugar a dos subunidades peptídicas glicosiladas que tienen pesos moleculares aparentes de aproximadamente 16 kDa y 18 kDa. En el estado reducido, la proteína no presenta actividad osteogénica detectable. La proteína no glicosilada, que también presenta actividad osteogénica, tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 27 kDa. Cuando se reduce, la proteína de 27 kDa da lugar a dos polipéptidos no glicosilados que tienen pesos moleculares de aproximadamente 14 kDa a 16 kDa, capaces de inducir la formación de hueso endocondral en un mamífero. La OP-1, tal como se usa en la presente memoria, puede incluir formas que tienen estructuras de glicosilación que varían, extremos N que varían y formas truncadas o mutadas de la proteína nativa.

Las publicaciones que describen secuencias de OP-1, así como sus propiedades químicas y físicas, incluyen: Patente de EE.UU. Nº 5.011.691; Patente de EE.UU. Nº 5.266.683; Ozkaynak y col., EMBO J., 9, páginas 20852093 (1990).

En otra realización de esta invención, la proteína OP-1 puede prepararse sintéticamente para inducir la formación de tejido. La OP-1 preparada sintéticamente puede ser una proteína nativa o puede ser una proteína no nativa, es decir, una que no se encuentra en la naturaleza.

En una realización preferida de esta invención, la proteína OP-1 comprende un par de subunidades de OP-1 unidas por puentes de disulfuro para producir una especie dimérica. En otra realización preferida de esta invención, la proteína OP-1 comprende un par de subunidades de OP-1 que producen una especie dimérica formada mediante interacciones no covalentes. Las interacciones no covalentes incluyen interacciones de Van der Waals, enlaces de hidrógeno e interacciones electrostáticas.

Como se ha indicado anteriormente, la OP-1 útil en la presente invención generalmente es una proteína dimérica que comprende un par plegado de polipéptidos. Dicha OP-1 es inactiva cuando está reducida, pero es activa en forma de homodímero oxidado. En algunas realizaciones, la OP-1 es un monómero.

La OP-1 útil en la presente invención incluye cualquier OP-1, tanto aislada a partir de fuentes naturales como producida mediante técnicas recombinantes de ADN u otras técnicas sintéticas, e incluye las variantes de contrapartida filogenética y alélica de dicha proteína, así como las muteínas de las misma y diversas construcciones truncadas y de fusión. También se contempla que los mutantes de eliminación o adición son activos, incluyendo aquellos que pueden alterar el dominio conservado C-terminal de seis o siete cisteínas, siempre que la alteración no afecte funcionalmente a la relación entre dichas cisteínas en la estructura plegada. Por consiguiente, dichas formas activas son consideradas equivalentes a la OP-1 descrita específicamente en la presente memoria. La OP-1 puede incluir formas que tienen estructuras de glicosilación variables, extremos N variables, una familia de proteínas relacionadas que presentan regiones de homología de secuencia de aminoácidos y formas activas truncadas o mutadas de proteínas nativas o biosintéticas, producidas mediante la expresión de ADN recombinante en células hospedantes.

La OP-1 contemplada en la presente memoria puede ser expresada a partir de ADNc intacto o truncado o a partir de ADNs sintéticos en células hospedantes procarióticas o eucarióticas, y puede purificarse, dividirse, replegarse y dimerizarse para formar composiciones morfogénicamente activas. Las células hospedantes preferidas actualmente incluyen, sin limitación, procariontes que incluyen E. coli o ecuariontes que incluyen células de levadura o de mamífero, tales como células CHO, COS ó BSC. El especialista en la técnica apreciará que se pueden usar otras células hospedantes para obtener ventaja. Las descripciones detalladas de la OP-1 útil en la práctica de esta invención, incluyendo cómo prepararla, usarla y probarla para determinar su actividad osteogénica, se describen en numerosas publicaciones, que incluyen las Patentes de EE.UU. Nº 5.266.683 y 5.011.691, así como en cualquiera de las publicaciones citadas en la presente memoria.

Por tanto, a la vista de esta descripción y del conocimiento disponible en la técnica, los ingenieros genéticos especialistas pueden aislar genes procedentes de ADNc o de bibliotecas genómicas de diferentes especies biológicas, que codifican secuencias de aminoácido apropiadas, o pueden construir ADNs a partir de oligonucleótidos, y a continuación pueden expresarlos en varios tipos de células hospedantes, que incluyen tanto procariontes como eucariontes, para producir grandes cantidades de proteínas activas capaces de estimular la morfogénesis de hueso y cartílago en un mamífero.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas que comprenden OP-1 pueden ser una disolución líquida o una suspensión líquida. Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con esta invención son para ser administradas al fluido sinovial.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden OP-1 pueden, por ejemplo, incluirse en formulaciones esterilizadas isotónicas. La formulación es líquida.

Las composiciones para su uso de acuerdo con esta invención son formulaciones de liberación sostenida, formulaciones de administración lenta, formulaciones mediante las cuales se retarda la eliminación de la proteína morfogénica. Existen numerosos materiales de administración disponibles para preparar estas composiciones. Incluyen, aunque sin limitación, microesferas de polímeros de ácido poliláctico/poliglicólico, liposomas, colágeno, polietilen glicol (PEG), matrices de ácido hialurónico/fibrina, ácido hialurónico, fibrina, quitosán, gelatina, Sistema SABERTM (isobutirato de acetato de sacarosa (SAIB)), DURINTM (polímero biodegradable para implantes cargados de fármaco), MICRODURTM (polímeros biodegradables/microencapsulación) y DUROSTM (bomba mini-osmótica). En algunas realizaciones, la proteína morfogénica está ligada covalentemente al material de administración.

Las composiciones para su uso de acuerdo con esta invención contienen OP-1 dispersa en un material portador biocompatible que actúan como un sistema de administración adecuado para los compuestos. Los ejemplos adecuados de vehículos de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables. Las matrices de liberación sostenida implantables o microcapsulares incluyen poliláctidos (Patente de EE.UU. Nº 3.773.319; EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman y col., Biopolymers, 22, páginas 54756 (1985)); poli(2-hidroxietil-metacrilato), etilen vinil acetato (Langer y col., J. Biomed. Mater. Res., 15, páginas 167277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12, páginas 98-105 (1982)) o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988), ácido poliláctico, ácido poliglicólico o los polímeros de los mismos.

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con esta invención también pueden administrarse usando, por ejemplo, microesferas, liposomas, otros sistemas de administración microparticulados o formulaciones de liberación sostenida colocadas dentro, cerca o en comunicación con los tejidos afectados, los fluidos que bañan dichos tejidos (por ejemplo, fluido sinovial) o el torrente sanguíneo que baña dichos tejidos.

Se pueden preparar liposomas que contengan OP-1 mediante métodos bien conocidos (véase, por ejemplo, DE 3.218.121; Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, páginas 3688-92 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, páginas 4030-34 (1980); Patentes de EE.UU. Nº 4.485.045 y 4.544.545). De forma ordinaria, los liposomas son de tipo unilamelar pequeños (aproximadamente 200-800 Angstroms), en donde el contenido lipídico es superior al aproximadamente el 30% molar de colesterol. La proporción de colesterol se selecciona para controlar la velocidad óptima de liberación de la proteína morfogénica.

La OP-1 usa en esta invención también puede ligarse a liposomas. La unión de OP-1 a liposomas puede llevarse a cabo mediante cualquier agente reticulante conocido tal como agentes reticulantes heterobifuncionales que han sido utilizados ampliamente para acoplar toxinas o agentes quimioterapéuticos a anticuerpos para una administración dirigida. La conjugación a liposomas también puede llevarse a cabo usando el reactivo reticulante dirigido a

5 carbohidratos hidrazide de ácido 4-(4-maleimidofenil)-butírico (MPBH) (Duzgunes y col., J. Cell. Biochem. Abst. Suppl. 16E 77 (1992)).

El especialista en la técnica puede crear una formulación biocompatible y/o biodegradable seleccionada para promover la inducción de tejido.

Un vehículo válido para OP-1 debería llevar a cabo varias funciones importantes. Debería actuar como un sistema

10 de administración lenta de OP-1 o de eliminación retardada de la proteína morfogénica, y proteger la proteína morfogénica frente a proteólisis no específica.

Adicionalmente, los materiales seleccionados deben ser compatibles in vivo y preferiblemente deben ser biodegradables. El ácido poliláctico (PLA), el ácido poliglicólico (PGA) y las diversas combinaciones presentan diferentes velocidades de disolución in vivo.

15 El vehículo también puede adoptar la forma de un hidrogel. Cuando el material vehículo comprende un hidrogel, se refiere a una red tridimensional de polímeros hidrofílicos reticulados en la forma de un gel compuesto sustancialmente por agua, preferiblemente, aunque sin limitación, geles que tengan más de un 90% de agua. El hidrogel puede tener carga neta positiva o carga neta negativa, o puede ser neutro. Un hidrogel típico con carga neta negativa puede caracterizarse por componentes de la matriz extracelular tales como colágeno y laminina. Los

20 ejemplos de componentes de matriz extracelular disponibles comercialmente incluyen MatrigelTM y VitrogenTM. Un ejemplo de un hidrogel de carga neutra es el óxido de polietileno altamente reticulado o el polivinilalcohol.

Niveles de dosificación de entre aproximadamente 1 µg y aproximadamente 1000 µg al día, preferiblemente de entre 3 µg y 50 µg al día, de OP-1 son útiles para la reparación y regeneración de cartílago. Como apreciará el especialista en la técnica, pueden requerirse niveles de dosis inferiores o superiores a los indicados. La dosificación

25 y los regímenes de tratamiento específicos para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores, que incluyen la actividad de la proteína morfogénica específica empleada, de la edad, del peso corporal, del estado general de salud, del sexo, de la dieta, del tiempo de administración, de la velocidad de excreción, de la combinación de fármacos, de la gravedad del daño del tejido y del juicio del médico responsable.

EJEMPLO 1: Reparación de defectos osteocondrales en el modelo de perro

30 Se someterá a cirugía a 12 perros macho adultos criados expresamente para este propósito. Ambas extremidades traseras se prepararán y se cubrirán de un modo estéril. Se hará una incisión pararotular media de aproximadamente cuatro centímetros de longitud. Se retraerá lateralmente la rótula para exponer el cóndilo femoral. En el cóndilo medio derecho se creará un defecto de 5,0 mm de diámetro que se extienda a través de la capa de cartílago y que penetre en el hueso subcondral hasta una profundidad de 6 mm en la región central de carga del

35 cóndilo femoral con una broca de perforación especialmente diseñada o modificada de 5,0 mm. Los animales se dividirán en dos grupos de 6 animales cada uno. En el primer grupo, tras una irrigación copiosa con disolución salina para eliminar los trozos y las células de médula liberadas, se aplicará la OP-1 de tiempo de liberación apropiado al fluido sinovial que rodea al defecto. En el primer grupo de 6 animales, los defectos de la derecha recibirán la OP-1 de liberación con el tiempo. La extremidad izquierda de todos los animales servirá como control que recibe partículas

40 de control (0% de OP-1).

El segundo grupo de 6 animales no recibirá tratamiento con OP-1 en el momento de la cirugía. A los 3 días de la cirugía, se inyectará la formulación apropiada de OP-1 de liberación con el tiempo en el fluido sinovial que rodea a la articulación con el defecto. En los 6 animales se inyectará la OP-1 de liberación con el tiempo en el fluido sinovial alrededor del defecto derecho. La extremidad izquierda de todos los animales servirá como control que recibe

45 partículas de control (0% de OP-1).

Los animales serán sacrificados a las 16 semanas de la cirugía. En el sacrificio se extraerán los fémures distales como una unidad y las zonas de defecto se evaluarán histológicamente y en conjunto en base al esquema de Moran y col. (J. Bone Joint Surg. 74B: 659-667, 1992) que se ha usado en investigaciones previas.

Se tomarán radiografías de las extremidades traseras antes de operar, inmediatamente después de operar y en la

50 semana 16 del postoperatorio. Las radiografías preoperatorias se usarán para asegurar que no había anormalidades preexistentes y para verificar la madurez esqueletal. Las radiografías postoperatorias se usarán para determinar el lugar del defecto. Las radiografías de sacrificio se usarán para determinar la velocidad de curación y restauración del hueso subcondral y de la superficie articular. Las radiografías se tomarán en una misma semana desde la fecha de evaluación.

El examen patológico general de los cadáveres se llevará a cabo inmediatamente después del sacrificio. Se extraerán inmediatamente los fémures distales como una unidad y se almacenarán en toallas empapadas en disolución salina y se colocarán en bolsas de plástico etiquetadas. Se tomarán fotografías de alta resolución de las zonas de defecto y etiquetarán cuidadosamente.

Los tejidos blandos serán extirpados de la zona de defecto mediante disección meticulosa y se extraerá el extremo proximal del fémur. Con una sierra de diamante refrigerada con agua se aislará cada zona de defecto para la evaluación histológica.

Los especímenes se fijarán mediante inmersión en una disolución de paraformaldehído al 4% y se prepararán para el procesado histológico descalcificado. Se cortarán tres secciones de tres niveles de cada bloque. Los niveles 1 y 3 serán los más próximos al perímetro del defecto. El nivel 2 estará localizado en el centro del defecto. Se teñirán tres secciones de cada nivel con azul de toluidina y Safranin O y verde rápido. Las secciones se graduarán en base al esquema de Moran y col. (J. Bone Joint Surg. 74B: 659-667, 1992).

Es de esperar que los animales tratados con OP-1 exhiban una reparación mejorada de los defectos osteocondrales en comparación con los animales de control.

EJEMPLO 2: Modelo de oveja de regeneración de defectos condrales mediante administración intraarticular de OP-1 en microesferas de liberación con el tiempo

Se someterá a cirugía a 18 ovejas adultas criadas expresamente para este fin. Con un instrumento especialmente diseñado, se creará un defecto condral de 10 mm en la rodilla de la extremidad trasera izquierda de las 18 ovejas en la superficie del cóndilo que soporta la carga de peso, de 2 mm de profundidad sobre la capa calcificada (la exposición de sangre se considerará un fallo). Las rodillas derechas de todos los animales se mantendrán intactas para actuar como control.

Grupo 1 (6 animales): en el día 3 del postoperatorio, la rodilla izquierda de cada animal recibirá una inyección intraarticular de una suspensión de 250 µL que contiene 57 mg de microesferas al 0,3% de control sin OP-1.

Grupo 2 (6 animales): en el día 3 del postoperatorio, la rodilla izquierda de cada animal recibirá una inyección intraarticular de una suspensión de 250 µL que contienen 57 mg de microesferas al 0,3% que contienen 170 µg de OP-1.

Grupo 3 (6 animales): en el día 3 del postoperatorio y en la semana 6 del postoperatorio, la rodilla izquierda de cada animal recibirá una inyección intraarticular de una suspensión de 250 µL que contiene 57 mg de microesferas al 0,3% que contienen 170 µg de OP-1.

La evaluación artroscópica de las rodillas se llevará a cabo en las semanas 3 y 6 del postoperatorio para todos los animales. Se realizarán escáneres de RMN/IRM en las semanas 3 y 6 del postoperatorio. También se llevará a cabo periódicamente una evaluación mecánica de las rodillas.

Todos los animales serán sacrificados en el mes 3 del postoperatorio. Tras el sacrificio se realizará una histología, una histomorfometría, una inmunotinción y una hibridación in situ para determinar marcadores específicos de condrocitos articulares. Es de esperar que las rodillas tratadas con OP-1 exhiban una regeneración mejorada respecto a las rodillas de control.

EJEMPLO 3: Modelo de oveja para la prevención de osteoartritis

Se usan ovejas como modelo para la osteoartritis porque se ha demostrado que en estos animales se produce una osteoartritis progresiva después de un impacto de lesión sencilla. En este estudio se utilizaron doce ovejas hembra adultas cruzadas que fueron aclimatadas durante 14 días. Todas las ovejas recibieron anestesia general y, usando técnicas asépticas, se practicó una artrotomía de 3 cm para permitir el acceso a ambas articulaciones femorotibiales. Se usó un mecanismo mecánico de muelle cargado para crear lesiones de impacto bilateral en la región de carga de peso del cóndilo femoral medio (30 MPa, diámetro de 6 mm x 2) (véase la figura 1). Tras una sutura rutinaria de las incisiones, las ovejas recibieron una inyección intra-articular en cada rodilla de OP-1 en un vehículo de colágeno y carboximetilcelulosa (Implante de OP-1, 340 µg) o vehículo solo. Se usaron dos grupos experimentales (N=6). El grupo A recibió 0,3 mL de OP-1 + colágeno + carboximetilcelulosa intra-articularmente en una rodilla en el momento de la cirugía (día 0) y una semana después (día 7). Las inyecciones del día 0 se administraron inmediatamente después del cierre de la incisión quirúrgica. El grupo B recibió OP-1 en una rodilla en los días 0, 7, 14, 21 y 35. Se aspiró el fluido sinovial antes de la inyección de la OP-1 y vehículo para permitir la medida de los valores de leucocitos y de proteína total como indicadores de inflamación. El tratamiento con OP-1 redujo significativamente los leucocitos en el fluido sinovial 1 semana después de la operación (p<0.003, ensayo T emparejado) pero no la concentración total de proteínas (véase la figura 2).

Las ovejas fueron sacrificadas 12 semanas después de la operación para una evaluación detallada (tinción paravital, tinción TUNEL, histopatología, cartílago, análisis GAG sulfatado, ensayo de indentación biomecánica) de los tejidos articulares. El cartílago anormal (captación de tinta de India) fue significativamente diferente entre los grupos (p<0.03) debido a que las lesiones en las rodillas de OP-1 a menudo se limitaban a un brillo/reflectividad reducido, mientras que las articulaciones de control presentaban áreas de fibrilación o erosión (véase la tabla 1).

Tabla 1

Cartílago anormal %1

Animal

Vehículo OP-1

28

20 5

29

40 20

30

60 0

31

50 20

32

70 10

33

25 10

1 A partir de captación de tinta de India sobre la superficie de la articulación, fotografía digital, medidas de área

escaladas usando el software de morfometría Northern EclipseTM.

Las secciones histológicas mostraron agrupaciones de condrocitos, matriz acelular y pérdida de cartílago en las

10 articulaciones tratadas con vehículo (figura 3A), mientras que las lesiones en articulaciones tratadas con OP-1 (figura 3B) consistieron en una pérdida de condrocitos en la zona superficial y/o pequeñas fisuras. La puntuación de histología Mankin no fue significativamente diferente (p<0,06, Wilcoxon Signed Rank Test), pero el sistema de puntuación OARSI, que es sensible al tamaño de la lesión, demostró ser valioso (p<0,03) (ver tabla 2) (van der Sluijs

J. y col., The reliability of the Mankin score for osteoarthritis. Ortho Res 1992, 10: 58-61).

15 Tabla 2

Puntuación Mankin modificada 1

Puntuación OARSI 2

Animal

Vehículo OP-1 Vehículo OP-1

28

4 2 6 2

29

4 2 8 1,5

30

4 2 8 1

31

5 1 12 5

32

4 3 13,5 4

33

6 3 10 4

1 La puntuación Mankin modificada está entre 0 y 13, siendo 0 cartílago normal. 2 Cálculo de la puntuación internacional de la Osteoarthritis Research Society = gravedad de la lesión x área con un máximo de 24 para una única lesión.

Las concentraciones de glicosaminoglicano sulfatado fueron superiores en el grupo tratado con OP-1 con una fuerte 20 tendencia hacia la significación estadística (p<0,06) (ver figura 4).

El grupo de colágeno/CMC solo dio como resultado fibrilaciones y erosión de la superficie, mientras que el grupo de OP-1 muestra poco o ningún daño (véase la figura 5). Las articulaciones tratadas con OP-1 parecen más sanas y brillantes que las de los controles.

Estos experimentos demuestran una clara mejora, si no la protección completa con dos inyecciones de OP-1.

25 Pequeñas lesiones pueden persistir tras la terapia debido a que se pueden producir defectos de grosor parcial de lesiones por impactos de 30 MPa que es improbable que se reparen completamente. La OP-1 fue capaz de suprimir la extensión centrífuga de los cambios degenerativos sobre el cóndilo femoral, mientras que las articulaciones tratadas con vehículo desarrollaron una osteoartritis unicompartimental. El mecanismo mediante el cual la OP-1 ejerce este efecto puede ser a través de sus propiedades anabólicas, que afecten a la reparación. Sin embargo,

30 había poco tejido reparado en las zonas de impacto, por lo que puede que otro mecanismo que promueve la supervivencia de condrocitos lesionados sea operativo. Estas observaciones indican que la OP-1 puede ser útil para otras aplicaciones tales como la ingeniería de tejidos y las terapias basadas en células, en donde la lesión puede producirse cuando las células son recolectadas o manejadas.

EJEMPLO 4: Modelo de oveja para el efecto terapéutico de OP-1 tras inyección intra-articular

Este estudio usará N=12 ovejas hembra adultas cruzadas de 1,5-2,5 años de edad que son aclimatadas durante 14 días y que pasan un reconocimiento de salud antes de pasar a formar parte del estudio. Con anestesia general y usando una técnica aséptica, todas las ovejas recibirán lesiones de impacto de 30 MPa estandarizadas en ambos (izquierdo y derecho) cóndilos femorales medios mediante una artrotomía de 3 cm mínimamente invasiva. Tres semanas después de la operación, las ovejas serán sedadas con diazepan (10 mg/kg) y quetamina (3-5 mg/kg) para permitir una preparación aséptica de la rodilla para sinoviocentesis e inyección del artículo en evaluación, placebo o disolución salina fisiológica en la articulación femorotibial media de acuerdo con la Tabla 3.

Tabla 3

Semana

0 3 4 8 12 16

Dosis

Grupo Nº de animales Nº de rodillas Cirugía Inyección intraarticular

Dos dosis 3 y 4 semanas después de lesión

Ensayo-L 9 9 Cirugía de impacto OP-1/P OP-1/P Sacrificio

Placebo-R

9 Placebo Placebo

Controles salinos

Control salino-R 3 6 Lesión de impacto Salino Salino Sacrificio

Control salino-L

Ninguno Ninguno

Animales totales en estudio

12

Aspiración de fluido sinovial

x x x x x x

10 R: extremidad derecha; L: extremidad izquierda.

Todas las ovejas recibirán lesiones en el cóndilo femoral medio bilateral. En el primer grupo de nueve ovejas, una rodilla recibirá el artículo de ensayo y la rodilla contralateral recibirá un placebo que consiste en el vehículo solo. Los tratamientos de rodilla recibirán disolución salina fisiológica USP como control para determinar el efecto del placebo.

15 El estudio seguirá el siguiente procedimiento establecido en la Tabla 4:

Tabla 4 EJEMPLO 5: Modelos de cobaya y conejo para osteoartritis

Día -14 a día -1

Pre-acondicionamiento, programa de mantenimiento de salud, recorte de pezuñas, ensayo de fiebre-Q

Semana 0 a semanas 3, 4

Cirugía y lesión de impacto en ambas rodillas de las ovejas. Recolección de fluido sinovial. El fluido sinovial recogido y OP-1 y placebo se inyectan en las respectivas articulaciones.

Semana 8, 12

Recolección de fluido sinovial usando técnicas asépticas y sedación. Congelación de 2 alícuotas de fluido sinovial (de 200 µL cada una) y procesado de una alícuota fresca de EDTA para el recuento de leucocitos totales, recuentos diferenciales y determinación de proteínas totales.

Semana 16

Sacrificar todas las ovejas. Recoger fluido sinovial y tejidos para inspección detallada.

Se utilizaron los modelos de osteoartritis de resección de LCA (inducida) de cobaya Hartley y de conejo. Catorce cobayas de 3, 6 ó 9 meses de edad fueron inyectadas en la rodilla derecha con una disolución salina tamponada de fosfato (PBS) que contenía 50 µg de rhOP-1 a intervalos de 3 semanas durante un periodo de 12 semanas. La rodilla izquierda sirvió como control sin tratamiento.

A diez conejos Blancos de Nueva Zelanda se les reseccionó el LCA izquierdo y recibieron una inyección en la articulación de 100 µg de rhOP-1 en una disolución de PBS o de una disolución de control a intervalos de 3 semanas durante un periodo de evaluación de 12 semanas. La rodilla derecha sirvió como control no tratado con LCA reseccionado para todos los animales.

Todos los animales de ambos modelos fueron evaluados en términos de apariencia general y de evidencias histológicas de cambios artríticos usando una escala Mankin modificada para graduar la gravedad de la degeneración. Las rodillas de cobayas sin tratar desarrollaron una progresión de cambios artríticos de 3 a 6, de 6 a 9 y de 9 a 12 meses de edad con una degeneración severa aparente global e histológicamente a los 12 meses de edad. El tratamiento con OP-1 presentó el efecto más profundo en la prevención de la degeneración en la cobaya en los periodos tempranos. La degeneración global e histológica en la rodilla a los 9 meses de edad en los animales tratados con rhOP-1 fue similar a los animales no tratados a los 6 meses de edad. A los 12 meses de edad, la gravedad de los cambios degenerativos era comparable. En el modelo de conejo con LCA reseccionado, el tratamiento con OP-1 mostró una ligera mejoría en la gravedad de la degeneración en las zonas tratadas en el periodo de evaluación de 12 semanas. Estos resultados demuestran que la OP-1 tiene algunos efectos beneficiosos para prevenir o frenar los cambios artríticos de la etapa inicial.

EJEMPLO 6: Modelo de oveja para curación de menisco

En cada menisco de ambas rodillas de las ovejas se creó un agujero (6 mm de diámetro) y un desgarro longitudinal (2 cm de largo) suturado mediante hilo no reabsorbible. Hubo dos grupos de tratamiento: de masilla de OP-1 (3,5 mg de OP-1/gramo de colágeno de tipo 1 bovino con carboximetilcelulosa) y un grupo de control sin ningún tratamiento más que el defecto creado quirúrgicamente. Los animales tratados con OP-1 recibieron 0,3 mL (350 µg) inyectados en el espacio articular antes de cerrar la incisión, y después fueron inyectados en el espacio articular 7 días después de la cirugía.

6, 12 y 26 semanas después del tratamiento, los animales serán sometidos a eutanasia. Tras la eutanasia, se extraerá el menisco y se cortará en dos partes, la anterior, con el desgarro longitudinal suturado, y la posterior, con el agujero. Las secciones serán teñidas con Tricromo de Masson y safranina O. También se puede llevar a cabo la inmunohistoquímica del menisco usando anticuerpos específicos para detectar colágeno I, II, VI, S100, proteasas MMP1.

Se separará una sección de menisco, se embeberá en OCT y se congelará en nitrógeno líquido. Las secciones obtenidas con un criostato se recolectarán, se homogeneizarán y se preparará el ARN usando reactivo Trizol. Se llevará a cabo RT-PCR para estudiar la expresión génica de varios marcadores que incluyen colágeno de tipo I, tipo II y agrecano con marcadores para matriz extracelular, TGF-β e IGF-2 como factores de crecimiento, MMP-1, MMP3 y TIMP-1 como enzimas degradadoras de matriz, y finalmente ciclina A, Bcl-2, BAX y caspasa 3 como marcadores para células proliferantes y en estado apoptótico. También se inspeccionará otro tejido de articulación y se comparará con controles para determinar cualquier diferencia global que pueda deberse a la OP-1.

Los resultados preliminares del efecto de masilla de OP-1 en los agujeros del área avascular del menisco indican que en todos los meniscos con defectos de agujero se observó un efecto positivo tras el tratamiento con masilla de OP-1. La masilla se mantuvo durante las primeras seis semanas, para después ser reabsorbida y desaparecer. Cabe destacar que se produjo una penetración notable de células desde la superficie del menisco hacia el interior de los agujeros, que se rellenaron principalmente con tejido fibroso desde la octava semana en adelante.

A las 6 semanas, la mayoría de los animales de control tenían poca materia rellenando los defectos, y la materia presente era fibrosa y tenue. En los defectos tratados con OP-1, había más tejido presente junto con colágeno particulado. La respuesta celular resultó ser mayor en el grupo de OP-1 (véase las figuras 6 y 7). A las 12 semanas, la mayoría de los defectos de control seguían vacíos. Se observó poca actividad celular en la periferia del defecto. Los defectos tratados con OP-1 todavía contenían partículas de colágeno, pero parecía haber un aumento de celularidad rodeando al defecto, y algo de progresión hacia la formación de nuevo tejido (véase la figura 8). Tras 25 semanas se observó la formación de puentes fibrosos en algunos de los animales de control, pero la mayoría eran de naturaleza tenue. Las partículas de colágeno desaparecieron de los defectos en el grupo de OP-1 y fueron reemplazadas predominantemente con tejido fibroso. La remodelación resultó seguir siendo activa (véase la figura 9).

Los resultados preliminares sobre el efecto de masilla de OP-1 en la reparación de meniscos con lesiones longitudinales no fueron concluyentes. Sólo se observaron diferencias pequeñas entre las lesiones tratadas con OP1 en comparación con el grupo de control. Esto podría deberse al hecho de que la sutura no proporciona una fijación adecuada, y que la proteína no se integra bien debido a la sutura. En unos pocos animales tratados con OP-1 se pudo observar la formación de puentes en el defecto (véase la figura 10).

EJEMPLO DE REFERENCIA 7: Modelo de oveja de reparación y regeneración de disco

La inducción experimental de defectos anulares exteriores controlados en ovejas inicia una secuencia de eventos que reproduce fielmente, patológica y bioquímicamente, la evolución de la degeneración de disco en el hombre. Los cambios de composición incluyen una alteración en la cantidad y en los tipos de colágenos sintetizados por las células en la zona de la lesión (Kaapa y col., 1994a, b, 1995, Kaapa E. y col. (1995) Collagen synthesis and types I, III, IV and VI collagens in an animal model of disc degeneration, Spine 20, 59-67; Kaapa E. y col., (1994) Collagens in the injured porcine intervertebral disc, J. Orthop. Res. 12, 93-102; y Kaapa E. y col., (1994) Proteoglycan chemistry in experimentally injured porcine intervertebral disk, J. Spin. Dis. 7, 296-306) pérdida de proteoglicanos de tipo agrecano de alta densidad boyante y una elevación de los niveles de los proteoglicanos pequeños sustituidos con DS, decorina y biglicano, en el disco lesionado (Melrose J. y col., (1992) A longitudinal study of the matrix changes induced in the intervertebral disc by surgical damage to the annulus fibrosus, J Orthop Res 10: 665-676; Melrose J. y col., (1997) Topographical variation in the catabolism of aggrecan in an ovine annular lesion model of experimental disc degeneration, J Spinal Disord 10: 55-67; y Melrose J. y col., (1997) Elevated synthesis of biglycan and decorin in an ovine annular lesion model of experimental disc degeneration, Eur Spine J 6: 376-84). Como consecuencia de la degeneración del disco, también se han anotado cambios en el suministro vascular a la placa final cartilaginosa (CEP, del inglés “cartilaginous end plate”) (Moore RJ y col., (1992) Changes in endplate vascularity after an outer anulus tear in the sheep, Spine 17: 874-878) y remodelación del hueso vertebral adyacente a los defectos anulares experimentales (Moore RJ y col., (1996) Remodeling of vertebral bone after outer anular injury in sheep, Spine 21: 936-940), cambios en la competencia biomecánica de discos afectados por lesión “reparados” (Latham JM y col., (1994) Mechanical consequences of annular tears and subsequent intervertebral disc degeneration, J Clin Biomech 9: 211-9), y cambios osteoartríticos en articulaciones de faceta espinal (Moore RJ y col., (1999) Osteoarthrosis of the facet joints resulting from annular rim lesions in sheep lumbar discs, Spine, 24: 519525).

A. El modelo ovino de lesión anular

Se someterá a ayuno a las ovejas desde 24 h antes de la cirugía y se inducirá anestesia con una inyección intravenosa de 1 g de tiopentona. Se tomará una placa de rayos-X plana lateral para verificar que la anatomía de espina lumbar es normal. Se mantendrá la anestesia general tras una intubación endotraqueal mediante halotano al 2,5% monitorizado mediante oximetría de pulso y medida de CO2 de marea final. Se preparará el flanco izquierdo desde las costillas hasta la cresta ilíaca para cirugía estéril. Las ovejas recibirán una inyección intramuscular de 1200 mg de penicilina. Se practicará una incisión cutánea sobre el lateral izquierdo inmediatamente anterior a los procesos inversos de la espina y se expondrá la espina lumbar mediante disección seca usando una técnica de separación del músculo anterior. Se respetará la anatomía vascular y neural y se controlarán las hemorragias mediante presión directa o electrocauterización, si fuera necesario.

Un total de doce ovejas de dos años de edad recibirán lesiones anulares controladas en sus discos L1-L2, L3-L4 y L5-L6 mediante incisión a través del ánulo fibroso anterolateral izquierdo paralela y adyacente a la placa final craneal usando un escalpelo del número 11 para crear una lesión que mide 4 mm de largo x 5 mm de profundidad. Los discos lumbares intervinientes (L2-L3, L4-L5) no se verán afectados por la incisión.

Los discos con incisión recibirán una de las siguientes 3 terapias, (I) sin tratamiento, (II) disolución de lactosa, o (III) lactosa que contiene OP-1. En todas las ovejas el disco L3-L4 se tratará con disolución de lactosa solamente y el disco L5-L6 se tratará con lactosa más OP-1. En las 4 ovejas restantes los tratamientos en los discos L1-L2 y L5-L6 se invertirán para evitar cualquier problema potencial asociado a nivel espinal. Debe quedar un disco sin operar entre los discos tratados para permitir un anclaje adecuado de FSUs en la evaluación mecánica posterior (ver más adelante). Se usará una sutura con cable para identificar el nivel craneal operado con fines de posterior identificación tanto en rayos X como en la identificación morfológica. También se usarán otros tres animales no operados como controles para el estudio biomecánico.

La degeneración producida por una incisión anular es bien conocida en ovejas (Osti OL y col., (1990) Volvo Award for Basic Science, Annulus tears and intervertebral disc degeneration. An experimental study using an animal model, Spine 15: 762-7) y es de esperar que muestra la primera evidencia radiográfica e histoquímica tras 12 semanas. Tres meses después de la inducción de las lesiones anulares, las ovejas serán sacrificadas mediante inyección intravenosa de 6,5 g de pentobarbitona sódica y las espinas lumbares serán radiografiadas para evaluar la calcificación de los discos, se extraerán mediante escisión y se procesarán para los análisis biomecánicos (n=8) e histoquímicos (n=4), y, después de la evaluación biomecánica los mismos discos serán diseccionados zonalmente para realizar análisis de composición.

B. Análisis de composición de los tejidos de los discos

Se diseccionarán zonalmente los tejidos de los discos intervertebrales en cuadrantes anulares y núcleos pulposos, tal como se indica en la Figura 11.

C. Determinación de los contenidos de proteoglicano y colágeno en los tejidos de disco

Se trocearán finamente muestras de ánulo fibroso y de núcleo pulposo sobre hielo y se secarán por congelación porciones representativas de cada zona de tejido de peso húmedo conocido hasta obtener un peso constante. La diferencia entre el peso inicial y el final de los tejidos proporcionará el contenido en agua. Se hidrolizarán por triplicado porciones (de 1-2 mg) de los tejidos secados en HCl 6M a 110ºC durante 16 h y se analizarán alícuotas de digestos neutralizados para determinar hidroxiprolina como medida del contenido en colágeno del tejido (Melrose J y col., (1992) A longitudinal study of the matrix changes induced in the intervertebral disc by surgical damage to the annulus fibrosus, J Orthop Res 10: 665-676; Melrose J y col., (1994a) Proteoglycan heterogeneity in the normal adulto vine intervertebral disc, Matrix 14: 61-75; Melrose J y col., (1994b) Variation in the composition of the ovine intervertebral disc with spinal level and in its constituent proteoglycans, Vet Comp Orthop Traum 7: 70-76; Melrose J y col., (1991) The influence of scoliosis and ageing on proteoglycan heterogeneity in the human intervertebral disc J Orthop Res 9: 68-77; y Melrose J y col., (1996) Intervertebral disc reconstitution after chemonucleolysis with chymopapain is dependent on dosage: an experimental study in beagle dogs Spine 21: 9-17). También se someterán a digestión, por triplicado, porciones de tejidos secados (~2 mg) con papaína, y se analizarán alícuotas del tejido solubilizado para determinar glicosaminoglicano sulfatado usando el colorante metacromático azul de 1,9dimetilmetileno como medida del proteoglicano en el tejido (véase Melrose y col., 1991, 1992, 1994, 1996, indicadas anteriormente).

D. Análisis histoquímicos e inmunohistoquímicos

Se aislarán segmentos de movimiento espinal que son designados para análisis histoquímico mediante el corte de los cuerpos craneal y caudal vertebral próximos a las placas finales cartilaginosas usando una sierra para hueso. Se fijarán en bloque los especímenes de disco enteros, que incluyen los segmentos de cuerpo vertebral adyacente, en formalina tamponada neutra al 10% o en Histochoice® durante 56 h, y se descalcificarán con varios cambios de ácido fórmico al 10% en NBF al 5% durante 2 semanas con agitación constante hasta lograr la descalcificación completa, confirmada usando una cabina de rayos X Faxitron HP43855A (Hewlett Packard, McMinnville, EE.UU.).

Se deshidratarán láminas sagitales (de 5 mm de espesor) de especímenes de cuerpo de disco vertebral descalcificado mediante disoluciones graduales de etanol empleando métodos histológicos estándares y embebidos en cera de parafina. Se prepararán secciones de parafina de 4 µm de espesor para la tinción histoquímica y se montarán sobre portas de vidrio para microscopio Superfrost Plus (Menzel-Glaser) y se secarán a 85ºC durante 30 minutos y después a 55ºC durante una noche. Las secciones serán desparafinadas en xileno (4 cambios x 2 minutos) y se rehidratarán a través de lavados con etanol graduado en agua (de 100% a 70% v/v).

Se teñirán tres secciones de todos los bloques con hematoxilina y eosina. Estas secciones se codificarán y serán examinadas por un histopatólogo independiente, que comparará las características histológicas de los niveles que recibieron la incisión anular solamente con los que recibieron la incisión y rhOP-1. Se usará un sistema de graduación semi-cuantitativo de cuatro puntos para determinar las características microscópicas. También se examinará la arquitectura de colágeno en las secciones teñidas con tricromo de Masson y rojo picro-sirius usando un microscopio de luz polarizada.

Los procedimientos de inmunohistoquímica se llevarán a cabo usando una casete Sequenza y un sistema de inmunotinción desechable Coverplate, tal como se ha descrito previamente (Melrose J y col., (2002) Perlecan, the Multi-domain Proteoglycan of Basement Membrane is also a Prominent Pericellular Component of Hypertrophic Chondrocyttes of Ovine Vertebral Growth Plate and Cartilaginous End Plate Cartilage, Histochem. Cell Biol. 118, 269-280; Melrose J y col., (2002) Increased nerve and blood-vessel in-growth associated with proteoglycan depletion in an ovine annular lesion model of experimental disc degeneration, Spine 27, 1278-85; Melrose J y col., (2002) Comparison of the morphology and growth characteristics of intervertebral disc cells, synovial fibroblasts and articular chondrocytes in monolayer and alginate bead cultures, Eur. Spine J. 12, 57-65; Melrose J y col., (2001) Differential expression of proteoglycan epitopes and growth characteristics of ovine intervertebral disc cells grown in alginate beads, Cells Tissues Organs 168: 137-146; Melrose J y col., (2003) Perlecan, the multi domain HS-proteoglycan of basement membranes is a prominent extracellular and pericellular component of the cartilaginous vertebral body rudiments, vertebral growth plates and intervertebral discs of the developing human spinal column, J Histochem Cytochem 51: 1331-1341; Melrose J y col., (2000) Differential Expression of Proteoglycan epitopes by ovine intervertebral disc cells grown in alginate bead culture, J. Anat. 197: 189-198; Melrose J y col., (2002) Spatial and Temporal Localisation of Transforming Growth Factor-β, Fibroblast Growth Factor-2, Osteonectin and Identification of Cells Expressing α-Smooth Muscle Actin in the Injured Annulus Fibrosus: Implications for Extracellular Matrix Repair, Spine 27: 1756-1764; y Knox S y col., (2002) Not all perlecans are created equal: interactions with fibroblast growth factor-2 (FGF-2) and FGF receptors, J. Biol. Chem. 277: 14657-14665). La actividad de peroxidasa endógena será bloqueada inicialmente mediante la incubación de secciones de tejido con H2O2 al 3%. Después se realizará una pre-digestión de las secciones de tejido con combinaciones de condroitinasa ABC (0,25 U/mL) en tampón Trisacetato 20 mM de pH 8,0 durante 1 h a 37ºC, hialuronidasa testicular bovina 1000 U/mL durante 1 h a 37ºC en tampón de fosfato a pH 5,0, seguido de tres lavados en Tris-HCl 20 mM a pH 7,2 con NaCl 0,5 M (TBS) o proteinasa-K (DAKO S3020) durante 6 minutos a temperatura ambiente para exponer epítopos antigénicos. A continuación los tejidos serán bloqueados durante 1 h en suero porción normal al 20% y serán probados con una serie de anticuerpos primarios de proteoglicanos y colágenos grandes y pequeños (Tabla 5). También se procesarán secciones de control negativo omitiendo el anticuerpo primario o sustituyendo un anticuerpo primario de isótopo irrelevante del anticuerpo primario auténtico de interés. Se usarán peroxidasa de rábano o anticuerpos secundarios conjugados a fosfatasa alcalina para la detección usando dihidrocloruro de 3,3’-diaminobencideno al 0,05% y H2O2 al 0,03% en TBS o sustratos Nova RED. Los portas teñidos se examinarán mediante microscopía de campo brillante y se fotografiarán usando un sistema de cámara digital de fotomicroscopio Leica MPS 60.

Tabla 5

Anticuerpos primarios de epítopos de proteína nuclear de proteoglicano y colágeno

Epítopo de anticuerpo primario

Clon (isótopo)

Proteoglicanos grandes

Agrecano

AD 11-2A9 (IgG)

Perlecano

A76 (IgG1)

Versicano

A1S1D1D1 (IgG)

Proteoglicanos pequeños

Decorina

6-B-6 (IgG)

Biglicano

LF-96 (IgG de conejo)

Fibromodulina

Policlonal de conejo

Colágeno

Tipo I

I8H5 (IgG1)

Tipo II

II-4CII (IgG1)

Tipo IV

CIV-22 (IgG1)

Tipo VI

Policlonal de conejo

Tipo X

Policlonal de ratón

E. Determinación bioquímica de los segmentos de movimiento espinal

10 Se llevará a cabo un análisis de rango de movimiento (ROM) biomecánico no destructivo para cada unidad espinal funcional (FSU) en varios planos de movimiento (flexión-extensión, contracción lateral, compresión y torsión). Cada FSU comprende dos vértebras adyacentes, el disco tratado y los ligamentos asociados.

Una plantilla especialmente diseñada, basada en la desarrollada por Callaghan y McGill, permite aplicar momentos puros de torsión y contracción a cada FSU, a la vez que mantiene una carga axial constante. Esta carga combinada

15 es una simulación próxima a las cargas fisiológicas experimentadas por la espina in vivo.

Se evaluarán cuatro FSUs: niveles de control no operados; niveles que se vieron sometidos a incisión; niveles que se vieron sometidos a incisión y se trataron con OP-1 y vehículo, y niveles que se vieron sometidos a incisión y se trataron solamente con vehículo. Cada FSU se montará en dos copas de aleación de aluminio y se asegurará con cemento dental de cura fría. Se tendrá cuidado para asegurar que el disco intervertebral está alineado con las 20 copas. Antes del inicio del ensayo, cada FSU se pre-cargará hasta una tensión de 0,5 MPa hasta alcanzar una estado de hidratación reproducible. Este se usa como línea base antes de cada ensayo. La tensión precargada de 0,5 MPa simula la posición de pie en relajación y está basada en la medida in vivo de las presión intradiscal (Wilke H-J y col., (1999) New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life, Spine 24: 755-62). Se aplicará una carga de torsión de ± 5 Nm y una carga de flexión-extensión de ± 1 Nm, la carga de contracción lateral

25 se aplicará durante 10 ciclos con una carga axial constante de 0,5 MPa. Se aplicará una carga axial cíclica (0-1000 N en 10 ciclos) para investigar la respuesta a la compresión axial del DIV.

F. Estudios piloto

Se han completado estudios piloto con espinas de ovejas y de canguros para verificar las técnicas experimentales. La Figura 12 muestra curvas típicas de “Par de torsión frente a rotación” de una FSU de oveja en 10 ciclos de carga

30 de flexión-extensión. Las dos curvas representan la FSU antes y después de una lesión de borde anular anterior cincunferencial. Se puede observar que el corte anular dio como resultado un aumento del rango de movimiento (ROM) durante la extensión, mientras que el ROM de flexión no se vio afectado. Este ROM incrementado representa de forma general un aumento en la inestabilidad espinal. Otra observación es la elevada repetibilidad de los ciclos de carga, lo que verifica la reproducibilidad de la instalación de ensayo.

El análisis de los datos incluirá la rigidez en la región lineal durante el quinto ciclo de carga, la histéresis y la energía de tensión y la extensión de la zona neutra. Los datos procedentes de los niveles no operativos se compararán con los niveles sometidos a incisión, con y sin OP-1, y se llevará a cabo un análisis de varianza de medidas repetidas en una dirección para cada uno de los parámetros biomecánicos.

5 EJEMPLO 8: El efecto de OP-1 en defectos condrales y de microfractura tratada en cartílagos en un modelo de cabra

Este estudio evaluará los efectos de la OP-1 en la cantidad y composición del tejido reparativo inducido por un procedimiento de microfractura en un modelo de cabra. Se usará un total de 24 cabras macho adultas (de edades entre 1,5 y 3 años) que pesan aproximadamente 25 kg. Antes de la cirugía, se examinará las articulaciones de 10 rodilla roentgenográficamente para excluir aquellos animales con enfermedades articulares degenerativas y otros problemas ortopédicos detectados. Se producirá un defecto condral cuadrado (extracción del cartílago hasta la capa de cartílago calcificado) de 8 mm (en un lateral) en la ranura troclear de las rodillas derechas (articulaciones reprimidas) de todos los animales. En 12 de las cabras dicho defecto condral servirá como zona de tratamiento (Grupos IA y IB, ver la Tabla 4 más adelante). Las articulaciones de rodilla derechas de 12 de los animales serán

15 sometidas entonces a un tratamiento de microfractura (Grupos IIA y IIB). Se producirán 16 agujeros de microfractura usando un pico de aproximadamente 1 mm de diámetro.

Inmediatamente después de la operación, se inyectarán aproximadamente 0,3 mL de masilla de OP-1 (colágeno + CMC) hidratada con salino en el fluido sinovial de la articulación. A los siete días, se administrará una segunda inyección. En 6 de los animales del grupo de defecto condral (IB) y en 6 de los animales del grupo de microfractura

20 (IIB) sólo se administrará el vehículo.

Tabla 6

Grupo

Tipo de lesión Tratamiento (+ ó -OP-1) Tamaño de muestra

IA

Condral + 6

IB

Condral - 6

IIA

Microfractura + 6

IIB

Microfractura - 6

Todos los animales serán sacrificados 16 semanas después de la cirugía. Todas las zonas se prepararán para la evaluación histomorfométrica. Se evaluará una sección histológica procedente de la porción central de cada defecto. 25 Se determinará el área total y los porcentajes de tipos de tejido específicos (cartílago articular, cartílago hialino, fibrocartílago y tejido fibroso) que rellenan la región del defecto condral original usando una rejilla en la parte ocular del microscopio. Se emplearán criterios histológicos bien aceptados para los tipos de tejidos (véase, por ejemplo, Wang Q., y col. Healing of defects in canine articular cartilage: distribution of nonvascular alpha smooth muscle actincontaining cells, Wound Repair Regen. 8, páginas 145-158 (2000); Breinan HA, y col., Healing of canine articular

30 cartilage defects treated with microfracture, a type II collagen matrix, or cultured autologous chondrocytes, J. Orthop. Res. 18, páginas 781-789 (2000); y Breinan, HA, y col., Effect of cultured autologous chondrocytes on repair of chondral defects in a canine model, J. Bone Joint Surg. 79A, páginas 1439-1451 (1997)).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110>

STRYKER CORPORATION

<120>

MÉTODOS PARA TRATAR DEFECTOS DEL CARTÍLAGO

<130>

STK-13 PCT

<140>

Pendiente de asignar

<141>

24-05-2005

<160>

11

<170>

PatentIn versión 3.2

<210>

1

<211>

431

<212>

PRT

<213>

Homo sapiens

<400>

1

<210>

2

<211>

96

<212>

PRT

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Secuencia sintética de aminoácidos COP-5

<400>

2

<210>

3

<211>

96

<212>

PRT

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Secuencia sintética de aminoácidos COP-7

<400>

3

<210> 4

<211> 102

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> OP-X

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(102)

<223> Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos específicos según se define en la descripción

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (2)..(3)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (9)..(9)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (11).. (11)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (16)..(16)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (19)..(19)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (23)..(23)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (26).. (26)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (35)..(35)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (39).. (39)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (41)..(41)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (50)..(50)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (52)..(52)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (56)..(58)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

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<221> característica_miscelánea

<222> (60)..(61)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (65)..(65)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

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<221> característica_miscelánea

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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (73)..(73)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

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<221> característica_miscelánea

<222> (75).. (75)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (80)..(80)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (82).. (82)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (84)..(84)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (87)..(87)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (89)..(89)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (91)..(91)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (97)..(97)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<400> 4

<210>

5

<211>

97

<212>

PRT

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Secuencia genérica 7

<220>

<221>

MOD_RES

<222>

(1)..(97)

<223> Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos específicos según se define en la descripción

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (2)..(4)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (6)..(8)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (11)..(16)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (18)..(21)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (23)..(23)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (26)..(26)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (28)..(28)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (30).. (31)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (33)..(40)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (44)..(60)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (63)..(63)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (65)..(72)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (74)..(80)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (82)..(82)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (84)..(88)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (90)..(90)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (92)..(93)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (95).. (95)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (97)..(97)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<400> 5 <220>

<210>

6

<211>

102

<212>

PRT

<213>

Secuencia Artificial

<223> Secuencia genérica 8

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(102)

<223> Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos específicos según se define en la descripción

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (2)..(5)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (7)..(9)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (11)..(13)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (16)..(21)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (23)..(26)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (28)..(28)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (31)..(31)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (33)..(33)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (35)..(36)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (38)..(45)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (49)..(65)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (68)..(68)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (70)..(77)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (79)..(85)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (87)..(87)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (89)..(93)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (95)..(95)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (97)..(98)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (100)..(100)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (102)..(102)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<400> 6 <210> 7

<211> 97

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia genérica 9

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(97)

<223> Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos específicos según se define en la descripción

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (1)..(16)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (18)..(24)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (26)..(26)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (28)..(28)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220> <221> característica_miscelánea

<222> (30)..(61)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (63)..(63)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (65)..(72)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (74)..(93)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (95)..(95)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (97)..(97)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<400> 7 <223> Secuencia genérica 10

<210>

8

<211>

102

<212>

PRT

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(102)

<223> Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos específicos según se define en la descripción

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (2)..(21)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (23)..(29)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (31)..(31)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (33)..(33)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (35)..(66)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (68)..(68)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (70)..(77)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (79)..(98)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (100)..(100)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (102)..(102)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<400> 8

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia consenso

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos específicos según se define en la descripción

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (2)..(5)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<400> 9

<210> 10

<211> 1822

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (49)..(1341)

<400> 10

<210>

11

<211>

431

<212>

PRT

<213>

Homo sapiens

<400>

11

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Una composición farmacéutica que consiste en OP-1 y un material de administración para liberación sostenida o eliminación retardada para su uso en la reparación de un defecto de cartílago en un paciente, en donde el cartílago está rodeado por fluido sinovial; en donde la composición farmacéutica debe administrarse en el fluido sinovial que rodea al cartílago; en donde la composición es una disolución líquida o una suspensión líquida y se formula como una formulación de liberación sostenida o como una formulación de eliminación retardada.
2. 2.-Una composición farmacéutica que consiste en OP-1 y un material de administración para liberación sostenida o eliminación retardada para su uso en la regeneración o la producción de cartílago en una zona de defecto de cartílago en un paciente, en donde el cartílago está rodeado por fluido sinovial; en donde la composición farmacéutica debe administrarse en el fluido sinovial que rodea al cartílago; en donde la composición es una disolución líquida o una suspensión líquida y se formula como una formulación de liberación sostenida o como una formulación de eliminación retardada.
3. 3.-Una composición farmacéutica que consiste en OP-1 y un material de administración para liberación sostenida o eliminación retardada para su uso en la promoción o la aceleración de la formación de cartílago en una zona de defecto de cartílago en un paciente, en donde el cartílago está rodeado por fluido sinovial; en donde la composición farmacéutica debe administrarse en el fluido sinovial que rodea al cartílago; en donde la composición es una disolución líquida o una suspensión líquida y se formula como una formulación de liberación sostenida o como una formulación de eliminación retardada.
4. 4.-Una composición farmacéutica que consiste en OP-1 y un material de administración para liberación sostenida o eliminación retardada para su uso en la prevención de la degradación de cartílago o en el tratamiento de una lesión de cartílago o una enfermedad o trastorno degenerativo de cartílago en un paciente, en donde el cartílago está rodeado por fluido sinovial; en donde la composición farmacéutica debe administrarse en el fluido sinovial que rodea al cartílago; en donde la composición es una disolución líquida o una suspensión líquida y se formula como una formulación de liberación sostenida o como una formulación de eliminación retardada.
5. 5.-La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la composición es una formulación inyectable.
6. 6.-La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la composición es una disolución acuosa.
7. 7.-La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la composición comprende polietilenglicol.
8. 8.-La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la OP-1 está glicosilada.
9. 9.-La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la lesión de tejido o la enfermedad degenerativa se selecciona del grupo que consiste en osteoartritis, desgarros de menisco y lesión de ligamento cruzado anterior (LCA).