ES2375995T3

ES2375995T3 - Composiciones y sus usos para deficiencias de enzima lisosomal.

Info

Publication number: ES2375995T3
Application number: ES05814893T
Authority: ES
Inventors: Edward I. Ginns; Gary R. Ostroff
Original assignee: University of Massachusetts Amherst
Current assignee: University of Massachusetts Amherst
Priority date: 2004-09-17
Filing date: 2005-09-19
Publication date: 2012-03-08
Anticipated expiration: 2025-09-19
Also published as: JP2008513484A; US8637045B2; IL181748A0; ZA200701943B; HK1105587A1; BRPI0515332A; CN101052383B; AU2005284727A1; CN101052383A; US8007814B2; WO2006032039A2; EP1802289A2; IL181748A; CA2580537A1; JP5302537B2; EP1802289B1; US20120039929A1; CA2580537C; WO2006032039A3; US20060083718A1

Abstract

Una composición caracterizada porque comprende: una pared de célula de levadura extraída que define un espacio interno y que comprende 6 a 90 por ciento en peso de beta-glucano; una molécula de captura de carga útil seleccionada del grupo que consiste de un polielectrolito catiónico, un polielectrolito aniónico, un polielectrolito anfotérico, un polisacárido, un polímero catiónico, un lípido catiónico, y una poliamina; y una molécula de carga útil seleccionada del grupo que consiste de (i) un ácido nucleico que codifica una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de enzima lisosomal, o un equivalente funcional de un activador de enzima lisosomal, en donde el activador de enzima lisosomal es seleccionado del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, Activador de proteína GM2; (ii) una proteína seleccionada del grupo que consiste de una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de enzima lisosomal y un equivalente funcional de un activador de enzima lisosomal, en donde el activador de enzima lisosomal es seleccionado del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, Activador de proteína GM2; y (iii) una mezcla de los mismos; en donde la molécula de carga útil está presente en una cantidad efectiva para complementar la función de una enzima lisosomal deficiente; en donde la molécula de carga útil y la molécula de captura de carga útil son solubles en el mismo sistema solvente; y en donde la molécula de captura de carga útil estabiliza la asociación de la molécula de carga útil y la pared de célula de levadura extraída.

Description

Composiciones y sus usos para deficiencias de enzima lisosomal

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los trastornos de almacenamiento lisosomal (LSDs) son un grupo de aproximadamente cincuenta enfermedades metabólicas heredadas que resultan de deficiencias celulares de una enzima lisosomal específica, objetivo de receptor, proteína activadora, proteína de membrana, o transportador que conduce a acumulación patogénica de sustancias en lisosomas, causando acumulación del sustrato, resultando en un deterioro de la función celular y tejidos. Wilcox, W.R., Lysosomal storage disorders: the need for better pediatric recognition and comprehensive care. J Pediatr. 2004 Mayo; 144(5 Suppl):S3-14. Los trastornos de almacenaje lisosomal ocurren en aproximadamente 1 en 5,000 nacimientos vivos y despliegan heterogeneidad bioquímica y química considerable. La mayoría de los trastornos de almacenaje lisosomal son heredados como condiciones recesivas autosomales aunque dos ejemplos de X-ligados son enfermedad de Fabry y MPS II.

La magnitud y severidad del trastorno de almacenaje lisosomal depende del tipo y cantidad de sustrato que se acumula, pero casi todos los trastornos son progresivos. Muchos trastornos tienen manifestaciones tanto sistémicas como del sistema nervioso central, mientras algunos afectan ya sea solo el sistema nervioso central o tejidos externos al sistema nervioso. Muchos sujetos con trastornos de almacenaje lisosomal mueren en la infancia o la niñez, y sujetos quienes sobreviven a la edad adulta a menudo tienen un trayecto de vida reducido y morbidez significante (Wilcox, 2004). La Tabla 1, siguiente, es un sumario de algunos de los trastornos de almacenaje lisosomal listados por la función lisosomal que es afectada.

La enfermedad de Gaucher es el trastorno de almacenaje lisosomal más prevalente y resulta de la deficiencia de glucocerebrosidasa (GC; EC 3.2.1.45) en todos los tejidos. Esta deficiencia de enzima produce acumulación de glucosilceramida en macrófagos cargados de lípidos (llamados células Gaucher) en el sistema reticuloendotelial que incluye hígado, bazos, pulmón y médula ósea. La enfermedad de Gaucher se ha categorizado en tres fenotipos principales: tipo 1, no neuropático; tipo 2, neuropático agudo, y tipo 3 neuropático subagudo. El espectro de severidad de enfermedad para la enfermedad de Gaucher tipo 1 es diversa, en donde niños y adultos pueden ser asintomáticos o pueden tener síntomas severamente debilitantes, que incluyen degeneración esquelética, anemia, trombocitopenia y hepatoesplenomegalia. Los síntomas pueden presentarse en cualquier edad, y aunque la enfermedad de Gaucher tipo 1 es más común entre la población Judía Asquenazí, ocurre en todos los grupos étnicos. La enfermedad de Gaucher Tipo 2 (neuropática aguda) es rápidamente progresiva, en donde por los seis meses de edad, muchos infantes tipo 2 tienen disfunción del tronco cerebral, y sucumben a complicaciones tales como paro respiratorio o anemia por aspiración en los 18-24 meses de edad. Los sujetos tipo 3 desarrollan anormalidades neurológicas en una edad posterior que los sujetos tipo 2; la mayoría solamente desarrolla un efecto de movimiento de ojo sacádico horizontal sutil. Las complicaciones sistémicas en sujetos con Gaucher tipos 1 y 2 responden a terapia enzimática.

Tabla 1

Trastornos de almacenaje lisosomal por función lisosomal afectada (Wilcox, W.R., J Pediatr. 2004 Mayo; 144(5 Suppl):S3-14)

Trastorno

MPS I–IX (enfermedades de Hurler, Scheie, Hunter, Sanflippo, Morquio, Maroteaux-Lamy, Sly, deficiencia de hialuronidasa)

Aspartilglucosaminuria, fucosidosis, manosidosis, enfermedad de Schindler, sialidosis tipo I

enfermedad de Pompe

enfermedad de Fabry, enfermedad de Faber, enfermedad de Gaucher (tipos 1-3), gangliosidosis-GM1, gangliosidosis-GM2 (enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Sandhoff, enfermedad activadora de GM2), enfermedad de Krabbe, leucodistrofia metacromática, enfermedad de Niemann-Pick (tipo A o B).

Función Lisosomal afectada

Degradación defectiva de polipéptidos

Degradación defectiva o transporte de colesterol, ésteres de colesterol u otros complejos lípidos

Deficiencias múltiples de enzimas lisosomales Transporte y defectos de tráfico

Defectos desconocidos

Trastorno

Picnodisostosis

Lipofuscinosis (tipos múltiples con diferentes defectos, algunos no conocidos aún), enfermedad de almacenaje de éster de colesterol, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, enfermedad de Wolman

Sulfatasa múltiple, galactosialidosis, muclipidosis tipos II, III,

Cistinosis, mucolipidosis IV, trastorno de almacenaje de ácido siálico, enfermedad de retención de quilomicrón con síndrome Marinesco-Sjögren, síndróme Hermansky-Pudlak (varias formas), síndrome Chediak-Higashi, y enfermedad de Danon

displasia Geleofísica, síndrome Marinesco-Sjögren

La terapia de reemplazo de enzima (ERT) para la enfermedad de Gaucher se aprobó primero por la FDA en 1991. La ERT a largo plazo mejora los conteos de sangre y organomegalia en la mayoría de sujetos con Gaucher. Sin embargo, la formulación actula de enzimas GC administradas IV no alteran el deterioro neurológico en sujetos tipo 2 o invierten significantemente las complicaciones esqueléticas. Para superar las limitaciones actuales de ERT para la enfermedad de Gaucher se propone aplicar una nueva técnica que usa partículas de la pared celular de levadura microscópica oralmente administradas que contienen ADN comprendido de secuencias que codifican glucocerebrosidasa humana para suministrar más eficientemetne enzima GC modificada o normal a macrófagos. Además del suministro mejorado de enzima GC a todos los tejidos, se espera que este procedimiento innovativo proporcinará una absorción más eficiente y específica por macrófagos en hueso de las partículas que suministran el ADN que codifica el GC normal o modificado. Este procedimiento puede conducir a mayor mejoramiento en complicaciones esqueléticas que no son actualmente invertidos por ERT actual.

Las partículas de la pared celular de levadura extraída son partículas sustancialmente esféricas, biodegradables, fácilmente disponibles de aproximadamente 2-4 μm de diámetro. La preparación de partículas de la pared celular de levadura extraída se conoce en la técnica, y se describe, por ejemplo en las Patentes Estadounidenses No. 4,992,540, 5,082,936, 5,028,703, 5,032,401, 5,322,841, 5,401,727, 5,504,079, 5,968,811, 6,444,448 B1, 6,476,003 B1, solicitudes Estadounidenses publicadas 2003/0216346 A1, 2004/0014715 A1, y solicitud PCT publicada WO 02/12348 A2. Una forma de partículas de la pared celular de levadura extraída, referida como “partículas de glucano enteras,” han sido sugeridas como vehículos de suministro, pero han sido limitadas ya sea para liberación por difusión simple del ingrediente activo a partir de la partícula o liberación de un agente químicamente reticulado a la partícula de glucano entera por biodegradación de la matriz de partícula. Véase Patentes Estadounidenses Nos. 5,032,401 y 5,607,677.

Las partículas de la pared celular de levadura extraída, principalmente debido a su contenido beta-glucano, son dirigidas a células fagocíticas, tales como macrófagos y células de tejido linfoide. El tejido linfoide asociado mucosal (MALT) comprende todas las células linfoides en epitelio y en la lámina propia puesta por debajo de las superficies mucosales del cuerpo. Los sitios principales de tejido linfoide asociado mucosal son los tejidos linfoides asociados al intestino (GALT), y los tejidos linfoides asociados bronquiales (BALT).

El documento WO 2004/012659describe composiciones que contienen beta-glucano, métodos para manufacturar betaglucanos y para manufacturar y usar beta-glucanos y conjugados de los mismos como adyuvantes de vacunas.

Otro componente importante del sistema inmune del GI es la célula micro pliegue o M. Las células M son un tipo de células específicas en el epitelio intestinal sobre folículos linfoides que provocan endocitosis de una variedad de proteínas y antígenos peptídicos. En lugar de digerir estas proteínas, las células M las transportan en el tejido subyacente, en donde son tomadas por células dendríticas locales y macrófagos.

Las células M toman moléculas y partículas del lumen intestinal por endocitosis o fagocitosis. Este material es entonces transportado a través del interior de la célula en vesículas a la membrana de células basales, en donde se liberan en el espacio extracelular. Este proceso es conocido como transcitosis. En su superficie basal, la membrana celular de células M es extensivamente plegada alrededor de los linfocitos subyacentes y células que presentan antígenos, los cuales toman el material transportado liberado de las células M y lo procesan para presentación del antígeno.

Un estudio ha mostrado que la transcitosis de partículas de levadura (3.4 + 0.8 micrones de diámetro) por células M de los parches de Peyer toma menos de 1 hora (Beier, R., & Gebert, A., Kinetics of particle uptake in the domes of Peyer’s patches, Am J Physiol. 1998 Jul; 275(1 Pt 1):G130-7). Sin fagocitosis significante por macrófagos intraepiteliales, las partículas de levadura migran hacia abajo en y a través de la lámina basal dentro de 2.5-4 horas, en donde rápidamente consiguen ser fagocitosados y transportados de las cúpulas de parche de Peyer. Las células M encontradas en tejido linfoide nasofaríngeo humano (tonsiles y adenoides) han sido mostradas por estar involucradas en el muestreo de virus que causan infecciones respiratorias. Estudios de un modelo de células M in vitro han mostrado la absorción de microesferas fluorescentemente etiquetadas (Fluoesferas, 0.2 μm) y micropartículas de quitosán (0.2 μm) van der Lubben I.M., et al., Transport of chitosan microparticles for mucosal vaccine delivery in a human intestinal M-cell model, J Drug Target, 2002 Sep;10(6):449-56. Una lectina, Ulex europaeus aglutinina 1 (UEA1, específica para residuos alfa-Lfucosa) ha sido usada para dirigir ya sea microesferas de poliestireno (0.5 μm) o liposomas polimerizadas a células M

(0.2 μm) (Clark, M.A., et al., Targeting polimerised liposome vaccine carriers to intestinal M cells, Vaccine. 2001 Oct 12;20(1-2):208-17). En estudios in vivo en ratones se ha reportado que microesferas de ácido poli-D,L-láctico (PDLLA) o microesferas de gelatina (GM) pueden ser eficientemente tomadas por macrófagos y células M. (Nakase, H., et al., Biodegradable microspheres targeting mucosal immune-regulating cells: new approach for treatment of inflammatory bowel disease, J Gastroenterol. 2003 Mar; 38 Suppl 15:59-62).

Chang, P. L describre “Microencapsulation - An alternative approach to gene therapy in Transfusions Science”, Vol. 17, No. 1, Marzo 1996, pág. 35-43.

Sin embargo, se ha reportado que la absorción de vehículos de suministro de partícula sintéticos que incluyen macropartículas de poli(DL-láctido-co-glicólido) y liposomas es altamente variable, y se determina por las propiedades físicas de tanto partículas como células M. Clark, M.A., et al., Exploiting M cells for drug and vaccine delivery, Adv Drug Deliv Rev. 2001 Aug 23;50 (1-2):81-106. El mismo estudio reportó que el suministro puede ser mejorado recubriendo las partículas o liposomas con reactivos que incluyen lectinas apropiadas, adhesinas microbianas e inmunoglobulinas las cuales se unen selectivamente a superficies de células M. Véase también, Florence, A.T., The oral absorption of micro- and nanoparticulates: neither exceptional nor unusual, Pharm Res. 1997 Mar; 14(3):259-66.

Receptores de reconocimiento de patrón de patógeno (PRRs) reconocen porciones moleculares y estructurales comunes en superficies microbianas y contribuyen a la inducción de respuestas inmunes innatas. Los receptores de manosa y receptores de beta-glucano en parte participan en el reconocimiento de patógenos fúngicos. El receptor de manosa (MR), un receptor de enlace al carbohidrato expresado en subseries de macrófagos, se considera uno de tales PRR. Los macrófagos tienen receptores para tanto manosa como manosa-6-fosfato que puede unirse a, e internalizar moléculas que despliegan estos azúcares. Las moléculas son internalizadas por endocitosis en un endosoma pre-lisosomal. Esta internalización ha sido usada para mejorar la entrada de oligonucleótidos en macrófagos usando albúmina de suero bovino modificada con manosa-6-fosfato y ligada a un oligodesoxinucleótido por un puente disulfuro a un extremo 3’ modificado; véase Bonfils, E., et al., Nucl. Acids Res. 1992 20, 4621-4629. véase E. Bonfils, C. Mendes, A. C. Roche, M. Monsigny and P. Midoux, Bioconj. Chem., 3, 277-284 (1992). Los macrófagos también expresan receptores de betaglucano, que incluyen CR3 (Ross, G.D., J.A. Cain, B.L. Myones, S.L. Newman, and P.J. Lachmann. 1987. Specificity of membrane complement receptor type three (CR3) for �-glucans. Complement Inflamm. 4:61), dectina-1. (Brown, G.D. and S. Gordon. 2001. Immune recognition. A new receptor for �-glucans. Nature 413:36.), y lactosilceramida (Zimmerman JW, Lindermuth J, Fish PA, Palace GP, Stevenson TT, DeMong DE. A novel carbohydrate-glycosphinglipid interaction between a beta-(1-3)-glucan immunomodulator, PGG-glucan, and lactosylceramide of human leukocytes. J Biol Chem. 1998 Aug 21:273(34):22014-20.). El receptor de beta-glucano, CR3 es predominantemente expresado en monocitos, neutrófilos y células NK, mientras la dectina-1 es predominantemente expresada en la superficie de las células de los macrófagos. La lactosilceramida se encuentra en niveles elevados en células M. La microglía también puede expresar un receptor de beta-glucano (Muller, C.D., et al. Functional beta-glucan receptor expression by a microglial cell line, Res Immunol. 1994 May; 145(4):267-75).

Existe evidencia de efectos aditivos en fagocitosis de enlace a tanto manosa como receptores de beta-glucano. Giaimis et al. reporta observaciones que sugieren que la fagocitosis de levadura elimina el calor no opsonizada (S. cerevisiae) por líneas de células similares a macrófago murino así como también macrófagos residentes peritoneales murinos es mediada por tanto manosa como receptores de beta-glucano. Para lograr fagocitosis máxima de levadura eliminada por calor no opsonizada, se requiere la coexpresión de tanto manosa como receptores de beta-glucano (Giaimis, J., et al., Both mannose and beta-glucan receptors are involved in phagocytosis of unopsonized, heat-killed Saccharomyces cerevisiae by murine macrophages, J Leukoc Biol. 1993 Dec; 54(6):564-71).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los trastornos lisosomales pueden ser tratados a través de la expresión dirigida por el macrófago del gen deficiente por administración ural usando las composiciones y métodos de la presente invención. En modalidades preferidas, los ADNs de plásmido que expresan enzimas lisosomales son incorporados en partículas de glucano de levadura (YGP) y partículas de glucano-manano de levadura (YGMP) en la forma de nanocomplejos de ADN-polímero catiónico. Estas micropartículas de YGP-DNA y YGMP-DNA son sistemáticamente, mucosamente y oralmente biodisponibles a través de la absorción mediada por el receptor en tejido, macrófago de tejido linfático asociado al intestino y mucosal (GALT) vía enlace del receptor a carbohidratos a las partículas de los polisacáridos glucano y manano de la superficie. Después de la fagocitosis, las partículas son engullidas en un compartimiento endosomal en donde el polímero catiónico libera el ADN e hincha el endosoma que libera el ADN en el citoplasma. La incorporación de excipientes en las formulaciones de YGP-DNA y YGMP-DNA facilitando la liberación de ADN endosomal y absorción nuclear. El suministro de ADN que expresa la proteína deficiente conduce a la suplementación, preferiblemente la restauración, de la actividad de la proteína deficiente y cataliza el rompimiento del producto de almacenaje acumulado tóxico.

La presente invención proporciona una composición que comprende 6 a 90 por ciento en peso de beta-glucano, una molécula de captura de carga útil y una molécula de carga útil, una composición que comprende: una pared de célula de levadura extraída que define un espacio interno y que comprende 6 a 90 por ciento en peso de beta-glucano; una molécula de captura de carga útil seleccionada del grupo que consiste de un polielectrolito catiónico, un polielectrolito aniónico, un polielectrolito anfotérico, un polisacárido, un polímero catiónico, un lípido catiónico, y una poliamina; y una molécula de carga útil seleccionada del grupo que consiste de (i) un ácido nucleico que codifica una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de enzima lisosomal, o un equivalente funcional de un activador de enzima lisosomal, en donde el activador de enzima lisosomal es seleccionado del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, activador de proteína GM2; (ii) una proteína seleccionada del grupo que consiste de una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de enzima lisosomal y un equivalente funcional de un activador de enzima lisosomal, en donde el activador de enzima lisosomal es seleccionado del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, proteína activadora de GM2; y

(iii) una mezcla de los mismos; en donde la molécula de carga útil está presente en una cantidad efectiva para complementar la función de una enzima lisosomal deficiente; en donde la molécula de carga útil y la molécula de captura de carga útil son solubles en el mismo sistema solvente; y en donde la molécula de captura de carga útil estabiliza la asociación de la molécula de carga útil y la pared de célula de levadura extraída. En ciertas modalidades preferidas, la pared de célula de levadura extraída además comprende manano, preferiblemente más de aproximadamente 30 por ciento en peso de manano, más preferiblemente entre aproximadamente 30 hasta aproximadamente 90 por ciento en peso de manano. En otras modalidades, partículas de YCP tienen un contenido sustancialmente superior de quitina + quitosan comparado con los otros tipos de partículas, en general más de 50 por ciento en peso, más preferiblemente entre aproximadamente 50 hasta aproximadamente 75 por ciento en peso. En ciertas modalidades, el ácido nucleico es seleccionado del grupo que consiste de un oligonucleótido, un constructo antisentido, un siRNA, un ARN enzimático, un constructo de ADN recombinante y una mezcla de los mismos. En modalidades preferidas, el constructo de ADN recombinante es un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta. En otras modalidades, la presente invención proporciona el uso de la composición para la manufactura de una composición farmacéutica para el tratamiento de una deficiencia de enzima lisosomal.

En ciertas modalidades preferidas, la proteína codificada por la estructura lectora abierta es una proteína que produce un efecto terapéutico en un sujeto que tiene un trastorno de almacenaje particular. En modalidades particularmente preferidas, la proteína codificada por la estructura lectora abierta es glucocerebrosidasa humana o su equivalente funcional.

En otras modalidades, la composición de la presente invención se usa en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de un trastorno de almacenaje lisosomal. Adecuadamente, el trastorno de almacenaje lisosomal es un metabolismo defectivo de glicosaminoglicanos, una degradación defectiva de la porción glicano de glicoproteínas, una degradación defectiva de glicógeno, una degradación defectiva de componentes esfingolípidos, una degradación defectiva de polipéptidos, una degradación defectiva o transporte de colesterol, ésteres de colesterol, u otros complejos lípidos, una deficiencia de enzimas lisosomales múltiples, un defecto de transporte o un defecto de tráfico intracelular. En modalidades preferidas, el trastorno de almacenaje lisosomal es enfermedad de Hurler, enfermedad de Scheie, enfermedad de Hunter, enfermedad de Sanfilippo, enfermedad de Morquio, enfermedad de Maroteaux-Lamy, enfermedad de Sly, una deficiencia de hialuronidasa, aspartilglucosaminuria, fucosidosis, manosidosis, enfermedad de Schindler, sialidosis tipo I, enfermedad de Pompe, enfermedad de Fabry, enfermedad de Farber, enfermedad de Gaucher tipo 1, enfermedad de Gaucher tipo 2, enfermedad de Gaucher tipo 3, una GM1-gangliosidosis, una GM2gangliosidosis tal como enfermedad de Tay-Sachs o enfermedad de Sandhoff, una enfermedad activadora de GM2, enfermedad de Krabbe, una leucodistrofia metacromática, enfermedad de Niemann-Pick tipo A, enfermedad de Niemann-Pick tipo B, una picnodisostosis, una lipofuscinosis ceroide, una enfermedad de almacenaje de éster de colesterol, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, enfermedad de Wolman, una enfermedad de sulfatasa múltiple, una galactosialidosis, mucolipidosis tipo II, mucolipidosis tipo III, una cistinosis, mucolipidosis IV, un trastornos de almacenaje de ácido siálico, enfermedad de retención de quilomicrón con síndrome Marinesco-Sjögren, síndrome Hermansky-Pudlak, síndrome Chediak-Higashi y enfermedad de Danon, displasia geleofísica o síndrome Marinesco-Sjögren.

En modalidades particularmente preferidas, el constructo de ADN recombinante es un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica una proteína, preferiblemente una enzima, más preferiblemente una enzima lisosomal un equivalente funcional de la misma. En otras modalidades preferidas, el constructo de ADN recombinante es un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica un activador de enzima lisosomal un equivalente funcional de la misma. En ciertas modalidades, el activador de enzima lisosomal es seleccionado del grupo que consiste de saprosina A, saprosina B, saprosina C, saprosina D y una mezcla de los mismos. En otras modalidades, el activador de enzima lisosomal es un activador de proteína GM2 (GM2AP), u otros activadores de proteína lisosomal.

En otras modalidades, la molécula de carga útil es una enzima lisosomal o un equivalente funcional de la misma. En otras modalidades, la molécula de carga útil es una proteína seleccionada del grupo que consiste de saprosina A, saprosina B, saprosina C, saprosina D, Activador de proteína GM2 y una mezcla de los mismos.

En otras modalidades, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la composición y aun excipiente farmacéuticamente aceptable. En modalidades preferidas, la composición es adecuada para administración oral. En otras modalidades preferidas, la composición es formulada para administración parenteral, muy preferiblemente para administración subcutánea o intramuscular. En otras modalidades preferidas, la composición es formulada para administración mucosal.

La presente invención también proporciona un método para suplementar una deficiencia de proteína u otra enzimática en una célula que incluye las etapas de proporcionar una cantidad efectiva de una primera composición que comprende una pared de célula de levadura extraída que comprende beta-glucano, una molécula de captura de carga útil y una molécula de carga útil, en donde la molécula de carga útil es un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica la proteína deficiente, tal como una enzima, o un equivalente funcional del mismo; in vitro una célula que tiene tal proteína o deficiencia enzimática con la primera composición. En modalidades preferidas, la primera composición es internalizada por la célula, típicamente por fagocitosis. El método puede además incluir las etapas de proporcionar una cantidad efectiva de una segunda composición que comprende una pared de célula de levadura extraída que comprende beta-glucano, una molécula de captura de carga útil y una molécula de carga útil, en donde la molécula de carga útil es un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica un activador de la enzima deficiente o un equivalente funcional del mismo y que contacta la célula que tiene tal proteína o deficiencia enzimática con la segunda composición.

La célula que puede ser adecuadamente tratada puede ser un macrófago, una célula M de parche Peyer, un monocito, un neutrófilo, una célula dendrítica, una célula Langerhans, una célula Kupffer, un fagocito alveolar, un macrófago peritoneal, un macrófago de leche, una célula microglial, un eosinófilo, granulocitos, un fagocito mesengial o una célula sinovial A.

La presente invención proporciona una composición que comprende: una pared de célula de levadura extraída que define un espacio interno y que comprende 6 a 90 por ciento en peso de beta-glucano; una molécula de captura de carga útil seleccionada del grupo que consiste de un polielectrolito catiónico, un polielectrolito aniónico, un polielectrolito anfotérico, un polisacárido, un polímero catiónico, un lípido catiónico, y una poliamina; y una molécula de carga útil seleccionada del grupo que consiste de (i) un ácido nucleico que codifica una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de enzima lisosomal, o un equivalente funcional de un activador de enzima lisosomal, en donde el activador de enzima lisosomal es seleccionado del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, Activador de proteína GM2; (ii) una proteína seleccionada del grupo que consiste de una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de enzima lisosomal y un equivalente funcional de un activador de enzima lisosomal, en donde el activador de enzima lisosomal es seleccionado del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, Activador de proteína GM2; y (iii) una mezcla de los mismos; en donde la molécula de carga útil está presente en una cantidad efectiva para complementar la función de una enzima lisosomal deficiente; en donde la molécula de carga útil y la molécula de captura de carga útil son solubles en el mismo sistema solvente; y en donde la molécula de captura de carga útil estabiliza la asociación de la molécula de carga útil y la pared de célula de levadura extraída. La composición puede tener la molécula de captura de carga útil seleccionada del grupo que consiste de quitosán, polietilenimina, poli-L-lisina, alginato, xantano, y mezclas de los mismos. La composición puede tener la pared de célula de levadura extraída que además comprende más de 30 por ciento en peso de manano. La composición puede tener la pared de célula de levadura extraída que además comprende más de 50 por ciento en peso quitina. La molécula de carga útil puede ser un ácido nucleico el cual es un constructo de ADN recombinante y preferiblemente el constructo de ADN recombinante es un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica la proteína. La proteína codificada por la estructura lectora abierta puede ser una proteína estructural, una proteína que tiene actividad enzimática, una proteína de membrana, una proteína de enlace a DNA, una proteína de señalización o un equivalente funcional del mismo, o la proteína puede ser una glucocerebrosidasa humana o un equivalente funcional de la misma, una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de proteína de enzima lisosomal o un equivalente funcional de un activador de proteína de enzima lisosomal. El activador de enzima lisosomal puede ser seleccionado del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D y una mezcla de los mismos, o el activador de enzima lisosomal puede ser el activador de proteína GM2 (GM2AP). La molécula de carga útil puede ser una proteína la cual es una enzima lisosomal o un equivalente funcional de la misma. La composición puede comprender además bromuro de hexadeciltrimetilamonio. La composición es útil en el tratamiento de un sujeto que tiene trastornos de almacenaje lisosomal que incluye la etapa de administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende beta-glucano, una molécula de captura de carga útil y una molécula de carga útil, en donde la molécula de carga útil es un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica la enzima lisosomal deficente, en donde la molécula de carga útil está presente en una cantidad efectiva para complementar la función de una enzima lisosomal deficiente. La composición can también puede ser usada en conjunto con una cantidad efectiva de una segunda composición que comprende una pared de célula de levadura extraída que comprende beta-glucano, una molécula de captura de carga útil y una molécula de carga útil, en donde la molécula de carga útil es un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica un activador de la enzima lisosomal deficiente. Alternativamente, la composición es administrada parenteralmente (subcutáneamente, intradermalmente o intramuscularmente o mucosalmente (piel, inhalación) al sujeto. En modalidades preferidas, la primera composición es administrada al sujeto oralmente, subcutáneamente, intramuscurlarmente o por inhalación. La composición es muy preferiblemente administrada oralmente al sujeto. En otras modalidades, la composición de la presente invención puede ser administrada a un feto in útero administrando la composición a la madre, o colocando una cantidad efectiva de la composición en el fluido amniótico.

Lo mencionado anteriormente y otras características y ventajas del sistema de suministro de fármaco de partícula y métodos serán aparentes a partir de la siguiente descripción más particular de las modalidades preferidas del sistema y método como se ilustra en los dibujos acompañantes en los cuales caracteres de referencia similares se refiere a las mismas partes a través de las diferentes vistas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 es un diagrama esquemático 100 de una sección transversal de una pared celular de levadura, que muestra, desde afuera hacia dentro, una capa fibrilar externa 110, una capa de manoproteína externa 120, una capa de beta glucano 130, una capa de beta glucano-quitina 140, una capa de manoproteína interna 150, la membrana plasmática 160 y el citoplasma 170.

La Figura 2A es un diagrama de la estructura de una partícula de pared celular de levadura; la Figura 2B es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color que muestra el teñido del componente manano de partículas de pared celular de levadura por concanavalina-A-FITC (con-A-isocianato de fluoresceína, Sigma Chemical, St. Louis, MO) que muestra partículas de la pared celular de levadura teñidas sustancialmente de manera completa 210; la Figura 2C es un diagrama de la estructura de una partícula beta glucanomanano YGMP, la Figure 2D es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color que muestra teñido desigual con-A-FITC de una partícula beta glucano-manano YGMP 220; la Figura 2E es un diagrama de la estructura de una partícula beta glucano YGP y la Figura 2F es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una micrografía fluorescente a color que muestra la ausencia de teñido con-AFITC.

La Figura 3A es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía de luz a color de células expuestas a partículas YGP cargadas con plásmido pIRES etiquetada fluorescente con PEI como el polímero de captura catiónico y CTAB como un detergente catiónico, indicando una célula 310 y la Figura 3B es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color del mismo campo de células que muestra teñido brillante que representa partículas YGP fluorescentes internalizadas por la misma célula 310 indicada en la Figura 3B.

La Figura 4A es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color de células, por ejemplo, una célula indicada 410; expuesta a partículas YGP etiquetadas fluorescentes, la Figura 4B es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color de células, por ejemplo, una célula indicada 420, expuesta a partículas YGP que contienen ADN pIRES, una polietilenimina de polímero de captura catiónico (PEI) y hexadeciltrimetilamoniobromuro detergente catiónico (también conocido como cetiltrimetilamoniobromuro o CTAB) que expresa GFP y la Figura 4C es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color de células, por ejemplo, una célula indicada 430, expuesta a partículas YGP que contienen ADN pIRES, un quitosán de polímero de captura catiónico y CTAB detergente catiónico que expresa GFP.

La Figura 5A es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente y de luz combinada a color de células, por ejemplo, una célula indicada 510, expuesta a partículas YGP etiquetadas fluorescentes; la Figura 5B es una representación gráfica de los resultados de un estudio de clasificación de células activadas fluorescentes (FACS) que muestra un pico mayor 520 que representa la distribución de señales a partir de células que tienen partículas YGP etiquetadas fluorescentes internalizadas y un pico menor 530 que representa la distribución de señales de células sin partículas YGP etiquetadas fluorescentes; la Figura 5C es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía de luz a color de células, por ejemplo, una célula indicada 540, expuesta a partículas YGP que contienen ADN etiquetado fluorescente, un polímero de captura catiónico PEI y CTAB detergente catiónico; la Figura 5D es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color del mismo campo de células que muestra la misma célula indicada 540, la Figura 5E es una representación gráfica de los resultados de un estudio FACS que muestra un pico mayor 610 que representa la distribución de señales de células que tienen partículas YGP internalizadas con carga útil de ADN fluorescente y un soporte 620 que representa la distribución de señales de células sin partículas YGP; la Figura 5F es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía de luz a color de células, por ejemplo, una célula indicada 710, incubada con partículas YGP que contienen carga útil de ARN antisentido fluorescente; la Figura 5G es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color del mismo campo de células que muestra la misma célula indicada 710; la Figura 5H es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una micrografía de luz a color de células, por ejemplo, una célula indicada 810, incubada con partículas YGP que contienen siARN etiquetado fluorescente, PEI y CTAB y la Figura 5I es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color del mismo campo de células que muestra la misma célula indicada 810 que contiene partículas YGP internalizadas con carga útil de ARNi fluorescente.

Las Figuras 6A-6G son imágenes a escala de grises de fotografías a color de células de macrófago murino J774 que muestran la absorción de partículas de pared de célula de levadura que contienen vectores de expresión pMFG-GC y expresión de glucocerebrasidasa humana (hGC). Las células se expusieron a una formulación de YGP o no tratada (conrolada), cultivada, y células adherentes se fijaron con formalina. Las células fijas se procesaron por inmunocitoquímica usando un anticuerpo anti-humano GC primario (antisuero de conejo), un anticuerpo secundario detectable apropiado (antisuero conjugado FITC anti-conejo de cabra), examinaron por microscopio de fluorescencia y fotografiaron. La Figura 6A es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía de luz transmitida a color de células J774, por ejemplo, una célula indicada 510, a partir de un cultivo de control no tratado. La Figura 6B es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía fluorescente a color del mismo campo de células J774 que muestra una carencia de células fluorescentemente etiquetadas. La Figura 6C es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía de fluorescencia y luz combinada a color de células J774 expuestas a una formulación de partículas de pared de células de levadura fluorescentemente etiquetadas (YGP-F) que muestran células, por ejemplo, célula 912, que contiene partículas fluorescentemente etiquetadas. Las Figuras 6D y 6E son imágenes a escala de grises de una fotomicrografía de luz transmitida a color y fotomicrografía de fluorescencia a color, respectivamente, del mismo campo de células J774 expuestas a una formulación de partículas de la pared de células de levadura que contienen vectores de expresión pMFG-GC (YGP:pMFG-GC:PEI:CTAB) que muestra expresión de glucocerebrosidasa humana (hGC) por inmunoreactividad en células fluorescentemente etiquetadas, por ejemplo, células 914.

Las Figuras 6F y 6G son imágenes a escala de grises de una fotomicrografía de luz transmitida a color y fotomicrografía de fluorescencia a color, respectivamente, del mismo campo de células J774 expuestas a una formulación de partículas de la pared de células de levadura que contienen vectores de expresión pMFG-GC (YGP-CN:pMFG-GC:CTAB) que muestra expresión de glucocerebrosidasa humana (hGC) por inmuno-reactividad en células fluorescentemente etiquetadas, por ejemplo, célula 916.

La Figura 7A es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía de fluorescencia y luz combinada a color de células J774 expuestas a una formulación de partículas fluorescentemente etiquetadas de la pared de células de levadura (YGMP-F) que muestra células, por ejemplo, células 925, que contiene partículas fluorescentemente etiquetadas y otras células, por ejemplo, células 926, que carecen de partículas fluorescentemente etiquetadas.

La Figura 7B es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía fluorescente a color de células J774 expuestas a una formulación de partículas de la pared de células de levadura que contiene un vector de expresión pIRES (YGMPpIRES) que muestra expresión de proteína fluorescente verde(GFP) en células fluorescentemente etiquetadas, por ejemplo, células 927.

La Figura 7C es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía fluorescente a color de células J774 expuestas a una formulación de partículas de la pared de células de levadura que contiene un vector de expresión pMFG-GC (YGMP-MFG-GC) que muestra expresión de glucocerebrosidasa humana (hGC) por inmuno-reactividad en células fluorescentemente etiquetadas, por ejemplo, células 928.

La Figura 8 es un diagrama esquemático de una modalidad preferida del método para suministrar partículas de betaglucano de levadura (YGP) 230 por migración de macrófago 370 a varios órganos 450, 452, 454, 456, 458 después de la administración oral in vivo 180. Una composición 182 que contiene partículas de beta-glucano de levadura (YGP) 230 se administra oralmente 180 a un sujeto 185. Las partículas de beta-glucano de levadura (YGP) 230 son absorbidas por las células M 355 en el revestimiento del intestino interno y son translocadas a través del epitelio 350 y son fagocitosadas por macrófagos intestinales 360. Los macrófagos que contienen YGP migran 370 a órganos y tejidos que incluyen hueso 450, pulmón 452, hígado 454, cerebro 456 y bazo 458. Aproximadamente 72 horas después de la administración oral, los macrófagos esplénicos 364 que tienen YGP fagocitosado se observan en el bazo 458 (mostrado ambos esquemáticamente en una imagen a escala de grises de contraste inverso de una fotomicrografía fluorescente a color). Aproximadamente 90 horas después de la administración oral, los macrófagos de médula ósea 362 que tienen YGP fagocitosado se observaron en hueso 450 (ambos mostrados esquemáticamente y en una imagen a escala de grises de contraste inverso de una fotomicrografía fluorescente a color).

La FIG. 9A y La Figura 9B son ilustraciones esquemáticas del uso de un vector de reemplazo que contiene loxP para generar un modelo de ratón de larga vida de enfermedad Gaucher que porta las mutaciones de punto L444P, R463C y N370S.

Las Figuras 10A-10D son imágenes a escala de grises fotomicrografías de luz transmitidas a color (Figura 10A y Figura 10C) y fotomicrografía de fluorescencia a color (Figura 10B y Figura 10D) de células de macrófago esplénico aisladas de ratones alimentados con partículas YGP etiquetadas fluorescentes. Alícuotas (0.1 ml) de YGP-F y YGMP-F se administraron a ratones (C57B1/6 tipo nativo y ratones mutantes con Gaucher) por alimentación forzada oral o inyección subcutánea que muestra macrófagos no fluorescentes 920 y macrófagos fluorescentes 922, 924.

Las Figuras 11A-11D son imágenes a escala de grises de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénico aisladas de ratones tratados in vivo que muestra la absorción de partículas de la pared de células de levadura que contienen vectores de expresión pIRES y expresión de proteína fluorescente verde(GFP). Las células aisladas se cultivaron a confluencia apropiada, y células adherentes se fijaron con formalina, se examinaron usando microscopio de fluorescencia y fotografiaron.

La Figura 11A es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe alimentación forzada oral in vivo de PBS (tratamiento de control) que muestra una carencia de macrófagos fluorescentes.

La Figura 11B es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe una inyección subcutánea in vivo de 0.1 ml de una formulación YGP-pIRES proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra un macrófago fluorescente 930.

La Figura 11C es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación YPG-pIRES proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra un macrófago fluorescente 931.

La Figura 11D es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación de YGMPpIRES proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra un macrófago fluorescente 932.

Las Figuras 12A-12M son imágenes de fotomicrografías de células de macrófago esplénicas inmunoteñidas aisladas de ratones tratados in vivo que muestra la absorción de partículas de la pared de células de levadura que contienen vectores de expresión pMFG-GC y expresión de glucocerebrosidasa humana (hGC). Las células aisladas se cultivaron a confluencia apropiada, y células adherentes se fijaron con formalina. Las células fijas se procesaron por inmunohistoquímica usando un anticuerpo GC anti-humano primario (antisuero de conejo), un anticuerpo secundario apropiado detectable (antisuero conjugado FITC anti-conejo de cabra), se examinaron usando microscopio fluorescente y fotografiaron.

La Figura 12A es una imagen de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas inmunoteñidas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe alimentación forzada oral in vivo de PBS (tratamiento de control) que muestra una carencia de macrófagos inmunoteñidos fluorescentes que expresan hGC.

Las Figuras 12B y 12C son imágenes de una fotomicrografía de luz transmitida a color (12B) y una fotomicrografía fluorescente a color (12C) de células de macrófago esplénicas inmunoteñidas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe una inyección subcutánea in vivo de 0.1 ml de una formulación YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra un macrófago inmunoteñido fluorescente que expresa hGC 935.

La Figura 12D es una imagen de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas inmunoteñidas aisladas de ratón mutante L444P -/- que recibe una inyección subcutánea in vivo de 0.1 ml de una formulación YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra un macrófago inmunoteñido fluorescente que expresa hGC 936.

La Figura 12E es una imagen de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas inmunoteñidas aisladas de un ratón mutante R463C -/- que recibe una inyección subcutánea in vivo de 0.1 ml de una formulación YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra un macrófago inmunoteñido fluorescente que expresa hGC 937.

Las Figuras 12F y 12G son imágenes de una fotomicrografía de luz transmitida a color (12F) y una fotomicrografía fluorescente a color (12G) de células de macrófago esplénicas inmunoteñidas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra macrófagos inmunoteñidos fluorescentes que expresan hGC, por ejemplo, macrófago 938.

Las Figuras 12H y 12I son imágenes de una fotomicrografía de luz transmitida a color (12H) y una fotomicrografía fluorescente a color (121) de células de macrófago esplénicas inmunoteñidas aisladas de ratón mutante L444P -/- que recibe 30 días de tratamiento de una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra macrófagos inmunoteñidos fluorescentes que expresan hGC, por ejemplo, macrófago 940.

La Figura 12J es una imagen de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas inmunoteñidas aisladas de un ratón mutante R463C -/- que recibe una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra macrófagos inmunoteñidos fluorescentes que expresan hGC, por ejemplo, macrófago 941.

La Figura 12K es una imagen de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas inmunoteñidas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación YGMPpMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra macrófagos inmunoteñidos fluorescentes que expresan hGC, por ejemplo, macrófago 942,

La Figura 12L es una imagen de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas inmunoteñidas aisladas de ratón mutante L444P -/- que recibe una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación YGMP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra macrófagos inmunoteñidos fluorescentes que expresan hGC, por ejemplo, macrófago 943.

La Figura 12M es una imagen de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas inmunoteñidas aisladas de un ratón mutante R463C -/- que recibe una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación YGMP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra macrófagos inmunoteñidos fluorescentes que expresan hGC, por ejemplo, macrófago 944.

La Figura 13 es una representación gráfica de datos a partir de un estudio que muestra la supervivencia incrementada vista en ratones con Gaucher R463C tratados con CBE después de la terapia de gen de expresión de glucocerebrosidasa en una modalidad preferida de la presente invención.

Lo mencionado anteriormente y otros objetos, características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción más particular de las modalidades preferidas de la invención, como se ilustra en los dibujos acompañantes en los cuales caracteres de referencia similares se refieren a las mismas partes a través de las vistas diferentes. Los dibujos no están necesariamente a escala, preferentemente se coloca énfasis sobre los que ilustran los principios de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona una composición que comprende: una pared de célula de levadura extraída que define un espacio interno y que comprende 6 a 90 por ciento en peso de beta-glucano; una molécula de captura de carga útil seleccionada del grupo que consiste de un polielectrolito catiónico, un polielectrolito aniónico, un polielectrolito anfotérico, un polisacárido, un polímero catiónico, un lípido catiónico, y una poliamina; y una molécula de carga útil seleccionada del grupo que consiste de (i) un ácido nucleico que codifica una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de enzima lisosomal, o un equivalente funcional de un activador de enzima lisosomal, en donde el activador de enzima lisosomal es seleccionado del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, Activador de proteína GM2; (ii) una proteína seleccionada del grupo que consiste de una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de enzima lisosomal y un equivalente funcional de un activador de enzima lisosomal, en donde el activador de enzima lisosomal es seleccionado del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, Activador de proteína GM2; y (iii) una mezcla de los mismos; en donde la molécula de carga útil está presente en una cantidad efectiva para complementar la función de una enzima lisosomal deficiente; en donde la molécula de carga útil y la molécula de captura de carga útil son solubles en el mismo sistema solvente; y en donde la molécula de captura de carga útil estabiliza la asociación de la molécula de carga útil y la pared de célula de levadura extraída. También se describe una pared de célula de levadura extraída que comprende betaglucano, una molécula de captura de carga útil y una molécula de carga útil, en donde la molécula de carga útil y la molécula de captura de carga útil son solubles en el mismo sistema solvente en donde la molécula de carga útil complementa la función de la enzima lisosomal deficiente. La invención además proporciona métodos para elaborar la composición.

Ventajosamente, la composición y método de la presente invención inherentemente dirigen macrófagos directamente y complementan la deficiencia de la proteína lisosomal, tal como una enzima en los macrófagos. La administración de la composición de la presente invención por rutas oral o mucosal o parenteral sirve para evitar los efectos adversos de enzima intravenosa o terapia de reemplazo de proteína. Complementar el déficit de proteína o enzimático suministrando un vector de expresión en lugar de la proteína codificada misma sirve para minimizar o evitar reacciones antigénicas. El método de la presente invención también puede ser usado para normalizar la actividad de enzima lisosomal endógena complementando activadores de enzima lisosomal, tales como saponina C.

Ventajosamente, dirigiendo macrófagos y otras células fagocíticas, la presente invención proporciona medios para suministrar el sistema terapéutico a un rango diverso de ubicaciones tales como hueso, riñón, pulmón, tracto gastrointestinal, y cerebro. Mientras no se desee ligar a una teoría particular, se cree que la migración de macrófagos y otras células fagocíticas a un sitio se determina en parte por uno o más estímulos, tales como inflamación, lípidos, u otros macrófagos fisiológicos atrayentes. Bajo este modelo, se cree que la población de células fagocíticas que portan la composición de la presente invención en cualquier tejido está en equilibrio dinámico con poblaciones similares en otros tejidos. Por lo tanto, la población de células fagocíticas que portan la composición en cualquier tejido particular, y de este modo la complementación de la enzima endógena deficiente, pueden fluctuar en tiempo, respondiendo, al menos en parte, a las influencias fisiológicas que actúan para regular el macrófago y otras distribuciones y actividades de células fagocíticas.

En general, las composiciones y métodos de la presente invención proporcionan suministro simple, eficaz y eficiente de agentes terapéuticos in vivo, preferiblemente por administración oral. Las composiciones tienen estabilidad mejorada comparada con composiciones disponibles, y tienen ventajas adicionales en la conveniencia del sujeto (y de este modo, cumplimiento del sujeto), costos inferiores y efectos secundarios reducidos o disminuidos.

Definiciones

“Sujeto” significa mamíferos y no mamíferos. “Mamífero” significa cualquier número de la clase Mammalia que incluye, pero no se limita a, humanos, primates no humanos tales como chimpancés y otros simios y especies de monos; animales de granja tales como vacas, caballos, ovejas, cabras y cerdos; animales domésticos tales como conejos, perros y gatos; animales de laboratorio que incluyen roedores, tales como ratas, ratones y cobayos; y similares. Ejemplos de no mamíferos incluyen, pero no se limitan a, aves y similares. El término “sujeto” no denota una edad o sexo particular.

Un “efecto terapéutico” significa un alivio de los síntomas o reducción del progreso de la enfermedad; en una deficiencia de enzima lisosomal, “efecto terapéutico” significa una complementación detectable de la función del gen deficiente o de la función del producto de gen deficiente. Una “cantidad terapéuticamente efectiva” significa una cantidad de un compuesto que, cuando se administra a un sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar tal tratamiento para la enfermedad. La “cantidad terapéuticamente efectiva” variará dependiendo del compuesto, el estado de enfermedad a ser tratado, la severidad o la enfermedad tratada, la edad y salud relativa del sujeto, la ruta y forma de administración, el juicio del médico especialista o practicante veterinario, y otros factores. Un “equivalente funcional” de una proteína significa una molécula, proteína o no proteína, que difiere estructuralmente de la proteína pero realiza la misma función como la proteína bajo condiciones equivalentes. Un “equivalente funcional” de una enzima lisosomal significa una molécula, proteína o no proteína, que difiere estructuralmente de la proteína y cataliza la misma reacción del sustrato de la enzima lisosomal nativa bajo condiciones equivalentes.

Moléculas de captura de carga útil

La molécula de captura de carga útil es preferiblemente un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las moléculas de captura y carga útil son ambas solubles en el sistema solvente; el sistema solvente debe ser absorbido a través de la matriz de carbohidrato de partícula de célula de levadura permitiendo la absorción del polímero de captura y carga útil.

Las moléculas de captura y carga útil son preferiblemente solubles en agua. En modalidades preferidas, la molécula de captura es biodegradable.

El mecanismo de acción de la reacción de captura con una carga útil dada dicta la elección de la molécula de captura de carga útil. Para interacciones electrostáticas se requiere una molécula de captura de carga útil cargada de carga opuesta de la carga útil. Para atrapamiento físico, la molécula de captura de carga útil adecuadamente participa en la formación de una matriz que reduce la difusión de una carga útil. En otras modalidades, la molécula de captura de carga útil contribuye a propiedad de enlace hidrofóbico que contribuye a la retención de la carga útil. En modalidades adicionales, la molécula de captura de carga útil selectivamente se une a la carga útil, proporcionando una interacción de afinidad que contribuye a la retención de la carga útil.

En general, polielectrolitos pueden ser moléculas de captura de carga útil adecuadas. Varios polielectrolitos adecuados se describen en la Patente Estadounidense No. 6,133,229. El polielectrolito puede ser un polielectrolito catiónico o aniónico. Los polielectrolitos anfotéricos también se pueden emplear. El polielectrolito catiónico es preferiblemente un polímero con grupos catiónicos distribuidos a lo largo de la cadena molecular. Los grupos catiónicos, los cuales en ciertas modalidades pueden incluir porciones derivadas de amonio cuaternario, pueden ser dispuestos en grupos laterales colgantes de la cadena o pueden ser incorporados en esta. Ejemplos de polielectrolitos catiónicos incluyen: copolímeros de vinil pirrolidona y metil metacrilato cuaternario por ejemplo, GAFQUAT®. series (755N, 734, HS-100) obtenidos de ISP; poliacrilamidas sustituidas; polietilenimina, polipropilenimina y derivados sustituidos; homopolímeros de poliamina (GOLCHEM® CL118); copolímeros de poliamina (por ejemplo, condensados de epiclorohidrina y mono o dimetilamina); cloruro de polidialildimetilamonio (poliDADMAC); dextranos sustituidos; goma guar modificada (sustituida con cloruro de hidroxipropiltrimonio); proteínas sustituidas (por ejemplo, grupos cuaternarios sustituidos en proteína de soya y colágeno hidrolizado); poliaminoácidos (por ejemplo, polilisina); compuestos de poliamino de bajo peso molecular (por ejemplo, espermina y espermidina). Polímeros naturales o artificiales pueden ser empleados. Polielectrolitos catiónicos con MW 150 a 5,000,000, preferiblemente 5000 a 500,000, más preferiblemente 5000 a 100,000 se pueden emplear. Una cantidad de 0.01 a 10% es preferida, más preferiblemente 0.1 a 2% p/v, especialmente 0.05 a 5%.

El polielectrolito aniónico es preferiblemente un polímero con grupos aniónicos distribuidos a lo largo de la cadena molecular. Los grupos aniónicos, los cuales pueden incluir carboxilato, sulfonato, sulfato u otros agrupamientos ionizables negativamente cargados, pueden estar dispuestos sobre grupos colgantes de la cadena o unidos directamente a la estructura polimérica. Se pueden emplear polímeros naturales o artificiales.

Ejemplos de polielectrolitos aniónicos incluyen: un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico, un copolímero de metil vinil éter y ácido maleico, (Gantrez series AN-series y series S, respectivamente, International Specialty Products, Wayne, NJ); ácido algínico y sales; carboximetil celulosas y sales; poliacrilamidas sustituidas (por ejemplo, sustituidas con grupos de ácido carboxílico); ácidos poliacrílicos y sales; ácidos poliestirensulfónico y sales; sulfatos de dextrano; sacáridos sustituidos por ejemplo, octosulfato de sacarosa; heparina. Los polielectrolitos aniónicos con PM de 150 a 5,000,000 se pueden usar, preferiblemente 5000 a 500,000, más preferiblemente 5000 a 100,000. Una cantidad de 0.01% a 10% es especialmente preferida 0.05 a 5% muy especialmente 0.1 a 2% p/v.

Polímeros biológicos, tales como polisacáridos, son polímeros de captura preferidos. Preferiblemente, los polímeros son procesados a un peso molecular promedio a menos de 100,000 Daltons. Los polímeros son preferiblemente derivatizados para proporcionar características catiónicas o aniónicas. Los polisacáridos adecuados incluyen quitosán (quitina desacetilada), alginatos, dextranos, tales como 2-(dietilamino) etil éter dextrano (DEAE-dextrano) y sulfato de dextrano, xantanos, goma de algarrobo y gomas guar.

Dos clases generales de moléculas catiónicas son adecuadas para uso como moléculas de captura con cargas útiles cargadas negativamente tales como ácidos nucleicos: polímeros y lípidos catiónicos.

Se ha mostrado una amplia variedad de polímeros catiónicos para mediar la transfección in vivo, que varían de proteínas [tales como histonas (Fritz, J. D., et al, (1996) Hum. Gene Ther. 7, 1395-1404) y proteínas del grupo de alta movilidad (HMG) (Mistry, A. R., et al. (1997) BioTechniques 22, 718-729)] y polipéptidos [tales como polilisina (Wu, G. Y. & Wu, C.

H. (1987) J. Biol. Chem. 262, 4429-4432, Wagner, E., et al., (1991) Bioconjugate Chem. 2, 226-231, péptidos sintéticos cortos (Gottschalk, S., et al., (1996) Gene Ther. 3, 448-457; Wadhwa, M. S., et al., (1997) Bioconjugate Chem. 8, 81-88), y péptidos anfifílicos helicoidales (Legendre, J. Y., et al., (1997) Bioconjugate Chem. 8, 57-63; Wyman, T. B., et al., (1997) Biochemistry 36, 3008-3017)] a polímeros sintéticos [tales como polietilenimina (Boussif, O., et al., (1996) Gene Ther. 3, 1074-1080), dendrímeros catiónicos (Tang, M. X., et al., (1996) Bioconjugate Chem. 7, 703-714; Haensler, J. et al., (1993) Bioconjugate Chem. 4, 372-379), y polímeros de glucaramida (Goldman, C. K., et al., (1997) Nat. Biotech. 15, 462-466)]. Otros polímeros catiónicos adecuados incluyen oligómeros de glicina N-sustituidos (peptoides) (Murphy, J.E., et al, A combinatorial approach to the discovery of efficient cationic peptoid reagents for gene delivery, Proc Natl Acad Sci. USA, 1998 95 (4)1517-1522), poli(ácido 2-metil-acrílico 2-[(2-dimetilamino)-etil)-metil-amino]-etil éster), abreviado como pDAMA, y poli(2-dimetilamino etil)-metacrilato (pDMAEMA) (Funhoff, A.M., et al., 2004 Biomacromolecules, 5, 3239).

Los cationes lípidos también se conocen en la técnica por ser adecuados para transfección. Felgner, P.L1, et al., Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci USA. 1987 84(21):7413-7. Lípidos catiónicos adecuados incluyen cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), [yoduro de N,N,N',N'-tetrametil-N,N'-bis(2-hidroxietil)-2,3-di(oleoiloxi)-1,4-butandiamonio] (Promega Madison, WI, USA), dioctadecilamidoglicil espermina (Promega Madison, WI, USA), metilsulfato de N-[1-(2,3-Dioleoiloxi)]-N,N,Ntrimetilamonipropano (DOTAP), cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio, bromuro de 1,2dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxietilamonio (DMRIE), dimiristoleoilfosfonometiltrimetilamonio (DMPTA) (véase Floch et al. 1997, Cationic fosfonolipids as non-viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molec. & Diseases 23:69-87), sal de amonio de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(7-nitro-2-1,3benzoxadiazol-4-il), (Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, AL, US), cloruro de 1,2-dioleoil-3-trimetilamoniopropano (Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, AL, US), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, AL, US) y 1,3-dioleoiloxi-2-(6-carboxiespermil)propilamida (DOSPER).

Las poliaminas adecuadas como moléculas de captura catiónicas se describen en las Patentes Estadounidenses No. 6,379,965 y 6,372,499.

Moléculas de Carga útil

El sistema de suministro de partícula de la presente invención es útil para suministro in vivo o in vitro de moléculas de carga útil y moléculas de carga útil seleccionadas del grupo que consiste de (i) un ácido nucleico que codifica una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de enzima lisosomal, o un equivalente funcional de un activador de enzima lisosomal, en donde el activador de enzima lisosomal se selecciona del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, proteína activadora de GM2; (ii) una proteína seleccionada del grupo que consiste de una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de enzima lisosomal y un equivalente funcional de un activador de enzima lisosomal, en donde el activador de enzima lisosomal se selecciona del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, proteína activadora GM2; y (iii) una mezcla de los mismos.

En otras modalidades preferidas, el sistema de suministro de partícula de la presente invención es útil para suministro in vivo o in vitro de moléculas de carga útil tales como aminoácidos, péptidos y proteínas. Por "proteína" significa una secuencia de aminoácidos para los cuales la longitud de cadena es suficiente para producir los niveles superiores de estructura terciaria y/o cuaternaria. Esto se distingue de “péptidos” u otros fármacos de peso molecular menor que no tienen tal estructura. Típicamente, la proteína aquí tendrá un peso molecular de al menos aproximadamente 15-20 kD, preferiblemente al menos aproximadamente 20 kD.

La molécula de carga útil de la proteína es preferiblemente esencialmente pura y deseablemente esencialmente homogénea (es decir, libre de proteínas contaminantes, etc). Proteína "esencialmente pura" significa una composición que comprende al menos aproximadamente 90% en peso de la proteína, con base en el peso total de la composición, preferiblemente al menos aproximadamente 95% en peso. Proteína "esencialmente homogénea" significa una composición que comprende al menos aproximadamente 99% en peso de proteína, con base en el peso total de la composición. Las proteínas se pueden derivar de fuentes que se originan naturalmente o producir por tecnología recombinante.

La molécula de carga útil de la proteína es preferiblemente esencialmente pura y deseablemente esencialmente homogénea (es decir, libre de proteínas contaminanes, etc.). Proteína "esencialmente pura" significa una composición que comprende al menos aproximadamente 90% en peso de la proteína, con base en el peso total de la composición, preferiblemente al menos aproximadamente 95% en peso. Proteína "esencialmente homogénea" significa una composición que comprende al menos aproximadamente 99% en peso de proteína, con base en el peso total de la composición. Las proteínas se pueden derivar de fuentes que se originan naturalmente o producir por tecnología recombinante.

Proteínas incluyen variantes producidas por sustituciones de aminoácido o por evolución de proteína directa (Kurtzman,

A. L., et al., Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination; applications to therapeutic proteins, Curr Opin Biotechnol. 2001 12(4);361-70), así como también derivados, tales como proteínas PEGiladas.

Terapia de Gen

También se describen composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos o condiciones genéticas que tienen un componente genético. Se describen composiciones útiles para la manufactura de productos farmacéuticos para el tratamiento de trastornos o condiciones genéticas que tiene un componente genético.

El proyecto de Genoma Humano ha incrementado el conocimiento de las bases genéticas de la enfermedad. Véase, en general, http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/medicine/assist.shtml.

Factores tanto ambientales como genéticos tienen papeles en el desarrollo de cualquier enfermedad. Un trastorno genético es una enfermedad causada por anormalidades en el material genético del individuo (genoma). Existen cuatro diferentes tipos de trastornos genéticos: (1) gen único, (2) multifactorial, (3) cromosomal, y (4) mitocondrial.

(1): Gen único (también llamado Mendeliano o monogénico) - Este tipo es causado por cambios o mutaciones que ocurren en la secuencia de ADN de un gen. Los genes codifican para proteínas las moléculas que portan la mayoría del trabajo, realizan la mayoría de las funciones vitales, y aún constituyen la mayoría de las estructuras celulares. Cuando un gen es mutado de manera que su producto de proteína no puede más llevar su función normal, puede resultar un trastorno. Existen más de 6,000 trastornos de gen único conocidos, los cuales ocurren en aproximadamente 1 de cada 200 nacimientos. Algunos ejemplos son fibrosis quística, anemia de células falciformes, síndrome de Marfan, enfermedad de Huntington y hemocromatosis hereditaria.

(2): Multifactorial (también llamado complejo o poligénico) - Este tipo es causado por una combinación de factores ambientales y mutaciones en genes múltiples. Por ejemplo, diferentes genes que influencian la susceptibilidad a cáncer de mama se han encontrado en los cromosomas 6, 11, 13, 14, 15, 17, y 22. Su naturaleza más complicada hace mucho más difícil de analizar que un gen único o trastornos cromosomales. Algunos de los trastornos crónicos más comunes son trastornos multifactoriales. Ejemplos incluyen enfermedad cardiaca, alta presión en sangre, enfermedad de Alzheimer, artritis, diabetes, cáncer y obesidad. La herencia multifactorial también está asociada con rasgos heredables tales como patrones en las huellas del dedo, altura, color de ojos y color de piel.

(3): Cromosomal - Cromosomas, estructuras distintas hechas de ADN y proteína, están localizadas en el núcleo de cada célula. Debido a que los cromosomas son portadores de material genético, tales anormalidades en la estructura de cromosoma como reincorporación o rompimiento de grosor o copias adicionales o faltas (translocaciones) pueden resultar en la enfermedad. Algunos tipos de anormalidades cromosomales mayores pueden ser detectadas por examinación microscópica. El síndrome de Down o trisomia 21 es un trastorno común que ocurre cuando una persona tiene tres copias del cromosoma 21.

(4): Mitocondrial - Esta tipo relativamente raro de trastorno genético es causado por mutaciones en el ADN no cromosomal de la mitocondria: las mitocondrias son organelos similares a varillas o redondos pequeños que están involucrados en la respiración celular y se encuentran en el citoplasma de células vegetales y animales. Cada mitocondrión puede contener 5 a 10 piezas circulares de ADN.

Un sistema de suministro de partícula puede ser usado para administrar al menos un ácido nucleico que comprende un gen de compensación. Un sistema de suministro de partícula puede ser usado para administrar al menos un ácido nucleico que codifica un producto de gen de un gen perdido, en donde la expresión del producto de gen es útil en el tratamiento del trastorno genético o el componente genético de una condición. Un sistema de suministro que incluye la molécula de carga útil deseada útil para la manufactura de un producto farmacéutico, puede ser para el tratamiento de trastorno genético o el componente genético de una condición. Tales productos farmacéuticos son adecuadamente administrados oralmente, rectalmente, parenteralmente, (por ejemplo, intravenosamente, intramuscularmente, o subcutáneamente) intracisternalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, intravesicalmente, localmente (por ejemplo, polvos, ungüentos o gotas), o como un atomizador nasal o bucal. Los productos farmacéuticos son preferiblemente administrados oralmente, bucalmente, y parenteralmente, más preferiblemente oralmente. Partículas cargadas con diferentes cargas útiles, por ejemplo, un ácido nucleico, un ácido nucleico, vector de expresión o un terapéutico de molécula pequeña, pueden ser mezclados en las proporciones apropiadas y administrados en conjunto, por ejemplo, en una cápsula, para terapia de combinación.

Las composiciones de ácido nucleico contienen ya sea genes de compensación o genes que codifican proteínas terapéuticas. Ejemplos de genes de compensación incluyen un gene que codifica distrofina o un fragmento funcional, un gen para compensar el gen defectivo en sujetos que sufren de fibrosis quística, un gen para compensar el gen defectivo en sujetos que sufren de ADA, y un gene que codifica el Factor VIII. Ejemplos de genes que codifican proteínas terapéuticas incluyen genes los cuales codifican a eritropoyetina, interferona, receptor LDL, GM-CSF, IL-2, IL-4 y TNF. Adicionalmente, composiciones de ácido nucleico las cuales codifican componentes de anticuerpo de cadena única los cuales específicamente se enlazan a sustancias tóxicas pueden ser administradas. En algunas modalidades preferidas, se proporciona el gen distrofina como parte de un mini-gen y se usa para tratar individuos que sufren de distrofia muscular. En algunas modalidades preferidas, se proporciona un mini-gen el cual contiene secuencias codificantes para una proteína de distrofina parcial. Las anormalidades de distrofina son responsables de tanto la Distrofia Muscular de Becker más leve (BMD) como la Distrofia Muscular de Duchenne más severa (DMD). En distrofina de BMD se hace pero es anormal en ya sea tamaño y/o cantidad. El sujeto es leve a moderadamente débil. En DMD no se hace proteína y el sujeto está unido a la silla de ruedas desde los 13 años y usualmente muere a los 20 años. En algunos sujetos, particularmente aquellos que sufren de BMD, la proteína distrofina parcial producida por expresión de un mini-gen suministrado de conformidad con la presente invención, puede proporcionar función mejorada del músculo.

Las composiciones de la invención pueden ser usadas para el tratamiento de trastornos lisosomales. Una composición farmacéutica que comprende la composición de la invención y un exciiente farmacéuticamente aceptable. El uso de la composición de la invención para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de un trastorno de almacenaje lisosomal. El trastorno de almacenaje lisosomal puede ser un metabolismo defectivo de glicosaminoglicanos, una degradación defectiva de la porción glicano de glicoproteínas, una degradación defectiva de glicógeno, una degradación defectiva de componentes esfingolípidos, una degradación defectiva de polipéptidos, una degradación defectiva o transporte de colesterol, ésteres de colesterol u otros complejos lípidos, una deficiencia de enzimas lisosomales múltiples, un defecto de transporte o un defecto de tráfico intracelular. Además, la composición puede ser una composición farmacéutica de la invención que además comprende bromuro de hexadecilmetilamonio.

Rutas de administración

Las rutas de administración incluyen pero no se limitan a oral, bucal, sublingual, pulmonar, transdérmica, transmucosal, así como inyección subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, e intramuscular. Rutas preferidas de administración son oral; bucal, sublingual, pulmonar y transmucosal.

El sistema de suministro de partícula de la presente invención se administra a un sujeto en una cantidad terapéuticamente efectiva. El sistema de suministro de partícula se puede administrar solo o como parte de una composición farmacéuticamente aceptable. Además, un compuesto o composición se puede administrar todo en una vez, como por ejemplo, por inyección de bolo, en múltiples veces, tal como por una serie de tabletas, o de manera uniforme sustancialmente suministrada sobre un periodo de tiempo, como por ejemplo, usando una formulación de liberación controlada. También se nota que la dosis del compuesto puede ser variada sobre el tiempo. El sistema de suministro de partícula se puede administrar usando una formulación de liberación inmediata, una formulación de liberación controlada, o sus combinaciones. El término “liberación controlada” incluye liberación sostenida, liberación retardada, y combinaciones de las mismas.

Una composición farmacéutica de la invención se puede preparar, empacar, o vender a granel, como una dosis unitaria sencilla, o como una pluralidad de dosis unitarias sencillas. Como se usa aquí, una “dosis unitaria” es la cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a la dosificación del ingrediente activo que puede ser administrado a un sujeto o una fracción conveniente de dicha dosificación tal como, por ejemplo, una mitad o un tercio de dicha dosificación.

Las cantidades relativas del ingrediente activo, el portador farmacéuticamente aceptable, y cualquiera de los ingredientes adicionales en una composición farmacéutica de la invención variará, dependiendo de la identidad, tamaño, y condición del humano tratado y además dependiendo de la ruta por la cual la composición se administra. A manera de ejemplo, la composición puede comprender entre 0.1% y 100% (p/p) de ingrediente activo. Una dosis unitaria de una composición farmacéutica de la invención generalmente comprenderá de aproximadamente 100 miligramos a aproximadamente 2 gramos del ingrediente activo, y preferiblemente comprende de aproximadamente 200 miligramos a aproximadamente

1.0 gramos del ingrediente activo.

Además, un sistema de suministro de partícula de la presente invención se puede administrar solo, en combinación con otro sistema de suministro de partícula con una carga útil, o con otros compuestos activos farmacéuticamente. Los otros compuestos activos farmacéuticamente se pueden seleccionar para tratar la misma condición como el sistema de suministro de partícula o una condición diferente.

Si el sujeto recibe o es que recibe compuestos activos farmacéuticamente múltiples, los compuestos se pueden administrar de manera simultánea o secuencial en cualquier orden. Por ejemplo, en el caso de tabletas, los compuestos activos se pueden encontrar en una tableta o en tabletas separadas, que se pueden administrar en una vez o de manera secuencial en cualquier orden. Además, se debe reconocer que las composiciones pueden estar en formas diferentes. Por ejemplo, uno o más compuestos se pueden suministrar vía una tableta, mientras otro se administra vía inyección u oralmente como un jarabe.

Se describe un kit que comprende una composición farmacéutica de la invención y material de instrucciones. Material de instrucciones incluye una publicación, un registro, un diagrama, o cualquier otro medio de expresión que se usa para comunicar la utilidad de la composición farmacéutica de la invención para uno de los propósitos expuestos aquí en un humano. El material de instrucciones también puede, por ejemplo, describir una dosis apropiada de la composición farmacéutica de la invención. El material de instrucciones del kit puede, por ejemplo, se fijado a un contenedor que contiene una composición farmacéutica de la invención o ser incluido junto con un contenedor que contiene la composición farmacéutica. De manera alternativa, el material de instrucciones se puede incluir de manera separada del contenedor con la intención de que el material de instrucciones y la composición farmacéutica se use cooperativamente por el recipiente.

También se describe un kit que comprende una composición farmacéutica de la invención y un dispositivo de suministro para suministrar la composición a un humano. A manera de ejemplo, el dispositivo de suministro puede ser una botella de rociado flexible, una botella de rociado de dosis medida, un dispositivo de rociado en aerosol, un atomizador, un dispositivo de suministro de polvo seco, un solvente auto-propelente/dispositivo de dispersión en polvo, una jeringa, una aguja, un tapón, o un contenedor de medición de dosificación. El kit puede además comprender un material de instrucciones como se describe aquí.

Por ejemplo, un kit puede comprender dos composiciones farmacéuticas separadas que comprenden respectivamente una primera composición que comprende un sistema de suministro de partícula y un portador farmacéuticamente aceptable; y la composición que comprende el segundo compuesto activo farmacéuticamente y un portador farmacéuticamente aceptable. El kit también comprende un contenedor para las composiciones separadas, tal como una botella dividida o un paquete de lámina dividida. Ejemplos adicionales de contenedores incluyen jeringas, cajas, bolsas, y lo similar. Usualmente, un kit comprende direcciones para la administración de los componentes separados. La forma del kit es particularmente ventajosa cuando los componentes separados son preferiblemente administrados en diferentes formas de dosificación (por ejemplo, oral y parenteral), se administran en diferentes intervalos de dosificación, o cuando la valoración de los componentes individuales de la combinación se desea por el médico que prescribe.

Un ejemplo de un kit es un paquete de ampollas. Paquetes de ampollas son bien conocidos en la industria de empaque y están siendo ampliamente usados para el empaquetamiento de formas de dosificación unitarias farmacéuticas (tabletas, cápsulas, y lo similar). Paquetes de ampollas generalmente consisten de una hoja de material relativamente rígido cubierto con una lámina de un material plástico transparente preferiblemente. Durante el proceso de empaque se forman huecos en la lámina de plástico. Los huecos tienen el tamaño y forma de las tabletas o cápsulas a ser empacadas. Después, las tabletas o cápsulas se colocan en los huecos y una hoja de material relativamente rígido se sella contra la lámina de plástico en la cara de la lámina que es opuesta de la dirección en la cual los huecos se forman. Como un resultado, las tabletas o cápsulas se sellan en los huecos entre la lámina de plástico y la hoja. Preferiblemente la fuerza de la hoja es tal que las tabletas o cápsulas se pueden remover del paquete de ampolla mediante presión aplicada manualmente en los huecos con lo cual una abertura se forma en la hoja en el lugar del hueco. La tableta o cápsula después se remueve vía dicha abertura.

Puede ser deseable proveer una ayuda de memoria en el kit, por ejemplo, en la forma de números siguientes a las tabletas o cápsulas con lo cual los números corresponden con los días del régimen que las tabletas o cápsulas así especificadas se deben ingerir. Otro ejemplo de dicha ayuda a la memoria es un calendario impreso en la tarjeta, por ejemplo como sigue: “Primera semana, lunes, martes, … etc…. Segunda semana, lunes, martes” etc. Otras variaciones de ayuda de memoria serán fácilmente aparentes. Una “dosis diaria” puede ser una tableta sencilla o cápsula o varias píldoras a ser tomadas en un día dado. También, una dosis diaria de una composición de sistema de suministro de partícula puede consistir de una tableta o cápsula, mientras una dosis diaria del segundo compuesto puede consistir de varias tabletas o cápsulas y viceversa. La ayuda de memoria debe reflejar esta y ayudar en la administración correcta.

También se describe un dispensador diseñado para dispensar las dosis diarias una en una vez en el orden de su uso destinado. Preferiblemente, el dispensador se equipa con una ayuda de memoria, de modo que además facilita el cumplimiento con el régimen de dosificación. Un ejemplo de dicha ayuda de memoria es un contador mecánico, que indica el número de dosis diarias que se han dispensado. Otro ejemplo de dicha ayuda de memoria es una memoria con microprocesador energizado con batería acoplada con un lector de cristal líquido, una señal de recordatorio audible que, por ejemplo lee fuera de la fecha en que la última dosis diaria se ha tomado y/o recuerda cuando la siguiente dosis se debe tomar.

Una composición de sistema de suministro de partícula, opcionalmente que comprende otros compuestos activos farmacéuticamente, se pueden administrar a un sujeto ya sea oralmente, rectalmente, parenteralmente, (por ejemplo, intravenosamente, intramuscularmente, o subcutáneamente) de forma intracisternal, intravaginalmente, intraperitonealmente, intravesicularmente, localmente (por ejemplo, polvos, ungüentos, o gotas), o como un rociado bucal o nasal.

Administración parenteral de una composición farmacéutica incluye cualquier ruta de administración caracterizado por el rompimiento físico de un tejido de un humano y la administración de la composición farmacéutica a través del rompimiento del tejido. Administración parenteral de esta manera incluye la administración de una composición farmacéutica mediante inyección de la composición, mediante la aplicación de la composición a través de una incisión quirúrgica, mediante la aplicación de la composición de la composición a través de una herida no quirúrgica que penetra el tejido, y lo similar. En particular, la administración parenteral incluye subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intramuscular, o inyección intraesternal o intravenosa, intraarterial o técnicas de infusión dialítica de riñón.

Composiciones adecuadas para inyección parenteral comprenden el ingrediente activo combinado con un portador farmacéuticamente aceptable tal como soluciones acuosas no acuosas estériles fisiológicamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, o pueden comprender polvos estériles para reconstitución en soluciones inyectables estériles o dispersiones. Ejemplos de portadores acuosos o no acuosos adecuados, diluyentes, solventes o vehículos incluyen agua, solución salina isotónica, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, y lo similar), sus mezclas adecuadas, triglicéridos, que incluyen aceites vegetales tales como aceite de oliva, o ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. Fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y/o mediante el uso de agente tensoactivos. Dichas formulaciones se pueden preparar, empacar, o vender en una forma adecuada para administración de bolo o para administración continua. Formulaciones inyectables se pueden preparar, empacar, o vender en forma de dosificación unitaria, tal como ampollas, en contenedores de dosis múltiples, que contienen un conservador, o un dispositivo de uso sencillo para auto-inyección o inyección por un practicante médico.

Formulaciones para administración parenteral incluyen suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, pastas, y formulaciones biodegradables o de liberación sostenida implantable. Dichas formulaciones pueden además comprender uno o más ingredientes adicionales que incluyen agentes de suspensión, estabilización, o dispersión. En una modalidad de una formulación para administración parenteral, el ingrediente activo se provee en forma seca (es decir, polvo o granular) para reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua libre de pirógeno estéril) antes de administración parenteral de la composición reconstituida. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar, empacar, o vender en la forma de una suspensión o solución acuosa o aceitosa inyectable estéril. Esta suspensión o solución se puede formular de acuerdo con la técnica conocida, y puede comprender, además del ingrediente activo, ingredientes adicionales tal como agentes de dispersión, agentes humectantes, o agentes de suspensión descritos aquí. Dichas formulaciones inyectables estériles se pueden preparar usando un diluyente o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, tal como agua o 1,3-butanediol, por ejemplo. Otros diluyentes y solventes aceptables incluyen solución de Ringer, solución de cloruro de sodio isotónico, y aceites fijados tal como mono- o diglicéridos sintéticos. Otras formulaciones parenteralmente administrables que son útiles incluyen aquellos que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina, en una preparación liposomal, o como un componente de un sistema de polímero biodegradable. Composiciones para liberación sostenida o implantación puede comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables tal como emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero soluble que se ingiere, o una sal soluble que se ingiere.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tal como agentes de conservación, humectación, emulsionamiento, y/o dispersión. Prevención de contaminación por microorganismos de las composiciones se pueden realizar por la adición de varios agentes antibacterianos y anti-fúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y lo similar. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio, y lo similar. Absorción prolongada de composiciones farmacéuticas inyectables se pueden llevar por el uso de agentes capaces de absorción retardada, por ejemplo, monoestearato de aluminio y/o gelatina.

Formas de dosificación pueden incluir implantes o depósitos inyectables o sólidos. En modalidades preferidas, el implante comprende una alícuota del sistema de suministro de partícula y un polímero biodegradable. En modalidades preferidas, un polímero biodegradable adecuado se puede seleccionar del grupo que consiste de poliaspartato, poliglutamato, poli(L-láctido), un poli(D,L-láctido), un poli(láctido-co-glicólido), un poli(s-caprolactona), un polianhídrido, un poli(beta-hidroxi butirato), un poli(orto éster) y un polifosfazeno.

Formas de dosificación sólida para administración oral incluyen cápsulas, tabletas, polvos, y gránulos. En dichas formas de dosificación sólidas, el sistema de suministro de partícula es opcionalmente mezclado con al menos un excipiente habitual inerte (o portador) tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio o (a) sustancias de relleno o entendedores, como por ejemplo, almidones, lactosa, sacarosa, manitol, o ácido silícico; (b) aglutinantes, como por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa, o acacia; (c) humectantes, como por ejemplo, glicerol; (d) agentes de desintegración, como por ejemplo, agar-agar, carbonato de calcio, papa o almidón de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos de complejo, o carbonato de sodio; (e) retardantes de solución, como por ejemplo, parafina; (f) aceleradores de absorción, como por ejemplo, compuestos de amonio cuaternario, (g) agentes humectantes, como por ejemplo, alcohol cetílico o monoestearato de glicerol; (h) adsorbentes, como por ejemplo, caolín, o bentonita; y/o (i) lubricantes, como por ejemplo, talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio, o sus mezclas. En el caso de cápsulas y tabletas, las formas de dosificación también pueden comprender agentes reguladores de pH.

Una tableta que comprende el sistema de suministro de partícula puede, por ejemplo, ser preparada al comprimir o moldear el ingrediente activo, opcionalmente con uno o más ingredientes adicionales. Tabletas comprimidas se pueden preparar al comprimir, en un dispositivo adecuado, el ingrediente activo en una forma que fluye libre tal como un polvo preparación granular, opcionalmente mezclada con uno o más de aglutinantes, un lubricante, un excipiente, un agente activo superficial, y un agente de dispersión. Tabletas moldeadas se pueden hacer al moldear, en un dispositivo adecuado, una mezcla de ingrediente activo, un portador farmacéuticamente aceptable y al menos líquido suficiente para humectar la mezcla. Excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de tabletas incluyen diluyentes inertes, agentes de granulación y desintegración, agentes aglutinantes y agentes lubricantes. Agentes de dispersión conocidos incluyen almidón de papa y glicolato almidón de sodio. Los agentes activos superficiales conocidos incluyen lauril sulfato de sodio. Diluyentes conocidos incluyen carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, celulosa microcristalina, fosfato de calcio, fosfato hidrógeno de calcio y fosfato de sodio. Agentes de granulación y desintegración conocidos incluyen almidón de maíz y ácido algínico. Agentes aglutinantes conocidos incluyen gelatina, acacia, almidón de maíz pre-gelatinizado, polivinilpirrolidona e hidroxipropil metilcelulosa. Agentes de lubricación conocidos incluyen estearato de magnesio, ácido esteárico, sílice y talco.

Tabletas pueden ser no recubiertas o pueden estar cubiertas mediante métodos conocidos para lograr la desintegración retrasada en el tracto gastrointestinal de un humano, lo que proporciona la liberación sostenida y absorción del sistema de suministro de partícula, por ejemplo, en la región del parche de Peyer en el intestino delgado. A modo de ejemplo, un material como gliceril monostearato o distearato de glicerilo puede utilizarse para recubrir las tabletas. Aún más a modo de ejemplo, las tabletas pueden estar cubiertas según métodos descritos en la Patente Estadounidense Nos. 4,256,108; 4,160,452; y 4,265,874 para formar tabletas de liberación controlada de forma osmótica. Las tabletas además pueden constar de un agente de edulcoración, agente saborizante, un agente de color, un preservativo o alguna combinación de estos para proporcionar una preparación farmacéuticamente elegante y apetitosa.

Formas de dosificación sólida como tabletas, grageas, cápsulas y gránulos pueden ser preparados con revestimientos o cubiertas, como recubrimientos entéricos y otros bien conocidos en la técnica. También pueden contener agentes opacantes y también pueden ser de esa composición que liberan el sistema de suministro de partícula de manera retardada. Ejemplos composiciones de fijación que se pueden utilizar son ceras y sustancias poliméricas. Los compuestos activos también pueden estar en forma micro-encapsulada, si procede, con uno o más de los excipientes antes mencionados.

Composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden utilizar como rellenos en cápsulas de gelatina blanda o dura utilizando esos excipientes como lactosa o azúcar de la leche, así como glicoles de polietileno de alto peso molecular y lo similar. Cápsulas duras que comprenden el sistema de suministro de partícula se pueden hacer mediante una composición fisiológicamente degradable, tal como la gelatina. Estas cápsulas duras comprenden el sistema de suministro de partícula y pueden comprender aún más ingredientes adicionales como, por ejemplo, un diluyente sólido inerte como carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín. Cápsulas de gelatina blanda que integran el sistema de suministro de partícula se pueden hacer mediante una composición fisiológicamente degradable, tal como la gelatina. Estas cápsulas blandas comprenden el sistema de suministro de partícula, que se puede mezclar con agua o un medio aceitoso tal como aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

Composiciones orales se pueden hacer, utilizando tecnología conocida, que específicamente libera agentes administrados por vía oral en el intestino delgado y grueso de un sujeto humano. Por ejemplo, formulaciones para el suministro en el sistema gastrointestinal, incluyendo el colon, incluyen sistemas con recubrimiento entérico, basados, por ejemplo, en copolímeros de metacrilato tales como poli(ácido metacrílico, metacrilato de metilo), que sólo son solubles a pH 6 y superior, para que el polímero sólo comience a disolverse a su entrada en el intestino delgado. El sitio donde se desintegran tales formulaciones de polímero depende de la tasa de tránsito intestinal y la cantidad de polímero presente. Por ejemplo, una capa de polímero relativamente gruesa se utiliza para el suministro en el colon proximal (Hardy et al., 1987 Aliment. Pharmacol. Therap. 1:273-280). También se pueden utilizar polímeros capaces de proporcionar suministro al colon específico del sitio, en el que el polímero se basa en la flora bacteriana del intestino grueso para proporcionar la degradación enzimática de la capa de polímero y, por tanto, liberación del fármaco. Por ejemplo, azopolímeros (Patente de E.U.A. No. 4,663,308), glicósidos (Friend et al., 1984, J. Med. Chem. 27:261- 268) y una variedad de polisacáridos naturalmente disponibles y modificados (ver la solicitud de PCT PCT/GB89/00581) se pueden usar en dichas formulaciones.

Tecnología de liberación pulsada como la que se describe en la Patente de E.U.A. 4,777,049 también puede utilizarse para administrar el sistema de suministro de partícula a una ubicación específica dentro del tracto gastrointestinal. Estos sistemas permiten el suministro en un tiempo predeterminado y se pueden usar para suministrar el sistema de suministro de partícula, de forma opcional, junto con otros aditivos que pueden alterar el microentorno local para promover la estabilidad y absorción, directamente sin tener que depender de las condiciones externas diferentes de la presencia de agua para proporcionar la liberación in vivo.

Formas de dosificación líquida para administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, y elíxires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, la forma de dosificación líquida puede contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, como el agua u otros solventes, solución salina isotónica, agentes de solubilización y emulsionantes, como por ejemplo, alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilen glicol, dimetilformamida, aceites, en particular, aceite de almendras, aceite de maní, aceite de coco, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de germen de maíz, aceite de oliva, aceite de ricino, aceite de sésamo, MIGLYOL™, glicerol, aceites fraccionados vegetales, aceites minerales, como la parafina líquida, alcohol tetrahidrofurfurílico, glicoles de polietileno, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, o mezclas de estas sustancias y lo similar. Además de estos diluyentes inertes, la composición también puede incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y suspensión, emolientes, conservantes, reguladores de pH, sales, edulcorantes, saborizantes, agentes colorantes y de perfume. Las suspensiones, además del compuesto activo, pueden contener agentes de suspensión, como por ejemplo, alcoholes isostearílicos etoxilados, sorbitol polioxietileno o ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, grasas comestibles hidrogenadas, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto, goma de acacia, agar-agar y derivados de celulosa como carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metahidróxido de aluminio, bentonita o mezclas de estas sustancias y lo similar. Formulaciones líquidas de una composición farmacéutica de la invención que son adecuadas para administración por vía oral se pueden preparar, envasar y vender en forma líquida o en forma de un producto seco destinado a la reconstitución con agua o con otro vehículo adecuado antes de utilizarse.

Agentes de dispersión o humectación conocidos incluyen fosfatidas naturales tales como la lecitina, productos de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso, con un alcohol alifático de cadena larga, con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol o con un éster parcial derivado de un ácido graso y un anhídrido hexitol (por ejemplo, estearato de polioxietileno, heptadecaetilenooxicetanol, sorbitol monooleato de polioxietileno y sorbitán monooleato de polioxietileno, respectivamente). Agentes emulsionantes conocidos incluyen lecitina y acacia. Conservantes conocidos incluyen metilo, etilo o n-propil-para-hidroxibenzoatos, ácido ascórbico y ácido sórbico. Agentes de edulcoración conocidos incluyen, por ejemplo, glicerol, propilen glicol, sorbitol, sacarosa y sacarina. Agentes de espesamiento conocidos para suspensiones oleosas incluyen, por ejemplo, cera de abejas, parafina dura y alcohol cetílico.

En otras modalidades, la composición farmacéutica puede ser preparada como un nutracéutico, es decir, en forma de, o agregada a, un alimento (por ejemplo, un elemento transformado destinado a la alimentación directa) o de un producto alimenticio (por ejemplo, un ingrediente comestible destinado a la incorporación de un alimento antes de ingestión). Ejemplos de alimentos adecuados incluyen dulces como piruletas, productos horneados, como galletas, panes, pastelitos y bocadillos, frutas enteras, puré o hervidas y vegetales, bebidas y productos cárnicos procesados. Ejemplos de productos alimenticios adecuados incluyen granos molidos y azúcares, especias y otros condimentos y jarabes. Los sistemas de suministro de partícula descritos en el presente documento preferiblemente no estén expuestos a altas temperaturas de cocción durante largos períodos de tiempo, con el fin de minimizar la degradación de los compuestos.

Composiciones para administración rectal o vaginal se pueden preparar por la mezcla de un sistema de suministro de partícula con los excipientes adecuados no irritantes o portadores, como manteca de cacao, polietilen glicol o una cera de supositorio, que son sólidos a temperatura ambiente normal, pero líquidos a la temperatura corporal, y por lo tanto, se funden en el recto o la cavidad vaginal y liberan el sistema de suministro de partícula. Tal composición puede estar en forma de, por ejemplo, un supositorio, una preparación de enema de retención y una solución para el riego colónico o rectal. Formulaciones de supositorio pueden constar de varios ingredientes adicionales como antioxidantes y conservantes. Preparaciones o soluciones de enema de retención para el riego colónico o rectal son posibles mediante la combinación de ingrediente activo con un portador líquido farmacéuticamente aceptable. Como es conocido en la técnica, preparaciones de enema pueden administrarse con, y pueden envasarse, dentro de un dispositivo de suministro adaptado a la anatomía rectal de un ser humano. Preparaciones de enema pueden comprender además de varios ingredientes adicionales como antioxidantes y conservantes.

Una composición farmacéutica de la invención se puede preparar, envasar o vender en una formulación adecuada para administración pulmonar a través de la cavidad bucal. Estas composiciones están convenientemente en forma de polvo seco para la administración con un dispositivo que comprende un reservorio de polvo seco al que se puede dirigir una corriente de impelente para dispersar el polvo o usando un solvente auto-impelente/dispensador de polvo como un dispositivo que comprende el sistema de suministro de partícula suspendido en un impelente de bajo punto de ebullición en un recipiente hermético. Composiciones de polvo seco pueden incluir un diluyente de polvo fino sólido, como el azúcar y convenientemente se proporcionan en una forma de dosis unitaria. Impelentes de bajo punto de ebullición generalmente incluyen impelentes líquidos cuyo punto de ebullición por debajo de 65°F a presión atmosférica. Por lo general el impelente puede constituir 50 a 99.9% (p/p) de la composición y el ingrediente activo puede constituir el 0.1% al 20% (p/p) de la composición. El impelente además puede comprender ingredientes adicionales como un agente tensoactivo líquido no iónico o sólido aniónico o un diluyente sólido (preferentemente con un tamaño de partícula del mismo orden que las partículas que integran el sistema de suministro de partícula).

Composiciones farmacéuticas de la invención formuladas para suministro pulmonar también pueden proporcionar el ingrediente activo en forma de gotas de una suspensión. Tales formulaciones pueden ser preparadas, envasadas o vendidas como suspensiones acuosas o diluidas alcohólicas, opcionalmente estériles, que comprenden el sistema de suministro de partícula, y convenientemente pueden administrarse con cualquier dispositivo de nebulización o atomización. Tales formulaciones pueden constar además de uno o más ingredientes adicionales como un agente saborizante como la sacarina de sodio, un aceite volátil, un agente de regulación de pH, un agente activo superficialmente o un conservante tal como metilhidroxibenzoato.

Las formulaciones que se describen en este documento, siendo útiles para el suministro pulmonar también son útiles para el suministro intranasal de una composición farmacéutica de la invención. Otra formulación adecuada para administración intranasal es un polvo grueso que comprende el sistema de suministro de partícula. Esta formulación es administrada en la forma de una aspiración, es decir, por inhalación rápida a través del paso nasal de un contenedor del polvo que se mantiene cerca a los orificios de la nariz.

Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse o venderse en una formulación adecuada para administración bucal. Tales formulaciones por ejemplo, pueden estar en forma de tabletas o pastillas hechas usando métodos convencionales y pueden, por ejemplo, comprender un sistema de suministro de partículas de 0.1% al 20% (p/p), el equilibrio que comprende una composición oral que se puede disolver o degradar y, opcionalmente, uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento. Como alternativa, formulaciones adecuadas para administración bucal pueden comprender un polvo o una solución de aerosol o atomizada o suspensión que comprende el sistema de suministro de partículas.

Ejemplo 1

La figura 1 es un diagrama esquemático 100 de una sección transversal de una pared celular de levadura, que muestra de afuera hacia dentro, una capa fibrilar externa 110, una capa de manoproteína externa 120, una capa de beta glucano 130, una capa de beta glucano - capa de quitina 140, una capa de manoproteína interna 150, la membrana de plasma 160 y el citoplasma 170.

Preparación de Partículas WGP

Partículas de Glucano Enteras (WGP, Lot W0282) son previamente obtenidas de Alpha-Beta Technology. En general, Partículas de Glucano Enteras se preparan a partir de células de levadura por extracción y purificación de la fracción de glucano insoluble en álcali a partir de las paredes celulares de levadura. Las células de levadura se tratan con una solución de hidróxido acuosa sin interrumpir las paredes celulares de levadura, las cuales digieren la proteína y porción intracelular de la célula, dejando al componente de la pared de glucano desprovisto de contaminación de proteína significante, y que tiene sustancialmente la estructura de pared celular inalterada de glucanos enlazados �(1-6) y (1-3). Las células de levadura (S. cerevisae cepa R4) se hacen crecer a fase Midlog en un medio mínimo bajo condiciones de fermentación de lote alimentado. Las células (~90 g de peso de célula en seco/l) se recolectan por centrifugación de lote a 2000 rpm durante 10 minutos. Las células. Las células después se lavan una vez en agua destilada y después se resuspenden en 1 litro de NaOH 1M y se calientan a 90 grados Celsius. La suspensión celular se agita vigorosamente durante 1 hora a esta temperatura. El material insoluble, que contiene las paredes celulares se recuperan por centrifugación a 2000 rpm durante 10 minutos. Este material después se suspende en 1 litro, NaOH 1M y se calienta nuevamente a 90 grados Celsius. La suspensión de agita vigorosamente durante 1 hora a esta temperatura. La suspensión después se deja enfriar a temperatura ambiente y se continúa la extracción por unas 16 horas adicionales. El residuo insoluble se recupera por centrifugación a 2000 rpm durante 10 minutos. Este material finalmente se extrae en 1 litro de agua llevada a pH 4.5 con HCl, a 75 grados Celsius durante 1 hora. El residuo insoluble se recupera por centrifugación y se lava tres veces con 200 mililitros de agua, cuatro veces con 200 mililitros de isopropanol y dos veces con 200 mililitros de acetona. La suspensión resultante se coloca en bandejas de vidrio y se secan a 55 grados Celsius bajo presión reducida para producir 7.7 g de un polvo blanco fino.

Una descripción más detallada de partículas de glucano enteras y un proceso para prepararlas se pueden encontrar en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,810,646; 4,992,540; 5,028,703; 5,607,677 y 5,741,495. Por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,028,703 describe que las partículas WGP de levadura se pueden producir de células de levadura en cultivo de fermentación. Las células se recolectan por centrifugación de lote a 8000 rpm durante 20 minutos en un centrifugador Sorval RC2-B. Las células después se lavan dos veces en agua destilada para prepararlas para la extracción del glucano entero. La primera etapa involucra resuspensión de la masa celular en 1 litro de NaOH al 4% p/v y se calienta a 100 grados Celsius. La suspensión celular se agita vigorosamente durante 1 hora a esta temperatura. El material insoluble que contiene las paredes celulares se recupera por centrifugación a 2000 rpm durante 15 minutos. Este material después se suspende en 2 litris de NaOH al 3% p/v y se calienta a 75 grados Celsius. La suspensión se agita vigorosamente durante 3 horas a esta temperatura. La suspensión después se deja enfriar a temperatura ambiente y la extracción se continúa por unas 16 horas adicionales. El residuo insoluble se recupera por centrifugación a 2000 rpm durante 15 minutos. Este material finalmente se extrae en 2 litros de NaOH al 3% p/v llevado a pH 4.5 con HCl, a 75 grados Celsius durante 1 hora. El residuo insoluble se recupera por centrifugación y se lava tres veces con 200 mililitros de agua, una vez con 200 mililitros de etanol deshidratado y dos veces con 200 mililitros de éter de etilo deshidratado. La suspensión resultante se coloca en placas de petri y se secan.

Preparación de Partículas YGMP

Se suspende S. cerevisiae (100 g de levadura para hornear Fleishmans) en 1 litro de NaOH 1M y se calienta a 55 grados Celsius. La suspensión celular se mezcla durante 1 hora a esta temperatura. El material insoluble que contiene las paredes celulares se recupera por centrifugación a 2000 rpm durante 10 minutos. Este material después se suspende en 1 litro de agua y se lleva a pH 4-5 con HCl, y se incuba a 55 grados Celsius durante 1 hora. El residuo insoluble se recupera por centrifugación y se lava una vez con 1000 mililitros de agua, cuatro veces con 200 mililitros de isopropanol deshidratado y dos veces con 200 mililitros de acetona. La suspensión resultante se coloca en una bandeja de vidrio y se seca a temperatura ambiente para producir 12.4 g de un polvo ligeramente blancuzco, fino.

Preparación de Partículas YGMP

Se suspende S. cerevisiae (75 g de SAF-Mannan) en 1 litro de agua y se ajusta a pH 12-12.5 con NaOH 1M, y se calienta a 55 grados Celsius. La suspensión celular se mezcla durante 1 hora a esta temperatura. El material insoluble que contiene las paredes celulares se recupera por centrifugación a 2000 rpm durante 10 minutos. Este material después se suspende en 1 litro de agua y se lleva a pH 4-5 con HCl, y se incuba a 55 grados Celsius durante 1 hora. El residuo insoluble se recupera por centrifugación y se lava una vez con 1000 mililitros de agua, cuatro veces con 200 mililitros de isopropanol deshidratado y dos veces con 200 mililitros de acetona. La suspensión resultante se coloca en una bandeja de vidrio y se seca a temperatura ambiente para producir 15.6 g de un polvo ligeramente blancuzco, fino.

Preparación de Partículas YCP

Células de levadura (Rhodotorula sp.) derivadas de cultivos obtenidos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) se hacen crecer aeróbicamente s fase estacionaria en YDP a 30 grados Celsius. Cultivos de Rhodotorula sp. disponibles de ATCC incluyen Nos. 886, 917, 9336, 18101, 20254, 20837 y 28983. Las células (1 l) se recolectan por centrifugación de lote a 2000 rpm durante 10 minutos. Las células después se lavan una vez en agua destilada y después se resuspenden en agua llevada a pH 4.5 con HCl a 75 grados Celsius durante 1 hora. El material insoluble que contiene las paredes celulares se recuperan por centrifugación a 2000 rpm durante 10 minutos. Este material después se suspende en 1 litro de NaOH 1M y se calienta a 90 grados Celsius durante 1 hora. La suspensión después se deja enfriar a temperatura ambiente y la extracción se continúa por unas 16 horas adicionales. El residuo insoluble se recupera por centrifugación a 2000 rpm durante 15 minutos y se lava dos veces con 1000 mililitros de agua, cuatro veces con 200 mililitros de isopropanol y dos veces con 200 mililitros de acetona. La suspensión resultante se coloca en una bandeja de vidrio y se seca a temperatura ambiente para producir 2.7 g de un polvo ligeramente marrón, fino.

La figura 2A es un diagrama de la estructura de una partícula de pared celular de levadura; la figura 2B es una fotomicrografía fluorescente que muestra teñido concanavalina-A-FITC (isocianato de con-A-fluoresceína, Sigma Chemical, St. Louis, MO) del componente manano de las partículas de la pared celular de levadura; la figura 2C es un diagrama de la estructura de una partícula beta glucano-manano YGMP, la figura 2D es una fotomicrografía fluorescente que muestra teñido con-A-FITC acentuado de una partícula beta glucano-manano YGMP; la figura 2E es un diagrama de la estructura de una partícula beta glucano YGP y la figura 2F es una micrografía fluorescente que muestra la ausencia de teñido con-A-FITC de una partícula de beta glucano YGP.

La concanavalina A es una lecitina que se une selectivamente a manosa. La unión de concanavalina A se evalúa por microscopio fluorescente para observar la cantidad y distribución del patrón de manano en la superficie de varias preparaciones de pared celular de levadura. Las suspensiones de levadura para hornear (levadura para hornear Fleishmans), YGMP y YGP en PBS + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 se preparan a una densidad de 1 x 108 partículas/ml.

La base con-A-FITC es 1 mg/ml de concanavalina A-FITC en PBS + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2. Se preparan las mezclas de etiquetado en tubos de microcentrifugador que consisten de:

100 μl de PBS + 1 mM de MgCl2 + 1 mM de CaCl2

2.5 μl de suspensión de partícula de pared celular de levadura

2.5 μl de solución base con-A-FITC.

Los tubos de microcentrifugador que contienen las mezclas de etiquetado se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora. Las partículas de pared celular de levadura se recolectan por centrifugación (10,000 rpm durante 10 minutos) seguido por lavado de la pelotilla con 100 μl de PBS tres veces. Las partículas de pared celular de levadura lavadas se resuspenden en 100 μl de PBS y se transfieren a una placa de 96 cavidades para examen con un microscopio fluorescente. Las fotografías de campos ejemplares se muestran en las figuras 2B, 2D y 2F. La tabla 2, abajo, resume los resultados de análisis de la composición química de partículas WGP, partículas YGP, partículas YGMP y partículas YCP que se preparan como se describe anteriormente. Nótese que las partículas YGP y partículas YGMP tienen beta-glucano bajo, en general entre aproximadamente 6 hasta aproximadamente 90 por ciento en peso, y alto contenido de proteína comparado con las partículas WGP de la técnica anterior. Las partículas YGMP tienen un contenido de manano sustancialmente elevado, en general entre aproximadamente 6 hasta aproximadamente 90 por ciento en peso, comparado con los otros tipos de partículas. Las partículas YCP tienen un contenido de quitina + quitosan, en general entre aproximadamente 50 hasta aproximadamente 75 porciento en peso, comparado con los otros tipos de partícula.

Tabla 2 Composición Química de Materiales de Pared Celular de Levadura

Analito: Método WGP S. cerevisiae YGMP S. cerevisiae YGP S. cerevisiae YCP Rhodotorula

Composición Macromolecular*

Proteína: Kjeldal <1 4.5 4.9 -

Grasa: Hidrólisis de base, extracción Soxhlet <1 1.6 1.4 -

Ceniza: Combustión 1.2 1.9 1.6 -

Composición de Carbohidrato**

Beta-Glucano: Hidrólisis Enzimática 90.3 41.9 77 6.5

Quitina + quitosán (como glucosamina, nacetil glucosamina): Monosac Análisis-Dionex 2.1 2.3 2.4 68

Manano (como manosa): Monosac Análisis-Dionex <1 36.9 0.47 1.3

Otros Glucanos (como sin beta 1,3- glucosa y otros azúcares no medidos): Monosac Análisis-Dionex 6.2 10.9 11.2 0.2

*Resultados reportados en % p/w de materiales analizados secos **Resultados reportados en % p/w de carbohidrato

WGP - Partícula de Glucano Entero - Tecnología de la Técnica Anterior; YGMP -Partícula Glucano-Manano de Levadura; YGP - Partícula de Glucano de Levadura; YCP -Partícula de Quitina de Levadura

Ejemplo 2 Volumen Hidrodinámico de Partículas de Pared Celular de Levadura

Se determinó el volumen hidrodinámico de partículas de pared celular de levadura como una medición de la capacidad de carga útil de las partículas. Se pesó 1 g de una alícuota de partículas de pared celular de levadura en un tubo de centrifugador de 15 ml en tara para determinar el peso de las partículas secas. Se agrega agua (125 ml) al tubo, y el

10 tubo se sometió a vórtice para mezclar la suspensión de partículas de pared celular de levadura. Las partículas se dejaron hincharse y absorber agua durante 30 minutos. La suspensión de partícula se centrifugó a 2000 rpm durante 10 minutos. Se removió agua, el tubo se peso y se calculó el peso del agua absorbida. Se calculó el volumen hidrodinámico como la proporción del peso de agua absorbida al peso de las partículas secas. La tabla 3 presenta los resultados para dos preparaciones de WGP y YGP y YGMP de la técnica anterior de la presente invención.

Tabla 3

Volumen Hidrodinámico de Preparaciones de Pared Celular de Levadura Ejemplar

Partícula de Pared Celular de Levadura: Volumen Hidrodinámico (g de agua/g de partículas)

WGP Prep 1: 9.7

WGP Prep 2: 6.9

YGP: 8.3

YGMP: 6.7

El volumen hidrodinámico inferior de WGP Prep 2 puede ser debido a un número incrementado de partículas fragmentadas en esta preparación. Con respecto a las otras partículas, el YGP “puro” tiene un volumen hidrodinámico mayor que el YGMP.

En general, el volumen de carga útil se limita a < 66% de volumen hidrodinámico para asegurar cantidades de absorción de la carga útil por las partículas de pared celular de levadura. Por esta regla, S 5.5 μl de carga útil puede ser cargada por mg de partículas de YGP y S 4.4 μl de carga útil puede ser cargada por mg de partículas de YGMP.

Ejemplo 3. Biodisponibilidad Oral de YGP y YGMP

Se preparan partículas de glucano de levadura fluorescentemente etiquetadas (YGP-F) y partículas de glucanomanano de levadura fluorescentemente etiquetadas (YGMP-F) para un estudio de absorción. Los materiales de partida son 5 ml YGP (5 mg/ml en amortiguador de borato 0.1M, pH 8), 5 ml YGMP (5 mg/ml en amortiguador de borato 0.1M, pH 8), diclorotriazinil aminofluoresceína (DTAF), 20 mg/ml en DMSO, recientemente preparado y amortiguador de borato 0.1M, pH 8.

Se llevaron a cabo reacciones de etiquetado a una escala de 25 mg. Se suspendieron alícuotas de 25 mg de partículas en 5 ml de amortiguador de borato 0.1M, pH 8 y se sonicaron para reducir grupos de partículas a partículas únicas. Las partículas se centrifugaron y resuspendieron en 5 ml de amortiguador de borato 0.1M, pH 8. Se agrega DTAF (05 ml 20 mg/ml) a las partículas resuspendidas e incubadas durante 2 días a 37 grados Celsius. Al final de la incubación, se agrega 5 ml de amortiguador Tris 1M, pH 8.3 y la mezcla se incubó 30 minutos para apagar DTAF. Las partículas incubadas se centrifugaron y se lavaron en PBS hasta los sobrenadantes ya no son fluorescentes. Las partículas lavadas se resuspendieron en PBS a 5 mg/ml. Se cuantificó el número de partículas en una dilución 1:100 de una alícuota. Resultados: las partículas de pared celular de levadura intensamente fluorescentes se producen a concentraciones de 1.8 x 109 partículas por ml de YGP-F y 2.1 x 109 partículas por ml de YGMP-F.

La influencia de la composición de carbohidrato de superficie en la biodisponibilidad oral de partículas de glucano de levadura se estudió para determinar si la absorción de partícula fagocítica de una carga útil puede ser dirigida vía el receptor de manosa así como también por los receptores beta glucano CR3/dectina-1. La disponibilidad para dirigir cualquiera o ambos receptores puede expandir la población objetivo de las células más allá de macrófagos y células dendríticas.

Los grupos de tratamiento se resumen en la Tabla 4, posterior. Materiales de partida incluidos: partículas de glucano de levadura etiquetadas con FITC (YGP-F), partículas de glucano-manano de levadura etiquetadas con FITC (YGMP-F), un grupo de siete ratones C57Black y un grupo de siete ratones C57/B16. Se prepararon dosis de YGP-F (1 mg/ml) y YGMP-F (3.7 mg/ml) para suministrar un número equivalente de partículas en 0.1 ml de PBS y se administra por sonda nasogástrica a un ratón de cada grupo diariamente durante cinco días. La misma dosis se administra por inyección subcutánea de 0.1 ml a un ratón de cada grupo diariamente durante cinco días. En el día cuatro las cajas se cambiaron y se proporcionó un lecho fresco. Se recolectaron las pelotillas fecales en el día 5 de cada grupo en 15 ml de tubos cónicos y se congelan para procesamiento posterior. Las pelotillas fecales se procesaron agregando 5 ml de agua y mantuvieron a 4 grados Celsius durante 2 horas. Las pelotillas fecales hidratadas se homogenizaron usando un homogenizador Polytron. Se colocaron las diluciones de la heces homogenizadas en una placa microtituladora de 96 cavidades y microscópicamente examinadas bajo condiciones de luz blanca transmitida y fluorescente para la presencia de partículas fluorescentes. Las alícuotas que tienen partículas fluorescentes se diluyen adicionalmente y se cuantificó el número de partículas fluorescentes/ml con un hematocitómetro.

Los ratones se sacrificaron en el día 7, y el bazo se removió de cada animal y se colocaron en tubos separados que contienen PBS en hielo. Los bazos se maceraron con tijeras y se presionaron hasta 70 micrones de tamiz para producir suspensiones de célula única. Se retuvieron alícuotas de las suspensiones de célula única y fijaron en 1% de formalina en PBS para cuantificar la fracción de células etiquetadas con partículas fluorescentes usando FACS. Las suspensiones celulares se tiñen usando un anticuerpo etiquetado con ficoeritrina (PE) contra marcador de macrófago, preferiblemente Emr-1(F4/80) murina, el cual tiñe macrófagos de pulpo rojo esplénico, células Kupffer, microglía y células Langerhans.

Las suspensiones celulares se colocan en placas a una densidad de 107 células por 60 mm en caja de petri en DMEM que contiene 10% de suero de bovino fetal (JRH Scientific), penicilina-estreptomicina y glucamina (Gibco) y se incubaron durante 24 horas a 37 grados Celsius bajo CO2 al 5% para permitir la unión. Después de la incubación, cualquiera de los linfocitos no unidos se lavan. Las células de macrófago esplénico unido se tripsinizaron, fijaron y registraron para la fracción de células adherentes que tienen partículas fluorescentes usando un microscopio fluorescente.

La administración de las partículas fluorescentes es bien tolerada. El análisis de macrófagos esplénicas adherentes demostró la presencia de partículas de pared celular fluorescente en animales tratados con partículas fluorescentes. Estos resultados demostraron que tanto YGP-F y YGMP-F están oralmente biodisponibles y pueden ser sistemáticamente distribuidos por macrófagos. En análisis de las heces demuestran la presencia de partículas fluorescentes, indicando que la absorción oral está incompleta en los niveles de dosificación usados. Los ratones C57/B16 son capaces de absorber YGP-F y YGMP-F administrados oralmente. El número de partículas fluorescentes en heces se cuantificó como un estimado de eficiencia de absorción.

Tabla 4

Presencia de Partículas Fluorescentes

Ruta: Tratamiento Dosis mg/ml # part./ml # part./dosis Macrófagos esplénicos Heces

Control: PBS control - - -

SQ: YGP-F 100 Pg 1 1x109 1x108 +

Oral: YGP-F 100 Pg 1 1x109 1x108 + +

Oral: YGP-F 33 Pg 0.33 3.3x108 3.3x107 + +

SQ: YGPM-F 370 Pg 3.7 1x109 1x108 +

Oral: YGPM-F 370Pg 3.7 1x109 1x108 + +

Oral: YGPM-F 110 Pg 1.1 3.3x108 3.3x107 + +

Control No tratado: - - - - - - -

Ejemplo 4: Preparación de Partículas YGP Cargadas con Quitosán

Se prepararon partículas YGP con un polímero de captura catiónico, quitosán. Se prepararon soluciones de quitosán 1% p/v en ácido acético 0.1M usando ya sea quitosán de Peso Molecular Alto (APM) (~70,000 Pm, Sigma Chemical St. Louis, Mo) o quitosán de Peso Molecular Bajo (APM) (~ 10,000 Pm, Sigma Chemical St. Louis, Mo). Ambas soluciones de quitosán APM como BPM al 1% se prepararon en ácido acético 0.1M. Se agrega 4 ml de solución de quitosán APM o BPM a 2 g de YGP en un tubo centrifugador cónico de 50 ml y se mezcló hasta que se formó una pasta suave. La mezcla se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir que el líquido sea absorbido. Se agrega NaOH (40 ml, 0.1M) a cada tubo, el cual sometió a vórtice inmediatamente para precipitar el quitosán dentro de YGP. La suspensión YGP:quitosán se pasó a través de una aguja de calibre 18 para producir una suspensión fina de partículas YGP:quitosán. Las partículas YGP:quitosán se recolectaron por centrifugación (2,000 rpm durante 10 minutos) seguido por lavado de la pelotilla con agua desionizada hasta que el pH del sobrenadante fue 7-8. Las partículas YGP:quitosán después se lavaron cuatro veces con dos volúmenes de pelotilla de isopropanol y después se lavaron dos veces con dos volúmenes de pelotilla de acetona. Las partículas YGP:quitosán después se secaron a temperatura ambiente en una capucha. El procedimiento proporcionó 1.2 g de partículas de quitosán YGP:BPM y 1.4 g de partículas de quitosán YGP:APM.

Ejemplo 5: Preparación de Partículas YGP Cargadas con CytoPure™

Se prepararon partículas YGP con un polímero de captura catiónico biodegradable, CytoPure™, un reactivo de transfección polimérico catiónico soluble en agua, comercialmente disponible, propietario (Qbiogene, Inc., CA). Se diluyó veinte μl de CytoPure™ en 0.5 ml de agua desionizada y se agrega 0.5 g de YGP en un tubo centrifugador cónico de 50 ml y se mezcló hasta que se formó una pasta suave. La mezcla se incubó durante 15 minutos a 4 grados Celsius para permitir que el líquido sea absorbido. Se agrega veinticinco ml de etanol a cada tubo, el cual sometió a vórtice inmediatamente para precipitar el CytoPure™ dentro de YGP. La suspensión YGP:CytoPure™ se sonicó para producir una suspensión fina de partículas YGP:CytoPure™. Las partículas YGP:CytoPure™ se recolectaron por centrifugación (2,000 rpm durante 10 minutos) seguido por lavado de la pelotilla cuatro veces con dos volúmenes de pelotilla de isopropanol y después se lavaron dos veces con dos volúmenes de pelotilla de acetona. Las partículas YGP:CytoPure™ después se secaron a temperatura ambiente en una capucha. El procedimiento proporcionó 0.45 g de partículas de YGP:CytoPure™.

Ejemplo 6: Preparación de Partículas YGP Cargadas con Polietilamina

Se prepararon partículas YGP con polietileniimina (PEI) como un polímero de captura catiónico. Se agrega una alícuota

0.5 ml de una solución PEI al 2% p/v (~50,000 Pm, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en gua a 0.5 g de YGP en un tubo centrifugador cónico de 50 ml y se mezcló hasta que se formó una pasta suave. La mezcla se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir que el líquido sea absorbido. Se agrega veinticinco ml de etanol a cada tubo, el cual sometió a vórtice inmediatamente para precipitar el PEI dentro de YGP. La suspensión YGP:PEI se pasó a través de una aguja de calibre 18 para producir una suspensión fina de partículas YGP:PEI. Las partículas YGP:PEI se recolectaron por centrifugación (2,000 rpm durante 10 minutos) seguido por lavado de la pelotilla cuatro veces con dos volúmenes de pelotilla de isopropanol y después se lavaron dos veces con dos volúmenes de pelotilla de acetona. Las partículas YGP:PEI después se secaron a temperatura ambiente en una capucha. El procedimiento proporcionó 0.48 g de partículas YGP:PEI.

Ejemplo 7: Preparación de Partículas YGP Cargadas con Alginato

Se prepararon partículas YGP con alginato (F200 o F200L, Multi-Kem Corp., Ridgefield, NJ) como un polímero de captura catiónico. Se agrega una alícuota de 2 ml de una solución de alginato al 1% p/v en gua a 1 g de YGP en un tubo centrifugador cónico de 50 ml y se mezcló hasta que se formó una pasta suave. La mezcla se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir que el líquido sea absorbido. La mezcla después se diluyó con 40 ml de una solución acuosa de cloruro de calcio al 1% p/v. La suspensión YGP:alginato se pasó a través de una aguja de calibre 18 para producir una suspensión fina de partículas YGP:alginato. Las partículas YGP:alginato se recolectaron por centrifugación (2,000 rpm durante 10 minutos). Las partículas de YGP:alginato se lavaron cuatro veces con dos volúmenes de pelotilla de isopropanol y después se lavaron dos veces con dos volúmenes de pelotilla de acetona. Las partículas YGP:alginato después se secaron a temperatura ambiente en una capucha. El procedimiento proporcionó 0.95 g de partículas TGP:alginato F200 y 0.86 g de partículas YGP:alginato F200.

Ejemplo 8: Preparación de Partículas YGP y YGMP Cargadas con Poli-L-lisina

Se prepararon partículas YGP y YGMP con Poli-L-lisina (PLL) como un polímero de captura. Se agrega una alícuota de 4 ml de una solución PLL al 1% p/v (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en gua a 1 g de YGP o YGMP en un tubo centrifugador cónico de 50 ml. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 55 grados Celsius para permitir que el líquido sea absorbido. Se agrega diez ml de etanol a cada tubo, el cual se homogenizó (homogenizador Polytron) para producir una suspensión fina de partículas YGP:PLL o YGMP:PLL. Las partículas YGP:PLL o YGMP:PLL se recolectaron por centrifugación (2,000 rpm durante 10 minutos). Las YGP:PLL o YGMP:PLL se lavaron cuatro veces con dos volúmenes de pelotilla de isopropanol y después se lavaron dos veces con dos volúmenes de pelotilla de acetona. Las partículas YGP:PLL o YGMP:PLL después se secaron a temperatura ambiente en una capucha. El procedimiento proporcionó 1.3 g de partículas TGP:PLL y 1.1 g de partículas YGMP:PLL. La evaluación en microscopio no mostró agregados de PLL libres, únicamente partículas YGP:PLL o YGMP:PLL.

Ejemplo 9: Preparación de Partículas YGP o YGMP Cargadas con Xantano

Se prepararon partículas YGP o YGMP con xantano como un polímero de captura catiónico. Se agrega una alícuota de 4 ml de una solución de xantano al 1% p/v en gua, se calentó a 55 grados Celsius para reducir la viscosidad y se agrega a 1 g de YGP o YGMP en un tubo centrifugador cónico de 50 ml. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 55 grados Celsius. Se agrega diez ml de etanol a cada tubo, el cual se homogenizó (homogenizador Polytron) para producir una suspensión fina de partículas YGP:xantano o YGMP:xantano. Las partículas YGP:xantano o YGMP:xantano se recolectaron por centrifugación (2,000 rpm durante 10 minutos). Las partículas YGP:xantano o YGMP:xantano se lavaron cuatro veces con dos volúmenes de pelotilla de isopropanol y después se lavaron dos veces con dos volúmenes de pelotilla de acetona. Las partículas YGP:xantano o YGMP:xantano después se secaron a temperatura ambiente en una

capucha. El procedimiento proporcionó 1.2 g de partículas TGP:xantano y 1.1 g de partículas YGMP:xantano. La evaluación en microscopio no mostró agregados de xantano libres, únicamente partículas YGP:xantano o YGMP:xantano.

Ejemplo 10: Evaluación de la Capacidad de YGP:Quitosán y YGP:Alginato Para Unir Tintes Cargados

Se prepararon partículas YGP:Quitosán y YGP:Alginato como se describe en los Ejemplos 7 y 9 anteriores. Se prepararon soluciones acuosa al 0.1% p/v de tripano azul (Benzamina azul; CI 23850), un tinte aniónico y xileno cianol (ácido azul, un tinte catiónico). Se agrega una alícuota de 50 μl de una solución de tinte acuosa al 0.1% p/v a 10 mg de YGP, YGP:quitosán o YGP:Alginato en tubos de microcentrifugador y la mezcla se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las pelotillas se lavaron con agua desionizada hasta que las soluciones del sobrenadante ya no está coloreadas. Se evaluó el color de las pelotillas; los resultados se representan en la Tabla 5, posterior.

Tabla 5

Color de Pelotilla

Formulación YGP: Tripano azul Xilen cianol

YGP: Bronceado Bronceado

YGP Quitosán: Azul Bronceado

YGP Alginato: Bronceado Verde

Las interacciones electroestáticas entre polímeros de captura insolubles dentro de YGP son capaces de unir a cargas útiles de tinte del modelo de peso molecular bajo, opuestamente cargados.

Ejemplo 11: Uso de YGP:Agarosa para Capturar Moléculas por Atrapamiento Físico

Se prepara YGP:Agarosa para evaluar el atrapamiento físico como un medio para capturar una carga útil en YGP. Se prepara una solución de agarosa al 2% p/v (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en TE, y se enfrió a 50 grados Celsius. Se diluyó 1 mg/ml de una solución base de ADN de esperma de salmón en TE a 0.5 mg/ml de ADN en TE o en 1% de agarosa a 50 grados Celsius. Se mezcló una alícuota de 500 mg de YGP con 500 μl de ADN en TE o 500 μl de ADN en agarosa a 50 grados Celsius y la mezcla se incubó 1 hora a 50 grados Celsius. La mezcla después se enfrió durante 1 hora en un refrigerador para solidificar la agarosa. Después de 1 hora, se agrega 10 ml de TE y la mezcla se incubó durante la noche en el refrigerador. La mezcla después se centrifugó, y se midió el ADN en el sobrenadante por absorción a 260 nm. Se retuvo aproximadamente >80% del ADN aplicado por YGP:Agarosa comparado a <1% retenido por el control YGP:TE. Estos resultados indican que la agarosa efectivamente atrapa ADN dentro de YGP por atrapamiento físico.

Ejemplo 12: Uso de YGP:Poliacrilamida para Capturar Moléculas por Atrapamiento Físico

Se prepara YGP:Poliacrilamida para evaluar el atrapamiento físico como un medio para capturar una carga útil en YGP. Se diluyó 1 mg/ml de una solución base de ADN de esperma de salmón en TE a 0.5 mg/ml de ADN en TE o en 30% de poliacrilamida/bis (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO). Se agrega TEMED (N,N,N’,N’-Tetrametiletilendiamina) a cada mezcla de ADN (1 μl de TEMED a 5 ml de solución de ADN), y se agrega una alícuota de 2 ml de cada solución a 1 g de YGP. Lo resultante se mezcló para formar una suspensión uniforme y se incubó 3 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación por 3 horas, se agrega 10 ml de TE y la mezcla se incubó durante la noche en un refrigerador. La mezcla después se centrifugó, y se midió el ADN en el sobrenadante por absorción a 260 nm. Se retuvo aproximadamente >95% del ADN aplicado por YGP:Poliacrilamida comparado a <1% retenido por el control YGP:TE. Estos resultados indican que la poliacrilamida es un polímero de captura efectivo de uso para capturar ADN dentro de YGP por atrapamiento físico.

Ejemplo 13: YGP Cargado con una Molécula Pequeña, Tetraciclina (Referencial)

Se cargó el antibiótico tetraciclina (tet) en YGP usando la insolubilidad relativa de la tetraciclina-sal de calcio. Las partículas de la pared celular de levadura usadas son YGP, YGP:alginato F200 y YGP:alginato F200L preparadas como se describe anteriormente. Las soluciones base son CaCl2 1M y 100 mg/ml de tetraciclina HCl (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Las mezclas de carga se muestran en resumen en la Tabla 6, posterior. Las mezclas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se agrega agua desionizada o CaCl2 1M como se indica. Después de 60 minutos a temperatura ambiente, las mezclas se sonicaron y se incubaron por al menos 30 minutos adicionales a temperatura ambiente.

Tabla 6

Cargado: Liberado

A355*: % tet % tet A355

YGP (1 mg): Tet (µl) Agua (µl) CaCl21M (µl) super unido p/p PBS HCl 01M

-
-
-: 200 0
-
-
-
-

-: 4 200 - 0.538
-
-
-
-

-: 4 - 200 0.542
-
-
-
-

YGP: - - 200 0.01 - - - -

YGP: 4 200 - 0.58 0 - - -

YGP: 4 - 200 0.524 <1 - - -

YGP-alginato F200: 4 200 - 0.405 24.8 9.9 3.6 4.9

YGP-alginato F200L: 4 200 - 0.375 30.3 12.1 5.9 12.2

*1/100 dilución

Las mezclas después se centrifugaron (2,000 rpm durante 10 minutos) y se indicó la presencia de tetraciclina por el color amarillo de la pelotilla y del sobrenadante inicial. Se calcula la cantidad de tetraciclina cargada en las partículas de pared celular de levadura a partir de la pérdida de absorción a 355 nm, el pico del espectro de absorción de tetraciclina. Una dilución de 4 μl de los 100 mg/ml de la solución base de tetraciclina HCl en 200 μl de agua desionizada tiene una absorbancia a 355 nm de 0.538 comparada a un blanco de agua desionizada. La liberación de tetraciclina a partir de las partículas de paredes celulares de levadura cargadas en PBS o HCl 0.1 también se midió espectrofotométricamente.

Los resultados se resumen en la Tabla 6, anterior. En general, mientras las pelotillas YGP:alginato F200 y YGP:alginato F200L son amarillas después del lavado, las pelotillas YGP no son amarillas, indicando poco, si cualquier carga de tetraciclina ya sea como el clorhidrato o la sal de calcio en la ausencia de un polímero de captura. En contraste, la tetraciclina es efectivamente cargada y atrapada en formulaciones YGP:alginato F200 y YGP:alginato F200L, con aproximadamente 25-30% de la carga de tetraciclina aplicada absorbida como la sal de alginato de calcio. La tetraciclina atrapada se libera a partir de YGP:alginato F200 y YGP:alginato F200L en HCl 0.1M. La tetraciclina atrapada es parcialmente retenida en YGP:alginato F200 y TGP:alginato F200L en PBS durante 1 hora a 37 grados Celsius, aproximadamente 26.5-51.6% de HCl 0.1M extraíble.

En resumen, la tetraciclina es fácilmente atrapada como un complejo de sal de alginato de calcio en una composición YGP-alginato de calcio, pero no es efectivamente cargada y retenida dentro de solo YGP. La tetraciclina atrapada como un completo alginato de calcio en YGP:alginato F200 y YGP:alginato F200L es lentamente liberada en PBS a 37 grados Celsius y sustancialmente liberada bajo condiciones acídicas.

Ejemplo 14: Eficacia de Tet y YGP:Tet Incrementando la Eliminación Microbiocida in vitro de Macrófagos J774 (Referencial)

Se prepara YGP:alginato-Tet como se describe en el Ejemplo 13, anterior. Los números de partículas de YGP y YGP:alginato-tet por ml en soluciones base son 9 x 107/ml y 6 x 108/ml, respectivamente.

Se combinó un ml de macrófagos de murina, J774 (5 x 105 ml) con YGP, YGP:alginato - tet o tetraciclina a concentraciones variadas como se resume en la Tabla 7, anterior. Las células J774 se cultivan durante la noche en medio (DMEM que contiene 10% de suero de bovino fetal son antibióticos o glutamina). Los cultivos se incuban con medio solo, tetraciclina diluida en medio o partículas diluidas en medio durante 1 hora con rotación a 37 grados Celsius para permitir la fagocitosis de las partículas. El ensayo de eliminación microbiana se fijo en placas de 96 cavidades. Los cultivos se diluyen en medio y se incuban durante la noche para permitir el metabolismo y liberación de tet a partir de partículas YGP:alginato-tet fagocitadas. Se agrega estimulo bacteriana como se indica en la Tabla 6 y los cultivos se incuban 2 horas a 37 grados Celsius en una incubadora de CO2 para permitir la fagocitosis y eliminación de S. aureus por los macrófagos de murina J774. Después de esta incubación, se agrega 200 μl de Caldo LB (Caldo Luria-Bertani: 1.0% de triptona, 0.5% de extracto de levadura, 1.0% de NaCl) a cada cultivo para someter a lisis los macrófagos. Los cultivos se incuban a 37 grados Celsius en una incubadora para permitir la excrecencia de S. atreus que sobreviven. El crecimiento se monitoreo por cambio en pH como se indica por fenoles rojo. Se comparan los efectos de YGP, YGP:alginato-tet o tetraciclina. Los resultados se proporcionan en las dos columnas derechas de la Tabla 7.

Tabla 7

Eliminación de S.aureus por Macrófagos de Murina J774 Cargados con Partículas YGP

Tubo YGP: J774 5 x 105/ml DMEM+C YGP/tet 5 x 107/ml µl Partículas/ml S. aureus Eliminada Eliminación incrementada de pliegues

a: 1 ml 0.1 ml - - - <1 x 105 1

b: - 1.1 ml - - - <1 x 105 1

c: 1 ml - YGP 100 3x 107 <1 x 105 1

d: - 1 ml YGP 100 3x 107 <1 x 105 1

e: 1 ml - YGP:tet 100 3.75 x 106 1x 108 100

f: - 1 ml YGP:tet 100 3.75 x 106 1x 106 -

g: 1 ml - YGP:tet 100 7.5 x 106 >1 x 108 >10

h: - 1 ml YGP:tet 100 7.5 x 106 1x 107 -

i: 1 ml - YGP:tet 100 1.5 x 107 >1 x 108 -

j: - 1 ml YGP:tet 100 1.5 x 107 >1 x 108 -

k: 1 ml - YGP:tet 100 3x 107 >1 x 108 -

l: - 1 ml YGP:tet 100 3x 107 >1 x 108 -

m: 1 ml - tet - 1.25 100 1.25 Pg/ml 1x 106 -

n: - 1 ml tet - 1.25 100 1.25 Pg/ml 1x106 1

o: 1 ml - tet - 2.5 100 2.5 Pg/ml 1x 107 3.3

p: - 1 ml tet - 2.5 100 2.5 Pg/ml 3.3 x 106 -

q: 1 ml - tet - 5 100 5 Pglml >1 x 108 -

r: - 1 ml tet - 5 100 5 Pg/ml >1 x 108 -

s: 1 ml - tet -10 100 10 Pg/ml >1 x 108 -

t: - 1 ml tet -10 100 10 Pg/ml >1 x 108 -

Aproximadamente 7.5 x 106 de partículas YGP:alginato-tet produce un efecto en macrófagos en apenas equivalente a

5 aproximadamente 2.5 μg/ml de tetraciclina HCl. Los macrófagos solos son relativamente menos efectivos que los macrófagos tratados con tetraciclina en ya sea forma, y tan efectivo como los macrófagos tratados con solo YGP vacío. Los macrófagos en combinación con tetraciclina libre en solución no son mucho más efectivos que solo tetraciclina. Los macrófagos tratados con partículas YGP:alginato-tet muestran sinergia significante. En general, los resultados demuestran que la fagosoma suministrada de tetraciclina en células de macrófago J774 mejora la capacidad de

10 eliminación de células de macrófago J774 para S. aureus.

Ejemplo 15: Carga de Proteína en YGP

Se evalúa la utilidad del sistema de suministro para la retención, transporte y suministro de péptidos o proteínas terapéuticas, antígenos de vacuna u otros péptidos o proteínas usando las proteínas mezcladas de suero de bovino fetal. Las partículas de pared celular de levadura usadas son: YGP, YGP-PEI y YGP-quitosán preparadas como se describe

15 anteriormente. Las soluciones base son 45 ng/μl de suero de bovino fetal (FCS) (Fetal Bovine Serum, JRH Biosciences, Lenexa, KS), 0.2% de PEI (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en TE, amortiguador de fosfato 0.05 M, pH 7.2 (amortiguador P) y amortiguador de fosfato 0.05 M, pH 7.2, NaCl 1M (P + amortiguador de sal).

Se agregaron cuatro μl de FCS a 1 mg de YGP, YGP-P o YGP-CN en tubos de microcentrifugadora como se indica en la Tabla 8 y la mezcla resultante se incuba 60 minutos a temperatura ambiente para permitir al líquido ser absorbido por las partículas. Después de la incubación, 200 μl de amortiguador de fosfato o 200 μl de PEI son como se indica en la Tabla 8 y la mezcla resultante se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, se agrega 0.5 5 ml de amortiguador de fosfato, y después unos 5 minutos adicionales de incubación, los tubos se someten a sonicación para producir partículas únicas. Las partículas son formadas en pelotillas por centrifugación a 10,000 rpm durante 10 minutos y los sobrenadantes se remueven a tubos nuevos. Se agrega 0.5 ml de amortiguador de fosfato de sodio 0.05M, pH 7.2 + NaCl 1M a las pelotillas, y después de 5 minutos adicionales de incubación, los tubos se centrifugan a 10,000 rpm durante 10 minutos y se remueven los sobrenadantes de elución muy salina a tubos nuevos. Se mide el contenido

10 de proteína de los sobrenadantes por absorbancia a 280 nm.

Tabla 8

Tubo: YGP 1° Carga 2° Carga Amortiguador P (µl) Amortiguador P+Sal (µl)

1: - 4 Pl FCS Amortiguador P 200 μl 500 500

2: YGP 4 Pl FCS Amortiguador P 200 μl 500 500

3: YGP 4 Pl FCS PEI 2% 200 μl 500 500

4: YGP-PEI 4 Pl FCS Amortiguador P 200 μl 500 500

5: YGP-CN 4 Pl FCS Amortiguador P 200 μl 500 500

Los resultados de carga de proteína se muestran en la Tabla 9. Las partículas YGP sin una molécula de captura atrapan únicamente el 5% de la proteína presentada. Las partículas YGP que se cargan primero con proteína FCS y después se exponen a PEI retienen el 47% de la carga de proteína. Las partículas YGP que se precargan con un polímero de captura tal como PEI o quitosán antes de la exposición a la carga de proteína tal como 68% y 60% retenido,

15 respectivamente de la carga de proteína.

Tabla 9

Tubo: YGP Carga útil Polímero de Captura Proteína no unida (ng) % de Proteína no unida Proteína unida (ng) % de Proteína unida

1: - FCS Amortiguador P 180 100 - -

2: YGP FCS Amortiguador P 180 95 10 5

3: YGP FCS 2% de PEI 120 63 70 47

4: YGP-PEI FCS Amortiguador P 60 32 130 68

5: YGP-CN FCS Amortiguador P 80 40 120 60

Los resultados demuestran que las proteínas de suero no son efectivamente cargadas y atrapadas en YGP sin polímero de captura. Usando YGP que se precarga con polímeros de captura antes de la exposición a las proteínas de carga útil resultando en incremento de proteína atrapada. Alternativamente, las proteínas pueden ser atrapadas dentro de YGP primero cargando la proteína, y después agregando un polímero de captura soluble para secuestrar la proteína con la

20 partícula.

Ejemplo 16. Comparación de Varios Métodos de ADN de Carga en YGP

Se evalúan varios métodos de carga de ADN de esperma de salmón de carga en YGP, YGP que contiene quitosán de peso molecular bajo (BPM) o YGP que contiene quitosán de peso molecular alto (APM).

a. Capilaridad de carga seguida por precipitación de etanol

Se divide ADN de esperma de salmón, Signa, St. Louis, MO) por 40 pasos a través de agujas de calibre 18 y se diluye a una concentración de 0.1 mg/ml en TE 50 mM (Tris-HCl, pH 8, 2 mM de EDTA). Se determinan los volúmenes de carga de la solución de ADN y se mezcla en tubos de centrifugadora por duplicado con 100 mg de alícuotas de YGP, YGP:quitosán BPM o YGP:quitosán APM como en el Ejemplo 2 y se incuban durante 1 hora. Las mezclas incubadas son precipitados de etanol agregando 1.5 ml de etanol a cada tubo. Los productos insolubles se recolectan por centrifugación a 2,000 rpm durante 10 minutos. Se agrega 10 ml de TE a cada tubo, incubado durante 1 hora a 37 grados Celsius, centrifugados a 2,000 rpm durante 10 minutos para sedimentar el YGP insoluble y se determina el contenido de ADN del sobrenadante por absorbancia a 260 nm. Se calcula la cantidad de ADN restante en el YGP.

b. Carga de ADN por absorción

Se mezclan los volúmenes de carga de la solución de ADN en tubos de centrifugadora por duplicado con 100 mg de alícuotas de YGP, YGP:quitosán BPM o YGP:quitosán APM como en el ejemplo 4a y se incuban durante 1 hora. Se agrega 10 ml de TE a cada tubo, incubado durante 1 hora a 37 grados Celsius, centrifugados a 2,000 rpm durante 10 minutos para sedimentar el YGP insoluble. Se determina el contenido de ADN del sobrenadante por absorbancia a 260 nm. Se calcula la cantidad de ADN restante en el YGP.

c. Carga de ADN por captura de CTAB

Se mezclan los volúmenes de carga de la solución de ADN en tubos de centrifugadora por duplicado con 100 mg de alícuotas de YGP, YGP:quitosán BPM o YGP:quitosán APM como en el ejemplo 4 y se incuban durante 1 hora. Las mezclas incubadas se precipitan agregando 1.5 ml de una solución de hexadeciltrimetilamoniobromuro al 2% (también conocido como bromuro de cetiltrimetilamonio o CTAB) a cada tubo. Se agrega 10 ml de TE a cada tubo, el cual se incuba durante 1 hora a 37 grados Celsius y se centrifuga a 2,000 rpm durante 10 minutos para sedimentar el YGP insoluble. Se determina el contenido de ADN del sobrenadante por absorbancia a 260 nm. Se calcula la cantidad de ADN restante en el YGP.

Se calcula la cantidad de ADN restante en el YGP.

Los resultados se representan en la Tabla 10, posterior.

Tabla 10

% de ADN unido en YGP

Método: YGP YGP:quitosán BPM YGP: quitosán APM

Carga Directa: <1 % 32% 70%

Carga Directa + Etanol: <1 % No realizado Not done

Carga Directa por captura de CTAB: >99% >99% 99%

Carga por Absorción: <1 % 5% 12%

La carga o precipitación de ADN de muestra fallan para efectivamente cargar y capturar ADN en el YGP. En contraste, el uso del polímero de captura catiónico, quitosán, resulta en la formación de complejos quitosán-ADN que puede capturar ADN dentro de YGP. Además, el agente catiónico CTAB puede efectivamente ser usado para capturar ADN cargado en YGP.

Ejemplo 17. Carga y Captura de ADN

Se prepara ADN de esperma de salmón fluorescente mezclando 1 mg/ml de la solución de ADN de esperma de salmón en amortiguador de carbonato 0.1M, pH 9.2 con 100 μl de una suspensión de DTAF 1 mg/ml en amortiguador de carbonato 10 mM, pH 9.2. Después de la incubación durante la noche a 37 grados Celsius, se agrega 200 μl de Tris-HCl 1M, pH 8.3 y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, se agregan 100 μl de NaCl 1M y 3 ml de etanol al ADN para precipitar el etanol. Después del almacenaje a -20ºC durante la noche, se recolecta lo precipitado de etanol por centrifugación a 10,000 rpm durante 15 minutos. Lo precipitado de etanol se lava con etanol al 70% hasta que el sobrenadante es claro y se resuspende en 1 ml de TE.

Las suspensiones de YGP se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, se agrega

0.45 ml de etanol al 95% a una serie (YGP, YGP-P, YGP-quitosán) de tres tubos, se agrega 0.2 ml de PEI al 2% a dos series de los tres tubos y se agrega 0.2 ml de CTAB al 2% a otra serie de tres tubos. Después de 30 minutos de

incubación a temperatura ambiente, se agrega 0.2 ml de CTAB al 2% a una serie de los tubos de PEI y la incubación prosigue por unos 30 minutos adicionales. Se agrega etanol (1 ml, 95%) y los YGP se almacenan durante la noche a -20 grados Celsius. Las suspensiones de YGP se lavan con etanol al 70% y se resuspenden en 0.5 ml de PBS. Los resultados se evalúan por microscopio fluorescente, y se muestran en la Tabla 11.

La captura no significante de ADN etiquetado fluorescente ocurre si únicamente se usa precipitación de etanol simple sin un polímero de captura, lo que demuestra que la tecnología de la técnica anterior no es efectiva como un sistema de suministro de ADN. El ADN etiquetado fluorescente claramente es capturado por polímeros de captura catiónicos PEI o quitosán, o con el detergente catiónico CTAP dentro de las partículas YGP. La mejor captura de ADN ocurre cuando se usa una combinación de polímero de captura y CTAB, tal como YGP:PEI: ADN:CTAB; YGP:quitosán:ADN: CTAB, o YGP:ADN:PEI:CTAB.

Tabla 11

Partícula: Tratamiento Pelotilla YGP Observación con Microscopio Fluorescente

YGP: etanol Blanca No fluorescente

YGP-CN: etanol Amarilla Fluorescencia de partícula interna

YGP-P: etanol Amarilla Fluorescencia de partícula interna

YGP: PEI al 2% Amarilla Fluorescencia de partícula interna

YGP-CN: PEI al 2% Amarilla Fluorescencia de partícula interna débil

YGP-P: PEI al 2% Amarilla Fluorescencia de partícula interna débil

YGP: CTAB al CTAB Amarilla Fluorescencia de partícula interna

YGP-CN: CTAB al 2% Amarilla Fluorescencia de partícula interna fuerte

YGP-P: CTAB al 2% Amarilla Fluorescencia de partícula interna fuerte

YGP: PEI al 2%/CTAB al 2% Amarilla Fluorescencia de partícula interna fuerte

YGP-CN: PEI al 2%/CTAB al 2% Amarilla Fluorescencia de partícula interna

YGP-P: PEI al 2%/CTAB al 2% Amarilla Fluorescencia de partícula interna

Ejemplo 18: ADN de Plásmido Fluorescentemente Etiquetado Cargado y Capturado

Se prepara el plásmido pIRES que contiene YGP por transfección y expresión de EGFP codificado en células J774, línea celular derivada de macrófagos de murina. Los agentes de captura catiónicos usados incluyen polímeros catiónicos tales como polietilenimina (PEI), CytoPure™, un reactivo de transfección de polímero catiónico soluble en agua, comercialmente disponible, propietario (Qbiogene, Inc. CA) y un detergente catiónico hexadeciltrimetil-amoniobromuro (CTAB). Un PEI preferido es JetPEI, un reactivo de transfección polimérico catiónico de polietilenimina lineal comercialmente disponible (Qbiogene, Inc, CA).

pIRES-EGFP (Clonetech, CA) contiene el sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) del virus de encefalomiocarditis (ECMV) entre el MCS y la región codificante EGFP (proteína fluorescente verde intensificada). Esto permite tanto a los genes de interés (clonados en el MCS) como al gen EGFP ser traducidos de un ARNm bicostrónico único, pIRES-EGFP es diseñado para la selección eficiente (por citometría de flujo u otros métodos) de células de mamífero recientemente transfectadas que expresan EGFP y otras proteínas de interés. Para optimizar la selección de células que expresan niveles altos de la proteína de interés, pIRES-EGFP utiliza una secuencia IRES parcialmente discapacitada (1). Este IRES atenuado conduce a una proporción reducida de iniciación de traducción en el codón de partida EGFP en relación al gen clonado. Esto permite la selección de aquellas células en las cuales el ARNm y por lo tanto la proteína objetivo, se produce a niveles elevados para compensar una proporción subóptima de traducción de EGFP. Este vector también se puede usar para expresar EGFP solo o para obtener líneas celulares establemente transfectadas sin fármacos que consumen tiempo y selección clonal. EGFP es una variante que cambia a rojo de GFP de tipo nativo que se ha optimizado para fluorescencia brillante o expresión elevada en células de mamífero. (Máximo de excitación = 488 nm; máximo de emisión = 509 nm) EGFP codifica la variante GFPmutl, la cual contiene las sustituciones de aminoácido Phe-64 a Leu y Ser-65 a Thr. Estas mutaciones incrementan la brillantez y solubilidad de GFP, principalmente debido a propiedades de plegado de la proteína mejoradas y eficiencia en la formación de cromóforos. EGFP también contiene una estructura de lectura abierta compuesta al menos completamente de codones humanos preferidos. Esto conduce a la traducción más eficiente y, por lo tanto, niveles de expresión elevados en células eucarióticas, en relación a GFP de tipo nativo.

Las soluciones preparadas son: ADN de plásmido pIRES EGFP, 0.72 μg/μl en agua, 0.2% p/v de PEI (Sigma) en TE, 2 μl de CytoPure (Qbiogen) + 48 μl de NaCl 0.15M, 2 μl de JetPEI (Qbiogene) + 48 μl de TE, 0.2% de Espermidina en TE, 2% de CTAB (ac) y salina amortiguada de fosfato (PBS).

5 Se prepara el ADN plásmido pIRES fluorescente mezclando 1 mg/ml de solución de ADN pIRES en amortiguador de carbonato 0.1M, pH 9.2 con 100 μl de 1 mg/ml de una suspensión de DTAF en 10 mM de amortiguador de carbonato, pH

9.2. Después de la incubación durante la noche a 37 grados Celsius, se agrega 200 μl de Tris-HCl 1M, pH 8.3 y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después se agregan 100 μl de NaCl 1M y 3 ml de etanol al ADN para precipitar el etanol. Después del almacenaje a -20 grados Celsius durante la noche, lo precipitado de etanol se recoleta

10 por centrifugación a 10,000 rpm durante 15 minutos. Lo precipitado de etano se lava con etanol al 70% hasta que el sobrenadante es claro y se resuspende en 1 ml de TE.

Se incuban las suspensiones de YGP durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, se agrega

0.45 ml de etanol al 95% a una serie de tres tubos (YGP, YGP-P, YGP-quitosán), se agrega 0.2 ml de PEI al 2% a dos series de tres tubos y se agrega 0.2 ml de CTAB al 2% a otra serie de tres tubos. Después de 30 minutos de incubación a

15 temperatura ambiente, se agrega 0.2 ml de CTAB al 2% a una serie de tubos de PEI y la incubación prosigue por 30 minutos adicionales. Se agrega etanol (1 ml, 95%) y los YGP se almacenan durante la noche a -20 grados Celsius. Las suspensiones YGP se lavan con etanol al 70% y se resuspenden en 0.5 ml de PBS.

Se colocan en placas macrófagos de murina J774 en placas de seis cavidades a una densidad de 2.5 x 105 células por cavidad y se incuban durante la noche como se describe en el Ejemplo 14. Las transfecciones se realizan como se

20 resume en la Tabla 12. Las partículas se agregan al medio de cultivo a una proporción de 10 partículas por célula y las placas se arremolinan para distribuir las partículas. Las células se incuban durante 4 horas. Al final del periodo de incubación, el medio de cultivo se remueve, las células se lavan con PBS y se fijan en formalina al 0.4% en PBS.

Tabla 12

Tubo: pIRES µg/µl vol µl YGP mg PEI al 2% en TE Quitosán al 2% en amortiguador de Acetato, pH 5.5 CTAB al 2% Etanol

1: - - 1 200 μl - 200 μl 800 μl

2: - - 1 - 200 μl 200 μl 800 μl

3: 1.8 4 1 200 μl - 200 μl 800 μl

4: 1.8 4 1 - 200 μl 200 μl 800 μl

Se evalúan péptidos que contienen ADN fluorescente y células J774 incubadas con partículas que contienen ADN fluorescente por microscopio fluorescente, y los resultados se resumen en la Tabla 13 y se muestran en las Figuras 3A y 25 3B.

Tabla 13

Tipo de Partícula: Tratamiento Color de Pelotilla Examen de Partículas con Microscopio

YGP: etanol Blanco Sin fluorescencia

YGP-CN: etanol Amarillo Partículas fluorescentes intracelulares

YGP-P: etanol Amarillo Partículas fluorescentes intracelulares

YGP: PEI al 2% Amarillo Partículas fluorescentes intracelulares

YGP-CN: PEI al 2% Amarillo Partículas fluorescentes intracelulares

YGP-P: PEI al 2% Amarillo Partículas fluorescentes intracelulares

YGP: CTAB al 2% Amarillo Partículas fluorescentes intracelulares

YGP-CN: CTAB al 2% Amarillo Partículas fluorescentes intracelulares

Tabla 13

Tipo Partícula: de Tratamiento Color de Pelotilla Examen de Partículas con Microscopio

YGP-P: CTAB al 2% Amarillo Partículas fluorescentes intracelulares

YGP: PEI al 2%/CTAB al 2% Amarillo intracelular Figuras 3A y 3B; Partículas muy fluorescentes

YGP-CN: PEI al 2%/CTAB al 2% Amarillo Partículas fluorescentes intracelulares

YGP-P: PEI al 2%/CTAB al 2% Amarillo Partículas fluorescentes intracelulares

La figura 3A es una imagen a escala de gris (negativo) de contraste invertido de una fotomicrografía de color brillante de células expuestas a partículas YGP cargadas con plásmido pIRES etiquetado fluorescente con PEI como el polímero de captura catiónico y CTAB como un detergente catiónico que indica una célula 310. La figura 38 es una imagen a escala de gris (negativo) de contraste invertido de una fotomicrografía de color fluorescente del mismo campo de células que muestra teñido brillante que representan partículas YGP fluorescentes que contienen ADN plásmido fluorescente internalizado por la misma célula 310 indicada en la Figura 3B.

Ejemplo 19: Expresión de EGFP Por Macrófagos Murinos J774 Incubados con YGP:pIRES

El ADN plásmido de pIRES no fue fluorescentemente etiquetado en este Ejemplo, preferentemente, la expresión funcional de la proteína fluorescente verde (GFP) codificada por pIRES se usa como una demostración de la absorción de partículas de la pared celular de levadura cargadas, liberación intracelular de ADN de pIRES y expresión del GFP como se evidencia por la producción de fluorescencia.

Las formulaciones de YGP: pIRES se prepararon como se resume en la Tabla 14, abajo. Se prepara ADN a partir de diluciones de agua desionizada de 1 mg/ml de solución base. La cantidad indicada de solución de ADN se agrega a YGP y se incuba por al menos 30 minutos para permitir la absorción de líquido. La cantidad indicada de 0.2% de PEI en TE o 0.2% de quitosán en amortiguador de acetato se agrega y la mezcla se deja incubar por 5 minutos antes de la sonicación para producir partículas únicas. Después de una incubación adicional de al menos 30 minutos, se agrega la cantidad indicada de 2% de CTAB. Después de 5 minutos adicionales de incubación, los tubos se sometieron a vórtices mezclados e incubados nuevamente por al menos 30 minutos. Se agrega la cantidad indicada de 95% de etanol. Cada tubo entonces se mezcla y almacena a -20°C durante la noche. Las partículas formuladas de YGP:pIRES entonces se centrifugan, se lavan dos veces en 70% de etanol, se recolectan por filtración a 10,000 rpm por 5 minutos, resuspenden en 0.5 ml de PBS estéril y se someten a sonicación para producir partículas únicas. El número de partículas por ml se contó y cada formulación está y almacena a -20°C.

Se plaquearon macrófagos murino J774 en placas de 6 cavidades a una densidad de 2.5 x105 células por cavidad y se incuban durante la noche como se describe en el Ejemplo 14. Las transfecciones se realizan como se resume en la Tabla 13, anterior. Las partículas se agregan al medio de cultivo a una relación de 10 partículas por célula y las placas son revueltas para distribuir las partículas. Las células se alimentaron diariamente e incubaron por 2 días. Al final del periodo de incubación, el medio de cultivo se removió, las células se lavaron con PBS y se fijaron en 0.4% de formalina en PBS.

Los resultados son resumidos en la Tabla 14 y se muestran en las Figuras 4A-C. Las células se examinaron usando microscopio de fluorescencia. Noventa y nueve por ciento de células J774 toman partículas YGP-F (Tabla 13, cavidad 1B, Figura 4A). La expresión de EGFP fue evidente en >80% de células J774 como fluorescencia punteada en vacuolas en las cavidades 1E (Figura 4B) y 1F (Figura 4C).

Tabla 14

Cavidad: Descripción YGP/Célula volumen Apariencia

1A: Sin control de tratamiento 0 - partículas fluorescentes de GFP no detectables

1B: Control de Absorción de Partícula de YGPF 10 10 μl 1/10 Figura 4A, que muestra fagocitosis de partículas de YGFP fluorescentes

Tabla 14

Cavidad: Descripción YGP/Célula volumen Apariencia

1C: Control de PEI/CTAB vacío de YGP 10 11 μl 1/10 partículas fluorescentes de GFP no detectables

1D: Control de Quitosán/CTAB vacío de YGP 10 5 μl 1/10 partículas fluorescentes de GFP no detectables

1 E: PEI/CTAB de pIRES de YGP 10 10 μl 1/10 Figura 4B, que muestra expresión de GFP fluorescente en células expresión in cells

1F: Quitosán/CTAB de pIRES de YGP 10 6.5 μl 1/10 Figura 4C, que muestra expresión de GFP fluorescente en células

La Figura 4A es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color de células, por ejemplo, una célula indicada 410, expuesta a partículas YGP etiquetadas fluorescentes, la Figura 4B es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color de células, por ejemplo, una célula indicada 420, que expresa GFP de ADN de pIRES suministrada por YGP con una

5 polietilenimina de polímero de captura catiónico (PEI) y una hexadeciltrimetilamoniobromuro detergente catiónico (también conocida como cetiltrimetilamoniobromuro o CTAB) y la Figura 4C es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color de células, por ejemplo, una célula indicada 430, que expresa GFP de ADN de pIRES suministrada por YGP con un quitosán de polímero de captura catiónico y CTAB detergente catiónico.

10 Ejemplo 20: Suministro de ADN Fluorescente, Oligonucleótido y Oligonucleótido de siARN en Células J774 Usando Tecnología de Polímero de Captura de Catión-YGP (Referencial)

Se usaron los siguientes materiales: partículas de YGP:ADN de esperma de salmón fluorescente:PEI:CTAB, partículas de YGP:Oligonucleótido fluorescente:PEI:CTAB, y YGP:siARN fluorescente:PEI:CTAB. El oligonucleótido fluorescente fue un 18 mer sintetizado por Sigma Genosys con un residuo de fluoresceína unido al extremo 5’:

15 5’ Fluoresceína-TTGGTCATCCATGGCTCT 3’ SEC ID NO:1.

El siARN fluorescente fue un siARN de control no silente de 21 mer sintetizado con un residuo de fluoresceína unido al extremo 5’ (Qiagen, Valencia, CA, Catálogo No. 1022079):

5’ Fluoresceína-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT 3’ SEC ID NO:2.

Se plaquearon macrófagos murino J774 en placas de 6 cavidades a una densidad de 2.5 x105 células por cavidad e

20 incubaron durante la noche como se describe en el Ejemplo 14. Se realizaron transfecciones como se resume en la Tabla 15. Se agregan partículas cargadas de nucleótido y control al medio de cultivo y las placas se revuelven para distribuir las partículas. Las células se alimentan diariamente e incuban por 24 horas. Al final del periodo de incubación, el medio de cultivo se removió y las células se lavaron con PBS y fijaron en 0.4% de formalina en PBS.

Tabla 15

Cavidad: Células Relación YGP/Célula Partículas

1A: J774 0 -

1 B: J774 10 YGPF

1C: J774 10 YGP DNAF

1D: J774 10 YGP oligoF

1 E: J774 10 YGP RNAiF

Los resultados se ilustran en las Figuras 5A - I. Se examinaron células usando microscopio de fluorescencia y FACS.

92% de células J774 tomaron partículas YGP-F (Tabla 14, cavidad 1B, Figura 5A). El suministro de oligonucleótido fluorescente (SEC ID NO:1) fue evidente en >80% de células J774 como fluorescencia endosomal punteada y fluorescencia citoplásmica difusa. El suministro de siARN no silente fluorescente (SEC ID NO:1) fue evidente en >80% de células J774 como fluorescencia endosomal punteada y fluorescencia citoplásmica difusa.

La Figura 5A es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente y de luz combinada a color de células, por ejemplo, una célula indicada 510, expuesta a partículas YGP etiquetadas fluorescentes; la Figura 5B es una representación gráfica de los resultados de un estudio de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que muestra un pico mayor 520 que representa la distribución de señales de células que tiene partículas YGP internalizadas etiquetadas fluorescentes y un pico menor 530 que representa la distribución de señales de células sin partículas YGP etiquetadas fluorescentes; la Figura 5C es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía de luz a color de células, por ejemplo, una célula indicada 540, expuesta a partículas de YGP que contienen ADN etiquetado fluorescente, un polímero PEI de captura catiónico y CTAB detergente catiónico; la Figura 5D es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color del mismo campo de células que muestra la misma célula indicada 540, la Figura 5E es una representación gráfica de los resultados de un estudio FACS que muestra un pico mayor 610 que representa la distribución de señales de células que tienen partículas de YGP internalizadas con carga útil de ADN fluorescente y un soporte 620 que representa la distribución de señales de células sin partículas de YGP; la Figura 5F es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía de luz a color de células, por ejemplo, una célula indicada 710, incubada con partículas de YGP que contienen ARN antisentido etiquetado fluorescente, PEI y CTAB; la Figura 5G es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color del mismo campo de células que muestra la misma célula indicada 710 que contiene partículas de YGP internalizadas con carga útil de ARN antisentido fluorescente; la Figura 5H es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una micrografía de luz a color de células, por ejemplo, una célula indicada 810, incubada con partículas de YGP que contiene siARN etiquetado fluorescente, PEI y CTAB y la Figura 5I es una imagen a escala de grises de contraste inverso (negativa) de una fotomicrografía fluorescente a color del mismo campo de células que muestra la misma célula indicada 810 que contiene partículas de YGP internalizadas con carga útil de ARNi fluorescente.

En resumen, las cargas útiles de ADN fluorescente, oligonucleótido o siARN cargadas en YGP usando un polímero de captura catiónico eficientemente suministra la carga útil en células J774. Las cargas útiles son liberadas del compartimiento endosomal dentro de 24 horas en el citoplasma y compartimientos nucleares.

Ejemplo 21: Formulaciones de YGP-ADN suministrando un plásmido ADN (pMFG-GC) que expresa hGC eficientemente en una línea de células de macrófago murino J774.

Los métodos como se describen anteriormente en el Ejemplo 18 se usaron para suministrar un plásmido de ADN (pMFG-GC) que expresa hGC en una línea de células de macrófago murino J774 y demuestran la expresión del producto de gen, glucocerbrosidasa humana. Las composiciones usadas se prepararon como se describe anteriormente y se listan en la Tabla 16, siguiente. Además, formulaciones que comprenden partículas de la pared de células de levadura que contienen pIRES se prepararon como se describe anteriormente.

Tabla16

[ADN] ug/ul: ADN 0.1 mg/ml Vol μl YGP mg 0.2% PE en TE 2% CTAB Etanol Partículas/ml

2: pMFG-GC 4 YGP 200 200 800 7.3 X 10E8

2: pMFG-GC 4 YGP-CN - 200 800 6.5X10E8

Los vectores de tipo pMFG-GC usados han sido previamente descritos (Fabrega, S., et al., Human glucocerebrosidase: heterologous expression of active site mutants in murine null cells. Glycobiology. 2000 Nov; 10(11): 1217-24). El vector comprende ADNc de GC humano insertado entre los sitios Nco I y Bam HI del armazón MFG. Los vectores de MFG, los cuales retienen los sitios donadores de empalme viral (SD) y aceptores de empalme (SA), usan la repetición terminal larga del virus 5’ de leucemia murina Maloney (5' LTR) para generar un ARNm empalmado responsable de la expresión de la secuencia insertada. El ADNc de GC humano se clonó en el vector de MFG de manera que el codón de inicio fue precisamente en el codón de inicio del gen env suprimido. Cuando se usa para transducir células de médula ósea de ratón, macrófagos cultivados exhiben en promedio, cuatro veces la actividad enzimática de macrófagos de control.

Células adherentes en cultivo se hicieron crecer en DMEM (Gibco) + 10% de suero de ternera fetal y medio de cultivo de tejido de penicilina-estreptomicina-glutamina (Gibco) en placas de cavidades múltiples de plástico. A confluencia apropiada, el medio de cultivo se removió, las células se lavaron brevemente con PBS, y después se fijaron (con 0.5-1%

de solución de formalina o paraformaldehído). Después de la remoción del fijativo, las células se lavaron brevemente con PBS y después se incubaron a TA por 1hr en 0.1% de albúmina de suero bovino/0.05% de Tween 20. Después de la remoción de 0.1% de albúmina de suero bovino/0.05% de solución Tween 20, las células entonces se incubaron a 4°C durante la noche con un antisuero de conejo a glucocerebrosidasa humana (dilución de trabajo 1/1000-1/5000; Ginns et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 79:5607-5610, Septiembre 1982) en PBS/0.05% Tween 20.

Después de la incubación durante la noche, la solución de anticuerpo se removió de la célula, y las células se lavaron cinco veces por 3 min con PBS/0.05% Tween 20 con fuerte agitación. Las células entonces se incubaron con antisuero conjugado FITC anti-conejo de cabra (Sondas Moleculares F2765, IgG anti-conejo de cabra de fluoresceína (H+L), 2 mg/mL; dilución de trabajo 1/100-1/500) por 1-2hr a TA.

Las células nuevamente se lavaron cinco veces por 3 min con PBS/0.05% Tween 20 con fuerte agitación. Después de la remoción de las soluciones de lavado final, se agregó PBS a cada cavidad y las placas de células se almacenaron a 4°C en la oscuridad hasta análisis microscópico fluorescente. El protocolo se resume en la Tabla 17.

Tabla 17

Cavidad: construcción de YGP µl Día Anticuerpo 1’ Anticuerpo 2’

1A: - - 3 Glucocerebrosidasa Anti-humana 200 ul IgG-F de anti-conejo de cabra

1B: YGP-F 5 3 - -

1C: YGP:pMFG-GC:PEl:CTAB 4.8 3 Glucocerebrosidasa Anti-humana 200 ul IgG-F de anti-conejo de cabra

1D: YGP-CN:pMFG-GC.PEhCTAB 17.9 3 Glucocerebrosidasa Anti-humana 200 ul IgG-F de anti-conejo de cabra

Las Figuras 6A-6G son imágenes a escala de grises de fotomicrografías a color de células de macrófago murinos J774 que muestran absorción de partículas de la pared de células de levadura que contienen vectores de expresión pMFG-GC y expresión de glucocerebrasidasa humana (hGC). Las células se expusieron a una formulación de YGP o células no tratadas (control), cultivadas y adherentes se fijaron con formalina. Las células fijas se procesaron para inmunohistoquímica usando un anticuerpo GC anti-humano primario (antisuero de conejo), un anticuerpo secundario detectable apropiado (antisuero conjugado FITC anti-conejo de cabra), se examinaron por microscopio de fluorescencia y fotografiaron.

La Figura 6A es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía de luz transmitida a color de células J774, por ejemplo, una célula indicada 510, de un cultivo de control no tratado.

La Figura 6B es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía de fluorescencia a color del mismo campo de células J774 que muestran una carencia de células fluorescentemente etiquetadas.

La Figura 6C es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía fluorescente y de luz combinada a color de células J774 expuestas a una formulación de partículas fluorescentemente etiquetadas de la pared de células de levadura (YGP-F) que muestran células, por ejemplo, células 912, que contienen partículas fluorescentemente etiquetadas.

Las Figuras 6D y 6E son imágenes a escala de grises de una fotomicrografía de luz transmitida a color y fotomicrografía fluorescente a color, respectivamente, del mismo campo de células J774 expuestas a una formulación de partículas de la pared de células de levadura que contienen vectores de expresión pMFG-GC (YGP:pMFG-GC:PEI:CTAB) que muestran expresión de glucocerebrosidasa humana (hGC) por inmuno-reactividad en células fluorescentemente etiquetadas, por ejemplo, células 914.

Las Figuras 6F y 6G son imágenes a escala de grises de una fotomicrografía de luz transmitida a color y fotomicrografía fluorescente a color, respectivamente, del mismo campo de células J774 expuestas a una formulación de partículas de la pared de células de levadura que contienen vectores de expresión pMFG-GC (YGP-CN:pMFG-GC:CTAB) que muestran expresión de glucocerebrosidasa humana (hGC) por inmuno-reactividad en células fluorescentemente etiquetadas, por ejemplo, células 916.

Los resultados generales de estos estudios pueden ser resumidos como sigue. Células de la línea de células de macrófago murino J774 someten a fagocitosis partículas YGP-F eficientemente (>90%). El anticuerpo antiglucocerebrosidasa humano selectivamente tiñe la proteína humana recombinada y no reacciona cruzado con la proteína endógena de ratón. La expresión de glucocerebrosidasa humana fue detectable como inmuno-reactividad en >50% de células tratadas con J774 in vitro con formulaciones de YGP pMFG-GC CTP. Formulaciones tanto de YGP:MFG-GC:PEI:CTAB como YGP-CN:pMFG-GC:CTAB fueron efectivas para suministrar ADN de plásmido e incluyen expresión detectable de glucocerebrosidasa humana en células J774. La glucocerebrosidasa humana parece ser normalmente procesada y se detectó en los compartimientos endosomales y lisosomales. Las formulaciones de YGP:CTP son efectivas en el suministro del gen de glucocerbrosidasa humana en pMFG-GC y promueven la expresión de glucocerebrosidasa humana en células de macrófago murino J774.

Ejemplo 22: Biodisponibilidad oral de partículas fluorescentes YGP y YGMP en ratones con Gaucher y de tipo nativo.

La Figura 8 es un diagrama esquemático de una modalidad preferida del método para suministrar partículas betaglucano de levadura (YGP) 230 por migración de macrófagos 370 a varios órganos 450, 452,454, 456, 458 después de la administración oral in vivo 180. Una composición 182 que contiene partículas beta-glucano de levadura (YGP) 230 se administra oralmente 180 a un sujeto 185. Las partículas beta-glucano de levadura (YGP) 230 son absorbidas por células M 355 en el revestimiento del intestino delgado y son translocadas a través del epitelio 350 y son fagocitosadas por macrófagos intestinales 360. Los macrófagos que contienen YGP migran 370 a órganos y tejidos que incluyen hueso 450, pulmón 452, hígado 454, cerebro 456 y bazos 458. Aproximadamente 72 horas después de la administración oral, macrófagos esplénicos 364 que han fagocitosado YGP se observaron en los bazos 458 (mostrados tanto esquemáticamente como en una imagen a escala de grises de contraste inverso de una fotomicrografía fluorescente a color). Aproximadamente 90 horas después de la administración oral, macrófagos de médula ósea 362 que han fagocitosado YGP se observaron en hueso 450 (mostrados tanto esquemáticamente como en una imagen a escala de grises de contraste inverso de una fotomicrografía fluorescente a color).

Se estudió el efecto de la composición de carbohidratos de la superficie celular en biodisponibilidad oral de partículas de glucano de levadura usando partículas fluorescentemente etiquetadas de la pared de células de levadura, YGP-F (partículas de glucano de levadura etiquetadas con FITC) y YGMP-F (partículas de glucomanano de levadura etiquetadas con FITC) se prepararon como se describe anteriormente. Alícuotas (0.1ml) de YGP-F y YGMP-F se administraron a ratones (ratón de modelo Gaucher y de tipo nativo C57B1/6) por alimentación forzada oral e inyección subcutánea por 5 días. Cerebro, hígado, médula ósea, intestino delgado y una sección de bazos de cada animal se fijaron y examinaron por microscopio fluorescente para determinar la extensión de la absorción de partículas de la pared de células de levadura fluorescentes. Una alícuota de bazos se colocó en hielo y procesó para producir suspensiones de células únicas. Células esplénicas se plaquearon a ~106 células por placa de 12 cavidades e incubaron por 24 horas para permitir la unión. Después del lavado separado de células no unidas, las paredes se registraron para células adherentes (macrófagos) con partículas fluorescentes internalizadas por microscopio de fluorescencia.

Partículas de la pared de células de levadura también se mostraron por ser útiles y efectivas para suministro in vivo (rutas oral y parenteral) del gen glucocerbrosidasa humana en constructos de pMFG-GC, produciendo la expresión de glucocerebrosidasa humana en células de macrófago esplénicas. Formulaciones que incorporan ADN plásmido de MFGGC que expresan GC humano en partículas de glucano de levadura (YGP) y partículas de glucano-manano de levadura (YGMP) en la forma de nanocomplejos de ADN-polímero catiónico se prepararon como se describe anteriormente. Los datos muestran que estas micropartículas de YGP-ADN y YGMP-ADN llegan a estar biodisponibles a través de la absorción mediada por el receptor en tejido, macrófagos de tejido linfático asociado con el intestino y mucosal (GALT) cuando se administran oralmente o parenteralmente. La absorción mediada por el receptor directo en macrófagos del tejido vía enlace al receptor de carbohidrato a los polisacáridos glucano y manano de la superficie de partículas ocurre cuando las micropartículas cargadas con ADN son sistemáticamente administradas. Después de la fagocitosis por células, las partículas son engullidas en endosomas en donde el polímero catiónico libera el ADN, hinchando el endosoma y liberando el ADN en el citoplasma en donde migra a los núcleos. El ADN liberado es procesado por la maquinaria celular para producir enzima GC humana normal.

Se usaron dos modelos de ratón de enfermedad de Gaucher. El primer ratón con Gaucher se produje inyectando ratones C57/B1 con 100 mg/kg de beta-epóxido de conduritol (CBE, 7-oxabiciclo[4.1.0]heptano-2,3,4,5-tetrol), intraperitonealmente diariamente por 3 semanas. Ratones C57/B1 con tres semanas de tratamiento de 3 meses de edad con CBE producen un incremento de aproximadamente 50% y 500% en la cantidad de glucosilceramida en tejido sistémico y cerebro, respectivamente. Hubo una reducción en la actividad de p-glucosidasa en ratones tratados con CBE, pero los niveles de otras enzimas hidrolíticas (a-manosidasa, �-héxosaminidasa, a-galactosidasa, a-glucosidasa y -glucuronidasa) no fueron significantemente diferentes de aquellos de ratones de control. No ocurrieron diferencias de comportamiento o peso en ratones tratados de 3 meses de edad. Por el contrario, ratones C57/B1 infantes de 1 día de edad tratados con 100mg/kg de CBE EP diariamente por 3 semanas tienen una diferencia significante en crecimiento comparada con controles. Expresado como porcentajes de peso corporal total, no hubo diferencia para cerebro, hígado, y riñón, pero los pesos de los bazos fueron 60% de control. Los ratones infantes tratados con CBE manifestaron arqueado de cola, un temblor de acción de alta amplitud potenciado y respuesta mínima al sobresalto, pero respuesta de

enderezamiento y natación normal, todos sugeridos de involucramiento de materia gris del CNS. Hubo un incremento del 50% y 300% en glucocerebrosidasa en tejido de hígado y cerebro, respectivamente.

Similar a los ratones de 3 meses tratados, los ratones infantes tratados han reducido drásticamente la actividad de glucosidasa. Sin embargo, mientras la a-glucosidasa y -galactosidasa fueron cercanos a lo normal, la actividad de hexosaminidasa y manosidasa fueron elevadas. Estos ratones han proporcionado una oportunidad para estudiar la patogénesis de enfermedad de Gaucher, pero los efectos de vida corta de la inyección de CBE hacen a estos ratones menos útiles para estudiar los efectos a largo plazo de la enzima y terapia de reemplazo de gen.

Se usó un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Gaucher en el cual se hicieron sustituciones de aminoácido en glucocerebrosidasa murina que produce una reducción significante en la expresión endógena de GC a un nivel menor que la mitad de aquel de la actividad enzimática en camadas normales. El ensayo de la actividad de glucocerebrosidasa en muestras de ratón se realizó usando 4-metilumbelerferil-glucopiranósido (4MUGP), un sustrato fluorescentemente etiquetado. Las mutaciones de punto, análogas a aquellas encontradas en los pacientes con enfermedad de Gaucher medianamente afectados, se introdujeron en un clon genómico de glucocerebrosidasa murina por mutagénesis por PCR. Los clones modificados se insertaron en un vector apropiado y transfectaron en células troncales embriónicas murinas RW4 (ES) por electroporación. Clones ES que contienen la mutación correctamente dirigida en un alelo del gen glucocerebrosidasa se inyectaron en blastocistos a partir de ratones C57BL/6 usando técnicas estándares los cuales fueron entonces transferidos a ratones criados. La descendencia macho de estas inyecciones se criaron en prueba contra hembras C57BL/6, y la progenie se seleccionó por PCR y análisis Southern para transmisión del alelo glucocerebrosidasa mutante.

Modelos murinos de larga vida de genotipos Gaucher humano son valiosos para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Previamente, se creó un ratón agénico por alteración dirigida del gen de glucocerebrosidasa que es un modelo murino de enfermedad de Gaucher tipo 2. Estos ratones homocigotos afectados no tienen actividad de glucocerebrosidasa, almacenamiento lípido en macrófagos, tienen piel ictiótica y mueren dentro de 24 horas del nacimiento. La ultraestructura del material de almacenaje en lisosomas se asemeja estrechamente a aquel de los pacientes humanos. Estudios adicionales usan un procedimiento de mutagénesis de inserción única para introducir mutaciones asociadas con dos fenotipos humanos conocidos. Estos ratones de mutación RecNcil por inserción tienen baja actividad enzimática y glucosilceramida acumulada, mientras los ratones L444P tienen niveles de enzima superior. Sin embargo, estos ratones RecNcil y L444P de mutación por inserción mueren dentro de 48 horas.

Las mutaciones L444P, R463C y N370S comprenden tres de las mutaciones más frecuentemente encontradas en pacientes Gaucher. La mutación L444P se encuentra en frecuencia superior en pacientes que tienen anormalidades neurológicas. El uso de un vector de reemplazo que contiene loxP para generar un modelo de ratón de larga vida con enfermedad de Gaucher que porta las mutaciones de punto L444P, R463C y N370S se ilustra esquemáticamente en la Figura 9A y FIG 9B. Se construyó un vector de objetivo de reemplazo usando la selección positiva/negativa que contiene un casete de resistencia de neomicina (NeoR) flanqueado por secuencias loxP insertadas en las regiones intergénicas entre metaxina murina (MX) y glucocerebrosidasa (GC). La mutación L444P se introdujo en un clon genómico de glucocerebrosidasa murina por mutagénesis por PCR. De esta forma, la secuencia GC murina normal en el comienzo del exón 10 se cambió de TGACTTGGA (SEC ID NO: 3) A TGACCCGGA (SEC ID NO: 4), que resultó en la sustitución de aminoácido de prolina para leucina e introducción de un sitio de restricción Ncil. Este cambio en secuencia se confirmó en el constructo por análisis tanto de digestión de restricción como secuencia directa. El constructo final contiene un brazo homólogo de GC al 5’ de 4.0 kb y un brazo homólogo MX al 3’ de 1.4 kb. Un casete de difteria toxina A (DTA) se colocó corriente abajo como un marcador seleccionable negativo como se muestra en la Figura 9A.

Después de la linealización, este constructo se introdujo en células troncales embriónicas murinas RW4 (ES) por electroporación y las células ES se sometieron a selección de fármaco en cultivo con G418 como se describe previamente. El evento de objetivo de gen correcto en clones individuales resistentes a G418 se identificó por análisis de PCR y manchado Southern. Células de clones ES que contienen la mutación L444P correctamente dirigida en un alelo del gen de glucocerebrosidasa se inyectaron en blastocistos de ratones C57BL/6 y después se transfirieron a ratones criados. La descendencia macho de estas inyecciones que tienen más de 30% de quimerismo de color de recubrimiento se reprodujeron por pruebas contra hembras C57BL/6, y la progenie se seleccionó por análisis PCR y Southern para transmisión del alelo de glucocerebrosidasa L444P mutante. Cuando la mutación L444P se transmitió, el fragmento de ADN se visualizó por una sonda de exón 9 en análisis Southern y el producto amplificado por PCR del exón 9 de 725bp (cebador delantero: 5'CTACCATCTTGGCCACTTCAG (SEC ID NO:5); cebador inverso: 5'GCACAGGAGCGAACTCTTTCC, SEC ID NO: 6) ambos desdoblados con Ncil. Dos líneas de ratones que contienen los alelos mutantes L444P se identificaron, y la secuencia de ADN se confirmó por secuenciamiento directo del ADN amplificado por PCR que contiene la mutación introducida en el exón 9. Ratones heterocigotos para el gen glucocerebrosidasa mutante de L444P se aparearon y se identificó la progenie mutante homocigota por manchado Southern y análisis por PCR. Además, los ratones L444P heterocigotos se aparearon a ratones que portan un transgen para recombinasa de ADN CRE, resultando en la escisión del marcador NeoR, dejando solamente una secuencia loxP de 34 pb. Como se esperaba, la mutación L444P dirigida se transmitió en una forma Mendeliana. El ensayo de la actividad de glucocerebrosidasa en muestras de cola de ratón usando 4-metilumbelerferil-glucopiranósido (4MUGP), un sustrato fluorescentemente etiquetado, demostró que en ratones mutantes homocigotos la actividad de glucocerebrosidasa fue aproximadamente 35% de la actividad enzimática en camadas normales.

Las Figuras 10A - 10D son imágenes a escala de grises de fotomicrografías de luz transmitida a color (Figura 10A y Figura 10C) y fotomicrografía fluorescente a color (Figura 10B y FIG, 10D) de células de macrófago esplénicas aisladas de partículas YGP etiquetadas fluorescentes alimentadas a ratones. Alícuotas (0.1 ml) de YGP-F y YGMP-F se administraron a ratones (Ratón mutante Gaucher y tipo nativo C57B1/6) por alimentación forzada oral o inyección subcutánea muestran macrófagos no fluorescentes 920 y macrófagos fluorescentes 922, 924.

Cerebro, hígado, médula ósea, intestino delgado y una sección de bazos de cada animal se fijaron y examinaron por microscopio fluorescente para determinar la extensión de la absorción de partículas de la pared de células de levadura fluorescentes. Una alícuota de bazos se colocó en hielo y procesó para producir suspensiones de células únicas. Células esplénicas se plaquearon a ~106 células por placa de 12 cavidades e incubaron por 24 horas para permitir la unión. Después del lavado separado de células no unidas, las cavidades se registraron por células adherentes (macrófagos) con partículas fluorescentes internalizadas por microscopio fluorescente.

Los tratamientos fueron en general bien tolerados. El análisis microscópico fluorescente de macrófagos esplénicos adherentes demostró la presencia de partículas fluorescentes de la pared de células de levadura en todos los animales tratados. Estos resultados demuestran que tanto YGP-F como YGMP-F son oralmente biodisponibles y sistémicamente distribuidos por macrófagos. El análisis de las heces demostró la presencia de partículas fluorescentes indicando que la absorción oral fue incompleta. Tanto el modelo de ratón de tipo nativo como Gaucher fueron competentes para absorber las partículas de la pared de células de levadura administradas oralmente.

La administración oral y subcutánea in vivo de formulaciones que comprenden las partículas de la pared de células de levadura que contienen un vector de expresión pIRES fue efectiva en producir la expresión de la proteína fluorescente verde en macrófagos murinos esplénicos. Las Figuras 11A-11D son imágenes a escala de grises de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas aisladas de ratones tratados in vivo que muestran absorción de partículas de la pared de células de levadura que contienen vectores de expresión pIRES y expresión de proteína fluorescente verde (GFP). Las células aisladas se cultivaron a confluencia apropiada, y las células adherentes se fijaron con formalina, se examinaron usando microscopio de fluorescencia y fotografiaron.

La Figura 11A es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe alimentación forzada oral in vivo de PBS (tratamiento de control) que muestran una carencia de macrófagos fluorescentes.

La Figura 11B es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe una inyección subcutánea in vivo de 0.1 ml de una formulación YGP-pIRES proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra un GFP fluorescente que expresa el macrófago 930.

La Figura 11C es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación YGP-pIRES proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra un GFP fluorescente que expresa el macrófago 931.

La Figura 11D es una imagen a escala de grises de una fotomicrografía fluorescente a color de células de macrófago esplénicas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación YGMPpIRES proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestra un GFP fluorescente que expresa el macrófago

932.

La administración oral y subcutánea in vivo de formulaciones que comprenden partículas de la pared de células de levadura que contienen un vector de expresión pMFG-GC preparado como se describe anteriormente fue efectiva en producir la expresión de glucocerebrosidasa humana en macrófagos esplénicos murinos. Las Figuras 12A-12M son imágenes de fotomicrografías de células inmunoteñidas de macrófago esplénicas aisladas de ratones in vivo que muestran absorción de partículas de la pared de células de levadura que contienen vectores de expresión pMFG-GC y expresión de glucocerebrosidasa humana (hGC). Las células aisladas se cultivaron a confluencia apropiada, y las células adherentes se fijaron con formalina. Las células fijas se procesaron por inmunocitoquímica usando un anticuerpo GC anti-humano primario (antisuero de conejo), un anticuerpo secundario detectable apropiado (antisuero conjugado FITC anti-conejo de cabra), se examinaron usando microscopio de fluorescencia y se fotografiaron.

La Figura 12A es una imagen de una fotomicrografía fluorescente a color de células inmunoteñidas de macrófago esplénicas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe alimentación forzada oral in vivo de PBS (tratamiento de control) que muestran una carencia de hGC que expresa macrófagos inmunoteñidos fluorescentes.

Las Figuras 12B y 12C son imágenes de una fotomicrografía de luz transmitida a color (12B) y una fotomicrografía fluorescente a color (12C) de células inmunoteñidas de macrófago esplénicas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe una inyección subcutánea in vivo de 0.1 ml de una formulación YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestran a hGC que expresa macrófago inmunoteñido fluorescente 935.

La Figura 12D es una imagen de una fotomicrografía fluorescente a color de células inmunoteñidas de macrófago esplénicas aisladas de un ratón mutante L444P -/- que recibe una inyección subcutánea in vivo de 0.1 ml de una formulación YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestran una hGC que expresa macrófago inmunoteñido fluorescente 936.

La Figura 12E es una imagen de una fotomicrografía fluorescente a color de células inmunoteñidas de macrófago esplénicas aisladas de un ratón mutante R463C -/- que recibe una inyección subcutánea in vivo de 0.1 ml de una formulación YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestran una hGC que expresa macrófago inmunoteñido fluorescente 937

Las Figuras 12F y 12G son imágenes de una fotomicrografía de luz transmitida a color (12F) y una fotomicrografía fluorescente a color (12G) de células inmunoteñidas de macrófago esplénicas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestran hGC que expresa macrófagos inmunoteñidos fluorescentes, por ejemplo, macrófago 938.

Las Figuras 12H y 12I son imágenes de una fotomicrografía de luz transmitida a color (12H) y una fotomicrografía fluorescente a color (12I) de células inmunoteñidas de macrófago esplénicas aisladas de un ratón mutante L444P -/- que recibe 30 días de tratamiento de una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestran hGC que expresa macrófagos inmunoteñidos fluorescentes, por ejemplo, macrófago 940.

La Figura 12J es una imagen de una fotomicrografía fluorescente a color de células inmunoteñidas de macrófago esplénicas aisladas de un ratón mutante R463C -/- que recibe una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación YGPpMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestran hGC que expresa macrófagos inmunoteñidos fluorescentes, por ejemplo, macrófago 941.

La Figura 12K es una imagen de una fotomicrografía fluorescente a color de células inmunoteñidas de macrófago esplénicas aisladas de un ratón de tipo nativo que recibe una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación de YGMPpMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestran hGC que expresa macrófagos inmunoteñidos fluorescentes, por ejemplo, macrófago 942.

La Figura 12L es una imagen de una fotomicrografía fluorescente a color de células inmunoteñidas de macrófago esplénicas aisladas de un ratón mutante L444P -/-que recibe una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación de YGMP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestran hGC que expresa macrófagos inmunoteñidos fluorescentes, por ejemplo, macrófago 943.

La Figura 12M es una imagen de una fotomicrografía fluorescente a color de células inmunoteñidas de macrófago esplénicas aisladas de un ratón mutante R463C que recibe una dosis oral in vivo de 0.1 ml de una formulación de YGMP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis que muestran hGC que expresa macrófagos inmunoteñidos fluorescentes, por ejemplo, macrófago 944

Ejemplo 23: Efectos sistémicos de administración oral de partículas de YGP y YGMP en ratones Gaucher y de tipo nativo.

La disponibilidad de estos ratones Gaucher con mutación de punto de vida prolongada que tienen anormalidades fenotípicas y bioquímicas similares a pacientes con Gaucher que tienen la misma mutación proporcionan un medio para probar la eficacia de la terapia de gen oralmente administrado en patología del sistema nervioso central y sistémico observado en enfermedad de Gaucher.

Las manifestaciones clínicas de la enfermedad en ratones Gaucher pueden ser empobrecidas y aceleradas por cursos cortos de tratamiento intraperitoneal (IP) con el �-epóxido conduritol inhibidor de glucosidasa (CBE, 7oxabiciclo[4.1.0]heptano-2,3,4,5-tetrol). Como se describe previamente en un modelo de ratón quimérico, los inhibidores de glucocerebrosidasa tales como CBE y agentes hemolíticos como fenilhidrazina podrían ser administrados a ratones Gaucher para comprometer además la capacidad de la enzima mutante residual para degradar el lípido, y con ello, conducir a almacenaje incrementado de lípido y manifestaciones clínicas tempranas y más severas.

El tratamiento in vivo por administración oral o subcutánea resulta en la absorción de tanto formulación a base de YGP como YGMP en macrófagos esplénicos de tanto ratones mutantes de modelo Gaucher como ratones de tipo nativo. Tal tratamiento resultó en expresión de hGC recombinante en macrófagos esplénicos aislados, como se mide por incremento detectable en material reactivo inmunológicamente cruzado de hGC. El tratamiento además resulta en alivio

5 observable de síntomas como Gaucher en ratones de modelo Gaucher tratados, indicando que el tratamiento sistémico usando las formulaciones de la presente invención tiene resultados terapéuticos deseables.

Los ratones mutantes L444P se compararon con ratones de tipo nativo y heterocigotos usando conteos de sangre, tamaño de órgano y actividad de glucocerebrosidasa. Los conteos de sangre completa se midieron por los animales mutantes C57/BL6 (tipo nativo), transgénicos, heterocigotos y homocigotos, y los conteos medios fueron similares, como

10 se muestra en la Tabla 18, siguiente. Se midió tamaño del cerebro, hígado y bazos para animales mutantes tipo nativo (wt), heterocigotos (het) y homocigotos (cuatro de cada uno). La Tabla 19 proporciona los pesos de órganos medios.

Tabla 18 Conteos de Sangre

Conteo en sangre: Ratones tipo nativo Ratones L444P

WBC: 6.6 ± 3.4 5.8 ± 2.9

hematócritos: 38.8 ±4.1 39.4 ±1.1

Plaquetas: 301,000 ±35,070 308,000 ±19,500

Tabla 19 Tamaño de órganos

Tejido: Ratón tipo nativo Ratones heterocigotos Ratones L444P

cerebro: 0.45q 0.50g 0.39g

hígado: 1.30g 1.30g 1.25g

bazo: < 0.1 <0.1g <0.1g

Todos los tejidos probados en los ratones mutantes L444P se encontraron por ser deficientes en actividad de glucocerebrosidasa, como se ensaya usando 4-metilumbeliferil-B-D-glucopiranosido (4MU-Glu). La actividad de 15 glucocerebrosidasa en los tejidos de los ratones Gaucher L444P no tratados fue significantemente inferior que aquella de los controles: bazo (10%), hígado (28%), pulmón (8%), médula ósea (11%) y cerebro (65%). El tratamiento con las formulaciones YGP (2 ratones) y formulaciones YGMP (3 ratones) suplementado con actividad de enzima glucocerebrosidasa de hígado, en donde las actividades de enzima de glucocerebrosidasa promedio en ratones Gaucher L444P no tratados (n= 7), ratones Gaucher L444P que reciben gen de terapia glucocerebrosidasa oral (n= 5) y ratones

20 de tipo nativo (n= 6) fue 12 por ciento, 29 por ciento y 100 por ciento de actividad específica de glucocerebrosidasa de ratón de tipo nativo, respectivamente.

En estudios preliminares que comparan el efecto de composiciones de YGP y YGMP, la administración oral de formulaciones de YGP-pMFG-GC (una dosis oral diaria de 0.1 ml de una formulación YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis por 14 días y 5 dosis por semana por 56 días) a un ratón Gaucher L444P produce un

25 incremento en la actividad de glucocerebrosidasa (normalizada a la actividad en los tejidos correspondientes de un ratón de tipo nativo) en pulmón y cerebro, y un incremento menor en bazo, comparado con la actividad en tejidos de ratones Gaucher L444P no tratados, como se muestra en la Tabla 20, posterior.

Tabla 20

Bazo: Hígado Pulmón Cerebro

No tratado: 10.7 27.8 7.7 66.7

tratado con YGP: 16 27 41 85

Tipo nativo: 100 100 100 100

La administración oral de formulaciones de YGMP-pMFG-GC a un ratón Gaucher L444P produce un incremento algo mayor en la actividad de glucocerebrosidasa como se muestra en la Tabla 20 comparado con el incremento visto después del tratamiento con la formulación de YGP-pMFG-GC. El incremento también mostró un patrón dependiente del tejido diferente del incremento en la actividad de glucocerebrosidasa. La Tabla 21, abajo, muestra los resultados de la actividad de glucocerebrosidasa promedio determinada en tejido de bazo, hígado, pulmón y cerebro de ratón L444P no tratado y ratón de tipo nativo (C57B1/6) comparada con aquella de un ratón Gaucher L444P que recibe una dosis oral diaria de 0.1 ml de una formulación YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis por 14 días y 5 dosis por semana por 56 días, normalizado a la actividad en los tejidos correspondientes del ratón de tipo nativo.

Tabla 21

Bazo: Hígado Pulmón Cerebro

No tratado: 10.7 27.8 7.7 66.7

tratado con YGMP: 86.7 92.6 61.7 97.3

Tipo nativo: 100 100 100 100

La administración oral de formulaciones de YGMP-pMFG-GC a un ratón mutante R463C también produce un patrón dependiente del tejido de incremento en actividad de glucocerebrosidasa como se muestra en la Tabla 22, siguiente. El tratamiento produce un pequeño cambio en la actividad de glucocerebrosidasa en el bazo, un incremento sustancial en la actividad glucocerebrosidasa en el pulmón, y un incremento intermedio en el hígado. La Tabla 21 muestra los resultados de la actividad de glucocerebrosidasa promedio determinada en tejido de bazo, hígado y pulmón de ratón R463C no tratado, y un ratón de tipo nativo (C57B1/6) comparada con aquella de un ratón Gaucher R463C que recibe una dosis diaria de 0.1 ml de una formulación YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis por 14 días y 5 dosis por semana por 56 días, normalizada a la actividad en los tejidos correspondientes del ratón de tipo nativo.

Tabla 22

Bazo: Hígado Pulmón Cerebro

No tratado: 30 27.8 1.7 29

tratado con YGMP: 30 27 74 100

Tipo nativo: 100 100 100 100

Algunos ratones fueron hechos ratones Gaucher R463C severamente sintomáticos siguiendo un curso de -epóxido de conduritol (100mg/kg/día IP por 14 días). Después del �-epóxido de conduritol (100mg/kg/día IP por 14 días) hubo una diferencia principal en el curso clínico y fenotipo entre ratones tipo nativo (wt) y ratones Gaucher R463C. En los ratones Gaucher, las manifestaciones clínicas severas y patología permanecen después de siete días de recuperación siguiendo un tratamiento 14 con -epóxido de conduritol. Después de un curso de �-epóxido de conduritol (100mg/kg/día IP por aproximadamente 2 semanas) ratones Gaucher L444P son severamente sintomáticos. Ratones Gaucher L444P que han recibido �-epóxido de conduritol (100mg/kg/día IP por 14 días) seguido por al menos 70 días de administración oral de

0.1 ml de una formulación de YGP-pMFG-GG proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis son menos severos graves que aquellos ratones que no reciben el tratamiento de formulación de YGP-pMFG-GC.

Ratones Gaucher R463C llegan a ser más sintomáticos siguiendo un curso de -epóxido de conduritol (100mg/kg/día IP por 16 días). Ratones Gaucher R463C que ha recibido �-epóxido de conduritol (100mg/kg/día IP por 16 días) seguido por al menos setenta días de administración oral de 0.1 ml de una formulación de YGP-pMFG-GC proporcionando 100 ng de ADN plásmido por dosis son clínicamente más saludables que aquellos que no reciben la formulación de YGPpMFG-GC.

El tratamiento incrementa la supervivencia de ratones R463C Gaucher. La Figura 13 es una representación gráfica de datos a partir de un estudio que muestra la supervivencia incrementada vista en ratones Gaucher R463C tratados con CBE siguiendo la terapia de gen de glucocerebrosidasa en una modalidad preferida de la presente invención.

Claims

REIVINDICACIONES

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

1. Una composición caracterizada porque comprende:

una pared de célula de levadura extraída que define un espacio interno y que comprende 6 a 90 por ciento en peso de beta-glucano;

una molécula de captura de carga útil seleccionada del grupo que consiste de un polielectrolito catiónico, un polielectrolito aniónico, un polielectrolito anfotérico, un polisacárido, un polímero catiónico, un lípido catiónico, y una poliamina; y

una molécula de carga útil seleccionada del grupo que consiste de

(i)

un ácido nucleico que codifica una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de enzima lisosomal, o un equivalente funcional de un activador de enzima lisosomal, en donde el activador de enzima lisosomal es seleccionado del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, Activador de proteína GM2;

(ii)

una proteína seleccionada del grupo que consiste de una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de enzima lisosomal y un equivalente funcional de un activador de enzima lisosomal, en donde el activador de enzima lisosomal es seleccionado del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, Activador de proteína GM2; y

(iii) una mezcla de los mismos;

en donde la molécula de carga útil está presente en una cantidad efectiva para complementar la función de una enzima lisosomal deficiente;

en donde la molécula de carga útil y la molécula de captura de carga útil son solubles en el mismo sistema solvente; y

en donde la molécula de captura de carga útil estabiliza la asociación de la molécula de carga útil y la pared de célula de levadura extraída.
2.

La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de captura de carga útil se selecciona del grupo que consiste de quitosán, polietilenimina, poli-L-lisina, alginato, xantano, y mezclas de los mismos.
3.

La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la pared de células de levadura extraídas además comprende más de 30 por ciento en peso de manano.
4.

La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la pared de células de levadura extraídas además comprende más de 50 por ciento en peso de quitina.
5.

La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de carga útil es un ácido nucleico el cual es un constructo de ADN recombinante.
6.

La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el constructo de ADN recombinante es un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica la proteína.
7.

La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la proteína codificada por la estructura lectora abierta es una proteína estructural, una proteína que tiene actividad enzimática, una proteína de membrana, una proteína de enlace al ADN, una proteína de señalización o un equivalente funcional de la misma.
8.

La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la proteína codificada por la estructura lectora abierta es glucocerebrosidasa humana o un equivalente funcional de la misma, una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, una proteína activadora de enzima lisosomal o un equivalente funcional de una proteína activadora de enzima lisosomal.
9.

La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el activador de enzima lisosomal se selecciona del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D y una mezcla de los mismos.
10.

La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el activador de enzima lisosomal

es la proteína activadora GM2 (GM2AP).
11.

La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de carga útil es una proteína la cual es una enzima lisosomal o un equivalente funcional de la misma.
12.

La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende bromuro de hexadeciltrimetilamonio.
13.

Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
14.

Uso de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de un trastorno de almacenaje lisosomal.
15.

El uso de conformidad con la reivindicación 14, en donde el trastorno de almacenaje lisosomal es un metabolismo defectivo de glicosaminoglicanos, una degradación defectiva de la porción glicano de glicoproteínas, una degradación defectiva de glicógeno, una degradación defectiva de componentes esfingolípidos, una degradación defectiva de polipéptidos, una degradación defectiva o transporte de colesterol, ésteres de colesterol, u otros complejos lípidos, una deficiencia de enzimas lisosomales múltiples, un defecto de transporte o un defecto de tráfico intracelular.
16.

El uso de conformidad con la reivindicación 14, en donde el trastorno de almacenaje lisosomal es enfermedad de Hurler, enfermedad de Scheie, enfermedad de Hunter, enfermedad de Sanfilippo, enfermedad de Morquio, enfermedad de Maroteaux-Lamy, enfermedad de Sly, una deficiencia de hialuronidasa, aspartilglucosaminuria, fucosidosis, manosidosis, enfermedad de Schindler, sialidosis tipo I, enfermedad de Pompe, enfermedad de Fabry, enfermedad de Farber, enfermedad de Gaucher tipo 1, enfermedad de Gaucher tipo 2, enfermedad de Gaucher tipo 3, una GM1-gangliosidosis, una GM2-gangliosidosis tal como enfermedad de Tay-Sachs o enfermedad de Sandhoff, una enfermedad activadora de GM2, enfermedad de Krabbe, una leucodistrofia metacromática, enfermedad de Niemann-Pick tipo A, enfermedad de Niemann-Pick tipo B, una picnodisostosis, una lipofuscinosis ceroide, una enfermedad de almacenaje de éster de colesterol, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, enfermedad de Wolman, una enfermedad de sulfatasa múltiple, una galactosialidosis, mucolipidosis tipo II, mucolipidosis tipo III, una cistinosis, mucolipidosis IV, un trastornos de almacenaje de ácido siálico, enfermedad de retención de quilomicrón con síndrome Marinesco-Sjögren, síndrome Hermansky-Pudlak, síndrome Chediak-Higashi y enfermedad de Danon, displasia geleofísica o síndrome Marinesco-Sjögren.
17.

Un método para elaborar la composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende las etapas de:

proporcionar una pared de células de levadura extraídas que define un espacio interno y que comprende 6 a 90 por ciento en peso de beta-glucano;

contactar la pared de célula de levadura extraída con una molécula de carga útil seleccionada del grupo que consiste de

(i)

un ácido nucleico que codifica una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de enzima lisosomal, o un equivalente funcional de un activador de enzima lisosomal, en donde el activador de enzima lisosomal es seleccionado del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, Activador de proteína GM2;

(ii)

una proteína seleccionada del grupo que consiste de una enzima lisosomal, un equivalente funcional de una enzima lisosomal, un activador de enzima lisosomal y un equivalente funcional de un activador de enzima lisosomal,

en donde el activador de enzima lisosomal es seleccionado del grupo que consiste de saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, Activador de proteína GM2; y

(iii) una mezcla de los mismos;

en una cantidad efectiva para complementar la función de una enzima lisosomal deficiente

y poner en contacto la pared de célula de levadura extraída con una molécula de captura de carga útil seleccionada del grupo que consiste de un polielectrolito catiónico, un polielectrolito aniónico, un polielectrolito anfotérico, un polisacárido, un polímero catiónico, un lípido catiónico, y una poliamina;

en donde la molécula de carga útil y la molécula de captura de carga útil son solubles en el mismo sistema solvente; y en donde la molécula de captura de carga útil estabiliza la asociación de la molécula de carga útil y la pared de célula de levadura extraída.
18.

El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la molécula de captura de carga útil se selecciona del grupo que consiste de quitosán, polietilenimina, poli-L-lisina, alginato, xantano, y mezclas de los mismos.
19.

El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la pared de células de levadura extraídas además comprende más de 30 por ciento en peso de manano.
20.

El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la pared de células de levadura extraídas comprende más de 50 por ciento en peso de quitina.
21.

El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el ácido nucleico es un constructo de ADN recombinante.
22.

El método de conformidad con la reivindicación 21 caracterizado porque el constructo de ADN recombinante es un vector de expresión que comprende un elemento de control, operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica la proteína.
23.

El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la proteína codificada por la estructura lectora abierta es una proteína estructural, una proteína que tiene actividad enzimática, una proteína de membrana, una proteína de enlace al ADN, una proteína de señalización o un equivalente funcional de la misma.
24.

Un método para complementar una deficiencia enzimática en una célula que comprende las etapas de: proporcionar una cantidad efectiva de una primera composición de conformidad con la reivindicación 6, en donde la molécula de carga útil de la primera composición es un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica la enzima deficiente o un equivalente funcional de la misma; y poner en contacto in vitro una célula que tiene tal deficiencia enzimática con la primera composición.
25.

El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la deficiencia enzimática es una deficiencia de enzima lisosomal.
26.

El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la enzima codificada por la estructura lectora abierta es glucocerebrosidasa humana o un equivalente funcional de la misma.
27.

El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque además comprende la etapa de fagocitosis de la primera composición por la célula.
28.

El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque además comprende las etapas de:

proporcionar una cantidad efectiva de una segunda composición de conformidad con la reivindicación 6, en donde la molécula de carga útil de la segunda composición es un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica un activador de la enzima deficiente o un equivalente funcional de la misma; y

poner en contacto in vitro la célula que tiene tal deficiencia enzimática con la segunda composición.
29.

El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque además comprende la etapa de fagocitosis de la segunda composición por la célula.
30.

El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la célula es un macrófago, una célula M de parche Peyer, un monocito, un neutrófilo, una célula dendrítica, una célula Langerhans, una célula Kupffer, un fagocito alveolar, un macrófago peritoneal, un macrófago de leche, una célula microglial, un eosinófilo, granulocitos, un fagocito mesengial o una célula sinovial A
31.

Uso de una composición de conformidad con la reivindicación 6 para la preparación de una primera composición farmacéutica para tratar un sujeto que tiene un trastorno de almacenaje lisosomal debido a la deficiencia de una proteína, en donde la molécula de carga útil es un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica la proteína deficiente o un equivalente funcional de la misma, y en donde la primera composición farmacéutica contacta una célula fagocítica.
32.

El uso de conformidad con la reivindicación 31, en donde el sujeto es un feto y la composición está siendo administrada al feto in útero administrando la composición a la madre, o colocando una cantidad efectiva de la composición en el fluido amniótico.
33.

El uso de conformidad con la reivindicación 31, además comprende el uso de una composición de conformidad con la reivindicación 6 para la preparación de una segunda composición farmacéutica, en donde la molécula de carga útil es un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica una proteína activadora o un equivalente funcional de la misma en el cual la segunda composición

5 farmacéutica contacta una célula fagocítica; en donde una cantidad efectiva de la primera composición y una cantidad efectiva de la segunda composición están siendo administradas a un sujeto que tiene un trastorno de almacenaje lisosomal.
34. Uso de una composición de conformidad con la reivindicación 1, para la preparación de una primera composición farmacéutica para tratar un sujeto que tiene una deficiencia de proteína lisosomal, en donde la molécula de 10 carga útil es un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica la proteína deficiente o un equivalente funcional de la misma, y el uso de una composición de conformidad con la reivindicación 1, para la preparación de una segunda composición farmacéutica, en donde la molécula de carga útil es una proteína activadora, un equivalente funcional de la misma o un vector de expresión que comprende un elemento de control operativamente ligado a una estructura lectora abierta que codifica una proteína

15 activadora o un equivalente funcional de la misma; en donde una cantidad efectiva de la primera composición y una cantidad efectiva de la segunda composición están siendo administrados a un sujeto que tiene un trastorno de almacenaje lisosomal.
35. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31, 33, o 34, en donde la primera composición farmacéutica está siendo administrada al sujeto oralmente, subcutáneamente, intramuscularmente o por inhalación.

20 36. El uso de conformidad con la reivindicación 34, en donde la primera composición farmacéutica es poner en contacto una célula fagocítica y la segunda composición farmacéutica pone en contacto una célula fagocítica.