ES2446520T3 - Producción de alcoholes de cuatro carbonos por fermentación - Google Patents

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Abstract

Una célula huésped microbiana recombinante que comprende moléculas de DNA heterólogas que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato a producto: a) acetil-CoA a acetoacetil-CoA, b) acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA, c) 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA, d) crotonil-CoA a butiril-CoA, e) butiril-CoA a butiraldehído, y f) butiraldehído a 1-butanol; en donde dicha célula huésped microbiana produce 1-butanol.

Description

Producción de alcoholes de cuatro carbonos por fermentación.
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de la microbiología industrial y la producción de alcoholes. Más específicamente, se produce 1-butanol por medio de la fermentación industrial de un microorganismo recombinante.
Antecedentes de la invención
El butanol es un importante producto químico industrial, útil como un aditivo para combustibles, como una materia prima química en la industria del plástico y como un disolvente de calidad alimentaria en la industria de los alimentos y los condimentos. Cada año se producen de 4,5 a 5,5 millones de toneladas de butanol por medios petroquímicos, y probablemente aumentará la necesidad de esta materia prima química.
Se conocen métodos para la síntesis química de 1-butanol, tales como el Proceso Oxo, el Proceso Reppe y la hidrogenación de crotonaldehído (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6ª edición, 2003, Wiley-VCH Verlag GmbH and Co., Weinheim, Alemania, volumen 5, páginas 716-719). En estos procedimientos se utilizan materiales de partida procedentes de productos petroquímicos, y los procedimientos son generalmente costosos y poco respetuosos con el medio ambiente. La producción de 1-butanol a partir de materias primas de origen vegetal minimizaría las emisiones de gases de efecto invernadero y representaría un progreso en la técnica.
También se conocen métodos para producir 1-butanol por biotransformación de otros productos químicos orgánicos. Por ejemplo, Muramoto et al. (Documento JP 63017695) describen un método para la producción de alcoholes, incluyendo butanol, a partir de aldehídos usando cepas de Pseudomonas. Además, Kuehnle et al. (Documento EP 1149918) describen un procedimiento para preparar 1-butanol y 2-butanol mediante la oxidación de hidrocarburos por diversas cepas de Rhodococcus ruber.
También se conocen métodos para producir butanol por fermentación, siendo el procedimiento más popular aquél con que se produce una mezcla de acetona, 1-butanol y etanol, procedimiento al que se hace referencia como proceso ABE (Blaschek et al., Patente de EE.UU. nº 6.358.717). La fermentación hasta acetona-butanol-etanol (ABE) por Clostridium acetobutylicum es una de las fermentaciones industriales conocidas más antiguas, y se han presentado las rutas y los genes responsables de la producción de estos disolventes [Girbal et al., Trends in Biotechnology 16: 11-16 (1998)]. Sin embargo, la fermentación real ha sido bastante complicada y difícil de controlar. La fermentación ABE ha decaído continuamente desde los años 1950, y casi todo el butanol es ahora producido por rutas petroquímicas, como se describió anteriormente. En una fermentación ABE típica, el C. acetobutylicum produce primero los ácidos butírico, propiónico, láctico y acético, el pH del cultivo disminuye, el cultivo experimenta un desplazamiento metabólico en "mariposa", y luego se forman 1-butanol, acetona, isopropanol y etanol. En fermentaciones ABE convencionales, el rendimiento de 1-butanol a partir de glucosa es pequeño, típicamente alrededor del 15 por ciento, y raras veces excede del 25 por ciento. En consecuencia, la concentración de 1-butanol en las fermentaciones ABE convencionales es normalmente inferior al 1,3 por ciento.
Los intentos para maximizar la producción de 1-butanol del proceso ABE mediante la eliminación de todos los demás subproductos disolventes no han resultado totalmente satisfactorios y, por consiguiente, el procedimiento permite producir cantidades significativas de acetona, que no es útil como aditivo para la gasolina. Un procedimiento para la producción de butanol por fermentación en que el 1-butanol fuera el único producto representaría un avance en la técnica.
Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento ambientalmente responsable y económicamente eficaz para la producción de 1-butanol como único producto. La presente invención se enfrenta a esta necesidad a través del descubrimiento de un huésped microbiano recombinante para producción que expresa una ruta biosintética del 1butanol.
Sumario de la invención
La invención proporciona un microorganismo recombinante que tiene una ruta biosintética del 1-butanol genéticamente diseñada. El microorganismo genéticamente diseñado puede ser utilizado para la producción comercial de 1-butanol. En consecuencia, la invención proporciona una célula huésped microbiana recombinante que comprende moléculas de DNA heterólogas que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato a producto:
a) acetil-CoA a acetoacetil-CoA,
b) acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA,
c) 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA,
d) crotonil-CoA a butiril-CoA, e) butiril-CoA a butiraldehído, y
f) butiraldehído a 1-butanol; en donde dicha célula huésped microbiana produce 1-butanol. En otra realización, la invención proporciona un método para la producción de 1-butanol, que comprende:
5 i) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende moléculas de DNA heterólogas que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato a producto: a) acetil-CoA a acetoacetil-CoA, b) acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA, c) 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA, 10 d) crotonil-CoA a butiril-CoA, e) butiril-CoA a butiraldehído, y
f) butiraldehído a 1-butanol; y ii) poner la célula huésped de (i) en contacto con un sustrato carbonado fermentable bajo unas condiciones mediante las cuales se produce 1-butanol.
15 Breve descripción de las figuras y las descripciones de secuencias
La invención puede ser entendida más a fondo a partir de la descripción detallada, la figura y las descripciones de secuencias adjuntas siguientes, que forman una parte de esta solicitud. En la Figura 1 se muestra la ruta biosintética del 1-butanol. Los pasos marcados como "a", "b", "c", "d", "e" y "f"
representan las conversiones de sustrato a producto descritas más adelante. 20 Las secuencias siguientes se ajustan a 37 C.F.R. 1.821-1.825 ("Requisitos para Solicitudes de Patente que Contienen Descripciones de Secuencias de Nucleótidos y/o Secuencias de Aminoácidos – las Reglas de Secuencias") y son coherentes con la Norma ST.25 (1998) de la Organización Mundial para la Propiedad Intelectual (WIPO; del inglés, World Intellectual Property Organization) y los requisitos de listas de secuencias de la EPO y el PCT [Reglas 5.2 y 49.5 (a-bis), y la Sección 208 y el Anexo C de las Instrucciones Administrativas]. Los símbolos y 25 el formato utilizados para los datos de secuencias de nucleótidos y aminoácidos cumplen con las reglas expuestas en 37 C.F.R. §1.822. Tabla 1
Sumario de números de ID. SEC. de genes y proteínas
Descripción
nº de ID. SEC. del ácido nucleico nº de ID. SEC. del péptido
Acetil-CoA acetiltransferasa thlA de Clostridium acetobutylicum ATCC 824
1 2
Acetil-CoA acetiltransferasa thlB de Clostridium acetobutylicum ATCC 824
3 4
Acetil-CoA acetiltransferasa de Escherichia coli
128 129
Acetil-CoA acetiltransferasa de Bacillus subtilis
130 131
Acetil-CoA acetiltransferasa de Saccharomyces cerevisiae
132 133
3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824
5 6
3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Bacillus subtilis
134 135
3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Ralstonia eutropha
136 137
3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Alcaligenes eutrophus
138 139
Crotonasa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824
7 8
Sumario de números de ID. SEC. de genes y proteínas
Descripción
nº de ID. SEC. del ácido nucleico nº de ID. SEC. del péptido
Crotonasa de Escherichia coli
140 141
Crotonasa de Bacillus subtilis
142 143
Crotonasa de Aeromonas caviae
144 145
Supuesta trans-enoil-CoA reductasa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824
9 10
Butiril-CoA deshidrogenasa de Euglena gracilis
146 147
Butiril-CoA deshidrogenasa de Streptomyces collinus
148 149
Butiril-CoA deshidrogenasa de Streptomyces coelocolor
150 151
Butiraldehído deshidrogenasa de Clostridium beijerinckii NRRL B594
11 12
Butiraldehído deshidrogenasa de Clostridium acetobutylicum
152 153
Butanol deshidrogenasa bdhB de Clostridium acetobutylicum ATCC 824
13 14
Butanol deshidrogenasa bdhA de Clostridium acetobutylicum ATCC 824
15 16
Butanol deshidrogenasa de Clostridium acetobutylicum
152 153
Butanol deshidrogenasa de Escherichia coli
154 155
Las ID. SEC. números 17-44 son las secuencias nucleotídicas de cebadores oligonucleotídicos usados para
multiplicar los genes de la ruta biosintética del 1-butanol. Las ID. SEC. números 45-72 son las secuencias nucleotídicas de cebadores oligonucleotídicos usados para secuenciación.
5 Las ID. SEC. números 73-75 son las secuencias nucleotídicas de cebadores oligonucleotídicos usados para
construir los vectores de transformación descritos en el Ejemplo 9. La ID. SEC. nº 76 es la secuencia de nucleótidos del gen CAC0462 optimizado en cuanto a codones, al que se hace referencia en esta memoria como CaTER.
La ID. SEC. nº 77 es la secuencia de nucleótidos del gen EgTER optimizado en cuanto a codones, al que se hace
10 referencia en esta memoria como EgTER (opt.). La ID. SEC. nº 78 es la secuencia de nucleótidos del gen ald optimizado en cuanto a codones, al que se hace referencia en esta memoria como ald (opt.).
La ID. SEC. nº 79 es la secuencia de nucleótidos del plásmido pFP988. Las ID. SEC. números 80-127, 160-185 y 190-207 son las secuencias de ácido nucleico de cebadores de clonación,
15 secuenciación, o exploración por PCR empleados para la clonación, secuenciación o exploración de los genes de la ruta biosintética del 1-butanol descrita en esta memoria, y se describen con mayor detalle en las Tablas 4 y 5. La ID. SEC. nº 156 es la secuencia de nucleótidos del grupo génico cscBKA. La ID. SEC. nº 157 es la secuencia de aminoácidos de la sacarosa hidrolasa (CscA). La ID. SEC. nº 158 es la secuencia de aminoácidos de la D-fructocinasa (CscK).
20 La ID. SEC. nº 159 es la secuencia de aminoácidos de la sacarosa permeasa (CscB).
La ID. SEC. nº 186 es la secuencia de nucleótidos del gen tery optimizado en cuanto a codones, descrito en el Ejemplo 17. La ID. SEC. nº 187 es la secuencia de aminoácidos de la butiril-CoA deshidrogenasa (ter) codificada por el gen tery
optimizado en cuanto a codones (ID. SEC. nº 186).
La ID. SEC. nº 188 es la secuencia de nucleótidos del gen aldy optimizado en cuanto a codones, descrito en el Ejemplo 17.
La ID. SEC. nº 189 es la secuencia de aminoácidos de la butiraldehído deshidrogenasa (ald) codificada por el gen aldy optimizado en cuanto a codones (ID. SEC. nº 188).
La ID. SEC. nº 208 es la secuencia de nucleótidos del DNA molde empleado en el Ejemplo 14.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a métodos para la producción de 1-butanol usando microorganismos recombinantes. La presente invención satisface diversas necesidades comerciales e industriales. El butanol es una importante materia prima química industrial con una diversidad de aplicaciones, siendo particularmente significativo su potencial como combustible o aditivo para combustibles. Aunque es un alcohol de sólo cuatro carbonos, el butanol tiene un contenido energético similar al de la gasolina y puede ser combinado con cualquier combustible fósil. El butanol es preferido como combustible o aditivo para combustibles ya que sólo produce CO2 y poco o nada de SOx y NOx cuando se quema en el motor estándar de combustión interna. Además, el butanol es menos corrosivo que el etanol, el aditivo para combustibles más preferido hasta la fecha.
Además de su utilidad como biocombustible o aditivo para combustibles, el butanol tiene el potencial de incidir en los problemas de distribución de hidrógeno en la industria emergente de las pilas de combustible. Hoy día, las pilas de combustible están plagadas de cuestiones de seguridad asociadas con el transporte y la distribución de hidrógeno. El butanol puede ser fácilmente reformado en cuanto a su contenido de hidrógeno y puede ser distribuido a través de las gasolineras existentes en la pureza requerida para las pilas de combustible o los vehículos.
Finalmente, la presente invención permite producir butanol a partir de fuentes carbonadas de origen vegetal, evitando el negativo impacto ambiental asociado con los procesos petroquímicos estándares para la producción de butanol.
Se van a utilizar las definiciones y abreviaturas siguientes para la interpretación de las reivindicaciones y la memoria descriptiva.
La expresión "invención" o "presente invención", como se emplea en esta memoria, es una expresión no restrictiva y con ella no se pretende hacer referencia a ninguna realización individual de la invención particular, sino que abarca todas las posibles realizaciones como las descritas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones.
"ABE" es la abreviatura del proceso de fermentación hasta Acetona-Butanol-Etanol.
La expresión "rutas biosintéticas del 1-butanol" significa la ruta enzimática para producir 1-butanol a partir de acetilcoenzima A (acetil-coA).
La expresión "acetil-CoA acetiltransferasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA y coenzima A (CoA). Las acetil-CoA acetiltransferasas preferidas son acetil-CoA acetiltransferasas con preferencias de sustrato (reacción en dirección hacia adelante) por un acil-CoA de cadena corta y acetil-CoA y son clasificadas como E.C. 2.3.1.9 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego); aunque también serán funcionales las enzimas con una variedad de sustratos más amplia (E.C. 2.3.1.16). Las acetil-CoA acetiltransferasas son asequibles de diversas fuentes, tales como, por ejemplo, Escherichia coli [números de GenBank: NP_416728 (ID. SEC. nº 129), NC_000913 (ID. SEC. nº 128); secuencia de aminoácidos del NCBI (National Center for Biotechnology Information), secuencia de nucleótidos del NCBI], Clostridium acetobutylicum [números de GenBank: NP_349476.1 (ID. SEC. nº 2), NC_003030 (ID. SEC. nº 1); NP_149242 (ID. SEC. nº 4), NC_001988 (ID. SEC. nº 3)], Bacillus subtilis [números de GenBank: NP_390297 (ID. SEC. nº 131), NC_000964 (ID. SEC. nº 130)] y Saccharomyces cerevisiae [números de GenBank: NP_015297 (ID. SEC. nº 133), NC_001148 (ID. SEC. nº 132)].
La expresión "3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA. Las 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasas pueden ser dependientes de nicotinamida adenina dinucleótido reducido (NADH), con una preferencia de sustrato por (S)-3-hidroxibutiril-CoA o (R)-3hidroxibutiril-CoA y son clasificadas como E.C. 1.1.1.35 y E.C. 1.1.1.30, respectivamente. Además, las 3hidroxibutiril-CoA deshidrogenasas pueden ser dependientes de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido (NADPH), con una preferencia de sustrato por (S)-3-hidroxibutiril-CoA o (R)-3-hidroxibutiril-CoA y son clasificadas como E.C. 1.1.1.157 y E.C. 1.1.1.36, respectivamente. Las 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasas son asequibles de diversas fuentes, tales como, por ejemplo, C. acetobutylicum [números de GenBank: NP_349314 (ID. SEC. nº 6), NC_003030 (ID. SEC. nº 5)], B. subtilis [números de GenBank: AAB09614 (ID. SEC. nº 135), U29084 (ID. SEC. nº 134)], Ralstonia eutropha [números de GenBank: YP_294481 (ID. SEC. nº 137), NC_007347 (ID. SEC. nº 136)] y Alcaligenes eutrophus [números de GenBank: AAA21973 (ID. SEC. nº 139), J04987 (ID. SEC. nº 138)].
El término "crotonasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de 3-hidroxibutiril-CoA en crotonil-CoA y H2O. Las crotonasas pueden tener una preferencia de sustrato por (S)-3-hidroxibutiril-CoA o (R)-3-hidroxibutiril-CoA y son clasificadas como E.C. 4.2.1.17 y E.C. 4.2.1.55, respectivamente. Las crotonasas son asequibles de diversas fuentes, tales como, por ejemplo, E. coli [números de GenBank: NP_415911 (ID. SEC. nº 141), NC_000913 (ID. SEC. nº 140)], C. acetobutylicum [números de GenBank: NP_349318 (ID. SEC. nº 8), NC_003030 (ID. SEC. nº 7)],
B. subtilis [números de GenBank: CAB13705 (ID. SEC. nº 143), Z99113 (ID. SEC. nº 142)] y Aeromonas caviae [números de GenBank: BAA21816 (ID. SEC. nº 145), D88825 (ID. SEC. nº 144)].
La expresión "butiril-CoA deshidrogenasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de crotonil-CoA en butiril-CoA. Las butiril-CoA deshidrogenasas pueden ser dependientes de NADH o dependientes de NADPH y son clasificadas como E.C. 1.3.1.44 y E.C. 1.3.1.38, respectivamente. Las butiril-CoA deshidrogenasas son asequibles de diversas fuentes, tales como, por ejemplo, C. acetobutylicum [números de GenBank: NP_347102 (ID. SEC. nº 10), NC_003030 (ID. SEC. nº 9)], Euglena gracilis [números de GenBank: Q5EU90 (ID. SEC. nº 147), AY741582 (ID. SEC. nº 146)], Streptomyces collinus [números de GenBank: AAA92890 (ID. SEC. nº 149), U37135 (ID. SEC. nº 148)] y Streptomyces coelicolor [números de GenBank: CAA22721 (ID. SEC. nº 151), AL939127 (ID. SEC. nº 150)].
La expresión "butiraldehído deshidrogenasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de butiril-CoA en butiraldehído, usando NADH o NADPH como cofactor. Las butiraldehído deshidrogenasas con una preferencia por NADH son conocidas como E.C. 1.2.1.57 y son asequibles de, por ejemplo, Clostridium beijerinckii [números de GenBank: AAD31841 (ID. SEC. nº 12), AF157306 (ID. SEC. nº 11)] y C. acetobutylicum [números de GenBank: NP_149325 (ID. SEC. nº 153), NC_001988 (ID. SEC. nº 152)].
La expresión "butanol deshidrogenasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de butiraldehído en 1butanol, usando NADH o NADPH como cofactor. Las butanol deshidrogenasas son asequibles de, por ejemplo, C. acetobutylicum [números de GenBank: NP_149325 (ID. SEC. nº 153), NC_001988 (ID. SEC. nº 152; nota: esta enzima posee actividad tanto aldehído como alcohol deshidrogenasa); NP_349891 (ID. SEC. nº 14), NC_003030 (ID. SEC. nº 13); y NP_349892 (ID. SEC. nº 16), NC_003030 (ID. SEC. nº 15)] y E. coli [números de GenBank: NP_417484 (ID. SEC. nº 155), NC_000913 (ID. SEC. nº 154)].
La expresión "un anaerobio facultativo" se refiere a un microorganismo que puede crecer en ambientes tanto aeróbicos como anaeróbicos.
La expresión "sustrato carbonado" o "sustrato carbonado fermentable" se refiere a una fuente carbonada capaz de ser metabolizada por organismos huésped de la presente invención y, particularmente, a fuentes carbonadas seleccionadas del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, y sustratos de un carbono o mezclas de los mismos.
El término "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que es capaz de expresarse como una proteína específica, incluyendo opcionalmente secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificadoras 5') y siguen (secuencias no codificadoras 3') a la secuencia de codificación. "Gen nativo" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificadoras que no se hallan juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que procedan de fuentes diferentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras procedentes de la misma fuente pero dispuestas de un modo diferente al hallado en la naturaleza. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su posición natural en el genoma de un organismo. Un gen "extraño" o "heterólogo" se refiere a un gen no hallado normalmente en el organismo huésped pero que se introduce en el organismo huésped por transferencia génica. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo,
o genes quiméricos. Un "transgén" es un gen que ha sido introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación.
Como se utiliza en esta memoria, la expresión "secuencia de codificación" se refiere a una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos específica. "Secuencias reguladoras adecuadas" se refiere a secuencias de nucleótidos situadas corriente arriba (secuencias no codificadoras 5'), dentro de, o corriente abajo (secuencias no codificadoras 3') de una secuencia de codificación y que influyen en el procesamiento o la estabilidad del RNA, la transcripción, o la traducción de la secuencia codificadora asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitio de procesamiento de RNA, sitio de unión de agentes efectores, y estructura de tallo-bucle.
El término "promotor" se refiere a una secuencia de DNA capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o un RNA funcional. En general, una secuencia de codificación está situada en 3' con respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden proceder de un gen nativo en su totalidad o pueden estar compuestos de diferentes elementos procedentes de diferentes promotores hallados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de DNA sintéticos. Los expertos en la técnica entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares, o en diferentes fases del desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales o fisiológicas. A los promotores que causan que un gen se exprese la mayoría de las veces en la mayoría de los tipos celulares se hace comúnmente referencia como "promotores constitutivos". Se reconoce además que, puesto que no se han definido completamente los límites exactos de las secuencias reguladoras en la mayoría de los casos, fragmentos de DNA de diferentes longitudes pueden tener una actividad promotora idéntica.
La expresión "operativamente ligado" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico de modo que la función de una resulte afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor está operativamente ligado a una secuencia de codificación cuando es capaz de afectar a la expresión de esa secuencia de codificación (es decir, que la secuencia de codificación está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias de codificación pueden estar operativamente ligadas a secuencias reguladoras en orientación sentido o antisentido.
El término "expresión", como se emplea en esta memoria, se refiere a la transcripción y la acumulación estable de RNA sentido (mRNA) o antisentido procedente del fragmento de ácido nucleico de la invención. "Expresión" se puede también referir a la traducción de mRNA en un polipéptido.
Como se emplea en esta memoria, el término "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico a un organismo huésped, para dar lugar a una herencia genéticamente estable. A los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se hace referencia como organismos "transgénicos" o "recombinantes" o "transformados".
Los términos "plásmido", "vector" y "casete" se refieren a un elemento extracromosómico que porta a menudo genes que no son parte del metabolismo central de la célula, y que está normalmente en forma de fragmentos de DNA circular de doble cadena. Tales elementos pueden ser secuencias que se replican autónomamente, secuencias que se integran en el genoma, secuencias de nucleótidos o fagos, lineales o circulares, de un DNA o RNA de cadena sencilla o doble, procedentes de cualquier fuente, en que diversas secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una construcción única que es capaz de introducir en una célula un fragmento promotor y una secuencia de DNA para un producto génico seleccionado junto con una apropiada secuencia 3' no traducida. "Casete de transformación" se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos, además del gen extraño, que facilitan la transformación de una célula huésped particular. "Casete de expresión" se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos, además del gen extraño, que permiten una expresión potenciada de ese gen en un huésped extraño.
Como se emplea en esta memoria, la expresión "degeneración de codones" se refiere a la naturaleza del código genético que permite una variación de la secuencia de nucleótidos sin que resulte afectada la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El técnico experto está al corriente de la "preferencia de codones" mostrada por una célula huésped específica en la utilización de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por lo tanto, cuando se sintetiza un gen para expresión mejorada en una célula huésped, es deseable diseñar el gen de modo que su frecuencia de utilización de codones se aproxime a la frecuencia de utilización preferida de codones de la célula huésped.
La expresión "optimizado en cuanto a codones", cuando se refiere a genes o regiones de codificación de moléculas de ácido nucleico para la transformación de diversos huéspedes, se refiere a la alteración de codones en el gen o las regiones de codificación de las moléculas de ácido nucleico para reflejar la utilización típica de codones del organismo huésped sin que se altere el polipéptido codificado por el DNA.
Las técnicas estándares de DNA recombinante y clonación molecular utilizadas en esta memoria son bien conocidas en este campo técnico y son descritas por J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) (en adelante "Maniatis"); y por T. J. Silhavy, M. L. Bennan y L. W. Enquist, "Experiments with Gene Fusions", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1984); y por F. M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", publicado por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987).
La ruta biosintética del 1-butanol
Los microorganismos que utilizan carbohidratos emplean la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), la ruta de Entner-Doudoroff y el ciclo de las pentosas fosfato como rutas metabólicas centrales para proporcionar energía y precursores celulares para el crecimiento y el mantenimiento. Estas rutas tienen en común el producto intermedio gliceraldehído-3-fosfato y, finalmente, se forma piruvato directamente o en combinación con la ruta EMP. Posteriormente, el piruvato se transforma en acetil-coenzima A (acetil-CoA) a través de una diversidad de medios, incluyendo la reacción con el complejo de piruvato deshidrogenasa, la piruvato-formiato liasa y la piruvatoferredoxina oxidorreductasa. El acetil-CoA actúa como un producto intermedio esencial en, por ejemplo, la generación de ácidos grasos, aminoácidos y metabolitos secundarios. Las reacciones combinadas de conversión de azúcares en acetil-CoA producen energía (por ejemplo, adenosina-5'-trifosfato, ATP) y equivalentes de reducción (por ejemplo, nicotinamida adenina dinucleótido reducido, NADH, y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido, NADPH). El NADH y el NADPH deben ser reciclados hasta sus formas oxidadas (NAD+ y NADP+,
–
respectivamente). En presencia de aceptores inorgánicos de electrones (por ejemplo, O2, NO3 y SO42–), los equivalentes de reducción pueden ser utilizados para aumentar la reserva energética; alternativamente, se puede formar un subproducto carbonado reducido. La producción de etanol y 1-butanol que resultan de la fermentación de carbohidratos es un ejemplo de lo último.
Esta invención posibilita la producción de 1-butanol a partir de fuentes de carbohidratos con microorganismos recombinantes al proporcionar una ruta biosintética de 1-butanol completa desde acetil-CoA hasta 1-butanol, como se muestra en la Figura 1. Esta ruta biosintética, que no se encuentra generalmente en la comunidad microbiana debido a la ausencia de genes o a la falta de una apropiada regulación génica, comprende las siguientes
5 conversiones de sustrato a producto:
a) acetil-CoA a acetoacetil-CoA, según es catalizada, por ejemplo, por la acetil-CoA acetiltransferasa;
b) acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA, según es catalizada, por ejemplo, por la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa;
c) 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA, según es catalizada, por ejemplo, por la crotonasa;
10 d) crotonil-CoA a butiril-CoA, según es catalizada, por ejemplo, por la butiril-CoA deshidrogenasa;
e) butiril-CoA a butiraldehído, según es catalizada, por ejemplo, por la butiraldehído deshidrogenasa; y
f) butiraldehído a 1-butanol; según es catalizada, por ejemplo, por la butanol deshidrogenasa.
La ruta no requiere ATP y genera NAD+ y/o NADP+, equilibrándose de este modo con las rutas metabólicas centrales que generan acetil-CoA. La capacidad de los organismos naturales para producir 1-butanol por 15 fermentación es rara y es ejemplificada lo más acusadamente por Clostridium beijerinckii y Clostridium acetobutylicum. Se han descrito la organización génica y la regulación génica para Clostridium acetobutylicum [L. Girbal y P. Soucaille, Trends in Biotechnology 216: 11-16 (1998)]. Sin embargo, muchas de estas actividades enzimáticas están también asociadas con rutas alternas, tales como, por ejemplo, la utilización de hidrocarburos, la oxidación de ácidos grasos y el metabolismo de polihidroxialcanoatos. De este modo, al proporcionar una ruta
20 recombinante desde acetil-CoA hasta 1-butanol, existen diversas opciones para satisfacer los pasos de reacción individuales, y la persona con experiencia en la técnica será capaz de utilizar secuencias públicamente disponibles para construir las pertinentes rutas. A continuación, en la Tabla 2, se expone una lista de un número representativo de genes conocidos en la técnica y útiles en la construcción de la ruta biosintética del 1-butanol.
Tabla 2
Fuentes de genes de la ruta del 1-butanol
Gen
Cita de GenBank
acetil-CoA acetiltransferasa
NC_000913 Escherichia coli K12, genoma completo gi|49175990|ref|NC_000913.2|[49175990]
NC_001988 Clostridium acetobutylicum ATCC 824, plásmido pSOL1, secuencia completa gi|15004705|ref|NC_001988.2|[15004705]
NC_000964 Bacillus subtilis subsp. subtilis cepa 168, genoma completo gi|50812173|ref|NC_000964.2|[50812173]
NC_001148 Saccharomyces cerevisiae, cromosoma XVI, secuencia cromosómica completa gi|50593503|ref|NC_001148.3|[50593503]
CP000017 Streptococcus pyogenes MGAS5005, genoma completo gi|71852596|gb|CP000017.1|[71852596]
NC_005773 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A, genoma completo gi|71733195|ref|NC_005773.3|[71733195]
CR931997 Corynebacterium jeikeium K411, genoma completo gi|68262661|emb|CR931997.1|[68262661]
3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa
NC_003030 Clostridium acetobutylicum ATCC 824, genoma completo gi|15893298|ref|NC_003030.1|[15893298]
U29084 Bacillus subtilis, genes (mmgA), (mmgB), (mmgC) y citrato sintasa III (mmgD), cds completa, y gen (mmgE), cds parcial gi|881603|gb|U29084.1|BSU29084[881603]
Fuentes de genes de la ruta del 1-butanol
Gen
Cita de GenBank
NC_007347 Ralstonia eutropha JMP134 Raeut01_1, secuencia aleatoria ("shotgun") del genoma completo gi|45517296|ref|NZ_AADY01000001.1|[45517296]
J04987 A. eutrophus, genes de beta-cetotiolasa (phbA) y acetoacetil-CoA reductasa (phbB), cds completa gi|141953|gb|J04987.1|AFAKTLAACA[141953]
NC_004129 Pseudomonas fluorescens Pf-5, genoma completo gi|70728250|ref|NC_004129.6|[70728250]
NC_000913 Escherichia coli K12, genoma completo gi|49175990|ref|NC_000913.2|[49175990]
NC_004557 Clostridium tetani E88, genoma completo gi|28209834|ref|NC_004557.1|[28209834]
NC_006350 Burkholderia pseudomallei K96243, cromosoma 1, secuencia completa gi|53717639|ref|NC_006350.1|[53717639]
NC_002947 Pseudomonas putida KT2440, genoma completo gi|26986745|ref|NC_002947.3|[26986745]
crotonasa
NC_000913 Escherichia coli K12, genoma completo gi|49175990|ref|NC-000913.2|[49175990]
NC_003030 Clostridium acetobutylicum ATCC 824, genoma completo gi|15893298|ref|NC_003030.1|[15893298]
Z99113 Bacillus subtilis, genoma completo (sección 10 de 21): de 1807106 a 2014934 gi|32468758|emb|Z99113.2|BSUB0010[32468758]
D88825 Aeromonas caviae, gen phaC para PHA sintasa, cds completa gi|2335048|dbj|D88825.1|[2335048]
NC_006274 Bacillus cereus ZK, genoma completo gi|52140164|ref|NC_006274.1|[52140164]
NC_004557 Clostridium tetani E88, genoma completo |28209834|ref|NC_004557.1|[28209834]
butiril-CoA deshidrogenasa
NC_003030 Clostridium acetobutylicum ATCC 824, genoma completo gi|15893298|ref|NC_003030.1|[15893298]
AY741582 Euglena gracilis, mRNA de trans-2-enoil-CoA reductasa, cds completa gi|58201539|gb|AY741582.1|[58201539]
reductasa
U37135 Streptomyces collinus, gen de crotonil-CoA reductasa (ccr), cds completa gi|1046370|gb|U37135.1|SCU37135[1046370]
AL939127 Streptomyces coelicolor A3(2), genoma completo; segmento 24/29 gi|24429552|emb|AL939127.1|SCO939127[244295 52]
AP006716 Staphylococcus haemolyticus JCSC1435, genoma completo gi|68445725|dbj|AP006716.1|[68445725]
NC_006274 Bacillus cereus ZK, genoma completo
Fuentes de genes de la ruta del 1-butanol
Gen
Cita de GenBank
gi|52140164|ref|NC_006274.1|[52140164]
NC_004557
NC_004557 Clostridium tetani E88, genoma completo gi|28209834|ref|NC_004557.1|[28209834]
butiraldehído deshidrogenasa
AF157306 Clostridium beijerinckii cepa NRRL B593, proteína hipotética, aldehído deshidrogenasa (ald) acilante de coenzima A, acetoacetato: butirato/acetato coenzima A
genes de transferasa (ctfA), acetoacetato:butirato/acetato coenzima A transferasa (ctfB), y acetoacetato descarboxilasa (adc), cds completa gi|47422980|gb|AF157306.2|[47422980]
NC_001988 Clostridium acetobutylicum ATCC 824, plásmido pSOL1, secuencia completa gi|15004705|ref|NC_001988.2|[15004705]
AY251646 Clostridium saccharoperbutylacetonicum, operón sol, secuencia completa gi|31075382|gb|AY251646.1|[31075382]
butanol deshidrogenasa
NC_001988 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 plásmido pSOL1, secuencia completa gi|15004705|ref|NC_001988.2|[15004705]
NC_003030 Clostridium acetobutylicum ATCC 824, genoma completo gi|15893298|ref|NC_003030.1|[15893298]
NC_000913 Escherichia coli K12, genoma completo gi|49175990|ref|NC_000913.2|[49175990]
NC_003198 Salmonella enterica subsp. enterica serovar. Typhi cepa CT18, genoma completo gi|16758993|ref|NC_003198.1|[16758993]
BX571966 Burkholderia pseudomallei cepa K96243, cromosoma 2, secuencia completa gi|52211453|emb|BX571966.11[52211453
Z99120 Bacillus subtilis, genoma completo (sección 17 de 21): de 3213330 a 3414388 gi|32468813|emb|Z99120.2|BSUB0017[32468813
NC_003366 Clostridium perfringens cepa 13, genoma completo gi|18308982|ref|NC_003366.1|[18308982
NC_004431 Escherichia coli CFT073, genoma completo gi[26245917|ref|NC_004431.1|[26245917
Huéspedes microbianos para la producción de 1-butanol
Los huéspedes microbianos para la producción de 1-butanol pueden ser seleccionados de entre bacterias, cianobacterias, hongos filamentosos y levaduras. El huésped microbiano utilizado para la producción de 1-butanol es preferiblemente tolerante al 1-butanol para que el rendimiento no se vea limitado por la toxicidad del butanol. Los 5 microbios que son metabólicamente activos en niveles de alto título de 1-butanol no son bien conocidos en la técnica. Aunque se han aislado mutantes tolerantes al butanol de clostridios disolventogénicos, se dispone de poca información en cuanto a la tolerancia de otras cepas bacterianas potencialmente útiles al butanol. La mayoría de los estudios sobre la comparación de la tolerancia a alcoholes en bacterias sugieren que el butanol es más tóxico que el etanol [de Cavalho et al., Microsc. Res. Tech. 64: 215-22 (2004), y Kabelitz et al., FEMS Microbiol. Lett. 220: 223
10 227 (2003)]. Tomas et al. [J. Bacteriol. 186: 2006-2018 (2004)] comunicaron que la producción de butanol durante la fermentación en Clostridium acetobutylicum puede verse limitada por la toxicidad del butanol. El efecto primario del butanol sobre Clostridium acetobutylicum es la alteración de las funciones de membrana [Hermann et al., Appl. Environ. Microbiol. 50: 1238-1243 (1985)].
Los huéspedes microbianos seleccionados para la producción de 1-butanol son preferiblemente tolerantes al 115 butanol y son capaces de convertir carbohidratos en 1-butanol. Los criterios para la selección de huéspedes microbianos adecuados incluyen los siguientes: tolerancia intrínseca al 1-butanol, elevado índice de utilización de glucosa, disponibilidad de herramientas genéticas para manipulación génica, y capacidad para generar alteraciones cromosómicas estables.
Se pueden identificar cepas huésped adecuadas con tolerancia al 1-butanol mediante una exploración basada en la tolerancia intrínseca de la cepa. La tolerancia intrínseca de los microbios al 1-butanol puede ser medida determinando la concentración de 1-butanol que es responsable de una inhibición del índice de crecimiento del 50% (IC50) cuando se cultivan en un medio mínimo. Los valores de IC50 pueden ser determinados usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden cultivar los microbios de interés en presencia de cantidades variables de 1-butanol y se puede controlar el índice de crecimiento midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros. El tiempo de duplicación puede ser calculado a partir de la parte logarítmica de la curva de crecimiento y ser utilizado como una medida del índice de crecimiento. La concentración de 1-butanol que produce una inhibición del crecimiento de 50% puede ser determinada a partir de un gráfico del porcentaje de inhibición del crecimiento frente a la concentración de 1-butanol. Preferiblemente, la cepa huésped debería tener una IC50 para 1-butanol de más de aproximadamente 0,5% en peso/volumen.
El huésped microbiano para la producción de 1-butanol también debería utilizar glucosa a una velocidad elevada. La mayoría de los microbios son capaces de utilizar carbohidratos. Sin embargo, ciertos microbios ambientales no pueden utilizar carbohidratos con elevada eficacia y, por lo tanto, no serían huéspedes adecuados.
La capacidad para modificar genéticamente el huésped es esencial para la producción de cualquier microorganismo recombinante. El modo de la tecnología para transferencia génica puede ser por electroporación, conjugación, transducción o transformación natural. Se dispone de una gran variedad de plásmidos para conjugación del huésped y de marcadores resistentes a fármacos. Los vectores de clonación se ajustan a los organismos huésped basándose en la naturaleza de marcadores de resistencia a antibióticos que pueden actuar en ese huésped.
El huésped microbiano ha de ser además manipulado con objeto de inactivar rutas competitivas para el flujo de carbono suprimiendo diversos genes. Esto requiere la disponibilidad o bien de transposones para dirigir la inactivación o bien de vectores de integración cromosómica. Además, el huésped de producción debería ser sensible a la mutagénesis química para que se pudieran obtener mutaciones para mejorar la tolerancia intrínseca al 1-butanol.
Basándose en los criterios anteriormente descritos, los huéspedes microbianos adecuados para la producción de 1butanol incluyen, pero no se limitan a, miembros de los géneros Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces. Los huéspedes preferidos incluyen: Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Bacillus licheniformis, Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis y Saccharomyces cerevisiae.
Construcción del huésped de producción
Se pueden construir organismos recombinantes que contengan los genes necesarios que codifiquen la ruta enzimática para la conversión de un sustrato carbonado fermentable en 1-butanol, usando técnicas bien conocidas en este campo técnico. En la presente invención, los genes que codifican las enzimas de la ruta biosintética del 1butanol, es decir, acetil-CoA acetiltransferasa, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, crotonasa, butiril-CoA deshidrogenasa, butiraldehído deshidrogenasa y butanol deshidrogenasa, pueden ser aislados de diversas fuentes, como se describió anteriormente.
Los métodos para obtener genes deseados de un genoma bacteriano son comunes y bien conocidos en la técnica de la biología molecular. Por ejemplo, si se conoce la secuencia del gen, se pueden crear bancos genómicos adecuados por digestión con endonucleasas de restricción y se pueden explorar con sondas complementarias a la secuencia génica deseada. Una vez que se ha aislado la secuencia, el DNA puede ser multiplicado usando métodos estándares de multiplicación dirigida con cebadores, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (Mullis, Patente de EE.UU. nº 4.683.202), para obtener cantidades de DNA adecuadas para transformación usando vectores apropiados. Las herramientas para la optimización de codones para expresión en un huésped heterólogo son fácilmente asequibles. Algunas herramientas para la optimización de codones son asequibles basándose en el contenido de GC del organismo huésped. En la Tabla 3 se da el contenido de GC de algunos huéspedes microbianos ejemplares.
Tabla 3
Contenido de GC de huéspedes microbianos
Cepa
% de GC
B. licheniformis
46
B. subtilis
42
C. acetobutylicum
37
E. coli
50
P. putida
61
A. eutrophus
61
Paenibacillus macerans
51
Rhodococcus erythropolis
62
Brevibacillus
50
Paenibacillus polymyxa
50
Una vez que se han identificado y aislado los genes relevantes de la ruta, se pueden transformar con ellos adecuados huéspedes de expresión por medios bien conocidos en la técnica. Los vectores o casetes útiles para la transformación de una diversidad de células huésped son comunes y son comercialmente asequibles de compañías 5 tales como EPICENTRE® (Madison, Wisconsin, EE.UU.), Invitrogen Corp. (Carlsbad, California, EE.UU.), Stratagene (La Jolla, California, EE.UU.) y New England Biolabs, Inc. (Beverly, Massachusetts, EE.UU.). Típicamente, el vector
o el casete contienen secuencias que dirigen la transcripción y traducción del gen relevante, un marcador seleccionable, y secuencias que permiten la replicación autónoma o la integración cromosómica. Los vectores adecuados comprenden una región 5' del gen que contiene controles de iniciación de la transcripción, y una región 3'
10 del fragmento de DNA que controla la terminación de la transcripción. Ambas regiones de control pueden proceder de genes homólogos con respecto a la célula huésped transformada, aunque se ha de entender que dichas regiones de control pueden también proceder de genes que no son nativos con respecto a la especie específica escogida como huésped de producción.
Los promotores o regiones de control de la iniciación, que son útiles para conducir la expresión de las regiones de
15 codificación relevantes de la ruta en la célula huésped deseada, son numerosos y resultan familiares a los expertos en la técnica. Casi cualquier promotor capaz de conducir estos elementos genéticos es adecuado para la presente invención, incluyendo, pero sin limitarse a, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, CUP1, FBA, GPD y GPM (útiles para expresión en Saccharomyces); AOX1 (útil para expresión en Pichia); lac, ara, tet, trp, IPL, IPR, T7, tac y trc (útiles para expresión en Escherichia coli, Alcaligenes y
20 Pseudomonas); los promotores amy, apr y npr y diversos promotores de fago útiles para expresión en Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis y Paenibacillus macerans; nisA (útil para expresión en bacterias Gram positivas [Eichenbaum et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (8): 2763-2769 (1998)]; y el promotor sintético P11 [útil para expresión en Lactobacillus plantarum; Rud et al., Microbiology 152: 1011-1019 (2006)].
Las regiones de control de la terminación pueden también proceder de diversos genes nativos con respecto a los
25 huéspedes preferidos. Opcionalmente, puede ser innecesario un sitio de terminación; sin embargo, lo más preferido es incluirlo.
Ciertos vectores son capaces de replicarse en una gran variedad de bacterias huésped y pueden ser transferidos por conjugación. Se dispone de la secuencia completa y anotada de pRK404 y tres vectores relacionados, pRK437, pRK442 y pRK442(H). Se ha demostrado que estos derivados son herramientas valiosas para la manipulación
30 genética en bacterias Gram negativas [Scott et al., Plasmid 50 (1): 74-79 (2003)]. Diversos derivados plasmídicos del plásmido Inc P4 RSF1010, que presenta amplia variedad de huéspedes, están también disponibles con promotores que pueden actuar en una diversidad de bacterias Gram negativas. Los plásmidos pAYC36 y pAYC37 tienen promotores activos junto con múltiples sitios de clonación que permiten la expresión de genes heterólogos en bacterias Gram negativas.
35 También se dispone en gran medida de herramientas para sustitución de genes cromosómicos. Por ejemplo, una variante termosensible del replicón pWV101 de amplia variedad de huéspedes ha sido modificada para construir un plásmido, pVE6002, que puede ser empleado para crear sustitución génica en una variedad de bacterias Gram positivas [Maguin et al., J. Bacteriol. 174 (17): 5633-5638 (1992)]. Además, se dispone de transposomas in vitro para crear mutaciones aleatorias en una diversidad de genomas de fuentes comerciales tales como EPICENTRE®.
A continuación se describe con mayor detalle la expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en varios huéspedes microbianos preferidos.
Expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en E. coli
Los vectores o casetes útiles para la transformación de E. coli son comunes y son comercialmente asequibles de las compañías anteriormente enumeradas. Por ejemplo, los genes de la ruta biosintética del 1-butanol pueden ser aislados de diversas cepas de Clostridium, clonados en un vector pUC19 modificado y usados para transformar E. coli NM522, como se describe en el Ejemplo 11. En el Ejemplo 13 se describe la expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en varias cepas distintas de E. coli.
Expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en Rhodococcus erythropolis
Se dispone de una serie de vectores lanzadera de E. coli-Rhodococcus para expresión en R. erythropolis, incluyendo, pero sin limitarse a, pRhBR17 y pDA71 [Kostichka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 62: 61-68 (2003)]. Además, se dispone de una serie de promotores para expresión de genes heterólogos en R. erythropolis [véanse, por ejemplo, Nakashima et al., Appl. Envir. Microbiol. 70: 5557-5568 (2004), y Tao et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, DOI 10.1007/s00253-005-0064]. Se puede crear una alteración génica dirigida de genes cromosómicos en R. erythropolis usando el método descrito por Tao et al., supra, y Brans et al. [Appl. Envir. Microbiol. 66: 2029-2036 (2000)].
Los genes heterólogos requeridos para la producción de 1-butanol, como se describió anteriormente, pueden ser clonados inicialmente en pDA71 o pRhBR71 y ser usados para transformar E. coli. Luego se puede transformar R. erythropolis con los vectores mediante electroporación, del modo descrito por Kostichka et al., supra. Se pueden cultivar los recombinantes en medio sintético que contiene glucosa y se puede seguir la producción de 1-butanol usando métodos conocidos en la técnica.
Expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en Bacillus subtilis
Los métodos para la expresión génica y la creación de mutaciones en B. subtilis también son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los genes de la ruta biosintética del 1-butanol pueden ser aislados de diversas cepas de Clostridium, clonados en un vector pUC19 modificado y usados para transformar Bacillus subtilis BE1010, como se describe en el Ejemplo 12. Además, los seis genes de la ruta 1-biosintética pueden ser divididos en dos operones para expresión, como se describe en el Ejemplo 14. Los tres primeros genes de la ruta (thl, hbd y crt) se integraron en el cromosoma de Bacillus subtilis BE1010 [Payne y Jackson, J. Bacteriol. 173: 2278-2282 (1991)]. Los tres últimos genes (EgTER, ald y bdhB) fueron clonados en plásmidos de expresión y usados para transformar la cepa de Bacillus que porta los genes de 1-butanol integrados.
Expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en Bacillus licheniformis
La mayoría de los plásmidos y vectores lanzadera que se replican en B. subtilis pueden ser utilizados para transformar B. licheniformis mediante transformación con protoplastos o electroporación. Por ejemplo, los genes requeridos para la producción de 1-butanol pueden ser clonados en derivados de plásmidos pBE20 o pBE60 [Nagarajan et al., Gene 114: 121-126 (1992)]. Los métodos para transformar B. licheniformis son conocidos en la técnica [véase, por ejemplo, Fleming et al., Appl. Environ. Microbiol. 61 (11): 3775-3780 (1995)]. Los plásmidos construidos para expresión en B. subtilis pueden ser también usados para transformar B. licheniformis, para producir un huésped microbiano recombinante que produzca 1-butanol.
Expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en Paenibacillus macerans
Se pueden construir plásmidos como los anteriormente descritos para expresión en B. subtilis y utilizarlos para transformar Paenibacillus macerans mediante transformación con protoplastos, para producir un huésped microbiano recombinante que produzca 1-butanol.
Expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en Alcaligenes (Ralstonia) eutrophus
Los métodos para la expresión génica y la creación de mutaciones en Ralstonia eutrophus son conocidos en la técnica [véase, por ejemplo, Taghavi et al., Appl. Environ. Microbiol. 60 (10): 3585-3591 (1994)]. Los genes para la ruta biosintética del 1-butanol pueden ser clonados en cualquiera de los anteriormente descritos vectores de amplia variedad de huéspedes y ser utilizados en electroporación para generar recombinantes que produzcan 1-butanol. Se ha descrito con detalle la ruta del polihidroxibutirato en Ralstonia y se conoce una diversidad de técnicas genéticas para modificar el genoma de Ralstonia eutrophus, y estas herramientas pueden ser aplicadas para modificar la ruta biosintética del 1-butanol.
Expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en Pseudomonas putida
Los métodos para la expresión génica en Pseudomonas putida son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ben-Bassat et al., Patente de EE.UU. nº 6.586.229). Por ejemplo, se pueden insertar los genes de la ruta del butanol en pPCU18 y se puede introducir este DNA ligado en células electrocompetentes de Pseudomonas putida DOT-T1 C5aAR1 para generar recombinantes que produzcan 1-butanol.
Expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en Saccharomyces cerevisiae
Los métodos para la expresión génica en Saccharomyces cerevisiae son conocidos en la técnica [véase, por ejemplo, Methods in Enzymology, Volumen 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Parte A, 2004, redactado por Christine Guthrie y Gerald R. Fink, Elsevier Academic Press, San Diego, California, EE.UU.). La expresión de genes en levaduras requiere típicamente un promotor, seguido del gen de interés, y un terminador de la transcripción. Se pueden utilizar diversos promotores de levadura en la construcción de casetes de expresión para genes que codifican la ruta biosintética del 1-butanol, incluyendo, pero sin limitarse a, los promotores constitutivos FBA, GPD y GPM y los promotores inducibles GAL1, GAL10 y CUP1. Los terminadores de la transcripción adecuados incluyen, pero no se limitan a, FBAt, GPDt, GPMt, ERG10t y GAL1t. Los promotores y terminadores de la transcripción adecuados y los genes de la ruta biosintética del 1-butanol pueden ser clonados en plásmidos de 2 micrómetros (2 µm) de levadura, como se describe en el Ejemplo 17.
Expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en Lactobacillus plantarum
El género Lactobacillus pertenece a la familia Lactobacillales y, para Lactobacillus, se pueden emplear muchos plásmidos y vectores usados en la transformación de Bacillus subtilis y Streptococcus. Los ejemplos no restrictivos de vectores adecuados incluyen pAMβ1 y derivados del mismo [Renault et al., Gene 183: 175-182 (1996); y O'Sullivan et al., Gene 137: 227-231 (1993)]; pMBB1 y pHW800, un derivado de pMBB1 [Wyckoff et al., Appl. Environ. Microbiol. 62: 1481-1486 (1996)]; pMG1, un plásmido conjugativo [Tanimoto et al., J. Bacteriol. 184: 58005804 (2002)]; pNZ9520 [Kleerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol. 63: 4581-4584 (1997)]; pAM401 (Fujimoto et al., Appl. Environ. Microbiol. 67: 1262-1267 (2001)]; y pAT392 [Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1899-1903 (1994)]. También se han presentado varios plásmidos de Lactobacillus plantarum [por ejemplo, R. van Kranenburg, N. Golic, R. Bongers, R. J. Leer, W. M. de Vos, R. J. Siezen, M. Kleerebezem, Appl. Environ. Microbiol., marzo de 2005; 71 (3): 1223-1230]. Por ejemplo, en el Ejemplo 18 se describe la expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en Lactobacillus plantarum.
Expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en Enterococcus faecium, Enterococcus qallinarium y Enterococcus faecalis
El género Enterococcus pertenece a la familia Lactobacillales y, para Enterococcus, se pueden emplear muchos plásmidos y vectores usados en la transformación de Lactobacillus, Bacillus subtilis y Streptococcus. Los ejemplos no restrictivos de vectores adecuados incluyen pAMβ1 y derivados del mismo [Renault et al., Gene 183: 175-182 (1996); y O'Sullivan et al., Gene 137: 227-231 (1993)]; pMBB1 y pHW800, un derivado de pMBB1 [Wyckoff et al., Appl. Environ. Microbiol. 62: 1481-1486 (1996)]; pMG1, un plásmido conjugativo [Tanimoto et al., J. Bacteriol. 184: 5800-5804 (2002)]; pNZ9520 [Kleerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol. 63: 4581-4584 (1997)]; pAM401 (Fujimoto et al., Appl. Environ. Microbiol. 67: 1262-1267 (2001)]; y pAT392 [Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1899-1903 (1994)]. También se pueden emplear vectores de expresión para E. faecalis usando el gen nisA de Lactococcus [Eichenbaum et al., Appl. Environ. Microbiol. 64: 2763-2769 (1998)]. Además, se pueden emplear vectores para sustitución génica en el cromosoma de E. faecium [Nallaapareddy et al., Appl. Environ. Microbiol. 72: 334-345 (2006)]. Por ejemplo, en el Ejemplo 19 se describe la expresión de la ruta biosintética del 1butanol en Enterococcus faecalis.
Medios de fermentación
Los medios de fermentación de la presente invención deben contener sustratos carbonados adecuados. Los sustratos adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, monosacáridos tales como glucosa y fructosa, oligosacáridos tales como lactosa y sacarosa, polisacáridos tales como almidón y celulosa o mezclas de los mismos, y mezclas no purificadas de materias primas renovables tales como filtrado de suero de queso, extracto de embrión de maíz, melaza de remolacha azucarera, y malta de cebada. Además, el sustrato carbonado puede ser también un sustrato de un carbono tal como dióxido de carbono o metanol, para el cual se ha demostrado la conversión metabólica en productos intermedios bioquímicos esenciales. Se sabe también que, además de sustratos de uno y dos carbonos, los organismos metilotrofos utilizan diversos compuestos diferentes que contienen carbono, tales como metilamina, glucosamina y una diversidad de aminoácidos, para su actividad metabólica. Por ejemplo, se sabe que las levaduras metilotrofas utilizan el carbono de la metilamina para formar trehalosa o glicerol [Bellion et al., Microb. Growth C1 Compd. (Int. Symp.), 7º (1993), 415-32, redactado por J. Collin Murrel y Don P. Kelly; Editorial Intercept, Andover, Reino Unido]. Similarmente, varias especies de Candida metabolizan alanina o ácido oleico [Sulter et al., Arch. Microbiol. 153: 485-489 (1990)]. Por lo tanto, se contempla que la fuente de carbono utilizada en la presente invención pueda abarcar una gran variedad de sustratos que contienen carbono, y dicha fuente estará sólo limitada por la elección del organismo.
Aunque se contempla que todos los sustratos carbonados anteriormente mencionados y las mezclas de los mismos son adecuados en la presente invención, los sustratos carbonados preferidos son la glucosa, la fructosa y la sacarosa.
Además de una fuente de carbono apropiada, los medios de fermentación deben contener minerales, sales, cofactores, tampones y otros componentes adecuados, conocidos por los expertos en la técnica, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de la ruta enzimática necesaria para la producción de 1-butanol.
Condiciones de cultivo
Típicamente, las células se cultivan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C en un medio apropiado. Los medios de cultivo adecuados de la presente invención son medios comunes comercialmente preparados, tales como caldo Luria Bertani (LB), caldo Sabouraud dextrosa (SD) y caldo de medio de levadura (YM; del inglés, yeast medium). También se pueden utilizar otros medios de cultivo definidos o sintéticos, y el medio apropiado para el cultivo del microorganismo particular será conocido por quien tiene experiencia en la técnica de la ciencia microbiológica o de fermentación. También se puede incorporar al medio de fermentación el uso de agentes conocidos por modular directa o indirectamente la represión por catabolitos, por ejemplo, adenosina-2',3'-monofosfato cíclico.
Los intervalos de pH adecuados para la fermentación están entre 5,0 y 9,0, prefiriéndose un pH de 6,0 a 8,0 como condición inicial.
Las fermentaciones pueden ser llevadas a cabo bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas, prefiriéndose las condiciones anaeróbicas o microaeróbicas.
La cantidad de 1-butanol producida en el medio de fermentación puede ser determinada utilizando diversos métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cromatografía de alta eficacia en fase líquida (HPLC; del inglés, high performance liquid chromatography) y cromatografía en fase gaseosa (GC; del inglés, gas chromatography).
Fermentaciones industriales discontinuas y continuas
En el procedimiento presente se emplea un método discontinuo de fermentación. Una fermentación discontinua clásica es un sistema cerrado donde la composición del medio es ajustada al comienzo de la fermentación y no es sometida a alteraciones artificiales durante la fermentación. De este modo, al comienzo de la fermentación, se inocula el organismo u organismos deseados al medio y se permite que tenga lugar la fermentación sin añadir nada al sistema. Sin embargo, típicamente, una fermentación "discontinua" es discontinua con respecto a la adición de fuente de carbono y a menudo se realizan intentos para controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno. En sistemas discontinuos, las composiciones de metabolitos y biomasa del sistema cambian constantemente hasta el momento en que se detiene la fermentación. En cultivos discontinuos, las células se moderan a través de una fase estática de latencia hasta una fase logarítmica de alto crecimiento y, finalmente, hasta una fase estacionaria donde el índice de crecimiento está reducido o detenido. Si no se tratan, las células en la fase estacionaria finalmente morirán. Las células en la fase logarítmica son generalmente responsables de la mayor parte de la producción del producto final o el compuesto intermedio.
Una variación del sistema discontinuo estándar es el sistema de alimentación discontinua. Los procedimientos de fermentación con alimentación discontinua son también adecuados en la presente invención y comprenden un sistema discontinuo típico con la excepción de que el sustrato se añade en incrementos conforme avanza la fermentación. Los sistemas de alimentación discontinua son útiles cuando la represión por catabolitos es susceptible de inhibir el metabolismo de las células y cuando es deseable tener cantidades limitadas de sustrato en los medios. La medición de la concentración real de sustrato en los sistemas de alimentación discontinua es difícil y, por lo tanto, es estimada basándose en los cambios de factores mensurables tales como el pH, el oxígeno disuelto y la presión parcial de gases de desecho tales como el CO2. Las fermentaciones discontinuas y con alimentación discontinua son comunes y bien conocidas en la técnica, y se pueden hallar ejemplos de ellas en Thomas D. Brock en "Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edición (1989), Sinauer Associates Inc., Sunderland, Massachusetts, EE.UU., o Mukund V. Deshpande, Appl. Biochem. Biotechnol. 36: 227 (1992).
Aunque la presente invención se lleva a cabo en modo discontinuo, se contempla que el método sea adaptable a métodos de fermentación continua. La fermentación continua es un sistema abierto donde se añade continuamente un medio de fermentación definido a un biorreactor y se extrae simultáneamente una cantidad igual de medio acondicionado para el procesamiento. En general, la fermentación continua mantiene los cultivos con una densidad elevada constante, estando esencialmente las células en crecimiento en fase logarítmica.
La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan al crecimiento celular o a la concentración del producto final. Por ejemplo, en un método se mantendrá un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o el nivel de nitrógeno, en una relación fija y se permitirá que se moderen todos los demás parámetros. En otros sistemas, se pueden alterar continuamente diversos factores que afectan al crecimiento mientras se mantiene constante la concentración celular, medida por la turbidez del medio. En los sistemas continuos se procura mantener las condiciones de crecimiento en estado estacionario y, por lo tanto, la pérdida de células debida al medio que se extrae debe ser equilibrada con respecto al índice de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos para modular nutrientes y factores de crecimiento para procesos de fermentación continua así como las técnicas para maximizar la velocidad de formación de productos son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial, y en Brock, supra, se detalla una diversidad de métodos.
Se contempla que la presente invención pueda ser llevada a la práctica usando procedimientos discontinuos, continuos o de alimentación discontinua y que cualquier modo de fermentación conocido sea adecuado. Además, se contempla que las células puedan ser inmovilizadas sobre un sustrato como catalizadores de célula completa y puedan ser sometidas a condiciones de fermentación para la producción de 1-butanol.
Métodos para el aislamiento de 1-butanol del medio de fermentación
El 1-butanol bioproducido puede ser aislado del medio de fermentación usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden separar los sólidos del medio de fermentación mediante centrifugación, filtración, decantación o similar. A continuación, se puede aislar el 1-butanol del medio de fermentación, que ha sido tratado del modo anteriormente descrito para separar los sólidos, usando métodos tales como destilación, extracción líquido-líquido o separación basada en membranas. Puesto que el 1-butanol forma una mezcla azeotrópica de bajo punto de ebullición con el agua, la destilación sólo puede ser empleada para someter la mezcla a separación hasta su composición azeotrópica. Se puede utilizar la destilación en combinación con otro método de separación para obtener la separación cerca del azeótropo. Los métodos que pueden ser utilizados en combinación con la destilación para aislar y purificar 1-butanol incluyen, pero no se limitan a, decantación, extracción líquido-líquido, adsorción y técnicas basadas en membranas. Además, se puede aislar el 1-butanol usando destilación azeotrópica con un disolvente de arrastre ("entrainer") (véase, por ejemplo, Doherty y Malone, "Conceptual Design of Distillation Systems", McGraw Hill, New York, 2001).
La mezcla de 1-butanol-agua forma un azeótropo heterogéneo, por lo que se puede utilizar la destilación en combinación con decantación para aislar y purificar el 1-butanol. En este método, el caldo de fermentación que contiene 1-butanol es sometido a destilación hasta cerca de la composición azeotrópica. A continuación, se condensa la mezcla azeotrópica y se separa el 1-butanol del medio de fermentación mediante decantación. La fase acuosa obtenida por decantación puede ser devuelta a la primera columna de destilación como reflujo. La fase orgánica obtenida por decantación y rica en 1-butanol puede ser adicionalmente purificada por destilación en una segunda columna de destilación.
El 1-butanol puede ser también aislado del medio de fermentación usando extracción líquido-líquido en combinación con destilación. En este método, el 1-butanol es extraído del caldo de fermentación usando extracción líquido-líquido con un disolvente adecuado. La fase orgánica que contiene 1-butanol es luego sometida a destilación para separar el 1-butanol del disolvente.
Se puede utilizar también destilación en combinación con adsorción para aislar 1-butanol del medio de fermentación. En este método, se somete el caldo de fermentación que contiene el 1-butanol a destilación hasta cerca de la composición azeotrópica y luego se separa el agua restante mediante el uso de un adsorbente, tal como tamices moleculares (Aden et al., "Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover, Report NREL/TP-510-32438, National Renewable Energy Laboratory, junio de 2002).
Además, se puede utilizar destilación en combinación con pervaporación para aislar y purificar el 1-butanol del medio de fermentación. En este método, se somete el caldo de fermentación que contiene el 1-butanol a destilación hasta cerca de la composición azeotrópica y luego se separa el agua restante mediante pervaporación a través de una membrana hidrófila [Guo et al., J. Membr. Sci. 245, 199-210 (2004)].
Ejemplos
La presente invención es adicionalmente definida en los Ejemplos siguientes. Se ha de entender que estos Ejemplos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, sólo se proporcionan a modo de ilustración.
Métodos generales
Las técnicas estándares de DNA recombinante y clonación molecular utilizadas en los Ejemplos son bien conocidas en este campo técnico y son descritas por J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989) (Maniatis); y por T. J. Silhavy, M. L. Bennan y L. W. Enquist, "Experiments with Gene Fusions", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1984); y por F. M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", publicado por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987).
Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son bien conocidos en la técnica. Pueden hallarse técnicas adecuadas para uso en los ejemplos siguientes, como se exponen en "Manual of Methods for General Bacteriology" [redactado por Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillips), American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)] o por Thomas D. Brock en "Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology", Segunda Edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massachusetts, EE.UU. (1989). Todos los reactivos, enzimas de restricción y materiales empleados para el crecimiento y mantenimiento de células bacterianas se obtuvieron de Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wisconsin, EE.UU.), BD Diagnostic Systems (Sparks, Maryland, EE.UU.), Life Technologies (Rockville, Maryland, EE.UU.), o Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri, EE.UU.), a menos que se especifique otra cosa.
En la Tabla 4 se proporcionan los cebadores oligonucleotídicos usados para clonación en los Ejemplos siguientes. En la Tabla 5 se proporcionan los cebadores utilizados para secuenciar o explorar los genes clonados. Todos los cebadores oligonucleotídicos fueron sintetizados por Sigma-Genosys (Woodlands, Texas, EE.UU.).
Tabla 4
Cebadores oligonucleotídicos de clonación
Gen
Nombre del cebador Secuencia ID. SEC. nº: Descripción
crt
N3 CACCATGGAACTAAACAAT GTCATCCTTG 17 crt directo
crt
N4 CCTCCTATCTATTTTTGAA GCCTTC 18 crt inverso
hbd
N5 CACCATGAAAAAGGTATGT GTTATAGGT 19 hbd directo
hbd
N6 CATTTGATAATGGGGATTC TTGT 20 hbd inverso
thlA
N7 CACCATGAAAGAAGTTGTA ATAGCTAGTGC 21 thlA directo
thlA
N8 CTAGCACTTTTCTAGCAAT ATTGCTG 22 thlA inverso
bdhA
N9 CACCATGCTAAGTTTTGAT TATTCAATAC 23 bdhA directo
bdhA
N10 TTAATAAGATTTTTTAAATA TCTCA 24 bdhA inverso
bdhB
N11 CACCATGGTTGATTTCGAA TATTCAATACC 25 bdhB directo
bdhB
N12 TTACACAGATTTTTTGAATA TTTGT 26 bdhB inverso
thlB
N15 CACCATGAGAGATGTAGTA ATAGTAAGTGCTG 27 thlB directo
thlB
N16 CCGCAATTGTATCCATATT GAACC 28 thlB inverso
CAC0462
N17 CACCATGATAGTAAAAGCA AAGTTTG 29 CAC0462 directo
CAC0462
N21 GCTTAAAGCTTAAAACCGC TTCTGGCG 30 CAC0462 inverso
ald
N27F1 CACCATGAATAAAGACACA CTAATACC 31 ald directo
ald
N28R1 GCCAGACCATCTTTGAAAA TGCGC 32 ald inverso
Cebadores oligonucleotídicos de clonación
Gen
Nombre del cebador Secuencia ID. SEC. nº: Descripción
thlA
N44 CATGCATGCAAAGGAGGTT AGTAGAATGAAAGAAG 33 thlA directo
thlA
N45 GTCCTGCAGGGCGCGCCC AATACTTTCTAGCACTTTTC 34 thlA inverso
hbd
N42 CATGTCGACAAAGGAGGT CTGTTTAATGAAAAAGGTA TG 35 hbd directo
hbd
N43 GTCGCATGCCTTGTAAACT TATTTTGAA 36 hbd inverso
CAC0462
N68 CATAGATCTGGATCCAAAG GAGGGTGAGGAAATGATA GTAAAAG 37 CAC0462 directo
CAC0462
N69 CATGTCGACGTGCAGCCTT TTTAAGGTTCT 38 CAC0462 inverso
crt
N38 CATGAATTCACGCGTAAAG GAGGTATTAGTCATGGAAC 39 crt directo
crt
N39 GTCGGATCCCTTACCTCCT ATCTATTTTTG 40 crt inverso
ald
N58 CATGCCCGGGGGTCACCA AAGGAGGAATAGTTCATGA ATAAA 41 ald directo
ald
N59 CATGGTTAACAAGAAGTTA GCCGGCAAGTACA 42 ald inverso
bdhB
N64 CATGGTTAACAAAGGAGG GGTTAAAATGGTTGATTTC GAAT 43 bdhB directo
bdhB
N65 CATGGCATGCGTTTAAACG TAGGTTTACACAGATTTT 44 bdhB inverso
--
BenF ACTTTCTTTCGCCTGTTTC AC 73 --
--
BenMA R CATGAAGCTTGGCGCGCC GGGACGCGTTTTTGAAAAT AATGAAAACT 74 --
--
BenBPR CATGAAGCTTGTTTAAACT CGGTGACCTTGAAAATAAT GAAAACTTATATTGTTTTGA AAATAATGAAAACTTATATT G 75 --
EgTER(opt)
N85 CATAGATCTGGATCCAAAG GAGGGTGAGGAAATGGCG ATGTTTACG 80 Egter directo
Cebadores oligonucleotídicos de clonación
Gen
Nombre del cebador Secuencia ID. SEC. nº: Descripción
EgTER(opt)
N86 GTCGACTTACTGCTGGGC GG 81 Egter inverso
Ptrc-ald(opt)
T-Ptrc(Bsp EI) TTCCGTACTTCCGGACGAC TGCACGGTGCACCAATGC TTCTG 87 Ptrc directo
Ptrc-ald(op)
B-aldopt(S cal) CGGATCTTAAGTACTTTAA C CCGCCAGCACACAGCGGC GCTGG 88 ald inverso
ald
AF BamHI CATTGGATCCATGAATAAA GACACACTAATACCTACAA C 93 ald directo
ald
AR Aat2 CATGACGTCACTAGTGTTA ACAAGAAGTTAGCCGGCA AG 94 ald inverso
EgTER
Forward 1(E) CATGTTAACAAAGGAGGAA AGATCTATGGCGATGTTTA CGACCACCGCAA 95 EgTER SOE directo
EgTER
Bottom Reverse I (E) CCCCTCCTTTGGCGCGCC TTACTGCTGGGCGGCGCT CGGCAGA 96 EgTER SOE inverso
bdh
Top Forward 2 (B) GCCCAGCAGTAAGGCGCG CCAAAGGAGGGGTTAAAAT GGTTGATTTCGAAT 97 bdh SOE directo
bdh
Reverse 2 (B) GTCGACGTCATACTAGTTT ACACAGATTTTTTGAATATT TGT 98 bdh SOE inverso
---
Pamy/la cO F CATTGTACAGAATTCGAGC TCTCGAGGCCCCGCACAT ACGAAAAGAC 99 Pamy directo
---
Pamy/la cO R CATTGTACAGTTTAAACAT AGGTCACCCTCATTTTCGT AGGAATTGTTATCC 100 Pamy inverso
---
Spac F CATCTCGAGTAATTCTACA CAGCCCAGTCC 101 Pspac directo
---
Spac R CATGTTTAAACGGTGACCC AAGCTGGGGATCCGCGG 102 Pspac inverso
thl
Top TF CATTGGTCACCATTCCCGG GCATGCAAAGGAGGTTAG TAGAATG 103 thl SOE directo
thl
Bot TR CCTTTACGCGACCGGTACT AGTCAAGTCGACAGGGCG CGCCCAATACTTTC 104 thl SOE inverso
Cebadores oligonucleotídicos de clonación
Gen
Nombre del cebador Secuencia ID. SEC. nº: Descripción
crt
Top CF CGCGCCCTGTCGACTTGA CTAGTACCGGTCGCGTAAA GGAGGTATTAGTCATGGAA C 105 crt SOE directo
crt
Bot CR CATCGTTTAAACTTGGATC CAGATCCCTTACCTCCTAT 106 crt SOE inverso
ERG10-ERG10t
OT731 AAAGCTGGAGCTCCACCG CGGTGGCGGCCGCTCTAG AAGTTTTCAAAGCAGAGTT TCGTTTGAATATTTTACCA 164 ERG10-ERG10t directo
ERG10-ERG10t
OT732 TTCAATATGCATGCCTCAG AACGTTTACATTGTATCGA CTGCCAGAACCC 165 ERG10-ERG10t inverso
GAL1-GAL10
OT733 GCAGTCGATACAATGTAAA CGTTCTGAGGCATGCATAT TGAATTTTCAAAAATTCTTA CTTTTTTTTTGGATGGACG CA 166 GAL1-GAL10 directo
GAL1-GAL10
OT734 ACCTGCACCTATAACACAT ACCTTTTCCATGGTAGTTT TTTCTCCTTGACGTTAAAG TATAGAGGTATATTA 167 GAL1-GAL10 inverso
hbd
OT735 AAAAACTACCATGGAAAAG GTATGTGTTATAGGTGCAG GTACTATGGGTTCAGGAAT TGC 168 hbd directo
hbd
OT736 GTAAAAAAAAGAAGGCCGT ATAGGCCTTATTTTGAATA ATCGTAGAAACCTTTTCCT GATTTTCTTCCAAG 169 hbd inverso
GAL1t
OT737 ACGATTATTCAAAATAAGG CCTATACGGCCTTCTTTTT TTTACTTTGTTCAGAACAA CTTCTCATTTTTTTCTACTC ATAA 170 GAL1t directo
GAL1t
OT738 GAATTGGGTACCGGGCCC CCCCTCGAGGTCGACCGA TGCCTCATAAACTTCGGTA GTTATATTACTCTGAGAT 171 GAL1t inverso
thlA
OT797 AAAGTAAGAATTTTTGAAA ATTCAATATGCATGCAAGA AGTTGTAATAGCTAGTGCA GTAAGAAC 172 thlA directo
Cebadores oligonucleotídicos de clonación
Gen
Nombre del cebador Secuencia ID. SEC. nº: Descripción
thlA
OT798 GAAAAAGATCATGAGAAAA TCGCAGAACGTAAGGCGC GCCTCAGCACTTTTCTAGC AATATTGCTGTTCCTTG 173 thlA inverso
CUP1
OT806 CTCGAAAATAGGGCGCGC CCCCATTACCGACATTTGG GCGC 174 CUP1 directo
CUP1
OT807 ACTGCACTAGCTATTACAA CTTCTTGCATGCGTGATGA TTGATTGATTGATTGTA 175 CUP1 inverso
promotor GPD
OT808 TCGGTAATGGGGGCGCGC CCTATTTTCGAGGACCTTG TCACCTTGA 176 promotor GPD directo
promotor GPD
OT809 TTTCGAATAAACACACATA AACAAACACCCCATGGAAA AGGTATGTGTTATAGGTGC AGG 177 promotor GPD inverso
promotor FBA1
OT799 TACCGGGCCCCCCCTCGA GGTCGACGGCGCGCCACT GGTAGAGAGCGACTTTGTA TGCCCCA 178 promotor FBA1 directo
promotor FBA1
OT761 CTTGGCCTTCACTAGCATG CTGAATATGTATTACTTGG TTATGGTTATATATGACAAA AG 179 promotor FBA1 inverso
promotor GPM1
OT803 CCCTCACTAAAGGGAACAA AAGCTGGAGCTCGATATC GGCGCGCCCACATGCAGT GATGCACGCGCGA 180 promotor GPM1 directo
promotor GPM1
OT804 AAGGATGACATTGTTTAGT TCCATGGTTGTAATATGTG TGTTTGTTTGG 181 promotor GPM1 inverso
crt
OT785 CACACATATTACAACCATG GAACTAAACAATGTCATCC TTGAAAAGGAAGG 182 CRT directo
crt
OT786 ATCATTCATTGGCCATTCA GGCCTTATCTATTTTTGAA GCCTTCAATTTTTCTTTTCT CTATG 183 Crt inverso
terminador GPM1t
OT787 CAAAAATAGATAAGGCCTG AATGGCCAATGAATGATTT GATGATTTCTTTTTCCCTC CATTTTTC 184 terminador GPM1t directo
Cebadores oligonucleotídicos de clonación
Gen
Nombre del cebador Secuencia ID. SEC. nº: Descripción
terminador GPM1t
OT805 GAATTGGGTACCGGGCCC CCCCTCGAGGTCGACTTAT AGTATTATATTTTCTGATTT GGTTATAGCAAGCAGCGTT T 185 terminador GPM1t inverso
promotor GPD
OT800 GGGAACAAAAGCTGGAGC TCCACCGCGGTGGGGCGC GCCCTATTTTCGAGGACCT TGTCACCTTGAGCC 190 promotor GPD directo
promotor GPD
OT758 TTAAGGTATCTTTATCCAT GGTGTTTGTTTATGTGTGT TTATTCGAAACT 191 promotor GPD inverso
terminador GPD
OT754 TTGGGTACCGGGCCCCCC CTCGAGGTCGACTGGCCA TTAATCTTTCCCATAT 192 terminador GPD directo
terminador GPD
OT755 TGTGTCCTAGCAGGTTAGG GCCTGCAGGGCCGTGAAT TTACTTTAAATCTTG 193 terminador GPD inverso
promotor FBA1
OT760 CGAAAATAGGGCGCGCCA CTGGTAGAGAGCGACTTT GTATGCCCCAATTG 194 promotor FBA1 directo
promotor FBA1
OT792 CCCTTGACGAACTTGGCCT TCACTAGCATGCTGAATAT GTATTACTTGGTTATGGTT ATATATGACAAAAG 195 promotor FBA1 inverso
terminador FBA1
OT791 CCCTTGACGAACTTGGCCT TCACTAGCATGCTGAATAT GTATTACTTGGTTATGGTT ATATATGACAAAAG 196 terminador FBA1 directo
terminador FBA1
OT765 GGAACAAAAGCTGGAGCT CCACCGCGGTGGTTTAAC GTATAGACTTCTAATATATT TCTCCATACTTGGTATT 197 terminador FBA1 inverso
IdhL
LDH EcoRV F GACGTCATGACCACCCGC CGATCCCTTTT 198 IdhL directo
Idhl
LDH AatllR GATATCCAACACCAGCGAC CGACGTATTAC 199 IdhL inverso
Cm
Cm F ATTTAAATCTCGAGTAGAG GATCCCAACAAACGAAAAT TGGATAAAG 200 Cm directo
Cebadores oligonucleotídicos de clonación
Gen
Nombre del cebador Secuencia ID. SEC. nº: Descripción
Cm
Cm R ACGCGTTATTATAAAAGCC AGTCATTAGG 201 Cm inverso
P11
P11 F TCGAGAGCGCTATAGTTGT TGACAGAATGGACATACTA TGATATATTGTTGCTATAG CGCCC 202 promotor P11 directo
P11
P11 R GGGCGCTATAGCAACAATA TATCATAGTATGTCCATTCT GTCAACAACTATAGCGCTC 203 promotor P11 inverso
PldhL
PldhL F GAGCTCGTCGACAAACCA ACATTATGACGTGTCTGGG C 204 promotor ldhL directo
PldhL
PldhL R GGATCCTACCATGTTTGTG CAAAATAAGTG 205 promotor ldhL inverso
PnisA
F-PnisA (EcoRV) TTCAGTGATATCGACATAC TTGAATGACCTAGTC 206 PnisA directo
PnisA
R-PnisA (P mel BamHI) TTGATTAGTTTAAACTGTA GGATCCTTTGAGTGCCTCC TTATAATTTA 207 PnisA inverso
Tabla 5
Cebadores de secuenciación y de exploración por PCR
Nombre
Secuencia Especificidad génica ID. SEC. nº:
M13 Directo
GTAAAACGACGGCCAGT vector TOPO 45
M13 Inverso
AACAGCTATGACCATG vector TOPO 46
N7SeqF1
GCAGGAGATGCTGACGTAATAA thlA 47
N7SeqR1
CCAACCTGCTTTTTCAATAGCTGC thlA 48
N15SeqF1
CAGAGATGGGGTCAAAGAATG thlB 49
N16SeqR1
GTGGTTTTATTCCGAGAGCG thlB 50
N5SeqF2
GGTCTATACTTAGAATCTCC hbd 51
N6SeqR2
CGGAACAGTTGACCTTAATATGGC hbd 52
N22SeqF1
GCCTCATCTGGGTTTGGTCTTG CAC0426 53
N22SeqF2
CGCCTAGGAGAAAGGACTATAAAA CTGG CAC0426 54
N22SeqF3
CAGAGTTATAGGTGGTAGAGCC CAC0426 55
N23SeqR1
CCATCCCGCTGTTCCTATTCTTCT CAC0426 56
N23SeqR2
CCAATCCTCTCCACCCATTACC CAC0426 57
Cebadores de secuenciación y de exploración por PCR
Nombre
Secuencia Especificidad génica ID. SEC. nº:
N23SeqR3
CGTCCATCCTTAATCTTCCC CAC0426 58
N31SeqF2
CCAACTATGGAATCCCTAGATGC ald 59
N31SeqF3
GCATAGTCTGCGAAGTAAATGC ald 60
N31SeqF4
GGATCTACTGGTGAAGGCATAACC ald 61
N32SeqR1
GTTAGCCGGCAAGTACACATC ald 72
N32SeqR2
GGCATCATGAGTTCTGTCATGAC ald 62
N32SeqR3
GCCTTCAATGATACTCTTACCAGCC ald 63
N32SeqR4
GCATTTCCAGCAGCTATCATGC ald 64
N32SeqR5
CCTTCCCATATGTGTTTCTTCC ald 65
N11SeqF1
GTTGAAGTAGTACTAGCTATAG bdhB 66
N11SeqF2
GACATAACACACGGCGTAGGGC bdhB 67
N12SeqR1
TAAGTGTACACTCCAATTAGTG bdhB 68
N12SeqR2
GCCATCTAACACAATATCCCATGG bdhB 69
N9SeqF1
GCGATACATGGGACATGGTTAAAG bdhA 70
N10SeqR1
TGCACTTAACTCGTGTTCCATA bdhA 71
T7Primer
TAATACGACTCACTATAGGG vector pET23 82
Trc99aF
TTGACAATTAATCATCCGGC vector pTRc99a 83
N5SeqF4
GGTCAACTGTTCCGGAAATTC hbd 84
T-ald (BamHI)
TGATCTGGATCCAAGAAGGAGCCC TTCACCATGAATAAAGACACAC ald 85
B-ald (EgTER)
CATCGCCATTTCCTCACCCTCCTTT TTAGCCGGCAAGTACACATCTTCTT TGTC ald 86
N3SeqF1
CCATCATACCATACTGACCC crt 107
N3SeqF2
GCTACTGGAGCATTGCTCAC crt 108
N3SeqF3
CCATTAACAGCTGCTATTACAGGC crt 109
N4SeqR3
GGTCTCGGAATAACACCTGG crt 110
N5SeqF3
CAAGCTTCATAACAGGAGCTGG hbd 111
N7SeqR2
ATCCCACAATCCGTCAGTGATC thlA 112
N31SeqF1
CTGAGATAAGAAAGGCCGCA ald 113
N62SeqF2
CAACCCTGGGCGTGTTTCTG EgTER 114
N62SeqF3
GTGGCGAAGATTGGGAACTG EgTER 115
N62SeqF4
GGGAAATGGCAGAAGATGTTCAGC EgTER 116
Cebadores de secuenciación y de exploración por PCR
Nombre
Secuencia Especificidad génica ID. SEC. nº:
N63SeqR1
CGGTCTGATAACCTGCAAAATCGC EgTER 117
N63SeqR2
CACCAGCGCTTTGGCAACAAC EgTER 118
N63SeqR3
GAACGTGCATACAGACCTGCTTC EgTER 119
N63SeqR4
CGGCTGAATAACTTTTGCGG EgTER 120
Pamy SeqF2
GCCTTTGATGACTGATGATTTGGC vector pFP988 121
Pamy SeqF
TCTCCGGTAAACATTACGGCAAAC vector pFP988 122
Pamy SeqR
CGGTCAGATGCAATTCGACATGTG vector pFP988 123
SpacF Seq
GAAGTGGTCAAGACCTCACT promotor Pspac 124
sacB Up
CGGGTTTGTTACTGATAAAGCAGG sacB 125
sacB Dn
CGGTTAGCCATTTGCCTGCTTTTA sacB 126
HT R
ACAAAGATCTCCATGGACGCGT vector pHT01 127
Scr1
CCTTTCTTTGTGAATCGG csc 160
Scr2
AGAAACAGGGTGTGATCC csc 161
Scr3
AGTGATCATCACCTGTTGCC csc 162
Scr4
AGCACGGCGAGAGTCGACGG csc 163
Métodos para determinar la concentración de 1-butanol en medios de cultivo
Se puede determinar la concentración de 1-butanol en los medios de cultivo mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en un método específico de cromatografía de alta eficacia en fase líquida (HPLC) se utilizó una columna Shodex SH-1011 con una columna protectora Shodex SH-G, ambas adquiridas a Waters 5 Corporation (Milford, Massachusetts, EE.UU.), con detección por índice de refracción (RI; del inglés, refractive index). La separación cromatográfica se llevó a cabo utilizando H2SO4 0,01 M como fase móvil con un caudal de 0,5 ml/min y una temperatura de columna de 50 °C. El 1-butanol tenía un tiempo de retención de 52,8 minutos bajo las condiciones empleadas. Alternativamente, se dispone de métodos para cromatografía en fase gaseosa (GC). Por ejemplo, en un método específico de GC se utilizó una columna HP-INNOWax (30 m x 0,53 mm de diámetro interno, 10 1 µm de espesor de película; Agilent Technologies, Wilmington, Delaware, EE.UU.), con un detector de ionización por llama (FID; del inglés, flame ionization detector). El gas portador fue helio a un caudal de 4,5 ml/min, medido a 150 °C con presión de cabeza constante; la división del inyector era 1:25 a 200 °C; la temperatura del horno era 45 °C durante 1 minuto, de 45 a 220 °C a 10 °C/minuto, y 220 °C durante 5 minutos; y la detección con FID se realizó a 240 °C con 26 ml/minuto de helio como gas auxiliar. El tiempo de retención del 1-butanol fue 5,4 minutos. También 15 se utilizó un método de GC similar usando una columna Varian CP-WAX 58 (FFAP) CB (25 m x 0,25 mm de
diámetro interno x 0,2 µm de espesor de película; Varian, Inc., Palo Alto, California, EE.UU.).
El significado de las abreviaturas es el siguiente: "s" significa segundos, "min" significa minutos, "h" significa horas,
"nm" significa nanómetros, "d" significa días, "µl" significa microlitros, "ml" significa mililitros, "l" significa litros, "mm"
significa milímetros, "nm" significa nanómetros, "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa 20 milimoles, "µmol" significa micromoles, "g" significa gramos, "µg" significa microgramos y "ng" significa nanogramos,
"PCR" (del inglés, polymerase chain reaction" significa reacción en cadena de la polimerasa, "DO" significa densidad
óptica, "DO600" significa densidad óptica medida a una longitud de onda de 600 nm, "DO550" significa densidad óptica
medida a una longitud de onda de 550 nm, "kDa" significa kilodáltones, "g" significa la constante de gravitación,
"rpm" significa revoluciones por minuto, "bp" (del inglés, base pairs) significa pares de bases, "kbp" significa pares de 25 kilobases, "% p/v" significa porcentaje en peso/volumen, "% v/v" significa porcentaje en volumen/volumen, "HPLC"
significa cromatografía de alta eficacia en fase líquida, y "GC" significa cromatografía en fase gaseosa.
Ejemplo 1
Clonación y expresión de acetil-CoA acetiltransferasa hace referencia en esta memoria como acetoacetil-CoA tiolasa, en E. coli. El gen thlA de acetoacetil-CoA tiolasa fue clonado de C. acetobutylicum (ATCC 824) y hecho expresar en E. coli. El gen thlA fue multiplicado a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) usando la PCR, lo que dio lugar a un producto de 1,2 kbp.
El DNA genómico de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) fue obtenido de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, Virginia, EE.UU.) o fue aislado de cultivos de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824), como se describe más adelante.
Se preparó DNA genómico de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) a partir de cultivos anaeróbicamente desarrollados. La cepa de Clostridium fue cultivada en 10 ml de medio de crecimiento clostridial [Lopez-Contreras et al., Appl. Env. Microbiol. 69 (2), 869-877 (2003)], en botellas Bellco para suero taponadas y selladas con cápsula, de 100 ml de capacidad (Bellco Glass Inc., Vineland, New Jersey, EE.UU.), en una cámara anaeróbica a 30 °C. El inóculo era una sola colonia de una placa YTG 2X (Kishii et al., Antimicrobial Agents & Chemotherapy 47 (1), 77-81 (2003)] cultivada en un dispositivo Anaeropak™ MGC de 2,5 l de capacidad (Mitsubishi Gas Chemical America Inc., New York, EE.UU.), a 37 °C.
Se preparó DNA genómico usando el kit Gentra Puregene® (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota, EE.UU.; número de catálogo: D-6000A) con modificaciones en las instrucciones del fabricante [Wong et al., Current Microbiology 32, 349-356 (1996)]. Se multiplicó por PCR el gen thlA a partir de DNA genómico de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) usando los cebadores N7 y N8 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 21 y 22, respectivamente. Otros reactivos para multiplicación por PCR fueron obtenidos de kits del fabricante, por ejemplo, DNA polimerasa Kod HiFi (Novagen Inc., Madison, Wisconsin, EE.UU.; número de catálogo: 71805-3), y fueron utilizados de acuerdo con el protocolo del fabricante. La multiplicación se llevó a cabo en un dispositivo termociclador de DNA GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.).
Para los estudios de expresión se utilizó la tecnología de clonación Gateway (Invitrogen Corp., Carlsbad, California, EE.UU.). El vector de entrada pENTR/SD/D-TOPO permitió una clonación direccional y proporcionó una secuencia Shine-Dalgarno para el gen de interés. El vector de destino pDEST14 empleaba un promotor de T7 para la expresión del gen sin etiqueta alguna. El cebador directo incorporaba cuatro bases (CACC) inmediatamente adyacentes al codón de inicio de la traducción para permitir la clonación direccional en pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen), para generar el plásmido pENTRSDD-TOPOthlA. Se transformaron células E. coli Top10 (Invitrogen) con la construcción pENTR y se sembraron en placas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se cultivaron durante la noche los transformantes y se preparó DNA plasmídico usando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Valencia, California, EE.UU.; número de catálogo: 27106) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los clones fueron sometidos a secuenciación con los cebadores directo e inverso de M13 (véase la Tabla 5), proporcionados como ID. SEC. números 45 y 46, respectivamente, para confirmar que los genes estaban insertados en la orientación correcta y para confirmar la secuencia. Se necesitaron cebadores de secuenciación adicionales, N7SeqF1 y N7SeqR1 (véase la Tabla 5), proporcionados como ID. SEC. números 47 y 48, respectivamente, para secuenciar completamente el producto de PCR. Se proporcionan como ID. SEC. nº 1 e ID. SEC. nº 2, respectivamente, la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF; del inglés, open reading frame) para este gen y la prevista secuencia de aminoácidos de la enzima.
Para crear un clon de expresión, se transfirió el gen thlA al vector pDEST 14 mediante recombinación para generar pDEST14thlA. Se transformaron células BL21-AI con el vector pDEST14thlA. Se inocularon los transformantes a medio LB complementado con 50 µg/ml de ampicilina y se cultivaron durante la noche. Se utilizó una parte alícuota del cultivo nocturno para inocular a 50 ml de medio LB complementado con 50 µg/ml de ampicilina. El cultivo se incubó a 37 °C con sacudimiento hasta que la DO600 alcanzó un valor de 0,6-0,8. Se dividió el cultivo en dos cultivos de 25 ml y se añadió arabinosa a uno de los matraces hasta una concentración final de 0,2% en peso. El matraz testigo negativo no fue sometido a inducción con arabinosa. Los matraces fueron incubados durante 4 horas a 37 °C con sacudimiento. Se recolectaron las células por centrifugación y se resuspendieron los sedimentos celulares de centrifugación en tampón de MOPS 50 mM, pH de 7,0. Las células se rompieron por sonicación o por paso a través de una prensa French. Se centrifugó el lisado de células completas para obtener el sobrenadante o extracto exento de células, y el sedimento de centrifugación o fracción insoluble. Una parte alícuota de cada fracción (lisado de células completas, extracto exento de células y fracción insoluble) fue resuspendida en tampón de carga (MES)-SDS (Invitrogen), calentada a 85 °C durante 10 minutos y sometida a un análisis por SDS-PAGE (gel de Bis-Tris al 4-12 % NuPAGE; número de catálogo: NP0322Box, Invitrogen). Una proteína del peso molecular esperado de aproximadamente 41 kDa, según se dedujo a partir de la secuencia de ácido nucleico, estaba presente en el cultivo inducido pero no en el testigo no inducido.
Se midió la actividad acetoacetil-CoA tiolasa en los extractos exentos de células como degradación de un complejo de Mg2+-acetoacetil-CoA controlando la disminución de la absorbancia a 303 nm. Las condiciones de ensayo estándares fueron Tris-HCl 100 mM, pH de 8,0, DTT (ditiotreitol) 1 mM y MgCl2 10 mM. Se dejó que se equilibrara el cóctel durante 5 minutos a 37 °C y luego se añadió el extracto exento de células. Se inició la reacción con la adición de acetoacetil-CoA 0,05 mM más CoA 0,2 mM. Se midió la concentración de proteína mediante el método Bradford
o mediante el kit Bicinchoninic (Sigma; número de catálogo: BCA-1). En ambos casos se utilizó albúmina sérica bovina (Bio-Rad, Hercules, California, EE.UU.) como patrón. En un ensayo típico, se determinó que la actividad específica de la proteína ThlA era 16,0 µmol mg-1 min-1 en el cultivo inducido frente a 0,27 µmol mg-1 min-1 en el cultivo no inducido.
Ejemplo 2
Clonación y expresión de acetil-CoA acetiltransferasa
La finalidad de este Ejemplo fue hacer que se expresara la enzima acetil-CoA acetiltransferasa, a la que también se hace referencia en esta memoria como acetoacetil-CoA tiolasa, en E. coli. El gen thlB de acetoacetil-CoA tiolasa fue clonado de C. acetobutylicum (ATCC 824) y hecho expresar en E. coli. El gen thlB fue multiplicado a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) usando la PCR.
Se clonó y expresó el gen thlB del mismo modo que el gen thlA descrito en el Ejemplo 1. Se multiplicó el DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por PCR usando los cebadores N15 y N16 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 27 y 28, respectivamente, creándose un producto de 1,2 kbp. El cebador directo incorporaba cuatro bases (CCAC) inmediatamente adyacentes al codón de inicio de la traducción para permitir la clonación direccional en pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen), para generar el plásmido pENTRSDD-TOPOthlB. Los clones fueron sometidos a secuenciación con los cebadores directo e inverso de M13, proporcionados como ID. SEC. números 45 y 46, respectivamente, para confirmar que los genes estaban insertados en la orientación correcta y para confirmar la secuencia. Se necesitaron cebadores de secuenciación adicionales, N15SeqF1 y N16SeqR1 (véase la Tabla 5), proporcionados como ID. SEC. números 49 y 50, respectivamente, para secuenciar completamente el producto de PCR. Se proporcionan como ID. SEC. nº 3 e ID. SEC. nº 4, respectivamente, la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) para este gen y la prevista secuencia de aminoácidos de la enzima.
Para crear un clon de expresión, se transfirió el gen thlB al vector pDEST 14 (Invitrogen) mediante recombinación para generar pDEST14thlB. Se transformaron células BL21-AI con el vector pDEST14thlB y se indujo la expresión desde el promotor de T7 mediante la adición de arabinosa. Una proteína del peso molecular esperado de aproximadamente 42 kDa, según se dedujo a partir de la secuencia de ácido nucleico, estaba presente en el cultivo inducido pero no en el testigo no inducido. Se llevaron a cabo ensayos enzimáticos como los descritos en el Ejemplo
1. En un ensayo típico, se determinó que la actividad específica de la proteína ThlB era 14,9 µmol mg-1 min-1 en el cultivo inducido frente a 0,28 µmol mg-1 min-1 en el cultivo no inducido.
Ejemplo 3
Clonación y expresión de 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa
La finalidad de este Ejemplo fue clonar el gen hbd de C. acetobutylicum (ATCC 824) y hacer que se expresara en E. coli. El gen hbd fue multiplicado a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) usando la PCR.
Se clonó y expresó el gen hbd usando el método descrito en el Ejemplo 1. Se multiplicó el gen hbd a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por PCR usando los cebadores N5 y N6 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 19 y 20, respectivamente, creándose un producto de 881 bp. El cebador directo incorporaba cuatro bases (CACC) inmediatamente adyacentes al codón de inicio de la traducción para permitir la clonación direccional en pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen), para generar el plásmido pENTRSDD-TOPOhbd. Los clones fueron sometidos a secuenciación con los cebadores directo e inverso de M13, proporcionados como ID. SEC. números 45 y 46, respectivamente, para confirmar que los genes estaban insertados en la orientación correcta y para confirmar la secuencia. Se necesitaron cebadores de secuenciación adicionales, N5SeqF2 y N6SeqR2 (véase la Tabla 5), proporcionados como ID. SEC. números 51 y 52, respectivamente, para secuenciar completamente el producto de PCR. Se proporcionan como ID. SEC. nº 5 e ID. SEC. nº 6, respectivamente, la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) para este gen y la prevista secuencia de aminoácidos de la enzima.
Para crear un clon de expresión, se transfirió el gen hbd al vector pDEST 14 (Invitrogen) mediante recombinación para generar pDEST14hbd. Se transformaron células BL21-AI con el vector pDEST14hbd y se indujo la expresión desde el promotor de T7 mediante la adición de arabinosa, como se describió en el Ejemplo 1. Una proteína del peso molecular esperado de aproximadamente 31 kDa, según se dedujo a partir de la secuencia de ácido nucleico, estaba presente en el cultivo inducido pero estaba ausente en el testigo no inducido.
Se determinó la actividad hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa midiendo la velocidad de oxidación de NADH, según se mide por la disminución de la absorbancia a 340 nm. Una mezcla de ensayo estándar contenía MOPS 50 mM, pH de 7,0, DTT 0,1 mM y NADH 0,2 mM. Se dejó que se equilibrara el cóctel durante 5 minutos a 37 °C y luego se añadió el extracto exento de células. Se iniciaron las reacciones mediante la adición del sustrato, acetoacetil-CoA 0,1 mM. En un ensayo típico, se determinó que la actividad específica de la proteína BHBD era 57,4 µmol mg-1 min-1 en el cultivo inducido frente a 0,885 µmol mg-1 min-1 en el cultivo no inducido.
Ejemplo 4
Clonación y expresión de crotonasa
La finalidad de este Ejemplo fue clonar el gen crt de C. acetobutylicum (ATCC 824) y hacer que se expresara en E. coli. El gen crt fue multiplicado a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) usando la PCR.
Se clonó y expresó el gen crt usando el método descrito en el Ejemplo 1. Se multiplicó el gen crt a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por PCR usando los cebadores N3 y N4 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 17 y18, respectivamente, creándose un producto de 794 bp. El cebador directo incorporaba cuatro bases (CACC) inmediatamente adyacentes al codón de inicio de la traducción para permitir la clonación direccional en pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen), para generar el plásmido pENTRSDD-TOPOcrt. Los clones fueron sometidos a secuenciación con los cebadores directo e inverso de M13, proporcionados como ID. SEC. números 45 y 46, respectivamente, para confirmar que los genes estaban insertados en la orientación correcta y para confirmar la secuencia. Se proporcionan como ID. SEC. nº 7 e ID. SEC. nº 8, respectivamente, la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) para este gen y su prevista secuencia de aminoácidos.
Para crear un clon de expresión, se transfirió el gen crt al vector pDEST 14 (Invitrogen) mediante recombinación para generar pDEST14crt. Se transformaron células BL21-AI con el vector pDEST14crt y se indujo la expresión desde el promotor de T7 mediante la adición de arabinosa, como se describió en el Ejemplo 1. Una proteína del peso molecular esperado de aproximadamente 28 kDa, según se dedujo a partir de la secuencia de ácido nucleico, estaba presente en cantidades mucho mayores en el cultivo inducido que en el testigo no inducido.
Se examinó la actividad crotonasa del modo descrito por Stern [Methods Enzymol. 1 559-566 (1954)]. En un ensayo típico, se determinó que la actividad específica de la proteína crotonasa era 444 µmol mg-1 min-1 en el cultivo inducido frente a 47 µmol mg-1 min-1 en el cultivo no inducido.
Ejemplo 5
Clonación y expresión de butiril-CoA deshidrogenasa
La finalidad de este Ejemplo fue hacer que se expresara la enzima butiril-CoA deshidrogenasa, a la que también se hace referencia en esta memoria como trans-2-enoil-CoA reductasa, en E. coli. El gen CAC0462, un supuesto homólogo de trans-2-enoil-CoA reductasa, fue clonado de C. acetobutylicum (ATCC 824) y hecho expresar en E. coli. El gen CAC0462 fue multiplicado a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) usando la PCR.
Se clonó y expresó el gen CAC0462 usando el método descrito en el Ejemplo 1. Se multiplicó el gen CAC0462 a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por PCR usando los cebadores N17 y N21 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 29 y 30, respectivamente, creándose un producto de 1,3 kbp. El cebador directo incorporaba cuatro bases (CACC) inmediatamente adyacentes al codón de inicio de la traducción para permitir la clonación direccional en pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen), para generar el plásmido pENTRSDD-TOPOCAC0462. Los clones fueron sometidos a secuenciación con los cebadores directo e inverso de M13, proporcionados como ID. SEC. números 45 y 46, respectivamente, para confirmar que los genes estaban insertados en la orientación correcta y para confirmar la secuencia. Se necesitaron cebadores de secuenciación adicionales, N22SeqF1 (ID. SEC. nº 53), N22SeqF2 (ID. SEC. nº 54), N22SeqF3 (ID. SEC. nº 55), N23SeqR1 (ID. SEC. nº 56), N23SeqR2 (ID. SEC. nº 57) y N23SeqR3 (ID. SEC. nº 58) (véase la Tabla 5) para secuenciar completamente el producto de PCR. Se proporcionan como ID. SEC. nº 9 e ID. SEC. nº 10, respectivamente, la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) para este gen y la prevista secuencia de aminoácidos de la enzima.
Para crear un clon de expresión, se transfirió el gen CAC0462 al vector pDEST 14 (Invitrogen) mediante recombinación para generar pDEST14CAC0462. Se transformaron células BL21-AI con el vector pDEST14CAC0462 y se indujo la expresión desde el promotor de T7 mediante la adición de arabinosa, como se describió en el Ejemplo
1. Un análisis mediante SDS-PAGE no mostró proteína sobreexpresada del esperado peso molecular en el testigo negativo ni en el cultivo inducido. El gen CAC0462 de C. acetobutylicum utilizaba muchos codones raros de E. coli. Para evitar problemas con la utilización de codones, se transformaron células BL21-AI que contenían el vector pDEST14CAC0462 con el plásmido pRARE (Novagen). Se repitieron los estudios de expresión con inducción por arabinosa con los cultivos que portaban el vector pRARE. Una proteína del peso molecular esperado de aproximadamente 46 kDa estaba presente en el cultivo inducido pero no en el testigo no inducido.
Se examinó la actividad trans-2-enoil-CoA reductasa del modo descrito por Hoffmeister et al. [J. Biol. Chem. 280, 4329-4338 (2005)]. En un ensayo típico, se determinó que la actividad específica de la proteína TER CAC0462 era 0,694 µmol mg-1 min-1 en el cultivo inducido frente a 0,0128 µmol mg-1 min-1 en el cultivo no inducido.
Ejemplo 6
Clonación y expresión de butiraldehído deshidrogenasa (acetilante)
La finalidad de este Ejemplo fue clonar el gen ald de C. beijerinckii (ATCC 35702) y hacer que se expresara en E. coli. El gen ald fue multiplicado a partir de DNA genómico de C. beijerinckii (ATCC 35702) usando la PCR.
Se clonó y expresó el gen ald usando el método descrito en el Ejemplo 1. Se multiplicó el gen ald a partir de DNA genómico de C. beijerinckii (ATCC 35702) (preparado a partir de cultivos anaeróbicamente desarrollados, como se describió en el Ejemplo 1) por PCR usando los cebadores N27 F1 y N28 R1 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 31 y 32, respectivamente, creándose un producto de 1,6 kbp. El cebador directo incorporaba cuatro bases (CACC) inmediatamente adyacentes al codón de inicio de la traducción para permitir la clonación direccional en pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen), para generar el plásmido pENTRSDD-TOPOald. Los clones fueron sometidos a secuenciación con los cebadores directo e inverso de M13, proporcionados como ID. SEC. números 45 y 46, respectivamente, para confirmar que los genes estaban insertados en la orientación correcta y para confirmar la secuencia. Se necesitaron cebadores de secuenciación adicionales, N31SeqF2 (ID. SEC. nº 59), N31SeqF3 (ID. SEC. nº 60), N31SeqF4 (ID. SEC. nº 61), N32SeqR1 (ID. SEC. nº 72), N31SeqR2 (ID. SEC. nº 62), N31SeqR3 (ID. SEC. nº 63), N31SeqR4 (ID. SEC. nº 64) y N31SeqR5 (ID. SEC. nº 65) (véase la Tabla 5) para secuenciar completamente el producto de PCR. Se proporcionan como ID. SEC. nº 11 e ID. SEC. nº 12, respectivamente, la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) para este gen y la prevista secuencia de aminoácidos de la enzima.
Para crear un clon de expresión, se transfirió el gen ald al vector pDEST 14 (Invitrogen) mediante recombinación para generar pDEST14ald. Se transformaron células BL21-AI con el vector pDEST14ald y se indujo la expresión desde el promotor de T7 mediante la adición de arabinosa, como se describió en el Ejemplo 1. Una proteína del peso molecular esperado de aproximadamente 51 kDa, según se dedujo a partir de la secuencia de ácido nucleico, estaba presente en el cultivo inducido pero no en el testigo no inducido.
Se determinó la actividad acilante aldehído deshidrogenasa controlando la formación de NADH, según se mide por el aumento de la absorbancia a 340 nm, del modo descrito por Husemann et al. [Appl. Microbiol. Biotechnol. 31: 435444 (1989)]. En un ensayo típico, se determinó que la actividad específica de la proteína Ald era 0,106 µmol mg-1 min-1 en el cultivo inducido frente a 0,01 µmol mg-1 min-1 en el cultivo no inducido.
Ejemplo 7
Clonación y expresión de butanol deshidrogenasa
La finalidad de este Ejemplo fue clonar el gen bdhB de C. acetobutylicum (ATCC 824) y hacer que se expresara en
E. coli. El gen bdhB fue multiplicado a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) usando la PCR.
Se clonó y expresó el gen bdhB usando el método descrito en el Ejemplo 1. Se multiplicó el gen bdhB a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por PCR usando los cebadores N11 y N12 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 25 y 26, respectivamente, creándose un producto de 1,2 kbp. El cebador directo incorporaba cuatro bases (CACC) inmediatamente adyacentes al codón de inicio de la traducción para permitir la clonación direccional en pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen), para generar el plásmido pENTRSDD-TOPObdhB. El codón de inicio de la traducción fue además cambiado de "GTG" a "ATG" por la secuencia del cebador. Los clones fueron sometidos a secuenciación con los cebadores directo e inverso de M13, proporcionados como ID. SEC. números 45 y 46, respectivamente, para confirmar que los genes estaban insertados en la orientación correcta y para confirmar la secuencia. Se necesitaron cebadores de secuenciación adicionales, N11SeqF1 (ID. SEC. nº 66), N11SeqF2 (ID. SEC. nº 67), N12SeqR1 (ID. SEC. nº 68) y N12SeqR2 (ID. SEC. nº 69) (véase la Tabla 5) para secuenciar completamente el producto de PCR. Se proporcionan como ID. SEC. nº 13 e ID. SEC. nº 14, respectivamente, la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) para este gen y la prevista secuencia de aminoácidos de la enzima.
Para crear un clon de expresión, se transfirió el gen bdhB al vector pDEST 14 (Invitrogen) mediante recombinación para generar pDEST14bdhB. Se transformaron células BL21-AI con el vector pDEST14bdhB y se indujo la expresión desde el promotor de T7 mediante la adición de arabinosa, como se describió en el Ejemplo 1. Una proteína del peso molecular esperado de aproximadamente 43 kDa, según se dedujo a partir de la secuencia de ácido nucleico, estaba presente en el cultivo inducido pero no en el testigo no inducido.
Se determinó la actividad butanol deshidrogenasa a partir de la velocidad de oxidación de NADH, según se mide por la disminución de la absorbancia a 340 nm, del modo descrito por Husemann y Papoutsakis, supra. En un ensayo típico, se determinó que la actividad específica de la proteína BdhB era 0,169 µmol mg-1 min-1 en el cultivo inducido frente a 0,022 µmol mg-1 min-1 en el cultivo no inducido.
Ejemplo 8
Clonación y expresión de butanol deshidrogenasa
La finalidad de este Ejemplo fue clonar el gen bdhA de C. acetobutylicum 824 y hacer que se expresara en E. coli. El gen bdhA fue multiplicado a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum 824 usando la PCR.
Se clonó y expresó el gen bdhA usando el método descrito en el Ejemplo 1. Se multiplicó el gen bdhA a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum 824 por PCR usando los cebadores N9 y N10 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 23 y 24, respectivamente, creándose un producto de 1,2 kbp. El cebador directo incorporaba cuatro bases (CACC) inmediatamente adyacentes al codón de inicio de la traducción para permitir la clonación direccional en pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen), para generar el plásmido pENTRSDD-TOPObdhA. Los clones, proporcionados como ID. SEC. números 45 y 46, respectivamente, para confirmar que los genes estaban insertados en la orientación correcta y para confirmar la secuencia. Se necesitaron cebadores de secuenciación adicionales, N9SeqF1 (ID. SEC. nº 70 y N10SeqR1 (ID. SEC. nº 71) (véase la Tabla 5) para secuenciar completamente el producto de PCR. Se proporcionan como ID. SEC. nº 15 e ID. SEC. nº 16, respectivamente, la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) para este gen y la prevista secuencia de aminoácidos de la enzima.
Para crear un clon de expresión, se transfirió el gen bdhA al vector pDEST 14 (Invitrogen) mediante recombinación para generar pDEST14bdhA. Se transformaron células BL21-AI con el vector pDEST14bdhA y se indujo la expresión desde el promotor de T7 mediante la adición de arabinosa, como se describió en el Ejemplo 1. Una proteína del peso molecular esperado de aproximadamente 43 kDa, según se dedujo a partir de la secuencia de ácido nucleico, estaba presente en el cultivo inducido pero no en el testigo no inducido.
Se determinó la actividad butanol deshidrogenasa a partir de la velocidad de oxidación de NADH, según se mide por la disminución de la absorbancia a 340 nm, del modo descrito por Husemann y Papoutsakis, supra. En un ensayo típico, se determinó que la actividad específica de la proteína BdhA era 0,102 µmol mg-1 min-1 en el cultivo inducido frente a 0,028 µmol mg-1 min-1 en el cultivo no inducido.
Ejemplo 9
Construcción de un vector de transformación para los genes de la ruta biosintética del 1-butanol – Ruta inferior
Para construir un vector de transformación que comprenda los genes que codifican los seis pasos de la ruta biosintética del 1-butanol, los genes que codifican los 6 pasos de la ruta fueron divididos en dos operones. La ruta superior comprende los cuatro primeros pasos, catalizados por la acetil-CoA acetiltransferasa, la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, la crotonasa y la butiril-CoA deshidrogenasa. La ruta inferior comprende los dos últimos pasos, catalizados por la butiraldehído deshidrogenasa y la butanol deshidrogenasa.
La finalidad de este Ejemplo fue construir el operón de la ruta inferior. La construcción del operón de la ruta superior se describe en el Ejemplo 10.
Se multiplicaron los genes individuales por PCR con cebadores que llevaban incorporados sitios de restricción para una clonación posterior, y los cebadores directos contenían un sitio optimizado de unión al ribosoma de E. coli (AAAGGAGG). Los productos de PCR fueron TOPO-clonados en el vector pCR4Blunt-TOPO y se utilizaron para transformar células E. coli Top10 (Invitrogen). Se preparó DNA plasmídico a partir de los clones TOPO y se verificó la secuencia de los genes. Se utilizaron enzimas de restricción y DNA ligasa de T4 (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, EE.UU.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para los experimentos de clonación, se purificaron los fragmentos de restricción mediante electroforesis en gel usando el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen).
Después de la confirmación de la secuencia, los genes fueron subclonados en un vector pUC19 modificado como una plataforma de clonación. El vector pUC19 fue modificado mediante una digestión con HindIII/SapI, creándose pUC19dHS. La digestión separó el promotor lac adyacente al sitio de clonación múltiple (MCS; del inglés, multiple cloning site), evitándose la transcripción de los operones en el vector.
Se multiplicó el gen ald a partir de DNA genómico de C. beijerinckii ATCC 35702 por PCR usando los cebadores N58 y N59 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 41 y 42, respectivamente, creándose un producto de 1,5 kbp. El cebador directo llevaba incorporados los sitios de restricción AvaI y BstEII y un sitio de unión al ribosoma (RBS; del inglés, ribosome binding site). El cebador inverso llevaba incorporado el sitio de restricción HpaI. El producto de PCR fue clonado en pCRBlunt II-TOPO, creándose pCRBluntII-ald. Se preparó DNA plasmídico a partir de los clones TOPO y se verificó la secuencia de los genes con los cebadores M13 Directo (ID. SEC. nº 45), M13 Inverso (ID. SEC. nº 46), N31SeqF2 (ID. SEC. nº 59), N31SeqF3 (ID. SEC. nº 60), N31SeqF4 (ID. SEC. nº 61), N32SeqR1 (ID. SEC. nº 72), N31SeqR2 (ID. SEC. nº 62), N31SeqR3 (ID. SEC. nº 63), N31SeqR4 (ID. SEC. nº 64) y N31SeqR5 (ID. SEC. nº 65) (véase la Tabla 5).
Se multiplicó el gen bdhB a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por PCR usando los cebadores N64 y N65 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 43 y 44, respectivamente, creándose un producto de 1,2 kbp. El cebador directo llevaba incorporados un sitio de restricción HpaI y un RBS. El cebador inverso llevaba incorporados un PmeI y un sitio de restricción SphI. El producto de PCR fue clonado en pCRBlunt II-TOPO, creándose pCRBluntII-bdhB. Se preparó DNA plasmídico a partir de los clones TOPO y se verificó la secuencia de los genes con los cebadores M13 Directo (ID. SEC. nº 45), M13 Inverso (ID. SEC. nº 46), N11SeqF1 (ID. SEC. nº 66), N11SeqF2 (ID. SEC. nº 67), N12SeqR1 (ID. SEC. nº 68) y N12SeqR2 (ID. SEC. nº 69) (véase la Tabla 5).
Para construir el operón de la ruta inferior, se ligaron conjuntamente un fragmento SphI y HpaI de 1,2 kbp de pCRBluntII-bhdB, un fragmento HpaI y SphI de 1,4 kbp de pCRBluntII-ald, y el fragmento grande de una digestión de pUC19dHS con AvaI y SphI. La ligación de tres vías creó pUC19dHS-ald-bdhB.
El vector pUC19dHS-ald-bdhB fue digerido con BstEII y PmeI, liberándose un fragmento de 2,6 kbp que fue clonado en pBenBP, un vector lanzadera de E. coli-Bacillus subtilis. El plásmido pBenBP se creó por modificación del vector pBE93, que es descrito por Nagarajan, Documento WO 93/24631 (Ejemplo 4). El promotor de la proteasa neutra (NPR), la secuencia señal y el gen phoA de Bacillus amyloliquefaciens fueron separados de pBE93 mediante una digestión con NcoI/HindIII. El promotor NPR fue multiplicado por PCR de pBE93 mediante los cebadores BenF y BenBPR, proporcionados por las ID. SEC. números 73 y 75, respectivamente. El cebador BenBPR llevaba incorporados sitios BstEII, PmeI y HindIII cadena abajo del promotor. El producto de PCR fue digerido con NcoI y HindIII, y el fragmento fue clonado en los correspondientes sitios del vector pBE93 para crear pBenBP. El fragmento de operón inferior fue subclonado en los sitios BstEII y PmeI de pBenBP, creándose pBen-ald-bdhB.
Se llevaron a cabo ensayos de actividades butiraldehído deshidrogenasa y butanol deshidrogenasa sobre extractos crudos usando los métodos anteriormente descritos. Se demostraron ambas actividades enzimáticas en niveles superiores a los de la cepa testigo que contenía un vector vacío.
Ejemplo 10 (profético)
Construcción de un vector de transformación para los genes de la ruta biosintética del 1-butanol – Ruta superior
La finalidad de este Ejemplo profético es describir cómo ensamblar el operón de la ruta superior. El planteamiento general es igual al descrito en el Ejemplo 9.
Se multiplica el gen thlA a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por PCR usando el par de cebadores N44 y N45 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 33 y 34, respectivamente, creándose un producto de 1,2 kbp. El cebador directo lleva incorporados un sitio de restricción SphI y un sitio de unión al ribosoma (RBS). El cebador inverso lleva incorporados sitios de restricción AscI y PstI. El producto de PCR es clonado en pCR4 Blunt-TOPO, creándose pCR4 Blunt-TOPO-thlA. Se prepara DNA plasmídico a partir de los clones TOPO y se verifica la secuencia de los genes con los cebadores M13 Directo (ID. SEC. nº 45), M13 Inverso (ID. SEC. nº 46), N7SeqF1 (ID. SEC. nº 47) y N7SeqR1 (ID. SEC. nº 48) (véase la Tabla 5).
Se multiplica el gen hbd a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por PCR usando el par de cebadores N42 y N43 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 35 y 36, respectivamente, creándose un producto de 0,9 kbp. El cebador directo lleva incorporados un sitio de restricción SalI y un RBS. El cebador inverso lleva incorporado un sitio de restricción SphI. El producto de PCR es clonado en pCR4 Blunt-TOPO, creándose pCR4 Blunt-TOPO-hbd. Se prepara DNA plasmídico a partir de los clones TOPO y se verifica la secuencia de los genes con los cebadores M13 Directo (ID. SEC. nº 45), M13 Inverso (ID. SEC. nº 46), N5SeqF2 (ID. SEC. nº 51) y N6SeqR2 (ID. SEC. nº 52) (véase la Tabla 5).
El gen CAC0462 es optimizado en cuanto a codones para expresión en E. coli como huésped primario y B. subtilis como huésped secundario. El nuevo gen llamado CaTER, proporcionado como ID. SEC. nº 76, es sintetizado por GenScript Corp. (Piscataway, New Jersey, EE.UU.). El gen CaTER es clonado en el vector pUC57 como un fragmento BamHI-SalI e incluye un RBS, produciéndose el plásmido pUC57-CaTER.
Se multiplica el gen crt a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por PCR usando el par de cebadores N38 y N39 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 39 y 40, respectivamente, creándose un producto de 834 bp. El cebador directo lleva incorporados sitios de restricción EcoRI y MluI y un RBS. El cebador inverso lleva incorporado un sitio de restricción BamHI. El producto de PCR es clonado en pCR4 Blunt-TOPO, creándose pCR4 Blunt-TOPO-crt. Se prepara DNA plasmídico a partir de los clones TOPO y se verifica la secuencia de los genes con los cebadores M13 Directo (ID. SEC. nº 45) y M13 Inverso (ID. SEC. nº 46) (véase la Tabla 5).
Después de la confirmación de la secuencia, los genes son subclonados en un vector pUC19 modificado como una plataforma de clonación. El vector pUC19 fue modificado mediante una digestión con SphI/SapI, creándose pUC19dSS. La digestión separó el promotor lac adyacente al MCS, evitándose la transcripción de los operones en el vector.
Para construir el operón de la ruta superior, se digiere pCR4 Blunt-TOPO-crt con EcoRI y BamHI, liberándose un fragmento de crt de 0,8 kbp. También se digiere el vector pUC19dSS con EcoRI y BamHI, liberándose un fragmento de vector de 2,0 kbp. El fragmento de crt y el fragmento de vector son ligados entre sí utilizando DNA ligasa de T4 (New England Biolabs) para formar pUC19dSS-crt. Se inserta el gen CaTER en pUC19dSS-crt digiriendo pUC57-CaTER con BamHI y SalI, liberándose un fragmento de CaTER de 1,2 kbp. Se digiere pUC19dSS-crt con BamHI y SalI y se liga el fragmento grande del vector con el fragmento de CaTER, creándose pUC19dSS-crt-CaTER. Para completar el operón, se ligan un fragmento SalI y SphI de 884 bp de pCR4 Blunt-TOPO-hbd, un fragmento SphI y PstI de 1,2 kb de thlA de pCR4 Blunt-TOPO-thlA, y el fragmento grande de una digestión de pUC19dSS-crt-CaTER con SalI y PstI. El producto de la ligación de 3 vías es pUC19dSS-crt-CaTER-hbd-thlA.
Se digiere el vector pUC19dSS-crt-CaTER-hbd-thlA con MluI y AscI, liberándose un fragmento de 4,1 kbp que es clonado en un derivado de pBE93 (Caimi, Documento WO 2004/018645, páginas 39-40), un vector lanzadera de E. coli-B. subtilis, al que se hace referencia como pBenMa. El plásmido pBenMA fue creado por modificación del vector pBE93. El promotor de la proteasa neutra (NPR), la secuencia señal y el gen phoA de Bacillus amyloliquefaciens son separados de pBE93 mediante una digestión con NcoI/HindIII. El promotor NPR es multiplicado por PCR de pBE93 mediante los cebadores BenF y BenMAR, proporcionados como ID. SEC. números 73 y 74, respectivamente. El cebador BenMAR lleva incorporados sitios MluI, AscI y HindIII cadena abajo del promotor. El producto de PCR es digerido con NcoI y HindIII, y el fragmento es clonado en los correspondientes sitios del vector pBE93, creándose pBenMA. El fragmento de operón superior es subclonado en los sitios MluI y AscI de pBenMa, creándose pBen-crthbd-CaTER-thlA.
Ejemplo 11 (profético)
Expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en E. coli
La finalidad de este Ejemplo profético es describir cómo hacer que se exprese la ruta biosintética del 1-butanol en E. coli.
Se transforma E. coli NM522 (ATCC 47000) con los plásmidos pBen-crt-hbd-CaTER-thlA y pBen-ald-bdhB, construidos del modo descrito en los Ejemplos 10 y 9, respectivamente, y se controla la expresión de los genes en cada operón mediante análisis por SDS-PAGE, ensayo enzimático y análisis Western. Para los análisis Western, se generan anticuerpos hacia péptidos sintéticos en Sigma-Genosys (The Woodlands, Texas, EE.UU.). Después de la confirmación de la expresión de todos los genes, se digiere pBen-ald-bdhB con EcoRI y PmeI para liberar el fragmento de promotor NPR-ald-bdhB. La digestión del fragmento con EcoRI produce extremos romos al utilizar el fragmento Klenow de DNA polimerasa (New England Biolabs; número de catálogo: M0210S). El plásmido pBen-crthbd-CaTER-thlA es digerido con PvuII para crear un fragmento de vector linealizado de extremos romos. Se ligan el vector y el fragmento de NPR-ald-bdhB, creándose p1B1 O.1 y p1B1 O.2, que contienen la ruta biosintética completa del 1-butanol con el fragmento de promotor NPR-ald-bdhB en orientaciones opuestas. Se transforma E. coli NM522 con los plásmidos p1B1 O.1 y p1B1 O.2 y se controla la expresión de los genes del modo previamente descrito.
Se inocula la cepa NM522 de E. coli/p1B1 O.1 o NM522/ p1B1 O.1 a un matraz para sacudimiento de 250 ml de capacidad que contiene 50 ml de medio y se sacude el matraz a 250 rpm y 35 °C. El medio está compuesto de: 5 g/l de dextrosa; MOPS 0,05 M; sulfato amónico 0,01 M; fosfato potásico monobásico 0,005 M; mezcla S10 de metales al 1 % (v/v); extracto de levadura al 0,1 % (p/v); ácidos Casamino al 0,1 % (p/v); 0,1 mg/l de tiamina; 0,05 mg/l de prolina; y 0,002 mg/l de biotina; y es titulado hasta un pH de 7,0 con KOH. La mezcla S10 de metales contiene: MgCl2 200 mM, CaCl2 70 mM, MnCl2 5 mM, FeCl3 0,1 mM, ZnCl2 0,1 mM, hidrocloruro de tiamina 0,2 mM, CuSO4 172 µM, CoCl2 253 µM y Na2MoO4 242 µM. Después de un periodo de 18 a 24 horas, se detecta 1-butanol mediante análisis por HPLC o GC, como se describe en la sección Métodos Generales.
Ejemplo 12 (profético)
Expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en Bacillus subtilis
La finalidad de este Ejemplo profético es describir cómo hacer que se exprese la ruta biosintética del 1-butanol en Bacillus subtilis. Se utiliza un planteamiento igual al descrito en el Ejemplo 11.
Se utilizan los operones superior e inferior construidos del modo descrito en los Ejemplos 10 y 9, respectivamente. Se transforma Bacillus subtilis BE1010 [J. Bacteriol. 173: 2278-2282 (1991)] con los plásmidos p1B1 O.1 y p1B1 O.2 y se controla la expresión de los genes en cada operón del modo descrito en el Ejemplo 11.
Se inocula la cepa B1010 de B. subtilis/p1B1 O.1 o BE1010/ p1B1 O.2 a un matraz para sacudimiento de 250 ml de capacidad que contiene 50 ml de medio y se sacude el matraz a 250 rpm y 35 °C durante 18 horas. El medio está compuesto de: 5 g/l de dextrosa; MOPS 0,05 M; ácido glutámico 0,02 M, sulfato amónico 0,01 M; tampón de fosfato potásico monobásico 0,005 M; mezcla S10 de metales (como la descrita en el Ejemplo 11) al 1 % (v/v); extracto de levadura al 0,1 % (p/v); ácidos Casamino al 0,1 % (p/v); 50 mg/l de triptófano; 50 mg/l de metionina; y 50 mg/l de lisina; y es titulado hasta un pH de 7,0 con KOH. Después de un periodo de 18 a 24 horas, se detecta 1-butanol mediante análisis por HPLC o GC, como se describe en la sección Métodos Generales.
Ejemplo 13
Producción de 1-butanol a partir de glucosa usando E. coli recombinante
En este Ejemplo se describe la producción de 1-butanol en E. coli. La expresión de los genes que codifican los 6 pasos de la ruta biosintética del 1-butanol fue dividida en tres operones. La ruta superior comprendía los cuatro primeros pasos codificados por thlA, hbd, crt y EgTER en un operón. El paso siguiente, codificado por ald, fue proporcionado por un segundo operón. El último paso de la ruta, codificado por yqhD, fue proporcionado en un tercer operón. Se demostró la producción de 1-butanol en cepas de E. coli que comprenden los tres operones.
A menos que se indique otra cosa en el texto, a los cebadores de clonación descritos en este Ejemplo se hace referencia por sus números de ID. SEC. en la Tabla 4, y a los cebadores de secuenciación y de exploración por PCR se hace referencia por sus números de ID. SEC. en la Tabla 5.
Acetil-CoA acetiltransferasa. Se multiplicó el gen thlA a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por PCR usando el par de cebadores N44 y N45 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 33 y 34, respectivamente, creándose un producto de 1,2 kbp. El cebador directo llevaba incorporados un sitio de restricción SphI y un sitio de unión al ribosoma (RBS). El cebador inverso llevaba incorporados sitios de restricción AscI y PstI. El producto de PCR fue clonado en pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen Corp., Carlsbad, California, EE.UU.), creándose pCR4Blunt-TOPO-thlA. Se preparó DNA plasmídico a partir de los clones TOPO y se verificó la secuencia de los genes con los cebadores M13 Directo (ID. SEC. nº 45), M13 Inverso (ID. SEC. nº 46), N7SeqF1 (ID. SEC. nº 47) y N7SeqR1 (ID. SEC. nº 48) (véase la Tabla 5).
3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa. Se multiplicó el gen hbd a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por PCR usando el par de cebadores N42 y N43 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 35 y 36, respectivamente, creándose un producto de 0,9 kbp. El cebador directo llevaba incorporados un sitio de restricción SalI y un RBS. El cebador inverso llevaba incorporado un sitio de restricción SphI. El producto de PCR fue clonado en pCR4Blunt-TOPO, creándose pCR4Blunt-TOPO-hbd. Se preparó DNA plasmídico a partir de los clones TOPO y se verificó la secuencia de los genes con los cebadores M13 Directo (ID. SEC. nº 45), M13 Inverso (ID. SEC. nº 46), N5SeqF2 (ID. SEC. nº 51) y N6SeqR2 (ID. SEC. nº 52) (véase la Tabla 5).
Crotonasa. Se multiplicó el gen crt a partir de DNA genómico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por PCR usando el par de cebadores N38 y N39 (véase la Tabla 4), proporcionados como ID. SEC. números 39 y 40, respectivamente, creándose un producto de 834 bp. El cebador directo llevaba incorporados sitios de restricción EcoRI y MluI y un RBS. El cebador inverso llevaba incorporado un sitio de restricción BamHI. El producto de PCR fue clonado en pCR4Blunt-TOPO, creándose pCR4Blunt-TOPO-crt. Se preparó DNA plasmídico a partir de los clones TOPO y se verificó la secuencia de los genes con los cebadores M13 Directo (ID. SEC. nº 45) y M13 Inverso (ID. SEC. nº 46) (véase la Tabla 5).
Butiril-CoA deshidrogenasa (trans-2-enoil-CoA reductasa). Se sintetizó el gen CAC0462 para utilización potenciada de codones en E. coli como huésped primario y en B. subtilis como huésped secundario. El nuevo gen (CaTER, ID. SEC. nº 76) fue sintetizado y clonado por GenScript Corporation (Piscataway, New Jersey, EE.UU.) en el vector pUC57 como un fragmento BamHI-SalI e incluye un RBS.
Se sintetizó un gen alternativo para butiril-CoA deshidrogenasa a partir de Euglena gracilis (TER, nº de GenBank: Q5EU90) para utilización potenciada de codones en E. coli y Bacillus subtilis. El gen fue sintetizado y clonado por GenScript Corporation en pUC57, creándose pUC57::EgTER. Los cebadores N85 y N86 (ID. SEC. números 80 y 81, respectivamente) junto con pUC57::EgTER como DNA molde, proporcionaron un fragmento de PCR que comprendía 1224 bp de DNA de pUC57::EgTER. La secuencia de los 1224 bp se proporciona como ID. SEC. nº 77, donde los bp 1-1218 son la secuencia de codificación (cds) de EgTER(opt). EgTER(opt) es un gen TER optimizado en cuanto a codones, que carece de la presecuencia mitocondrial normal para ser funcional en E. coli [Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280: 4329 (2005)].
Se clonó EgTER(opt) en pCR4Blunt-TOPO y se confirmó su secuencia con los cebadores M13 Directo (ID. SEC. nº 45) y M13 Inverso (ID. SEC. nº 46). Se necesitaron los cebadores de secuenciación adicionales N62SeqF2 (ID. SEC. nº 114), N62SeqF3 (ID. SEC. nº 115), N62SeqF4 (ID. SEC. nº 116), N63SeqR1 (ID. SEC. nº 117), N63SeqR2 (ID. SEC. nº 118), N63SeqR3 (ID. SEC. nº 119) y N63SeqR4 (ID. SEC. nº 120) para secuenciar completamente el producto de PCR. La secuencia de EgTER(opt) de 1,2 kbp fue luego escindida con HincII y PmeI y fue clonada en pET23+ (Novagen) linealizado con HincII. La orientación del gen EgTER(opt) con respecto al promotor fue confirmada mediante una exploración de colonias por PCR con los cebadores T7Primer y N63SeqR2 (ID. SEC. números 82 y 118, respectivamente). Para los estudios de expresión, se transformó BL21 (DE3) con el plásmido resultante, pET23+::EgTER(opt).
Se examinó la actividad trans-2-enoil-CoA reductasa del modo descrito por Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280: 4329 (2005). En un ensayo típico, se determinó que la actividad específica de la proteína EgTER(opt) era 1,9 µmol mg-1 min-1 en el cultivo inducido de BL21 (DE3)/pET23+::EgTER(opt) frente a 0,547 µmol mg-1 min-1 en el cultivo no inducido.
El gen EgTER(opt) fue luego clonado en el vector pTrc99a bajo el control del promotor trc. El gen EgTER(opt) fue aislado como un fragmento BamHI/SalI de 1287 bp de pET23+::EgTER(opt). El vector pTrc99a de 4,2 kbp fue linealizado con BamHI/SalI. Se ligaron el vector y el fragmento, creándose pTrc99a-EgTER(opt) de 5,4 kbp. Se confirmaron los clones positivos mediante PCR de colonias con los cebadores Trc99aF y N63SeqR3 (ID. SEC. números 83 y 119, respectivamente), produciéndose un producto de 0,5 kb.
Construcción del plásmido pTrc99a-E-C-H-T que comprende genes que codifican acetil-CoA acetiltransferasa (thlA), 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (hbd), crotonasa (crt) y butiril-CoA deshidrogenasa [trans-2-enoil-CoA reductasa, EgTER(opt)]. Para iniciar la construcción de un operón de cuatro genes que comprende la ruta superior [EgTER(opt), crt, hbd y thlA], se digirió pCR4Blunt-TOPO-crt con EcoRI y BamHI, liberándose un fragmento de crt de 0,8 kbp. También se digirió el vector pUC19dSS (descrito en el Ejemplo 10) con EcoRI y BamHI, liberándose un fragmento de vector de 2,0 kbp. El fragmento de crt y el fragmento de vector fueron ligados entre sí utilizando DNA ligasa de T4 (New England Biolabs) para formar pUC19dSS-crt. Se insertó el gen CaTER en pUC19dSS-crt digiriendo pUC57-CaTER con BamHI y SalI, liberándose un fragmento de CaTER de 1,2 kbp. Se digirió pUC19dSScrt con BamHI y SalI y se ligó el fragmento grande del vector con el fragmento de CaTER, creándose pUC19dSS-crt-CaTER. Para completar el operón, se ligaron un fragmento SalI y SphI de 884 bp de pCR4Blunt-TOPO-hbd, un fragmento SphI y PstI de 1,2 kb de thlA de pCR4Blunt-TOPO-thlA, y el fragmento grande de una digestión de pUC19dSS-crt-CaTER con SalI y PstI. El producto de la ligación de 3 vías fue denominado pUC19dSS-crt-CaTERhbd-thlA o pUC19dss::Operon1.
Se obtuvo mayor actividad butiril-CoA deshidrogenasa de pTrc99a-EgTER(opt) que de construcciones de CaTER, por lo que se construyó un operón derivado de pTrc99a-EgTER(opt). Se separó el gen CaTER de pUC19dss::Operon1 digiriendo con BamHI/SalI y purificando en gel el fragmento de vector de 5327 bp. El vector fue tratado con Klenow y fue vuelto a ligar, creándose pUC19dss::Operon 1 ΔCaTER. El fragmento de crt-hbd-thlA (C-H-T) de 2934 bp fue luego aislado como un fragmento EcoRI/PstI de pUC19dss::Operon 1 ΔCaTER. El fragmento de C-H-T fue tratado con Klenow para hacer romos los extremos. Se digirió el vector pTrc99a-EgTER(opt) con SalI y se trataron los extremos con Klenow. El vector de extremos romos y el fragmento de C-H-T de extremos romos fueron ligados para crear pTrc99a-E-C-H-T. Se llevaron a cabo reacciones PCR de colonias con los cebadores N62SeqF4 y N5SeqF4 (ID. SEC. números 116 y 84, respectivamente) para confirmar la orientación del inserto.
Construcción de los plásmidos pBHR T7-ald y pBHR-Ptrc-ald(opt) que comprenden genes que codifican butiraldehído deshidrogenasa [ald y ald(opt)]. El operón PT7-ald fue subclonado de pDEST14-ald (Ejemplo 6) en el plásmido pBHR1 de amplia variedad de huéspedes (MoBitec, Goettingen, Alemania) para crear pBHR1 PT7-ald. El plásmido pBHR1 es compatible con plásmidos pUC19 o pBR322, por lo que se puede utilizar pBHR1 PT7-ald en combinación con derivados de pUC19 o pBR322 que portan el operón de la ruta superior para la producción de 1butanol en E. coli. El plásmido pDEST14-ald fue digerido con BglII y fue tratado con el fragmento Klenow de DNA polimerasa para crear extremos romos. Luego se digirió el plásmido con EcoRI y se purificó en gel el fragmento de PT7-ald de 2245 bp. Se digirió el plásmido pBHR1 con ScaI y EcoRI y se purificó en gel el fragmento de 4883 bp. El fragmento de PT7-ald fue ligado con el vector pBHR1, creándose pBHR T7-ald. La multiplicación de los transformantes mediante PCR de colonias con los cebadores T-ald(BamHI) y B-ald(EgTER) (ID. SEC. números 85 y 86, respectivamente) confirmó el esperado producto de PCR de 1,4 kb. El mapeo de restricción de los clones pBHR T7-ald con EcoRI y DrdI confirmó los esperados fragmentos de 4757 y 2405 bp.
Para los ensayos de actividad butiraldehído deshidrogenasa, se transformaron células BL21Star™ (DE3) (Invitrogen) con el plásmido pBHR T7-ald y se indujo la expresión a partir del promotor de T7 mediante la adición de Larabinosa, como se describió en el Ejemplo 1. Se determinó la actividad aldehído deshidrogenasa acilante controlando la formación de NADH, según se mide por el aumento de la absorbancia a 340 nm, como se describió en el Ejemplo 6.
Una secuencia de DNA alternativa para el gen ald de Clostridium beijerinckii ATCC 35702 fue sintetizada (optimizando para utilización de codones en E. coli y Bacillus subtilis) y clonada en pUC57 por GenScript Corporation (Piscataway, New Jersey, EE.UU.), creándose el plásmido pUC57-ald(opt). Se digirió pUC57-ald(opt) con SacI y SalI para liberar un fragmento de 1498 bp que comprendía el gen optimizado en cuanto a codones, ald(opt), y un RBS ya para E. coli. La secuencia del fragmento de 1498 bp se proporciona como ID. SEC. nº 78.
Se digirió pTrc99a con SacI y SalI obteniéndose un fragmento de vector de 4153 bp, que fue ligado con el fragmento de ald(opt) de 1498 bp para crear pTrc-ald(opt). La expresión del gen sintético, ald(opt), está bajo el control del promotor Ptrc inducible por IPTG.
El operón Ptrc-ald(opt) fue subclonado en el plásmido pBHR1 (MoBitec) de amplia variedad de huéspedes con objeto de que fuera compatible con el plásmido de la ruta superior anteriormente descrito. El fragmento de Ptrcald(opt) fue multiplicado por PCR a partir de pTrc99A::ald(opt) con T-Ptrc(BspEI) y B-aldopt(ScaI) (ID. SEC. números 87 y 88, respectivamente) que llevaban incorporados sitios de restricción BspEI y ScaI dentro de los correspondientes cebadores. El producto de PCR fue digerido con BspEI y ScaI. Se digirió el plásmido pBHR1 con ScaI y BspEI y se purificó en gel el fragmento de 4883 bp. El fragmento de Ptrc-ald(opt) fue ligado con el vector pBHR1, creándose pBHR-PcatPtrc-ald(opt). El mapeo de restricción de los clones pBHR-PcatPtrc-ald(opt) con ScaI y BspEI confirmó los esperados fragmentos de 4883 y 1704 bp. Para separar la región del promotor cat portado por el plásmido (Pcat), se digirió el plásmido pBHR-PcatPtrc-ald(opt) con BspEI y AatII y se purificó en gel el fragmento de 6172 bp. Se mezclaron T-BspEIAatII y B-BspEIAatII (ID. SEC. números 89 y 90, respectivamente) en una disolución que contenía NaCl 50 mM, Tris 10 mM-HCl y MgCl2 10 mM (pH de 7,9) hasta una concentración final de 100 µM y se hibridaron mediante una incubación a 75 °C durante 5 minutos y un lento enfriamiento hasta la
5 temperatura ambiental. Los oligonucleótidos hibridados fueron ligados con el fragmento de 6172 bp, creándose pBHR-Ptrc-ald(opt).
Construcción de cepas de E. coli que expresan butanol deshidrogenasa (yqhD). E. coli contiene un gen nativo (yqhD) que fue identificado como una 1,3-propanodiol deshidrogenasa (Patente de EE.UU. nº 6.514.733). El gen yqhD tiene una identidad del 40% con el gen adhB de Clostridium, una probable butanol deshidrogenasa 10 dependiente de NADH. El gen yqhD fue puesto bajo la expresión constitutiva de una variante del promotor 1.6GI de glucosa isomerasa (ID. SEC. nº 91) en la cepa MG1655 1.6yqhD::Cm de E. coli (Documento WO 2004/033646) usando la tecnología λ Red [Datsenko y Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 6640 (2000)]. Similarmente, el promotor nativo fue sustituido por el promotor 1.5GI (Documento WO 2003/089621) (ID. SEC. nº 92), creándose la cepa MG1655 1.5GI-yqhD::Cm, reemplazándose de este modo el promotor 1.6GI de MG1655 1.6yqhD::Cm por el
15 promotor 1.5GI.
Se preparó un lisado de P1 a partir de MG1655 1.5GI-yqhD::Cm y se trasladó el casete a las cepas de expresión MG1655 (DE3), preparada a partir de la cepa MG1655 de E. coli y un kit de lisogenización lambda DE3 (Invitrogen), y BL21 (DE3) (Invitrogen), creándose MG1655 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm y BL21 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm, respectivamente.
20 Demostración de la producción de 1-butanol a partir de E. coli recombinante. Se transformó la cepa MG1655 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm de E. coli con los plásmidos pTrc99a-E-C-H-T y pBHR T7-ald para producir la cepa MG1655 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald. Se cultivaron inicialmente dos productos de aislamiento independientes en medio LB que contenía 50 µg/ml de kanamicina y 100 µg/ml de carbenicilina. Se inocularon las células a matraces para sacudimiento (volumen total de aproximadamente 175 ml) que contenían 15, 50 y 150 ml de
25 medio TM3a/glucosa (con antibióticos apropiados) para que representaran unas condiciones de alto, medio y bajo nivel de oxígeno, respectivamente. El medio TM3a/glucosa contenía (por litro): 10 g de glucosa, 13,6 g de KH2PO4, 2,0 g de monohidrato de ácido cítrico, 3,0 g de (NH4)2SO4, 2,0 g de MgSO4·7H2O, 0,2 g de CaCl2·2H2O, 0,33 g de citrato férrico amónico, 1,0 mg de tiamina·HCl, 0,50 g de extracto de levadura y 10 ml de una disolución de oligoelementos, con el pH ajustado a 6,8 con NH4OH. La disolución de oligoelementos contenía: ácido cítrico·H2O
30 (4,0 g/l), MnSO4·H2O (3,0 g/l), NaCl (1,0 g/l), FeSO4·7H2O (0,10 g/l), CoCl2·6H2O (0,10 g/l), ZnSO4·7H2O (0,10 g/l), CuSO4·5H2O (0,010 g/l), H3BO3 (0,010 g/l) y Na2MoO4·2H2O (0,010 g/l). Los matraces recibieron el inóculo a una DO600 de partida ≤ 0,01 unidades y fueron incubados a 34 °C con sacudimiento a 300 rpm. Los matraces que contenían 15 y 50 ml de medio fueron tapados con tapas ventiladas; los matraces que contenían 150 ml fueron tapados con tapas no ventiladas para minimizar el intercambio de aire. Se añadió IPTG hasta una concentración
35 final de 0,04 mM; la DO600 de los matraces en el momento de la adición era ≥ 0,4 unidades.
Aproximadamente 15 horas después de la inducción, se analizó una parte alícuota del caldo en cuanto al contenido de 1-butanol mediante HPLC (columna Shodex Sugar SH1011) con detección por índice de refracción (RI) y mediante GC [columna Varian CP-WAX 58 (FFAP) CB, 25 m x 0,25 mm de diámetro interno x 0,2 µm de espesor de película] con detección por ionización por llama (FID), como se describe en la sección Métodos Generales. En la
40 Tabla 6 se exponen los resultados de las determinaciones de 1-butanol.
Tabla 6
Producción de 1-butanol por la cepa MG1655 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald de E. coli
Cepa
Nivel de O2 1-butanol, mM Rendimiento molar, %
MG1655 a
alto 0,11 0,2
MG1655 b
alto 0,12 0,2
MG1655 a
medio 0,13 0,3
MG1655 b
medio 0,13 0,2
MG1655 a
bajo 0,15 0,4
MG1655 b
bajo 0,18 0,5
– Los valores se determinaron mediante un análisis por HPLC. – Los sufijos "a" y "b" de la cepa indican productos de aislamiento independientes.
Se examinaron los dos productos de aislamiento independientes de MG1655 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald en cuanto a la producción de 1-butanol de un modo idéntico salvo por que el medio contenía 5 g/l de extracto de levadura. Los resultados se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7
Producción de 1-butanol por la cepa MG1655 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald de E. coli
Cepa
Nivel de O2 1-butanol, mM Rendimiento molar, %
MG1655 a
alto – –
MG1655 b
alto – –
MG1655 a
medio 0,08 0,1
MG1655 b
medio 0,06 0,1
MG1655 a
bajo 0,14 0,3
MG1655 b
bajo 0,14 0,3
– Se determinaron valores cuantitativos mediante un análisis por HPLC. – "–" = no detectado. – Los sufijos "a" y "b" de la cepa indican productos de aislamiento independientes.
Se transformó la cepa BL21 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm de E. coli con los plásmidos pTrc99a-E-C-H-T y pBHR T7-ald para producir la cepa BL21 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald. Se examinaron dos productos de aislamiento independientes en cuanto a la producción de 1-butanol de un modo exactamente igual al anteriormente descrito. Los resultados se presentan en las Tablas 8 y 9.
Tabla 8 Tabla 9
Producción de 1-butanol por la cepa BL21 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald de E. coli
Cepa
Nivel de O2 1-butanol, mM Rendimiento molar, %
DE a
alto + +
DE b
alto – –
DE a
medio 0,80 1,4
DE b
medio 0,77 1,4
DE a
bajo 0,06 0,2
DE b
bajo 0,07 0,2
– Se determinaron valores cuantitativos mediante un análisis por HPLC. – "–" indica no detectado. – "+" indica identificación cualitativa positiva por GC, con un menor límite de detección que por HPLC. – Los sufijos "a" y "b" de la cepa indican productos de aislamiento independientes.
Producción de 1-butanol por la cepa BL21 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald de E. coli
Cepa
Nivel de O2 1-butanol, mM Rendimiento molar, %
DE a
alto + +
DE b
alto + +
DE a
medio 0,92 1,7
DE b
medio 1,03 1,9
DE a
bajo + +
DE b
bajo + +
– Se determinaron valores cuantitativos mediante un análisis por HPLC. – "–" indica no detectado. – "+" indica identificación cualitativa positiva por GC, con un menor límite de detección que por HPLC. – Los sufijos "a" y "b" de la cepa indican productos de aislamiento independientes.
Se transformó la cepa MG1655 1.5GI-yqhD::Cm de E. coli con los plásmidos pTrc99a-E-C-H-T y pBHR-Ptrc-ald(opt) para producir la cepa MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt). Se cultivaron inicialmente dos productos de aislamiento en medio LB que contenía 50 µg/ml de kanamicina y 100 µg/ml de carbenicilina. Se 5 inocularon las células a matraces para sacudimiento (volumen total de aproximadamente 175 ml) que contenían 50 y 150 ml de medio TM3a/glucosa (con antibióticos apropiados). Los matraces recibieron el inóculo a una DO550 de partida ≤ 0,04 unidades y fueron incubados del modo anteriormente descrito, con y sin inducción. Se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,4 mM; la DO550 de los matraces en el momento de la adición estaba entre 0,6 y 1,2 unidades. En este caso, no fue necesaria inducción para la expresión de genes de la ruta del 1-butanol debido a
10 la pérdida de actividad de los promotores inducibles por IPTG y a la naturaleza constitutiva del promotor 1.5GI; sin embargo, la inducción proporcionó un intervalo de expresión más amplio.
Aproximadamente 15 horas después de la inducción, se analizó una parte alícuota del caldo en cuanto al contenido de 1-butanol mediante GC con detección por ionización por llama, como se describió anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 10. En cuanto a las cepas de E. coli recombinantes, se produjo 1-butanol en todos los
15 casos; en experimentos independientes, se mostró que cepas de E. coli de tipo silvestre no producen 1-butanol detectable (datos no mostrados).
Tabla 10
Producción de 1-butanol por la cepa MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt) de E. coli
Cepa
Nivel de O2 1-butanol, mM Inducción por IPTG
MG1655 a
medio 0,14 no
MG1655 b
medio 0,14 no
MG1655 a
medio 0,03 sí
MG1655 b
medio 0,07 sí
MG1655 a
bajo 0,04 no
Producción de 1-butanol por la cepa MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt) de E. coli
Cepa
Nivel de O2 1-butanol, mM Inducción por IPTG
MG1655 b
bajo 0,04 no
MG1655 a
bajo 0,02 sí
MG1655 b
bajo 0,03 sí
– Los sufijos "a" y "b" de la cepa indican productos de aislamiento independientes.
Ejemplo 14
Producción de 1-butanol a partir de glucosa usando B. subtilis recombinante
En este Ejemplo se describe la producción de 1-butanol en Bacillus subtilis. Los seis genes de la ruta 1-biosintética, que codifican seis actividades enzimáticas, fueron divididos en dos operones para expresión. Los tres primeros
5 genes de la ruta (thl, hbd y crt) se integraron en el cromosoma de Bacillus subtilis BE1010 [Payne y Jackson, J. Bacteriol. 173: 2278-2282 (1991)]. Los tres últimos genes (EgTER, ald y bdhB) fueron clonados en un plásmido de expresión y usados para transformar la cepa de Bacillus que porta los genes de 1-butanol integrados.
A menos que se indique otra cosa en el texto, a los cebadores de clonación descritos en este Ejemplo se hace referencia por sus números de ID. SEC. en la Tabla 4, y a los cebadores de secuenciación y de exploración por PCR
10 se hace referencia por sus números de ID. SEC. en la Tabla 5.
Plásmido de integración. El plásmido pFP988 es un vector de integración de Bacillus que contiene un replicón de pBR322 de E. coli, un marcador del antibiótico ampicilina para selección en E. coli y dos secciones de homología con respecto al gen sacB del cromosoma de Bacillus que dirige la integración del vector y la secuencia intermedia por recombinación homóloga. Entre las regiones de homología de SacB están el promotor Pamy y una secuencia
15 señal que pueden dirigir la síntesis y la secreción de un gen clonado, una etiqueta de His, y eritromicina como un marcador seleccionable para Bacillus. El promotor Pamy y la secuencia señal son de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens. La región promotora también contiene la secuencia lacO para regulación de la expresión por una proteína represora de lacI. La secuencia de pFP988 (6509 bp) se proporciona como ID. SEC. nº 79.
Puesto que los genes de la ruta del 1-butanol se iban a expresar en el citoplasma, se suprimió la secuencia señal de
20 amilasa. Se multiplicó el plásmido pFP988 con los cebadores Pamy/lacO F y Pamy/lacO R, creándose un producto de 317 bp (0,3 kbp) que contenía el promotor Pamy/lacO. El extremo 5' del cebador Pamy/lacO F llevaba incorporado un sitio de restricción BsrGI seguido de un sitio EcoRI. El extremo 5' del cebador Pamy/lacO R llevaba incorporado un sitio de restricción BsrGI seguido de un sitio de restricción PmeI. El producto de PCR fue TOPOclonado en pCR4Blunt-TOPO, creándose pCR4Blunt-TOPO-Pamy/lacO. Se preparó DNA plasmídico a partir de
25 cultivos nocturnos y se sometió a secuenciación con los cebadores M13 Directo y M13 Inverso (ID. SEC. nº 45 e ID. SEC. nº 46, respectivamente) para asegurar que no se había introducido mutación alguna en el promotor. Se digirió un clon de pCR4Blunt-TOPO-Pamy/lacO con BsrGI y se purificó en gel el fragmento de 0,3 kbp. Se digirió el vector pFP988 con BsrGI, lo que dio lugar a la supresión de 11 bp de la región 5' de homología de sacB y la separación del promotor Pamy/lacO y la secuencia señal y la etiqueta de His. El vector digerido con BsrGI, de 6 kbp, fue purificado
30 en gel y fue ligado con el inserto de Pamy/lacO BsrGI. Los plásmidos resultantes fueron explorados con los cebadores Pamy SeqF2 y Pamy SeqR para determinar la orientación del promotor. El clon correcto tenía restablecido el promotor Pamy/lacO en su orientación original y fue denominado pFP988Dss.
Se construyó el casete con los genes thl-crt por ayuste mediante extensión por solapamiento (SOE; del inglés, splicing by overlap extension). Se multiplicaron los genes usando pUC19dss::Operon1 como molde. Los cebadores 35 de thl fueron Top TF y Bot TR, produciéndose la multiplicación de un producto de 0,9 kbp. Los cebadores de crt fueron Top CF y Bot CR, produciéndose la multiplicación de un producto de 1,3 kbp. Se juntaron los dos genes mediante SOE con multiplicación por PCR usando los cebadores Top TF y Bot CR, generándose un producto de 2,1 kbp que fue TOPO-clonado en pCR4Blunt-TOPO, creándose pCR4Blunt-TOPO-T-C. Se sometieron los clones a secuenciación para confirmar la secuencia. Se digirió el plásmido pCR4Blunt-TOPO-T-C con BstEII y PmeI, 40 liberándose un fragmento de 2,1 kbp que fue purificado en gel. El inserto fue tratado con polimerasa Klenow para despuntar el sitio BstEII. Se digirió el vector pFP988Dss con PmeI y se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternera (New England BioLabs) para evitar la autoligación. Se ligaron el fragmento de thl-crt de 2,1 kbp y el vector pFP988Dss digerido, y con ellos se transformaron células de E. coli Top10. Se exploraron los transformantes mediante multiplicación por PCR con Pamy SeqF2 y N7SeqR2 para un producto de 0,7 kbp; el producto correcto fue
45 denominado pFP988Dss-T-C.
el gen hbd fue subclonado de pCR4Blunt-TOPO-hbd como un fragmento SalI/SpeI de 0,9 kbp. Se digirió el vector pFP988Dss-T-C con SalI y SpeI y se purificó en gel el fragmento de vector de 8 kbp. Se ligaron el vector y el inserto de hbd y se utilizaron para transformar células de E. coli Top10. Se exploraron los transformantes mediante multiplicación por PCR con los cebadores Pamy SeqF y N3SeqF3 para un fragmento de 3,0 kbp. El plásmido resultante fue denominado pFP988Dss-T-H-C.
El promotor Pamy fue posteriormente sustituido por el promotor Pspac del plásmido pMUTIN4 [Vagner et al., Microbiol. 144: 3097-3104 (1998)]. El promotor Pspac fue multiplicado de pMUTIN4 con los cebadores Spac F y Spac R como un producto de 0,4 kbp y fue TOPO-clonado en pCR4Blunt-TOPO. Los transformantes fueron explorados en cuanto a la presencia de un inserto de 0,5 kbp mediante multiplicación por PCR con los cebadores M13 Directo y M13 Inverso. Los clones positivos fueron sometidos a secuenciación con los mismos cebadores. Se digirió el plásmido pCR4Blunt-TOPO-Pspac con SmaI y XhoI y se purificó en gel el fragmento de 0,3 kbp. Se digirió el vector pFP988Dss-T-H-C con SmaI y XhoI y se aisló el vector de 9 kbp mediante purificación en gel. Se ligaron el vector y el inserto de Pspac digeridos y se utilizaron para transformar células de E. coli Top10. Los transformantes fueron explorados mediante multiplicación por PCR con los cebadores SpacF Seq y N7SeqR2. Los clones positivos proporcionaron un producto de 0,7 kbp. Se preparó DNA plasmídico a partir de los clones positivos y se exploró adicionalmente mediante multiplicación por PCR con los cebadores SpacF Seq y N3SeqF2. Los clones positivos proporcionaron un producto de PCR de 3 kbp y fueron denominados pFP988DssPspac-T-H-C.
Integración en B. subtilis BE1010 para formar B. subtilis ΔsacB::T-H-C::erm #28 que comprende genes thl, hbd y crt exógenos. Se prepararon células competentes de B. subtilis BE1010 del modo descrito por Doyle et al., J. Bacteriol.
144: 957-966 (1980). Se recolectaron células competentes mediante centrifugación y se resuspendieron los sedimentos celulares de centrifugación en un pequeño volumen del sobrenadante celular. A 1 volumen de células competentes se añadieron 2 volúmenes de medio SPII-EGTA ["Methods for General and Molecular Bacteriology", redactado por P. Gerhardt, American Society for Microbiology, Washington, DC, EE.UU. (1994)]. Se distribuyeron partes alícuotas de 0,3 ml de células en tubos de ensayo y se añadió el plásmido pFP988DssPspac-T-H-C a los tubos. Se incubaron las células durante 30 minutos a 37 °C con sacudimiento, después de lo cual se añadieron 0,1 ml de extracto de levadura al 10% a cada tubo y se incubaron adicionalmente las células durante 60 minutos. Se sembraron los transformantes para selección en placas de LB-eritromicina usando el método de doble capa de agar ("Methods for General and Molecular Bacteriology", supra). Los transformantes fueron inicialmente explorados mediante multiplicación por PCR con los cebadores Pamy SeqF y N5SeqF3. Los clones positivos que multiplicaron el esperado producto de PCR de 2 kbp fueron adicionalmente explorados mediante multiplicación por PCR. Si la inserción del casete en el cromosoma se hubiera producido por medio de un proceso de doble entrecruzamiento, el conjunto de cebadores sacB Up y N7SeqR2 y el conjunto de cebadores sacB Dn y N4SeqR3 multiplicarían entonces unos productos de 1,7 kbp y 2,7 kbp, respectivamente. Se identificó un clon positivo, y fue denominado B. subtilis ΔsacB::T-H-C::erm #28.
Expresión plasmídica de los genes EgTER, ald y bdhB. Los tres genes restantes del 1-butanol se expresaron a partir del plásmido pHT01 (MoBitec). El plásmido pHT01 es un vector lanzadera de Bacillus-E. coli que se replica a través de un mecanismo theta. Las proteínas clonadas se expresan a partir del promotor GroEL fusionado con una secuencia lacO. Cadena abajo de la secuencia lacO está el eficaz RBS del gen gsiB seguido de un MCS. Se multiplicó el gen ald mediante PCR con los cebadores AF BamHI y AR Aat2 usando pUC19dHS-ald-bdhB (descrito en el Ejemplo 9) como molde, creándose un producto de 1,4 kbp. El producto fue TOPO-clonado en pCR4-TOPO y fue utilizado para transformar células de E. coli Top10. Se exploraron los transformantes con los cebadores M13 Directo y M13 Inverso. Los clones positivos multiplicaron un producto de 1,6 kbp. Se sometieron los clones a secuenciación con los cebadores M13 Directo y M13 Inverso, N31SeqF2, N31SeqF3, N32SeqR2, N32SeqR3 y N32SeqR4. El plásmido fue denominado pCR4TOPO-B/A-ald.
Se digirieron tanto el vector pHT01 como el plásmido pCR4TOPO-B/A-ald con BamHI y AatII. Se ligaron conjuntamente el fragmento de vector de 7,9 kbp y el fragmento de ald de 1,4 kbp para crear pHT01-ald. Se transformaron células de E. coli Top10 con el producto de ligación y se exploraron los transformantes en cuanto a un producto de 1,3 kbp mediante multiplicación por PCR con los cebadores N31SeqF1 y HT R.
Para añadir los dos últimos pasos de la ruta al vector pHT01, se diseñaron dos esquemas de clonación. Para ambos esquemas, se multiplicaron conjuntamente EgTER y bdhB mediante SOE. Posteriormente, el fragmento de EgTERbdh fue clonado en pHT01-ald creándose pHT01-ald-EB o fue clonado en pCR4-TOPO-B/A-ald creándose pCR4TOPO-ald-EB. El fragmento de ald-Egter-bdhB del vector TOPO fue luego clonado en pHT01, creándose pHT01-AEB.
Se multiplicó un fragmento de EgTER-bdhB por PCR usando los cebadores Directo 1 (E) e Inverso 2 (B), usando el DNA molde proporcionado como ID. SEC. nº 208. El producto de PCR de 2,5 kbp resultante fue TOPO-clonado en pCR4Blunt-TOPO, creándose pCR4Blunt-TOPO-E-B. Se transformaron células de E. coli TOP10 con el producto de reacción TOPO. Se exploraron las colonias con los cebadores M13 Directo y M13 Inverso mediante multiplicación por PCR. Los clones positivos generaron un producto de 2,6 kbp. Los clones de pCR4Blunt-TOPO-E-B fueron sometidos a secuenciación con los cebadores M13 Directo e Inverso, N62SeqF2, N62SeqF3, N62SeqF4, N63SeqR1, N63SeqR2, N63SeqR3, N11SeqF1 y N11SeqF2, N12SeqR1 y N12SeqR2.
Se digirió el plásmido pCR4Blunt-TOPO-E-B con HpaI y AatII para liberar un fragmento de 2,4 kbp. El fragmento de E-B fue tratado con polimerasa Klenow para despuntar el extremo y fue luego purificado en gel. Se digirió el plásmido pHT01-ald con AatII y se trató con polimerasa Klenow para despuntar los extremos. El vector fue luego tratado con fosfatasa alcalina intestinal de ternera y fue purificado en gel. Se ligó el fragmento de E-B con el vector 5 pHT01-ald linealizado y se utilizó el producto de ligación para transformar células de E. coli Top10, realizándose la selección en placas LB que contenían 100 µg/ml de ampicilina. Los transformantes fueron explorados mediante multiplicación por PCR con los cebadores N3SeqF1 y N63SeqR1 para obtener un producto de 2,4 kbp. Se transformaron células JM103, una cepa recA+ de E. coli, con el plásmido resultante, pHT01-ald-EB. Los plásmidos preparados a partir de cepas recA+ forman más multímeros que las cepas recA–. El Bacillus subtilis se transforma más eficazmente con multímeros plasmídicos que con monómeros ("Methods for General and Molecular Bacteriology", supra). Se preparó DNA plasmídico a partir de JM103 y se transformó con él B. subtilis ΔsacB::T-HC::erm #28 competente, formándose la cepa B. subtilis ΔsacB::T-H-C::erm #28/pHT01-ald-EB. Se prepararon células competentes y se transformaron del modo previamente descrito. Se seleccionaron transformantes en placas LB que contenían 5 µg/ml de cloranfenicol y se exploraron en cuanto a un producto de 1,3 kbp mediante PCR de
15 colonias con los cebadores N31 SeqF1 y N63SeqR4.
En la estrategia de clonación alterna, se digirió pCR4Blunt-TOPO-E-B con HpaI y AatII, liberándose un fragmento de 2,4 kbp que fue purificado en gel. Se digirió el plásmido pCR4-TOPO-B/A-ald con HpaI y AatII y se purificó en gel el fragmento de vector de 5,4 kbp. Se ligó el fragmento de vector de pCR4-TOPO-B/A-ald con el fragmento HpaI-AatII de E-B, creándose pCR4-TOPO-ald-EB. Se transformaron células de E. coli TOP10 con el producto de ligación y se exploraron los transformantes resultantes en cuanto a un producto de 2,1 kbp mediante multiplicación por PCR con los cebadores N11 SeqF2 y N63SeqR4. Se digirió el plásmido pCR4-TOPO-ald-EB con BamHI y AatII y SphI. La digestión con BamHI/AatII liberó un fragmento de ald-EB de 3,9 kbp que fue purificado en gel. La finalidad de la digestión con SphI fue cortar el vector restante en fragmentos más pequeños para que no comigrara con el inserto de ald-EB en el gel. Se digirió el vector pHT01 con BamHI y AatII y se purificó en gel el fragmento de vector de 7,9
25 kbp. Se ligaron los fragmentos de vector y de inserto de ald-EB para formar el plásmido pHT01-AEB, y se transformaron con éste células de E. coli Top10. Se exploraron las colonias en cuanto a un producto de 1,5 kbp mediante multiplicación por PCR con los cebadores N62SeqF4 y HT R. Se preparó un plásmido y se transformaron con él células JM103. Se preparó DNA plasmídico a partir de JM103 y se transformó con él B. subtilis ΔsacB::T-HC::erm #28 competente, formándose la cepa B. subtilis ΔsacB::T-H-C::erm #23/pHT01-AEB. Se prepararon células BE1010 competentes y se transformaron del modo previamente descrito. Se exploraron transformantes de Bacillus en cuanto a un producto de 1,3 kbp mediante multiplicación por PCR con los cebadores N31 SeqF1 y N63SeqR4.
Demostración de la producción de 1-butanol a partir de B. subtilis recombinante
Se inocularon tres productos de aislamiento independientes de cada cepa de B. subtilis ΔsacB::T-H-C::erm #28/pHT01-ald-EB y B. subtilis ΔsacB::T-H-C::erm #28/pHT01-AEB a matraces para sacudimiento (volumen total de
35 aproximadamente 175 ml) que contenían 15 ml de medio. Como testigo negativo también se incluyó una cepa de B. subtilis BE1010 que carecía de la ruta exógena de seis genes del 1-butanol. El medio contenía (por litro): 10 ml de (NH4)2SO4 1 M; 5 ml de tampón de fosfato potásico 1M, pH de 7,0; 100 ml de tampón de MOPS/KOH 1 M, pH de 7,0; 20 ml de la sal potásica del ácido L-glutámico 1 M; 10 g de glucosa; 10 ml de cada una de unas disoluciones de 5 g/l de L-metionina, L-triptófano y L-lisina; 0,1 g de cada uno de extracto de levadura y ácidos Casamino; 20 ml de una mezcla de metales; y antibióticos apropiados (5 mg de cloranfenicol y eritromicina para las cepas recombinantes). La mezcla de metales contenía: MgCl2 200 mM, CaCl2 70 mM, MnCl2 5 mM, FeCl3 0,1 mM, ZnCl2 0,1 mM, hidrocloruro de tiamina 0,2 mM, CuSO4 172 µM, CoCl2 253 µM y Na2MoO4 242 µM. Los matraces recibieron el inóculo a una DO600 de partida ≤ 0,1 unidades, fueron sellados con tapas no ventiladas y fueron incubados a 37 °C con sacudimiento a aproximadamente 200 rpm.
45 Aproximadamente 24 horas después de la inoculación, se analizó una parte alícuota del caldo en cuanto al contenido de 1-butanol mediante HPLC (columna Shodex Sugar SH1011) con detección por índice de refracción (RI) y mediante GC [columna Varian CP-WAX 58 (FFAP) CB, 0,25 mm x 0,2 µm x 25 m] con detección por ionización por llama (FID), como se describe en la sección Métodos Generales. En la Tabla 11 se exponen los resultados de las determinaciones de 1-butanol.
Tabla 11 5
Producción de 1-butanol por las cepas B. subtilis ΔsacB::T-H-C::erm y B. subtilis ΔsacB::T-H-C::erm #28/pHT01-AEB
Cepa
1-butanol, área del pico por HPLC-RI 1-butanol, mM*
BE1010 testigo
no detectado no detectado
Producción de 1-butanol por las cepas B. subtilis ΔsacB::T-H-C::erm y B. subtilis ΔsacB::T-H-C::erm #28/pHT01-AEB
Cepa
1-butanol, área del pico por HPLC-RI 1-butanol, mM*
pHT01-ald-EB a
4629 0,19
pHT01-ald-EB b
3969 no determinado
pHT01-ald-EB c
4306 no determinado
pHT01-AEB a
4926 0,16
pHT01-AEB b
3984 no determinado
pHT01-AEB c
3970 no determinado
* Concentración determinada por GC. – Los sufijos "a", "b" y "c" de la cepa indican productos de aislamiento independientes.
Ejemplo 15
Producción de 1-butanol a partir de glucosa o sacarosa por E. coli recombinante
Para dotar a E. coli MG1655 con la capacidad para utilizar sacarosa como fuente de carbono y energía para la producción de 1-butanol, un grupo génico para utilización de sacarosa (cscBKA) del plásmido pScrI (descrito más adelante) fue subclonado en pBHR-Ptrc-ald(opt) (descrito en el Ejemplo 13) en este organismo. Los genes para utilización de sacarosa (cscA, cscK y cscB) codifican una sacarosa hidrolasa (CscA), proporcionada como ID. SEC. nº 157, una D-fructocinasa (CscK), proporcionada como ID. SEC. nº 158, y una sacarosa permeasa (CscB), proporcionada como ID. SEC. nº 159. Para permitir la expresión constitutiva de los tres genes a partir de su promotor natural, el gen represor específico de sacarosa, cscR, que regula el grupo génico, no está presente en la construcción.
Clonación y expresión del grupo génico cscBKA para utilización de sacarosa, en el plásmido pBHR-Ptrc-ald(opt). El grupo génico cscBKA para utilización de sacarosa, proporcionado como ID. SEC. nº 156, fue aislado de DNA genómico de una cepa de E. coli que utiliza sacarosa, derivada de la cepa ATCC 13281 de E. coli. Se digirió el DNA genómico hasta compleción con BamHI y EcoRI. Los fragmentos que tenían un tamaño medio de aproximadamente 4 kbp fueron aislados de un gel de agarosa y fueron ligados con el plásmido pLitmus28 (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, EE.UU.), que fue luego digerido con BamHI y EcoRI. Se transformaron células ultracompetentes de E. coli Top10F' (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) con el DNA resultante. Los transformantes fueron sembrados en placas de agar MacConkey que contenían sacarosa al 1% y 100 µg/ml de ampicilina y fueron explorados en cuanto a colonias moradas. Se aisló DNA plasmídico de los transformantes morados y se secuenció usando los cebadores M13 Directo (ID. SEC. nº 45), M13 Inverso (ID. SEC. nº 46), scr1 (ID. SEC. nº 160), scr2 (ID. SEC. nº 161), scr3 (ID. SEC. nº 162) y scr4 (ID. SEC. nº 163). El plásmido que contenía los genes cscB, cscK y cscA (cscBKA) fue denominado pScr1.
Se digirió el plásmido pScrI con XhoI y se trató con el fragmento Klenow de DNA polimerasa para despuntar los extremos. Luego se digirió el plásmido con AgeI y se purificó en gel el fragmento de 4179 bp del grupo génico cscBKA. El plásmido pBHR-Ptrc-ald(opt) fue preparado del modo descrito en el Ejemplo 13 y fue digerido con AgeI y NaeI. El fragmento resultante de 6003 bp de pBHR-Ptrc-ald(opt) fue purificado en gel. Se ligó el fragmento de cscBKA con el plásmido pBHR-Ptrc-ald(opt), obteniéndose pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB. Se transformaron células electrocompetentes de E. coli NovaXG (Novagen, Madison, Wisconsin, EE.UU.) con el plásmido pBHR-Ptrc-ald(opt)cscAKB y se confirmó la utilización de sacarosa sembrando los transformantes en placas de agar McConkey que contenían sacarosa al 2% y 25 µg/ml de kanamicina. En la construcción pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB, los genes para utilización de sacarosa estaban clonados cadena abajo de Ptrc-ald(opt) como un fragmento separado en el orden cscA, cscK y cscB.
Alternativamente, los genes para utilización de sacarosa fueron clonados en dirección opuesta en pBHR-Ptrcald(opt). Se digirió el plásmido pBHR-Ptrc-ald(opt) con ScaI y AgeI y se purificó en gel el fragmento de 5971 bp de pBHR-Ptrc-ald(opt). Se ligó el fragmento de 4179 bp de cscBKA, preparado del modo anteriormente descrito, con el fragmento de pBHR-Ptrc-ald(opt), obteniéndose pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA. Se transformaron células electrocompetentes de E. coli NovaXG (Novagen, Madison, Wisconsin, EE.UU.) con el plásmido pBHR-Ptrc-ald(opt)cscBKA y se confirmó la utilización de sacarosa sembrando los transformantes en placas de agar McConkey que contenían sacarosa al 2% y 25 µg/ml de kanamicina. En la construcción pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA, los genes para utilización de sacarosa estaban clonados como un fragmento separado cadena abajo de Ptrc-ald(opt), en el orden cscB, cscK y cscA.
Demostración de la producción de 1-butanol a partir de glucosa o sacarosa usando E. coli recombinante. Se transformó la cepa MG1655 1.5GI-yqhD::Cm de E. coli (descrita en el Ejemplo 13) con los plásmidos pTrc99a-E-C-H-T (preparado del modo descrito en el Ejemplo 13) y pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB o pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA para producir dos cepas, MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB #9 y MG1655 5 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA #1. Se prepararon cultivos de arranque de las dos cepas cultivando las células en medio LB que contenía 25 µg/ml de kanamicina y 100 µg/ml de carbenicilina. Luego se utilizaron estas células para la inoculación a matraces para sacudimiento (volumen total de aproximadamente 175 ml) que contenían 50, 70 y 150 ml de medio TM3a/glucosa (con antibióticos apropiados) para que representaran unas condiciones de alto, medio y bajo nivel de oxígeno, respectivamente, como se describió en el Ejemplo 13. 10 Como un testigo negativo se utilizó una tercera cepa, E. coli MG1655/pScr1, cultivada en medio TM3a/glucosa que contenía 100 µg/ml de carbenicilina. Para cada una de las cepas, se preparó un conjunto idéntico de matraces con medio TM3a/sacarosa (con antibióticos apropiados). El medio TM3a/sacarosa es idéntico al medio TM3a/glucosa salvo por que la sacarosa (10 g/l) sustituye a la glucosa. Los matraces recibieron el inóculo a una DO550 de partida ≤ 0,03 unidades y fueron incubados del modo descrito en el Ejemplo 13. Con la excepción de los matraces del testigo
15 negativo, se añadió IPTG a los matraces (concentración final de 0,04 mM) cuando los cultivos alcanzaron una DO550 de entre 0,2 y 1,8 unidades. Las células se recolectaron cuando la DO550 de los cultivos aumentó en un factor de al menos 3.
Aproximadamente 24 horas después de la inoculación, se analizó una parte alícuota del caldo en cuanto al contenido de 1-butanol mediante HPLC (columna Shodex Sugar SH1011) con detección por índice de refracción (RI)
20 y mediante GC (columna HP-INNOWax, 30 m x 0,53 mm de diámetro interno, 1 µm de espesor de película) con detección por ionización por llama (FID), como se describe en la sección Métodos Generales.
En la Tabla 12 y la Tabla 13, respectivamente, se proporcionan las concentraciones de 1-butanol en los cultivos después del crecimiento en los medios que contenían glucosa y sacarosa. Ambas cepas de E. coli recombinantes que contenían la ruta biosintética del 1-butanol produjeron 1-butanol a partir de glucosa y sacarosa bajo todas las
25 condiciones de oxígeno, mientras que la cepa testigo negativo no produjo 1-butanol detectable.
Tabla 12 Tabla 13
Producción de 1-butanol a partir de glucosa por las cepas de E. coli recombinantes MG1655 1.5GIyqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB #9 y MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHRPtrc-ald(opt)-cscBKA #1
Cepa
Nivel de O2 1-butanol, mM Rendimiento molar, %
cscBKA #1
alto 0,01 0,03
cscBKA #1
medio 0,20 0,43
cscBKA #1
bajo 0,07 0,21
cscAKB #9
alto 0,01 0,02
cscAKB #9
medio 0,17 0,35
cscAKB #9
bajo 0,04 0,12
pScr1
alto no detectado no detectado
pScr1
medio no detectado no detectado
pScr1
bajo no detectado no detectado
Producción de 1-butanol a partir de sacarosa por cepas de E. coli recombinantes
Cepa
Nivel de O2 1-butanol, mM Rendimiento molar, %
cscBKA #1
alto 0,02 0,10
cscBKA #1
medio 0,02 0,11
cscBKA #1
bajo 0,01 0,09
cscAKB #9
alto 0,03 0,11
cscAKB #9
medio 0,03 0,15
cscAKB #9
bajo 0,02 0,10
pScr1
alto no detectado no detectado
pScr1
medio no detectado no detectado
pScr1
bajo no detectado no detectado
Ejemplo 16
Producción de 1-butanol a partir de sacarosa usando B. subtilis recombinante
En este ejemplo se describe la producción de 1-butanol a partir de sacarosa usando Bacillus subtilis recombinante.
5 Se examinaron dos productos de aislamiento independientes de la cepa ΔsacB::T-H-C::erm #28/pHT01-ald-EB de B. subtilis (Ejemplo 14) en cuanto a la producción de 1-butanol, esencialmente del modo descrito en el Ejemplo 14. Se inocularon las cepas a matraces para sacudimiento (volumen total de aproximadamente 175 ml) que contenían 20 ml o 100 ml de medio para simular unas condiciones de alto y bajo nivel de oxígeno, respectivamente. El medio A era exactamente como el descrito en el Ejemplo 14 salvo por que la glucosa estaba sustituida por 5 g/l de sacarosa.
10 El medio B era idéntico al medio TM3a/glucosa descrito en el Ejemplo 13 salvo por que la glucosa estaba sustituida por 10 g/l de sacarosa y el medio estaba complementado con (por litro) 10 ml de una disolución de 5 g/l de cada uno de L-metionina, L-triptófano y L-lisina. Los matraces recibieron el inóculo a una DO550 de partida ≤ 0,1 unidades, y fueron tapados con tapas ventiladas e incubados a 34 °C con sacudimiento a 300 rpm.
Aproximadamente 24 horas después de la inoculación, se analizó una parte alícuota del caldo en cuanto al
15 contenido de 1-butanol mediante GC (columna HP-INNOWax, 30 m x 0,53 mm de diámetro interno, 1,0 µm de espesor de película) con detección por FID, como se describe en la sección Métodos Generales. En la Tabla 14 se proporcionan los resultados de las determinaciones de 1-butanol. La cepa de Bacillus recombinante que contenía la ruta biosintética del 1-butanol produjo niveles detectables de 1-butanol bajo condiciones de alto y bajo nivel de oxígeno en ambos medios.
20 Tabla 14
Producción de 1-butanol a partir de sacarosa por la cepa ΔsacB::T-H-C::erm #28/pHT01-ald-EB de B. subtilis
Cepa
Medio Nivel de O2 1-BuOH, mM1,2
Ninguna
A no aplicable no detectado
pHT01-ald-EB a
A alto +
Producción de 1-butanol a partir de sacarosa por la cepa ΔsacB::T-H-C::erm #28/pHT01-ald-EB de B. subtilis
Cepa
Medio Nivel de O2 1-BuOH, mM1,2
pHT01-ald-EB b
A alto +
pHT01-ald-EB a
A bajo 0,01
pHT01-ald-EB b
A bajo 0,01
Ninguna
B no aplicable no detectado
pHT01-ald-EB a
B alto +
pHT01-ald-EB b
B alto +
pHT01-ald-EB a
B bajo 0,04
pHT01-ald-EB b
B bajo 0,03
1 Concentración determinada por GC. 2 "+" indica presencia cualitativa de 1-butanol. Los sufijos "a" y "b" de la cepa indican productos de aislamiento independientes.
Ejemplo 17
Producción de 1-butanol a partir de glucosa y sacarosa usando Saccharomyces cerevisiae
En este ejemplo se describe la producción de 1-butanol en la levadura Saccharomyces cerevisiae. De los seis genes que codifican enzimas que catalizan los pasos de la ruta biosintética del 1-butanol, cinco fueron clonados en tres plásmidos compatibles de 2 micrómetros (2 µm) de levadura y hechos expresar conjuntamente en Saccharomyces cerevisiae. La "ruta superior" se define como los tres primeros pasos enzimáticos, catalizados por la acetil-CoA acetiltransferasa (thlA, tiolasa), la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (hbd) y la crotonasa (crt). La ruta inferior se define como los pasos enzimáticos cuarto (butil-CoA deshidrogenasa, ter) y quinto (butilaldehído deshidrogenasa, ald) de la ruta. El último paso enzimático de la ruta del 1-butanol es catalizado por la alcohol deshidrogenasa, que puede ser codificada por genes de levadura endógenos, tales como, por ejemplo, adhI y adhII.
La expresión de genes en levadura requiere típicamente un promotor, seguido por el gen de interés, y un terminador de la transcripción. Se utilizaron diversos promotores constitutivos de levadura en la construcción de casetes de expresión para genes que codifican la ruta biosintética del 1-butanol, incluyendo los promotores FBA, GPD y GPM. También se utilizaron algunos promotores inducibles, por ejemplo, GAL1, GAL10 y CUP1, en la construcción de plásmidos intermedios pero no en la cepa de demostración final. Se utilizaron diversos terminadores de la transcripción, incluyendo FBAt, GPDt, GPMt, ERG10t y GAL1t. Los genes que codifican la ruta biosintética del 1butanol fueron primero subclonados en un plásmido de levadura flanqueado por un promotor y un terminador, lo que produjo casetes de expresión para cada gen. Los casetes de expresión fueron opcionalmente combinados en un único vector mediante clonación con reparación de huecos, como se describe más adelante. Por ejemplo, los tres casetes génicos que codifican la ruta superior fueron subclonados en un plásmido de 2 µm de levadura. Cada uno de los genes ter y ald se expresó individualmente en los plásmidos de 2 µm. La transformación conjunta de los tres plásmidos en una sola cepa de levadura dio lugar a una ruta biosintética funcional del 1-butanol. Alternativamente, varios fragmentos de DNA que codificaban promotores, genes y terminadores fueron directamente combinados en un único vector mediante clonación con reparación de huecos.
Métodos para construir plásmidos y cepas en levadura Saccharomyces cerevisiae. En Methods in Enzymology, Volumen 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Parte A, 2004, redactado por Christine Guthrie y Gerald R. Fink, Elsevier Academic Press, San Diego, California, EE.UU.), se describen protocolos básicos sobre la biología molecular de levaduras, incluyendo la transformación, el crecimiento celular, la expresión génica, la recombinación con reparación de huecos, etc.
Los plásmidos empleados en este Ejemplo fueron los vectores lanzadera pRS423, pRS424, pRS425 y pRS426 de E.
coli- S. cerevisiae (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU.), que contienen un origen de replicación de E. coli (por ejemplo, pMB1), un origen de replicación de 2 µm de levadura, y un marcador para selección nutricional. Los marcadores de selección para estos cuatro vectores son His3 (vector pRS423), Trp1 (vector pRS424), Leu2 (vector pRS425) y Ura3 (vector pRS426). Estos vectores permiten la propagación de cepas tanto en cepas de E. coli como de levadura. Como huéspedes para clonación y expresión de genes, se utilizaron una cepa haploide de levadura, BY4741 (MATa his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0 ura3Δ0) (Research Genetics, Huntsville, Alabama, EE.UU.; también disponible de ATCC 201388), y una cepa diploide, BY4743 (MATa/alpha his3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0, lys2Δ0/LYS2 MET15/met15Δ0 ura3Δ0/ura3Δ0) (Research Genetics, Huntsville, Alabama, EE.UU.; también disponible de ATCC 201390). La construcción de vectores de expresión para genes que codifican enzimas de la ruta biosintética del 1-butanol se llevó a cabo mediante técnicas de clonación molecular estándares en E. coli o mediante el método de recombinación con reparación de huecos en levadura.
La estrategia de clonación con reparación de huecos se aprovecha de la muy eficaz recombinación homóloga en levadura. Típicamente, se digiere un DNA vector de levadura (por ejemplo, en su sitio de clonación múltiple) para crear un "hueco" en su secuencia. Se genera un número de DNAs insertados de interés que contienen una secuencia ≥ 21 bp tanto en el extremo 5' como en el 3' que solapan secuencialmente entre sí y con los extremos 5' y 3' del DNA vector. Por ejemplo, para construir un vector de expresión de levadura para el "Gen X", se seleccionan un promotor de levadura y un terminador de levadura para el casete de expresión. El promotor y el terminador son multiplicados a partir del DNA genómico de levadura, y el Gen X o bien es multiplicado por PCR a partir de su organismo fuente o bien es obtenido de un vector de clonación que comprende la secuencia del Gen X. Hay al menos una secuencia de solapamiento de 21 bp entre el extremo 5' del vector linealizado y la secuencia de promotor, entre el promotor y el Gen X, entre el Gen X y la secuencia de terminador, y entre el terminador y el extremo 3' del vector linealizado. El vector "con huecos" y los DNAs insertados son luego empleados para transformar conjuntamente una cepa de levadura y son sembrados en el medio selectivo mínimo SD, y se seleccionan colonias para el desarrollo de cultivos y minipreparaciones para DNAs plasmídicos. La presencia de combinaciones correctas de insertos puede ser confirmada mediante mapeo por PCR. El DNA plasmídico aislado de levadura (normalmente en una concentración baja) puede ser luego empleado para transformar una cepa de E. coli, por ejemplo, TOP10, lo que va seguido de minipreparaciones y mapeo de restricción para verificar adicionalmente la construcción plasmídica. Finalmente, se puede verificar la construcción mediante el análisis de su secuencia. Los transformantes de levadura de plásmidos positivos son cultivados en medio SD para llevar a cabo ensayos enzimáticos para caracterizar las actividades de las enzimas expresadas por los genes de interés.
Se desarrollaron cultivos de levadura en medio complejo YPD o medio selectivo mínimo sintético que contenía glucosa (medio SD) y las mezclas de compuestos apropiadas que permiten la complementación de los marcadores para selección nutricional en los plásmidos (Methods in Enzymology, Volumen 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, 2004, Parte A, páginas 13-15). El componente de azúcar del medio selectivo SD era glucosa al 2%. Para la producción de 1-butanol, también se desarrollaron cultivos de levadura en medio selectivo mínimo sintético con sacarosa al 2% (medio SS).
Para el análisis de la actividad enzimática, se sembró en forma de rayas una sola colonia de cada cepa en una placa fresca que contenía medio selectivo mínimo SD y se incubó a 30 °C durante 2 días. Las células de esta placa fueron utilizadas para inocular a 20 ml de medio selectivo SD en un matraz para sacudimiento de 125 ml de capacidad y fueron cultivadas durante la noche a 30 °C, con sacudimiento a 250 rpm. Se midió la densidad óptica (DO600) del cultivo nocturno, y el cultivo fue diluido hasta una DO600 = 0,1 en 250 ml del mismo medio en un matraz para sacudimiento de 1,0 l de capacidad y fue desarrollado a 30 °C con sacudimiento a 250 rpm hasta una DO600 de entre 0,8 y 1,0. Las células fueron luego recolectadas por centrifugación a 2000 x g durante 10 minutos y fueron resuspendidas en 20 ml de tampón de Tris 50 mM-HCl, pH de 8,5. Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo del modo anteriormente descrito.
Construcción del plásmido NY102 para la coexpresión de thlA y hbd. Se construyó un número de vectores de expresión duales para la coexpresión de los genes thlA y hbd. El gen ERG10 de Saccharomyces cerevisiae es un ortólogo funcional del gen thlA. Inicialmente, se construyó un vector dual de ERG10 y hbd usando el promotor dual divergente GAL1-GAL10 de levadura, el terminador GAL1 (GAL1t) y el terminador ERG10 (ERG10t). El fragmento de DNA de gen ERG10-ERG10t fue multiplicado por PCR a partir de DNA genómico de la cepa BY4743 de Saccharomyces cerevisiae usando los cebadores OT731 (ID. SEC. nº 164) y OT732 (ID. SEC. nº 165). El promotor divergente GAL1-GAL10 de levadura fue también multiplicado por PCR a partir de DNA genómico de BY4743 usando los cebadores OT733 (ID. SEC. nº 166) y OT734 (ID. SEC. nº 167). El gen hbd fue multiplicado a partir del plásmido pTrc99a-E-C-H-T de E. coli (descrito en el Ejemplo 13) usando los cebadores OT735 (ID. SEC. nº 168) y OT736 (ID. SEC. nº 169) para PCR. Se multiplicó GAL1t a partir de DNA genómico de BY4743 usando los cebadores OT737 (ID. SEC. nº 170) y OT738 (ID. SEC. nº 171). De este modo se obtuvieron cuatro fragmentos de PCR, erg10-ERG10t, promotores GAL1-GAL10, hbd y GAL1t, con secuencias de solapamiento de aproximadamente 25 bp entre cada fragmento de PCR adyacente. Cada uno de los fragmentos GAL1t y ERG10-ERG10t contiene secuencias de solapamiento de aproximadamente 25 bp con el vector pRS425 de levadura. Para ensamblar estas secuencias mediante recombinación con reparación de huecos, se transformó la cepa BY4741 de levadura con los fragmentos de DNA junto con el vector pRS425 que había sido digerido con las enzimas BamHI e HindIII. Se seleccionaron colonias de placas mínimas SD-Leu y se identificaron los clones con insertos mediante multiplicación por PCR. El nuevo plásmido fue denominado pNY6 (pRS425.ERG10t-erg10-GAL10-GAL1-hbd-GAL1t). Se llevó a cabo una confirmación adicional mediante mapeo de restricción.
La cepa BY4741 (pNY6) de levadura, preparada al transformar S. cerevisiae BY4741 con el plásmido PNY6, mostró buena actividad Hbd pero no actividad tiolasa. Debido a la falta de actividad tiolasa, se sustituyó el gen ERG10 por el gen thlA mediante recombinación con reparación de huecos. Se multiplicó el gen thlA a partir del vector pTrc99a-E-C-H-T de E. coli por PCR usando los cebadores OT797 (ID. SEC. nº 172), que añade un sitio de restricción SphI, y OT798 (ID. SEC. nº 173), que añade un sitio de restricción AscI. El plásmido PNY6 fue digerido con las enzimas de restricción SphI y PstI, purificado en gel, y usado para transformar BY4741 de levadura junto con el producto de PCR de thlA. Debido a las secuencias de solapamiento de 30 bp entre el producto de PCR de thlA y el plásmido pNY6 digerido, el gen thlA se recombinó en PNY6 entre el promotor GAL10 y el terminador ERG10t. Esto produjo el plásmido PNY7 (pRS425.ERG10t-thlA-GAL10-GAL1-hbd-GAL1t), que fue verificado mediante PCR y mapeo de restricción.
En una subsiguiente etapa de clonación basada en recombinación con reparación de huecos, se sustituyó el promotor GAL10 de pNY7 por el promotor CUP1 y se sustituyó el promotor GAL1 por el potente promotor GPD. Este plásmido, pNY10 (pRS425.ERG10t-thlA-CUP1-GPD-hbd-GAL1t), permite la expresión del gen thlA bajo CUP1, un promotor inducible por cobre, y la expresión del gen hbd bajo el promotor GPD. La secuencia del promotor CUP1 fue multiplicada por PCR a partir de DNA genómico de levadura BY4743 usando los cebadores OT806 (ID. SEC. nº 174) y OT807 (ID. SEC. nº 175). El promotor GPD fue multiplicado a partir de DNA genómico de BY4743 usando los cebadores OT808 (ID. SEC. nº 176) y OT809 (ID. SEC. nº 177). Los productos de PCR de los promotores CUP1 y GPD fueron combinados con el plásmido pNY7 que había sido digerido con las enzimas de restricción NcoI y SphI. A partir de esta etapa de clonación con reparación de huecos, se construyó el plásmido pNY10, que fue verificado mediante PCR y mapeo de restricción. La cepa BY4741 de levadura que contenía pNY10 mostró actividad Hbd pero no actividad ThlA. La actividad Hbd bajo el promotor GPD resultó significativamente mejorada en comparación con la actividad Hbd controlada por el promotor GAL1 (1,8 U/mg frente a 0,40 U/mg). Un análisis por secuenciación reveló que el gen thlA de PNY10 tenía una supresión de una base cerca del extremo 3', lo que daba lugar a una proteína truncada. Esto explica la falta de actividad tiolasa en la cepa.
Se construyó el plásmido pNY12 con la correcta secuencia del gen thlA. El gen thlA fue cortado del vector pTrc99a-E-C-H-T mediante digestión con SphI y AscI. El promotor FBA1 fue multiplicado por PCR a partir de DNA genómico de BY4743 usando los cebadores OT799 (ID. SEC. nº 178) y OT761 (ID. SEC. nº 179) y fue digerido con las enzimas de restricción SalI y SphI. El fragmento del gen thlA y el fragmento del promotor FBA1 fueron ligados en sitios AscI y SalI del plásmido pNY10, generándose el plásmido pNY12 (pRS425.ERG10t-thlA-FBA1), lo que fue confirmado por mapeo de restricción. Se transformó la cepa BY4741 de levadura con PNY12, y el transformante resultante mostró una actividad ThlA de 1,66 U/mg.
El fragmento de promotor FBA1-gen thlA de pNY12 fue vuelto a subclonar en pNY10. El vector pNY10 fue cortado con la enzima de restricción AscI y fue ligado con el fragmento de promotor FBA1-gen thlA digerido con AscI, aislado del plásmido pNY12. Esto creó un nuevo plásmido con dos posibles orientaciones de inserto. Se escogieron los clones con promotores FBA1 y GPD situados adyacentemente entre sí en orientación opuesta, y este plásmido fue denominado pNY102. Se verificó el plásmido pNY102 (pRS425.ERG10t-thlA-FAB1-GPD-hbd-GAL1t) mediante mapeo de restricción. Se preparó la cepa DPD5206 al transformar la cepa BY4741 de levadura con pNY102. La actividad ThlA de DPD5206 era 1,24 U/mg y la actividad Hbd era 0,76 U/mg.
Construcción de plásmidos pNY11 para la expresión de crt. Se construyó el casete de expresión del gen crt combinando el promotor GPM1, el gen crt y el terminador GPM1t en el vector pRS426 usando recombinación con reparación de huecos en levadura. El promotor GPM1 fue multiplicado por PCR a partir de DNA genómico de la levadura BY4743 usando los cebadores OT803 (ID. SEC. nº 180) y OT804 (ID. SEC. nº 181). El gen crt fue multiplicado usando los cebadores de PCR OT785 (ID. SEC. nº 182) y OT786 (ID. SEC. nº 183) a partir del plásmido pTrc99a-E-C-H-T de E. coli. El terminador GPM1t fue multiplicado por PCR a partir de DNA genómico de la levadura BY4743 usando OT787 (ID. SEC. nº 184) y OT805 (ID. SEC. nº 185). El vector pRS426 de levadura fue digerido con BamHI e HindIII y fue purificado en gel. Este DNA fue utilizado junto con los productos de PCR del promotor GPM1, el gen crt y el terminador GPM1t para transformar células competentes de levadura BY4741. Los clones con los insertos correctos fueron verificados por PCR y mapeo de restricción, y la resultante cepa BY4741 (pNY11: pRS426-GPM1-crt-GPM1t) de levadura tenía una actividad Crt de 85 U/mg.
Construcción del plásmido pNY103 para la coexpresión de thlA, hbd y crt. Para la coexpresión de las enzimas de la ruta superior del 1-butanol, el casete del gen crt de pNY11 fue subclonado en el plásmido pNY102 para crear un vector de expresión de hbd, thlA y crt. Un fragmento de DNA de 2347 bp que contenía el promotor GPM1, el gen crt y el terminador GPM1 fue cortado del plásmido pNY11 con las enzimas de restricción SacI y NotI y fue clonado en el vector pNY102, que había sido digerido con NotI y parcialmente digerido con SacI, produciéndose el vector de expresión pNY103 (pRS425.ERG10t-thlA-FBA1-GPD-hbd-GAL1t-GPM1t-crt-GPM1). Después de la confirmación de la presencia de los tres casetes en pNY103 mediante digestión con HindIII, se transformaron células de levadura BY4743 con el plásmido, y la cepa de levadura transformada fue denominada DPD5200. Cuando se cultivó bajo condiciones estándares, DPD5200 mostró actividades enzimáticas ThlA, Hbd y Crt de 0,49 U/mg, 0,21 U/mg y 23,0 U/mg, respectivamente.
Construcción del plásmido pNY8 para la expresión de ald. Se sintetizaron un gen optimizado en cuanto a codones denominado tery (ID. SEC. nº 186), que codifica la proteína Ter (ID. SEC. nº 187), y un gen optimizado en cuanto a codones denominado aldy (ID. SEC. nº 188), que codifica la proteína Ald (ID. SEC. nº 189), usando codones preferidos de Saccharomyces cerevisiae. Mediante DNA2.0 (Palo Alto, California, EE.UU.) se prepararon el plásmido pTERy, que contiene el gen ter optimizado en cuanto a codones, y pALDy, que contiene el gen ald optimizado en cuanto a codones.
Para ensamblar pNY8 (pRS426.GPD-ald-GPDt), tres fragmentos de inserto que incluían un producto de PCR del promotor GPD [sintetizado a partir de los cebadores OT800 (ID. SEC. nº 190) y OT758 (ID. SEC. nº 191) y DNA genómico de BY4743], un fragmento del gen aldy escindido de pALDy mediante digestión con NcoI y SfiI (ID. SEC. nº 188, y un producto de PCR del terminador GPD [sintetizado a partir de los cebadores OT754 (ID. SEC. nº 192) y OT755 (ID. SEC. nº 193) y DNA genómico de BY4743] fueron recombinados con el vector pRS426 que había sido digerido con BamHI e HindIII, por medio de clonación por recombinación con reparación de huecos. Los clones de transformación de la levadura BY4741 fueron analizados mediante mapeo por PCR. El nuevo plásmido así construido, pNY8, fue adicionalmente confirmado mediante mapeo de restricción. Los transformantes de la levadura BY4741 que contenían pNY8 fueron analizados en cuanto a actividad Ald, y la actividad específica hacia butiril-CoA fue aproximadamente 0,07 U/mg.
Construcción de los plásmidos pNY9 y pNY13 para la expresión de ter. El gen tery optimizado en cuanto a codones fue clonado en el vector pRS426 bajo el control del promotor FBA1 mediante clonación con reparación de huecos. El promotor FBA1 fue multiplicado por PCR a partir de DNA genómico de la levadura BY4743 usando los cebadores OT760 (ID. SEC. nº 194) y OT792 (ID. SEC. nº 195). El gen tery se obtuvo por digestión del plásmido pTERy mediante las enzimas de restricción SphI y NotI, lo que dio lugar al fragmento proporcionado como ID. SEC. nº 186. Se generó el fragmento de PCR del terminador FBA1 mediante una PCR a partir de DNA genómico de la levadura BY4743 usando los cebadores OT791 (ID. SEC. nº 196) y OT765 (ID. SEC. nº 197). Se combinaron tres fragmentos de DNA, el promotor FBA1, el gen ter y el terminador FBA1, con el vector pRS426 que había sido digerido con BamHI e HindIII, y se utilizaron para transformar la levadura BY4741 mediante recombinación con reparación de huecos. El plásmido resultante, pNY9 (pRS426-FBA1-tery-FBA1t), fue confirmado mediante mapeo por PCR así como mediante digestión de restricción. La levadura BY4741 transformada con pNY9 produjo una actividad Ter de 0,26 U/mg.
Para preparar la cepa final de la ruta biosintética del 1-butanol fue necesario construir una cepa de expresión de levadura que contuviera diversos plásmidos, cada uno con un marcador para selección nutricional único. Puesto que el vector parental pRS426 contenía un marcador Ura para selección, el casete de expresión de ter fue subclonado en el vector pRS423, que contenía un marcador His3. Un fragmento de 3,2 kb que contenía el casete FBA1-tery-FBA1t fue aislado del plásmido pNY9 por digestión con las enzimas de restricción SacI y XhoI y fue ligado en el vector pRS423 que había sido cortado con estas dos mismas enzimas. El nuevo plásmido, pNY13 (pRS423-FBA1-tery-FBA1t), fue mapeado mediante digestión de restricción. Se transformó la cepa BY4741 con PNY13 y se cultivó el transformante en medio SD-His, obteniéndose una cepa con una actividad Ter de 0,19 U/mg.
Construcción de una cepa de levadura que contiene genes de la ruta biosintética del 1-butanol para la demostración de la producción de 1-butanol. Como se describió anteriormente, se construyó la cepa DPD5200 de levadura mediante la transformación de la cepa BY4743 de S. cerevisiae con el plásmido pNY103, lo que permite la coexpresión de los genes thlA, hbd y crt. Se prepararon células competentes de levadura DPD5200 del modo anteriormente descrito y se transformaron con los plásmidos pNY8 y pNY13, generándose la cepa DPD5213. DPD5213 permite la expresión constitutiva simultánea de cinco genes de la ruta biosintética del 1-butanol, thlA, hbd, crt, ter y ald. Como un testigo negativo se utilizó la cepa DPD5212 (cepa BY4743 de S. cerevisiae transformada con plásmidos vacíos, pRS425 y pRS426). Se cultivaron cuatro productos de aislamiento independientes de la cepa DPD5213 en medio mínimo selectivo SD-Ura, -Leu, -His en presencia de glucosa al 2% o sacarosa al 2% para permitir la complementación de crecimiento de los tres plásmidos. Se cultivó similarmente un único producto de aislamiento de DPD5212 en el medio apropiado.
Para demostrar la producción de 1-butanol mediante cultivos aeróbicos, se sembró en forma de rayas una sola colonia de cada cepa en una placa de agar fresco que contenía medio de crecimiento selectivo mínimo SD (que contenía glucosa al 2%) o medio de crecimiento selectivo mínimo SS (que contenía sacarosa al 2%) y se incubó a 30 °C durante 2 días. Las células de estas placas fueron utilizadas para inocular a 20 ml del medio selectivo mínimo (SD o SS) en matraces de plástico para sacudimiento de 125 ml de capacidad y fueron cultivadas durante la noche a 30 °C con sacudimiento a 250 rpm. Se midió la densidad óptica (DO600) del cultivo nocturno, y el cultivo fue diluido hasta una DO600 de 0,1 en 25 ml del mismo medio en un matraz para sacudimiento de 125 ml de capacidad y fue desarrollado a 30 °C con sacudimiento a 250 rpm.
Se tomaron partes alícuotas del cultivo a las 24 horas y las 48 horas para el análisis de la producción de 1-butanol mediante GC (columna HP-INNOWax, 30 m x 0,53 mm de diámetro interno, 1 µm de espesor de película) con detección por FID, como se describe en la sección Métodos Generales. Los resultados del análisis por GC se presentan en la Tabla 15.
Tabla 15
Producción de 1-butanol a partir de glucosa y sacarosa por la cepa DPD5213 de S. cerevisiae
Cepa1
Azúcar 1-butanol a las 24 h, mg/l2 1-butanol a las 48 h, mg/l2
DPD5212
Glucosa No detectado No detectado
DPD5213 a
Glucosa 0,4 0,5
Dud5213 b
Glucosa 0,9 0,2
DPD5213 c
Glucosa 1,0 0,6
DPD5213 d
Glucosa 0,8 0,3
DPD5212
Sacarosa No detectado No detectado
DPD5213 a
Sacarosa No detectado 1,7
DPD5213 b
Sacarosa No detectado 1,3
DPD5213 c
Sacarosa 0,2 1,5
DPD5213 d
Sacarosa 0,6 0,9
1 Mediante a-d se indican productos de aislamiento independientes. 2 Concentración determinada por GC.

Ejemplo 18 (profético)
Expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en Lactobacillus plantarum
La finalidad de este Ejemplo profético es describir cómo hacer que se exprese la ruta biosintética del 1-butanol en Lactobacillus plantarum. Los seis genes de la ruta del 1-butanol, que codifican seis actividades enzimáticas, son 5 divididos en dos operones para expresión. Los tres primeros genes de la ruta (thl, hbd y crt, que codifican las enzimas acetil-CoA acetiltransferasa, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa y crotonasa, respectivamente) se integran en el cromosoma de Lactobacillus plantarum mediante recombinación homóloga usando el método descrito por Hols et al. [Appl. Environ. Microbiol. 60: 1401-1413 (1994)]. Los tres últimos genes (EgTER, ald y bdhB, que codifican las enzimas butiril-CoA deshidrogenasa, butiraldehído deshidrogenasa y butanol deshidrogenasa, respectivamente) se
10 clonan en un plásmido de expresión y se usan para transformar la cepa de Lactobacillus que porta los genes integrados de la ruta superior del 1-butanol. Se cultiva el lactobacilo en medio MRS (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, EE.UU.) a 37 °C. Se aísla DNA cromosómico de Lactobacillus plantarum del modo descrito por Moreira et al. (BMC Microbiol. 5: 15 (2005)].
Integración. El casete thl-hbd-crt bajo el control del promotor sintético P11 [Rud et al., Microbiology 152: 1011-1019
15 (2006)] se integra en el cromosoma de Lactobacillus plantarum ATCC BAA-793 (NCIMB 8826), en el locus IdhL1, mediante recombinación homóloga. Para construir el vector de direccionamiento para integración de IdhL, un fragmento de DNA de Lactobacillus plantarum (Genbank NC_004567) con homología con respecto a IdhL. es multiplicado por PCR con los cebadores LDH EcoRV F (ID. SEC. nº 198) y LDH AatIIR (ID. SEC. nº 199). El fragmento de PCR de 1986 bp es clonado en pCR4Blunt-TOPO y es secuenciado. El clon pCR4Blunt-TOPO-IdhL1
20 es digerido con EcoRV y AatII, liberándose un fragmento de IdhL1 de 1982 bp que es purificado en gel. El vector de integración pFP988, descrito en el Ejemplo 14, es digerido con HindIII y es tratado con DNA polimerasa Klenow para despuntar los extremos. Luego se digiere con AatII el plásmido linealizado y se purifica en gel el fragmento de vector de 2931 bp. El fragmento EcoRV/AatII de IdhL1 es ligado con el fragmento de vector pFP988 y utilizado para transformar células de E. coli Top10. Los transformantes son seleccionados en placas de agar LB que contienen
25 ampicilina (100 µg/ml) y son explorados mediante PCR de colonias para confirmar la construcción de pFP988-IdhL.
Para añadir un marcador seleccionable al DNA de integración, se multiplica por PCR el gen Cm con su promotor a partir de pC194 (Genbank NC_002013) con los cebadores Cm F (ID. SEC. nº 200) y Cm R (ID. SEC. nº 201), multiplicándose un producto de PCR de 836 bp. El amplicón es clonado en pCR4Blunt-TOPO y usado para transformar células de E. coli TOP10, creándose pCR4Blunt-TOPO-Cm. Después de una secuenciación para confirmar que no se han introducido errores mediante la PCR, el casete Cm es digerido de pCR4Blunt-TOPO-Cm como un fragmento MluI/SwaI de 828 bp y es purificado en gel. El vector de integración pFP988-IdhL que contiene homología con IdhL es digerido con MluI y SwaI, y el fragmento de vector de 4740 bp es purificado en gel. El fragmento del casete Cm es ligado con el vector pFP988-IdhL, creándose pFP988-DIdhL::Cm.
Finalmente, el casete thl-hbd-crt de pFP988Dss-T-H-C, descrito en el Ejemplo 14, es modificado para sustituir el promotor de amilasa por el promotor sintético P11. A continuación, se traslada el operón completo a pFP988-DIdhL::Cm. Se construye el promotor P11 mediante hibridación de oligonucleótidos por extremos complementarios con los cebadores P11 F (ID. SEC. nº 202) y P11 R (ID. SEC. nº 203). El oligonucleótido hibridado es purificado en un gel ULTRA al 6% para PAGE (Embi Tec, San Diego, California, EE.UU.). El plásmido pFP988Dss-T-H-C es digerido con XhoI y SmaI, y el fragmento de vector de 9 kbp es purificado en gel. El fragmento de P11 aislado es ligado con el plásmido pFP988Dss-T-H-C digerido para crear pFP988-P11-T-H-C. El plásmido pFP988-P11-T-H-C es digerido con XhoI y BamHI, y el fragmento de P11-T-H-C de 3034 bp es purificado en gel. Se digiere pFP988-DIdhL::Cm con XhoI y BamHI y se aísla el fragmento de vector de 5558 bp. Se liga el operón de la ruta superior con el vector de integración para crear pFP988-DIdhL-P11-THC::Cm.
Integración de pFP988-DIdhL-P11-THC::Cm en L. plantarum BAA-793 para formar L. plantarum ΔIdhL1::T-H-C::Cm que comprende genes thl, hbd y crt exógenos. Se preparan células electrocompetentes de L. plantarum de la forma descrita por T. W. Aukrust et al. (en "Electroporation Protocols for Microorganisms", redactado por J. A. Nickoloff; Methods in Molecular Biology, volumen 47, Humana Press, Inc., Totowa, New Jersey, EE.UU., 1995, páginas 201208). Después de la electroporación, las células son desarrolladas en medio MRSSM (medio MRS complementado con sacarosa 0,5 M y MgCl2 0,1 M) de la forma descrita por Aukrust et al., supra, durante 2 horas a 37 °C sin sacudimiento. Las células sometidas a electroporación son sembradas para selección en placas MRS que contienen cloranfenicol (10 µg/ml) y son incubadas a 37 °C. Los transformantes son inicialmente explorados mediante multiplicación por PCR de colonias para confirmar la integración, y los clones positivos iniciales son luego explorados más rigurosamente mediante multiplicación por PCR con una batería de cebadores.
Expresión plasmídica de los genes EgTER, ald y bdhB. Los tres genes restantes del 1-butanol se expresan a partir del plásmido pTRKH3 [D. J. O'Sullivan y T. R. Klaenhammer, Gene 137: 227-231 (1993)] bajo el control del promotor IdhL de L. plantarum [Ferain et al., J. Bacteriol. 176: 596-601 (1994)]. El promotor IdhL es multiplicado por PCR a partir del genoma de L. plantarum ATCC BAA-793 con los cebadores PIdhL F (ID. SEC. nº 204) y PIdhL R (ID. SEC. nº 205). El producto de PCR de 369 bp es clonado en pCR4Blunt-TOPO y es secuenciado. El plásmido resultante, pCR4Blunt-TOPO-PIdhL, es digerido con SacI y BamHI, liberándose el fragmento de pIdhL de 359 bp.
Se digiere pHT01-ald-EB, descrito en el Ejemplo 14, con SacI y BamHI y se recupera el fragmento de vector de
10.503 bp mediante purificación en gel. Se ligan el fragmento de PIdhL y el vector para crear pHT01-PIdhl-ald-EB.
Para subclonar el casete de promotor IdhL-ald-EgTER-bdh, se digiere pHT01-PIdhl-ald-EB con MluI y se tratan los extremos con DNA polimerasa Klenow. Se digiere con SalI el vector linealizado y se purifica en gel el fragmento de 4270 bp que contiene el fragmento PIdhL-AEB. El plásmido pTRKH3 es digerido con SalI y EcoRV, y el fragmento de vector purificado en gel es ligado con el fragmento PIdhL-AEB. Se transforman células de E. coli Top 10 con la mezcla de ligación y se siembran los transformantes en placas de medio BHI [Infusión de Cerebro y Corazón (Brain Heart Infusion en inglés); Difco Laboratories, Detroit, Michigan, EE.UU.] que contiene eritromicina (150 mg/l). Los transformantes son explorados por PCR para confirmar la construcción de pTRKH3-ald-E-B. Se transforma L. plantarum ΔIdhL1::T-H-C::Cm con el plásmido de expresión pTRKH3-ald-E-B por electroporación de la manera anteriormente descrita.
Se inocula L. plantarum ΔIdhL1::T-H-C::Cm que contiene pTRKH3-ald-E-B a un matraz para sacudimiento de 250 ml de capacidad que contiene 50 ml de medio MRS más eritromicina (10 µg/ml) y se cultiva a 37 °C durante un periodo de 18 a 24 horas sin sacudimiento. Después del período de 18 a 24 horas, se detecta 1-butanol mediante análisis por HPLC o GC, como se describe en la sección Métodos Generales.
Ejemplo 19 (profético)
Expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en Enterococcus faecalis
La finalidad de este Ejemplo profético es describir cómo hacer que se exprese la ruta biosintética del 1-butanol en Enterococcus faecalis. La secuencia genómica completa de la cepa V583 de Enterococcus faecalis, que se usa como cepa huésped para la expresión de la ruta biosintética del 1-butanol en este Ejemplo, ha sido publicada [Paulsen et al., Science 299: 2071-2074 (2003)]. Se utiliza el plásmido pTRKH3 [D. J. O'Sullivan y T. R. Klaenhammer, Gene 137: 227-231 (1993)], un vector lanzadera de E. coli/bacterias Gram positivas, para la expresión de los seis genes (thlA, hbd, crt, EgTER, ald, bdhB) de la ruta del 1-butanol en un operón. pTRKH3 contiene un origen de replicación del plásmido p15A de E. coli y el replicón pAMβ1, y dos marcadores de resistencia a antibióticos para selección, resistencia a tetraciclina y resistencia a eritromicina. La resistencia a tetraciclina sólo se expresa en E. coli, y la resistencia a eritromicina se expresa tanto en E. coli como en bacterias Gram positivas. Los derivados del plásmido pAMβ1 se pueden replicar en E. faecalis [Poyart et al., FEMS Microbiol. Lett. 156: 193198 (1997)]. Se utiliza el promotor inducible nisA (PnisA), que ha sido empleado para un control eficaz de la expresión génica por nisina en una diversidad de bacterias Gram positivas, incluyendo Enterococcus faecalis [Eichenbaum et al., Appl. Environ. Microbiol. 64: 2763-2769 (1998)], para controlar la expresión de los seis genes deseados que codifican las enzimas de la ruta biosintética del 1-butanol.
El fragmento de DNA lineal (215 bp) que contiene el promotor nisA [Chandrapati et al., Mol. Microbiol. 46 (2): 467477 (2002)] es multiplicado por PCR a partir de DNA genómico de Lactococcus lactis con los cebadores F-PnisA(EcoRV) (ID. SEC. nº 206) y R-PnisA(PmeI BamHI) (ID. SEC. nº 207). Se digiere el fragmento de PCR de 215 bp con EcoRV y BamHI y se purifica en gel el fragmento de PnisA resultante. Se digiere el plásmido pTRKH3 con EcoRV y BamHI y se purifica en gel el fragmento de vector. Se liga el plásmido pTRKH3 linealizado con el fragmento de PnisA. Se transforman células de E. coli TOP10 con la mezcla de ligación mediante electroporación y se seleccionan transformantes después de un cultivo nocturno a 37 °C en placas de agar LB que contienen eritromicina (25 µg/ml). Los transformantes son luego explorados mediante PCR de colonias con los cebadores F-PnisA(EcoRV) y R-PnisA(BamHI) para confirmar el clon correcto de pTRKH3-PnisA.
Se digiere el plásmido pTRKH3-PnisA con PmeI y BamHI y se purifica en gel el vector. Se construye el plásmido pHT01-ald-EgTER-bdhB de la manera descrita en el Ejemplo 14 y se digiere con SmaI y BamHI, y se purifica en gel el fragmento de ald-EgTER-bdhB de 2973 bp. Se liga el fragmento de ald-EgTER-bdhB de 2973 bp al vector pTRKH3-PnisA, en los sitios PmeI y BamHI. Se transforman células de E. coli TOP10 con la mezcla de ligación mediante electroporación y se seleccionan transformantes después de una incubación a 37 °C durante la noche en placas de agar LB que contienen eritromicina (25 µg/ml). Los transformantes son luego explorados mediante PCR de colonias con el cebador directo N27F1 de ald (ID. SEC. nº 31) y el cebador inverso N65 de bdhB (ID. SEC. nº 44). El plásmido resultante es denominado pTRKH3-PnisA-ald-EgTER-bdhB (= pTRKH3-A-E-B).
Se purifica el plásmido pTRKH3-A-E-B a partir del transformante y se utiliza para la clonación adicional de los genes restantes (thlA, hbd, crt) en el sitio BamHI situado cadena abajo del gen bdhB. Se digiere el plásmido pTRKH3-A-E-B con BamHI y se trata con el fragmento Klenow de DNA polimerasa para despuntar los extremos. Se construye el plásmido pFP988Dss-thlA-hbd-crt (= pFP988Dss-T-H-C) de la manera descrita en el Ejemplo 14 y se digiere con SmaI y BamHI. El fragmento de thlA-hbd-crt resultante de 2973 bp es tratado con el fragmento Klenow de DNA polimerasa para despuntar los extremos y es purificado en gel. El fragmento de thlA-hbd-crt de 2973 bp es ligado con el plásmido pTRKH3-A-E-B linealizado. Se transforman células de E. coli TOP10 con la mezcla de ligación mediante electroporación y se seleccionan transformantes después de un cultivo nocturno a 37 °C en placas de agar LB que contienen eritromicina (25 µg/ml). Los transformantes son luego explorados mediante PCR de colonias con el cebador directo N7 de thlA (ID. SEC. nº 21) y el cebador inverso N4 de crt (ID. SEC. nº 18). El plásmido resultante es denominado pTRKH3-PnisA-ald-EgTER-bdhB-thlA-hbd-crt (= pTRKH3-A-E-B-T-H-C). Se prepara el plásmido pTRKH3-A-E-B-T-H-C a partir de los transformantes de E. coli y se utiliza para transformar células electrocompetentes de E. faecalis V583 por electroporación usando métodos conocidos en la técnica (T. W. Aukrust et al. en "Electroporation Protocols for Microorganisms", redactado por J. A. Nickoloff; Methods in Molecular Biology, volumen 47, Humana Press, Inc., Totowa, New Jersey, EE.UU., 1995, páginas 217-226), lo que da lugar a E. faecalis V583/pTRKH3-A-E-B-T-H-C.
Se transforma E. Faecalis V583/pTRKH3-A-E-B-T-H-C, mediante electroporación, con el segundo plásmido que contiene nisR, nisK y genes reguladores de nisA, el gen add9 de resistencia a espectinomicina, y el origen de replicación de pSH71. El plásmido que contiene el origen de replicación de pSH71 es compatible con derivados de pAMβ1 en E. faecalis (Eichenbaum et al., supra). Se seleccionan transformantes doblemente resistentes a fármacos en placas de agar LB que contienen eritromicina (25 µg/ml) y espectinomicina (100 µg/ml).
La cepa resultante V583B de E. faecalis que porta dos plásmidos, es decir, un plásmido de expresión (pTRKH3-A-E-B-T-H-C) y un plásmido regulador (pSH71-nisRK), se inocula a un matraz para sacudimiento de 250 ml de capacidad que contiene 50 ml de caldo Todd-Hewitt complementado con extracto de levadura (0,2%) [Fischetti et al.,
J. Exp. Med. 161: 1384-1401 (1985)], nisina (20 µg/ml) (Eichenbaum et al., supra), eritromicina (25 µg/ml) y espectinomicina (100 µg/ml). Se incuba el matraz sin sacudimiento a 37 °C durante un periodo de 18 a 24 horas, después del cual se mide la producción de 1-butanol mediante análisis por HPLC o GC, como se describe en la sección Métodos Generales.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> E.I. du Pont de Nemours and Co.
<120> Producción de alcoholes de cuatro carbonos por fermentación
<130> CL3241 PCT 5 <160> 208
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 1179
<212> DNA 10 <213> Clostridium acetobutylicum
<400>
1
<400>
75
15
<210><211><212><213> 2 392 PRT Clostridium acetobutylicum
<400>
2
5
<210><211><212><213> 3 1179 DNA Clostridium acetobutylicum
<400>
3
5
<210><211><212><213> 4 392 PRT clostridium acetobutylicum
<400>
4
5
<210><211><212><213> 5 849 DNA Clostridium acetobutylicum
<400>
5
5
<210><211><212><213> 6 282 PRT clostridium acetobutylicum
<400>
6
5
<210><211><212><213> 7 786 DNA clostridium acetobutylicum
<400>
7
10
<210><211><212><213> 8 261 PRT clostridium acetobutylicum
<400>
8
5
<210><211><212><213> 9 1197 DNA clostridium acetobutylicum
<400>
9
58
5
<210><211><212><213> 10 398 PRT clostridium acetobutylicum
<400>
10
5
<210><211><212><213> 11 1407 DNA Clostridium beijerinckii
<400>
11
5
<210><211><212><213> 12 468 PRT clostridium beijerinckii
<400>
12
<210>
13
<211>
1215
63
<212>
DNA
<213>
clostridium acetobutylicum
<400>
13
5
<210><211><212><213> 14 390 PRT Clostridium acetobutylicum
<400>
14
5
<210><211><212><213> 15 1170 DNA clostridium acetobutylicum
<400>
15
5
<210><211><212><213> 16 389 PRT Clostridium acetobutylicum
<400>
16
5
<210><211><212><213> 17 29 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 17 caccatggaa ctaaacaatg tcatccttg
29
10
<210><211><212><213> 18 25 DNA Secuencia artificial
15
<220> <223> Cebador
<400> 18 cctcctatct atttttgaag ccttc
25
<210>
19
<211><212><213>
28 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 19 caccatgaaa aaggtatgtg ttataggt
28
<210><211><212><213>
20 23 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 20 catttgataa tggggattct tgt
23
<210><211><212><213>
21 30 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 21 caccatgaaa gaagttgtaa tagctagtgc
30
<210><211><212><213>
22 26 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 22 ctagcacttt tctagcaata ttgctg
26
<210><211><212><213>
23 29 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 23 caccatgcta agttttgatt attcaatac
29
<210><211><212><213>
24 25 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 24 ttaataagat tttttaaata tctca
25
<210><211><212><213>
25 30 DNA Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 25 caccatggtt gatttcgaat attcaatacc
30
<210><211><212><213>
26 25 DNA Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 26 ttacacagat tttttgaata tttgt
25
<210><211><212><213>
27 32 DNA Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 27 caccatgaga gatgtagtaa tagtaagtgc tg
32
<210><211><212><213>
28 24 DNA Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 28 ccgcaattgt atccatattg aacc
24
<210><211><212><213>
29 26 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 29 caccatgata gtaaaagcaa agtttg
26
<210><211><212><213>
30 27 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 30 gcttaaagct taaaaccgct tctggcg
27
<210><211><212><213>
31 27 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 31 caccatgaat aaagacacac taatacc
27
<210><211><212><213>
32 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 32 gccagaccat ctttgaaaat gcgc
24
<210><211><212><213>
33 35 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 33 catgcatgca aaggaggtta gtagaatgaa agaag
35
<210><211><212><213>
34 38 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 34 gtcctgcagg gcgcgcccaa tactttctag cacttttc
38
<210><211><212><213>
35 39 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 35 catgtcgaca aaggaggtct gtttaatgaa aaaggtatg
39
<210><211><212><213>
36 28 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 36 gtcgcatgcc ttgtaaactt attttgaa
28
<210><211><212><213>
37 44 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
37
catagatctg gatccaaagg agggtgagga aatgatagta aaag
44
<210><211><212><213>
38 30 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 38 catgtcgacg tgcagccttt ttaaggttct
30
<210><211><212><213>
39 38 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 39 catgaattca cgcgtaaagg aggtattagt catggaac
38
<210><211><212><213>
40 30 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 40 gtcggatccc ttacctccta tctatttttg
30
<210><211><212><213>
41 42 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 41 catgcccggg ggtcaccaaa ggaggaatag ttcatgaata aa
42
<210><211><212><213>
42 32 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 42 catggttaac aagaagttag ccggcaagta ca
32
<210><211><212><213>
43 41 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 43 catggttaac aaaggagggg ttaaaatggt tgatttcgaa t
41
<210><211><212>
44 37 DNA
<213>
Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
44
catggcatgc gtttaaacgt aggtttacac agatttt
37
<210><211><212><213>
45 17 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 45 gtaaaacgac ggccagt
17
<210><211><212><213>
46 16 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 46 aacagctatg accatg
16
<210><211><212><213>
47 22 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 47 gcaggagatg ctgacgtaat aa
22
<210><211><212><213>
48 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 48 ccaacctgct ttttcaatag ctgc
24
<210><211><212><213>
49 21 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 49 cagagatggg gtcaaagaat g
21
<210><211><212><213>
50 20 DNA Secuencia artificial
<220>
<223>
Cebador
<400> 50 gtggttttat tccgagagcg
20
<210><211><212><213>
51 20 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 51 ggtctatact tagaatctcc
20
<210><211><212><213>
52 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 52 cggaacagtt gaccttaata tggc
24
<210><211><212><213>
53 22 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 53 gcctcatctg ggtttggtct tg
22
<210><211><212><213>
54 28 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 54 cgcctaggag aaaggactat aaaactgg
28
<210><211><212><213>
55 22 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 55 cagagttata ggtggtagag cc
22
<210><211><212><213>
56 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
56
ccatcccgct gttcctattc ttct
24
<210><211><212><213>
57 22 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 57 ccaatcctct ccacccatta cc
22
<210><211><212><213>
58 20 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 58 cgtccatcct taatcttccc
20
<210><211><212><213>
59 23 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 59 ccaactatgg aatccctaga tgc
23
<210><211><212><213>
60 22 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 60 gcatagtctg cgaagtaaat gc
22
<210><211><212><213>
61 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 61 ggatctactg gtgaaggcat aacc
24
<210><211><212><213>
62 23 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 62 ggcatcatga gttctgtcat gac
23
<210>
63
<211><212><213>
25 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 63 gccttcaatg atactcttac cagcc
25
<210><211><212><213>
64 22 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 64 gcatttccag cagctatcat gc
22
<210><211><212><213>
65 22 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 65 ccttcccata tgtgtttctt cc
22
<210><211><212><213>
66 22 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 66 gttgaagtag tactagctat ag
22
<210><211><212><213>
67 22 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 67 gacataacac acggcgtagg gc
22
<210><211><212><213>
68 22 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 68 taagtgtaca ctccaattag tg
22
<210><211><212><213>
69 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 69 gccatctaac acaatatccc atgg
24
<210><211><212><213>
70 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 70 gcgatacatg ggacatggtt aaag
24
<210><211><212><213>
71 22 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 71 tgcacttaac tcgtgttcca ta
22
<210><211><212><213>
72 21 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 72 gttagccggc aagtacacat c
21
<210><211><212><213>
73 21 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 73 actttctttc gcctgtttca c
21
<210><211><212><213>
74 47 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 74 catgaagctt ggcgcgccgg gacgcgtttt tgaaaataat gaaaact
47
<210><211><212><213>
75 79 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador
5
<210><211><212><213> 76 1197 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Gen CAC0462 optimizado en cuanto a codones de Clostridium acetobutylicum,
<400>
76
15
<210><211><212><213> 77 1224 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
EgTER optimizado en cuanto a codones
<400>
77
5
<210><211><212><213> 78 1498 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Gen ald optimizado en cuanto a codones
<400>
78
5
<210><211><212><213> 79 6509 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Plásmido pFP988
<400>
79
<210><211><212><213>
80 46 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N85
<400> 80 catagatctg gatccaaagg agggtgagga aatggcgatg tttacg
46
<210><211><212><213>
81 20 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N86
<400> 81 gtcgacttac tgctgggcgg
20
<210><211><212><213>
82 20 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador T7Primer
<400> 82 taatacgact cactataggg
20
<210><211><212><213>
83 20 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Trc99af
<400> 83 ttgacaatta atcatccggc
20
<210><211><212><213>
84 21 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N5SeqF4
<400> 84 ggtcaactgt tccggaaatt c
21
<210>
85
<211><212><213>
46 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador T-ald(BamHI)
<400> 85 tgatctggat ccaagaagga gcccttcacc atgaataaag acacac
46
<210><211><212><213>
86 54 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador B-ald(ETGER)
<400> 86 catcgccatt tcctcaccct cctttttagc cggcaagtac acatcttctt tgtc
54
<210><211><212><213>
87 42 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador T-Ptrc(BspEI)
<400> 87 ttccgtactt ccggacgact gcacggtgca ccaatgcttc tg
42
<210><211><212><213>
88 43 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador B-aldopt(BspEI)
<400> 88 cggatcttaa gtactttaac ccgccagcac acagcggcgc tgg
43
<210><211><212><213>
89 32 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador T-BspEIAatII
<400> 89 ccggatcatg ataataatgg tttcttagac gt
32
<210><211><212><213>
90 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador B-BspEIAatII
<400> 90 ctaagaaacc attattatca tgat
24
<210><211><212><213>
91 42 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Promotor 1.6GI
<400> 91 gcccttgaca atgccacatc ctgagcaaat aattcaacca ct
42
<210><211><212><213>
92 42 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Promotor 1.5GI
<400> 92 gcccttgact atgccacatc ctgagcaaat aattcaacca ct
42
<210><211><212><213>
93 39 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador AFBamHI
<400> 93 cattggatcc atgaataaag acacactaat acctacaac
39
<210><211><212><213>
94 39 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador ARAat2
<400> 94 catgacgtca ctagtgttaa caagaagtta gccggcaag
39
<210><211><212><213>
95 50 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Directo 1(E)
<400> 95 catgttaaca aaggaggaaa gatctatggc gatgtttacg accaccgcaa
50
<210><211><212><213>
96 43 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador inferior inverso 1(E)
<400> 96 cccctccttt ggcgcgcctt actgctgggc ggcgctcggc aga
43
<210><211><212><213>
97 51 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador superior directo 2(B)
<400> 97 gcccagcagt aaggcgcgcc aaaggagggg ttaaaatggt tgatttcgaa t
51
<210><211><212><213>
98 42 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador inverso 2(B)
<400> 98 gtcgacgtca tactagttta cacagatttt ttgaatattt gt
42
<210><211><212><213>
99 47 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Pamy/lacOF
<400> 99 cattgtacag aattcgagct ctcgaggccc cgcacatacg aaaagac
47
<210><211><212><213>
100 52 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Pam/la cOR
<400> 100 cattgtacag tttaaacata ggtcaccctc attttcgtag gaattgttat cc
52
<210><211><212><213>
101 52 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Spac F
<400> 101 cattgtacag tttaaacata ggtcaccctc attttcgtag gaattgttat cc
52
<210><211><212><213>
102 36 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Spac R
<400> 102 catgtttaaa cggtgaccca agctggggat ccgcgg
36
<210><211><212><213>
103 44 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Top TF
<400> 103 cattggtcac cattcccggg catgcaaagg aggttagtag aatg
44
<210><211><212><213>
104 51 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Bot TR
<400> 104 cctttacgcg accggtacta gtcaagtcga cagggcgcgc ccaatacttt c
51
<210><211><212><213>
105 57 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Top CF
<400> 105 cgcgccctgt cgacttgact agtaccggtc gcgtaaagga ggtattagtc atggaac
57
<210><211><212><213>
106 38 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Bot CR
<400> 106 catcgtttaa acttggatcc agatccctta cctcctat
38
<210><211><212><213>
107 20 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N3SeqF1
<400> 107 ccatcatacc atactgaccc
20
<210><211><212><213>
108 20 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N3SeqF2
<400> 108 gctactggag cattgctcac
20
<210><211><212><213>
109 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N3SeqF3
<400> 109 ccattaacag ctgctattac aggc
24
<210><211><212>
110 20 DNA
<213>
Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N4SeqR3
<400> 110 ggtctcggaa taacacctgg
20
<210><211><212><213>
111 22 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N5SeqF3
<400> 111 caagcttcat aacaggagct gg
22
<210><211><212><213>
112 22 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N7SeqR2 ,
<400> 112 atcccacaat ccgtcagtga tc
22
<210><211><212><213>
113 20 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N31SeqF1
<400> 113 ctgagataag aaaggccgca
20
<210><211><212><213>
114 20 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N62SeqF2
<400> 114 caaccctggg cgtgtttctg
20
<210><211><212><213>
115 20 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N625SeqF3
<400> 115 gtggcgaaga ttgggaactg
20
<210><211><212><213>
116 24 DNA Secuencia artificial
<220>
<223>
Cebador N62SeqF4
<400> 116 gggaaatggc agaagatgtt cagc
24
<210><211><212><213>
117 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N63SeqR1
<400> 117 cggtctgata acctgcaaaa tcgc
24
<210><211><212><213>
118 21 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N63SeqR2
<400> 118 caccagcgct ttggcaacaa c
21
<210><211><212><213>
119 23 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N63SeqR3
<400> 119 gaacgtgcat acagacctgc ttc
23
<210><211><212><213>
120 20 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador N63SeqR4
<400> 120 cggctgaata acttttgcgg
20
<210><211><212><213>
121 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Pamy SeqF2
<400> 121 gcctttgatg actgatgatt tggc
24
<210><211><212><213>
122 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Pamy SeqF
<400>
122
tctccggtaa acattacggc aaac
24
<210><211><212><213>
123 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Pamy seqR
<400> 123 cggtcagatg caattcgaca tgtg
24
<210><211><212><213>
124 20 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador SpacF Seq
<400> 124 gaagtggtca agacctcact
20
<210><211><212><213>
125 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador sacB Up
<400> 125 cgggtttgtt actgataaag cagg
24
<210><211><212><213>
126 24 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador sacB Dn
<400> 126 cggttagcca tttgcctgct ttta
24
<210><211><212><213>
127 22 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador HT R
<400> 127 acaaagatct ccatggacgc gt
22
<210><211><212><213>
128 1185 DNA Escherichia coli
<400>
128
5
<210><211><212><213> 129 394 PRT Escherichia coli
<400>
129
<210>
130
<211>
1182
93
<212>
DNA
<213>
Bacillus subtilis
<400>
130
5
<210><211><212><213> 132 1197 DNA Saccharomyces cerevisiae
<400>
132
<210> 133
<211>
398
<212>
PRT
<213>
Saccharomyces cerevisiae
<400>
133
5
<210><211><212><213> 134 864 DNA Bacillus subtilis
<400>
134
5
<210><211><212><213> 135 287 PRT Bacillus subtilis
<400>
135
5
<210><211><212><213> 136 855 DNA Ralstonia eutropha
<400>
136
10
<210><211><212><213> 137 284 PRT Ralstonia eutropha
<400>
137
5
<210><211><212><213><400> 138 741 DNA Alcaligenes eutrophis 138
101
5
<210><211><212><213> 139 246 PRT Alcaligenes eutrophus
<400>
139
5
<210><211><212><213> 140 768 DNA Escherichia coli
<400>
140
5
<210><211><212><213> 141 255 PRT Escherichia coli
<400>
141
5
<210><211><212><213> 142 783 DNA Bacillus subtilis
<400>
142
10
<210><211><212><213> 143 260 PRT Bacillus subtilis
<400>
143
5
<210><211><212><213> 144 405 DNA Aeromonas caviae
<400>
144
5
<210><211><212><213> 145 134 PRT Aeromonas caviae
<400>
145
10
<210><211><212><213> 146 1912 DNA Euglena gracilis
<400>
146
5
<210><211><212><213> 147 539 PRT Euglena gracilis
<400>
147
<210>
148
<211>
1344
5
<212> DNA
<213>
Sreptomyces collinus
110
<400> 148
5
<210><211><212><213> 149 447 PRT Streptomyces collinus
<400>
149
5
<210><211><212><213> 150 1344 DNA Streptomyces coelicolor
<400>
150
5
<210><211><212><213> 151 447 PRT Streptomyces coelicolor
<400>
151
5
<210><211><212><213> 152 2589 DNA clostridium acetobutylicum
<400>
152
5
<210><211><212><213> 153 862 PRT Clostridium acetobutylicum
<400>
153
5
<210><211><212><213> 154 1164 DNA Escherichia coli
<400>
154
5
<210><211><212><213> 155 387 PRT Escherichia coli
<400>
155
5
<210><211><212><213> 156 3883 DNA Escherichia coli
<400>
156
5
<210><211><212><213> 157 477 PRT Escherichia coli
<400>
157
5
<210><211><212><213> 158 304 PRT Escherichia coli
<400>
158
5
<210><211><212><213> 159 415 PRT Escherichia coli
<400>
159
5
<210><211><212><213> 160 18 DNA Secuencia artificial
129
<220> <223>
Cebador Scr1
<400> 160 cctttctttg tgaatcgg
18
<210><211><212><213>
161 18 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Scr2
<400> 161 agaaacaggg tgtgatcc
18
<210><211><212><213>
162 20 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Scr3
<400> 162 agtgatcatc acctgttgcc
20
<210><211><212><213>
163 20 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Scr4
<400> 163 agcacggcga gagtcgacgg
20
<210><211><212><213>
164 74 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador OT731
<400>
164
<210> 165
<211> 50
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador OT732
<400> 165 ttcaatatgc atgcctcaga acgtttacat tgtatcgact gccagaaccc 50
<210> 166
<211> 79
<212> DNA
<213> Secuencia artificial 5 <210> 167
<220>
<223>
Cebador OT733
<400>
166
<211> 72
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Cebador OT734
<400> 167
15
<210><211><212><213> 168 60 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador OT735
20
<400> 168 aaaaactacc atggaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt actatgggtt caggaattgc 60
<210><211><212><213>
169 71 DNA Secuencia artificial
25
<220> <223> Cebador OT736
<400>
169
30
<210><211><212><213> 170 81 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador OT737
35
<400> 170
40
<210><211><212><213> 171 73 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador OT738
<400> 171
5
<210><211><212><213> 172 65 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador OT797
<400>
172
<210> 173
<211> 73
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Cebador OT798
<400> 173
<210> 174 20 <211> 41
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador OT806
25 <400> 174 ctcgaaaata gggcgcgccc cattaccga catttgggcg c 41
<210> 175
<211> 55
<212> DNA 30 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador OT807
<400> 175 actgcactag ctattacaac ttcttgcatg cgtgatgatt gattgattga ttgta 55
35 <210> 176
<211> 55
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220> 40 <223> Cebador OT808
<400> 176 actgcactag ctattacaac ttcttgcatg cgtgatgatt gattgattga ttgta 55
<210> 177
<211> 60 45 <212> DNA
<213>
Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador OT809
5
<400> 177 tttcgaataa acacacataa acaaacaccc catggaaaag gtatgtgtta taggtgcagg 60
<210><211><212><213>
178 62 DNA Secuencia artificial
10
<220> <223> Cebador OT799
<400>
178
<210> 179 15 <211> 60
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador OT761
20 <400> 179 cttggccttc actagcatgc tgaatatgta ttacttggtt atggttatat atgacaaaag 60
<210> 180
<211> 68
<212> DNA 25 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador OT803
<400> 180
30 <210> 181
<211> 49
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
35 <223> Cebador OT804
<400> 181
aaggatgaca ttgtttagtt ccatggttgt aatatgtgtg tttgtttgg 49
<210> 182
<211> 51 40 <212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador OT785
<400> 182 45 cacacatatt acaaccatgg aactaaacaa tgtcatcctt gaaaaggaag g 51
<210>
183
<211>
63
<212>
DNA
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Cebador OT786
<400>
183
<210>
184
<211>
65
<212>
DNA
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Cebador OT787
<400>
184
<210>
185
<211>
77
<212>
DNA
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Cebador PT805
<400>
185
<210><211><212><213>
186 1269 DNA Secuencia artificial
30
<220> <223> Gen TER optimizado en cuanto a codones
<400>
186
5
<210><211><212><213> 187 398 PRT Secuencia artificial
<220> <223>
Proteína Ter modificada
<400>
187
5
<210><211><212><213> 188 1484 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Gen ald optimizado en cuanto a codones
<400>
188
5
<210><211><212><213> 189 468 PRT Artificial
<220> <223>
Gen Ald modificado
<400>
189
5
<210><211><212><213> 190 69 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador PT800
<400>
190
10 <210> 191
<211> 50
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Cebador OT758
<400> 191
ttaaggtatc tttatccatg gtgtttgttt atgtgtgttt attcgaaact 50
<210> 192
<211> 52 20 <212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador OT754
<400> 192
25 ttgggtaccg ggccccccct cgaggtcgac tggccattaa tctttcccat at 52
<210> 193
<211> 52
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
30 <220> <223> Cebador OT755
<400> 193 tgtgtcctag caggttaggg cctgcagggc cgtgaattta ctttaaatct tg 52
<210> 194 5 <211> 50
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador OT760
10 <400> 194 cgaaaatagg gcgcgccact ggtagagagc gactttgtat gccccaattg 50
<210> 195
<211> 71
<212> DNA 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador OT792
<400> 195
20 <210> 196
<211> 71
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220> 25 <223> Cebador OT791
<400> 196
30
<210><211><212><213> 197 73 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador OT765
<400>
197
<210> 198
<211> 29
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
40 <220>
<223> Cebador LDHEcoRV F
<400> 198
gacgtcatga ccacccgccg atccctttt 29
<210> 199
<211><212><213>
30 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador LDH AatlR
<400> 199 gatatccaac accagcgacc gacgtattac
30
<210><211><212><213>
200 47 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Cm F
<400> 200 atttaaatct cgagtagagg atcccaacaa acgaaaattg gataaag
47
<210><211><212><213>
201 29 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador Cm R
<400>
201
acgcgttatt ataaaagcca gtcattagg
29
<210><211><212><213>
202 62 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador P11 F
<400>
202
<210><211><212><213>
203 58 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador P11 R
<400> 203 gggcgctata gcaacaatat atcatagtat gtccattctg tcaacaacta tagcgctc
58
<210><211><212><213>
204 38 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador PldhL F
<400> 204 gagctcgtcg acaaaccaac attatgacgt gtctgggc
38
<210>
205
<211><212><213>
30 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador PldhL R
<400> 205 ggatcctacc atgtttgtgc aaaataagtg
30
<210><211><212><213>
206 34 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador F-PnisA (EcoRV)
<400> 206 ttcagtgata tcgacatact tgaatgacct agtc
34
<210><211><212><213>
207 48 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador R-PnisA(PmeI BamHI)
<400> 207 ttgattagtt taaactgtag gatcctttga gtgcctcctt ataattta
48
<210><211><212><213>
208 2460 DNA Secuencia artificial
<220> <223>
DNA molde
<400>
208

Claims (22)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una célula huésped microbiana recombinante que comprende moléculas de DNA heterólogas que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato a producto: a) acetil-CoA a acetoacetil-CoA, b) acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA, c) 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA, d) crotonil-CoA a butiril-CoA, e) butiril-CoA a butiraldehído, y
    f) butiraldehído a 1-butanol; en donde dicha célula huésped microbiana produce 1-butanol.
  2. 2.
    La célula huésped según la Reivindicación 1, en donde el polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto de acetil-CoA a acetoacetil-CoA es la acetil-CoA acetiltransferasa.
  3. 3.
    La célula huésped según la Reivindicación 1, en donde el polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto de acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA es la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa.
  4. 4.
    La célula huésped según la Reivindicación 1, en donde el polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto de 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA es la crotonasa.
  5. 5.
    La célula huésped según la Reivindicación 1, en donde el polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto de crotonil-CoA a butiril-CoA es la butiril-CoA deshidrogenasa.
  6. 6.
    La célula huésped según la Reivindicación 1, en donde el polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto de butiril-CoA a butiraldehído es la butiraldehído deshidrogenasa.
  7. 7.
    La célula huésped según la Reivindicación 1, en donde el polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto de butiraldehído a 1-butanol es la butanol deshidrogenasa.
  8. 8.
    La célula huésped según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, en donde la célula es seleccionada del grupo que consiste en: una bacteria, una cianobacteria, un hongo filamentoso y una levadura.
  9. 9.
    La célula huésped según la Reivindicación 8, en donde la célula es un miembro de un género seleccionado del grupo que consiste en Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces.
  10. 10.
    La célula huésped según la Reivindicación 9, en donde la célula es seleccionada del grupo que consiste en
    Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Bacillus licheniformis, Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium, Enterococcus faecalis y Saccharomyces cerevisiae.
  11. 11.
    La célula huésped según la Reivindicación 2, en donde la acetil-CoA acetiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 4, ID. SEC. nº 129, ID. SEC. nº 131 e ID. SEC. nº 133.
  12. 12.
    La célula huésped según la Reivindicación 3, en donde la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 135, ID. SEC. nº 137 e ID. SEC. nº 139.
  13. 13.
    La célula huésped según la Reivindicación 4, en donde la crotonasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 141, ID. SEC. nº 143 e ID. SEC. nº 145.
  14. 14.
    La célula huésped según la Reivindicación 5, en donde la butiril-CoA deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID. SEC. nº 10, ID. SEC. nº 147, ID. SEC. nº 149, ID. SEC. nº 151 e ID. SEC. nº 187.
  15. 15.
    La célula huésped según la Reivindicación 6, en donde la butiraldehído deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID. SEC. nº 12, ID. SEC. nº 153 e ID. SEC. nº 189.
  16. 16.
    La célula huésped según la Reivindicación 7, en donde la butanol deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID. SEC. nº 14, ID. SEC. nº 16, ID. SEC. nº 153, ID. SEC. nº
    155 e ID. SEC. nº 157.
  17. 17.
    La célula huésped según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, en donde la célula huésped es un anaerobio facultativo.
  18. 18. Un método para la producción de 1-butanol, que comprende: 5 i) proporcionar la célula huésped microbiana recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 17; y
    ii) poner la célula huésped de (i) en contacto con un sustrato carbonado fermentable bajo unas condiciones mediante las cuales se produce 1-butanol.
  19. 19. El método según la Reivindicación 18, en donde el sustrato carbonado fermentable es seleccionado del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.
    10 20. El método según la Reivindicación 18, en donde el sustrato carbonado es seleccionado del grupo que consiste en glucosa, sacarosa y fructosa.
  20. 21. El método según la Reivindicación 18, en donde las condiciones mediante las cuales se produce 1-butanol son anaeróbicas.
  21. 22. El método según la Reivindicación 18, en donde las condiciones mediante las cuales se produce 1-butanol 15 son microaeróbicas.
  22. 23. El método según la Reivindicación 18, en donde la célula huésped es puesta en contacto con el sustrato carbonado en medios mínimos.
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