ES2453665T3 - Genes biosintéticos de piripiropeno A - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido aislado que es (a) un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 266, (b) un polinucleótido que tiene una secuencia polinucleotídica que codifica al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 267 a 274 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a las mismas, dicha secuencia de aminoácidos equivalente tiene de 1 a 40 residuos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados comparada con SEQ ID NO: 267 a 270 y 272 a 274, y tiene la misma actividad enzimática que SEQ ID NO: 267 a 270 y 272 a 274, respectivamente, o dicha secuencia de aminoácidos equivalente tiene de 1 a 8 residuos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados comparada con SEQ ID NO: 271, y tiene la misma actividad enzimática que SEQ ID NO: 271.
Description
Genes biosintéticos de piripiropeno A
Esta solicitud de patente reivindica prioridad respecto a la solicitud de patente japonesa No. 190862/2008 que se presentó el 24 de julio, 2008, la solicitud de patente japonesa No. 270294/2008 que se presentó el 20 de octubre, 2008 y la solicitud de patente japonesa No. 20591/2008 que se presentó el 30 de enero, 2009.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a un gen biosintético de piripiropeno A.
Como se divulga en la publicación de la patente japonesa accesible al público No. 360895/1992 (Documento de patente 1) y Journal of Antibiotics (1993), 46(7), 1168-9 (Documento no patente 1), el piripiropeno A tiene una actividad inhibidora contra ACAT (acil CoA colesterol aciltransferasa). Se espera la aplicación del mismo al tratamiento de enfermedades causadas por la acumulación de colesterol o similares.
Además, en Journal of Synthetic Organic Chemistry, Japón (1998), Vol. 56, No. 6, 478-488 (Documento no patente 2), documento WO94/09147 (Documento de patente 2), publicación de la patente japonesa accesible al público No. 184158/1994 (Documento de patente 3), publicación de la patente japonesa accesible al público No. 239385/1996 (Documento de patente 4), publicación de la patente japonesa accesible al público No. 259569/1996 (Documento de patente 5), publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269062/1996 (Documento de patente 6), publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269063/1996 (Documento de patente 7), publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269064/1996 (Documento de patente 8), publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269065/1996 (Documento de patente 9), publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269066/1996 (Documento de patente 10), publicación de la patente japonesa accesible al público No. 291164/1996 (Documento de patente 11) y Journal of Antibiotics (1997), 50(3), 229-36 (Documento no patente 3), se han divulgado análogos y derivados de piripiropeno, así como actividades inhibidoras de ACAT de los mismos.
Además, Applied and Environmental Microbiology (1995), 61(12), 4429-35 (documento no patente 4) ha divulgado que piripiropeno A tiene una actividad insecticida contra la larva de Heliciverpa armigera. Aún más, el documento WO2004/060065 (Documento de patente 12) ha divulgado que el piripiropeno A tiene actividades insecticidas contra la larva de la polilla de crucíferas y Tenebrio molitor.
Además, los documentos WO2006/129714 (Documento de patente 13) y WO2008/066153 (documento de patente 14) han divulgado que los análogos de piripiropeno tienen actividades insecticidas contra áfidos.
Además, como bacteria productora de piripiropeno A, se divulga la cepa FO-1289 de Aspergillus fumigatus en la publicación de la patente japonesa accesible al público No. 360895/1992 (documento de patente 1); la cepa NRRL3446 de Eupenicillium reticulosporum en Applied and Environmental Microbiology (1995), 61(12), 4429-35 (documento no patente 4), y la cepa F1959 de Penicillium griseofulvum en el documento WO2004/060065 (documento de patente 12); y la cepa PF1169 de Penicillium coprobium en Journal of Technical Disclosure 500997/2008 (documento de patente 15).
Además, como ruta biosintética de piripiropeno A, Journal of Organic Chemistry (1996), 61, 882-886 (Documento no patente 5) y Chemical Review (2005), 105, 4559-4580 (Documento no patente 6) han divulgado una putativa ruta biosintética en la cepa FO-1289 de Aspergillus fumigatus. Estos documentos han divulgado que, en la cepa FO-1289 de Aspergillus fumigatus, estructuras parciales individualmente sintetizadas por la policétido sintasa y la preniltransferasa se unen para sintetizar piripiropeno A mediante una ciclasa.
Referencias del estado de la técnica
[Documento de patente 1] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 360895/1992 [Documento de patente 2] WO94/09147 [Documento de patente 3] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 184158/1994 [Documento de patente 4] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 239385/1996 [Documento de patente 5] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 259569/1996 [Documento de patente 6] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269062/1996 [Documento de patente 7] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269063/1996 [Documento de patente 8] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269064/1996 [Documento de patente 9] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269065/1996 [Documento de patente 10] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269066/1996 [Documento de patente 11] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 291164/1996 [Documento de patente 12] WO2004/060065 [Documento de patente 13] WO2006/129714 [Documento de patente 14] WO2008/066153 [Documento de patente 15] Journal of Technical Disclosure 500997/2008
[Documento no patente 1] Journal of Antibiotics (1993), 46(7), 1168-9 [Documento no patente 2] Journal of Synthetic Organic Chemistry, Japón (1998), Vol. 56, No. 6, 478-488 [Documento no patente 3] Journal of Antibiotics (1997), 50(3), 229-36 [Documento no patente 4] Applied and Environmental Microbiology (1995), 61(12), 4429-35 [Documento no patente 5] Journal of Organic Chemistry (1996), 61, 882-886 [Documento no patente 6] Chemical Review (2005), 105, 4559-4580
Los presentes inventores han encontrado ahora una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un polipéptido implicado en la biosíntesis de piripiropeno A. La presente invención se ha hecho basada en tal descubrimiento.
Según esto, un objeto de la presente invención es proporcionar un polinucleótido novedoso aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un polipéptido implicado en la biosíntesis de piripiropeno A, un vector recombinante que comprende el polinucleótido, y un transformante que comprende el polinucleótido.
Además, según una forma de realización de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que es
- (a)
- un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 266,
- (b)
- un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 266 en condiciones rigurosas, o
- (c)
- un polinucleótido que tiene una secuencia polinucleotídica que codifica al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 267 a 274 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a las mismas.
Además, según otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de (1) o (2) a continuación:
- (1)
- una secuencia de nucleótidos en cualquiera de (a) a (h) a continuación:
- (a)
- una secuencia de nucleótidos de 3342 a 5158 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (b)
- una secuencia de nucleótidos de 5382 a 12777 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (c)
- una secuencia de nucleótidos de 13266 a 15144 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (d)
- una secuencia de nucleótidos de 16220 a 18018 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (e)
- una secuencia de nucleótidos de 18506 a 19296 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (f)
- una secuencia de nucleótidos de 19779 a 21389 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (g)
- una secuencia de nucleótidos de 21793 a 22877 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (h)
- una secuencia de nucleótidos de 23205 a 24773 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266;
- (2)
- una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con una secuencia de nucleótidos en (1) en condiciones rigurosas.
Además, según otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido implicado en la biosíntesis de piripiropeno A.
Además, según otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una o más actividades de actividad policétido sintasa, actividad preniltransferasa, actividad hidroxilasa, actividad acetiltransferasa o actividad adenilato sintetasa.
5 Aún más, según otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que deriva de la cepa PF1169 de Penicillium coprobium.
Además, según otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un vector recombinante que 10 comprende el polinucleótido mencionado anteriormente.
Aún más, según otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un transformante que comprende el polinucleótido mencionado anteriormente.
15 Además, según una forma de realización de la presente invención, se proporciona un método para producir un precursor de piripiropeno A, caracterizado en cultivar un transformante en el que se incorpora un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos (c) o (d) anteriormente mencionada simultáneamente o por separado, y aislar el precursor de piripiropeno A a partir de piripiropeno E representado por la siguiente fórmula:
20 [Fórmula química 1]
- 25
- Piripiropeno E
- Aún más, se proporciona un método de producción en donde el precursor de piripiropeno A anteriormente mencionado es uno representado por la siguiente fórmula (I):
- 30
- [Fórmula química 2]
fórmula (I)
35 Además, se proporciona un método para producir un precursor de piripiropeno A caracterizado en cultivar el transformante anteriormente mencionado y aislar el precursor de piripiropeno A a partir de piripiropeno O representado por la siguiente fórmula:
[Fórmula química 3] 40
Piripiropeno O
5 Aún más, se proporciona un método de producción en donde el precursor de piripiropeno A anteriormente mencionado es uno representado por la siguiente fórmula (II): [Fórmula química 4]
fórmula (II)
15 Según una forma de realización de la presente invención, se proporcionan la producción de un análogo novedoso de piripiropeno, la mejora de la productividad de una bacteria que produce piripiropeno A, la producción de un agente insecticida novedoso para microorganismos, la creación de una planta novedosa resistente a plagas de insectos o similares.
Figura 1. La figura 1 muestra un patrón de electroforesis de los productos de PCR mediante gel de agarosa. Para la electroforesis, se usaron los productos de PCR amplificados usando los siguientes cebadores: M: marcador de peso molecular (escalera de 100 pb), carril 1: cebadores de SEQ ID NO: 1 y 2, carril 2: cebadores de SEQ ID NO: 239 y
25 240, carril 3: cebadores de SEQ ID NO: 237 y 238, carril 4: cebadores de SEQ ID NO: 241 y 242, carril 5: cebadores de SEQ ID NO: 247 y 248, carril 6: cebadores de SEQ ID NO: 251 y 252, carril 7: cebadores de SEQ ID NO: 245 y 246, carril 8: cebadores de SEQ ID NO: 243 y 244, carril 9: cebadores de SEQ ID NO: 249 y 250, carril 10: cebadores de SEQ ID NO: 235 y 236, carril 11: cebadores de SEQ ID NO: 233 y 234, carril 12: cebadores de SEQ ID NO: 227 y 228, carril 13: cebadores de SEQ ID NO: 229 y 230, carril 14: cebadores de SEQ ID NO: 231 y 232.
30 Figura 2. De forma similar a la figura 1, la figura 2 muestra un patrón de electroforesis de productos de PCR mediante gel de agarosa. Para la electroforesis, se usaron los productos de PCR amplificados usando los siguientes cebadores: M: marcador de peso molecular (escalera de 100 pb), carril 1: cebadores de SEQ ID NO: 253 y 254, carril 2: cebadores de SEQ ID NO: 257 y 258, carril 3: cebadores de SEQ ID NO: 259 y 260, carril 4: cebadores de
35 SEQ ID NO: 255 y 256, carril 5: cebadores de SEQ ID NO: 261 y 262.
Figura 3. De forma similar a la figura 1, la figura 3 muestra un patrón de electroforesis de productos de PCR en gel de agarosa. Para la electroforesis, se usaron los productos de PCR amplificados usando los siguientes cebadores: carril 1: marcador de peso molecular (escalera de 100 pb), carril 2: cebadores de SEQ ID NO: 264 y 265 (fragmento
40 amplificado de 400 pb).
Figura 4. La figura 4 muestra el mapa plasmídico de pUSA.
Figura 5. La figura 5 muestra el mapa plasmídico de pPP2.
Figura 6. La figura 6 muestra un esquema de la amplificación del ADNc de P450-2.
Figura 7. La figura 7 muestra el mapa plasmídico de pPP3.
Figura 8. La figura 8 muestra el espectro de 1H-RMN de piripiropeno E en acetonitrilo deuterado.
Figura 9. La figura 9 muestra el espectro de 1H-RMN en acetonitrilo deuterado de un producto del cultivo de Aspergillus oryzae transformado con el plásmido pPP2.
Figura 10. La figura 10 muestra el espectro de 1H-RMN de piripiropeno O en acetonitrilo deuterado.
Figura 11. La figura 11 muestra el espectro de 1H-RMN en acetonitrilo deuterado de un producto del cultivo de Aspergillus oryzae transformado con el plásmido pPP3.
Depósito de microorganismos
Escherichia coli (Escherichia coli EPI300™-T1R) transformada con el plásmido PCC1-PP1 se ha depositado con el Depositario de Organismos de Patentes Internacionales, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón, 305-8566), con el número de acceso FERM BP-11133 (convertido del depósito nacional con el número de acceso FERM P-21704) (referencia de identificación por los depositantes: Escherichia coli EPI300™-T1R/pCC1-PP1) el 9 de octubre, 2008 (fecha del depósito original).
Aspergillus oryzae transformada con el plásmido pPP2 se ha depositado con el Depositario de Organismos de Patentes Internacionales, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón, 305-8566), con el número de acceso FERM BP-11137 (referencia de identificación por los depositantes: Aspergillus oryzae pPP2-1) el 23 de junio, 2009.
Aspergillus oryzae transformada con el plásmido pPP3 se ha depositado con el Depositario de Organismos de Patentes Internacionales, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón, 305-8566), con el número de acceso FERM BP-11141 (referencia de identificación por los depositantes: Aspergillus oryzae PP3-2) el 3 de julio, 2009.
Polinucleótido aislado
La presente invención es un polinucleótido aislado. El polinucleótido aislado según la presente invención es (a) un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 266; (b) un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 266 en condiciones rigurosas, o (c) un polinucleótido que tiene una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 267 a 274 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a las mismas. El polinucleótido aislado mencionado anteriormente preferiblemente tiene una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad enzimática implicada en la biosíntesis de piripiropeno A.
En la presente invención, “una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente” significa una secuencia de
aminoácidos que no afecta a una actividad de un polipéptido a pesar del hecho de que uno o más aminoácidos están alterados por sustitución, deleción, adición o inserción. El número de residuos de aminoácidos alterados es preferiblemente de 1 a 40 residuos, más preferiblemente de 1 a varios residuos, aún más preferiblemente de 1 a 8 residuos, lo más preferiblemente de 1 a 4 residuos.
Además, un ejemplo de alteración que no afecta a la actividad incluye una sustitución conservadora. El término, “sustitución conservadora” significa la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos con otros residuos de aminoácidos químicamente similares de modo que la actividad de un polipéptido no se altera sustancialmente. Los ejemplos de las mismas incluyen casos donde un cierto residuo de aminoácido hidrofóbico se sustituye con otro residuo de aminoácido hidrofóbico y casos donde un cierto residuo de aminoácido polar se sustituye con otro residuo de aminoácido polar que tiene las mismas cargas. Los aminoácidos funcionalmente similares capaces de tal sustitución se conocen en la técnica para cada aminoácido. Concretamente, los ejemplos de aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptófano, fenilalanina, metionina y similares. Los ejemplos de aminoácidos polares (neutros) incluyen glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparragina, cisteína y similares. Los ejemplos de aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, histidina, lisina y similares. Los ejemplos de aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico, ácido glutámico y similares.
Además, el polinucleótido aislado de la presente invención puede ser un polinucleótido que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos en cualquiera de (1) o (2) a continuación:
- (1)
- una secuencia polinucleotídica en cualquiera de (a) a (h) a continuación:
- (a)
- una secuencia de nucleótidos de 3342 a 5158 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (b)
- una secuencia de nucleótidos de 5382 a 12777 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (c)
- una secuencia de nucleótidos de 13266 a 15144 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (d)
- una secuencia de nucleótidos de 16220 a 18018 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (e)
- una secuencia de nucleótidos de 18506 a 19296 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (f)
- una secuencia de nucleótidos de 19779 a 21389 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (g)
- una secuencia de nucleótidos de 21793 a 22877 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (h)
- una secuencia de nucleótidos de 23205 a 24773 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266;
- (2)
- una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con una secuencia de nucleótidos en (1) en condiciones rigurosas.
Un polinucleótido que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos en cualquiera de los anteriormente mencionados (1) o (2) preferiblemente codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad enzimática implicada en la biosíntesis de piripiropeno A.
El término “condiciones rigurosas” en la presente invención significa condiciones donde se lleva a cabo una
operación de lavado de las membranas después de la hibridación a altas temperaturas en una solución con bajas concentraciones de sal, por ejemplo, condiciones de lavado en una solución con concentración de SSC 2X (SSC 1X: citrato trisódico 15 mM, cloruro de sodio 150 mM) y SDS al 0,5% a 60ºC durante 20 minutos.
El polinucleótido que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos en cualquiera de los anteriormente mencionados (1) o (2) según la presente invención es uno que codifica un polipéptido que tiene una cualquiera o más actividades de actividad policétido sintasa, actividad preniltransferasa, actividad hidroxilasa, actividad acetiltransferasa o actividad adenilato sintetasa; y, en particular, uno que codifica un polipéptido que tiene la actividad hidroxilasa.
Además, según una forma de realización de la presente invención, el polinucleótido mencionado anteriormente es uno que codifica un polipéptido que tiene una actividad para hidroxilar la posición 7 y/o la posición 13 de los anteriormente mencionados piripiropeno E u O, o uno que codifica un polipéptido que tiene una actividad para hidroxilar la posición 11 del anteriormente mencionado piripiropeno E.
Obtención del polinucleótido aislado
El método para obtener el polinucleótido aislado de la presente invención no está particularmente restringido. Por ejemplo, el polinucleótido se puede aislar de la cepa PF1169 de Penicillium coprobium o una bacteria filamentosa mediante el siguiente método.
Basado en una secuencia de homología obtenida por el método del ejemplo 9 posteriormente o similar, se sintetizan cebadores capaces de amplificar específicamente un gen de policétido sintasa. Se lleva a cabo una PCR para una genoteca genómica en fósmidos de la cepa PF1169 de Penicillium coprobium que se prepara por separado, seguido por hibridación de colonias. Se obtiene mediante ello un vector recombinante y se determina la secuencia de bases de un ADN insertado del mismo.
Además, basado en la secuencia de homología obtenida por el método del ejemplo 9 posteriormente o similar, se sintetizan cebadores capaces de amplificar específicamente un gen de preniltransferasa. Además, se determina la secuencia de bases de un ADN insertado de la misma manera que anteriormente.
Además, basado en la secuencia de homología obtenida por el método del ejemplo 9 posteriormente o similar, se sintetizan cebadores capaces de amplificar específicamente uno cualquiera o ambos de un gen de policétido sintasa y un gen de preniltransferasa. Además, se determina la secuencia de bases de un ADN insertado de la misma manera que anteriormente.
Además, basado en la secuencia de homología de al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 266 y la secuencia de nucleótidos en cualquiera de los anteriormente mencionados (1) o (2) según la presente invención, se sintetizan cebadores capaces de amplificar específicamente uno cualquiera o más de un gen de policétido sintasa, un gen de preniltransferasa, un gen de hidroxilasa, un gen de acetiltransferasa o un gen de adenilato sintetasa, preferiblemente el gen de hidroxilasa. Además, la secuencia de bases de un ADN insertado se determina de la misma manera que anteriormente.
Aún más, basado en una secuencia de aminoácidos conservada entre varias policétido sintasas de bacterias filamentosas, se sintetizaron cebadores degenerados para la amplificación y se determina la secuencia de ADN insertado.
Transformantes
En general, los ejemplos de un método para mejorar la productividad de un producto de metabolismo secundario por recombinación génica incluyen mejorar la expresión de un gen que codifica una proteína que cataliza una reacción biosintética que es una reacción limitante de la velocidad, mejorar la expresión de o desorganizar un gen que regula la expresión de un gen biosintético, bloquear un sistema del metabolismo secundario innecesario, y similares. Por tanto, especificar el gen biosintético hace posible mejorar la productividad del producto del metabolismo secundario ligando el gen a un vector apropiado e introduciendo el vector en una bacteria de producción.
Mientras tanto, para crear una sustancia activa novedosa, por recombinación génica, se llevan a cabo, alteración de dominios de la policétido sintasa [Ikada y Ohmura, "PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME" Vol. 43, p. 12651277, 1998], [Carreras, C.W. y Santi, D.V., "Current Opinion in Biotechnology", (UK), 1998, Vol. 9, p. 403-411], [Hutchinson, C. R., "Current Opinion in Microbiology", (UK), 1998, Vol. 1, p. 319-329], [Katz, L. y McDaniel, R., "Medicinal Research Reviews", (USA), 1999, Vol. 19, p. 543-558]; desorganización de un gen biosintético; introducción de un gen de modificación de enzimas de otros organismos [Hutchinson, C. R., "Bio/Technology", (USA), 1994, Vol. 12, p. 375-380]; y similares. Por tanto, especificar el gen biosintético hace posible mejorar la productividad del producto del metabolismo secundario ligando el gen a un vector apropiado e introduciendo el vector en una bacteria de producción.
Por tanto, se puede producir piripiropeno A o se puede mejorar la productividad del mismo ligando el polinucleótido aislado según la presente invención al vector apropiado, introduciendo el vector en un huésped, expresándolo, aumentando la expresión del mismo, o llevando a cabo la desorganización génica de parte del polinucleótido aislado usando recombinación homóloga y alterando las funciones del mismo.
La desorganización génica usando recombinación homóloga se puede llevar a cabo según un método convencional. La preparación de un vector usado para la desorganización génica y la introducción del vector en un huésped son aparentes para los expertos en la materia.
El vector recombinante según la presente invención preferiblemente comprende uno cualquiera o más de polinucleótidos que tienen la secuencia de nucleótidos en SEQ ID NO: 266 y el anteriormente mencionado (1); un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con la secuencia de nucleótidos en SEQ ID NO: 266 y el anteriormente mencionado (1) en condiciones rigurosas, o un polinucleótido que tiene una secuencia polinucleotídica que codifica al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 267 a 274 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a las mismas. Más preferiblemente, el vector recombinante según la presente invención es uno en donde el polipéptido anteriormente mencionado comprende un polinucleótido que hidroxila la posición 7 y/o la posición 13 de piripiropeno E u O, y el polipéptido anteriormente mencionado comprende un polinucleótido que hidroxila la posición 11 de piripiropeno E.
Se puede preparar un vector recombinante para la introducción de genes modificando el polinucleótido proporcionado por la presente invención en una forma apropiada dependiendo de un objeto y ligándolo a un vector según un método convencional, por ejemplo, técnicas de recombinación génica descritas en [Sambrook, J. et al., "Molecular cloning: a laboratory manual", (USA), 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989].
El vector recombinante usado en la presente invención se puede seleccionar apropiadamente de vectores de virus, plásmidos, fósmidos, cósmidos o similares. Por ejemplo, cuando una célula huésped es Escherichia coli, los
ejemplos de los mismos incluyen bacteriófago basado en el fago λ y plásmidos basados en pBR y pUC. En el caso
de un Bacillus subtilis, los ejemplos incluyen plásmidos basados en pUB. En el caso de levadura, los ejemplos incluyen plásmidos basados en YEp, YRp, YCp y YIp.
Además, se prefiere que al menos un plásmido entre los plásmidos usados comprenda un marcador de selección para seleccionar un transformante. Como el marcador de selección, se puede usar un gen que codifica resistencia a un fármaco y un gen que complementa auxotrofia. Los ejemplos preferidos concretos de los mismos incluyen cuando un huésped que se va a usar es una bacteria, genes de resistencia a ampicilina, genes de resistencia a kanamicina, gen de resistencia a tetraciclina y similares; en el caso de levadura, el gen biosintético de triptófano (TRP1), gen biosintético de uracilo (URA3), gen biosintético de leucina (LEU2) y similares; en el caso de un hongo, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a bialafos, genes de resistencia a bleomicina, genes de resistencia a aureobasidina, y similares; y en el caso de una planta, genes de resistencia a kanamicina, genes de resistencia a bialafos y similares.
Además, las moléculas de ADN que sirven como un vector de expresión usado en la presente invención preferiblemente tiene secuencias de ADN necesarias para expresar cada gen, señales reguladoras de la transcripción y señales reguladoras de la traducción tales como promotores, señales de iniciación de la transcripción, sitios de unión al ribosoma, señales de parada de la traducción, terminadores. Los ejemplos preferidos de los promotores incluyen promotores del operón lactosa, del operón triptófano y similares en Escherichia coli; promotores del gen de la alcohol deshidrogenasa, del gen de la fosfatasa ácida, gen metabolizante de galactosa, gen de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa o similares en levadura; promotores del gen de la α-amilasa, del gen de la glucoamilasa, gen de la celobiohidrolasa, gen de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, gen abp1 o similares en hongos; un promotor del ARN de 35S del CaMV, un promotor del ARN de 19S del CaMV o el promotor del gen de la nopalina sintetasa en plantas.
Un huésped en el que se introduce el polinucleótido aislado según la presente invención se puede seleccionar apropiadamente, dependiendo del tipo de vector usado, de actinomicetos, Escherichia coli, Bacillus subtilis, levadura, bacterias filamentosas, células vegetales o similares.
Se puede seleccionar un método para introducir un vector recombinante en un huésped, dependiendo de la célula huésped en ensayo, de transferencia conyugal, transducción por fagos, así como métodos de transformación tal como un método con ión de calcio, un método con ión de litio, un método de electroporación, un método con PEG, un método con Agrobacterium o un método de cañón particulado.
En los casos donde se introduce una pluralidad de genes en las células huésped en la presente invención, los genes pueden estar contenidos en una única molécula de ADN o individualmente en diferentes moléculas de ADN. Además, cuando una célula huésped es una bacteria, cada gen se puede diseñar de modo que se exprese como ARNm policistrónico y se hace en una molécula de ADN.
El transformante según la presente invención preferiblemente comprende cualquiera de uno o más de los polinucleótidos que tienen la secuencia de nucleótidos en SEQ ID NO: 266 y el anteriormente mencionado (1); un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 266 y la anteriormente mencionada (1) en condiciones rigurosas, o un polinucleótido que tiene una secuencia polinucleotídica que codifica al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 267 a 274 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a las mismas.
El transformante obtenido se puede cultivar por un método convencional y se pueden estudiar las características recién obtenidas. Como medio, se pueden usar componentes comúnmente usados, por ejemplo, como fuentes de carbono, glucosa, sacarosa, jarabe de almidón, dextrina, almidón, glicerol, molasas, aceites animales y vegetales o similares. Además, como fuentes de nitrógeno, se puede usar harina de soja, germen de trigo, líquido de maceración del maíz, harina de semilla de algodón, extracto de carne, polipeptona, extracto de malta, extracto de levadura, sulfato de amonio, nitrato de sodio, urea o similares. Además, según se requiera, la adición de sodio, potasio, calcio, magnesio, cobalto, cloro, ácido fosfórico (hidrogenofosfato dipotásico o similar), ácido sulfúrico (sulfato de magnesio
o similar) o sales inorgánicas que pueden generar otros iones es eficaz. Además, según se requiera, se pueden añadir varias vitaminas tales como tiamina (clorhidrato de tiamina o similar), aminoácidos tal como ácido glutámico (glutamato de sodio o similar) o asparragina (DL-asparragina o similar), oligonutrientes tal como nucleótidos, o agentes de selección tales como antibióticos. Además, se pueden añadir apropiadamente, sustancias orgánicas o sustancias inorgánicas que ayudan al crecimiento de un bacteria y fomentan la producción de piripiropeno A.
El pH del medio es, por ejemplo, aproximadamente de pH 5,5 a pH 8. Como método para cultivar, se pueden emplear cultivo sólido en condiciones aerobias, cultivo con agitación, cultivo con burbujeo con agitación o cultivo aerobio de parte profunda y, en particular, el cultivo aerobio de parte profunda es el más apropiado. La temperatura apropiada para el cultivo es de 15ºC a 40ºC y, en muchos casos, el crecimiento tiene lugar aproximadamente de 22ºC a 30ºC. La producción de piripiropeno A varía dependiendo del medio y las condiciones de cultivo, o el huésped usado. En cualquier método para cultivar, la acumulación habitualmente alcanza un pico de 2 días a 10 días. El cultivo se termina en el momento cuando la acumulación de piripiropeno A en el cultivo alcanza el pico y se aísla y purifica una sustancia deseada del cultivo.
Para aislar piripiropeno A del cultivo, se puede extraer y purificar por un medio de separación habitual usando propiedades del mismo, tal como un método de extracción con solvente, un método con resina de intercambio iónico, un método de filtración en gel, diálisis, un método de precipitación, un método de cristalización, que se pueden usar individualmente o apropiadamente usar en combinación.
Método para producir un precursor de piripiropeno A
Para aislar piripiropeno A, se puede aislar piripiropeno A a partir de un precursor de piripiropeno A usando un método conocido. Un ejemplo de un método conocido incluye el método del documento WO2009/022702. Cultivando un microorganismo que contiene un vector que contiene uno o más de los anteriores, se puede aislar el precursor de piripiropeno A a partir de piripiropeno E. El precursor de piripiropeno A puede ser, por ejemplo, el compuesto representado por la anteriormente mencionada fórmula (I).
Además, cultivando un microorganismo que comprende un vector que contiene uno o más, el precursor de piripiropeno A se puede aislar a partir de piripiropeno O. Un ejemplo puede ser el compuesto representado por la anteriormente mencionada fórmula (II).
La presente invención se ilustrará además en detalle mediante los siguientes ejemplos, que no se pretende que restrinjan la presente invención.
Ejemplo 1: Preparación de ADN genómico de la cepa PF1169 de Penicillium coprobium
Se colocó medio NB esterilizado (500 ml) en un matraz Erlenmeyer (1 L). Se añadió la cepa PF1169 de Penicillium coprobium (Journal of Technical Disclosure 500997/2008 (documento de patente 15)) precultivada en medio agar CMMY 1/2 a 28ºC durante 4 días al medio mencionado anteriormente y se sometió a cultivo líquido a 28ºC durante 4 días. Se llevó a cabo filtración con Miracloth para obtener 5 g de células bacterianas. De estas células bacterianas, se obtuvieron 30 µg de ADN genómico según el manual adjunto al kit de purificación de ADN genómico Genomic-tip 100/G (fabricado por Qiagen K.K.).
Ejemplo 2: Cebadores degenerados para la amplificación de policétido sintasa (PKS) y fragmento amplificado de la misma
Basado en la secuencia de aminoácidos conservada entre varias policétido sintasas de bacterias filamentosas, se diseñaron y sintetizaron los siguientes cebadores como cebadores degenerados para amplificación:
LC1: GAYCCIMGITTYTTYAAYATG (SEQ ID NO:1)
LC2c: GTICCIGTICCRTGCATYTC (SEQ ID NO:2)
(en donde R=A/G, Y=C/T, M=A/C, I=inosina).
Usando estos cebadores degenerados, el ADN genómico preparado en el ejemplo 1 y la polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Bio Inc.) se dejaron reaccionar según el manual adjunto. Se detectó un fragmento amplificado de aproximadamente 700 pb (véase la figura 1). Además, el fragmento amplificado mencionado anteriormente se analizó apara especificar la secuencia de sus 500 pb internas (SEQ ID NO: 3).
Ejemplo 3: Secuenciación a gran escala del ADN genómico y búsqueda de homología de secuencia de aminoácidos
El ADN genómico de la cepa PF1169 de Penicillium coprobium obtenido en el ejemplo 1 se sometió a secuenciación a gran escala y búsqueda de homología para secuencias de aminoácidos. Específicamente, parte de 50 µg de ADN genómico se pretrató y después de ello se sometió al secuenciador de ADN Roche 454FLX para obtener aproximadamente 250 pb, 103 miles de secuencias de fragmentos (en total, 49 Mb de secuencia).
Para estas secuencias, como secuencias conocidas entre policétido sintasas y preniltransfereasas, las siguientes cinco secuencias (secuencias derivadas de policétido sintasas: PKS de 2146 a.a. de Aspergillus(A.) fumigatus y ácido 6-metilsalicílico sintasa de 1744 a.a. de Penicillium(P.) griseofluvum; así como preniltransferasas: preniltransferasa de Aspergillus (A.) fumigatus, preniltransferasa de Aspergillus(A.) fumigatus (4-hidroxibezoato octapreniltransferasa) y preniltransferasa de Penicillium(P.) marneffei) se seleccionaron y se llevó a cabo una búsqueda mediante el software de búsqueda de homología de secuencia blastx, obteniéndose con ello 89, 86, 2, 1 y 3 secuencias de homología, respectivamente (véase la tabla 1). Además, a partir de las secuencias de homología de PKS de 2146 a.a. de A. fumigatus y ácido 6-metilsalicílico sintasa de 1744 a.a. de P. griseofluvum, se obtuvieron respectivamente 19 y 23 secuencias cóntigo (las secuencias cóntigo de PKS de 2146 a.a. de A. fumigatus: SEQ ID NO: 179 a 179; las secuencias cóntigo de ácido 6-metilsalicílico sintasa de 1744 a.a. de P. griseofluvum: SEQ ID NO: 198 a 220) (véase la tabla 1).
Tabla 1
- Nombre de la enzima
- Origen Número de secuencias de homología SEQ ID NO
- PKS de 2146 a.a. de A. fumigatus
- 89 4-92
- Policétido sintasas
- ácido 6-metilsalicílico sintasa de 1744 a.a. de P. griseofluvum 86 93-178
- PKS de 2146 a.a. de A. fumigatus
- 19 (secuencias cóntigo) 179-197
- ácido 6-metilsalicílico sintasa de 1744 a.a. de P. griseofluvum
- 23 (secuencias cóntigo) 198-220
- preniltransferasa de A. fumigatus
- 2 221, 222
- Preniltransferasas
- preniltransferasa de A. fumigatus (4hidroxibezoato octapreniltransferasa) 1 223
- preniltransferasa de P. marneffei
- 3 224-226
Ejemplo 4: Amplificación por PCR de ADN genómico
5 De los resultados de búsqueda de blastx obtenidos en el ejemplo 3, para policétido sintasas, se sintetizaron 13 tipos de pares de cebadores mostrados en SEQ ID NO: 227 a 252. Similarmente, para preniltransferasas, se sintetizaron 5 tipos de pares de cebadores mostrados en SEQ ID NO: 253 a 262. Cuando se llevó a cabo PCR para el ADN genómico usando estos cebadores, se vieron fragmentos amplificados con el tamaño esperado para todos los pares
10 de cebadores (véanse la figura 1 y la figura 2).
Ejemplo 5: Construcción de genoteca genómica en fagos
Se construyó una genoteca genómica en fago λ de la cepa PF1169 de Penicillium coprobium usando el kit
15 λBlueSTAR Xho I Half-site Arms (fabricado por Takara Bio Inc., No. de catálogo 69242-3) según el manual adjunto. Es decir, el ADN genómico se digirió parcialmente usando una enzima de restricción, Sau3A1. El fragmento de ADN con aproximadamente 20 kb (0,5 μg) se ligó con 0,5 μg de ADN λBlueSTAR adjunto al kit. Esta solución de ligación se sometió a empaquetamiento in vitro usando el kit de empaquetamiento Lambda INN (fabricado por Nippon Gene Co., Ltd.) basándose en el manual adjunto para obtener 1 ml de una solución. Esta solución con fagos
20 empaquetados (10 µl) se infectó en 100 µl de la cepa ER1647 de E. coli y se cultivó en un medio de formación de placas a 37ºC durante la noche, obteniéndose mediante ello aproximadamente 500 clones de placas. Por tanto, se construyó la genoteca genómica compuesta de aproximadamente 50000 clones de fagos en los que se introdujeron de 10 a 20 kb de ADN genómico de la cepa PF1169 de Penicillium coprobium mediante infección.
25 Ejemplo 6: Cribado de una genoteca de fagos
Para 10000 clones de la genoteca en fagos preparada en el ejemplo 5, se llevó a cabo el cribado primario mediante hibridación en placa usando, como sonda, el producto de PCR amplificado por el par de cebadores LC1-LC2c preparado anteriormente. Para el marcaje y detección de la sonda, se usó el sistema AlkPhos Direct Labelling and
30 Detection con CDP-Star (fabricado por GE Healthcare, No. de catálogo RPN3690). La hibridación mencionada anteriormente se llevó a cabo según el manual adjunto.
Mediante el cribado primario, 6 clones permanecieron como candidatos. Además, como resultado del cribado secundario por hibridación en placa, se obtuvieron 4 clones. Estos clones positivos se infectaron en la cepa BM25.8
35 de E. coli y los fagos se convirtieron a plásmidos según el manual adjunto, obteniéndose con ello 4 tipos de plásmidos que contenían una región deseada.
Ejemplo 7: Preparación de una genoteca genómica en fósmidos
40 Se construyó una genoteca genómica de la cepa PF1169 de Penicillium coprobium usando el kit CopyControl Fosmid Library Production (fabricado por EPICENTRE, No. de catálogo CCFOS110) según el manual adjunto al mismo. Es decir, 0,25 µg de fragmento de ADN de aproximadamente 40 kb de ADN genómico se hicieron con extremos romos y después se incorporaron en el vector fósmido pCCFOS (fabricado por Epicentre). Esta solución de ligación se sometió a empaquetamiento in vitro usando el MaxPlac Lambda Packaging Extract adjunto al kit
45 basado en el manual adjunto al kit. Esta solución con virus empaquetados (10 µl) se infectó en 100 µl de la cepa EPI300™-T1R de E. coli y se cultivó en un medio que contenía cloranfenicol a 37ºC durante la noche y se seleccionó, obteniéndose con ello aproximadamente 300 clones de placas. Por tanto, se obtuvieron aproximadamente 30000 clones de los fósmidos en los que se introdujeron 40 kb del ADN genómico de la cepa PF1169 de Penicillium coprobium mediante infección. Se hicieron alícuotas en una placa de 96 pocillos de modo que
50 hubiera aproximadamente 50 clones por pocillo. Por tanto, se construyó la genoteca genómica compuesta de 96 conjuntos, aproximadamente 4800 clones.
Ejemplo 8: Cribado de la genoteca de fósmidos
Según el manual adjunto al fósmido, los ADN de plásmido se prepararon individualmente de los 96 conjuntos de la genoteca preparada en el ejemplo 7. Usando los cebadores degenerados para la amplificación de la policétido sintasa sintetizados en el ejemplo 2, se llevó a cabo una PCR para los 96 conjuntos de estas muestras de ADN de plásmido. Como resultado, se amplificaron fragmentos de ADN de aproximadamente 700 pb de 9 conjuntos. Además, se preparó una placa petri que contenía colonias de aproximadamente 300 clones o más a partir de los conjuntos positivos y se volvió a cribar por hibridación de colonias. Como resultado, usando el par de cebadores LC1-LC2c, se obtuvieron 9 tipos de fósmidos de aproximadamente 4800 clones.
Ejemplo 9: Secuenciación a gran escala de ADN genómico y búsqueda de homología de secuencias de aminoácidos
El ADN genómico de la cepa PF1169 de Penicillium coprobium obtenido en el ejemplo 1 se sometió a secuenciación a gran escala y búsqueda de homología para secuencias de aminoácidos. Específicamente, parte de 50 µg del ADN genómico se pretrató y después se sometió a secuenciador de ADN Roche 454FLX para obtener 1405 secuencias de fragmentos con una longitud media de cóntigo de 19,621 kb (secuencia de una longitud total de bases de 27,568160 Mb).
Para estas secuencias, como secuencias conocidas entre policétido sintasas y preniltransferasas, se seleccionaron las siguientes cinco secuencias (secuencias derivadas de policétido sintasas: ácido 6-metilsalicílico sintasa de 1744
a.a. de Penicillium(P.) griseofluvum (P22367) y PKS de 2146 a.a. de Aspergillus(A.) fumigatus (Q4WZA8); así como preniltransferasas: preniltransferasa de Penicillium(P.) marneffei (Q0MRO8), preniltransferasa de Aspergillus(A.) fumigatus (Q4WBI5) y preniltransferasa de Aspergillus (A.) fumigatus (4-hidroxibezoato octapreniltransferasa) (Q4WLD0)) y se llevó a cabo una búsqueda mediante el software de búsqueda de secuencia de homología blastx, obteniéndose con ello 22 (P22367), 21 (Q4WZA8), 2 (Q0MRO8), 3 (Q4WBI5) y 3 (Q4WLD0) de las secuencias homólogas, respectivamente.
Ejemplo 10: Cribado de la genoteca en fósmidos y análisis de secuencia de genes agrupados
Según el manual ajunto al kit de fósmidos (fabricado por EPICENTRE, Kit CopyControl Fosmid Library Production), los ADN de plásmidos se prepararon individualmente de 96 conjuntos de la genoteca preparada en el ejemplo 7. Basado en las secuencias de bases determinadas por el secuenciador de ADN Roche 454FLX, se llevó cabo una búsqueda de homología para secuencias de aminoácidos para buscar regiones adyacentes a policétido sintasa y preniltransferasa. Basado en la secuencia de bases de preniltransferasa de la región obtenida, se sintetizó un par de cebadores (No. 27) capaz de amplificar un fragmento de ADN de 400 pb. Usando los cebadores, se llevó a cabo PCR para estos 48 conjuntos de muestras de ADN de plásmido. Como resultado, se amplificaron fragmentos de ADN esperados de aproximadamente 400 pb (SEQ ID NO: 263) de 11 conjuntos (véase la figura 3). Además, se preparó una placa petri que contenía colonias de aproximadamente 300 clones o más de 6 conjuntos de los conjuntos positivos y se llevó a cabo un recribado por hibridación de colonias. Como resultado, usando el par de cebadores 27F + 27R (cebador 27F: SEQ ID NO: 264, cebador 27R: SEQ ID NO: 265), se obtuvieron 4 tipos de fósmidos a partir de aproximadamente 4800 clones. Uno de ellos se nombró pCC1-PP1 y se determinó la secuencia entera del fragmento insertado (SEQ ID NO: 266).
El pCC1-PP1 obtenido se transformó en la cepa EPI300™-T1R de Escherichia coli (incluida en el kit de fósmidos), obteniéndose de esta manera cepa EPI300™-T1R de Escherichia coli/pCC1-PP1.
Cuando se llevó a cabo una búsqueda de homología entre la secuencia anteriormente mencionada de SEQ ID NO: 266 y cada una de la enzima formadora de adenilato; policétido sintasa similar a LovB; citocromo P450 monoxigenasa, proteína integral de membrana, monoxigenasa dependiente de FAD, que son hidroxilasas; preniltransferasa similar a UbiA; acetiltransferasa, proteína de biosíntesis de toxina Tri7, que son acetiltransferasas; y ATPasa transportadora de cationes (las enzimas mencionadas anteriormente derivan todas de la cepa Af293 de Aspergillus fumigatus), se vio una alta homología del 70% o más en cada búsqueda.
Los nucleótidos 3342 a 5158 de SEQ ID NO: 266 codifican la enzima formadora de adenilato y el correspondiente polipéptido se muestra con la secuencia de aminoácidos representado en SEQ ID NO: 267; los nucleótidos 5382 a 12777 de SEQ ID NO: 266 codifican la policétido sintasa similar a LovB y el correspondiente polipéptido se muestra con la secuencia de aminoácidos representado en SEQ ID NO: 268; los nucleótidos 13266 a 15144 de SEQ ID NO: 266 (de aquí en adelante, una proteína codificada por esta secuencia polinucleotídica (P450-1) se denomina citocromo P450 monoxigenasa (1)) y los nucleótidos 16220 a 18018 (de aquí en adelante, una proteína codificada por esta secuencia polinucleotídica (P450-2) se denomina citocromo P450 monoxigenasa (2)) codifican citocromo P450 monoxigenasas y los polipéptidos correspondientes se muestran con las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 269 y 270, respectivamente; los nucleótidos 18506 a 19296 de SEQ ID NO: 266 codifica la proteína integral de membrana y el correspondiente polipéptido se muestra con la secuencia de aminoácidos representado en SEQ ID NO: 271; los nucleótidos 19779 a 21389 de SEQ ID NO: 266 codifica la monoxigenasa dependiente de FAD y el correspondiente polipéptido se muestra con la secuencia de aminoácidos representado en SEQ ID NO: 272; los nucleótidos 21793 a 22877 de SEQ ID NO: 266 codifican la preniltransferasa similar a UbiA y el correspondiente polipéptido se muestra con la secuencia de aminoácidos representado en SEQ ID NO: 273; los nucleótidos 23205 a 24773 de SEQ ID NO: 266 codifican la acetiltransferasa y el correspondiente polipéptido se muestra con la secuencia de aminoácidos representado en SEQ ID NO: 274; los nucleótidos 25824 a 27178 de SEQ ID NO: 266 codifica la proteína de biosíntesis de toxina Tri7 y el correspondiente polipéptido se muestra con la secuencia de aminoácidos representado en SEQ ID NO: 275; y los nucleótidos 27798 a 31855 de SEQ ID NO: 266 codifica la ATPasa transportadora de cationes y el correspondiente polipéptido se muestra con la secuencia de aminoácidos representado en SEQ ID NO: 276.
Ejemplo 11: Hidroxilación de piripiropeno E o piripiropeno O mediante transformación de Aspergillus oryzae
El piripiropeno E usado posteriormente se puede producir mediante, por ejemplo, un método para cultivar un microorganismo basado en el método descrito en la publicación de la patente japonesa accesible al público No. 239385/1996 (Documento de patente 4), el documento WO94/09147 o la patente en EE UU No. 5597835, o el método de síntesis total descrito en Tetrahedron Letters, vol. 37, No. 36, 6461-6464, 1996. Además, el piripiropeno O usado posteriormente se puede producir mediante, por ejemplo, un método para cultivar un microorganismo basado en el método descrito en J. Antibiotics 49, 292-298, 1996 o el documento WO94/09147.
- (1)
- Preparación del vector de expresión para introducir en una bacteria filamentosa
pUSA (figura 4) y pHSG399 (Takara Bio Inc.) se digirieron individualmente con KpnI y se ligaron, obteniéndose con ello pUSA-HSG. Este plásmido se digirió con SmaI y KpnI en el orden mencionado, y se sometió a purificación por gel, obteniéndose de esta manera un ADN vector lineal que tiene un extremo cohesivo KpnI y un extremo romo SmaI.
- (2)
- Preparación del plásmido pPP2
Con el fósmido pCC1-PP1 como molde, el polinucleótido del anteriormente mencionado P450-1 se amplificó usando un par de cebadores P450-1 con Kpn F (SEQ ID NO: 277)/P450-1 con Swa R (SEQ ID NO: 278). El fragmento de ADN purificado se clonó en pCR-Blunt (Invitrogen, No. de catálogo K2700-20). El plásmido obtenido se digirió con KpnI y SwaI. El fragmento de P450-1 anteriormente mencionado se ligó el vector pUSA-HSG anteriormente mencionado, obteniéndose de esta manera un plásmido pPP2 mostrado en la figura 5.
- (3)
- Preparación del plásmido pPP3
Con el fósmido pCC1-PP1 como molde, según el curso mostrado en la figura 6, se amplificaron primero exones solos usando los pares de cebadores F1 (SEQ ID NO:279)/R1 (SEQ ID NO:280), F2 (SEQ ID NO:281)/R2 (SEQ ID NO:282), F3 (SEQ ID NO:283)/R3 (SEQ ID NO:284), F4 (SEQ ID NO:285)/R4 (SEQ ID NO:286), F5 (SEQ ID NO:287)/R5 (SEQ ID NO:288) y F6 (SEQ ID NO:289)/R6 (SEQ ID NO:290), obteniéndose con ello seis fragmentos. A continuación, se llevó a cabo una amplificación con estos fragmentos como moldes usando los pares de cebadores F1/R2, F3/R4 y F5/R6, obteniéndose de esta manera fragmentos más largos. Además, repitiendo la amplificación usando los pares de cebadores F1/R4 y F1/R6, se preparó ADNc que no contenía intrones del polinucleótido del P450-2 anteriormente mencionado. Este fragmento de ADNc se insertó en pCR-Blunt (Invitrogen, No. de catálogo K2700-20) y el plásmido obtenido se usó como molde para amplificación mediante un par de cebadores, infusión F de ADNc de P450-2 (SEQ ID NO: 291)/infusión R de ADNc de P450-2 (SEQ ID NO: 292). Basándose en el manual del kit, se obtuvo un plásmido pPP3 mostrado en la figura 7 usando el kit In-Fusion Advantage PCR Cloning (Clontech).
(4) Transformación de Aspergillus oryzae (A. oryzae)
En un medio de agar CD-Met (que contiene L-metionina 40 µg/ml), se cultivó A. oryzae (cepa HL-1105) a 30ºC durante una semana. De esta placa petri, se recogieron conidios (>108) y se sembraron en 100 ml de medio líquido YPD en un matraz de 500 ml. Después de cultivar 20 horas (30ºC, 180 rpm), se obtuvieron células bacterianas que tenían forma de bola de musgo. Las células bacterianas se recogieron con un filtro de vidrio 3G-1, se lavaron con NaCl 0,8 M, y se eliminó el agua bien. Lo resultante se resuspendió en solución TF I (solución de formación de protoplastos) y después se agitó a 30ºC, a 60 rpm durante 2 horas. A un intervalo de 30 minutos, se llevó a cabo observación con el microscopio y se comprobó la presencia de protoplastos. Después de ello, el medio de cultivo se filtró y se sometió a centrifugación (2000 rpm, 5 minutos) para recoger los protoplastos, que se lavaron después con solución TF II. Después de lavar, se añadieron 0,8 volúmenes de solución TF II y 0,2 volúmenes de solución TF III y se mezcló, obteniendo de esta manera una suspensión de protoplastos.
A 200 µl de esta suspensión, se añadieron 10 µg de ADN de plásmido (pPP2 o pPP3). La mezcla se dejó reposar en hielo 30 minutos y se añadió solución TF III (1 ml). La mezcla resultante se mezcló suavemente y después se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de ello, el ADN de plásmido se introdujo en los protoplastos anteriormente mencionados. A esto, se añadió solución TF II (8 ml) y se sometió a centrifugación (a 2000 rpm durante 5 minutos). Además, los protoplastos se recuperaron después dejándose de 1 a 2 ml. La solución
de protoplastos recuperada se dejó caer a un medio de regeneración (fase inferior) y se echó un medio de regeneración (fase superior). Lo resultante se mezcló haciendo girar una placa petri y después se cultivó a 30ºC durante 4 a 5 días. Los clones generados se aislaron en el medio de regeneración (fase inferior), se subcultivaron y purificaron, obteniéndose con ello un transformante (Aspergillus oryzae PP2-1 y Aspergillus oryzae PP3-2).
La solución TF I anteriormente mencionada (solución de formación de protoplastos) se preparó con las siguientes composiciones.
Nombre del compuesto Concentración Yatalasa (fabricado por Takara Bio Inc.) 20 mg/ml Sulfato de amonio 0,6 M Ácido maleico-NaOH 50 mM
Después de preparar las composiciones anteriormente mencionadas (pH 5,5), se llevó a cabo esterilización por filtración.
La solución TF II anteriormente mencionada se preparó con las siguientes composiciones.
Nombre del compuesto Sorbitol 1,2 M (MW = 182,17) 43,72 g CaCl2 50 mM 10 ml de CaCl2 1 M (1/20) NaCl 35 mM 1,4 ml de NaCl 5 M Tris-HCl 10 mM 2 ml de Tris-HCl 1 M (1/100) Hasta un volumen total 200 ml
Después de preparar las composiciones anteriormente mencionadas, se llevó a cabo esterilización con autoclave.
La solución TF III anteriormente mencionada se preparó con las siguientes composiciones.
Nombre del compuesto PEG4000 al 60% 6 g CaCl2 50 mM 500 µl de CaCl2 1 M (1/20) Tris-HCl 50 mM 500 µl de Tris-HCl 1 M (1/100) Hasta un volumen total 10 ml
Después de preparar las composiciones anteriormente mencionadas, se llevó a cabo esterilización por filtración.
El medio de regeneración anteriormente mencionado se preparó con las siguientes composiciones.
- Nombre del compuesto
- Concentración
- Sorbitol (MW = 182,17)
- 218,6 g 1,2 M
- NaNO3
- 3,0 g 0,3% (p/v)
- KCl
- 2,0 g 0,2% (p/v)
- KH2PO4
- 1,0 g 0,1% (p/v)
- MgSO4·7H2O
- 2 ml de MgSO4 1 M 0,05% 2 mM
- Solución de oligoelementos
- 1 ml
- Glucosa
- 20,0 g 2% (p/v)
- Hasta el volumen total de 1 litro
Después de preparar las composiciones anteriormente mencionadas (pH 5,5), se llevó a cabo esterilización con autoclave.
Además, la solución de oligoelementos usada anteriormente se preparó con la siguiente composición.
Nombre del compuesto FeSO4·7H2O 1,0 g ZnSO4·7H2O 8,8 g CuSO4·5H2O 0,4 g Na2B4O7·10H2O 0,1 g (NH4)6Mo7O24·4H2O 0,05 g Hasta un volumen total de 1 L
Después de preparar las composiciones anteriormente mencionadas, se llevó a cabo esterilización con autoclave.
(5) Análisis de función y ensayos de cultivo de adición de P450-1
A un medio YPD (extracto de levadura al 1% (p/v), peptona al 2% (p/v), dextrosa al 2% (p/v)) que contenía maltosa al 1% (p/v), se añadió 1/100 volumen de una solución de dimetilsulfóxido de piripiropeno E 2 mg/ml para proporcionar el medio A. De flora de Aspergillus oryzae PP2-1 cultivada en medio agar de Czapek Dox, se recogieron conidios de los mismos y se resuspendieron en agua esterilizada. Esta suspensión de conidios se ajustó a 104 esporas/ml. Además, se añadieron 100 µl de esta suspensión de conidios ajustada a 10 ml de medio A y se cultivó con agitación a 25ºC durante 96 horas. A esta solución de cultivo, se añadieron 10 ml de acetona y la mezcla se mezcló bien. Después de ello, la acetona se eliminó usando un concentrador centrífugo. A esto, se añadieron 10 ml de acetato de etilo y la mezcla resultante se mezcló bien y después solo se recuperó la fase de acetato de etilo. Un producto seco obtenido eliminando el acetato de etilo usando el concentrador centrífugo se disolvió en 1000 µl de metanol. Esto se usó como una muestra y se analizó por CL-EM (Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, módulo de separación 2695, columna: Waters Xterra C18 (Φ 4,5x50 mm, 5 μm)) y CL-RMN (Avance500 fabricado por Burker Daltonik).
Como resultados de la medida por LC-EM anteriormente mencionada, se confirmó que el compuesto obtenido era un único compuesto A que aumentó en un peso molecular de 16 comparado con piripiropeno E. Además, como resultados de la medida de CL-RMN, se confirmó que este compuesto A era un hidróxido en la posición 11 de piripiropeno E. Se confirmó que la anteriormente mencionada citocromo P450 monoxigenasa (1) era una enzima que hidoxilaba la posición 11 de piripiropeno E con piripiropeno E como sustrato.
Las propiedades fisicoquímicas del compuesto A anteriormente mencionado se muestran a continuación:
- 1.
- Espectro de masas: ES-MS 468M/Z (M+H)+
- 2.
- Fórmula molecular: C27H33NO6
- 3.
- HPLC: Columna: columna Waters Xterra C18 (5 µm, 4,6 mmx50 mm), 40ºC, Fase móvil: de solución de acetonitrilo acuosa al 20% a acetonitrilo al 100% en 10 minutos (gradiente lineal), Velocidad de flujo: 0,8 ml/min, Detección: tiempo de retención 6,696 minutos a UV 323 nm.
- 4.
- Espectro de 1H-RMN (CD3CN, 2H: 3,134, 3,157 H-11)
Los gráficos del espectro de 1H-RMN de piripiropeno E y el espectro de 1H-RMN según 4 descrito anteriormente se muestran en la figura 8 y la figura 9, respectivamente.
(6) Análisis de función y ensayos de cultivo de adición de P450-2
A un medio YPD (extracto de levadura al 1% (p/v), peptona al 2% (p/v), dextrosa al 2% (p/v)) que contenía maltosa al 1% (p/v), se añadió 1/100 volumen de una solución de dimetilsulfóxido de piripiropeno E 2 mg/ml para proporcionar el medio B, y similarmente se añadió 1/100 volumen de una solución de dimetilsulfóxido de piripiropeno O 2 mg/ml para proporcionar el medio C. De flora de Aspergillus oryzae PP3-2 cultivada en medio agar de Czapek Dox, se recogieron conidios de los mismos y se resuspendieron en agua esterilizada. Esta suspensión de conidios se ajustó a 104 esporas/ml. Además, se añadieron 100 µl de esta suspensión de conidios ajustada a 50 ml de medio B o medio C y se cultivó con agitación a 25ºC durante 96 horas. A esta solución de cultivo, se añadieron 50 ml de acetona y la mezcla se mezcló bien. Después de ello, la acetona se eliminó usando un concentrador centrífugo. A esto, se añadieron 50 ml de acetato de etilo y la mezcla resultante se mezcló bien y después solo se recuperó la fase de acetato de etilo. Un producto seco obtenido eliminando el acetato de etilo usando el concentrador centrífugo se disolvió en 1500 µl de metanol. Esto se usó como una muestra y se analizó por CL-EM (fabricado por Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, módulo de separación 2695, columna: Waters Xterra C18 (Φ 4,5x50 mm, 5 μm)) y CL-RMN (fabricado por Burker Daltonik, Avance500). Como resultados de la medida por LC-EM, de una muestra obtenida del medio B, se detectó el compuesto B que aumentó en un peso molecular de 32 comparado con piripiropeno E. Además, de una muestra obtenida del medio C, se detectó el compuesto C que aumentó en un peso molecular de 32 comparado con piripiropeno O. Además, como resultados de la medida de CL-RMN, se confirmó que este compuesto C era un hidróxido en la posición 7 y la posición 13 de piripiropeno O. Se confirmó que la anteriormente mencionada citocromo P450 monoxigenasa (2) era una enzima que hidoxilaba la posición 7 y la posición 13 de cada uno de piripiropeno E o piripiropeno O.
Las propiedades fisicoquímicas del compuesto B anteriormente mencionado se muestran a continuación:
- 1.
- Espectro de masas: ES-MS 484M/Z (M+H)+
- 2.
- Fórmula molecular: C27H33NO7
- 3.
- HPLC: Columna: columna Waters Xterra C18 (5 µm, 4,6 mmx50 mm), 40ºC, Fase móvil: de solución de acetonitrilo acuosa al 20% a acetonitrilo al 100% en 10 minutos (gradiente lineal), Velocidad de flujo: 0,8 ml/min, Detección: tiempo de retención 5,614 minutos a UV 323 nm.
Las propiedades fisicoquímicas del compuesto C anteriormente mencionado se muestran a continuación:
- 1.
- Espectro de masas: ES-MS 542M/Z (M+H)+
- 2.
- Fórmula molecular: C29H35NO9
- 3.
- HPLC: Columna: columna Waters Xterra C18 (5 µm, 4,6 mmx50 mm), 40ºC, Fase móvil: de solución de acetonitrilo acuosa al 20% a acetonitrilo al 100% en 10 minutos (gradiente lineal), Velocidad de flujo: 0,8 ml/min, Detección: tiempo de retención 5,165 minutos a UV 323 nm.
5 4. Espectro de 1H-RMN (CD3CN, 1H 4,858 H-13), (CD3CN, 1H 3,65 H-7),
Los gráficos del espectro de 1H-RMN de piripiropeno O y el compuesto C mencionado anteriormente se muestran en la figura 10 y la figura 11, respectivamente.
FERM BP-11133
FERM BP-11137
FERM BP-11141
<110> Meiji Seika Kaisha Ltd.
<120> Genes biosintéticos de piripiropeno A
<130> 69111D29416
<140> PCT/JP/063293
<141>
<150> JP2008-190862
<151>
<150> JP2008-270294
<151>
<150> JP2009-20591
<151>
<160> 292
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> ADN
<213> Hongo filamentoso
<220>
<221> base modificada
<222> (6)..(6)
<223> I
<220>
<221> base modificada
<222> (9)..(9)
<223> I
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> ADN
<213> Hongo filamentoso
<220>
<221> base modificada
<222> (3)..(3)
<223> I
<220>
<221> base modificada
<222> (6)..(6)
<223> I
<220>
<221> base modificada
<222> (9)..(9)
<223> I
<400>2
<210> 3
<211> 500
<212> ADN
<213> Hongo filamentoso
<400> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
15 <400> 4
<210> 5
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<211> 70
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<212> PRT
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<213> Penicillium coprobium PF1169
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<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
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<211> 66
<212> PRT
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<210> 13
<211> 14
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<211> 71
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
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<213> Penicillium coprobium PF1169
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<212> PRT
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- <213>
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- <213>
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- <211>
- 74 20 <212> PRT
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- <211>
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- <213>
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- <213>
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- <213>
- Penicillium coprobium PF1169 15
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<213> Penicillium coprobium PF1169
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<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
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<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
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<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 43
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<213> Penicillium coprobium PF1169
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<213> Penicillium coprobium PF1169
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<212> PRT 15 <213> Penicillium coprobium PF1169
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<211> 59
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<210> 53
<211> 67
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
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<210> 55
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- <213>
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<211> 70
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- <213>
- Penicillium coprobium PF1169 15
10 10 10
<220>
<221> característica mezcla
<222> (5)..(5)
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<400> 74
<210> 75
<211> 45
<212> PRT
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<400> 75
10 <210> 76
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<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
15 <220>
<221> característica mezcla
<222> (13)..(13)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
20 <400> 76
<210> 77
<211> 69 25 <212> PRT
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<400> 77
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<400> 78
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<400> 83
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<400> 85
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<211> 53
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<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169 <220>
<221> característica mezcla
<222> (4)..(4)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 91
10 <210> 92
<211> 79
<212> PRT
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<212> PRT
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- <210>
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<212> PRT
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<210> 150
- <211>
- 65 15 <212> PRT
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<400> 150
<210> 151
- <211>
- 78 5 <212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<220>
<221> característica mezcla 10 <222> (45)..(45)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 151
<210> 153
<211> 38
<212> PRT
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<400> 153
<210> 154
<211> 74
<212> PRT
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<400> 155
5 <210> 156
<211> 72
<212> PRT
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<211> 51
<212> PRT
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<400> 164
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<212> PRT
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<220> 25 <221> característica mezcla
<222> (5)..(5)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<400> 165
<210> 166
<211> 74
<212> PRT
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<210> 168
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<212> PRT
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<210> 169
<211> 56
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<400> 169
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<211> 53
<212> PRT
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<211> 69
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<400> 173
<210> 174
<211> 71
<212> PRT
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<400> 174
<210> 175 15 <211> 41
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 175
<210> 176
<211> 64
- <212>
- PRT 25 <213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 176
<210> 177
<211> 74
<212> PRT
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<211> 72
- <212>
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<212> PRT
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<211> 51
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<211> 26
<212> PRT
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<210> 183
<211> 65
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15 <210> 184
<211> 96
<212> PRT
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<211> 58
<212> PRT
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<400> 186
<210> 187
<211> 31
<212> PRT
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<400> 187
- <210>
- 188 25 <211> 26
<212> PRT
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<400> 188
<210> 189
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<212> PRT
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<212> PRT
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<400> 190
- <210>
- 191 20 <211> 65
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 191
<210> 192
<211> 53
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 192
<210> 193
<211> 40
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169 15
<400> 193
<210> 194 20 <211> 68
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 194
<210> 195
<211> 62
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<210> 196
<211> 76
<212> PRT 15 <213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 196
<210> 197
<211> 79
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 197
10 <210> 198
<211> 40
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
15 <400> 198
<210> 199
<211> 70 20 <212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 199
<210> 200
<211> 284
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 200
<210> 201
<211> 73
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 201
<210> 202
<211> 63
<212> PRT
- <213>
- Penicillium coprobium PF1169 15
<400> 202
<210> 203
<211> 69
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 203
<210> 204
<211> 96
<212> PRT
- <213>
- Penicillium coprobium PF1169 15
<400> 204
20 <210> 205
<211> 58
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 205
<210> 206
<211> 52 10 <212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 206
<210> 207
<211> 59
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169 20
<400> 207
<210> 208 25 <211> 28
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<210> 209
<211> 71
<212> PRT 10 <213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 209
15 <210> 210
<211> 80
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
20 <400> 210
<210> 211
<211> 38 25 <212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 211
5 <210> 212
<211> 76
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
10 <400> 212
<210> 213 15 <211> 69
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<210> 214
<211> 53
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<210> 215
<211> 63
<212> PRT 10 <213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 215
15 <210> 216
<211> 68
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
20 <400> 216
<210> 217
<211> 39
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 217
<210> 218
<211> 76
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169 15
<400> 218
<210> 219 20 <211> 61
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 219
<210> 220
<211> 79
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 220
<210> 221
<211> 81 10 <212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 221
<210> 222
<211> 82
<212> PRT
- <213>
- Penicillium coprobium PF1169 20
<400> 222
<210> 223
<211> 35
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 223
<210> 224
<211> 86
<212> PRT
- <213>
- Penicillium coprobium PF1169 15
<400> 224
<210> 225
<211> 82
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 225
<210> 226
<211> 45
<212> PRT
- <213>
- Penicillium coprobium PF1169 15
10 10
<400> 226
20 <210> 227
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 227
<210> 228
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 228
<210> 229
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 229
<210> 230
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 230
<210> 231
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 231
<210> 232
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 232
<210> 233
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 233
<210> 234
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 234
<210> 235
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 235
<210> 236
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 236
<210> 237
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 237
<210> 238
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 238
<210> 239
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 239
<210> 240
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 240
<210> 241
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 241
<210> 242
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 242
<210> 243
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 243
<210> 244
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 244
<210> 245
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 245
<210> 246
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 246
<210> 247
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 247
<210> 248
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 248
<210> 249
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 249
<210> 250
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 250 <210> 251
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 251
<210> 252
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 252
<210> 253
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 253
<210> 254
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 254
<210> 255
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 255
<210> 256
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 256
<210> 257
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 257
<210> 258
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 258
<210> 259
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 259
<210> 260
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 260
<210> 261
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 261
<210> 262
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 262
<210> 263 10 <211> 406
<212> ADN
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 263
<210> 264
<211> 20
<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<210> 265
<211> 20 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR 35
<400> 265
<210> 266 40 <211> 39008
<212> ADN
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 266
<210> 267
<211> 556
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 267
<210> 268
<211> 2447
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 268
<210> 269
<211> 509
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 269
<210> 270
<211> 505
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 270
<210> 271
<211> 241
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 271
<210> 272
<211> 464
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 272
<210> 273
<211> 317
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 273
<210> 274
<211> 522
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 274
<210> 275
<211> 434
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 275
<210> 276
<211> 1299
<212> PRT
<213> Penicillium coprobium PF1169
<400> 276
<210> 277
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 277
<210> 278
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 278
<210> 279
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 279
<210> 280
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 280
<210> 281
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 281
<210> 282
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 282
<210> 283
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 283
<210> 284
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 284
<210> 285
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 285
<210> 286
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 286
<210> 287
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 287
<210> 288
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 288
<210> 289
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 289
<210> 290
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 290
<210> 291
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 291
<210> 292
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador para PCR
<400> 292
Claims (22)
- REIVINDICACIONES1. Un polinucleótido aislado que es
- (a)
- un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 266,
- (b)
- un polinucleótido que tiene una secuencia polinucleotídica que codifica al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 267 a 274 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a las mismas,
dicha secuencia de aminoácidos equivalente tiene de 1 a 40 residuos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados comparada con SEQ ID NO: 267 a 270 y 272 a 274, y tiene la misma actividad enzimática que SEQ ID NO: 267 a 270 y 272 a 274, respectivamente, odicha secuencia de aminoácidos equivalente tiene de 1 a 8 residuos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados comparada con SEQ ID NO: 271, y tiene la misma actividad enzimática que SEQ ID NO: 271. - 2. Un polinucleótido aislado, que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos en cualquiera de (i) a (viii) a continuación:
- (i)
- una secuencia de nucleótidos de 3342 a 5158 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (ii)
- una secuencia de nucleótidos de 5382 a 12777 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
(iii) una secuencia de nucleótidos de 13266 a 15144 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,- (iv)
- una secuencia de nucleótidos de 16220 a 18018 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (v)
- una secuencia de nucleótidos de 18506 a 19296 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
- (vi)
- una secuencia de nucleótidos de 19779 a 21389 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,
(vii) una secuencia de nucleótidos de 21793 a 22877 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,(viii) una secuencia de nucleótidos de 23205 a 24773 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266; -
- 3.
- El polinucleótido según la reivindicación 1 o 2, que codifica al menos un polipéptido implicado en la biosíntesis de piripiropeno A.
-
- 4.
- El polinucleótido según la reivindicación 1 o 2, que codifica un polipéptido que tiene una o más actividades de actividad policétido sintasa, actividad preniltransferasa, actividad hidroxilasa, actividad acetiltransferasa o actividad adenilato sintetasa.
-
- 5.
- El polinucleótido según la reivindicación 1 o 2, que deriva de la cepa PF1169 de Penicillium coprobium.
-
- 6.
- El polinucleótido según la reivindicación 1 o 2, que codifica un polipéptido que tiene actividad para hidroxilar la posición 7 y/o la posición 13 de piripiropeno E o piripiropeno O.
-
- 7.
- El polinucleótido según la reivindicación 1 o 2, que codifica un polipéptido que tiene actividad para hidroxilar la posición 11 de piripiropeno E.
-
- 8.
- Un vector recombinante que comprende uno o más de dicho polinucleótido según la reivindicación 1 o 2.
-
- 9.
- El vector recombinante según la reivindicación 8, que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad para hidroxilar la posición 7 y/o la posición 13 de piripiropeno E o piripiropeno O.
-
- 10.
- El vector recombinante según la reivindicación 8, que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad para hidroxilar la posición 11 de piripiropeno E.
-
- 11.
- El vector recombinante según la reivindicación 8, en donde dicho vector recombinante es un plásmido que contiene el fragmento SEQ ID NO: 266, preferiblemente el plásmido pCC1-PP1.
-
- 12.
- El vector recombinante según la reivindicación 8, en donde dicho vector recombinante es un plásmido que comprende los nucleótidos 13266 a 15144 de SEQ ID NO: 266, preferiblemente el plásmido pPP2.
-
- 13.
- El vector recombinante según la reivindicación 8, en donde dicho vector recombinante es un plásmido que comprende los nucleótidos 16220 a 18018 de SEQ ID NO: 266, preferiblemente el plásmido pPP3.
- 14. Un transformante no humano que comprende uno o más de dicho polinucleótido según la reivindicación 1 o 2. 5
-
- 15.
- El transformante según la reivindicación 14, en donde dicho transformante es Escherichia coli que comprende un plásmido que comprende el fragmento SEQ ID NO: 266, preferiblemente el plásmido pCC1-PP1.
-
- 16.
- El transformante según la reivindicación 14, en donde dicho transformante es Aspergillus oryzae que
10 comprende un plásmido que comprende los nucleótidos 13266 a 15144 de SEQ ID NO: 266, preferiblemente el plásmido pPP2. - 17. El transformante según la reivindicación 14, en donde dicho transformante es Aspergillus oryzae quecomprende un plásmido que comprende los nucleótidos 16220 a 18018 de SEQ ID NO: 266, preferiblemente 15 el plásmido pPP3.
- 18. Un método para producir un precursor de piripiropeno A, que comprende cultivar un microorganismo que comprende dichos vectores según la reivindicación 8 y aislar el precursor de piripiropeno A a partir de piripiropeno E.
- 19. Un método según la reivindicación 18, que comprende cultivar dicho transformante según la reivindicación 16 y dicho transformante según la reivindicación 17 simultáneamente o por separado, y aislar el precursor de piripiropeno A a partir de piripiropeno E.25 20. Un método según la reivindicación 18, en donde dicho precursor de piripiropeno A está representado por la fórmula (I) a continuación:30 fórmula (I)
- 21. Un método para producir un precursor de piripiropeno A, que comprende cultivar un microorganismo que comprende dichos vectores según la reivindicación 8 y aislar el precursor de piripiropeno A a partir de piripiropeno O.
- 22. Un método según la reivindicación 21, que comprende cultivar dicho transformante según la reivindicación 17 y aislar el precursor de piripiropeno A a partir de piripiropeno O.
- 23. Un método según la reivindicación 21, en donde dicho precursor de piripiropeno A está representado por la 40 fórmula (II) a continuación:fórmula (II)
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