ES2468558T3

ES2468558T3 - Proteína de fusión que se puede escindir proteol�ticamente que comprende un factor de coagulación sanguínea

Info

Publication number: ES2468558T3
Application number: ES07726010.7T
Authority: ES
Inventors: Hubert Metzner; Thomas Weimer; Stefan Schulte
Original assignee: CSL Behring GmbH Deutschland
Current assignee: CSL Behring GmbH Deutschland
Priority date: 2006-06-14
Filing date: 2007-06-14
Publication date: 2014-06-16
Anticipated expiration: 2027-06-14
Also published as: US20090042787A1; EP2256135A1; PL3564267T3; DK3564267T3; EP3564267B1; ES2729426T3; ES2468558T5; DK2032607T3; EP3564267A1; DK2032607T4; EP1867660A1; EP2256135B1

Abstract

Proteína de fusión terapéutica que comprende a) un factor de coagulación, b) un polipéptido que alarga la semivida seleccionado entre el grupo que consiste en albúmina incluyendo variantes y derivados de la misma, polipéptidos de la familia de la albúmina incluyendo variantes y derivados de los mismos e inmunoglobulinas sin el domino de unión a antígenos, y c) un enlazador peptídico que une el factor de coagulación y el extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido que alarga la semivida de modo que el enlazador peptídico escindible intercalado se introduce entre el factor de coagulación y el polipéptido que alarga la semivida; en donde el enlazador peptídico se puede escindir con proteasas implicadas en la coagulación o activadas por enzimas de la coagulación y en donde la proteína de fusión terapéutica tiene en comparación con la proteína de fusión terapéutica respectiva unida por un enlazador no escindible que tiene la secuencia de aminoácidos GGGGGGV, un aumento de la actividad específica molar en al menos un ensayo relacionado con la coagulación y en donde la actividad específica molar se incrementa en al menos el 100%.

Description

Prote�na de fusión que se puede escindir proteol�ticamente que comprende un factor de coagulación sanguínea

Introducci�n

La presente invención se refiere al campo de las proteínas de fusión terapéuticas, modificadas con una semivida incrementada en comparación con sus polip�ptidos terapéuticos parentales no modificados. La invención se refiere específicamente a factores de coagulación fusionados con polip�ptidos que alargan la semivida (HLEPs), que est�n conectados por p�ptidos enlazadores que se pueden escindir proteol�ticamente, de modo que el p�ptido enlazador escindible intercalado se introduce entre el factor de coagulación y el polip�ptido que alarga la semivida. La escisión de tales enlazadores libera el polip�ptido terapéutico de cualquier impedimento est�rico que afecta a la actividad, causado por el HLEP y por lo tanto permite la generación de proteínas de fusión que conservan una actividad específica molar elevada del factor de coagulación. En caso de que las proteínas de fusión terapéuticas sean zim�genos, se prefieren especialmente los enlazadores que liberan el polip�ptido terapéutico esencialmente de forma simultánea con su activación in vivo, después de la exposición a la(s) proteasa(s) correspondiente(s).

La idea de la invención se demuestra, en particular, a través de polip�ptidos humanos dependientes de la vitamina K, Factor IX, Factor VII y Factor VIIa, pero el concepto también se puede aplicar a otros factores de coagulación. Cualquier polip�ptido que alarga la semivida (HLEP) puede estar conectado con el polip�ptido terapéutico a través de un p�ptido enlazador escindible, pero la albúmina o inmunoglobulinas sin un dominio de unión a ant�genos, como el fragmento Fc sin un dominio de unión a ant�genos, son los HLEPs preferidos. La invención también se refiere a secuencias de ADNc que codifican los polip�ptidos terapéuticos y a derivados de los mismos fusionados genéticamente con un ADNc que codifica HLEPs, tal como albúmina de suero humano ligada a oligonucle�tidos que codifican enlazadores pept�dicos escindibles intercalados. Tales derivados codificados muestran una mejora de las actividades específicas molares y de la semivida que se incrementan en comparación con sus homólogos no escindibles. La invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que contienen tales secuencias de ADNc, a células hospedadoras transformadas con tales vectores de expresión recombinantes, a polip�ptidos recombinantes y a derivados que tienen actividades biológicas comparables a la del polip�ptido terapéutico de tipo silvestre no modificado pero que tienen semividas mejoradas. La invención también se refiere a procedimientos para la preparación de tales proteínas recombinantes y sus derivados. La invención también incluye un vector de transferencia para uso en terapia g�nica humana, que comprende tales secuencias de ADN modificadas, útiles para incrementar la semivida in vivo.

Antecedentes de la invención

Varios polip�ptidos terapéuticos recombinantes est�n disponibles comercialmente para uso terapéutico y profiláctico en los seres humanos. Los pacientes se benefician en general del modo específico de acción de los ingredientes activos recombinantes, pero una desventaja es frecuentemente su limitada disponibilidad debido a sus procedimientos de preparación costosos y complejos. Una reducción de la dosis requerida o de la frecuencia de administración de tales productos, podría mejorar esta situación. Una frecuencia de administración reducida podría mejorar la comodidad del paciente y, por lo tanto, también la aceptación de la terapia. Se han descrito diversas soluciones para lograr el objetivo de una semivida in vivo más larga después de la administración. Las soluciones propuestas recientemente incluyen la formación de proteínas de fusión, especialmente en el caso de polip�ptidos con una semivida corta in vivo que se puede alargar significativamente mediante la fusión con un HLEP.

Ballance et al. (documento WO 01/79271) describen polip�ptidos de fusión de una multitud de diferentes polip�ptidos terapéuticos que, cuando se fusionan con la albúmina de suero humano, se prev� que tengan una semivida funcional incrementada in vivo y una vida útil prolongada. Se han descrito largas listas de posibles ligandos de la fusión sin que los datos experimentales muestren para casi ninguno de estos polip�ptidos que las proteínas de fusión de albúmina respectivas, realmente conservan la actividad biológica y tienen propiedades mejoradas. Entre la lista de polip�ptidos terapéuticos mencionados como Ejemplos est�n el Factor IX y FVII/FVIIa. También se describen las fusiones de FIX y de FVII/FVIIa en las que hay un enlazador pept�dico entre la albúmina y FIX o FVII/FVIIa. Sin embargo, no se sugiere el uso de p�ptidos enlazadores escindibles.

Sheffield et al. (Sheffield W.P. et al. (2004), Br. J. Haematol. 126: 565-573) expresaron una proteína de fusión de albúmina y Factor IX murino, compuesta de FIX murino, un enlazador de 8 amino�cidos (GPG4TM), albúmina murina y un marcador pept�dico de 22 amino�cidos, y también una proteína de fusión de albúmina y Factor IX humano compuesta de Factor IX humano, un enlazador de 7 amino�cidos (G6V) y albúmina humana. Empleando un ensayo de coagulación de una sola etapa, dependiente de FIX, las actividades específicas molares de la proteína de fusión FIX-albúmina murina (MFUST) y la proteína de fusión FIX-albúmina humana (HFUS) eran al menos de dos a tres veces menores que las de sus homólogos no fusionados, un efecto atribuido, al menos parcialmente a un proceso de activación proteol�tica más lenta mediante FXIa. Sheffield no utilizó ni sugirió el uso de un enlazador escindible entre FIX y la albúmina.

Varias solicitudes de patente describen la fusión de polip�ptidos terapéuticos con regiones constantes de inmunoglobulinas para extender la semivida in vivo del polip�ptido terapéutico. Los documentos WO 2002/04598, WO

2003/059935, WO 2004/081053, WO 2004/101740 y WO 2005/001025 incluyen FIX como ejemplo del resto de polip�ptido terapéutico. Las dos últimas solicitudes de patentes también describen FVII/FVIIa fusionados con regiones constantes de inmunoglobulinas y se observ� que los homod�meros de proteínas de fusión tienen una actividad de coagulación inferior, en comparación con proteínas de fusión que consistían en un mon�mero/d�mero. Una vez más, no se sugiere el uso de p�ptidos enlazadores escindibles.

En el documento WO 91/09125 se describen proteínas de fusión que se unen a través de enlazadores que son escindibles con proteasas de la cascada de la coagulación sanguínea, pero las proteínas de fusión se limitan a las que comprenden proteínas fibrinol�ticas o antitromb�ticas.

En el documento WO 03/068934 se describen moléculas quiméricas que se componen de al menos una primera molécula de componente, al menos un enlazador y al menos una segunda molécula, en donde el enlazador comprende un sitio de escisión enzim�tica para producir una unión de origen no natural y un sitio de escisión entre la primera y la segunda molécula de componente y en donde, después de la escisión de la molécula quimérica en el sitio de escisión, al menos una de las moléculas de componente es funcionalmente activa. Las proteasas que escinden pueden ser factores de coagulación, como la trombina. Las moléculas de componente descritas son entre muchas otras FIX y FVIIa. Sin embargo, las proteínas de fusión terapéuticas de la presente invención no se describen, ni se describen propiedades mejoradas de las proteínas de fusión terapéuticas de la presente invención, tales como el aumento de la actividad específica molar, el aumento de las tasas de inactivaci�n y/o eliminación en comparación con la proteína terapéutica sin enlazadores escindibles.

Descripci�n de la invención

Existe una gran necesidad m�dica de factores de coagulación que tengan una semivida larga. En la técnica anterior se han sugerido fusiones de factores de coagulación con polip�ptidos que alargan la semivida, para lograr este objetivo. Sin embargo, una vez que un factor de coagulación se activa durante la coagulación, ya sea mediante escisión proteol�tica del zim�geno (como FIX) o por contacto de un factor que ya est� proteol�ticamente "pre"-activado con un segundo polip�ptido (como FVIIa que se une al factor tisular), ya no es deseable mantener la larga semivida del factor de coagulación que est� ahora activado, ya que esto podría dar lugar a complicaciones tromb�ticas, como ya es el caso para un factor de coagulación de tipo silvestre, tal como FVIIa (Aledort L.M., J Thromb Haemost 2(10): 17001708 (2004)) y debe ser aún más relevante si el factor activado tuviera una semivida incrementada. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar factores de coagulación de larga vida, que después de la activación o después de la disponibilidad de un cofactor, tienen una semivida comparable a la de un factor de coagulación sin modificar.

Las fusiones de los factores de coagulación con polip�ptidos que alargan la semivida, tal como se describen en la técnica anterior y como también se muestran, en el ejemplo 6 y 7, tienen en general una actividad específica molar reducida del factor de coagulación fusionado. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar factores de coagulación con una semivida mejorada, que muestran una mayor actividad específica molar en comparación con la proteína de fusión terapéutica correspondiente sin un enlazador escindible.

La invención es, por tanto, sobre proteínas de fusión terapéuticas que comprenden

a) un factor de coagulación, sus variantes o derivados,

b) un polip�ptido que alarga la semivida seleccionado entre el grupo que consiste en albúmina, incluyendo variantes y derivados de la misma, polip�ptidos de la familia de la albúmina incluyendo variantes y derivados de los mismos e inmunoglobulinas sin el domino de unión a ant�genos y

c) un enlazador pept�dico que une el factor de coagulación y el polip�ptido que alarga la semivida; de modo que el enlazador pept�dico escindible intercalado se introduce entre el factor de coagulación y el polip�ptido que alarga la semivida

en donde el enlazador pept�dico se puede escindir con proteasas implicadas en la coagulación o activadas por enzimas de la coagulación y la proteína de fusión terapéutica tiene, en comparación con la proteína de fusión terapéutica respectiva unida a un enlazador no escindible que tiene la secuencia de amino�cidos GGGGGGV,

un aumento de la actividad específica molar en al menos un ensayo relacionado con la coagulación y la actividad específica molar se incrementa en al menos el 100%.

Como consecuencia del enlazador escindible, después de la escisión del enlazador pept�dico en un modo relacionado con la coagulación, el comportamiento del factor de coagulación se parece más al comportamiento del factor natural, sin fusión y no muestra un aumento de la semivida del factor activo con efectos potencialmente protromb�ticos.

La escisión proteol�tica en un modo relacionado con la coagulación, en el sentido de la invención, es cualquier escisión proteol�tica que se produce como consecuencia de la activación de al menos un factor de coagulación o un cofactor de la coagulación.

La expresión "factor de coagulación activado después de que el enlazador pept�dico es escindido proteol�ticamente en un modo relacionado con la coagulación", en el sentido de la invención significa que el factor de coagulación se activa ya sea casi de forma paralela a la escisión proteol�tica del p�ptido enlazador, o que el factor de coagulación ya estaba activado antes de la escisión proteol�tica del p�ptido enlazador. La activación se puede producir, por ejemplo, mediante escisión proteol�tica del factor de coagulación o mediante la unión a un cofactor.

Los factores de coagulación preferidos son factores de coagulación dependientes de la vitamina K y fragmentos y variantes de los mismos. Incluso más preferidos son FVIIa y FIX y fragmentos y variantes de los mismos.

Los HLEPs preferidos son albúmina y fragmentos o variantes de la misma e inmunoglobulinas sin el dominio que se une a ant�genos.

La región del enlazador en una realización preferida comprende una secuencia del polip�ptido terapéutico que se va a administrar o una variante de la misma, que debería dar como resultado una disminución del riesgo de propiedades neoantig�nicas (formación de un nuevo ep�topo potencialmente inmunog�nico debido a la presencia de un p�ptido dentro del ant�geno terapéutico que no existe en las proteínas humanas) de la proteína de fusión expresada. También en el caso de que la proteína terapéutica sea un zim�geno (por ejemplo, que requiere ser activado proteol�ticamente), la cinética de la escisión del p�ptido enlazador reflejar� más estrechamente la cinética de activación del zim�geno relacionada con la coagulación. Por lo tanto, en tales realizaciones preferidas, un zim�geno y un enlazador correspondiente se activan y se escinden respectivamente, con cinéticas comparables. Por esta razón, la presente invención también se refiere particularmente a proteínas de fusión de un zim�geno y un HLEP, en donde la cinética de la escisión del enlazador con proteasas relevantes no se retrasa en más del triple, y lo más preferiblemente no más del doble, en comparación con la cinética de activación del zim�geno.

En una realización adicional, el p�ptido enlazador comprende sitios de escisión para más de una proteasa. Esto se puede lograr ya sea mediante un p�ptido enlazador que se puede escindir en la misma posición con diferentes proteasas o mediante un p�ptido enlazador que proporciona dos o más sitios de escisión diferentes. Estas pueden ser circunstancias ventajosas en donde la proteína de fusión terapéutica se debe activar mediante escisión proteol�tica para lograr una actividad enzim�tica y en donde diferentes proteasas pueden contribuir a esta etapa de activación. Este es el caso, por ejemplo, después de la activación de FIX, que, o bien se puede lograr a través de FXIa o de FVIIa/Factor Tisular (TF).

Las realizaciones preferidas de la invención son proteínas de fusión terapéuticas en las que el enlazador se puede escindir con la proteasa, que activa el factor de coagulación, lo que garantiza que la escisión del enlazador est� ligada a la activación del factor de coagulación en un sitio en el que se produce la coagulación.

Otras proteínas de fusión terapéuticas preferidas de acuerdo con la invención son aquellas en las que el enlazador se puede escindir con el factor de coagulación una vez que se activa, el cual forma parte de la proteína de fusión terapéutica, asegurando de este modo también que la escisión de la proteína de fusión est� conectada con un evento de coagulación.

Otras proteínas de fusión terapéuticas preferidas de acuerdo con la invención son aquellas en las que el enlazador se puede escindir con una proteasa, que a su vez se activa directa o indirectamente por la actividad del factor de coagulación que forma parte de la proteína de fusión terapéutica, asegurando de este modo también que la escisión de la proteína de fusión est� conectada con un evento de coagulación.

Una clase de las proteínas de fusión terapéuticas más preferidas es aquella en la que el enlazador se puede escindir con FXIa y/o con FVIIa/TF y el factor de coagulación es FIX.

El punto esencial de la invención se demuestra, en particular, con el polip�ptido Factor IX dependiente de la vitamina K, los enlazadores escindibles y albúmina como HLEP, as� como su secuencia de ADNc correspondiente. La invención también se refiere a secuencias de ADNc que codifican cualquier otro factor de coagulación que se puede activar proteol�ticamente o que est� implicado en la activación de otros zim�genos o polip�ptidos. Estos ADNc se fusionan genéticamente con secuencias de ADNc que codifican albúmina de suero humano u otros HLEPs, y est�n unidos con oligonucle�tidos que codifican enlazadores pept�dicos escindibles, intercalados. Las proteínas de fusión terapéuticas expresadas muestran actividades específicas molares que se incrementan en comparación con sus homólogas no escindibles. La invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que contienen tales secuencias de ADNc fusionadas, células hospedadoras transformadas con tales vectores de expresión recombinantes, proteínas de fusión terapéuticas recombinantes y derivados que tienen actividades biológicas casi comparables a las de los polip�ptidos terapéuticos no modificados de tipo silvestre, pero que tienen una semivida mejorada in vivo. La invención también se refiere a procedimientos para la preparación de tales polip�ptidos recombinantes y de sus derivados. La invención también incluye un vector de transferencia para uso en terapia g�nica humana, que comprende tales secuencias de ADN modificadas, útiles para aumentar los niveles de productos in vivo.

Las proteínas de fusión terapéuticas preferidas de acuerdo con la invención son aquellas que tienen una actividad específica molar, en particular una actividad específica molar en al menos un ensayo relacionados con la coagulación, que se ha incrementado al menos un 100% en comparación con la de la proteína de fusión terapéutica sin un enlazador escindible.

Descripci�n detallada de la invención

Polip�ptidos dependientes de vitamina K

Los polip�ptidos dependientes de vitamina K como un grupo de los polip�ptidos terapéuticos, son polip�ptidos que est�n y-carboxilados enzim�ticamente en el hígado usando la vitamina K como cofactor. Tales polip�ptidos dependientes de la vitamina K son, por ejemplo, los Factores II, VII, IX, X, la proteína C, la proteína S, GAS6 y la proteína

Z.

FIX humano

El FIX humano, uno de los miembros del grupo de polip�ptidos dependientes de vitamina K, es una glicoprote�na de cadena sencilla con un peso molecular de 57 kDa, que es secretada por las células hepáticas al torrente circulatorio como un zim�geno inactivo de 415 amino�cidos. Contiene 12 residuos de ácido y-carboxi-glut�mico localizados en el dominio Gla N-terminal del polip�ptido. Los residuos Gla requieren vitamina K para su biosíntesis. Después del dominio Gla hay dos dominios del factor de crecimiento epid�rmico, un p�ptido de activación y un dominio de proteasa de serina de tipo tripsina. Otras modificaciones postraduccionales de FIX incluyen la hidroxilaci�n (Asp 64), N(Asn157 y Asn167) as� como la glicosilaci�n de tipo O (Ser53, Ser61, Thr159, Thr169 y Thr172), sulfataci�n (Tyr155) y fosforilaci�n (Ser158).

FIX es convertido a su forma activa, Factor IXa, mediante proteolisis del p�ptido de activación en Arg145-Ala146 y Arg180-Val181 lo que conduce a la formación de dos cadenas de polip�ptidos, una cadena ligera N-terminal (18 kDa) y una cadena pesada C-terminal (28 kDa), que se mantienen unidas por un puente disulfuro. La escisión activadora del Factor IX se puede conseguir in vitro, por ejemplo, con el Factor XIa o el Factor VIIa/TF. El Factor IX est� presente en el plasma humano en una concentración de 5-10 μg/ml. La semivida plasm�tica terminal del Factor IX en seres humanos se encontr� que era de aproximadamente 15 a 18 horas (White GC et al. 1997. Recombinant factor IX. Thromb. Haemost. 78: 261-265; Ewenstein BM y col. 2002. Pharmacokinetic analysis of plasma-derived and recombinant F IX concentrates in previously treated patients with moderate or severe hemophilia B. Transfusion 42:190-197).

La hemofilia B est� causada por un Factor IX no funcional o ausente y se trata con concentrados de Factor IX procedentes del plasma o una forma recombinante del Factor IX. Como los pacientes con hemofilia B reciben con frecuencia al menos dos administraciones semanales profilácticas de Factor IX para evitar hemorragias espontáneas, es deseable aumentar los intervalos entre las administraciones, incrementando la semivida del producto de Factor IX aplicado. Una mejora en la semivida plasm�tica aportaría una ventaja significativa para el paciente. Hasta la fecha, no est� disponible comercialmente ninguna preparación farmacéutica de un Factor IX con una semivida plasm�tica mejorada, ni se ha publicado ningún dato que muestre variantes de FIX con una semivida prolongada in vivo y una actividad específica molar casi inalterada en ensayos relacionados con la coagulación. Por lo tanto, todavía existe una gran necesidad m�dica de desarrollar formas del Factor IX que tengan una semivida funcional más larga in vivo.

Factor VII y Factor VIIa

El FVII es una glicoprote�na de cadena sencilla con un peso molecular de 50 kDa, que es secretada por las células hepáticas en el torrente sanguíneo como un zim�geno inactivo de 406 amino�cidos. El FVII se convierte en su forma activa Factor VIIa, mediante proteolisis del enlace pept�dico sencillo en Arg152-lle153 lo que conduce a la formación de dos cadenas de polip�ptidos, una cadena ligera N-terminal (24 kDa) y una cadena pesada C-terminal (28 kDa), que se mantienen unidas por un puente disulfuro. En contraste con otros factores de coagulación dependientes de vitamina K, no se escinde ningún p�ptido de activación durante la activación. La escisión para la activación del Factor VII se puede conseguir in vitro, por ejemplo, mediante el Factor Xa, Factor IXa, Factor VIIa, Factor XIIa, proteasa activadora del Factor siete (FSAP) y trombina. Mollerup et al. (Biotechnol. Bioeng. (1995) 48: 501-505) informaron de que algunas escisiones también se producen en la cadena pesada en Arg290 y/o Arg315.

El Factor VII est� presente en el plasma en una concentración de 500 ng/ml. Aproximadamente 1% o 5 ng/ml del Factor VII est�n presentes como Factor VII activado. La semivida plasm�tica terminal del Factor VII se encontr� que era de aproximadamente 4 horas y la del Factor VIIa de aproximadamente 2 horas.

A través de la administración de concentraciones suprafisiol�gicas de Factor VIIa se puede lograr una hemostasia evitando la necesidad de Factor VIlla y Factor IXa. La clonaci�n del ADNc del Factor VII (documento de EE.UU. 4.784.950) hizo posible desarrollar un Factor VII activado como un producto farmacéutico. El Factor VIIa se administr� con éxito por primera vez en 1988. Desde entonces el número de indicaciones de Factor VIIa ha crecido de manera constante, mostrando un potencial para convertirse en un agente hemost�tico universal para detener el sangrado (Erhardtsen, 2002). Sin embargo, la corta semivida terminal del Factor VIIa de aproximadamente 2 horas y la recuperación in vivo reducida, est�n limitando su aplicación. Por lo tanto, todavía existe una gran necesidad m�dica de desarrollar formas del Factor VIIa que tengan una semivida mejorada pero que, por el contrario, la actividad específica molar, la cinética de inactivaci�n y/o la cinética de eliminación no se vean afectadas después del inicio de la coagulación.

Prote�nas de fusión terapéuticas

"Proteínas de fusión terapéuticas" en el sentido de esta invención son factores de coagulación fusionados con un polip�ptido que alarga la semivida que, después de la administración a un ser humano o a un animal, pueden producir un efecto profiláctico o terapéutico. Estas proteínas de fusión terapéuticas se pueden administrar a un ser humano o a un animal por una vía intravenosa, intramuscular, oral, típica, parenteral o por otras vías. Las clases específicas de proteínas de fusión terapéuticas incluidas, es decir, en los ejemplos de esta invención, son factores de coagulación tales como, por ejemplo, polip�ptidos dependientes de la vitamina K ligados a polip�ptidos que alargan la semivida tales como, por ejemplo, albúmina e inmunoglobulinas sin dominio de unión a ant�genos. La expresión "proteína de fusión terapéutica" se usa de forma intercambiable con "proteína de fusión".

Polip�ptido que alarga la semivida (HLEP)

La albúmina, los miembros de la familia de la albúmina y las inmunoglobulinas y sus fragmentos o derivados se han descrito anteriormente como ejemplos de polip�ptidos que alargan la semivida (HLEPs). Las expresiones "albúmina de suero humano" (HSA) y "albúmina humana" (HA) se utilizan indistintamente en esta solicitud. Los términos "albúmina" y "albúmina de suero" son más amplios, y abarcan la albúmina de suero humano (y fragmentos y variantes de la misma), as� como la albúmina de otras especies (y fragmentos y variantes de la misma).

Tal como se utiliza en esta memoria, "albúmina" se refiere colectivamente a un polip�ptido de albúmina o a una secuencia de amino�cidos, o a un fragmento de albúmina o una variante que tiene una o varias actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas) de la albúmina. En particular, "albúmina" se refiere a la albúmina humana o a fragmentos de la misma, especialmente la forma madura de la albúmina humana, tal y como se muestra en SEQ ID NO: 1 en el presente documento, o la albúmina de otros vertebrados o fragmentos de la misma, o análogos o variantes de estas moléculas o fragmentos de las mismas.

La porción de albúmina de las proteínas de fusión de albúmina puede comprender la longitud completa de la secuencia de HA tal y como se ha descrito anteriormente, o puede incluir uno o varios fragmentos de la misma que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica. Tales fragmentos pueden ser de 10 o más amino�cidos de longitud o pueden incluir aproximadamente 15, 20, 25, 30, 50 o más amino�cidos contiguos de la secuencia de HA o pueden incluir parte o la totalidad de los dominios específicos de HA.

La porción de albúmina de las proteínas de fusión de albúmina de la invención puede ser una variante de HA normal, ya sea natural o artificial. La porción de polip�ptido terapéutico de las proteínas de fusión de la invención también pueden ser variantes de los polip�ptidos terapéuticos correspondiente tal y como se describen en el presente documento. El término "variantes" incluye inserciones, deleciones y sustituciones, ya sean conservadoras o no conservadoras, ya sean naturales o artificiales, en donde tales cambios no alteran sustancialmente el sitio activo, o el dominio activo que confiere las actividades terapéuticas de los polip�ptidos terapéuticos.

En particular, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden incluir variantes polim�rficas de origen natural de albúmina humana y fragmentos de albúmina humana. La albúmina se puede obtener a partir de cualquier vertebrado, especialmente de cualquier mamífero, por ejemplo, ser humano, vaca, oveja o cerdo. Las albúminas de animales no mamíferos incluyen, pero sin limitación, gallina y salmón. La porción de albúmina del polip�ptido enlazado con albúmina puede ser de un animal diferente que la porción de polip�ptido terapéutico.

En términos generales, un fragmento o una variante de albúmina tendr� una longitud de al menos 10, preferiblemente al menos 40, más preferiblemente más de 70 amino�cidos. La variante de albúmina puede consistir preferentemente o comprender alternativamente al menos un dominio completo de albúmina o fragmentos de dichos dominios, por ejemplo, los dominios 1 (amino�cidos 1-194 de SEQ ID NO: 1), 2 (amino�cidos 195-387 de SEQ ID NO: 1), 3 (amino�cidos 388-585 de SEQ ID NO: 1), 1 + 2 (1-387 de SEQ ID NO: 1), 2 + 3 (195-585 de SEQ ID NO: 1) o 1 + 3 (amino�cidos 1-194 de SEQ ID NO: 1 + amino�cidos 388-585 de SEQ ID NO: 1). Cada dominio se compone de dos subdominios homólogos, a saber 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 y 512-585, con regiones enlazadoras flexibles entre los subdominios que comprenden los residuos Lys106 a Glu119, Glu292 a Val315 y Glu492 a Ala511.

La porción de albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención puede comprender al menos un subdominio o un dominio de HA o modificaciones conservadoras de la misma.

Todos los fragmentos y variantes de la albúmina est�n abarcados por la invención como parejas de fusión de un factor de coagulación, siempre que conduzcan a una extensión de la semivida de la proteína de fusión terapéutica en el plasma de al menos 25%, en comparación con el factor de coagulación no fusionado.

Adem�s de la albúmina, la alfa-fetoprote�na, otro miembro de la familia de la albúmina, se ha reivindicado porque mejora la semivida de un polip�ptido terapéutico fijado in vivo (documento WO 2005/024044). La familia de proteínas de la albúmina, proteínas de transporte en suero relacionadas evolutivamente, consiste en albúmina, alfafetoprote�na (AFP; Beattie y Dugaiczyk 1982. Gene 20:415-422), afamina (AFM; Lichenstein et al. 1994. J. Biol. Chem. 269:18149-18154) y proteína que se une a la vitamina D (DBP; Cooke & David 1985. J. Clin. Invest. 76:24202424). Sus genes representan una agrupación multig�nica con similitudes estructurales y funcionales que se cartograf�an en la misma región cromos�mica en los seres humanos, ratones y ratas. La similitud estructural de los miembros de la familia de la albúmina sugiere su posible utilidad como HLEPs. Por lo tanto, otro objeto de la invención es el uso de tales miembros de la familia de la albúmina, de fragmentos y variantes de la misma, como HLEPs.

El término "variantes" incluye inserciones, deleciones y sustituciones, ya sea conservadoras o no conservadoras, siempre y cuando la función deseada est� todavía presente.

Los miembros de la familia de la albúmina pueden comprender la longitud completa de la proteína respectiva AFP, AFM y DBP, o pueden incluir uno o varios fragmentos de la misma que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica. Tales fragmentos pueden tener una longitud de 10 o más amino�cidos o pueden incluir aproximadamente 15, 20, 25, 30, 50 o más amino�cidos contiguos de la secuencia proteica respectiva o pueden incluir parte o la totalidad de los dominios específicos de la proteína respectiva, siempre y cuando los fragmentos de HLEP proporcionen una extensión de la semivida de al menos un 25%, en comparación con el factor de coagulación no fusionado. Los miembros de la familia de la albúmina de las proteínas de fusión terapéuticas de la invención pueden incluir variantes polim�rficas de origen natural de AFP, AFM y DBP.

IgG y fragmentos de IgG sin el dominio que se une a ant�genos también se pueden usar como HLEPs, siempre y cuando los fragmentos de HLEPs proporcionen una extensión de la semivida de al menos un 25%, en comparación con el factor de coagulación no fusionado. La porción de polip�ptido terapéutico est� conectada a la IgG o a los fragmentos de IgG sin el dominio que se une a ant�genos, a través de un enlazador escindible que permite actividades específicas molares elevadas de la proteína de fusión. Ejemplos de moléculas de fusión del factor VII/VIIA y factor IX con IgG se encuentran, por ejemplo, en el documento WO 2005/001025 que se incorpora en esta memoria como referencia en su totalidad. Se describe un homod�mero compuesto de dos moléculas de factor VII (factor VIIa) y dos moléculas Fc y un híbrido mon�mero/d�mero compuesto de una molécula de FVII (FVIIa) y dos moléculas de Fc, mostrando el mon�mero/d�mero una actividad de coagulación aproximadamente cuatro veces mayor que el homod�mero. Una secuencia enlazadora de la presente que libera las moléculas de FVII (FVIIa) después de la escisión con una proteasa de la cascada de la coagulación como, por ejemplo, FXIa, FXa o FIXa, podría ser capaz de elevar la actividad coaguladora de las estructuras artificiales y en especial la del homod�mero, hasta un nivel de actividad comparable al del mon�mero/d�mero o incluso superior. Una proteína de fusión FIX-Fc con enlazador escindible se muestra a modo de ejemplo en SEQ ID NO 93. Enlazadores escindibles tales como los mostrados en la tabla 3a y 3b se pueden aplicar en este caso.

La invención se refiere específicamente a proteínas de fusión que comprenden enlazar un factor de coagulación o un fragmento o una variante del mismo con el extremo N-terminal o C-terminal de un HLEP o un fragmento o variante del mismo, de tal manera que un enlazador pept�dico escindible intercalado se introduce entre el polip�ptido terapéutico y el HLEP, de modo que la proteína de fusión formada tiene una semivida in vivo más larga, en comparación con el factor de coagulación que no se ha enlazado con un HLEP y de modo que la proteína de fusión tiene al menos una actividad específica molar 100% superior, en comparación con la proteína de fusión correspondiente con un enlazador no escindible en al menos uno de los diferentes ensayos relacionados con la coagulación disponibles.

"Factor de coagulación" tal como se utiliza en esta solicitud incluye, pero no se limita a, polip�ptidos que consisten en el Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor von Willebrand, Factor V, Factor X, Factor XI, Factor XII, Factor XIII, Factor I, Factor Il (protrombina), Proteína C, Proteína S, GAS6 o Proteína Z, as� como sus formas activadas. Además, los polip�ptidos terapéuticos útiles pueden ser polip�ptidos de tipo silvestre o pueden contener mutaciones. El grado y la ubicación de la glicosilaci�n u otras modificaciones posteriores a la traducción pueden variar dependiendo de las células hospedadoras seleccionadas y de la naturaleza del entorno celular del anfitrión. Cuando se hace referencia a secuencias de amino�cidos específicas, las modificaciones posteriores a la traducción de tales secuencias est�n incluidas en esta solicitud.

"Factor de coagulación" dentro de la definición anterior, incluye polip�ptidos que tienen la secuencia de amino�cidos natural, incluyendo cualquier polimorfismo natural. También incluye polip�ptidos con una secuencia de amino�cidos ligeramente modificada, por ejemplo, un extremo N-terminal o C-terminal modificado que incluye deleciones o adiciones de amino�cidos terminales, siempre y cuando esos polip�ptidos conserven sustancialmente la actividad del polip�ptido terapéutico respectivo. Las variantes incluyen diferir en uno o varios residuos de amino�cidos procedentes de la secuencia de tipo silvestre. Ejemplos de tales diferencias pueden incluir el truncamiento del extremo Nterminal y/o C-terminal mediante uno o varios residuos de amino�cidos (por ejemplo, preferiblemente de 1 a 30 residuos de amino�cidos), o la adición de uno o varios residuos adicionales en el extremo N-terminal y/o C-terminal, as� como sustituciones de amino�cidos conservadoras, es decir, sustituciones realizadas dentro de grupos de amino�cidos con características similares, por ejemplo (1) amino�cidos pequeños, (2) amino�cidos ácidos, (3) amino�cidos polares, (4) amino�cidos básicos, (5) amino�cidos hidrófobos y (6) amino�cidos aromáticos. Ejemplos de tales sustituciones conservadoras se muestran en la siguiente tabla.

Tabla 1

(1): Alanina Glicina

(2): Acido asp�rtico Acido glut�mico

(3a): Asparagina Glutamina

(3b): Serina Treonina

(4): Arginina Histidina Lisina

(5): Isoleucina Leucina Metionina Valina

(6): Fenilalanina Tiosina Tript�fano

La semivida in vivo de las proteínas de fusión de la invención, determinada generalmente como la semivida terminal

o semivida �, es por lo general al menos aproximadamente 25%, preferiblemente al menos aproximadamente 50%, y más preferiblemente más del 100% superior que la semivida in vivo del polip�ptido no fusionado.

Las proteínas de fusión de la presente invención tienen al menos una actividad específica molar incrementada en un 100%, en comparación con las proteínas de fusión correspondientes sin enlazadores escindibles.

La actividad específica molar (o la actividad específica molar relacionada con la coagulación, tal y como se considera en esta memoria en particular) en este sentido se define como la actividad expresada por mol (o, por ejemplo, nmol) del polip�ptido terapéutico o de la proteína de fusión terapéutica de interés. El cálculo de la actividad específica molar permite una comparación directa de la actividad de las diferentes estructuras artificiales que no se ve afectada por los diferentes pesos moleculares o densidades ópticas de los polip�ptidos estudiados. La actividad específica molar se puede calcular tal y como se ejemplifica en la tabla 2 a continuación para FIX y una proteína de fusión FIX-HSA.

Tabla 2: Cálculo de la actividad específica molar tal y como se muestra para una proteína de fusión FIX-HSA purificada

Producto: DO(280nm, %) PM Actividad/Vol/DO280 (UI/L/DO280) Densidad óptica molar (DO(280) a 1 mol/L) Cálculo de la actividad específica molar (UI/mol)

FIX: 13,3 1) 57000 determinada para el producto 75810 (= PM x DO(280. 1%)/10) =(Actividad/Vol/DO280) x (DO280 a 1 mol/L)

HSA: 5,7 2) 66300 37791 (= PM x DO(280, 1%)/10)

FIX-HSA: determinada para el producto 113601 (= suma de la densidad óptica molar de FIX y HSA) =(Actividad/Vol/DO280) x (DO280 a 1 mol/L)

1) R.G. Di Scipio et al., Biochem. 16: 698-706 (1977) 2) C. Chaudhury et al, J. Exp. Med. 197(3): 315-322 (2003)

Con el fin de determinar una actividad específica molar relacionada con la coagulación, se puede utilizar cualquier ensayo que determine las actividades enzim�ticas o de cofactores que son relevantes para el proceso de coagulación.

Por lo tanto "los ensayos relacionados con la coagulación" en el sentido de la invención, son cualquier ensayo que determina la actividad enzim�tica o de cofactores que son de relevancia en el proceso de coagulación o que es capaz de determinar que se ha activado tanto la cascada de la coagulación intrínseca como la extrínseca. El ensayo "relacionado con la coagulación" por lo tanto puede ser un ensayo de coagulación directo como TTPa, PT, o un ensayo de generación de trombina. Sin embargo, otros ensayos tales como, por ejemplo, ensayos cromog�nicos aplicados para factores de coagulación específicos, también se incluyen. Ejemplos de tales ensayos o reactivos correspondientes son Pathromtin� SL (ensayo de TTPa, Dade Behring) o Thromborel� S (ensayo de tiempo de protrombina, Dade Behring) con plasma correspondiente que carece de factor de coagulación (Dade Behring), kits de ensayos de generación de trombina (Technoclone, Thrombinoscope) que emplean, p. ej., plasma que carece de factor de coagulación, ensayos cromog�nicos como Biophen Factor IX (Hyphen BioMed), Staclot� FVIIa-rTF (Roche Diagnostics GmbH), Coatest� Factor VIII:C/4 (Chromogenix), u otros.

Para los fines de esta invención, un incremento en uno cualquiera de los ensayos anteriores o un ensayo equivalente relacionado con la coagulación, se considera que muestra un aumento en la actividad específica molar. Por ejemplo, un aumento del 25% se refiere a un aumento del 25% en cualquiera de los ensayos anteriores o en un ensayo

equivalente.

Para determinar si las proteínas de fusión terapéuticas est�n dentro del alcance de la presente invención, el patrón frente al que se compara la actividad específica molar de estas proteínas es una estructura artificial en la que el factor de coagulación respectivo y el HLEP respectivo est�n unidos a través de un enlazador no escindible que tiene la secuencia de amino�cidos GGGGGGV.

En el caso de FIX, se utilizan frecuentemente ensayos de TTPa para la determinación de la actividad de coagulación. Un ensayo de coagulación (ensayo de TTPa) de este tipo se describe en el ejemplo 5 con más detalle. Sin embargo, otros ensayos relacionados con la coagulación o principios de ensayo se pueden aplicar para determinar la actividad específica molar de FIX.

F�rmacos a base de polip�ptidos recombinantes terapéuticos suelen ser caros y no todos los países pueden permitirse tratamientos costosos basándose en dichos fármacos. El incremento de la recuperación in vivo de tales fármacos podría hacer que el uso de estos productos fuera más económico y, posteriormente, se pudieran beneficiar más pacientes de los mismos. En el caso de las proteínas de fusión de la presente invención, un incremento de la recuperación in vivo también sería una ventaja deseable. "Recuperación in vivo" en el sentido de la invención, significa la cantidad de producto que se encuentra en la sangre o en el plasma poco después de la administración del producto. Por lo tanto, para detectar la recuperación in vivo, en general, el contenido en plasma se determina pocos minutos (por ejemplo, 5 o 15 min) después de la administración del producto.

De acuerdo con esta invención, el resto polipept�dico terapéutico est� acoplado al resto de HLEP a través de un enlazador pept�dico escindible de modo que el enlazador intercalado escindible se introduce entre el factor de coagulación y el polip�ptido que alarga la semivida. El enlazador debe ser no inmunog�nico y debe ser lo suficientemente flexible como para permitir la escisión con proteasas. La escisión del enlazador debe proceder de forma comparativamente rápida a la de la activación del polip�ptido terapéutico dentro de la proteína de fusión, si la proteína de fusión es un zim�geno.

El enlazador escindible comprende preferentemente una secuencia obtenida a partir de

a) el polip�ptido terapéutico que se va a administrar, si contiene sitios de escisión proteol�tica que se escinden proteol�ticamente durante la activación del polip�ptido terapéutico,

b) un polip�ptido sustrato de este polip�ptido terapéutico, o

c) un polip�ptido sustrato escindido por una proteasa que se activa o se forma por la participación directa o indirecta del polip�ptido terapéutico.

La región enlazadora en una realización más preferida comprende una secuencia del polip�ptido terapéutico que se va a aplicar, lo que debería dar como resultado una disminución del riesgo de propiedades neoantig�nicas de la proteína de fusión expresada. También en caso de que la proteína terapéutica sea un zim�geno (por ejemplo, necesita ser activada proteol�ticamente), la cinética de la escisión del p�ptido enlazador reflejar� más estrechamente la cinética de activación relacionada con la coagulación, del zim�geno.

En una realización preferida, el polip�ptido terapéutico es zim�geno FIX y el HLEP es albúmina. En este caso, la secuencia del enlazador se obtiene a partir de las secuencias de las regiones de activación de FIX, de la región de escisión de cualquier sustrato de FIX, tal como FX o FVII, o de la región de escisión de cualquier polip�ptido sustrato que se escinde con una proteasa en cuya activación est� implicado FIXa.

En una realización muy preferida el p�ptido enlazador se obtiene a partir de FIX. En otra realización preferida, el p�ptido enlazador se obtiene a partir de FX o de FVII. En otra realización preferida, la secuencia enlazadora comprende dos secuencias de escisión que pueden ser escindidas con FXIa o FVIIa/TF, dos activadores fisiológicamente relevantes de FIX.

Ejemplos de combinaciones de polip�ptido terapéutico, enlazador escindible y HLEP incluyen las estructuras artificiales enumeradas en las tablas 3a y 3b, pero que no se limitan a las siguientes:

Tabla 3a: Ejemplos de posibles estructuras artificiales

Factor de coagulación: Enlazador HLEP Enlazador obtenido a partir de (con modificaciones si es aplicable) SEQ ID NO:

Enlazador no escindible o no escindible suficientemente rápido

FIX: - HSA

FIX: R I HSA

FIX: GGGGGGV(Sheffield et al.) HSA 94

FIX: (GGS)nGS HSA

FIX: SS(GGS)7GS HSA 30

FIX: SSNGS(GGS)3NGS(GGS)3GGNGS HSA 31

Enlazador con un sitio de escisión

FIX (1-412): SVSQTSKLTR AETVFPDVD HSA FIX 36

FIX (1-412): SVSQTSKLTR AETVFPDVD GS HSA FIX 37

FIX: SVSQTSKLTR AETVFPDVD HSA FIX 38

FIX: SVSQTSKLTR AETVFPDVD GS GGS HSA FIX 95

FIX: SVSQTSKLTR AETVFPDVD GS HSA FIX 39

FIX: SVSQTSKLTR AETVFPDVD NGS HSA FIX 40

FIX: SVSQTSKLTR AETVFPDV HSA FIX 96

FIX: QTSKLTR AETVFPDV HSA FIX 97

FIX: SKLTR AETVFPDV HSA FIX 98

FIX: SVSQTSKLTR AETVFP HSA FIX 99

FIX: SVSQTSKLTR AETVF HSA FIX 100

FIX: QTSKLTR AETVF HSA FIX 101

FIX: SKLTR AETVF HSA FIX 102

FIX: SVSQTSKLTR AET HSA FIX 103

FIX: QTSKLTR AET HSA FIX 104

FIX: SKLTR AET HSA FIX 105

FIX: SVSQTSKLTR GETVFPDVD HSA FIX 41

FIX: SVSQTSKLTR TETVFPDVD HSA FIX 42

FIX: SVSQTSKLTR SETVFPDVD HSA FIX 43

FIX: SVSQTSKLTR LETVFPDVD HSA FIX 44

FIX: SVSQTSKLTR TEAVFPDVD HSA FIX 45

FIX: SVSQTSKLTR GEAVFPDVD HSA FIX 46

FIX: QTSKLTR AETVFPDVD GS HSA FIX 106

FIX: SKLTR AETVFPDVD GS HSA FIX 107

FIX: SKLTR AETVPDVD HSA FIX 47

FIX: QSFNDFTR VVGGED HSA FIX 48

FIX: QSFNDFTR VVGGED GS HSA FIX 49

FIX: QSFNDFTR VVGGE HSA FIX 108

FIX: QSFNDFTR TVGGED HSA FIX 50

FIX: QSFNDFTR LVGGED HSA FIX 51

FIX: QSFNDFTR GVGGED HSA FIX 52

FIX: QSFNDFTR VVGGED NGS HSA FIX 53

FIX: QSFNDFTR VVGGEDN HSA FIX 54

FIX: PERGDNNLTR IVGGQE GS HSA FX 109

FIX: PERGDNNLTR IVGGQE HSA FX 61

FIX: PERGDNNLTR IVGGQ HSA FX 110

FIX: DNNLTR IVGGQ HSA FIX 111

FIX: SVSQTSKLTR AETVFPDVD Fc FIX 62

FIX: QSFNDFTR VVGGED N Fc FIX 63

FIX (1-412): SVSQTSKLTR AETVFPDVD Fc FIX 64

FIX: ASKPQGR IVGG HSAdeIDAH FVII 112

FIX: KRNASKPQGR IVGGKV HSA FVII 65

FIX: PEEPQLR MKNNEEAED HSA FVIII 66

FIX: DNSPSFIQIR SVAKKHPKT HSA FVIII 67

FIX: LSKNNAEPR SFSQNSRHPS HSA FVIII 68

FIX: DEDENQSPR SFQKKTRHYFIA HSA FVIII 69

FIX: SPHVLRNR AQSGSVPQ HSA FVIII 70

FVII o FVIIa: PEEPQLR MKNNEEAEDYDDDLTDS HSA FVII 71

FVII o FVIIa: DDDNSPSFIQIR SVAKKHPKTWVH-YAAEEED HSA FVII 72

FVII o FVIIa: LSKNNAIEPR SFSQNSRHPSTRQKQFNA HSA FVIII 73

FVII o FVIIa: DEDENQSPR SFQKKTRHYFIAA HSA FVIII 74

FVII o FVIIa: DYGMSSSPHVLRNR AQSGSVPQFKKVVFQEFT HSA FVIII 75

FVIII: Obtenido a partir de los sitios de escisión de FVIII, FIX o Fibrin�geno HSA FVIII, FIX o Fgn

VWF: Obtenido a partir de los sitios de escisión de VWF, FVIII o FIX HSA FIX,FVIII,VWF

VWF: DIYDEDENQSPR SFOKKTRHYFIA HSA FVIII 76

VWF: DNSPSFIQIR SVAKKHP HSA FVIII 77

VWF: LSKNNAIEPR SFSQNSRHPS HSA FVIII 78

con el polimorfismo natural, T148-A148, las secuencias pueden contener también A en lugar de T en esta posición. Tabla 3b: Ejemplos de posibles estructuras artificiales con dos o más sitios de escisión

Factor de coagulación: Enlazador HLEP Enlazador obtenido a partir de (modificaciones parcialmente incluidas) SEQ ID NO:

Enlazador con dos sitios de escisión

FIX: SVSQTSKLTR AETVFPDV TQPERGDNNLTR IVGGQE HSA FIX FX 79

FIX: SKLTR AETVFPDNNLTRIVGGQE HSA FIX FX 80

FIX: R AETVFPDV TQPERGDNNLTR IVGGQE HSA FIX FX 81

FIX: R AETVFPERGDNNLTRIVGGOE HSA FIX FX 82

FIX: SVSQTSKLTR AETVFPDVDYV NNLTR IVGG-QE HSA FIX FX 83

FIX: SVSQTSKLTRAETVFPDVD NNLTRIVGGQE HSA FIX FX 84

FIX: SVSQTSKLTRAETVFPDVD NNLTRIVGGQE HSA FIX FX 85

FIX: SVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNIT QSTQSFN DFTRVVGGEDA HSA FIX 86

FIX: SVSQTSKLTRAETVFPDVQSFNDFTRVVGGED HSA FIX 87

FIX: SVSQTSKLTR AETVFPDVD SFNDFTR VVGGED HSA FIX 88

FIX: SVSQTSKLTRAETVFPDVNASKPQGRIVGGKV HSA FIX y FVII 89

FIX: SVSQTSKLTRAETVFPDVNASKPQGRLVGGKV HSA FIX y FVII 90

FIX: SVSQTSKLTRAETVFPDVNASKPQGRTVGGKV HSA FIX y FVII 91

FIX: SVSQTSKLTR AETVFPDVD Fc 92

Las variantes y los fragmentos de los enlazadores descritos también est�n incluidos en la presente invención siem

5 pre y cuando el enlazador todavía se pueda escindir con la proteasa o las proteasas, que escinden los enlazadores de las tablas 3a y 3b o con el tipo de proteasas definidas anteriormente. El término "variantes" incluye inserciones, deleciones y sustituciones, ya sea conservadoras o no conservadoras.

Otras combinaciones de las secuencias de escisión descritas anteriormente y de sus variantes se incluirán en la presente invención.

10 En otra realización, se incluyen sustituciones de amino�cidos que cambian el patrón de modificación posttraduccional del enlazador pept�dico. Estas pueden ser, por ejemplo, sustituciones de amino�cidos que est�n glicosilados, sulfatados o fosforilados.

Breve descripción de las Figuras

Figura 1: Activación in vitro de proteínas de fusión FIX-albúmina a través de FXIa a 37�C en una relación molar en

15 tre FXIa y la proteína de fusión de aproximadamente 1:500. Se utilizó una proteína de fusión con enlazador no escindible (1478/797) y dos proteínas de fusión con enlazador escindible (1088/797 y 1089/797). Las muestras se analizaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras seguido por tinción con azul de Coomassie.

Figura 2: Farmacocin�tica de FIX rec activado y proteínas de fusión FIX-albúmina, con y sin enlazador escindible en comparación con proteínas de fusión no activadas.

20 Figura 3: Inactivaci�n de FIX rec activado o proteínas de fusión FIX-albúmina mediante AT. La actividad residual de

FIX se determin� después de 120 min utilizando un ensayo de tiempo de tromboplastina parcial no activado.

Ejemplos:

Ejemplo 1: Generación de ADNc que codifican FIX y proteínas de fusión FIX - albúmina

La secuencia codificadora del Factor IX fue amplificada mediante PCR a partir de una genoteca de ADNc de hígado humano (ProQuest, Invitrogen) usando los cebadores We1403 y We1404 (SEQ ID NO 5 y 6). Después de una segunda ronda de PCR usando los cebadores We1405 y We1406 (SEQ ID NO 7 y 8), el fragmento resultante se clon� en pCR4TOPO (Invitrogen). A partir de ahí se transfirió el ADNc de FIX como un fragmento EcoRI en el sitio EcoRI de pIRESpuro3 (BD Biosciences) en donde un sitio XhoI interno había sido eliminado previamente. El pl�smido resultante fue denominado pFIX-496 y era el vector de expresión para el factor IX de tipo silvestre.

Para la generación de estructuras artificiales de fusión con albúmina, el ADNc de FIX se volvió a amplificar con PCR en condiciones convencionales usando los cebadores We2610 y We2611 (SEQ ID NO 9 y 10) eliminando el cod�n de parada e introduciendo un sitio XhoI en su lugar. El fragmento FIX resultante se digirió con las endonucleasas de restricción EcoRI y XhoI y se ligó en un pIRESpuro3 digerido con EcoRI/BamH1 junto con fragmento enlazador digerido con XhoI / BamH1, tal y como se describe a continuación.

Se generaron dos fragmentos distintos de enlazador glicina / serina sin sitios de escisión internos: los oligonucle�tidos We2148 y We2150 (SEQ ID NO 11 y 12) se reasociaron en concentraciones equimolares (10 pmol) en condiciones estándar de PCR, se rellenaron y se amplificaron usando un protocolo de PCR de desnaturalización inicial durante 2 min a 94�C, seguida de 7 ciclos de 15 s de desnaturalización a 94�C, 15 s de reasociaci�n a 55�C y 15 s de alargamiento a 72�C, y finalizó por una etapa de extensión de 5 min a 72�C. El mismo procedimiento se llev� a cabo usando los oligonucle�tidos We2156 y We2157 (SEQ ID NO 13 y 14). Los fragmentos enlazadores resultantes se digirieron con las endonucleasas de restricción XhoI y BamH1 y se utilizaron por separado en la reacción de ligación descrita anteriormente. Por tanto, los pl�smidos resultantes contenían la secuencia codificadora de FIX y una extensión C-terminal de un enlazador de glicina / serina.

Se generaron dos fragmentos enlazadores escindibles diferentes obtenidos a partir de los sitios de activación de FIX: los oligonucle�tidos We2335 y We2336 (SEQ ID NO 15 y 16), que contenían el sitio de escisión de activación de la región limítrofe de la cadena ligera de FIX / p�ptido de activación, se reasociaron, se rellenaron y se amplificaron tal y como se ha descrito anteriormente. El fragmento enlazador resultante se digirió con las endonucleasas de restricción XhoI y BamH1 y se utilizó en la reacción de ligación descrita anteriormente. Por consiguiente, el pl�smido resultante contenía la secuencia codificadora de FIX y una extensión C-terminal de una secuencia de FIX escindible (amino�cidos 136 a 154 de SEQ ID NO 2). En una reacción posterior de mutag�nesis dirigida al sitio con un kit de mutag�nesis disponible comercialmente (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) usando los oligonucle�tidos We2636 y We2637 (SEQ ID NO 17 y 18), se elimin� el sitio XhoI.

Para la generación del segundo fragmento de enlazador escindible obtenido a partir de FIX, se realizó el mismo procedimiento usando los oligonucle�tidos We2337 y We2338 (SEQ ID NO 19 y 20) para la construcción enlazador. El fragmento de enlazador resultante se digirió con las endonucleasas de restricción XhoI y BamH1 y se utilizó en la reacción de ligación descrita anteriormente. El pl�smido resultante contenía entonces la secuencia codificadora de FIX y una extensión C-terminal de una secuencia escindible de FIX obtenida a partir del sitio de escisión de activación de la región limítrofe del p�ptido de activación de FIX / cadena pesada (amino�cidos 173 a 186 de SEQ ID NO 2). Los oligonucle�tidos We2638 y Nos 2639 (SEQ ID NO 21 y 22) fueron utilizados para la deleci�n del sitio XhoI tal y como se ha descrito anteriormente.

En la siguiente etapa de clonaci�n, los pl�smidos generados anteriormente se digirieron con BamH1 y se insert� un fragmento de BamH1 que contenía el ADNc de albúmina humana madura. Este fragmento había sido generado por PCR sobre una secuencia de ADNc de albúmina usando los cebadores We1862 y We1902 (SEQ ID NO 23 y 24) en condiciones estándar.

Los pl�smidos finales con enlazadores de glicina / serina no escindibles fueron designados pFIX-980 (SEQ ID NO 30) y pFIX-986 (SEQ ID NO 31), respectivamente. Los pl�smidos finales con enlazadores escindibles obtenidos a partir de secuencias de FIX, fueron designados pFIX-1088 (SEQ ID NO 40) y pFIX-1089 (SEQ ID NO 49), respectivamente. Sus secuencias enlazadoras y el FIX C-terminal y las secuencias N-terminales de albúmina se describen a continuación. Los sitios de escisión proteol�tica dentro de los enlazadores se indican con flechas, las secuencias enlazadoras obtenidas a partir de FIX est�n subrayadas.

Para la expresión en células CHO, las secuencias codificadoras de la proteína de fusión FIX albúmina se transfirieron a vectores plRESneo3 (BD Biosciences) o pcDNA3.1 (Invitrogen), respectivamente.

Para un procesamiento eficaz del prop�ptido en células que expresan FIX en altas cantidades es necesaria la coexpresi�n de furina (Wasley LC y col. 1993. PACE/Furin can process the vitamin K-dependent pro-factor IX precursor within the secretory pathway. J. Biol. Chem. 268:8458-8465). La furina se amplificó a partir de una genoteca de ADNc de hígado (Ambion) usando los cebadores We1791 y We1792 (SEQ ID NO 25 y 26). Una segunda ronda de PCR usando los cebadores We1808 y We1809 (SEQ ID NO 27 y 28) proporcion� un fragmento de furina en el que se había eliminado el dominio transmembranal carboxiterminal (TM) y se había introducido un cod�n de parada; este fragmento se clon� en pCR4TOPO (Invitrogen). A partir de ahí el ADNc de furinaLTM se transfirió como un fragmento EcoRI/NotI en los sitios EcoRI/NotI de pIRESpuro3 (BD Biosciences) en donde se había delecionado previamente un sitio XhoI interno. El pl�smido resultante se design� pFu-797. Este pl�smido se cotransfect� con todas las estructuras artificiales de FIX en una relación molar de 1:5 (pFu-797 : pFIX-xxx). La secuencia de amino�cidos de la furina secretada codificada por pFu-797 se proporciona como SEQ ID NO 29.

Ejemplo 2: Transfecci�n y expresión de FIX y de proteínas de fusión FIX-albúmina

Los pl�smidos se dejaron crecer en E. coli TOP10 (Invitrogen) y se purificaron utilizando protocolos convencionales (Qiagen). Las células HEK-293 se transfectaron usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se dejaron crecer en medio exento de suero (Invitrogen 293 Express) en presencia de 50 ng/ml de vitamina K y 4 μg/ml de puromicina. Las poblaciones de células transfectadas se propagaron a través de matraces T a botellas de cultivo rotatorias

o a fermentadores a pequeña escala, a partir de los cuales se recogió el material sobrenadante para la purificación.

Alternativamente, células CHO K1 o DG44 (Invitrogen) se transfectaron utilizando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se dejaron crecer en medio exento de suero (Invitrogen CD-CHO) en presencia de 50 ng/ml de vitamina K y 500-750 ng/ml de Geneticina. Se seleccionaron los clones que tenían mayor expresión y se propagaron a través de matraces T a botellas de cultivo rotatorias o a fermentadores a pequeña escala, a partir de los cuales se recogió el material sobrenadante para la purificación.

Ejemplo 3: Purificación de FIX y de proteínas de fusión FIX-albúmina

La cosecha de un cultivo celular que contenía FIX o proteína de fusión FIX albúmina se aplicó sobre una columna de Q-Sepharose FF, previamente equilibrada con tampón TrisxHCI 50 mM / NaCl 100 mM pH 8,0. Posteriormente, la columna se lav� con tampón de equilibrado que contenía NaCl 200 mM. La eluci�n de FIX o de la proteína de fusión FIX unida se consiguió mediante un gradiente de sal usando tampón TrisxHCI 50 mM / NaCl 200 mM pH 8,0 como base. El material eluido se purificó adicionalmente por cromatograf�a en columna sobre una resina de hidroxiapatita. Para este propósito, el material eluido de la columna de Q-Sepharose FF se cargó en una columna de cromatograf�a de hidroxiapatito equilibrada con tampón TrisxHCI 50 mM / NaCl 100 mM pH 7,2. La columna se lav� con el mismo tampón y FIX o FIX-HSA se eluyeron usando un gradiente de fosfato de potasio a pH 7,2. El material eluido se dializ� para reducir la concentración de sal y se utilizó para un análisis bioquímico as� como para la determinación de los parámetros farmacocin�ticos. El ant�geno y la actividad de FIX se determinaron tal y como se describe en el ejemplo 5.

Ejemplo 4: Esquema de purificación alternativa de FIX y de proteínas de fusión FIX-albúmina

Como se ha descrito en el ejemplo 3, la cosecha del cultivo celular que contenía FIX o proteína de fusión FIX albúmina se purificó por cromatograf�a en Q-Sepharose FF. El material eluido de Q-Sepharose se purificó adicionalmente por cromatograf�a en una columna de heparina-Fractogel. Para este fin, la columna de heparina-Fractogel se equilibr� con tampón Tris x HCl 50 mM, NaCl 50 mM pH 8,0 (EP), el material eluido de Q-Sepharose FF se aplicó y la columna se lav� con tampón de equilibrado que contenía NaCl 75 mM. FIX o la proteína de fusión FIX albúmina, respectivamente, se eluyeron usando EP ajustado a NaCl 300 mM. El material eluido de heparina-Fractogel se purificó adicionalmente por cromatograf�a en una columna de cromatograf�a de hidroxiapatita, tal y como se ha descrito en el

ejemplo 3. El material concentrado purificado de FIX proteína de fusión FIX albúmina, respectivamente, se sometió a una determinación de la actividad y del ant�geno de FIX de acuerdo con el ejemplo 5 y se caracterizó con investigaciones adicionales in vitro e in vivo.

Ejemplo 5: Determinación de la actividad y del ant�geno de FIX

La actividad de FIX se determin� como coagulación o actividad coagulante (FIX:C), utilizando reactivos de TTPa disponibles comercialmente (TTPa Pathromtin SL y plasma con FIX reducido, Dade Behring). Como referencia se utilizó un subpatr�n interno calibrado frente al Patrón Internacional de la OMS de concentrado de FIX (96/854).

El ant�geno de FIX (FIX:Ag) se determin� por una ELISA según protocolos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Brevemente, placas de microtitulaci�n se incubaron con 100 μL por pocillo del anticuerpo de captura (anticuerpos emparejados para ELISA de FIX 1:200, Cedarlane, pero también se pueden aplicar otras fuentes de anticuerpos adecuados) durante una noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas tres veces con tampón de lavado B (Sigma P3563), cada pocillo se incub� con 200 μL de tampón de bloqueo C (Sigma P3688) durante una hora a temperatura ambiente. Después de otras tres etapas de lavado con tampón B, diluciones en serie de la muestra del ensayo se incubaron en tampón B, as� como diluciones en serie de un subpatr�n (SHP) en tampón B (volúmenes por pocillo: 100 μL) durante dos horas a temperatura ambiente. Después de tres etapas de lavado con tampón B, se añadieron 100 μL de una dilución 1:200 del anticuerpo de detección (anticuerpos emparejados para ELISA de FIX, marcados con peroxidasa, Cedarlane) en tampón B a cada pocillo y se incubaron durante otras dos horas a temperatura ambiente. Después de tres etapas de lavado con tampón B, se añadieron 100 μL de solución de sustrato (TMB, Dade Behring, OUVF) por pocillo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La adición de 100 μL de solución de detención sin diluir (Dade Behring, OSFA) preparaba las muestras para la lectura en un lector de microplacas adecuado a 450 nm de longitud de onda. Las concentraciones de las muestras de ensayo se calcularon luego usando la curva estándar con plasma humano estándar como referencia.

Ejemplo 6: Comparación de la relación actividad de FIX / ant�geno de FIX de diferentes proteínas de fusión FIX-albúmina en material sobrenadante de cultivos celulares

Material sobrenadante de cultivos celulares de células HEK transfectadas con estructuras artificiales de ADN que codificaban proteínas de fusión FIX-albúmina que contenían diferentes p�ptidos enlazadores, se sometieron a un ensayo de la actividad y del ant�geno de FIX, tal y como se ha descrito anteriormente (véase el ejemplo 5). La relación de FIX:C a FIX:Ag se calcul� representando una medida directamente proporcional a la actividad específica molar de las diferentes estructuras artificiales.

Los resultados mostrados en la tabla 4 indican que hay un incremento en la relación de actividad/ant�geno después de la introducción de enlazadores escindibles en la molécula FIX-HSA. También se muestra que el p�ptido enlazador escindible debe tener una longitud de más de dos amino�cidos con el fin de proporcionar claramente el aumento de las relaciones de actividad/ant�geno.

Tabla 4: Relaciones de FIX:C/FIX:Ag de proteínas de fusión FIX-albúmina que contienen diferentes p�ptidos enlazadores

Estructura artificial FIX-HSA: Enlazador FIX:C/FIX:Ag Número de veces del incremento en comparación con la proteína de fusión 980/797 con enlazador no escindible (GGGGGGV)

1182/797: Ninguno < 0,031

1366/797: RI < 0,068

1478/863: GGGGGGV (Sheffield et al.) 0,041 --

980/797: SS(GGS)7GS 0,070 1,7

986/797: SSNGS(GGS)3NGS (GGS)3GGNGS 0,076 1,9

1483/863: SVSQTSKLTR AETVFPDVD GSGGS 0,688 16,8

1088/797: SVSQTSKLTR AETVFPDVD GS 0,832 20,3

1365/797: SVSQTSKLTR AETVFPDVD 0,630 15,4

1482/863: SVSQTSKLTR AETVFP 0,482 11,8

1087/797: SVSQTSKLTR AETVFPDVD GS (FIX deltaKLT) 0,472 11,5

1089/797: QSFNDFTR WGGED GS 0,532 13,0

1091/797: PERGDNNLTR IVGGQE GS 0,111 2,7

Ejemplo 7: Comparación de FIX y proteínas de fusión FIX - albúmina respecto a la actividad específica molar, la semivida terminal in vivo y la recuperación in vivo en ratas o conejos

En FIX purificado de tipo silvestre recombinante (rFIX 496/797) y proteínas de fusión FIX-albúmina (rFIX 980/797,

5 rFIX 986/797, rFIX-1088/797 y rFIX 1089/797) se analizó la actividad de FIX en un ensayo de coagulación tal y como se ha descrito anteriormente. Paralelamente, se determin� la diferencia de la densidad óptica a 280 y 320 nm como una medida de la concentración de proteína (DO280-320). Se calcularon las relaciones de la actividad por DO280320 y basándose en las densidades ópticas molares, se calcularon las actividades específicas molares. En la siguiente tabla 5 se resumen los resultados.

10 Tabla 5: Actividades específicas molares de FIX wt (de tipo silvestre) en comparación con fusiones FIX-albúmina

Enlazador: Densidad óptica Actividad coagulante de FIX Actividad/Vol/DO Actividad específica molar*

(DO280-320): (UI/mL) (UI/mL/DO) (UI/nmol)

rFIX.wt (496/797): 0,3798 21,2 55,8 4,23

rFIX-HSA (no escindible, 1478/863): GGGGGGV (Sheffield et al.) 2,9189 5,8 2,0 0,23

rFIX-HSA (no escindible, 980/797): SS (GGS)7 GS 1,1122 3,4 3,0 0,35

rFIX-HSA (no escindible 986/797): SS NGS (GGS)3 NGS (GGS)3 GGN GS 0,8107 3,2 4,0 0,45

rFIX-HSA (escindible, 1088/797): FXIa escindible 0,3421 11,9 34,8 3,95

rFIX-HSA (escin-: FXIa escindible 0,4512 11,3 25,0 2,84

(DO280-320): (UI/mL) (UI/mL/DO) (UI/nmol)

dible, 1089/797)

* Actividad específica molar basada en la actividad, la densidad óptica y las siguientes densidades ópticas molares: Densidad óptica molar de FIX: DO(280 nm, 1 mol/L) = 75 810 Densidad óptica molar de albúmina: DO(280 nm, 1 mol/L) = 37 791 Densidad óptica molar de la proteína de fusión FIX-albúmina: DO(280 nm, 1 mol/L) = 113 601

Tomando en cuenta los resultados resumidos en la Tabla 5, es sorprendente que dos estructuras artificiales que se habían generado de acuerdo con la presente invención, muestren un gran incremento de las actividades específicas molares en comparación con las proteínas de fusión con enlazadores no escindibles. Además, la actividad específica molar de estas estructuras artificiales solo había disminuido moderadamente en comparación con rFIX de tipo silvestre.

Investigaciones in vitro de las reacciones de escisión proteol�tica mediante Factor XIa (FXIa) confirmaron que las proteínas de fusión FIX-albúmina que contienen un enlazador escindible tal como, por ejemplo, la estructura artificial n� 1088/797 o 1089/797, se activan y paralelamente el enlazador se escinde dando como resultado la liberación del resto de albúmina (Figura 1). La proteína de fusión con enlazador no escindible no mostr� una liberación correspondiente del resto de albúmina.

En el caso de FVIIa como proteasa para la escisión, en presencia de factor tisular, las proteínas de fusión FIXalb�mina 1088/797 o 1089/797 que contenían un enlazador escindible, también mostraron la liberación del resto de albúmina paralelamente a la liberación del p�ptido de activación de FIX (Datos no mostrados).

Adem�s de la determinación de la actividad de coagulación específica molar, los polip�ptidos n� 496/797, 980/797, 986/797, 1088/797 y 1089/797 descritos anteriormente, se administraron por vía intravenosa a ratas CD/Lewis narcotizadas (6 ratas por sustancia) y/o a conejos (4 conejos por sustancia) con una dosis de 50 UI/kg de peso corporal. Las muestras de sangre fueron tomadas antes de la administración de la sustancia del ensayo y a intervalos apropiados, comenzando 5 minutos después de la administración de las sustancias del ensayo. El contenido en ant�geno de FIX se cuantific� posteriormente mediante un ensayo ELISA específico para el Factor IX humano (véase más arriba). Se utilizaron los valores medios de los grupos respectivos para calcular la recuperación in vivo después de 5 min. Las semividas para cada proteína se calcularon utilizando los puntos de tiempo de la fase beta de eliminación (semivida terminal) de acuerdo con la fórmula t1/2 = In2 / k, en donde k es la pendiente de la recta de regresión obtenida en el trazado de los niveles de FIX:Ag a escala logarítmica y tiempo a escala lineal.

Las semividas calculadas in vivo se resumen en la tabla 6. En ratas as� como en conejos se encontr� que las semividas in vivo de las proteínas de fusión FIX-albúmina se incrementaban de manera significativa en comparación con FIX no fusionado de tipo silvestre recombinante, preparado internamente, en comparación con el producto de FIX recombinante disponible comercialmente. Las semividas in vivo la de las proteínas de fusión de albúmina en comparación con BeneFIX� se incrementaron hasta aproximadamente 200-400%, dependiendo de las especies animales o de la estructura artificial utilizada (Tabla 6).

Para evaluar la recuperación in vivo, los niveles de ant�geno de FIX medidos por mL de plasma a sus concentraciones máximas, después de una administración intravenosa (t = 5 min), estaban relacionados con la cantidad de producto aplicado por kg. Alternativamente, se calcul� un porcentaje relacionando el nivel de ant�geno determinado (UI/ml) 5 min después de la infusión, con el nivel de producto teórico esperado con una recuperación del 100% (producto aplicado por kg, dividido por un volumen de plasma asumido de 40 mL por kg). Las recuperaciones in vivo (IVR) de las proteínas de fusión FIX-albúmina eran significativamente mayores que las recuperaciones in vitro de rFIX (496/797) o BeneFIX� (Tabla 7).

Tabla 6: Tabla 7:

Semividas terminales in vivo de preparaciones de FIX obtenidas a partir de expresión recombinante (BeneFIX�, rFIX 496/797) y proteínas de fusión FIX albúmina (rFIX 980/797, rFIX 986/797, rFIX 1088/797 y rFIX 1089/797) después de una administración intravenosa de 50 UI/kg en ratas y/o 50 UI/kg en conejos, respectivamente.

Experimentos en ratas: Experimentos en conejos

PSR18-05, PSR06-05, PSR02-05: PSK11-05

Semivida terminal (h): en relación con BeneFIX [%] Semivida terminal (h) en relación con BeneFIX [%]

rFIX 496/797: 4,5* 91 n.t. n.t.

rFIX 980/797: 11,6* 234 36,9� 29,3� (22 exp.) 410 326

rFIX 986/797: 10,5* 212 n.t. n.t.

rFIX 1088/797: 8,3* 168 30,3� 337

rFIX 1089/797: 10,5* 212 n.t. n.t.

BeneFIX: 4,95* (media de 5,3 y 4,6) 100 9,0� 100

* Determinada entre 120 y 1440 min � Determinada entre 4 y 96 h

Recuperaciones in vivo (cantidad de sustancia 5 minutos después de la administración) de preparaciones de FIX recombinante (BeneFIX, rFIX 496/797) y proteínas de fusión FIX albúmina (rFIX 1088/797, rFIX 1089/797) después de una administración intravenosa de 50 UI/kg en ratas. El porcentaje de recuperación in vivo se calcul� basándose en un volumen de plasma asumido de 40 mL/kg.

Experimento en ratas

recuperaci�n in vivo UI/dL por UI/kg/[%]*: en relación con BeneFIX [%]

rFIX 496/797: 0,462 / 18,5 74,6

rFIX 1088/797: 1,034 / 41,4 166,5

rFIX 1089/797: 1,063 / 42,5 171,2

BeneFIX: 0,621 / 24,8 100

* Calculado basándose en un volumen plasm�tico de 40 mL/kg

Ejemplo 8: Activación in vitro de proteínas de fusión FIX albúmina con/sin enlazador escindible (1088/797 y 5 980/797) y determinación de la farmacocin�tica en ratas

Prote�nas de fusión FIX albúmina y rec FIX se activaron in vitro utilizando Factor XIa disponible comercialmente (Kordia). Brevemente, cantidades molares idénticas de FIX o de proteína de fusión FIX-albúmina (3,0 x 10-6 mol/L) se activaron a 37�C en solución en presencia de FXIa (1,9 x 10-8 mol/L) y CaCl2 (1,5 mmol/L) tamponado a pH 6,8. Después de la activación completa tal y como se mostr� por SDS-PAGE, se detuvo la reacción mediante la adición

10 de 5 veces exceso molar de inhibidor C1 (Berinert P) basándose en la cantidad de FXIa. Las muestras se almacenaron congeladas a menos de -70�C hasta el inicio de la investigación farmacocin�tica.

Una investigación farmacocin�tica de FIX y las proteínas de fusión FIX-albúmina activadas se realizó en ratas tal como se ha descrito en el Ejemplo 7 y los resultados se compararon con unos resultados farmacocin�ticos que incluían proteínas de fusión no activadas.

15 Result� que las proteínas de fusión activadas mostraban unas semividas as� como AUCs significativamente reducidas, en comparación con las moléculas no activadas (Figura 2). Después de la activación de la proteína de fusión de FIX con enlazador escindible (1088/797) se mostr� un comportamiento farmacocin�tico muy similar al de rec FIX activado (BeneFIX) mientras que la proteína de fusión activada con enlazador no escindible (980/797) daba como resultado una semivida mayor tanto inicial como terminal, en comparación con la proteína de fusión activada 1088/797

5 con enlazador escindible. Por lo tanto, los resultados demuestran claramente que el enlazador escindible da como resultado un aumento de la eliminación del factor de coagulación después de la activación y, por lo tanto, evita la acumulación de proteínas de fusión potencialmente trombog�nicas, activadas con semividas prolongadas.

Ejemplo 9: Comparación de proteínas de fusión FIX - albúmina con/sin enlazador escindible con respecto a la tasa de inactivaci�n de los factores de coagulación activados mediante antitrombina III (AT)

10 Las proteínas de fusión de FIX con (1088/797) y sin (980/797) enlazador escindible se activaron mediante incubaci�n con FXIa tal y como se ha descrito en el ejemplo 8. Los factores activados se incubaron con AT durante 120 min y la actividad residual de FIXa se determin� usando un método de ensayo de coagulación manual de FIX sin activación (TTPna, ver más abajo) según Schnitger y Gross. Como muestras testigo se utilizaron las proteínas de fusión FIX-albúmina activadas en presencia de la misma cantidad de AT pero sin incubaci�n.

15 La actividad de FIX se determin� con la ayuda de un ensayo de tiempo de tromboplastina parcial no activada (TTPna) utilizando plasma carente de FIX de Dade Behring. Las muestras se diluyeron previamente en un tampón de pH 6,8 que contenía His, Gly, sacarosa y Tween 80. Toda la determinación se realizó utilizando coagul�metros según Schnitger & Gross. Una mezcla de 0,1 ml de plasma carente de FIX, 0,1 ml de muestra y 0,1 ml de 0,1% de fosfol�pidos (Rh�ne-Poulenc-Nattermann, 1:3 diluido previamente en tampón imidazol suplementado con 1% de

20 HSA) se incub� durante 2 minutos a 37�C. La reacción de coagulación se inici� añadiendo 0,1 ml de solución de CaCl2 0,025 mol/l y se determin� el tiempo de coagulación.

La Figura 3 muestra los resultados de un experimento de inactivaci�n correspondiente. En el caso de la proteína de fusión con enlazador escindible (1088/797), un aumento en el tiempo de coagulación de 210 a 540 s (factor de 2,57x) demostr� un proceso de inactivaci�n acelerada de la actividad de FIXa mediante AT, en comparación con una

25 proteína de fusión con enlazador no escindible (980/797) que solo mostraba un aumento de 196 a 411 s (factor de 2,10x). Lo más probable es que el residuo de albúmina afecte est�ricamente al proceso de inactivaci�n dependiente de AT en el caso de la proteína de fusión con enlazador no escindible, mientras que en el caso de la proteína de fusión con enlazador escindible, el residuo de albúmina se separa por escisión dando lugar a una inactivaci�n acelerada por AT.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> CSL Behring GmbH CSL Behring GmbH

<120> Proteínas de fusión que se pueden escindir proteol�ticamente con actividad específica molar elevada 5 <130> 2006_M004_A115

<150> EP06012262.9

<151> 2006-06-14

<160> 112

<170> PatentIn versión 3.3 10 <210> 1

<211> 585

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 415

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 1386

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 1830

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 21 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 5 10 ccactttcac aatctgctag c 21

<210> 6

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Artificial

5 <400> 6 caattccaat gaattaacct tgg 23

<210> 7

<211> 21

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 7 atgcagcgcg tgaacatgat c 21

15 <210> 8

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Artificial

<400> 8 tcattaagtg agctttgttt tttcc 25

<210> 9

<211> 21 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 9 30 gattcgaatt cgcccttatg c 21

<210> 10

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<223> Artificial

<400> 10 cgctcgaggt gagctttgtt ttttccttaa tc 32

<210> 11 40 <211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 11 ctcgagcggg ggatctggcg ggtctggagg ctctggaggg tcgggaggct ct 52

5: <210> 12 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Artificial

10: <400> 12 ggatccagat cccccagagc ctccagagcc tcccgaccct ccagag 46

<210> 13 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15: <220> <223> Artificial

<400> 13 ctcgagcaat ggatctggcg ggtctggagg ctctggaggg tcgaatggct ctggag: 56

20: <210> 14 <211> 64 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Artificial

25: <400> 14

30: <210> 15 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Artificial

<400> 15 cctcgagctc tgtgagccag acctccaagc tcaccagggc cgagac 46

35: <210> 16 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia artificial

40: <220> <223> Artificial

<400> 16 gggatccgtc cacatcaggg aagacagtct cggccctggt gagc: 44

<210> 17 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5: <220> <223> Artificial

<400> 17 ggaaaaaaca aagctcactt ctgtgagcca gac: 33

10: <210> 18 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Artificial

15: <400> 18 gtctggctca cagaagtgag ctttgttttt tcc 33

20: <210> 19 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Artificial

<400> 19 cctcgagcag agcttcaatg acttcacccg ggtggtgg 38

25: <210> 20 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

30: <220> <223> Artificial

<400> 20 gggatccatc ctccccgccc accacccggg tgaagtcatt g: 41

35: <210> 21 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Artificial

40: <400> 21 ggaaaaaaca aagctcactc agagcttcaa tgac 34

<210> 22 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 22 gtcattgaag ctctgagtga gctttgtttt ttcc 34

5 <210> 23

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Artificial

<400> 23 gtgggatccg atgcacacaa gagtgaggtt g 31

<210> 24

<211> 35 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 24 20 cacggatccc tataagccta aggcagcttg acttg 35

<210> 25

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> Artificial

<400> 25 caaggagacg ggcgctcc 18

<210> 26 30 <211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Artificial

35 <400> 26 gcccaaggag gggattggc 19

<210> 27

<211> 30

<212> ADN 40 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 27 gtggaattca tggagctgag gccctggttg 30

<210> 28 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5: <220> <223> Artificial

<400> 28 cacgcggccg ctcactacag ccgttgcccc gcctccac: 38

10: <210> 29 <211> 704 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 30

<210> 31

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 31

<210> 32 10 <211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

15 <400> 32

<210> 33

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 33

25 <210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 30 <223> Enlazador

<400> 34

<210> 35

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 35

5 <210> 36

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 10 <223> Enlazador

<400> 36

<210> 37

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 38

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> Enlazador

<400> 38

<210> 39 30 <211> 21

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 39

<210> 40

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 41

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

15 <220>

<223> Enlazador

<400> 41

<210> 42

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> Enlazador

<400> 42

<210> 43 30 <211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 43

<210> 44

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 45

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

15 <220>

<223> Enlazador

<400> 45

<210> 46 20 <211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

25 <400> 46

<210> 47

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 47

<210> 48

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 48

<210> 49 10 <211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

15 <400> 49

<210> 50

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 50

25 <210> 51

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 30 <223> Enlazador

<400> 51

<210> 52

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 53

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 53

<210> 54 10 <211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

15 <400> 54

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

25 <210> 56

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 30 <223> Enlazador

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 58

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 59 10 <211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 60

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

25 <210> 61

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 30 <223> Enlazador

<400> 61

<210> 62

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 63

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 63

<210> 64

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 64

<210> 65

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 65

<210> 66

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 66

<210> 67

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 67

<210> 68

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 69

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

15 <220>

<223> Enlazador

<400> 69

<210> 70 20 <211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

25 <400> 70

<210> 71

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 71

<210> 72

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 73

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

15 <220>

<223> Enlazador

<400> 73

<210> 74 20 <211> 22

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

25 <400> 74

<210> 75

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 75

<210> 76

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 77

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

15 <220>

<223> Enlazador

<400> 77

<210> 78 20 <211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

25 <400> 78

<210> 79

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 79

<210> 80

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 81

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial

15 <220>

<223> Enlazador

<400> 81

<210> 82 20 <211> 22

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

25 <400> 82

<210> 83

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 83

<210> 84

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 85

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

15 <220>

<223> Enlazador

<400> 85

<210> 86 20 <211> 52

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

25 <400> 86

<210> 87 30 <211> 32

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Enlazador

<400> 87

5 <210> 88

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 10 <223> Enlazador

<400> 88

<210> 89

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 90

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> Enlazador

<400> 90

<210> 91 30 <211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 91

<210> 92

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 93

<211> 666

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

15 <400> 93

<210> 94

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 95 10 <211> 24

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

15 <400> 95

<210> 96

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 96

25 <210> 97

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 30 <223> Enlazador

<400> 97

<210> 98

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 98

<210> 99

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 100

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

15 <220>

<223> Enlazador

<400> 100

<210> 101 20 <211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

25 <400> 101

<210> 102

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 102

35 <210> 103

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 40 <223> Enlazador

<400> 103

<210> 104

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 105

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

15 <220>

<223> Enlazador

<400> 105

<210> 106 20 <211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

25 <400> 106

<210> 107 30 <211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

35 <400> 107

<210> 108

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<400> 108

5 <210> 109

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 10 <223> Enlazador

<400> 109

<210> 110

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

<210> 111

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> Enlazador

<400> 111

<210> 112 30 <211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Enlazador

35 <400> 112

Claims

REIVINDICACIONES

1. Proteína de fusión terapéutica que comprende

a) un factor de coagulación,

b) un polip�ptido que alarga la semivida seleccionado entre el grupo que consiste en albúmina incluyendo variantes y derivados de la misma, polip�ptidos de la familia de la albúmina incluyendo variantes y derivados de los mismos e inmunoglobulinas sin el domino de unión a ant�genos, y

c) un enlazador pept�dico que une el factor de coagulación y el extremo N-terminal o C-terminal del polip�ptido que alarga la semivida de modo que el enlazador pept�dico escindible intercalado se introduce entre el factor de coagulación y el polip�ptido que alarga la semivida;

en donde el enlazador pept�dico se puede escindir con proteasas implicadas en la coagulación o activadas por enzimas de la coagulación y en donde la proteína de fusión terapéutica tiene en comparación con la proteína de fusión terapéutica respectiva unida por un enlazador no escindible que tiene la secuencia de amino�cidos GGGGGGV, un aumento de la actividad específica molar en al menos un ensayo relacionado con la coagulación y en donde la actividad específica molar se incrementa en al menos el 100%.
2.

Prote�na de fusión terapéutica según la reivindicación 1, en donde el factor de coagulación es un factor de coagulación dependiente de la vitamina K.
3.

Prote�na de fusión terapéutica según las reivindicaciones 1 a 2, en donde el factor de coagulación es FVIIa

o FIX.
4.

Prote�na de fusión terapéutica según las reivindicaciones 1 a 3, en donde el polip�ptido que alarga la semivida es una inmunoglobulina sin un dominio de unión a ant�genos.
5.

Prote�na de fusión terapéutica según las reivindicaciones 1 a 4, en donde el enlazador se puede escindir con FXIa y/o FVIIa/TF.
6.

Prote�na de fusión terapéutica según las reivindicaciones 1 a 5, en donde el enlazador se puede escindir con la proteasa o proteasas que activan el factor de coagulación.
7.

Prote�na de fusión terapéutica según la reivindicación 6, en donde la cinética de la escisión del enlazador con la proteasa o proteasas no se retrasa, en comparación con la cinética de la activación de dicho factor de coagulación en más de un factor 3.
8.

Prote�na de fusión terapéutica según la reivindicación 7, en donde el enlazador se puede escindir con la proteasa o proteasas que se activan después de la implicación del factor de coagulación.
9.

Prote�na de fusión terapéutica según las reivindicaciones 1 a 8, en donde el enlazador se puede escindir con FXIa y/o FVIIa/TF y el factor de coagulación es FIX.
10.

Prote�na de fusión terapéutica según las reivindicaciones 1 a 9, en donde el enlazador se puede escindir con FXa y/o FVIIa/TF y el factor de coagulación es FVIIa.
11.

Prote�na(s) de fusión terapéutica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el enlazador comprende una secuencia seleccionada entre el grupo de las tablas 3a and 3b en donde los enlazadores RI, GGGGGGV, (GGS)nGS, SS(GGS)7GS y SSNGS(GGS)3NGS(GGS)3GGNGS est�n excluidos.
12.

Prote�na(s) de fusión terapéutica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para uso como medicamento.
13.

Un polinucle�tido que codifica una proteína de fusión terapéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
14.

Un pl�smido o un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 13.
15.

Una célula hospedadora que comprende un polinucle�tido según la reivindicación 13 o un pl�smido o un vector según la reivindicación 14.
16.

Un método para producir una proteína de fusión terapéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende cultivar células hospedadoras según la reivindicación 15 en condiciones tales que se expresa la proteína de fusión terapéutica.
17.

Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión terapéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polinucle�tido según la reivindicación 13, o un pl�smido o un vector según la reivindicación 14.
18.

El uso de una proteína de fusión terapéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, de un polinucle�tido según la reivindicación 13, o de un pl�smido o un vector según la reivindicación 14, o de una célula hospedadora según la reivindicación 15, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno de la coagulación sanguínea.
19.

El uso según la reivindicación 18, en donde el trastorno de la coagulación sanguínea es hemofilia B, una deficiencia en FVII y/o FVIIa o hemofilia A.
20.

El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 18 y 19, en donde el tratamiento comprende terapia g�nica humana.