ES2468558T5 - Proteína de fusión escindible proteolíticamente que comprende un factor de coagulación sanguínea - Google Patents

Proteína de fusión escindible proteolíticamente que comprende un factor de coagulación sanguínea Download PDF

Info

Publication number
ES2468558T5
ES2468558T5 ES07726010.7T ES07726010T ES2468558T5 ES 2468558 T5 ES2468558 T5 ES 2468558T5 ES 07726010 T ES07726010 T ES 07726010T ES 2468558 T5 ES2468558 T5 ES 2468558T5
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
fusion protein
fix
coagulation
therapeutic fusion
factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES07726010.7T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2468558T3 (es
Inventor
Hubert Metzner
Thomas Weimer
Stefan Schulte
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CSL Behring GmbH Deutschland
Original Assignee
CSL Behring GmbH Deutschland
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37450975&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2468558(T5) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by CSL Behring GmbH Deutschland filed Critical CSL Behring GmbH Deutschland
Priority claimed from PCT/EP2007/005246 external-priority patent/WO2007144173A1/en
Publication of ES2468558T3 publication Critical patent/ES2468558T3/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2468558T5 publication Critical patent/ES2468558T5/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Protema de fusion escindible proteolfticamente que comprende un factor de coagulacion sangumea Introduccion
La presente invencion se refiere al campo de las protemas de fusion terapeuticas, modificadas con una semivida aumentada en comparacion con sus polipeptidos terapeuticos parentales no modificados. La invencion se refiere espedficamente al factor IX fusionado a polipeptidos potenciadores de la semivida (HLEP), que estan conectados por peptidos de engarce escindibles proteolfticamente, de modo que el peptido de engarce escindible intermedio se introduce entre el factor de coagulacion y el polipeptido potenciador de la semivida. La escision de dichos engarces libera el polipeptido terapeutico de cualquier impedimento esterico que afecte a la actividad provocado por el HLEP y de este modo permite la generacion de protemas de fusion que conservan una actividad espedfica molar elevada del factor de coagulacion. En caso de que las protemas de fusion terapeuticas sean zimogenos, se prefieren especialmente los engarces que liberan el polipeptido terapeutico esencialmente de forma simultanea con su activacion in vivo, tras la exposicion a la o las proteasas correspondientes.
La idea de la invencion se demuestra por el Factor IX humano conectado mediante un peptido de engarce escindible a albumina o inmunoglobulinas sin un dominio de union a anftgeno, como el fragmento Fc sin un dominio de union a anftgeno. La invencion tambien se refiere a secuencias de ADNc que codifican los polipeptidos terapeuticos y a derivados de los mismos fusionados geneticamente a un ADNc que codifica HLEP, tales como la albumina serica humana unida por oligonucleotidos que codifican engarces pepftdicos escindibles intermedios. Dichos derivados codificados presentan una mejora de la semivida y de las actividades espedficas molares que aumentan en comparacion con sus homologos no escindibles. La invencion tambien se refiere a vectores de expresion recombinantes que contienen dichas secuencias de ADNc, a celulas hospedadoras transformadas con dichos vectores de expresion recombinantes, a polipeptidos recombinantes y a derivados que tienen actividades biologicas comparables a la del polipeptido terapeutico de tipo silvestre no modificado pero que tienen semividas mejoradas. La invencion tambien se refiere a procedimientos para la fabricacion de dichas protemas recombinantes y sus derivados. La invencion tambien cubre un vector de transferencia para su uso en terapia genica humana, que comprende dichas secuencias de ADN modificadas, utiles para aumentar la semivida in vivo.
Antecedentes de la invencion
Existen varios polipeptidos terapeuticos recombinantes disponibles en el mercado para su uso terapeutico y profilactico en los seres humanos. Los pacientes se benefician en general del modo espedfico de accion de los ingredientes activos recombinantes, pero una desventaja con frecuencia es su limitada disponibilidad debido a sus procedimientos de fabricacion costosos y complejos. Una reduccion de la dosis necesaria o de la frecuencia de administracion de dichos productos, podna mejorar esta situacion. Una frecuencia de administracion reducida podna mejorar la comodidad del paciente y, por tanto, tambien la aceptacion de la terapia. Se han descrito varias soluciones para conseguir el objetivo de una semivida in vivo aumentada despues de la administracion. Las soluciones propuestas recientemente incluyen la formacion de protemas de fusion, especialmente en el caso de polipeptidos con una semivida in vivo corta que se puede aumentar significativamente mediante la fusion a un HLEP.
Ballance y col. (documento WO 01/79271) describen polipeptidos de fusion de una multitud de diferentes polipeptidos terapeuticos que, cuando se fusionan a la albumina serica humana, se preve que tengan una semivida funcional aumentada in vivo y un penodo de validez prolongada. Se han descrito largas listas de posibles companeros fusion sin que los datos experimentales muestren para casi ninguno de estos polipeptidos que las protemas de fusion de albumina respectivas realmente conservan la actividad biologica y tienen propiedades mejoradas. Entre la lista de polipeptidos terapeuticos mencionados como Ejemplos estan el Factor IX y FVII/FVIIa. Tambien se describen las fusiones de FIX y de FVII/FVIIa en las que hay un engarce pepftdico entre la albumina y FIX o FVII/FVIIa. Sin embargo, no se sugiere el uso de peptidos de engarce escindibles.
Sheffield y col. (Sheffield W.P. y col. (2004), Br. J. Haematol. 126: 565-573) expresan una protema de fusion de albumina y Factor IX murino, compuesta de FIX murino, un engarce de 8 aminoacidos (GPG4TM), albumina murina y un marcador pepftdico de 22 aminoacidos, y tambien una protema de fusion de albumina y Factor IX humano compuesta de Factor IX humano, un engarce de 7 aminoacidos (G6V) y albumina humana. Empleando un ensayo de coagulacion de una sola etapa, dependiente de FIX, las actividades espedficas molares de la protema de fusion FIX-albumina murina (MFUST) y la protema de fusion FIX-albumina humana (HFUS) eran al menos de dos a tres veces menores que las de sus homologos no fusionados, un efecto atribuido, al menos parcialmente a un proceso de activacion proteolftica mas lenta mediante FXIa. Sheffield no utilizo ni sugirio el uso de un engarce escindible entre FIX y la albumina.
Varias solicitudes de patente describen la fusion de polipeptidos terapeuticos con regiones constantes de inmunoglobulinas para extender la semivida in vivo del polipeptido terapeutico. Los documentos WO 2002/04598, WO 2003/059935, WO 2004/081053, WO 2004/101740 y WO 2005/001025 incluyen FIX como ejemplo del resto polipepftdico terapeutico. Las dos ultimas solicitudes de patentes tambien describen FVII/FVIIa fusionados a regiones constantes de inmunoglobulinas y se observo que los homodfmeros de protemas de fusion tienen una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
actividad de coagulacion inferior, en comparacion con protemas de fusion que consistian en un monomeroMmero. Una vez mas, no se sugiere el uso de peptidos de engarce escindibles.
En el documento WO 91/09125 se desvelan protemas de fusion que se unen a traves de engarces que son escindibles por proteasas de la cascada de la coagulacion sangumea, pero las protemas de fusion se limitan a las que comprenden protemas fibrinolfticas o antitromboticas.
En el documento WO 03/068934 se describen moleculas quimericas que se componen de al menos una primera molecula componente, al menos un engarce y al menos una segunda molecula, en las que el engarce comprende un sitio de escision enzimatica para producir una union de origen no natural y un sitio de escision entre la primera y la segunda molecula componente y en las que, tras la escision de la molecula quimerica en el sitio de escision, al menos una de las moleculas componentes es funcionalmente activa. Las proteasas que escinden pueden ser factores de coagulacion, como la trombina. Las moleculas componentes descritas son entre muchas otras FIX y FVIIa. Sin embargo, las protemas de fusion terapeuticas de la presente invencion no se desvelan, ni se desvelan propiedades mejoradas de las protemas de fusion terapeuticas de la presente invencion, tales como el aumento de la actividad espedfica molar, el aumento de las tasas de inactivacion y/o eliminacion en comparacion con la protema terapeutica sin engarces escindibles.
Descripcion de la invencion
Existe una gran necesidad medica de factores de coagulacion que tengan una semivida larga. En la tecnica anterior se han sugerido fusiones de factores de coagulacion a polipeptidos potenciadores de la semivida, para conseguir este objetivo. Sin embargo, una vez que un factor de coagulacion se activa durante la coagulacion, ya sea mediante escision proteolftica del zimogeno (como FIX) o por contacto de un factor que ya esta proteolfticamente "pre"- activado con un segundo polipeptido (como FVIIa que se une al factor tisular), ya no es deseable mantener la semivida larga del factor de coagulacion que ahora esta activado, ya que esto podna conducir a complicaciones tromboticas, como ya es el caso para un factor de coagulacion de tipo silvestre como FVIIa (Aledort L.M., J Thromb Haemost 2(10): 1700-1708 (2004)) y debe ser aun mas relevante si el factor activado tuviera una semivida aumentada. Por tanto, un objetivo de la presente invencion es proporcionar factores de coagulacion de larga vida, que despues de la activacion o despues de la disponibilidad de un cofactor, tengan una semivida comparable a la de un factor de coagulacion sin modificar.
Las fusiones de los factores de coagulacion a polipeptidos potenciadores de la semivida como se describen en la tecnica anterior y como tambien se muestran, en el ejemplo 6 y 7, tienen en general una actividad espedfica molar reducida del factor de coagulacion fusionado. Otro aspecto de la presente invencion es proporcionar FIX con una semivida potenciada, que muestra una mayor actividad espedfica molar en comparacion con la protema de fusion terapeutica correspondiente sin un engarce escindible.
La invencion es, por tanto, acerca de protemas de fusion terapeuticas que comprenden
a) un factor de coagulacion, en el que el factor de coagulacion es FIX,
b) un polipeptido potenciador de la semivida seleccionado entre el grupo que consiste en albumina, incluyendo variantes y derivados de la misma, polipeptidos de la familia de la albumina incluyendo variantes y derivados de los mismos e inmunoglobulinas sin el domino de union a antfgenos y
c) un engarce peptfdico que une el factor de coagulacion al extremo N o C del polipeptido potenciador de la semivida; de manera que el engarce peptfdico escindible intermedio se introduce entre el factor de coagulacion y el polipeptido potenciador de la semivida
en las que el engarce peptfdico es escindible por proteasas implicadas en la coagulacion o activadas por enzimas de la coagulacion y en las que la protema de fusion terapeutica tiene, en comparacion con la protema de fusion terapeutica respectiva unida por un engarce no escindible que tiene la secuencia de aminoacidos GGGGGGV, una actividad espedfica molar aumentada en al menos un ensayo relacionado con la coagulacion y en las que la actividad espedfica molar esta aumentada en al menos el 100 %.
Como consecuencia del engarce escindible, despues de la escision del engarce peptfdico en un modo relacionado con la coagulacion, el comportamiento del factor de coagulacion se parece mas al comportamiento del factor nativo, no fusionado, y no muestra un aumento de la semivida del factor activo con efecto potencialmente protrombotico.
La escision proteolftica en un modo relacionado con la coagulacion, en el sentido de la invencion, es cualquier escision proteolftica que se produzca como consecuencia de la activacion de al menos un factor de coagulacion o un cofactor de la coagulacion.
La expresion "factor de coagulacion activado despues de que el engarce peptfdico se escinde proteolfticamente en un modo relacionado con la coagulacion", en el sentido de la invencion significa que el factor de coagulacion se activa ya sea casi de forma paralela a la escision proteolftica del peptido de engarce, o que el factor de coagulacion ya estaba activado antes de la escision proteolftica del peptido de engarce. La activacion se puede producir, por ejemplo, mediante escision proteolftica del factor de coagulacion o mediante la union a un cofactor.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La region del engarce en una realizacion preferida comprende una secuencia del polipeptido terapeutico que se va a administrar o una variante de la misma, que debena dar como resultado una disminucion del riesgo de propiedades neoantigenicas (formacion de un nuevo epttopo potencialmente inmunogeno debido a la presencia de un peptido dentro del antigeno terapeutico que no existe en las protemas humanas) de la protema de fusion expresada. Tambien en el caso de que la protema terapeutica sea un zimogeno (por ejemplo, que requiere ser activado proteoltticamente), la cinetica de la escision del peptido de engarce reflejara mas estrechamente la cinetica de activacion del zimogeno relacionada con la coagulacion. Por tanto, en dichas realizaciones preferidas, FIX y un engarce correspondiente se activan y se escinden respectivamente, con cineticas comparables. Por esta razon, la presente invencion tambien se refiere en particular a protemas de fusion de FIX y un HLEP, donde la cinetica de la escision del engarce por proteasas relevantes no se retrasa en mas del triple, y mucho mas preferentemente no mas del doble, en comparacion con la cinetica de activacion del zimogeno.
En una realizacion adicional, el peptido de engarce comprende sitios de escision para mas de una proteasa. Esto se puede conseguir ya sea mediante un peptido de engarce que puede escindirse en la misma posicion por diferentes proteasas o mediante un peptido de engarce que proporcione dos o mas sitios de escision diferentes. Estas pueden ser circunstancias ventajosas donde la protema de fusion terapeutica se debe activar mediante escision proteolftica para conseguir una actividad enzimatica y donde diferentes proteasas pueden contribuir a esta etapa de activacion. Este es el caso, por ejemplo, tras la activacion de FIX, que, o bien se puede conseguir a traves de FXIa o de FVIIa/Factor Tisular (TF).
Son realizaciones preferidas de la invencion las protemas de fusion terapeuticas en las que el engarce es escindible por la proteasa, que activa el factor de coagulacion, garantizando de este modo que la escision del engarce este ligada a la activacion del factor de coagulacion en un sitio en el que se produce la coagulacion.
Otras protemas de fusion terapeuticas preferidas de acuerdo con la invencion son aquellas en las que el engarce es escindible por el factor de coagulacion que forma parte de la protema de fusion terapeutica una vez que se activa, asegurando de este modo tambien que la escision de la protema de fusion esta conectada a un acontecimiento de coagulacion.
Otras protemas de fusion terapeuticas preferidas de acuerdo con la invencion son aquellas en las que el engarce es escindible por una proteasa, que a su vez se activa directa o indirectamente por la actividad del factor de coagulacion que forma parte de la protema de fusion terapeutica, asegurando de este modo tambien que la escision de la protema de fusion esta conectada a un acontecimiento de coagulacion.
Una clase de las protemas de fusion terapeuticas mas preferidas es aquella en la que el engarce es escindible por FXIa y/o con FVIIa/TF y el factor de coagulacion es FIX.
El punto esencial de la invencion se demuestra, en particular, por el polipeptido dependiente de la vitamina K, Factor IX, los engarces escindibles y albumina como HLEP, asf como su secuencia de ADNc correspondiente. La invencion tambien se refiere a secuencias de ADNc que codifican FIX que se puede activar proteoltticamente o que esta implicado en la activacion de otros zimogenos o polipeptidos. Estos ADNc se fusionan geneticamente a secuencias de ADNc que codifican la albumina serica humana u otros HLEP, y se unen a oligonucleotidos que codifican engarces peptfdicos escindibles intermedios. Las protemas de fusion terapeuticas expresadas presentan actividades espedficas molares que aumentan en comparacion con sus homologas no escindibles. La invencion tambien se refiere a vectores de expresion recombinantes que contienen dichas secuencias de ADNc fusionadas, celulas hospedadoras transformadas con dichos vectores de expresion recombinantes, protemas de fusion terapeuticas recombinantes y derivados que tienen actividades biologicas casi comparables a las de los polipeptidos terapeuticos no modificados de tipo silvestre, pero que tienen una semivida mejorada in vivo. La invencion tambien se refiere a procedimientos para la fabricacion de dichos polipeptidos recombinantes y de sus derivados. La invencion tambien incluye un vector de transferencia para su uso en terapia genica humana, que comprende dichas secuencias de ADN modificadas, utiles para aumentar los niveles de productos in vivo.
Descripcion detallada de la invencion
FIX humano
El FIX humano, uno de los miembros del grupo de polipeptidos dependientes de vitamina K, es una glicoprotema de cadena sencilla con un peso molecular de 57 kDa, que es secretada por las celulas hepaticas al torrente sangumeo como un zimogeno inactivo de 415 aminoacidos. Contiene 12 restos de acido Y-carboxi-glutamico localizados en el dominio Gla N-terminal del polipeptido. Los restos Gla requieren vitamina K para su biosmtesis. Despues del dominio Gla hay dos dominios del factor de crecimiento epidermico, un peptido de activacion y un dominio de proteasa de serina de tipo tripsina. Modificaciones adicionales postraduccionales de FIX abarcan la hidroxilacion (Asp 64), N- (Asn157 y Asn167) asf como la glicosilacion de tipo O (Ser53, Ser61, Thr159, Thr169 y Thr172), sulfatacion (Tyr155) y fosforilacion (Ser158).
El FIX se convierte en su forma activa, Factor IXa, mediante proteolisis del peptido de activacion en Arg145-Ala146 y Arg180-Val181 lo que conduce a la formacion de dos cadenas de polipeptidos, una cadena ligera N-terminal (18 kDa) y una cadena pesada C-terminal (28 kDa), que se mantienen unidas por un puente disulfuro. La escision
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
activadora del Factor IX se puede conseguir in vitro, por ejemplo, por el Factor XIa o el Factor VIIa/TF. El Factor IX esta presente en el plasma humano en una concentracion de 5-l0 |jg/ml. Se descubrio que la semivida plasmatica terminal del Factor IX en seres humanos era de aproximadamente 15 a 18 horas (White GC y col. 1997. Recombinant factor IX. Thromb. Haemost. 78: 261-265; Ewenstein BM y col. 2002. Pharmacokinetic analysis of plasma-derived and recombinant FIX concentrates in previously treated patients with moderate or severe hemophilia B. Transfusion 42:190-197).
La hemofilia B esta causada por un Factor IX no funcional o ausente y se trata con concentrados de Factor IX procedentes del plasma o una forma recombinante del Factor IX. Como los pacientes con hemofilia B reciben con frecuencia al menos dos administraciones semanales profilacticas de Factor IX para evitar hemorragias espontaneas, es deseable aumentar los intervalos entre las administraciones, aumentando la semivida del producto de Factor IX aplicado. Una mejora en la semivida plasmatica aportana una ventaja significativa para el paciente. Hasta la fecha, no hay disponible en el mercado ninguna preparacion farmaceutica de un Factor IX con una semivida plasmatica mejorada, ni se ha publicado ningun dato que muestre variantes de FIX con una semivida prolongada in vivo y una actividad espedfica molar casi inalterada en ensayos relacionados con la coagulacion. Por tanto, todavfa existe una gran necesidad medica de desarrollar formas del Factor IX que tengan una semivida funcional mas larga in vivo.
Protemas de fusion terapeuticas
"Protemas de fusion terapeuticas" en el sentido de la presente divulgacion son factores de coagulacion fusionados a un polipeptido potenciador de la semivida que, despues de la administracion a un ser humano o a un animal, pueden producir un efecto profilactico o terapeutico. Estas protemas de fusion terapeuticas se pueden administrar a un ser humano o a un animal por via intravenosa, intramuscular, oral, topica, parenteral o por otras vfas. Las clases espedficas de protemas de fusion terapeuticas incluidas, es decir, en los ejemplos de la presente invencion, son factores de coagulacion tales como, por ejemplo, polipeptidos dependientes de la vitamina K ligados a polipeptidos potenciadores de la semivida tales como, por ejemplo, albumina e inmunoglobulinas sin dominio de union a antfgenos. La expresion "protema de fusion terapeutica" se usa de forma intercambiable con "protema de fusion".
Polipeptido potenciador de la semivida (HLEP)
La albumina, los miembros de la familia de la albumina y las inmunoglobulinas y sus fragmentos o derivados se han descrito anteriormente como ejemplos de polipeptidos potenciadores de la semivida (HLEP). Las expresiones "albumina serica humana" (HSA) y "albumina humana" (HA) se utilizan indistintamente en esta solicitud. El termino "albumina" y la expresion "albumina serica" son mas amplios, y abarcan la albumina serica humana (y fragmentos y variantes de la misma), asf como la albumina de otras especies (y fragmentos y variantes de la misma).
Como se utiliza en el presente documento, "albumina" se refiere colectivamente a un polipeptido de albumina o a una secuencia de aminoacidos, o a un fragmento de albumina o una variante que tiene una o mas actividades funcionales (por ejemplo, actividades biologicas) de la albumina. En particular, "albumina" se refiere a la albumina humana o a fragmentos de la misma, especialmente la forma madura de la albumina humana como se muestra en la SEQ ID NO: 1 en el presente documento, o la albumina de otros vertebrados o fragmentos de la misma, o analogos o variantes de estas moleculas o fragmentos de las mismas.
La porcion de albumina de las protemas de fusion de albumina puede comprender la longitud completa de la secuencia de HA como se ha descrito anteriormente, o puede incluir uno o mas fragmentos de la misma que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapeutica. Dichos fragmentos pueden ser de 10 o mas aminoacidos de longitud o pueden incluir aproximadamente 15, 20, 25, 30, 50 o mas aminoacidos contiguos de la secuencia de HA o pueden incluir parte o la totalidad de los dominios espedficos de HA.
La porcion de albumina de las protemas de fusion de albumina de la invencion puede ser una variante de HA normal, ya sea natural o artificial. La porcion de polipeptido terapeutico de las protemas de fusion de la invencion tambien puede ser variantes de los polipeptidos terapeuticos correspondiente como se describen en el presente documento. El termino "variantes" incluye inserciones, supresiones y sustituciones, ya sean conservadoras o no conservadoras, ya sean naturales o artificiales, donde dichos cambios no alteran sustancialmente el sitio activo o el dominio activo que confiere las actividades terapeuticas de los polipeptidos terapeuticos.
En particular, las protemas de fusion de albumina de la invencion pueden incluir variantes polimorficas de origen natural de albumina humana y fragmentos de albumina humana. La albumina se puede obtener a partir de cualquier vertebrado, especialmente de cualquier mairnfero, por ejemplo, ser humano, vaca, oveja o cerdo. Las albuminas de animales no mai^eras incluyen, pero sin limitacion, las de gallina y salmon. La porcion de albumina del polipeptido unido a albumina puede ser de un animal diferente que la porcion de polipeptido terapeutico.
En terminos generales, un fragmento o una variante de albumina tendran una longitud de al menos 10, preferentemente al menos 40, mas preferentemente mas de 70 aminoacidos. La variante de albumina puede consistir preferentemente o comprender alternativamente al menos un dominio completo de albumina o fragmentos de dichos dominios, por ejemplo, los dominios 1 (aminoacidos 1-194 de la SEQ ID NO: 1), 2 (aminoacidos 195-387 de la SEQ ID NO: 1), 3 (aminoacidos 388-585 de la SEQ ID NO: 1), 1 + 2 (1-387 de la SEQ ID NO: 1), 2 + 3 (195-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
585 de la SEQ ID NO: 1) o 1 + 3 (aminoacidos 1-194 de la SEQ ID NO: 1 + aminoacidos 388-585 de la SEQ ID NO: 1). Cada dominio se compone a su vez de dos subdominios homologos, a saber 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 y 512-585, con regiones de engarce flexibles entre los subdominios que comprenden los restos Lys106 a Glu119, Glu292 a Val315 y Glu492 a Ala511.
La porcion de albumina de una protema de fusion de albumina de la invencion puede comprender al menos un subdominio o un dominio de HA o modificaciones conservadoras de la misma.
Todos los fragmentos y variantes de la albumina estan incluidos en la invencion como parejas de fusion de un factor de coagulacion, siempre que conduzcan a una extension de la semivida de la protema de fusion terapeutica en el plasma de al menos el 25 %, en comparacion con el factor de coagulacion no fusionado.
Ademas de la albumina, se ha reivindicado que la alfa-fetoprotema, otro miembro de la familia de la albumina, potencia la semivida de un polipeptido terapeutico fijado in vivo (documento WO 2005/024044). La familia de protemas de la albumina, protemas de transporte en suero relacionadas evolutivamente, consiste en albumina, alfa- fetoprotema (AFP; Beattie y Dugaiczyk 1982. Gene 20:415-422), afamina (AFM; Lichenstein y col. 1994. J. Biol. Chem. 269:18149-18154) y protema que se une a la vitamina D (DbP; Cooke & David 1985. J. Clin. Invest. 76:24202424). Sus genes representan una agrupacion multigenica con similitudes estructurales y funcionales que se cartograffan en la misma region cromosomica en los seres humanos, ratones y ratas. La similitud estructural de los miembros de la familia de la albumina sugiere su posible utilidad como HLEP. Por tanto, otro objeto de la invencion es el uso de dichos miembros de la familia de la albumina, fragmentos y variantes de los mismos como HLEP. El termino "variantes" incluye inserciones, supresiones y sustituciones, ya sea conservadoras o no conservadoras, a condicion de que la funcion deseada todavfa este presente.
Los miembros de la familia de la albumina pueden comprender la longitud completa de la protema respectiva AFP, AFM y DBP, o pueden incluir uno o mas fragmentos de la misma que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapeutica. Dichos fragmentos pueden tener una longitud de 10 o mas aminoacidos o pueden incluir aproximadamente 15, 20, 25, 30, 50 o mas aminoacidos contiguos de la secuencia proteica respectiva o pueden incluir parte o la totalidad de los dominios espedficos de la protema respectiva, a condicion de que los fragmentos de HLEP proporcionen una extension de la semivida de al menos un 25 %, en comparacion con el factor de coagulacion no fusionado. Los miembros de la familia de la albumina de las protemas de fusion terapeuticas de la invencion pueden incluir variantes polimorficas de origen natural de AFP, AFM y DBP.
Tambien pueden utilizarse IgG y fragmentos de IgG sin el dominio de union a antfgenos como HLEP, a condicion de que los fragmentos de HLEP proporcionen una extension de la semivida de al menos un 25 %, en comparacion con el factor de coagulacion no fusionado. La porcion de polipeptido terapeutico se conecta a la IgG o a los fragmentos de IgG sin el dominio de union a antfgenos, a traves de un engarce escindible que permite actividades espedficas molares elevadas de la protema de fusion. Se encuentran ejemplos de moleculas de fusion del factor VII/VIIA y factor IX con IgG, por ejemplo, en el documento WO 2005/001025 que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad. El mismo desvela un homodfmero compuesto de dos moleculas de factor VII (factor VIIa) y dos moleculas Fc y un Idbrido monomero/dfmero compuesto de una molecula de FVII (FVIIa) y dos moleculas de Fc, mostrando el monomeroMmero una actividad de coagulacion aproximadamente cuatro veces mayor que el homodfmero. Una secuencia de engarce de la presente que libera las moleculas de FVII (FVIIa) tras la escision por una proteasa de la cascada de la coagulacion como, por ejemplo, FXIa, FXa o FIXa, podna ser capaz de elevar la actividad coaguladora de las construcciones y en especial la del homodfmero, hasta un nivel de actividad comparable al del monomeroMmero o incluso superior. Una protema de fusion FIX-Fc con engarce escindible se muestra a modo de ejemplo en la SEQ ID NO 93. Se pueden aplicar en este caso engarces escindibles tales como los que se muestran en la tabla 3a y 3b.
La invencion se refiere espedficamente a protemas de fusion que comprenden la union de un factor de coagulacion o un fragmento o una variante del mismo al extremo N-terminal o C-terminal de un HLEP o un fragmento o variante del mismo, de manera que un engarce peptfdico escindible intermedio se introduce entre el polipeptido terapeutico y el HLEP, de manera que la protema de fusion formada tenga una semivida in vivo mas larga, en comparacion con el factor de coagulacion que no se ha unido a un HLEP y de manera que la protema de fusion tenga al menos una actividad espedfica molar del 100% superior, en comparacion con la protema de fusion correspondiente con un engarce no escindible en al menos uno de los diferentes ensayos relacionados con la coagulacion disponibles.
"Factor de coagulacion" como se utiliza en la presente solicitud incluye, pero no se limita a, polipeptidos que consisten en el Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor de von Willebrand, Factor V, Factor X, Factor Xi, Factor XII, Factor XIII, Factor I, Factor Il (protrombina), Protema C, Protema S, GAS6 o Protema Z, asf como sus formas activadas. Ademas, los polipeptidos terapeuticos utiles pueden ser polipeptidos de tipo silvestre o pueden contener mutaciones. El grado y la ubicacion de la glicosilacion u otras modificaciones postraduccionales pueden variar dependiendo de las celulas hospedadoras seleccionadas y de la naturaleza del entorno celular del anfitrion. Cuando se hace referencia a secuencias de aminoacidos espedficas, las modificaciones posteriores a la traduccion de dichas secuencias estan incluidas en la presente solicitud.
"Factor de coagulacion" dentro de la definicion anterior, incluye polipeptidos que tengan la secuencia de aminoacidos
5
10
15
20
25
30
natural, incluyendo cualquier polimorfismo natural. Tambien incluye polipeptidos con una secuencia de aminoacidos ligeramente modificada, por ejemplo, un extremo N-terminal o C-terminal modificado que incluye supresiones o adiciones de aminoacidos terminales, a condicion de que esos polipeptidos conserven sustancialmente la actividad del polipeptido terapeutico respectivo. Las variantes incluidas difieren en uno o mas restos de aminoacidos procedentes de la secuencia de tipo silvestre. Los ejemplos de dichas diferencias pueden incluir el truncamiento del extremo N-terminal y/o C-terminal por uno o mas restos de aminoacidos (por ejemplo, preferentemente de 1 a 30 restos de aminoacidos), o la adicion de uno o mas restos adicionales en el extremo N-terminal y/o C-terminal, asf como sustituciones de aminoacidos conservadoras, es decir, sustituciones realizadas dentro de grupos de aminoacidos con caractensticas similares, por ejemplo (1) aminoacidos pequenos, (2) aminoacidos acidos, (3) aminoacidos polares, (4) aminoacidos basicos, (5) aminoacidos hidrofobos y (6) aminoacidos aromaticos. Se muestran ejemplos de dichas sustituciones conservadoras en la siguiente tabla.
Tabla 1
(1)
Alanina Glicina
(2)
Acido aspartico Acido glutamico
(3a)
Asparagina Glutamina
(3b)
Serina Treonina
(4)
Arginina Histidina Lisina
(5)
Isoleucina Leucina Metionina Valina
(6)
Fenilalanina Tirosina Triptofano
La semivida in vivo de las protemas de fusion de la invencion, determinada generalmente como la semivida terminal o semivida p, es por lo general al menos aproximadamente un 25 %, preferentemente al menos aproximadamente un 50 % y mas preferentemente mas del 100 % mayor que la semivida in vivo del polipeptido no fusionado.
Las protemas de fusion de la presente invencion tienen al menos una actividad espedfica molar aumentada en un 100 %, en comparacion con las protemas de fusion correspondientes sin engarces escindibles.
La actividad espedfica molar (o la actividad espedfica molar relacionada con la coagulacion, como se considera en el presente documento en particular) en este sentido se define como la actividad expresada por mol (o, por ejemplo, nmol) del polipeptido terapeutico o de la protema de fusion terapeutica de interes. El calculo de la actividad espedfica molar permite una comparacion directa de la actividad de las diferentes construcciones que no se ve afectada por los diferentes pesos moleculares o densidades opticas de los polipeptidos estudiados. La actividad espedfica molar se puede calcular como se ejemplifica en la tabla 2 a continuacion para FIX y una protema de fusion FIX-HSA.
Tabla 2: Calculo de la actividad espedfica molar como se muestra para una protema de fusion FIX-HSA purificada
Producto
DO(280 nm, %) PM Actividad/Vol/DO280 (UI/l/DO280) Densidad optica molar (DO(280) a 1 mol/l) Calculo de la actividad espedfica molar (UI/mol)
FIX
13,3 57000 determinada para el producto 75810 (= PM x DO(280. 1 %)/10) = (Actividad/Vol/DO280) x (DO280 a 1 mol/l)
HSA
5,7 2) 66300 37791 (= PM x DO(280, 1 %)/10)
FIX-HSA
determinada para el producto 113601 (= suma de la densidad optica molar de FIX y HSA) = (Actividad/Vol/DO280) x (DO280 a 1 mol/l)
R.G. Di Scipio y col., Biochem. 16: 698-706 (1977) 2) C. Chaudhury y col., J. Exp. Med. 197(3): 315-322 (2003)
Con el fin de determinar una actividad espedfica molar relacionada con la coagulacion, se puede utilizar cualquier ensayo que determine las actividades enzimaticas o de cofactores que son relevantes para el proceso de coagulacion.
Por tanto los "ensayo relacionado con la coagulacion" en el sentido de la invencion, es cualquier ensayo que determine la actividad enzimatica o de cofactores que son de relevancia en el proceso de coagulacion o que sea capaz de determinar que se ha activado ya sea la cascada de coagulacion intrmseca o la extrmseca. El ensayo "relacionado con la coagulacion" por tanto puede ser un ensayo de coagulacion directo como TTPa, TP o un ensayo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
de generacion de trombina. Sin embargo, otros ensayos tales como, por ejemplo, ensayos cromogenicos aplicados para factores de coagulacion espedficos, tambien se incluyen. Son ejemplos de dichos ensayos o reactivos correspondientes Pathromtin® SL (ensayo de TTPa, Dade Behring) o Thromborel® S (ensayo de tiempo de protrombina, Dade Behring) con plasma correspondiente que carece de factor de coagulacion (Dade Behring), kits de ensayos de generacion de trombina (Technoclone, Thrombinoscope) que utilizan, por ejemplo, plasma que carece de factor de coagulacion, ensayos cromogenicos como Biophen Factor IX (Hyphen BioMed), Staclot® FVIIa- rTF (Roche Diagnostics GmbH), Coatest® Factor VIII:C/4 (Chromogenix) u otros.
Para los fines de la presente invencion, se considera que un aumento en uno cualquiera de los ensayos anteriores o un ensayo equivalente relacionado con la coagulacion muestra un aumento en la actividad espedfica molar. Por ejemplo, un aumento del 25 % se refiere a un aumento del 25 % en cualquiera de los ensayos anteriores o en un ensayo equivalente.
Para determinar si las protemas de fusion terapeuticas pertenecen al ambito de la presente invencion, la referencia con la que se compara la actividad espedfica molar de estas protemas es una construccion en la que el factor de coagulacion respectivo y el HLEP respectivo estan unidos a traves de un engarce no escindible que tiene la secuencia de aminoacidos GGGGGGV.
En el caso de FIX, se utilizan frecuentemente ensayos de TTPa para la determinacion de la actividad de coagulacion. Un ensayo de coagulacion (ensayo de TTPa) de este tipo se describe en el ejemplo 5 con mas detalle. Sin embargo, se pueden aplicar otros ensayos relacionados con la coagulacion o principios de ensayo para determinar la actividad espedfica molar de FIX.
Los farmacos de polipeptidos recombinantes terapeuticos por lo general son caros y no todos los pafses pueden permitirse tratamientos costosos basados en dichos farmacos. El aumento de la recuperacion in vivo de dichos farmacos podna hacer que el uso de estos productos fuera mas economico y, posteriormente, mas pacientes se pudieran beneficiar de los mismos. En el caso de las protemas de fusion de la presente invencion, un aumento de la recuperacion in vivo tambien sena una ventaja deseable. "Recuperacion in vivo" en el sentido de la invencion, significa la cantidad de producto que se encuentra en la sangre o en el plasma poco despues de la administracion del producto. Por tanto, para detectar la recuperacion in vivo, en general, el contenido en plasma se determina pocos minutos (por ejemplo, 5 o 15 min) despues de la administracion del producto.
De acuerdo con la presente invencion, el resto polipeptfdico terapeutico esta acoplado al resto de HLEP a traves de un engarce peptfdico escindible de modo que el engarce intermedio escindible se introduce entre el factor de coagulacion y el polipeptido potenciador de la semivida. El engarce debe ser no inmunogeno y debe ser lo suficientemente flexible como para permitir la escision por proteasas. La escision del engarce debe transcurrir comparativamente tan rapido como la activacion del polipeptido terapeutico dentro de la protema de fusion, si la protema de fusion es un zimogeno.
El engarce escindible comprende preferentemente una secuencia derivada de
a) el propio polipeptido terapeutico que se va a administrar si contiene sitios de escision proteolftica que se escinden proteoltticamente durante la activacion del polipeptido terapeutico,
b) un polipeptido sustrato de este polipeptido terapeutico, o
c) un polipeptido sustrato escindido por una proteasa que se activa o se forma por la implicacion directa o indirecta del polipeptido terapeutico.
La region de engarce en una realizacion mas preferida comprende una secuencia del polipeptido terapeutico que se va a aplicar, lo que debena dar como resultado una disminucion del riesgo de propiedades neoantigenicas de la protema de fusion expresada. Tambien en el caso de que la protema terapeutica sea un zimogeno (por ejemplo, necesita ser activada proteolfticamente), la cinetica de la escision del peptido de engarce reflejara mas estrechamente la cinetica de activacion relacionada con la coagulacion del zimogeno.
En una realizacion preferida, el polipeptido terapeutico es el zimogeno FIX y el HLEP es albumina. En este caso, la secuencia del engarce deriva ya sea de las secuencias de las regiones de activacion de FIX, de la region de escision de cualquier sustrato de FIX, como FX o FVII, o de la region de escision de cualquier polipeptido sustrato que se escinde por una proteasa en cuya activacion esta implicado FIXa.
En una realizacion muy preferida el peptido de engarce deriva del propio FIX. En otra realizacion preferida, el peptido de engarce deriva de FX o de FVII. En otra realizacion preferida, la secuencia de engarce comprende dos secuencias de escision que pueden ser escindidas por FXIa o FVIIa/TF, dos activadores fisiologicamente relevantes de FIX.
Las combinaciones de ejemplo de polipeptido terapeutico, engarce escindible y HLEP incluyen las construcciones que se enumeran en las tablas 3a y 3b, pero no se limitan a estas:
Tabla 3a: Ejemplos de posibles construcciones
Factor de coagulacion
Engarce HLEP Engarce derivado de (con modificaciones si es aplicable) SEQ ID NO:
Engarce no escindible o escindible no lo suficientemente rapido
FIX
- HSA
FIX
R I HSA
FIX
GGGGGGV(Sheffield y col.) HSA 94
FIX
(GGS)nGS HSA
FIX
SS(GGS)yGS HSA 30
FIX
SSNGS(GGS)3NGS(GGS)3GGNGS HSA 31
Engarce con un sitio de escision
FIX (1-412)
SVSQTSKLTR AETVFPDVD HSA FIX 36
FIX (1-412)
SVSQTSKLTR AETVFPDVD GS HSA FIX 37
FIX
SVSQTSKLTR AETVFPDVD HSA FIX 38
FIX
SVSQTSKLTR AETVFPDVD GS GGS HSA FIX 95
FIX
SVSQTSKLTR AETVFPDVD GS HSA FIX 39
FIX
SVSQTSKLTR AETVFPDVD NGS HSA FIX 40
FIX
SVSQTSKLTR AETVFPDV HSA FIX 96
FIX
QTSKLTR AETVFPDV HSA FIX 97
FIX
SKLTR AETVFPDV HSA FIX 98
FIX
SVSQTSKLTR AETVFP HSA FIX 99
FIX
SVSQTSKLTR AETVF HSA FIX 100
FIX
QTSKLTR AETVF HSA FIX 101
FIX
SKLTR AETVF HSA FIX 102
FIX
SVSQTSKLTR AET HSA FIX 103
FIX
QTSKLTR AET HSA FIX 104
FIX
SKLTR AET HSA FIX 105
FIX
SVSQTSKLTR GETVFPDVD HSA FIX 41
FIX
SVSQTSKLTR TETVFPDVD HSA FIX 42
FIX
SVSQTSKLTR SETVFPDVD HSA FIX 43
FIX
SVSQTSKLTR LETVFPDVD HSA FIX 44
FIX
SVSQTSKLTR TEAVFPDVD HSA FIX 45
FIX
SVSQTSKLTR GEAVFPDVD HSA FIX 46
FIX
QTSKLTR AETVFPDVD GS HSA FIX 106
FIX
SKLTR AETVFPDVD GS HSA FIX 107
FIX
SKLTR AETVPDVD HSA FIX 47
FIX
QSFNDFTR VVGGED HSA FIX 48
FIX
QSFNDFTR VVGGED GS HSA FIX 49
FIX
QSFNDFTR VVGGE HSA FIX 108
FIX
QSFNDFTR TVGGED HSA FIX 50
FIX
QSFNDFTR LVGGED HSA FIX 51
FIX
QSFNDFTR GVGGED HSA FIX 52
FIX
QSFNDFTR VVGGED NGS HSA FIX 53
FIX
QSFNDFTR VVGGEDN HSA FIX 54
(continuacion)
Factor de coagulacion
Engarce HLEP Engarce derivado de (con modificaciones si es aplicable) SEQ ID NO:
Engarce con un sitio de escision
FIX
PERGDNNLTR IVGGQE GS HSA FX 109
FIX
PERGDNNLTR IVGGQE HSA FX 61
FIX
PERGDNNLTR IVGGQ HSA FX 110
FIX
DNNLTR IVGGQ HSA FIX 111
FIX
SVSQTSKLTR AETVFPDVD Fc FIX 62
FIX
QSFNDFTR VVGGED N Fc FIX 63
FIX (1-412)
SVSQTSKLTR AETVFPDVD Fc FIX 64
FIX
ASKPQGR IVGG HSAdeIDAH FVII 112
FIX
KRNASKPQGR IVGGKV HSA FVII 65
FIX
PEEPQLR MKNNEEAED HSA FVIII 66
FIX
DNSPSFIQIR SVAKKHPKT HSA FVIII 67
FIX
LSKNNAEPR SFSQNSRHPS HSA FVIII 68
FIX
DEDENQSPR SFQKKTRHYFIA HSA FVIII 69
FIX
SPHVLRNR AQSGSVPQ HSA FVIII 70
FVII o FVIIa
PEEPQLR MKNNEEAEDYDDDLTDS HSA FVII 71
FVII o FVIIa
DDDNSPSFIQIR SVAKKHPKTWVHYAAEEED HSA FVII 72
FVII o FVIIa
LSKNNAIEPR SFSQNSRHPSTRQKQFNA HSA FVIII 73
FVII o FVIIa
DEDENQSPR SFQKKTRHYFIAA HSA FVIII 74
FVII o FVIIa
DYGMSSSPHVLRNR AQSGSVPQFKKVVFQEFT HSA FVIII 75
FVIII
Derivado de los sitios de escision de FVIII, FIX o Fibrinogeno HSA FVIII, FIX o Fgn
FVW
Derivado de los sitios de escision de FVW, FVIII o FIX HSA FIX, FVIII, FVW
FVW
DIYDEDENQSPR SFOKKTRHYFIA HSA FVIII 76
FVW
DNSPSFIQIR SVAKKHP HSA FVIII 77
FVW
LSKNNAIEPR SFSQNSRHPS HSA FVIII 78
En el caso de engarces derivados de la region N-terminal del peptido de activacion de FIX, de acuerdo con el polimorfismo natural T148-A148, las secuencias pueden contener tambien A en lugar de T en esta posicion.
5

Claims (17)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Protema de fusion terapeutica que comprende
    a) un factor de coagulacion, en el que el factor de coagulacion es FIX,
    b) un polipeptido potenciador de la semivida seleccionado entre el grupo que consiste en albumina incluyendo variantes y derivados de la misma, polipeptidos de la familia de la albumina incluyendo variantes y derivados de los mismos e inmunoglobulinas sin domino de union a antigenos, y
    c) un engarce peptidico que une el factor de coagulacion al extremo N-terminal o C-terminal del polipeptido potenciador de la semivida, de manera que el engarce peptfdico escindible intermedio se introduce entre el factor de coagulacion y el polipeptido potenciador de la semivida;
    en la que el engarce peptfdico es escindible por proteasas implicadas en la coagulacion o activadas por enzimas de la coagulacion y en la que la protema de fusion terapeutica tiene, en comparacion con la protema de fusion terapeutica respectiva unida por un engarce no escindible que tiene la secuencia de aminoacidos GGGGGGV, una actividad espedfica molar aumentada en al menos un ensayo relacionado con la coagulacion y en la que la actividad espedfica molar esta aumentada en al menos el 100 %.
  2. 2. Protema de fusion terapeutica de acuerdo con la reivindicacion 1 en la que el polipeptido potenciador de la semivida es una inmunoglobulina sin un dominio de union a antigenos.
  3. 3. Protema de fusion terapeutica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2 en la que el engarce es escindible por FXIa y/o FVIIa/TF.
  4. 4. Protema de fusion terapeutica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en la que el engarce es escindible por la proteasa o proteasas, que activa o activan el factor de coagulacion.
  5. 5. Protema de fusion terapeutica de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que la cinetica de la escision del engarce por la proteasa o proteasas no se retrasa en mas de un factor de 3 en comparacion con la cinetica de la activacion de dicho factor de coagulacion.
  6. 6. Protema de fusion terapeutica de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que el engarce es escindible por la proteasa o proteasas que se activa/activan tras la implicacion del factor de coagulacion.
  7. 7. Protema de fusion terapeutica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en la que el engarce es escindible por FXIa y/o FVIIa/TF y el factor de coagulacion es FIX.
  8. 8. Protema o protemas de fusion terapeuticas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en las que el engarce comprende una secuencia seleccionada entre el grupo de las tablas 3a y 3b en las que los engarces RI, GGGGGGV, (GGS)nGS, SS(GGS)7GS y SSNGS(GGS)aNGS(GGS)aGGNGS estan excluidos.
  9. 9. Protema o protemas de fusion terapeuticas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso como medicamento.
  10. 10. Un polinucleotido que codifica una protema de fusion terapeutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  11. 11. Un plasmido o un vector que comprende un acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 10.
  12. 12. Una celula hospedadora que comprende un polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 10 o un plasmido o un vector de acuerdo con la reivindicacion 11.
  13. 13. Un procedimiento de produccion de una protema de fusion terapeutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende cultivar celulas hospedadoras de acuerdo con la reivindicacion 12 en condiciones de manera que se exprese la protema de fusion terapeutica.
  14. 14. Una composicion farmaceutica que comprende una protema de fusion terapeutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 10, o un plasmido o un vector de acuerdo con la reivindicacion 11.
  15. 15. El uso de una protema de fusion terapeutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, de un polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 10, de un plasmido o un vector de acuerdo con la reivindicacion 11, o de una celula hospedadora de acuerdo con la reivindicacion 12, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de un trastorno de la coagulacion sangumea.
  16. 16. El uso de acuerdo con la reivindicacion 15, en el que el trastorno de la coagulacion sangumea es la hemofilia B.
  17. 17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 y 16, en el que el tratamiento comprende terapia genica humana.
    imagen1
    % de dosis inicial
    imagen2
    Tiempo (min)
    Fig. 2
    imagen3
ES07726010.7T 2006-06-14 2007-06-14 Proteína de fusión escindible proteolíticamente que comprende un factor de coagulación sanguínea Active ES2468558T5 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06012262A EP1867660A1 (en) 2006-06-14 2006-06-14 Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
EP06012262 2006-06-14
US81962006P 2006-07-11 2006-07-11
US819620P 2006-07-11
PCT/EP2007/005246 WO2007144173A1 (en) 2006-06-14 2007-06-14 Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2468558T3 ES2468558T3 (es) 2014-06-16
ES2468558T5 true ES2468558T5 (es) 2017-07-18

Family

ID=37450975

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10168453T Active ES2729426T3 (es) 2006-06-14 2007-06-14 Proteínas de fusión escindibles proteolíticamente que comprenden un Factor de la coagulación de la sangre
ES07726010.7T Active ES2468558T5 (es) 2006-06-14 2007-06-14 Proteína de fusión escindible proteolíticamente que comprende un factor de coagulación sanguínea

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10168453T Active ES2729426T3 (es) 2006-06-14 2007-06-14 Proteínas de fusión escindibles proteolíticamente que comprenden un Factor de la coagulación de la sangre

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20090042787A1 (es)
EP (3) EP1867660A1 (es)
DK (2) DK2032607T4 (es)
ES (2) ES2729426T3 (es)
PL (1) PL3564267T3 (es)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
DE602007007923D1 (de) * 2006-04-11 2010-09-02 Csl Behring Gmbh Verfahren zur erhöhung der in-vivo-gewinnung therapeutischer polypeptide
US7939632B2 (en) * 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
CA2673459C (en) * 2006-12-22 2016-09-13 Stefan Schulte Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
US20100268055A1 (en) * 2007-07-19 2010-10-21 Arizona Board of Regents, a body corporate acting for and on behalf of Arizona State University Self-Anchoring MEMS Intrafascicular Neural Electrode
PL2291523T3 (pl) * 2008-06-24 2015-05-29 Csl Behring Gmbh Czynnik VIII, czynnik von Willebranda lub ich kompleksy o wydłużonym okresie półtrwania in vivo
US20120121613A1 (en) * 2009-01-19 2012-05-17 Bayer Healthcare Llc Protein conjugate having an endopeptidase- cleavable bioprotective moiety
ES2610356T3 (es) 2009-02-03 2017-04-27 Amunix Operating Inc. Polipéptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos
US8680050B2 (en) * 2009-02-03 2014-03-25 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same
US8703717B2 (en) * 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
US9849188B2 (en) 2009-06-08 2017-12-26 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
WO2010144508A1 (en) * 2009-06-08 2010-12-16 Amunix Operating Inc. Glucose-regulating polypeptides and methods of making and using same
CA2771999A1 (en) 2009-08-24 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same
JP2013517782A (ja) * 2010-01-28 2013-05-20 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー 因子ｖｉｉ融合ポリペプチド
EP2371857A1 (en) * 2010-04-01 2011-10-05 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for treating interstitial lung disease
KR101853405B1 (ko) 2010-10-20 2018-05-02 주식회사 티움바이오 인자 ｉｘ 활성을 갖는 융합 단백질
CN104271150A (zh) * 2012-01-12 2015-01-07 比奥根艾迪克Ma公司 嵌合因子viii多肽及其用途
EP2822577B1 (en) 2012-02-15 2019-02-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
JP6256882B2 (ja) 2012-02-15 2018-01-10 アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド 第ｖｉｉｉ因子組成物、ならびに組成物の作製方法および用途
ES2761730T3 (es) 2013-01-31 2020-05-20 Pfizer Composiciones y procedimientos para contrarrestar la inhibición del factor Xa
EP2796145B1 (en) 2013-04-22 2017-11-01 CSL Ltd. A covalent complex of von willebrand factor and faktor viii linked by a disulphide bridge
TW202003554A (zh) 2013-08-14 2020-01-16 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
EP3063170A4 (en) * 2013-11-01 2017-06-28 The Children's Hospital of Philadelphia Compositions and methods for increasing the half-life of factor xa
EP3068891A1 (en) * 2013-11-13 2016-09-21 Aequus Biopharma Inc. Engineered glycoproteins and uses thereof
AU2015204646B2 (en) 2014-01-10 2020-08-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII chimeric proteins and uses thereof
US10676731B2 (en) 2014-08-19 2020-06-09 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for modulating factor IX function
EA201890423A1 (ru) 2015-08-03 2018-07-31 Биовератив Терапьютикс Инк. Слитые белки фактора ix, способы их получения и применения
KR102440820B1 (ko) * 2015-09-08 2022-09-05 테리피온, 인크. ApoA-1 융합 폴리펩티드 및 관련 조성물 및 방법
MX2019006444A (es) 2016-12-02 2019-10-30 Bioverativ Therapeutics Inc Métodos de tratamiento de artropatía hemofílica utilizando factores de coagulación quiméricos.
AU2019271148B9 (en) 2018-05-14 2025-05-29 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
WO2019222296A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin 12 polypeptides and methods of use thereof
PL3793588T3 (pl) 2018-05-18 2025-09-01 Bioverativ Therapeutics Inc. Sposoby leczenia hemofilii a
EP3969035A4 (en) 2019-05-14 2023-06-21 Werewolf Therapeutics, Inc. SEPARATION UNITS AND METHODS AND THEIR USE
MX2022005666A (es) 2019-11-14 2022-10-07 Werewolf Therapeutics Inc Polipeptidos de citocina activables y metodos de uso de los mismos.
CA3182800A1 (en) 2020-06-14 2021-12-23 Vertex Pharmaceuticals Inc. Complement factor i-related compositions and methods

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR860984B (en) * 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
GB8927722D0 (en) 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
DE69519929T2 (de) * 1994-07-11 2001-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Verfahren und zusammensetzungen für die spezifische koagulation von tumorgefässen
EP2213743A1 (en) 2000-04-12 2010-08-04 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2001275897A1 (en) 2000-07-12 2002-01-21 Immunex Corporation Improvement of cell culture performance
ES2322945T5 (es) 2001-12-21 2012-10-17 Immunex Corporation Métodos para purficación de proteína
CN101044154A (zh) 2002-02-14 2007-09-26 威廉·J·鲁特 治疗宿主中切割的嵌合分子
US8809504B2 (en) * 2002-09-03 2014-08-19 Vit Lauermann Inhibitor which is deactivatable by a reagent produced by a target cell
EP1444986A1 (en) * 2003-02-07 2004-08-11 Aventis Behring GmbH Pharmaceutical preparation for the improved treatment of blood-clotting disorders
US20050176108A1 (en) 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
PL2298347T3 (pl) * 2003-05-06 2016-03-31 Bioverativ Therapeutics Inc Białka chimeryczne czynnika krzepnięcia do leczenia zaburzenia hemostazy
TWI353991B (en) * 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
CA2537273A1 (en) 2003-09-05 2005-03-17 Gtc Biotherapeutics, Inc. Method for the production of fusion proteins in transgenic mammal milk
EP1816201A1 (en) * 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life

Also Published As

Publication number Publication date
ES2468558T3 (es) 2014-06-16
US20090042787A1 (en) 2009-02-12
EP2256135A1 (en) 2010-12-01
PL3564267T3 (pl) 2021-10-11
DK3564267T3 (da) 2021-05-31
EP3564267B1 (en) 2021-03-17
ES2729426T3 (es) 2019-11-04
DK2032607T3 (da) 2014-04-14
EP3564267A1 (en) 2019-11-06
DK2032607T4 (en) 2017-05-15
EP1867660A1 (en) 2007-12-19
EP2256135B1 (en) 2019-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2468558T5 (es) Proteína de fusión escindible proteolíticamente que comprende un factor de coagulación sanguínea
ES2910207T3 (es) Proteínas de fusión escindibles proteolíticamente que comprenden un factor de coagulación de la sangre
CN101379189B (zh) 具有延长的半衰期的经修饰的凝血因子VIIa
US7939632B2 (en) Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
CN102470182A (zh) 用于在出血性紊乱的治疗和预防性处理中进行非静脉内施用的白蛋白融合凝血因子
ES2349024T3 (es) Metodo para aumentar la recuperacion in vivo de polipeptidos terapeuticos.
AU2012258466A1 (en) Modified coagulation Factor VIIa with extended half-life
HK1129421B (en) Modified coagulation factor vila with extended half-life