ES2531882T3

ES2531882T3 - EPSPS mutantes

Info

Publication number: ES2531882T3
Application number: ES12152493.8T
Authority: ES
Inventors: Greg F.W. Gocal
Original assignee: Cibus Europe BV
Current assignee: Cibus Europe BV
Priority date: 2006-01-12
Filing date: 2007-01-10
Publication date: 2015-03-20
Anticipated expiration: 2027-01-10
Also published as: WO2007084294A2; US10612035B2; NZ613267A; SI2465340T1; WO2007084294A3; CA2636771C; EP2923563B1; DK2465341T3; RU2441366C2; EP2923563A2; US8268622B2; EP2465340B1; AU2007207813B2; JP2009523418A; CA3077776C; NZ597682A; PT2465340E; ES2532112T3; US20130019349A1; EP1978799A2

Abstract

Un procedimiento de producción de una planta no transgénica, resistente o tolerante a herbicida que comprende: introducir en células vegetales una oligonucleobase recombinagénica con una mutación dirigida en el gen EPSPS para producir células vegetales con un gen de EPSPS mutante que expresa una proteína EPSPS que está mutada en las posiciones de aminoácidos Thr179 y Pro183 en una proteína EPSPS de Arabidopsis (AF360224) o en un resto de aminoácido análogo en una proteína EPSPS de otra especie en la que Thr179 se cambia a Ile y Pro183 se cambia a Thr; seleccionar una célula vegetal que muestra una tolerancia mejorada al glifosato en comparación con una célula vegetal de tipo silvestre correspondiente; y regenerar una planta no transgénica resistente o tolerante a herbicida que tiene un gen de EPSPS mutado de dicha célula vegetal seleccionada.

Description

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el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también efectúa un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos puede suceder por azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo al ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01, y lo más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.

En la puesta en práctica de la presente invención se produce una planta no transgénica o una célula vegetal que tiene mutaciones en el gen de EPSPS. La planta resultante tiene resistencia aumentada o tolerancia a un miembro de la familia de fosfonometilglicina, tal como glifosato, y muestra un crecimiento o desarrollo de la planta, sus órganos, tejidos o células sustancialmente normal, sus órganos, en comparación con la planta o célula de tipo silvestre correspondiente. El gen mutado produce un producto génico que tiene sustituciones en las posiciones de aminoácidos 179 y 183 del producto AF 360244 del gen de EPSPS de Arabidopsis o en una posición de aminoácidos análoga en un homólogo de EPSPS en el que Thr179 se cambia a Ile y Pro183 se cambia a Thr. Preferentemente, la planta mutada es resistente al glifosato y tiene sustancialmente la misma actividad catalítica en comparación con la proteína EPSPS de tipo silvestre.

Para identificar genes de EPSPS mutantes que puedan producir un producto génico que proporcione resistencia al glifosato, puede efectuarse una exploración in vitro en un sistema bacteriano para ahorrar tiempo y recursos. Pueden generarse curvas de crecimiento de colonias de bacterias que expresan genes de EPSPS mutantes candidatos para evaluar si los genes de EPSPS mutantes proporcionan un fenotipo resistente al glifosato. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 6.870.075 desvela un ensayo de resistencia a glifosato en Salmonella que emplea genes de EPSPS mutantes de Arabidopsis transformados en una cepa LacZ-Salmonella typhi. El gen de EPSPS de E. coli, también llamado el gen AroA, puede usarse para evaluar la resistencia a glifosato de mutantes de EPSPS. Los ensayos de curva de crecimiento que miden los valores de Ki y Km para los mutantes candidatos se llevan a cabo de acuerdo con técnicas de ensayo bien conocidas. Una vez se ha identificado un mutante resistente a glifosato en el gen de EPSPS de E. coli, se muta un aminoácido análogo en un gen de EPSPS de planta con nucleobases recombinagénicas tal como se describe en el presente documento para producir una planta resistente al glifosato.

Las sustituciones de aminoácidos en el producto del gen de EPSPS (AroA) de E. coli de acuerdo con la presente invención incluyen las siguientes:

Thr97Ile y Pro101Thr en las que el aminoácido a la izquierda del número en subíndice es el aminoácido nativo y el aminoácido a la derecha del número en subíndice es el aminoácido mutante.

Las posiciones correspondientes de aminoácidos en especies de plantas se cambian de acuerdo con la presente invención para producir una planta resistente a herbicida no transgénica. A continuación se expone una lista de algunos cultivos preferidos que lista las posiciones de aminoácidos en el gen de EPSPS que se cambian. Las sustituciones de aminoácidos según la presente invención se listan a la derecha del número de posición del aminoácido.

Para el maíz:

Thr102Ile y

Pro106Thr

Para el algodón:

Thr97Ile y

Pro101Thr

Para el arroz:

Thr169Ile y

Pro173Thr

Para Brassica napus (2-28 de la traducción de ADNg X51475):

Thr174Ile y

Pro178Thr

Para Arabidopsis thaliana (AF360224):

Thr179Ile y

Pro183Thr

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Para Petunia hybrida:

Thr174Ile y

Pro178Thr

Como se apreciará, E. coli no es una planta. Sin embargo, se contempla en la presente invención ya que el gen de E. coli puede mutarse en un sistema de cultivo de células bacterianas y después puede ensayarse la actividad enzimática del producto génico de E. coli (KI y Km) que indicará la resistencia a glifosato y la función como un producto enzimático necesario que es esencial en plantas. Una vez se ha identificado un mutante de E. coli mutado, se efectúa esa mutación en una célula vegetal empleando las oligonucleobases recombinagénicas descritas en el presente documento para producir una planta no transgénica resistente a herbicida. Por estos motivos, E. coli mutada y las proteínas AroA mutadas se consideran parte de la presente invención.

La siguiente tabla lista posiciones de sustituciones de aminoácidos según la presente invención, por el número de aminoácido, para varias especies. Al efectuar sustituciones de aminoácidos de acuerdo con la presente invención en estas posiciones producirá plantas resistentes a glifosato: Nº de referencia de GenBank

Proteína Nº T97 P101

E. coli X00557 97 101 Arabidopsis thaliana AF360224 179 183 Petunia hybrida M21084.1 174 178 Brassica napus X51475.1 174 178 Zea mays X63374 102 106 Oryza sativa AF413082 169 173 Arabidopsis thaliana NM 130093 178 182

Como puede observarse en la tabla anterior y en las Fig. 1-5 hay algunas variaciones menores entre los genes de EPSPS entre especies y dentro de las especies. Esto es de esperar. Estas variaciones menores deben tenerse en cuenta cuando se produzcan mutantes según la presente invención. Los aminoácidos en posiciones análogas entre los diferentes genes se mutan para producir plantas resistentes a glifosato. Por ejemplo, la mutación en AF360224 de Arabidopsis en la posición 179 (T>A) será equivalente a la mutación T>A en la posición 178 de NM 130093 de Arabidopsis.

Además, algunas especies tienen más de un gen de EPSPS. En dicho caso, se mutan uno o más de los genes según la presente invención para producir un mutante resistente a glifosato. Si los niveles de expresión de los diversos genes de EPSPS se conocen y son diferentes, se prefiere mutar los genes de EPSPS de mayor expresión. En una realización preferida, todos los genes de EPSPS en un cultivo se mutan para producir un fenotipo de glifosato. Por ejemplo, se sabe que la canola tiene cuatro genes de EPSPS. Dos genes se muestran en las Fig. 4 y 5. Una comparación mostrará una ligera diferencia entre los dos genes.

La planta mutada según la presente invención puede ser de cualquier especie de planta dicotiledónea, monocotiledónea o gimnosperma, incluyendo cualquier especie de planta leñosa que crezca como un árbol o como un arbusto, cualquier especie herbácea, o cualquier especie que produzca frutos comestibles, semillas o vegetales, o cualquier especie que produzca flores coloridas o aromáticas. Por ejemplo, la planta puede seleccionarse de una especie de planta del grupo que consiste en canola, girasol, tabaco, remolacha azucarera, batata, batata, algodón, maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, tomate, mango, melocotón, manzana, pera, fresa, banana, melón, patata, zanahoria, lechuga, cebolla, especies de soja, caña de azúcar, guisante, cacahuete, habas, álamo, uva, cítricos, alfalfa, centeno, avena, césped y hierbas de forraje, lino, colza, pepino, enredadera, bálsamo, pimienta, berenjena, caléndula, loto, repollo, margarita, clavel, tulipán, iris, lirio, y plantas productoras de frutos secos siempre que no se hayan mencionado ya específicamente.

La oligonucleobase recombinagénica puede introducirse en una célula vegetal usando cualquier procedimiento usado de manera común en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, microtransportadores (administración biolística), microfibras (patillas), electroporación, captación directa de ADN y microinyección.

Los ejemplos ilustrativos de una oligonucleobase recombinagénica se describen a continuación.

La invención puede ponerse en práctica con oligonucleobases recombinagénicas que tienen las conformaciones y químicas descritas en las patentes de Kmiec I y Kmiec II. Kmiec I enseña un procedimiento para introducir alteraciones genéticas específicas en un gen diana. Las oligonucleobases recombinagénicas en Kmiec I y/o Kmiec II contienen dos hebras complementarias, una de las cuales contiene al menos un segmento de nucleótidos de tipo ARN (un "segmento de ARN") que está emparejado por bases a nucleótidos de tipo ADN de la otra hebra.

Kmiec II desvela que los no nucleótidos que contienen bases de purina y pirimidina pueden sustituirse por nucleótidos. Las Patentes de los Estados Unidos Nº 5.756.325; 5.871.984; 5.760.012; 5.888.983; 5.795.972; 5.780.296; 5.945.339; 6.004.804; y 6.010.907 y la Patente Internacional Nº PCT/US00/23457; y las Publicaciones de Patentes

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Internacionales Nº WO 98/49350; WO 99/07865, WO 99/58723, WO 99/58702, WO 99/40789, US 6.870.075; y la Solicitud de Patente Publicada de los Estados Unidos 20030084473 desvelan moléculas recombinagénicas adicionales que pueden usarse para la presente invención. La expresión "oligonucleobase recombinagénica" se usa en el presente documento para indicar las moléculas que pueden usarse en los procedimientos de la presente invención e incluyen oligonucleótidos en doble hélice mixtos, moléculas que contienen no nucleótidos enseñadas en Kmiec II, oligodesoxinucleótidos monocatenarios y otras moléculas recombinagénicas enseñadas en las patentes y publicaciones de patentes anteriormente mencionadas.

En una realización, la oligonucleobase recombinagénica es un oligonucleótido de doble hélice mixto en el que los nucleótidos de tipo ARN del oligonucleótido de doble hélice mixto se hacen resistentes a RNasa reemplazando el 2'-hidroxilo con una funcionalidad fluoro, cloro o bromo o poniendo un sustituyente en el 2'-O. Los sustituyentes adecuados incluyen los sustituyentes enseñados por Kmiec II. Los sustituyentes alternativos incluyen los sustituyentes enseñados por la Patente de los Estados Unidos Nº 5.334.711 (Sproat) y los sustituyentes enseñados por las Publicaciones de Patente EP 629 387 y EP 679 657 (de manera colectiva, las Solicitudes Martin). Como se usa en el presente documento, un derivado 2'-fluoro, cloro o bromo de un ribonucleótido o un ribonucleótido que tiene un sustituyente 2'-OH con un sustituyente descrito en las Solicitudes Martin o Sproat se denomina "Ribonucleótido 2'-sustituido". Tal como se usa en el presente documento, la expresión "nucleótido de tipo ARN" significa un nucleótido 2'-hidroxilo o 2'-sustituido que está enlazado a otros nucleótidos de un oligonucleótido de doble hélice mixto por un enlace fosfodiéster no sustituido o cualquiera de los enlaces no naturales enseñados por Kmiec I o Kmiec II. Tal como se usa en el presente documento, la expresión nucleótido de tipo desoxirribo" significa un nucleótido que tiene un 2'-H, que puede enlazarse a otros nucleótidos de un MDON mediante un enlace fosfodiéster no sustituido o cualquiera de los enlaces no naturales enseñados por Kmiec I o Kmiec II.

En una realización de la presente invención, la oligonucleobase recombinagénica es un oligonucleótido de doble hélice mixto que está enlazado únicamente por enlaces fosfodiéster no sustituidos. En realizaciones alternativas, el enlace es mediante fosfodiésteres sustituidos, derivados fosfodiéster y enlaces no basados en fósforo tal como se enseña por Kmiec II. En otra realización más, cada molécula de tipo ARN en el oligonucleótido de doble hélice mixto es un nucleótido 2'-sustituido. Las realizaciones particularmente preferidas de ribonucleótidos 2'-sustituidos son ribonucleótidos sustituidos con 2'-fluoro, 2'-metoxi, 2'-propiloxi, 2'-aliloxi, 2'-hidroxiletiloxi, 2'-metoxietiloxi, 2'-fluoropropiloxi y 2'-trifluoropropiloxi. Las realizaciones más preferidas de ribonucleótidos 2'-sustituidos son nucleótidos sustituidos en 2'-fluoro, 2'-metoxi, 2'-metoxietiloxi, y 2'-aliloxi. En otra realización, el oligonucleótido de doble hélice mezclado se enlaza mediante enlaces fosfodiéster no sustituidos.

Aunque se sintetizan de manera más conveniente los oligonucleótidos de doble hélice mixto que tienen un solo tipo de nucleótido de tipo ARN 2'-sustituido, los procedimientos de la invención pueden ponerse en práctica con oligonucleótidos de doble hélice que tienen dos o más tipos de nucleótidos de tipo ARN. La función de un segmento de ARN puede no verse afectada por una interrupción causada por la introducción de un desoxinucleótido entre dos trinucleótidos de tipo ARN, por consiguiente, la expresión segmento de ARN abarca dicho "segmento de ARN interrumpido". Un segmento de ARN no interrumpido se cita como un segmento de ARN contiguo. En una realización alternativa, un segmento de ARN puede contener nucleótidos resistentes a RNasa y 2'-OH no sustituidos alternos. Los oligonucleótidos de doble hélice mixtos tienen preferentemente menos de 100 nucleótidos y más preferentemente menos de 85 nucleótidos, pero más de 50 nucleótidos. La primera y la segunda hebra están emparejadas por emparejamiento de bases de Watson-Crick. En una realización, las hebras del oligonucleótido de doble hélice mixtos están unidos covalentemente mediante un enlazante, tal como por un hexa, penta o tretranucleótido monocatenario de tal forma que la primera y la segunda hebra son segmentos de una sola cadena de oligonucleótido que tiene un solo extremo 3' y un solo extremo 5'. Los extremos 3' y 5' pueden protegerse mediante la adición de una "tapa en horquilla" en la que los nucleótidos 3' y 5' terminal están emparejados por emparejamiento de Watson-Crick a nucleótidos adyacentes. Una tapa en horquilla secundaria puede, además, situarse en la unión entre la primera y la segunda hebra distantes de los extremos 3' y 5', de tal forma que se estabiliza el emparejamiento de Watson-Crick entre la primera y la segunda hebra.

La primera y la segunda hebra contienen dos regiones que son homólogas a dos fragmentos del gen de EPSPS diana, es decir, tienen la misma secuencia que los genes diana. Una región homóloga contiene los nucleótidos de un segmento de ARN y pueden contener uno o más nucleótidos de tipo ADN de segmento de ADN conector y también pueden contener nucleótidos de tipo ADN que no se encuentran en el segmento de ADN interviniente. Las dos regiones de homología se separan mediante, y cada una es adyacente a, una región que tiene una secuencia que difiere de la secuencia del gen diana, citada como una "región heteróloga". La región heteróloga puede contener uno, dos o tres nucleótidos desemparejados. Los nucleótidos desemparejados pueden ser contiguos o, como alternativa, separarse mediante uno o dos nucleótidos que son homólogos con el gen diana. Como alternativa, la región heteróloga también puede contener una inserción de uno, dos, tres o de cinco o menos nucleótidos. Como alternativa, la secuencia del oligonucleótido de doble hélice mixto puede diferir de la secuencia del gen diana solo por la eliminación de uno, dos, tres, o cinco o menos nucleótidos del oligonucleótido de doble hélice mixto. La longitud y posición de la región heteróloga, en este caso, se considera la longitud de la eliminación, aunque ningún nucleótido del oligonucleótido de doble hélice mixto se encuentre dentro de la región heteróloga. La distancia entre los fragmentos del gen diana que son complementarios a las dos regiones homólogas es de manera idéntica la longitud de la región heteróloga cuando se pretende una sustitución o sustituciones. Cuando la región heteróloga contiene una inserción, las regiones se separan de este modo en el oligonucleótido de doble hélice mixto más allá de lo que lo están sus

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fragmentos homólogos complementarios en el gen, y lo contrario es aplicable cuando la región heteróloga codifica una eliminación.

Los segmentos de ARN de los oligonucleótidos de doble hélice mixtos son cada uno parte de una región homóloga, es decir, una región que es idéntica en secuencia a un fragmento del gen diana, conteniendo dichos segmentos juntos al menos 13 nucleótidos de tipo ARN y preferentemente de 16 a 25 nucleótidos de tipo ARN o aún más preferentemente 18-22 nucleótidos de tipo ARN o lo más preferentemente 20 nucleótidos. En una realización, los segmentos de ARN de las regiones de homología se separan mediante y son adyacentes a, es decir, "conectadas por" un segmento de ADN interviniente. En una realización, cada nucleótido de la región heteróloga es un nucleótido del segmento de ADN interviniente. Un segmento de ADN interviniente que contiene la región heteróloga de un oligonucleótido de doble hélice mixto se denomina un "segmento mutador".

El cambio a introducir en el gen de EPSPS diana se codifican por la región heteróloga. El cambio a introducir en el gen de EPSPS puede ser un cambio en una o en más bases de la secuencia del gen de EPSPS que cambia en el aminoácido nativo en esa posición al aminoácido deseado.

En otra realización de la presente invención, la oligonucleobase recombinagénica es un vector mutacional de oligodesoxinucleótido monocatenario o SSOMV, que se desvela en la Solicitud de Patente Internacionale PCT/US00/23457. La secuencia de SSOMV se basa en los mismos principios que los vectores mutacionales descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nº 5.756.325; 5.871.984; 5.760.012; 5.888.983; 5.795.972; 5.780.296; 5.945.339; 6.004.804; y 6.010.907 y en las Publicaciones Internacionales Nº WO 98/49350; WO 99/07865, WO 99/58723, WO 99/58702, WO 99/40789, US 6.870.075; y en la Solicitud de Patente Publicada 20030084473. La secuencia del SSOMV contiene dos regiones que son homólogas con la secuencia diana separadas por una región que contiene la alteración genética deseada citada como región mutadora. La región mutadora puede tener una secuencia que tiene la misma longitud que la secuencia que separa a las regiones homólogas en la secuencia diana, pero que tiene una secuencia diferente. Dicha región mutadora causará una sustitución.

Los nucleótidos del SSOMV son desoxirribonucleótidos que están unidos mediante enlaces fosfodiéster no modificados excepto que el enlace internucleótido 3' terminal y/o 5' terminal o como alternativa, los dos enlaces internucleótido 3' terminal y/o 5' terminal pueden ser un fosforotioato o fosfoamidato. Tal como se usa en el presente documento, un enlace internucleótido es el enlace entre nucleótidos del SSOMV y no incluye el enlace entre el nucleótido 3' final o el nucleótido 5' final y un sustituyente bloqueante, véase más arriba. En una realización específica, la longitud del SSOMV es de entre 21 y 55 desoxinucleótidos y las longitudes de las regiones de homología tienen, por consiguiente, una longitud total de al menos 20 desoxinucleótidos y al menos dos regiones de homología deben tener cada una longitudes de al menos 8 desoxinucleótidos.

El SSOMV puede diseñarse para ser complementario con la hebra codificante o la no codificante del gen diana. Cuando la mutación deseada es una sustitución de una sola base, se prefiere que los dos nucleótidos mutadores sean una pirimidina. Hasta el punto en que sea coherente con lograr el resultado funcional deseado, se prefiere que tanto el nucleótido mutador como el nucleótido diana en la hebra complementaria sean pirimidinas. Se prefieren particularmente SSOMV que codifiquen mutaciones por transversión, es decir, un nucleótido mutador de C o T se desempareja, respectivamente, con un nucleótido C o T en la hebra complementaria.

Además del oligodesoxinucleótido, el SSOMV puede contener un sustituyente bloqueante en 5' que está unido a los carbonos 5' terminales a través de un enlazante. La química del enlazante no es crítica más allá de su longitud, pero debe ser preferentemente de 6 átomos de longitud y el enlazante debe ser flexible. Puede usarse una variedad de sustituyentes no tóxicos, tales como biotina, colesterol u otros esteroides o un colorante fluorescente catiónico no intercalante. Los reactivos vendidos como Cy3™ y Cy5™ por Glen Research, Sterling VA, se prefieren particularmente como reactivos para preparar el SSOMV, que son fosforamiditas bloqueadas que tras la incorporación en un oligonucleótido producen indomonocarbocianina sustituida con 3,3,3',3'-tetrametilo y N,N'-isopropilo y colorantes de indodicarbocianina, respectivamente. Cy3 es el más preferido. Cuando la indocarbocianina está sustituida por N-oxialquilo, puede unirse convenientemente al 5' terminal del oligodesoxinucleótido mediante un fosfodiéster con un fosfato 5' terminal. La química del enlazante colorante entre el colorante y el oligodesoxinucleótido no es crítica y se selecciona por conveniencia sintética. Cuando la fosforamidita Cy3 disponible comercialmente se usa según se indica, la modificación 5' resultante consiste en un sustituyente bloqueante y enlazante juntos que son un una indomonocarbocianina de N-hidroxipropilo, N'-fosfatidilpropilo y 3,3,3',3'-tetrametilo.

En una realización preferida, el colorante de indocarbocianina está tetrasustituido en las posiciones 3 y 3' de los anillos de indol. Sin limitación en cuanto a la teoría, estas sustituciones evitan que el colorante sea un colorante intercalante. La identidad de los sustituyentes en estas posiciones no son críticas. El SSOMV puede además tener un sustituyente 3' bloqueante. Nuevamente, la química del sustituyente 3' bloqueante no es crítica.

En otra realización preferida, el oligonucleótido recombinagénico es un oligodesoxinucleótido monocatenario que tiene un nucleótido 3' terminal, un nucleótido 5' terminal, que tiene al menos 25 desoxinucleótidos y no más de 65 desoxinucleótidos, y que tiene una secuencia que comprende al menos dos regiones de al menos 8 desoxinucleótidos cada una que son cada una, respectivamente, idénticas a al menos dos regiones del gen cromosomal diana, teniendo dichas regiones juntas al menos 24 nucleótidos de longitud, y estando dichas regiones separadas por al menos un

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Brassica rapa, Brassica oleracea, y Brassica juncea), algodón (Gossypium hirsuitum L.), varias especies leguminosas (por ejemplo, soja [Glycine max], guisante [Pisum sativum], etc.), uvas [Vitis vinifera], y un hospedador de otras plantas de cultivo importantes. La embriogénesis de microesporas, tanto desde anteras y cultivo de microesporas, se ha descrito en más de 170 especies, que pertenecen a 68 géneros y 28 familias de dicotiledóneas y monocotiledóneas (Raghavan, Embryogenesis in Agniosperms: A Developmental and Experimental Study, Cambridge University Press, Cambridge, Inglaterra 1986; Rhagavan, Cell Differentiation 21:213-226, 1987; Raemakers y col., Euphytica 81:93-107, 1995). Para una discusión detallada del aislamiento de microesporas, su cultivo, y la regeneración de plantas dobles haploides a partir de embriones derivados de microesporas [MDE] en Brassica napus L., véase Nehlin, The Use of Rapeseed (Brassica napus L.) Microspore as a Tool for Biotechnological Applications, Tesis doctoral, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Suecia, 1999; también Nehlin y col., Plant Sci. 111:219-227, 1995, y Nehlin y col., Plant Sci. 111:219-227, 1995). La duplicación de cromosomas a partir de microesporas u otro cultivo es una técnica bien establecida para la producción de líneas de plantas homólogas dobles haploides en varios cultivos (Heberle-Bors y col., In vitro pollen cultures: Progress and perspectives. En: Pollen Biotechnology. Gene expression and allergen characterization, vol. 85-109, ed. Mohapatra, S. S., y Knox, R. B., Chapman y Hall, Nueva York, 1996).

Los procedimientos de electroporación de microesporas se describen en Jardinaud y col., Plant Sci. 93:177-184, 1993, y Fennell y Hauptman, Plant Cell Reports 11:567-570, 1992. Los procedimientos para la electroporación de MDON en protoplastos de plantas también pueden adaptarse para su uso en electroporación de microesporas.

Patillas y microinyección

En otra realización alternativa más, la oligonucleobase recombinagénica puede administrarse a la célula vegetal por medio de patillas o microinyección de la célula vegetal. La técnica denominada de patillas se lleva a cabo esencialmente tal como se describe en Frame y col., 1994, Plant J. 6:941-948. La oligonucleobase recombinagénica se añade a las patillas y se usa para transformar las células vegetales. La oligonucleobase recombinagénica puede incubarse conjuntamente con plásmidos que comprenden secuencias que codifican proteínas capaces de formar complejos de recombinasa en células vegetales de tal forma que la recombinación está catalizada entre el oligonucleótido y la secuencia diana en el gen de EPSPS.

Selección de plantas resistentes a glifosato

Puede ensayarse la resistencia o tolerancia de las plantas o células vegetales a un herbicida de fosfonometilglicina usando procedimientos conocidos de manera común en la técnica, por ejemplo, creciendo la planta o célula vegetal en presencia de un herbicida de fosfonometilglicina y midiendo la velocidad de crecimiento en comparación con la velocidad de crecimiento de plantas de control en ausencia de herbicida. En el caso de glifosato se usan concentraciones de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mM en el medio de selección.

Los siguientes ejemplos ilustran la práctica de la presente invención pero no deben entenderse como limitantes de su ámbito.

Ejemplo 1: Mutantes P178A en Brassica napus (canola) (No según la invención)

Se preparó el siguiente genoplasto (oligonucleobase recombinagénica) para hacer un cambio P178A en germoplasma de Brassica napus (canola):

SEC ID 1: VATGCAGGAACAGCCATGCGTTCACTTACGGCTGCAGTTACTH

en la que V es un colorante fluorescente (V=Cy3) y H es un nucleótido reverso o base reversa (H=3’DMTdCCPG). Las nucleobases subrayadas representan una región heteróloga (codon) donde la mutación sucede en el genoma de la canola, es decir, A. El genoplasto se prepara según técnicas bien conocidas y el genoplasto se administra preferentemente en una célula de planta de canola mediante bombardeo de micropartículas, es decir, biolísticamente. Las plantas de canola regeneradas que contienen al mutante P178 A son resistentes al glifosato cuando se aplican velocidades comerciales.

Ejemplo 2: Mutantes P173A en Oryza sativa (arroz) (No según la invención)

Se preparó el siguiente genoplasto (oligonucleobase recombinagénica) para hacer un cambio P173A en germoplasma de Oryza sativa (arroz):

SEC ID 2: VGGAACGCTGGAACTGCAATGCGAGCATTGACAGCAGCCGTGACTGCH

en la que V es un colorante fluorescente (V=Cy3) y H es un nucleótido reverso o base reversa (H=3’DMTdCCPG). Las nucleobases subrayadas representan una región heteróloga (codon) donde la mutación sucede en el genoma del arroz, es decir, A. El genoplasto se prepara según técnicas bien conocidas y el genoplasto se administra preferentemente en una célula de planta de arroz mediante bombardeo de micropartículas, es decir, biolísticamente. Las plantas de arroz regeneradas que contienen al mutante P173A son resistentes al glifosato cuando se aplican velocidades comerciales.

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Claims

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