ES2337762T3 - Plantas no transgenicas resistentes a un herbicida. - Google Patents
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Abstract
Método para la producción de una planta no transgénica, que es resistente o tolerante a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina comprendiendo: (a) la introducción en células vegetales de una oligonucleobase recombinagénica con una mutación objetivo en el gen EPSPS para producir células vegetales con un gen EPSPS mutante que expresa una proteína EPSP que es mutada en una o más posiciones de aminoácidos, dichas posiciones siendo seleccionadas en el grupo que consiste en Leu173, Ala179, Met180, Arg181, Ser98, Ser255 y Leu198 en la proteína EPSPS de Arabidopsis o en un residuo de aminoácido análogo en un gen EPSP de otra especie; (b) la identificación de una célula vegetal que presenta un crecimiento normal, en comparación con una célula vegetal de tipo salvaje correspondiente en presencia de glifosato; y (c) la regeneración de una planta no transgénica resistente o tolerante al herbicida que posee dicho gen EPSPS mutado a partir de dicha célula vegetal; donde la planta no transgénica, resistente o tolerante al herbicida exhibe un crecimiento y desarrollo normales en comparación con el de las plantas correspondientes de tipo salvaje y donde la enzima EPSPS mutada tiene la misma actividad catalítica en comparación con la de la enzima de tipo salvaje.
Description
Plantas no transgénicas resistentes a un
herbicida.
La presente invención se refiere a la producción
de una planta no transgénica resistente o tolerante a un herbicida
de la familia de la fosfonometilglicina, por ejemplo, glifosato. La
presente invención también se refiere al uso de una oligonucleobase
recombinagénica para que se realice una mutación deseada en las
secuencias cromosómicas o episómicas de una planta en el gen
codificante con respecto a una 5-enol
piruvil-shikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS). La proteína mutada, que mantiene sustancialmente
la actividad catalítica de la proteína de tipo salvaje, permite una
mayor resistencia o tolerancia de la planta frente a un herbicida de
la familia de la fosfonometilglicina, y permite el crecimiento o
desarrollo sustancialmente normales de la planta, de sus órganos,
tejidos o células en comparación con la planta de tipo salvaje
independientemente de la presencia o ausencia del herbicida. La
presente invención también se refiere a una célula vegetal no
transgénica en la que ha mutado el gen EPSPS, una planta no
transgénica regenerada a partir de ahí, así como una planta obtenida
mediante un cruce utilizando una planta regenerada no transgénica
con un gen EPSPS mutado.
Las plantas tolerantes al herbicida pueden
reducir la necesidad de trabajar el suelo para controlar las malas
hierbas reduciendo así eficazmente la erosión del suelo. Un
herbicida objeto de mucha investigación a este respecto es la
N-fosfonometilglicina, comúnmente denominada
glifosato. El glifosato inhibe la vía ácida shiquímica que conduce a
la biosíntesis de compuestos aromáticos incluyendo aminoácidos,
hormonas y vitaminas. Específicamente, el glifosato frena la
conversión de ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y ácido
3-fosfoshiquímico en ácido
5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico
por la inhibición del enzimático
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (a partir de ahora denominado sintasa EPSP o EPSPS). Para
los objetivos de la presente invención, el término "glifosato"
incluye cualquier forma eficaz herbicidamente de la
N-fosfonometilglicina (incluyendo cualquier derivado
de sal, otras formas con las que se obtiene la producción del ión
glifosato en plantas y cualesquiera otras herbicidas de la familia
de la fosfonometliglicina.
La tolerancia de las plantas al glifosato puede
aumentar con la introducción de un gen mutante EPSPS que tiene una
alteración en la secuencia codificante de los aminoácidos EPSPS en
el genoma de la planta. Ejemplos de algunas de las mutaciones en el
gen EPSPS para inducir la tolerancia al glifosato se describen en
las siguientes patentes: patente EEUU nº. 5,310,667; patente EEUU
nº. 5,866,775; patente EEUU nº. 5,312,910; patente EEUU nº.
5,145,783. Estas mutaciones propuestas habitualmente tienen un valor
k_{i} más alto para el glifosato que la enzima EPSPS de tipo
salvaje que confiere el fenotipo tolerante al glifosato, pero éstas
variantes también se caracterizan por un K_{m} alto de PEP con el
que la enzima cinéticamente se vuelve menos eficiente. (Kishore
et al., 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663;
Schulz et al., 1984, Arch. Microbiol. 137:
121-123; Sost et al., 1984, FEBS. Lett 173:
238-241; Kishore et al., 1986, Fed. Proc. 45:
1506; Sost y Amrhein, 1990, Arch. Biochem. Biophys. 282:
433-436.) Muchas mutaciones del gen EPSPS son
elegidas con el fin de producir una enzima EPSP que sea resistente a
herbicidas, pero desafortunadamente, la enzima EPSPS que produce el
gen EPSPS mutado tiene una actividad enzimática significativamente
inferior al EPSPS de tipo salvaje. Por ejemplo, el K_{m} aparente
de PEP y el K_{i} aparente de glifosato para el EPSPS de tipo
salvaje de E. coli son de 10 \muM y 0.5 \muM, mientras
que para un aislado tolerante al glifosato que tiene una sola
sustitución de aminoácidos de alanina con respecto a la glicina en
posición 96, estos valores son de 220 \muM y 4.0 mM,
respectivamente. Un numero de genes EPSPS tolerantes al glifosato se
han construido por mutagénesis. De nuevo, el EPSPS tolerante al
glifosato presentaba una eficiencia catalítica inferior
(V_{max}/K_{m}), como lo mostraba un incremento en el K_{m} de
PEP, y una ligera reducción del V_{max} de la enzima vegetal de
tipo salvaje (Kishore et al., 1988, Ann. Rev. Biochem.
57:627-663).
Como las constantes cinéticas de las enzimas
variantes se deterioran con respecto al PEP, se han propuesto unos
niveles altos de sobreproducción de la enzima variante, de 40 a 80
veces más, que serán necesarios para mantener una actividad
catalítica normal en plantas en presencia de glifosato (Kishore
et al., 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663).
Se ha demostrado que se pueden producir plantas tolerantes al
glifosato por inserción en el genoma de la planta de la capacidad
para producir un nivel más alto de EPSP sintasa en el cloroplasto de
la célula (Shah et al., 1986, Science 233,
478-481), cuya enzima es preferiblemente tolerante
al glifosato (Kishore et al.. 1988, Ann. Rev. Biochem.
57:627-663).
La introducción de los genes EPSPS mutantes
exógenos en plantas está bien documentada. Por ejemplo, según la
patente EEUU nº. 4,545,060, para incrementar la resistencia de una
planta al glifosato, un gen codificante para una variante EPSP que
tiene al menos una mutación que hace que la enzima sea más
resistente a su inhibidor competitivo, es decir, glifosato, es
introducido en el genoma de la planta. No obstante, se asocian
muchas complicaciones y problemas con estos ejemplos. Muchas de
dichas mutaciones producen una expresión baja del producto genético
EPSPS mutado o produce un producto genético EPSPS con una actividad
enzimática significativamente inferior en comparación con el tipo
salvaje. La expresión baja o actividad enzimática baja de la enzima
mutada produce niveles anormalmente bajos de crecimiento y de
desarrollo de la planta.
Mientras que estas variantes en las EPSP
sintasas han demostrado ser útiles en la obtención de plantas
transgénicas tolerantes al glifosato, sería mucho más beneficioso
obtener una variante de producto genético EPSPS altamente tolerante
al glifosato pero que siga eficiente cinéticamente para que la
tolerancia mejorada pueda ser obtenida con un nivel de expresión de
tipo salvaje.
Las oligonucleobases recombinagénicas y su uso
para efectuar cambios genéticos en células eucarióticas se describen
en la patente estadounidense nº. 5,565,350 de Kmiec (Kmiec I). Kmiec
I enseña un método para la introducción de alteraciones genéticas
específicas en un gen objetivo. Kmiec I divulga, entre otras cosas,
oligonucleobases recombinagénicas que tienen dos cadenas, en las que
la primera cadena contiene dos segmentos de al menos 8 nucleótidos
de tipo ARN que son separados por un tercer segmento desde 4 hasta
aproximadamente 50 nucleótidos de tipo ADN, llamado "segmento de
ADN interpuesto". Los nucleótidos de la primera cadena en
apareamiento de bases de nucleótidos de tipo ADN de una segunda
cadena. Las primeras y segundas cadenas son enlazadas adicionalmente
por un segmento de nucleótidos monocatenario de modo que las primera
y segunda cadenas son partes de una única cadena oligonucleótida.
Kmiec I enseña además un método para la introducción de alteraciones
genéticas específicas en un gen objetivo. Según Kmiec I, las
secuencias de los segmentos RNA son seleccionadas para ser
homologas, es decir, idénticas, a la secuencia de un primer y de un
segundo fragmento del gen objetivo. La secuencia del segmento
interpuesto de ADN es homologa a la secuencia del gen objetivo entre
el primer y el segundo fragmento excepto para una región de
diferencia, llamada "región heteróloga". La región heteróloga
puede efectuar una inserción o deleción, o puede contener una o más
bases que no coinciden con la secuencia del gen objetivo con el fin
de efectuar una sustitución. Según Kmiec I, la secuencia del gen
objetivo es alterada en forma dirigida por la región heteróloga, de
manera que el gen objetivo se vuelve homólogo con la secuencia de la
oligonucleobase recombinagénica. Kmiec I enseña específicamente que
los nucleótidos que contienen ribosa y
2'-O-metilribosa, es decir
2'-metoxiribosa, pueden ser usados en las
oligonucleobases recombinagénicas y nucleótidos que contienen
deoxiribosa de origen natural, pueden ser utilizados como
nucleótidos de tipo ADN.
La patente EEUU nº. 5,731, 181 para Kmiec (Kmiec
II) divulga específicamente el uso de oligonucleobases
recombinagénicas para efectuar cambios genéticos en células
vegetales y divulga otros ejemplos de análogos y derivados de
nucleótidos tipo ARN y tipo ADN que se pueden utilizar para efectuar
cambios genéticos en genes de objetivo específicos. Otras patentes
que discuten el uso de oligonucleobases recombinagénicas incluyen:
patentes EEUU nº 5,756,325, 5,871,984, 5,760,012, 5,888,983,
5,795,972, 5, 780,296, 5,945,339, 6,004,804; y 6,010,907 y en
patente Internacional nº PCT/US00/23457; y en la Publicación
Internacional de patentes nº WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723;
WO 99/58702; y WO 99/40789. Las Oligonucleobases recombinagénicas
incluyen oligonucleótidos dúplex mezclados, moléculas sin contenido
de nucleótidos mostradas en Kmiec II y otras moléculas que aparecen
en las patentes y publicaciones de patentes mencionadas más
arriba.
La citación o identificación de cualquier
referencia en La Sección 2, o cualquier sección de esta solicitud no
debe ser interpretada como una admisión de que tal referencia está
disponible como técnica anterior a la presente invención.
La presente invención se dirige a un método para
producir una planta no transgénica o célula vegetal que tiene una o
más mutaciones en el gen EPSPS, la cual planta ha incrementado
resistencia o tolerancia a un elemento de la familia de la
fosfonometilglicina y que presenta un crecimiento o desarrollo
sustancialmente normal de la planta, de sus órganos, tejidos o
células, en comparación con la planta o célula de tipo salvaje
correspondiente. La presente invención también se dirige a un método
para producir una planta no transgénica que tiene una mutación en el
gen EPSPS, la cual planta es resistente o tiene una tolerancia
incrementada a un elemento de la familia de la fosfonometilglicina,
por ejemplo, glifosato, donde la proteína EPSPS mutada posee
sustancialmente la misma actividad catalítica en comparación con la
proteína EPSPS de tipo salvaje.
La presente invención también se dirige a un
método para producir una planta no transgénica que tiene un gen
EPSPS mutado que mantiene sustancialmente la actividad catalítica de
la proteína de tipo salvaje independientemente de la presencia o
ausencia de un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina. El
método comprende la introducción de una célula vegetal en una
oligonucleobase recombinagénica con una mutación específica en el
gen EPSPS y la identificación de una célula, semilla, o planta que
posee un gen EPSPS mutado.
Ejemplos ilustrativos de una oligonucleobase
recombinagénica se encuentran en las siguientes publicaciones de
patente, que se incorporan aquí en su integridad como referencia: en
las patentes estadounidenses nº 5,565,350, 5,756,325, 5,871,984,
5,760,012, 5,731,181, 5,888,983, 5,795,972, 5, 780,296, 5,945,339,
6,004,804; y 6,010,907 y en la patente internacional nº.
PCT/US00/23457; y en la publicación de patente internacional nº WO
98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; y WO 99/40789.
La planta puede ser de cualquier especie de
planta dicotiledónea, monocotiledónea o gimnosperma, incluyendo
cualquier especie de planta leñosa que crece como un árbol o
arbusto, cualquier especie herbácea, o cualquier especie que
produzca frutas comestibles, semillas o verduras, o cualquier
especie que produzca flores coloridas o aromáticas. Por ejemplo, la
planta puede ser seleccionada a partir de una especie de planta del
grupo que consiste en canola, girasol, tabaco, remolacha azucarera,
algodón, maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, tomate, mango,
melocotón, manzana, pera, fresa, plátano, melón, patata, zanahoria,
lechuga, cebolla, especies de soja, azúcar de caña, guisante, habas,
álamo, uva, cítrico, alfalfa, centeno, avena, césped y forraje,
lino, colza, pepino, manto de cielo, bálsamo, pimienta, berenjena,
caléndula, loto, repollo, margarita, clavel, tulipán, iris, lirio, y
plantas que producen frutos de cáscara ya que no están mencionados
específicamente.
La oligonucleobase recombinagénica puede ser
introducida en una célula vegetal usando cualquier método usado
habitualmente en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a éstos,
microsoportes (entrega biolística), microfibras, electroporación,
microinyección.
También se divulga un método para controlar
selectivamente las malas hierbas en un campo, el campo comprendiendo
plantas con las alteraciones del gen EPSPS y malas hierbas
descritas, el método comprendiendo la aplicación de un herbicida al
campo en el que dichas plantas se han vuelto resistentes.
También se divulgan nuevas mutaciones en el gen
EPSPS que confieren resistencia o tolerancia a un elemento de la
familia de la fosfonometilglicina, por ejemplo, glifosato, a una
planta o donde el EPSPS mutado tiene sustancialmente la misma
actividad enzimática en comparación con el EPSPS de tipo
salvaje.
La invención debe ser entendida conforme a las
siguientes definiciones.
Una oligonucleobase es un polímero de
nucleobases, el cual polímero puede hibridarse por apareamiento de
bases de Watson-Crick a un ADN que posee la
secuencia complementaria.
Las nucleobases comprenden una base, que es una
purina, pirimidina, o un derivado o análogo de ésta. Las nucleobases
incluyen nucleobases de péptidos, las subunidades de ácidos
nucleicos de péptidos, y nucleobases de morfolina además de
nucleósidos y nucleótidos. Los nucleósidos son nucleobases que
contienen una fracción de pentosefuranosil, por ejemplo, una
ribosida o 2'-deoxiribosida opcionalmente
sustituida. Los nucleósidos pueden ser enlazados por una de las
varias fracciones de enlace, que pueden o no contener un fósforo.
Los nucleósidos que son enlazados por medio de enlaces de
fosfodiéster insustituibles son llamados nucleótidos.
Una cadena de oligonucleobase tiene un terminal
5' y 3' único, que son las nucleobases definitivas del polímero. Una
cadena particular de oligonucleobase puede contener nucleobases de
todo tipo. Un compuesto de oligonucleobase es un compuesto que
comprende una o más cadenas de oligonucleobase que son
complementarias e hibridizadas por el apareamiento de bases de
Watson-Crick. Las nucleobases son del tipo deoxiribo
o tipo ribo. Las nucleobases de tipo ribo son nucleobases con un
contenido de pentosefuranosil donde el carbono 2' es un metileno
sustituido con un hidróxilo, alquiloxi o halógeno. Las nucleobases
del tipo deoxiribo son nucleobases distintas a las nucleobases tipo
ribo e incluyen todas las nucleobases que no contienen una fracción
de pentosefuranosil.
Una cadena oligonucleobase incluye genéricamente
ambas cadenas de oligonucleobase y segmentos o regiones de cadenas
de oligonucleobase. Una cadena de oligonucleobase tiene un extremo
3' y un extremo 5'. Cuando una cadena oligonucleobase es coextensiva
con una cadena, los extremos 3' y 5' de la cadena también son
terminales 3' y 5' de la cadena.
Según la presente invención, el crecimiento
sustancialmente normal de una planta, órgano de planta, tejido
vegetal o célula vegetal se define como un índice de crecimiento o
nivel de división celular de la planta, órgano de planta, tejido
vegetal, o célula vegetal que es de al menos 35%, al menos 50%, al
menos 60%, o al menos 75% del índice de crecimiento o nivel de
división celular en una planta, órgano de planta, tejido vegetal o
célula vegetal correspondiente que expresa la proteína EPSPS de tipo
salvaje.
Según la presente invención, el desarrollo
sustancialmente normal de una planta, órgano de planta, tejido
vegetal o célula vegetal está definido como la incidencia de uno o
más eventos de desarrollo en la planta, órgano vegetal, tejido
vegetal o célula vegetal que son sustancialmente los mismos que los
que se producen en una planta, órgano vegetal, tejido vegetal o
célula vegetal correspondiente expresando la proteína de tipo
salvaje EPSPS.
Según la presente invención los órganos de la
planta incluyen, pero no se limitan a éstos, hojas, tallos, raíces,
yemas vegetativas, yemas florales, meristemas, embriones,
cotiledones, endospermo, sépalos, pétalos, pistilos, carpelos,
estambres, anteras, microsporas, polen, tubos de polen, óvulos,
ovarios y frutos, o secciones, rodajas o discos tomados de éstos.
Los tejidos vegetales incluyen, pero no se limitan a éstos, tejidos
callosos, tejidos tórreos, tejidos vasculares, tejidos de
almacenamiento, tejidos meristemáticos, tejidos de hojas, tejidos de
vástago, tejidos de raíz, tejidos biliares, tejidos tumorales
vegetales, y tejidos reproductivos. Las células vegetales incluyen,
pero no se limitan a éstas, células aisladas con membranas
celulares, agregados de varios tamaños de éstas, y protoplastos.
Las plantas son sustancialmente
"tolerantes" al glifosato cuando son sometidas a éste y proveen
una curva de dosis/respuesta que es desplazada hacia la derecha
cuando se compara con la curva provista por plantas de tipo no
tolerantes sometidas de forma similar. Tales curvas de
dosis/respuesta presentan la indicación "dosis" indicada sobre
el eje X y las indicaciones "porcentaje de muerte" "efecto de
herbicidas", etc., indicadas sobre el eje Y. Las plantas
tolerantes requerirán más herbicida que las plantas de tipo no
tolerante con el fin de producir un efecto de herbicida determinado.
Las plantas que son sustancialmente "resistentes" al glifosato,
exhiben pocas o ninguna lesión necrótica, lítica, clorótica, u
otras, cuando son expuestas al glifosato en concentraciones e
índices empleados típicamente por la comunidad agroquímica para
eliminar las malas hierbas en el campo. Las plantas que son
resistentes a un herbicida también son tolerantes al herbicida. Los
términos "resistente" y "tolerante" deben entenderse como
"tolerante y/o resistente" en el contexto de la presente
solicitud.
La Fig. 1A es la secuencia de ADN del gen EPSPS
Arabidopsis thaliana (SEC ID NO:1). Los residuos de
nucleótidos subrayados en negrita son los residuos específicos.
La Fig. 1B es la secuencia de aminoácidos de
Arabidopsis thaliana de la proteína EPSPS (SEC ID NO:2). Los
residuos de aminoácidos subrayados en negrita son los residuos
específicos.
La Fig. 2 es una lista del tipo salvaje de
Arabidopsis thaliana y de nucleótido EPSPS mutante y de
aminoácidos en la región de la posición 173 a 183; secuencia de
nucleótidos de tipo salvaje (SEC ID NO:1) y secuencia de aminoácidos
de tipo salvaje (SEC ID NO:2), secuencia de nucleótidos A_{177}
mutantes (SEC ID NO:3) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:4);
secuencia de nucleótidos mutantes I_{178} (SEC ID NO:5) y
secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:6); secuencia de nucleótidos
mutantes A_{177} I_{118} (SEC ID NO:7) y secuencia de
aminoácidos (SEC ID NO:8); secuencia de nucleótidos mutantes
I_{178} S_{182} (SEC ID nº: 9) y secuencia de aminoácidos (SEC
ID NO:10); secuencia de nucleótidos mutantes A_{177} S_{182}
(SEC ID NO:11) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 12); secuencia
de nucleótidos mutantes A_{177} I_{178} S_{182} (SEC ID NO:13)
y secuencia de aminoácidos (SEC ID nº: 14); secuencia de nucleótidos
mutantes V_{177} S_{182} (SEC ID NO: 15) y secuencia de
aminoácidos (SEC ID nº: 16); secuencia de nucleótidos mutantes
L_{118} S_{182} (SEC ID nº: 17) y secuencia de aminoácidos (SEC
ID nº: 18); secuencia de nucleótidos mutantes A_{177} V_{118}
(SEC ID NO:19) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:20); secuencia
de nucleótidos mutantes A_{177} L_{182} (SEC ID NO:21) y
secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:22).
La Fig. 3A-C es una alineación
del ADN del gen EPSPS de Arabidopsis Thaliana realizada por
DNAStar (LaserGene), (SEC ID NO:1) con las secuencias de nucleótidos
de Brassica napus (SEC ID NO:23); Petunia Hybrida (SEC
ID NO:24); y gen EPSPS de Zea Mays (SEC ID NO:25). Las
secuencias se alinean utilizando el método J. Hein con una tabla de
peso de residuos ponderados.
La Fig. 4 es una alineación de la secuencia
EPSPS de aminoácidos de Arabidopsis thaliana (SEC ID NO:2)
con las secuencias EPSPS de aminoácidos de Brassica napus
(SEC ID NO:26); petunia hibrida (SEC ID NO:27); y Zea
Mays (SEC ID NO:28). Las secuencias se alinean utilizando el
método J. Hein con una tabla de peso de residuos ponderados.
La Fig. 5 es una lista de los cebadores de
mutagénesis utilizados, con los codones de objetivo en caracteres en
negrita (cebador mutante A_{177} (SEC ID NO:29); cebador mutante
I_{178} (SEC ID NO:30); cebador mutante A_{177} I_{178} (SEC
ID NO:31); cebador mutante I_{178} S_{182} (SEC ID NO:32);
cebador mutante A_{177} S_{182} (SEC ID NO:34); cebador mutante
A_{177} I_{178} S_{182} (SEC ID NO:35); cebador mutante
V_{177} S_{182} (SEC ID NO:35); cebador mutante L_{178}
S_{182} (SEC ID NO:36); cebador mutante A_{177} V_{178} (SEC
ID NO:37); y cebador mutante A_{177} L_{182} (SEC ID NO:38).
La Fig. 6 es el crecimiento medido por densidad
óptica a 600 nm de clones de Arabidopsis en presencia (+) y
ausencia (-) de 17 mM de glifosato.
La Fig. 7 (panel superior) es una transferencia
Western que muestra la expresión de Bacillus de histidina
marcada, Arabidopsis de tipo salvaje(WT) y proteínas
EPSPS (AS) mutantes aisladas de lisados (L) y eluatos (E) de
células. La Salmonella no transformada como control negativo
no muestra ninguna expresión EPSPS. El panel inferior es un gel
duplicado teñido en plata.
La presente invención se dirige a un método de
producción de una plañía o célula vegetal no transgénica que tiene
una mutación en el gen EPSPS, la cual plata tiene una resistencia o
tolerancia incrementada con respecto a un elemento de la familia de
la fosfonometilglicina y la cual plañía exhibe un crecimiento o
desarrollo sustancialmente normal de la planta, de sus órganos,
tejidos o células, en comparación con la planta o célula de tipo
salvaje correspondiente. La presente invención también se dirige a
una plañía no transgénica que tiene una mutación en el gen EPSPS, la
cual plañía es resistente o tiene una tolerancia incrementada a un
elemento de la familia de la fosfonometilglicina, por ejemplo,
glifosato, donde la proteína EPSPS mutada tiene sustancialmente la
misma actividad catalítica en comparación con la proteína EPSPS de
tipo salvaje.
La presente invención se dirige también a un
método para la producción de una plañía no transgénica que posee un
gen EPSPS mutado que mantiene sustancialmente la actividad
catalítica de la proteína de tipo salvaje sin tener en cuenta la
presencia o ausencia de un herbicida de la familia de la
fosfonometilglicina. El método comprende la introducción en una
célula vegetal de una oligonucleobase recombinagénica con una
mutación especifica en el gen EPSPS y la identificación de una
célula, semilla, o plañía que tiene un gen EPSPS mutado.
Ejemplos ilustrativos de una oligonucleobase
recombinagénica se encuentran en las siguientes publicaciones de
patentes estadounidenses nº 5,565,350; 5,756,325; 5,871,984;
5,760,012; 5,731,181; 5,888,983; 5,795,972; 5, 780,296; 5,945,339;
6, 004,804; y 6,010,907 y en la patente Internacional nº.
PCT/US00/23457; y en la publicación internacional de patentes nº WO
98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; y WO 99/40789.
La planta puede ser cualquier especie de plantas
dicotiledóneas, monocotiledóneas o gimnospermas incluyendo cualquier
especie de planta leñosa que crece como un árbol o arbusto,
cualquier especie herbácea, o cualquier especie que produzca frutos
comestibles, semillas o verduras, o cualquier especie que produzca
flores coloridas o aromáticas. Por ejemplo, la planta puede ser
seleccionada a partir de una especie de planta del grupo que
consiste en canola, girasol, tabaco, remolacha azucarera, algodón,
maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, tomate, mango, melocotón,
manzana, pera, fresa, plátano, melón, patata, zanahoria, lechuga,
cebolla, especies de soja, azúcar de caña, guisante, habas, álamo,
uva, cítrico alfalfa, centeno, avena, hierbas de turba y forraje,
lino, colza oleaginosa, pepino, manto de cielo, bálsamo, pimienta,
berenjena, caléndula, loto, repollo, margarita, clavel, tulipán,
iris, lirio, y plantas que producen frutos de cáscara ya que no
están mencionadas específicamente.
La oligonucleobase recombinagénica puede ser
introducida en una célula vegetal usando cualquier método usado
habitualmente en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a éstos,
microsoportes (entrega biolística), microfibras, electroporación,
microinyección.
Se divulga un método para controlar
selectivamente las malas hierbas en un campo, el campo comprendiendo
plantas con las alteraciones de gen EPSPS y malas hierbas
divulgadas, el método comprendiendo la aplicación al campo de una
herbicida con respecto al cual dichas plantas se han vuelto
resistentes.
Además se divulgan nuevas mutaciones en el gen
EPSPS que confiere resistencia o tolerancia a un elemento de la
familia de la fosfonometilglicina, por ejemplo, glifosato, a una
planta o donde el EPSPS mutado tiene sustancialmente la misma
actividad enzimática en comparación con el EPSPS de tipo
salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención puede ser practicada con
oligonucleobases recombinagénicas que tienen las conformaciones y
composiciones químicas descritas en la patente estadounidense nº
5,565,350 para Kmiec (Kmiec I) y el gen de la patente estadounidense
nº 5,731,181 (Kmiec II). Kmiec I enseña un método de introducción de
alteraciones genéticas específicas en un gen objetivo. Las
oligonucleobases recombinagénicas en Kmiec I y/o Kmiec II contienen
dos cadenas complementarias, de las cuales una contiene al menos un
segmento de nucleótidos de tipo ARN (un "segmento de ARN") que
son bases apareadas con nucleótidos de tipo ADN de la otra
cadena.
Kmiec II divulga que los no nucleótidos que
contienen una base de purina y pirimidina pueden ser sustituidos por
nucleótidos. Las patentes estadounidenses nº 5,756,325; 5,871,984;
5,760,012; 5,888,983; 5,795,972; 5, 780,296; 5,945,339; 6,004,804; y
6,010,907 y la patente internacional nº PCT/US00/23457; y las
publicaciones de patentes internacionales nº WO 98/49350; WO
99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; y WO 99/40789, divulgan
moléculas recombinagénicas adicionales que pueden ser utilizadas en
la presente invención. Los términos "oligonucleobase
recombinagénica" se utiliza aquí para indicar las moléculas que
se pueden utilizar en los métodos de la presente invención e
incluyen oligonucleótidos dúplex mezclados, conteniendo moléculas no
nucleótidos divulgados en Kmiec II, oligodeoxinucleótidos
monocatenarios y otras moléculas recombinagénicas que se divulgan en
las patentes y publicaciones de patentes citadas más arriba.
La oligonucleobase recombinagénica es un
oligonucleótido doble mezclado en el que los nucleótidos de tipo ARN
de los oligonucleótidos dúplex mezclados son producidos resistentes
a la ribonucleasa por sustitución del 2'-hidroxil
con una función de fluoro, cloro o bromo o por aplicación de un
sustituyente en el 2'-O. Sustituyentes adecuados
incluyen los sustituyentes divulgados por Kmiec II. Sustituyentes
alternativos incluyen los sustituyentes expuestos en la patente
estadounidense nº. 5,334,711 (Sproat) y los sustituyentes expuestos
por las publicaciones de patente EP 629 387 y EP 679 657
(colectivamente, solicitudes Martin). Como se utiliza aquí, un
derivado de 2-fluoro, cloro o bromo de un
ribonucleótido o un ribonucleótido que tiene un
2'-OH sustituido con un sustituyente descrito en
las solicitudes Martín o Sproat es llamado "ribonucleótido
2'-sustituido". Como se utiliza aquí, el término
"nucleótido de tipo ARN" define un 2'-hidroxil
o nucleótido 2'-sustituido que se enlaza con otros
nucleótidos de un oligonucleótido doble mezclado por un enlace de
fosfodiéster no sustituido o cualquiera de los enlaces no naturales
expuestos por Kmiec I o Kmiec II.
La oligonucleobase recombinagénica es un
oligonucleótido doble mezclado que es enlazado únicamente por
enlaces de fosfodiéster no sustituidos. En una alternativa, el
enlace se realiza por fosfodiésters sustituidos, derivados de
fosfodiéster y enlaces sin base de fósforo como expuesto por Kmiec
II. De manera alternativa, cada nucleótido de tipo ARN en el
oligonucleótido doble mezclado es un nucleótido sustituido 2'. Los
ribonucleótidos substituidos 2' puede ser ribonucleótidos
sustituidos 2'-fluoro, 2'-metoxi,
2-propiloxi, 2'-alliloxi,
2-hidroxiletiloxi, 2'-metoxietiloxi,
2'-fluoropropiloxi y
2'-trifluoropropiloxi. Los ribonucleótidos
2'-substituidos preferidos son
2'-fluoro, 2-metoxi,
2'-metoxietiloxi, y nucleótidos sustituidos
2'-alliloxi. De forma alternativa el
oligonucleótido doble mezclado es enlazado por enlaces de
fosfodiéster sin sustituir.
\newpage
Aunque el oligonucleótido doble mezclado que
posee sólo un único tipo de nucleótido de tipo ARN substituido en
posición 2' sea sintetizado de manera más apropiada, los métodos
pueden ser practicados con oligonucleótidos dúplex mezclados que
poseen dos o más tipos de nucleótidos de tipo ARN. La función de un
segmento de ARN puede no ser afectada por una interrupción causada
por la introducción de un deoxinucleótido entre dos trinucleótidos
de tipo ARN, por lo que, los términos segmento de ARN define tal
"segmento de ARN interrumpido". Un segmento de ARN no
interrumpido es llamado segmento de ARN contiguo. En una forma de
realización alternativa un segmento de ARN puede contener
nucleotidos alternantes resistentes a la ribonucleasa y
2'-OH no sustituidos. Los oligonucleótidos dúplex
mezclados tienen preferiblemente menos de 100 nucleótidos y más
preferiblemente menos de 85 nucleótidos, pero más de 50 nucleótidos.
Las primera y segunda cadenas son pares de bases
Watson-Crick. Las cadenas del oligonucleótido dúplex
mezclado son unidas de forma covalente por un enlazador, tal como
una hexa, penta o tetranucleótido monocatenario de modo que las
primera y segunda cadenas son segmentos de una cadena de
oligonucleótidos única con un extremo 3' único y 5' único. Los
extremos 3' y 5' pueden se protegidos por la adición de un "tope
de retorno" por el que los nucleótidos de terminales 3' y 5' son
apareados Watson-Crick con nucleótidos contiguos. Un
segundo tope de retorno puede, adicionalmente, estar dispuesto en la
unión entre las primera y segunda cadenas lejos de las extremidades
3' y 5', de modo que el apareamiento Watson-Crick
entre las primera y segunda cadenas sea
estabilizado.
estabilizado.
Los primeros y segundos hilos contienen dos
regiones que son homologas con dos fragmentos del gen EPSPS
objetivo, es decir que tiene la misma secuencia que el gen objetivo.
Una región homologa contiene los nucleótidos de un segmento de ARN y
pueden contener uno o más nucleótidos tipo ADN de segmento de
conexión de ADN y también pueden contener nucleótidos de tipo ADN
que no se encuentran dentro del segmento de ADN intermedio. Las dos
regiones de homología son separadas por, y cada una es contigua a,
una región que posee una secuencia diferente a la secuencia del gen
objetivo, denominada "región heteróloga". La región heteróloga
puede contener uno, dos o tres nucleótidos desequilibrados. Los
nucleótidos desequilibrados pueden ser contiguos o de forma
alternativa pueden estar separados por uno o dos nucleótidos que son
homólogos al gen objetivo. De forma alternativa, la región
heteróloga también puede contener una inserción o uno, dos, tres o
cinco, o menos nucleótidos. De forma alternativa, la secuencia de
oligonucleótido dúplex mezclado puede diferir de la secuencia del
gen objetivo sólo por deleción de uno, dos, tres, o cinco o menos
nucleótidos del oligonucleótido dúplex mezclado. La longitud y
posición de la región heteróloga se define, en este caso, como la
longitud de la deleción, aunque ninguno de los nucleótidos del
oligonucleótido dúplex mezclado se encuentran dentro de la región
heteróloga. La distancia entre los fragmentos del gen objetivo que
son complementarios a las dos regiones homologas es idéntica a la
longitud de la región heteróloga cuando se prevé una sustitución o
sustituciones. Cuando la región heteróloga contiene una inserción,
las regiones homologas son así más separadas en el oligonucleotido
dúplex mezclado que sus fragmentos homólogos complementarios en el
gen, y lo contrario es aplicable cuando la región heteróloga
codifica una deleción.
Los segmentos de ARN de los oligonucleótidos
dúplex mezclados son cada uno una parte de una región homologa, es
decir, una región que es idéntica en secuencia a un fragmento del
gen objetivo, los cuales segmentos juntos contienen preferiblemente
al menos 13 nucleótidos de tipo ARN y preferiblemente 16 a 25
nucleótidos de tipo ARN o aún más preferiblemente
18-22 nucleótidos de tipo ARN o mucho más
preferiblemente 20 nucleótidos. En una forma de realización, los
segmentos de ARN de las regiones de homología son separados por y
contiguos a, es decir, "conectados por" un segmento de ADN
intermedio. En una forma de realización, cada nucleótido de la
región heteróloga es un nucleótido del segmento de ADN intermedio.
Un segmento de ADN intermedio que contiene la región heteróloga de
un oligonucleótido dúplex mezclado se denomina "segmento
mutador".
El cambio a introducir en el gen EPSPS objetivo
es codificado por la región heteróloga. El cambio a introducir en el
gen EPSPS puede ser un cambio en una o más bases de la secuencia de
gen EPSPS o la adición o deleción de una o más bases.
De forma alternativa, la oligonucleobase
recombinagénica es un vector mutacional de oligodeoxinucleótido
monocatenario o SSOMV, que se divulga en la solicitud de patente
internacional PCT/US00/23457. La secuencia del SSOMV se basa en los
mismos principios que los vectores mutacionales que se describen en
las patentes estadounidenses nº 5,756,325; 5,871,984; 5,760,012;
5,888,983; 5,795,972; 5, 780,296; 5,945,339; 6,004,804; y 6,010,907
y en las publicaciones internacionales nº WO 98/49350; WO 99/07865;
WO 99/58723; WO 99/58702; y WO 99/40789. La secuencia del SSOMV
contiene dos regiones que son homologas con la secuencia objetivo
separada por una región que contiene la alteración genética deseada
llamada región mutadora. La región mutadora puede tener una
secuencia que presenta la misma longitud que la secuencia que separa
las regiones homologas en la secuencia objetivo, pero que posee una
secuencia diferente. Tal región mutadora puede causar una
sustitución. De forma alternativa, las regiones homologas en el
SSOMV pueden ser contiguas entre sí, mientras que las regiones en el
gen objetivo que poseen la misma secuencia son separadas por uno,
dos o más nucleótidos. Tal SSOMV causa una deleción de los
nucleótidos del gen objetivo que están ausentes del SSOMV.
Finalmente, la secuencia del gen objetivo que es idéntica a las
regiones homologas puede ser contigua en el gen objetivo pero
separada por uno, dos o más nucleótidos en la secuencia del SSOMV.
Tal SSOMV causa una inserción en la secuencia del gen objetivo.
Los nucleótidos del SSOMV son
desoxiribonucleótidos que son enlazados por enlaces de fosfodiéster
no modificados con la excepción de que el enlace internucleótido de
terminal 3' y/o terminal 5' o de forma alternativa los dos enlaces
internucleótidos de terminal 3' y/o terminal 5' pueden ser un
fosforotioato o fosfoamidato. Como se utiliza aquí, un enlace
internucleótido es el enlace entre nucleótidos del SSOMV y no
incluye el enlace entre el nucleótido de extremo 3' o nucleótido de
extremo 5' y un sustituyente de bloqueo, ver supra. La
longitud del SSOMV está entre 21 y 55 deoxinucleótidos y las
longitudes de las regiones de homología son, por consiguiente, una
longitud total de al menos 20 deoxinucleótidos y al menos dos de las
regiones de homología deben tener cada una unas longitudes de al
menos 8 deoxinucleótidos.
El SSOMV puede ser diseñado para ser
complementario a cualquiera cadena codificante o no codificante del
gen objetivo. Cuando la mutación deseada es una sustitución de base
única, se prefiere que ambos nucleótido mutador sean pirimidina. En
la medida en que se consigue obtener el resultado funcional deseado
se prefiere el hecho de que tanto el nucleótido mutador como el
nucleótido objetivo en la cadena complementaria sean pirimidinas. Se
prefieren particularmente los SSOMV que codifican mutaciones de
transversión, es decir que un nucleótido mutador C o T es mal
apareado, respectivamente, con un nucleótido C o T en la cadena
complementaria.
Además del oligodeoxinucleótido, el SSOMV puede
contener un sustituyente de bloqueo 5' que es conectado con los
carbonos de terminal 5' a través de un enlazador. La composición
química del enlazador no es decisiva, a parte de su longitud que
debe tener preferiblemente al menos 6 átomos de largo y de que el
enlazador debe ser flexible. Una variedad de sustituyentes no
tóxicos como la biotina, colesterol u otros esteroides o un
colorante fluorescente catiónico no intercalante, pueden ser
utilizados. Los reactivos particularmente preferidos para producir
SSOMV son los reactivos vendidos como Cy3^{TM} y CyS^{TM} por
Glen Research, Sterling VA, que son fosforamiditas bloqueadas que
durante su incorporación en un oligonucleótido producen colorantes
de indomonocarbocianina e indodicarbocianina sustituidos
3,3,3'.3'-tetrametil
N,N'-isopropilo, respectivamente. Cy3 es el más
preferido. Cuando la indocarbocianina es sustituida por
N-oxialquilo, ésta puede ser enlazada adecuadamente
al terminal 5' del oligodeoxinucleótido a través de un fosfodiéster
con un fosfato de terminal 5'. La composición química del enlazador
colorante entre el colorante y el oligodeoxinucleótido no es
decisiva y se elige por conveniencia sintética. Cuando la
fosforamidita Cy3 disponible comercialmente es usada tal y como se
indica, la modificación 5' resultante consiste en un sustituyente de
bloqueo y el enlazador juntos que son una indomonocarbocianina
N-hidroxipropilo,
N'-fosfatidilpropilo
3,3,3'.3'-tetrametilo.
El colorante de indocarbocianina puede ser tetra
sustituido en las posiciones 3 y 3' de los anillos de indol. Sin
limitación en cuanto a la teoría, éstas sustituciones impiden que el
colorante sea un colorante intercalante. La identidad de los
sustituyentes en éstas posiciones no es decisiva. Los SSOMV pueden
además tener un sustituyente de bloqueo 3'. De nuevo, la química del
sustituyente de bloqueo 3' no es crítica.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización de la presente
invención, el gen EPSPS de Arabidopsis thaliana (ver figura
1A) y la enzima EPSPS correspondiente (ver figura 1B) comprende una
mutación en uno o más residuos de aminoácidos seleccionados en el
grupo que consiste en Leu_{173}, Gli_{177}, Tr_{178},
Ala_{179}, Met_{180}, Arg_{181}, Pro_{182}, Ser_{98},
Ser_{225} y Leu_{198}, o en un residuo de aminoácido análogo en
un gen EPSP de otra especie, y la mutación produce una o más de las
siguientes sustituciones de aminoácidos en la enzima EPSPS en
comparación con la secuencia de tipo salvaje:
- (i)
- Leu_{173}-Phe
- (ii)
- Gli_{177}-Ala o Ile
- (iii)
- Tr_{178}-Ile o Val o Leu
- (iv)
- Ala_{179}-Gly
- (v)
- Met_{180}-Cys
- (vi)
- Arg_{181}-Leu o Ser
- (vii)
- Pro_{182}-Leu o Ser
- (viii)
- Ser_{98}-Asp
- (ix)
- Ser_{255}-Ala
- (x)
- Leu_{198}-Lys.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización de la presente
invención, dentro del producto genético EPSPS, el residuo de
aminoácido que debe ser sustituido es Leu dentro de la secuencia
contigua
Leu-Tyr-Leu-Gly-Asn
(SEC ID NO:29) y es sustituido por Phe; o el residuo de aminoácido
que debe ser sustituido es Gly dentro de la secuencia contigua
Asn-Ala-Gly-Thr-Ala
(SEC ID NO:30) y es sustituido por Ala o Ile; o el aminoácido que
debe ser sustituido es Thr dentro de la secuencia contigua
Ala-Gly-Thr-Ala-Met
(SEC ID NO:31) y es sustituido por Ile, Val o Leu; o el aminoácido
que debe ser sustituido es Ala dentro de la secuencia contigua
Gly-Thr- Ala-Met-Arg
(SEC ID NO:32) y es sustituido por Gly; o el aminoácido que debe ser
sustituido es Met dentro de la secuencia contigua
Thr-Ala-Met-Arg-Pro
(SEC ID NO:33) y es sustituido por Cys; o el aminoácido que debe ser
sustituido es Arg dentro de la secuencia contigua
Ala-Met-Arg-Pro-Leu
(SEC ID NO:34) y es sustituido por Leu o Ser; o el aminoácido que
debe ser sustituido es Pro dentro de la secuencia contigua
Met-Arg-Pro-Leu-Thr
(SEC ID NO:35) y es sustituido por Leu o Ser; o el aminoácido que
sustituir es Ser dentro de un contiguo
Pro-Gly-Ser-Lys-Ser
(SEC ID NO:36) y es sustituido por Asp; o el aminoácido que
sustituir es Ser dentro de la secuencia contigua
lle-Ser-Ser-Gln-Tyr
(SEC ID NO:37) y es sustituido por Ala; o el aminoácido que debe ser
sustituido es Leu dentro de la secuencia contigua
Tyr-Val-Leu-Asp-Gly
(SEC ID NO:38) y es sustituido por Lys. En otras versiones, una o
más de las sustituciones precedentes pueden realizarse en la
secuencia de aminoácidos EPSPS.
De forma alternativa, y/o adicionalmente, la
mutación puede implicar la sustitución de cualquiera de los
aminoácidos en posiciones correspondientes a 256,
284-288 y 353-356 con respecto a la
proteína EPSPS representada en la figura 1B (SEC ID NO.2).
De forma alternativa, el gen EPSPS es mutado en
la posición del aminoácido 177 en la que Gly es sustituido por Ala.
De forma alternativa existe la sustitución de Thr en la posición del
aminoácido 178 por Ile. De forma alternativa una mutación en la
posición del aminoácido 177 en la que Gly es sustituido por Ala, más
la sustitución adicional de Thr en la posición del aminoácido 178
por Ile. De forma alternativa mutaciones en la posición del
aminoácido 178, en la que Thr es sustituido por Ile, más la mutación
adicional en la posición 182, en la que Pro es sustituido por Ser.
De forma alternativa incluye la sustitución de Gly en la posición
del aminoácido 177 por Ala, más la mutación adicional en la posición
del aminoácido 182, en la que Pro es sustituido por Ser. Otras
secuencias de EPSPS mutado comprenden la sustitución de Gly en la
posición 177 por Ala, más la sustitución en la posición 178, en la
que Thr es sustituido por Ile, más la sustitución adicional de Pro
en la posición del aminoácido 182 por Ser. De forma alternativa la
sustitución de Thr en la posición del aminoácido 178 por Val y la
mutación adicional en la posición del aminoácido 182, en la que Pro
es sustituido por Ser. De forma alternativa la sustitución de Thr en
la posición 178 por Leu está incluida más la mutación en la posición
del aminoácido 182, en la que Pro es sustituido por Ser. Otra forma
de realización incluye, la sustitución en la posición del aminoácido
177 en la que Gly es sustituido por Ala, más la sustitución de Thr
en la posición 178 por Val. La sustitución en la posición del
aminoácido 177 en la que Gly es sustituido por Ala, más la
sustitución de Thr en la posición del aminoácido 178 por Leu (ver
figura 2).
Las mutaciones precedentes en el gen EPSPS se
describieron utilizando el gen EPSPS de Arabidopsis thaliana
(SEC ID NO:1) y proteína (SEC ID NO:2). La presente invención
también incluye genes EPSPS mutantes de otra especie. No obstante,
debido a variaciones en los genes EPSPS de diferentes especies, el
número del residuo de aminoácido que debe ser sustituido por una
especie puede ser diferente en otra especie. Sin embargo, la
posición análoga es identificada fácilmente por un experto en la
técnica por homología secuencial. Por ejemplo, la figura
3A-C muestra las secuencias de nucleótidos alineadas
y la figura 4 muestra las secuencias de aminoácidos alineadas de
cuatro genes EPSPS de Arabidopsis thaliana, Zea Mays, Petunia
hybrida, y Brassica napus. Así, las posiciones análogas
en Zea Mays son Leu_{97}, Gli_{101}, Tr_{102},
Ala_{103}, Met_{104}, Arg_{105}, Pro_{106}, Ser_{23},
Ser_{179} y Leu_{122}. Por lo que la secuencia de aminoácidos
EPSPS de Zea Mays es mutada en una o más de las siguientes
posiciones de aminoácidos y resulta en una o más de las siguientes
sustituciones:
- (i)
- Leu_{97}-Phe
- (ii)
- Gly_{101}-Ala o Ile
- (iii)
- Tr_{102}-Me o Val o Leu
- (iv)
- Ala_{103}-Gly
- (v)
- Met_{104}-Cys
- (vi)
- Arg_{105}-Leu o Ser
- (vii)
- Pro_{106}-Leu o Ser
- (viii)
- Ser_{23}-Asp
- (ix)
- Ser_{179}-Ala
- (x)
- Leu_{122}-Lys.
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro del producto de gen EPSPS de Zea
mays el residuo de aminoácido que debe ser sustituido es Leu
dentro de la secuencia contigua
Leu-Phe-Leu-Gly-Asn
(SEC ID NO:39) y es sustituido por Phe; o el residuo de aminoácido
que debe ser sustituido es Gly dentro de la secuencia contigua
Asn-Ala-Gly-Thr-Ala
(SEC ID NO:30) y es sustituido por Ala o Ile; o el aminoácido que
debe ser sustituido es Thr dentro de la secuencia contigua
Ala-Gly-Thr-Ala-Met
(SEC ID NO:31) y es sustituido por Ile, Val o Leu; o el aminoácido
que debe ser sustituido es Ala dentro de la secuencia contigua
Gly-Thr-Ala-Met-Arg
(SEC ID nº: 32) y es sustituido por Gly; o el aminoácido que debe
ser sustituido es Met dentro de la secuencia contigua
Thr-Ala-Met-Arg-Pro
(SEC ID NO:33) y es sustituido por Cys; o el aminoácido que debe ser
sustituido es Arg dentro de la secuencia contigua
Ala-Met-Arg-Pro-Leu
(SEC ID NO:34) y es sustituido por Leu o Ser; o el aminoácido que
debe ser sustituido es Pro dentro de la secuencia contigua
Met-Arg-Pro-Leu-Thr
(SEC ID NO:35) y es sustituido por Leu o Ser; o el aminoácido que
debe ser sustituido es Ser dentro de una secuencia contigua
Pro-Gly-Ser-Lys-Ser
(SEC ID NO:36) y es sustituido por Asp; o el aminoácido que debe ser
sustituido es Ser dentro de la secuencia contigua
lle-Ser-Ser-Gln-Tyr
(SEC ID NO:37) y es sustituido por Ala; o el aminoácido que debe ser
sustituido es Leu dentro de la secuencia contigua
Tyr-Val-Leu-Asp-Gly
(SEC ID NO:38) y que debe ser sustituido por Lys. De forma
alternativa, una o más de las sustituciones precedentes pueden ser
realizados en la secuencia EPSPS de los aminoácidos.
En Brassica napus, las posiciones
análogas de aminoácidos son Leu_{169}, Gli_{173}, Tr_{174},
Ala_{175}, Met_{176}, Arg_{177}, Pro_{178}, Ser_{94},
Ser_{251}, y Leu_{194}. Así, la secuencia de aminoácidos EPSPS
de Brassica napus es mutada en una o más de las siguientes
posiciones de aminoácidos y resulta en una o más de las siguientes
sustituciones:
- (i)
- Leu_{169}-Phe
- (ii)
- Gli_{173}-Ala o Ile
- (iii)
- Tr_{174}-Ile o Val o Leu
- (iv)
- Ala_{175}-Gly
- (v)
- Met_{176}-Cys
- (vi)
- Arg_{177}-Leu o Ser
- (vii)
- Pro_{178}-Leu o Ser
- (viii)
- Ser_{94}-Asp
- (ix)
- Ser_{251}-Ala
- (x)
- Leu_{194}-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro del producto genético EPSPS de
Brassica napus el residuo de aminoácido que debe ser
sustituido es Leu dentro de la secuencia contigua
Leu-Tyr-Leu-Gly-Asn
(SEC ID NO:29) y es sustituido por Phe; o el residuo de aminoácido
que debe ser sustituido es Gly dentro de la secuencia contigua
Asn-Ala-Gly-Thr-Ala
(SEC ID NO:30) y es sustituido por Ala o Ile; o el aminoácido que
debe ser sustituido es Thr dentro de la secuencia contigua
Ala-Gly-Thr-Ala-Met
(SEC ID NO:31) y es sustituido por Ile, Val o Leu; o el aminoácido
que debe ser sustituido es Ala dentro de la secuencia contigua
Gly-Thr-Ala-Met-Arg
(SEC ID nº: 32) y es sustituido por Gly; o el que debe ser
sustituido es Met dentro de la secuencia contigua
Thr-Ala-Met-Arg-pro
(SEC ID NO:33) y es sustituido por Cys; o el aminoácido que debe ser
sustituido es Arg dentro de la secuencia contigua
Ala-Met- Arg-pro-Leu
(SEC ID NO:34) y es sustituido por Leu o Ser; o el aminoácido que
debe ser sustituido es Pro dentro de la secuencia contigua
Met-Arg-Pro-Leu-Thr
(SEC ID NO:35) y es sustituido por Leu o Ser; o el aminoácido que
debe ser sustituido es Ser dentro de un contiguo
Pro-Gly-Ser-Lys-Ser
(SEC ID NO:36) y es sustituido por Asp; o el aminoácido que debe ser
sustituido es Ser dentro de la secuencia contigua
Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr
(SEC ID NO:37) y es sustituido por Ala; o el aminoácido que debe
ser sustituido es Leu dentro de la secuencia contigua
Tyr-Val-Leu-Asp-Gly
(SEC ID NO:38) y es sustituido por Lys. De forma alternativa, una o
más de las sustituciones precedentes pueden realizarse en la
secuencia de aminoácidos EPSPS.
En Petunia hybrida las posiciones
análogas son Leu_{169}, Gli_{173}, Tr_{174}, Ala_{175},
Met_{176}, Arg_{177}, Pro_{178}, Ser_{94}, Ser_{251} y
Leu_{194}. Así, la secuencia de aminoácidos EPSPS de Petunia
hybrida es mutada en una o más de las siguientes posiciones de
aminoácidos y resulta en una o más de las siguientes
sustituciones:
- (i)
- Leu_{169}-Phe
- (ii)
- Gli_{173}-Ala o Ile
- (iii)
- Tr_{174}-Ile o Val o Leu
- (iv)
- Ala_{175}-Gly
- (v)
- Met_{176}-Cys
- (vi)
- Arg_{177}-Leu o Ser
- (vii)
- Pro_{178}-Leu o Ser
- (viii)
- Ser_{94}-Asp
- (ix)
- Ser_{251}-Ala
- (x)
- Leu_{194}-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro del producto genético EPSPS de Petunia
hybrida el residuo de aminoácido que debe ser sustituido es Leu
dentro de la secuencia contigua
Leu-Phe-Leu-Gly-Asn
(SEC ID NO:39) y es sustituido por Phe; o el residuo de aminoácido
que debe ser sustituido es Gly dentro de la secuencia contigua
Asn-Ala-Gly-Thr-Ala
(SEC ID NO:30) y es sustituido por Ala o Ile; o el aminoácido que
debe ser sustituido es Thr dentro de la secuencia contigua
Ala-Gly-Thr-Ala-Met
(SEC ID NO:31) y es sustituido por Ile, Val o Leu; o el aminoácido
que debe ser sustituido es Ala dentro de la secuencia contigua
Gly-Thr-Ala-Met-Arg
(SEC ID nº: 32) y es sustituido por Gly; o el aminoácido que debe
ser sustituido es Met dentro de la secuencia contigua
Thr-Ala-Met-Arg-Pro
(SEC ID NO:33) y es sustituido por Cys; o el aminoácido que debe ser
sustituido es Arg dentro de la secuencia contigua
Ala-Met-Arg-Pro-Leu
(SEC ID NO:34) y es sustituido por Leu o Ser; o el aminoácido que
debe ser sustituido es Pro dentro de la secuencia contigua
Met-Arg-Pro-Leu-Thr
(SEC ID NO:35) y es sustituido por Leu o Ser; o el aminoácido que
debe ser sustituido es Ser dentro de una secuencia contigua
Pro-Gly-Ser-Lys-Ser
(SEC ID NO:36) y se cambia a Asp; o el aminoácido que debe ser
sustituido es Ser dentro de la secuencia contigua
lle-Ser-Ser-Gln-Tyr
(SEC ID NO:37) y es sustituido por Ala; o el aminoácido que debe ser
sustituido es Leu dentro de la secuencia contigua
Tyr-Val-Leu-Asp-Gly
(SEC ID NO:38) y es sustituido por Lys. De forma alternativa, una o
más de las sustituciones precedentes pueden realizarse en la
secuencia de aminoácidos EPSPS.
\vskip1.000000\baselineskip
Cualquier método comúnmente conocido puede ser
usado en los métodos de la presente invención para transformar una
célula vegetal con una oligonucleobase recombinagénica. Se enumeran
métodos ilustrativos a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
El uso de microsoportes metálicos (microesferas)
para la introducción de grandes fragmentos de ADN en células
vegetales que tienen paredes celulares de celulosa por penetración
de proyectiles es bien conocida por los expertos en la técnica (a
partir de ahora, entrega biolística). Las patentes estadounidenses
nº 4,945,050, 5,100,792 y 5,204,253 describen técnicas generales
para seleccionar microsoportes y dispositivos para su
proyección.
Condiciones específicas para el uso de
microsoportes en los métodos de la presente invención se describen
en la Publicación Internacional WO 99/07865. En una técnica
ilustrativa, microsoportes congelados (60 mg/ml), oligonucleótido
dúplex mezclado (60 mg/ml) 2.5 M de CaCl_{2} y 0.1 M de
espermidina son agregados en ese orden; la mezcla es agitada
suavemente, por ejemplo, en forma de remolino, durante 10 minutos y
se deja reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, con lo
cual los microsoportes son diluidos en 5 volúmenes de etanol,
centrifugados y resuspendidos en 100% de etanol. Se pueden obtener
buenos resultados con una concentración en la solución de adherencia
de 8-10 \mug/\mul de microsoportes, 14 17
\mug/ml de oligonucleótido dúplex mezclado,
1.1-1.4 M de CaCl_{2} y 18-22 mM
de espermidina. Se observaron resultados óptimos en las condiciones
de 8 \mug/\mul de microsoportes, 16. 5 \mug/ml de
oligonucleótido dúplex mezclado, 1.3 M de CaCl_{2} y 21 mM de
espermidina.
Las oligonucleobases recombinagénicas también se
pueden introducir en células vegetales para la práctica de la
presente invención utilizando microfibras para penetrar en la pared
celular y membrana celular. La patente EEUU nº 5,302,523 de Coffee
et al. describe el uso de 30 X 0,5 \mum y 10 X 0,3 \mum
de fibras de carburo de silicona para facilitar la transformación de
cultivos de maíz de suspensión de Black Mexican Sweet. Cualquier
técnica mecánica que puede se utilizar para introducir ADN para la
transformación de una célula vegetal ser puede usada para la entrega
de oligonucleobase recombinagénica para su transmutación.
Una técnica ilustrativa para la entrega de
microfibras de una oligonucleobase recombinagénica es la siguiente:
microfibras estériles (2 \mug) son suspendidas en 150 \mul de
medio de cultivo vegetal comprendiendo aproximadamente 10 \mug de
un oligonucleótido dúplex mezclado. Se deja reposar un cultivo en
suspensión y unos volúmenes iguales de células empaquetadas y la
suspensión de fibras/nucleótidos estéril son removidas durante 10
minutos y dispuestas en placas. Unos medios selectivos son aplicados
inmediatamente o con un retraso de hasta aproximadamente 120 horas
según lo apropiado para la característica particular.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización alternativa, la
oligonucleobase recombinagénica puede ser entregada a la célula
vegetal por electroporación de un protoplasto derivado de una parte
de planta. Los protoplastos son formados por tratamiento enzimático
de una parte de planta, particularmente una hoja, según técnicas
bien conocidas por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo,
Gallois et al., 1996, en Methods in Molecular Biology
55:89-107, Humana Press, Totowa, NJ; Kipp et
al., 1999, en Methods in Molecular
Biology.133:213-221, Humana Press, Totowa, NJ. Los
protoplastos no necesitan ser cultivados en medios de crecimiento
antes de la electroporación. Unas condiciones ilustrativas para la
electroporación son 3 X 10^{5} protoplastos en un volumen total de
0.3 ml con una concentración de oligonucleobase recombinagénica de
entre 0.6-4 \mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
También en otra forma de realización
alternativa, la oligonucleobase recombinagénica puede ser entregada
a la célula vegetal por triquitos o microinyección de la célula
vegetal. La técnica de triquitos se realiza esencialmente tal y como
se describe en Frame et al., 1994, Plant J.
6:941-948. La oligonucleobase recombinagénica es
añadida a los triquitos y es usada para transformar las células
vegetales. La oligonucleobase recombinagénica puede ser coincubada
con plásmidos que comprenden secuencias de codificación de proteínas
capaces de formar complejos de recombinasa en células vegetales de
tal forma que la recombinación es catalizada entre el
oligonucleótido y la secuencia objetivo en el gen EPSPS.
\vskip1.000000\baselineskip
Las plantas o células vegetales pueden ser
evaluadas por resistencia o tolerancia a una herbicida utilizando
métodos comúnmente conocidos en la técnica, por ejemplo, por
crecimiento de la planta o célula vegetal en presencia de un
herbicida y medición del nivel de crecimiento en comparación con el
índice de crecimiento en la ausencia del herbicida.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes experimentos demuestran la
producción de genes EPSPS de Thaliana arabidopsis mutantes
que son resistentes al glifosato herbicida y que permite que las
células vegetales mantengan un índice de crecimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Un fragmento de ADN de 1.3 kb se amplificó por
PCR a partir de una biblioteca de ADNc de Arabidopsis
utilizando los cebadores AtEXPEXPM1 y AtEXPEXP2CM-2.
Los dos cebadores se diseñaron para amplificar el ADNc desde el
péptido maduro hasta el codón de terminación. El cebador
5'AtEXPEXPM1 contiene un sitio XbaI (subrayado) y el cebador 3'
AtEXPEXP2CM-2 contiene un sitio BglII, (subrayado),
sitios que serán útiles para la clonación del fragmento en el vector
de expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
AtEXPEXPM1
5'-GCTCTAGAGAAAGCGTCGGAGATTGTACTT-3'
(SEC ID NO:40)
\vskip1.000000\baselineskip
AtEXPEXP2CM-2
5'-GCAGATCTGAGCTCTTAGTGCTTTGTGATTCTTTCAAGTAC-3'(SEC
ID NO:41)
\vskip1.000000\baselineskip
La banda de PCR fue extirpada del gel de agarosa
y purificada (GeneClean, Biol). Su secuencia fue confirmada entonces
como la secuencia peptídica madura del gen EPSPS de Arabidopsis
thaliana.
\vskip1.000000\baselineskip
La región de codificación EPSPS del gen de
AroE bacillus subtilis se obtuvo por PCR usando los
siguientes cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
BsAroE5'Xba
5'-GCGTCTAGAAAAACGAGATAAGGTGCAG-3'
(SEC ID NO:42) y
\vskip1.000000\baselineskip
BsAroE3'BamHI
5-GCGGATCCTCAGGATTTTTTCGAAAGCTTATTTAAATG-3'
(SEC ID NO:43).
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de PCR, sin codón iniciador (ATG),
fue clonado en el marco del vector pACLaclMH6RecA por sustitución
del ORF de RecA por digestión con XbaI y BamHI.
PACLaclMH6RecA contenía la región Lacl de Pet21 en las posiciones
1440 a 3176, el MH6 RecA en posiciones 3809 a 5188, gen resistente
al cloranfenicol en posiciones 5445 218 (5446 a 5885 y 1 a 218), y
el origen p15A de replicación en posiciones 581 1 a 1424. El gen
RecA de la región de codificación fue clonado de E. coli en
el marco con el codón de inicio y enlazador de histidina 6 (MH6)
detrás del promotor LacZ de pUC19.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de PCR 1.3 kb de Arabidopsis
fue digerido con XbaI y BamHI (compatible con BglII) y clonado en el
plásmido pACiCLaclMH6EPSPS, en lugar del gen de Bacillus.
Los clones obtenidos (seleccionados en
cloranfenicol) fueron secuenciados después y positivos confirmados.
Uno de los clones confirmados (pAtEPS-12) fue
seleccionado y las uniones entre el ADNc y el plásmido de la
clonación también fueron confirmadas como idénticas a las secuencias
esperadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Diez mutantes diferentes del gen EPSPS de
Arabidopsis thaliana fueron diseñados, (ver figura 2). Para
los experimentos de mutagénesis, se diseñaron cebadores de PCR con
una, dos o tres mutaciones. Las reacciones PCR se realizaron usando
un cebador flanqueador ordinario (5'ATEPS-198:
5'-GAAAGCGTCGGAGATTGTAC-3' (SEC ID
NO:44)) y uno de los cebadores de soporte de mutación (ver figura
5).
Los fragmentos de PCR de 353bp obtenidos fueron
purificados (kit de purificación de PCR Qiagen) y su secuencia
confirmada. Los fragmentos fueron digeridos después con PstI
(subrayado en las secuencias de cebador) y BamHI y ligados al vector
pAtEPS-12, el cual había sido previamente digerido
con PstI y células competente BamHI.JM 109 (Promega) fueron usadas
para la transformación y dispuestas en placas en placas LB
comprendiendo cloranfenicol. Unos clones de cada experimento de
mutagénesis fueron aislados después y su secuencia fue
confirmada.
\vskip1.000000\baselineskip
Unas células electrocompetentes de SA4247, una
cepa de Salmonella tifi LacZ, fueron preparadas según unos
procesos bien conocidos.(ver Current Protocols en Molecular Biology,
(Wiley and Sons, Inc.)). 30 \mul de células competentes SA4247
fueron electroporados con 20 ng de cada proteína de ADN de plásmido
codificante de Arabidopsis de tipo salvaje y de EPSPS
mutantes, EPSPS tipo salvaje de Bacillus, junto con una
transfección simulada en forma de control. Los ajustes para la
electroporación fueron de 25 \muF, 2.5 KV y 200 ohmios. Después de
la electroporación, las células fueron transferidas a tubos de
cultivo de 15 ml y se les añadió 970 \mul de medio SOC. Los
cultivos fueron incubados durante 1 hora y media a 37ºC a 225
r.p.m.. 50 \mul de cada cultivo fueron dispuestos en placas en
placas LB con 17 \mug/ml conteniendo cloranfenicol (en duplicados)
e incubados durante toda la noche a 37ºC. Al día siguiente, 5
colonias de cada placa fueron seleccionadas y trasladadas a placas
M9 e incubadas durante toda la noche a 37ºC.
Las colonias de la incubación durante toda la
noche en M9 sólido, fueron inoculadas en 4 ml de líquido medio M9 y
dispuestas en crecimiento toda la noche a 37ºC. Al día siguiente, 25
ml de medio M9 líquido conteniendo cloranfenicol, IPTG y 17 mM o 0
mM de Glifosato (Aldrich, 33775-7) fueron inoculados
con 1-2 ml de cada cultivo durante toda la noche (en
duplicados), el OD de inicio (a 600 nm) fue medido y todos los
cultivos fueron normalizados para iniciarse en el mismo OD. Una
medición de OD fue tomada cada hora durante siete horas. Como un
control del crecimiento bacteriano, un cultivo de Salmonella
no transformado fue inoculado también en un medio LB simple. En dos
experimentos independientes, los clones A_{177} I_{178},
A_{177} V_{178} A_{177} L_{178} y I_{177} no crecieron en
medio M9, por lo que no se pudieron realizar los ensayos de
resistencia al glifosato.
\vskip1.000000\baselineskip
Un mililitro de cultivo durante toda la noche de
cada uno de los clones bacterianos es inoculado en 100 ml de medio
LB líquido conteniendo cloranfenicol. Las células pudieron crecer a
37ºC hasta alcanzar un OD de 0.5-0.7
(aproximadamente 3 horas y media). Se añadió después IPTG a los
cultivos en una concentración de 1.0 mM. Las células fueron
dispuestas en crecimiento durante cinco horas más. Y éstas fueron
después granuladas a 4000 r.p.m. durante 20 minutos a 4ºC.
El aislamiento y la purificación de las
proteínas marcadas con histidina se realizaron siguiendo el sistema
Qiagen Ni-NTA Protein Purification System. Lisatos y
eluatos de células fueron formados en duplicados en geles de
archilamida a 12.5%. Uno de los geles era teñido con plata para su
visualización inmediata, el segundo gel fue transferido sobre una
membrana Millipore Immobilon-P, y bloqueado durante
toda la noche en 5% de leche en TBS-T. La membrana
fue expuesta después a la solución de anticuerpos primarios
Anti-His (Amersham Pharmacia Biotech, cat#
37-4710), seguido de una exposición a la solución de
anticuerpos secundarios
Anti-Mouse-lgG. (NIF825, de sistema
de análisis por transferencia Western ECL de Amersham Pharmacia
Biotech, cat# RPN2108). Se realizaron lavados y reacciones de
detección según las instrucciones del fabricante. Se desarrollaron
autoradiogramas después de 5 minutos de exposición.
\vskip1.000000\baselineskip
Unas células conteniendo una mutación en el gen
EPSPS produjo células que eran a la vez resistentes al glifosato
herbicida, y que tenían un índice de crecimiento sustancialmente
similar en ausencia o presencia de glifosato, en comparación con las
células de tipo salvaje, sin tener en cuenta la presencia de
glifosato (ver figura 6).
También se demostró que los clones de
Arabidopsis conteniendo un gen EPSPS mutante expresaba la
proteína mutante sustancialmente al mismo nivel que la proteína de
tipo salvaje (ver figura 7).
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 2763
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 520
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)...(33)
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 4
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\hskip1cm
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<210> 5
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)...(33)
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
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<210> 7
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana
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<221> CDS
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<222> (1)...(33)
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<210> 8
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3831
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassisca napus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base-modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1...3831
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1944
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Petunia hybrida
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1335
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea Mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassisca Napus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Petunia hybrida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 444
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea Mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador mutante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Mutante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Mutante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador mutante
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Mutante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador mutante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador mutante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador mutante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador mutante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador mutante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Petunia hybrida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagaga aagcgtcgga gattgtactt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagatctga gctcttagtg ctttgtgatt ctttcaagta c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtctagaa aaacgagata aggtgcag
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggatcctc aggatttttt cgaaagctta tttaaatg
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaagcgtcg gagattgtac
\hfill20
Claims (16)
1. Método para la producción de una planta no
transgénica, que es resistente o tolerante a un herbicida de la
familia de la fosfonometilglicina comprendiendo:
- (a)
- la introducción en células vegetales de una oligonucleobase recombinagénica con una mutación objetivo en el gen EPSPS para producir células vegetales con un gen EPSPS mutante que expresa una proteína EPSP que es mutada en una o más posiciones de aminoácidos, dichas posiciones siendo seleccionadas en el grupo que consiste en Leu_{173}, Ala_{179}, Met_{180}, Arg_{181}, Ser_{98}, Ser_{255} y Leu_{198} en la proteína EPSPS de Arabidopsis o en un residuo de aminoácido análogo en un gen EPSP de otra especie;
- (b)
- la identificación de una célula vegetal que presenta un crecimiento normal, en comparación con una célula vegetal de tipo salvaje correspondiente en presencia de glifosato; y
- (c)
- la regeneración de una planta no transgénica resistente o tolerante al herbicida que posee dicho gen EPSPS mutado a partir de dicha célula vegetal;
donde la planta no transgénica, resistente o
tolerante al herbicida exhibe un crecimiento y desarrollo normales
en comparación con el de las plantas correspondientes de tipo
salvaje y donde la enzima EPSPS mutada tiene la misma actividad
catalítica en comparación con la de la enzima de tipo salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método para la producción de una planta no
transgénica, que es resistente o tolerante a un herbicida de la
familia de la fosfonometilglicina, comprendiendo:
- (a)
- la introducción en células vegetales de una oligonucleobase recombinagénica con una mutación objetivo en el gen EPSPS para producir células vegetales con un gen mutante EPSPS que expresa una proteína mutante EPSPS que es mutada en una o más posiciones de aminoácidos, dichas posiciones siendo seleccionadas en el grupo que consiste en Leu_{173}, Ala_{179}, Met_{180}, Arg_{181}, Ser_{98}, Ser_{255} y Leu_{198} en la proteína Arabidopsis EPSPS o en un residuo análogo de aminoácido en un gen EPSP de otra especie;
- (b)
- la identificación de una célula vegetal que posee una proteína EPSPS mutante que tiene la misma actividad catalítica en comparación con una proteína EPSPS correspondiente de tipo salvaje en presencia de glifosato; y
- (c)
- la regeneración de una planta no transgénica resistente o tolerante al herbicida que posee dicho gen EPSPS mutado a partir de dicha célula vegetal;
donde la planta no transgénica resistente o
tolerante al herbicida exhibe un crecimiento y desarrollo normal en
comparación con el de las plantas correspondientes de tipo salvaje,
y donde la enzima EPSPS mutada tiene la misma actividad catalítica
en comparación con la de la enzima de tipo salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método según la reivindicación 1 o 2 en el
que la oligonucleobase recombinagénica es un nucleótido dúplex
mezclado o un vector mutacional de oligodeoxinucleótido
monocatenario (SSMOV).
4. Método según la reivindicación 3 en el que el
nucleótido dúplex mezclado contiene una primera región homologa que
tiene una secuencia idéntica a la secuencia de al menos 6 pares de
bases del primer fragmento del gen EPSPS objetivo y una segunda
región homologa que tiene una secuencia idéntica a la secuencia de
al menos 6 pares de bases de un segundo fragmento del gen EPSPS
objetivo, y una región intermedia que contiene al menos una
nucleobase heteróloga al gen EPSPS objetivo, la cual región
intermedia conecta las primera y segunda regiones homologas.
5. Método según la reivindicación 1 o 2 en el
que la oligonucleobase recombinagénica es introducida por
electroporación.
6. Método según la reivindicación 1 en el que
las posiciones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que
consiste en Leu_{97}, Ala_{103}, Met_{104}, Arg_{105},
Ser_{23}, Ser_{179} y Leu_{122} en el gen EPSPS de Zea
mays.
7. Método según la reivindicación 1 en el que
las posiciones de aminoácidos son seleccionados en el grupo que
consiste en Leu_{169}, Ala_{175}, Met_{176}, Arg_{177},
Ser_{94}, Ser_{251} y Leu_{194} en el gen EPSPS de una especie
de Brassica.
8. Método según la reivindicación 1 en el que
las posiciones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que
consiste en Leu_{169}, Ala_{175}, Met_{176}, Arg_{177},
Ser_{94}, Ser_{251} y Leu_{94} en el gen EPSPS de Petunia
hybrida.
9. Método según la reivindicación 1 o 2 en el
que las células vegetales son seleccionadas en el grupo que consiste
en maíz, trigo, arroz, cebada, semilla de soja, algodón, remolacha
azucarera, colza, canola, lino, girasol, patata, tabaco, tomate,
alfalfa, álamo, pino, eucalipto, manzano, lechuga, guisantes,
lentejas, uva, césped y especie de Brassica.
10. Método según la reivindicación 2 en el que
las posiciones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que
consiste en Leu_{97}, Ala_{103} Met_{104}, Arg_{105},
Ser_{23}, Ser_{179} y Leu_{122} en el gen EPSPS de Zea
mays.
11. Método según la reivindicación 2 en el que
las posiciones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que
consiste en Leu_{169}, Ala_{175}, Met_{176}, Arg_{177},
Ser_{94}, Ser_{251} y Leu_{194} en el gen EPSPS de una especie
de Brassica.
12. Método según la reivindicación 2 en el que
las posiciones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que
consiste en Leu_{189}, Ala_{175}, Met_{176}, Arg_{177},
Ser_{94}, Ser_{251} y Leu_{194} en el gen EPSPS de Petunia
hybrida.
13. Método para la producción de una planta no
transgénica que es resistente o tolerante a un herbicida de la
familia de la fosfonometilglicina comprendiendo:
- (a)
- la introducción en células vegetales de una oligonucleobase recombinagénica con una mutación objetivo en el gen EPSPS para producir células vegetales con un gen EPSPS mutante que expresa una proteína EPSP que es mutada en dos posiciones de aminoácidos, dichas posiciones siendo seleccionadas en el grupo que consiste en Thr_{178} y Pro_{182}, en la proteína EPSPS de Arabidopsis o en un residuo de aminoácido análogo en un gen EPSP de otra especie donde el Thr178 es sustituido por Val o Leu y Pro_{182} es sustituido por Ser;
- (b)
- la identificación de una célula vegetal que presenta un crecimiento normal en comparación con una célula vegetal de tipo salvaje correspondiente en presencia de glifosato; y
- (c)
- la regeneración de una planta no transgénica, resistente o tolerante al herbicida que tiene dicho gen EPSPS mutado de dicha célula vegetal;
donde la planta no transgénica, resistente o
tolerante al herbicida exhibe un crecimiento y desarrollo normales
en comparación con el de las plantas correspondientes de tipo
salvaje, y donde la enzima EPSPS mutada tiene la misma actividad
catalítica en comparación con la de la enzima de tipo salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Método según la reivindicación 13 en el que
las posiciones de aminoácidos son Thr_{102}y Pro_{106} en el gen
EPSPS de Zea mays.
15. Método según la reivindicación 13 en el que
las posiciones de aminoácidos son Thr_{174} y Pro_{178} en el
gen EPSPS de una especie de Brassica.
16. Método según la reivindicación 13 en el que
las posiciones de aminoácidos son Thr_{174} y Pro_{178} en el
gen EPSPS de Petunia hybrida.
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