ES2532277T3 - Derivados de quinazolina capaces de inhibir la señalización de citoquinina - Google Patents

Derivados de quinazolina capaces de inhibir la señalización de citoquinina Download PDF

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Abstract

Uso de un compuesto representado por la fórmula general (I):**Fórmula** donde R y X son iguales o diferentes y donde R representa un grupo hidrocarburo opcionalmente sustituido, un grupo representado por NR1 R2, un grupo representado por OR3, un grupo nitro o un átomo de halógeno, y donde X representa un grupo hidrocarburo opcionalmente sustituido, un grupo representado por NR1R2, un grupo representado por OR3, un grupo representado por S(O)mR4, un grupo nitro o un átomo de halógeno, en la que R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo hidrocarburo opcionalmente sustituido, R2 representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidrocarburo opcionalmente sustituido, un grupo representado por NR5 R6 (en la que R5 y R6 son iguales o diferentes y representan un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-6 opcionalmente sustituido) o un grupo representado por OR7 (en la que R7 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-6 opcionalmente sustituido), o R1 y R2 se toman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos para formar un grupo amino cíclico opcionalmente sustituido, cada uno de R3 y R4 representa un grupo hidrocarburo opcionalmente sustituido, I representa un número entero de 0 a 1, m representa un número entero de 0 a 2, n representa un número entero de 0 a 4, cuando n es 2 o más, cada X es igual o diferente entre sí, y Ar representa un grupo arilo opcionalmente sustituido o un grupo heteroarilo opcionalmente sustituido; o una sal agrícolamente aceptable de los mismos, como un principio activo para controlar el crecimiento o diferenciación de una planta.

Description

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donde R y X son iguales o diferentes y representa un grupo hidrocarburo opcionalmente sustituido, un grupo representado por NR1R1, un grupo representado por OR3, un grupo representado por SiO)mR4, un grupo nitro o un átomo de halógeno, en la que R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo hidrocarburo opcionalmente sustituido, R3 representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidrocarburo opcionalmente sustituido, un grupo representado por NR5R6 (en la que R5 y R6 son iguales o diferentes y representan un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-6 opcionalmente sustituido) o un grupo representado por OR7 (en la que R7 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-6 opcionalmente sustituido); o R1 y R2 se toman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos para formar un grupo amino cíclico opcionalmente sustituido, cada uno de R3 y R4 representa un grupo hidrocarburo opcionalmente sustituido, 1 representa un número entero de 0 a 1, m representa un número entero de 0 a 2, n representa un número entero de 0 a 4, cuando n es 2 o más, cada X es igual o diferente entre sí, y Ar representa un grupo arilo opcionalmente sustituido o un grupo heteroarilo opcionalmente sustituido; o una sal agrícolamente aceptable de los mismos, como un principio activo;
(26)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con el punto (25) anterior, donde l es 1 y R es un grupo hidrocarburo opcionalmente sustituido;
(27)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con el punto (25) anterior, donde l es 1 y R es un grupo alquilo C1-3 que está opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno o uno o más grupos oxo;
(28)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con el punto (26) anterior, donde el grupo hidrocarburo opcionalmente sustituido es un grupo alquilo C1-3 que está opcionalmente sustituido con un o más átomos de halógeno o uno o más grupos oxo;
(29)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con el punto (25) anterior, donde 1 es 1 y R es un grupo representado por NR1R2;
(30)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con el punto (29) anterior, donde R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-3, R2 representa un átomo de hidrógeno, un grupo amino, un grupo alquilamino C1-3, un grupo dialquilamino C1-3, un grupo amidino, un grupo alcoxi C1-3, un grupo fenilo, un grupo acilo C1-3, un grupo alquilo C1-6, un grupo alquinilo C3-6 o un grupo alquinilo C3-6, en el que el grupo fenilo está opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alquilo C1-3 iguales o diferente, el grupo fenilo, el grupo acilo, el grupo alquilo, el grupo alquenilo y el grupo alquinilo están opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C1-3, un grupo hidroxi alcoxi C1-3, un grupo carboxilo, un grupo alcoxicarbonilo C1-3, un grupo carbamoílo, un grupo amino, un grupo alquilamino C1-3, un grupo dialquilamino C1-3, un grupo mercapto, un aciltio C1-3, un grupo ciano, un grupo furilo y un grupo tetrahidrofurilo, o R1 y R1 se toman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos para formar un grupo pirrolidino, un grupo piperidino o un grupo morfolino;
(31)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con el punto (29) anterior, donde R1 representa un átomo de hidrógeno, R2 representa un átomo de hidrógeno, un grupo formilo, un grupo alquilo C1-6, un grupo alquenilo C36 o un grupo alquinilo C3-6, en el que el grupo alquilo, el grupo alquenilo y el grupo alquinilo están opcionalmente sustituidos con uno o mas sustituyentes seleccionados entre un grupo hidroxilo, un grupo metoxi, un grupo metoxicarbonilo, un grupo etoxicarbonilo, un grupo ciano y un grupo furilo;
(32)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con el punto (25) anterior., donde l es 1 y R es un grupo representado por OR3;
(33)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con el punto (32) anterior, donde R3 es un grupo alquilo C13 que está opcionalmente sustituido con un grupo amino;
(34)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con el punto (25) anterior, donde l es 1 y R es un grupo representado por S(O)mR4;
(35)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con el punto (34) anterior, donde R4 es un grupo alquilo C13 que está opcionalmente sustituido con un grupo amino o un grupo hidroxi, y m es 0;
(36)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con el punto (25) anterior, donde l es 1 y R es un átomo de halógeno;
(37)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con el punto (36) anterior, donde el átomo de halógeno es un átomo de cloro;
(38)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (25) a (37) anteriores, donde n es de 1 a 2 y X es un grupo alquilo C1-3, un grupo alcoxi C1-3, un grupo haloalquilo C1-3, un grupo ciano, un átomo de halógeno o un grupo nitro;
(39)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con el punto (38) anterior, donde X es un átomo de cloro, un átomo de bromo o un grupo nitro, y X está en la posición 6 y/o la posición 8;
(40)
el regulador del crecimiento vegetal de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (25) a (37) anteriores, donde Ar es un grupo fenilo que está opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno o uno o más grupos alquilo C1-3;
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en la resistencia al estrés por sequía o resistencia a plagas, y una disminución en la cantidad de fertilizante mejorando la capacidad de absorción de nutrientes.
Como se describe en este documento, el "crecimiento de una raíz" de una planta significa que la longitud de una raíz 5 y la cantidad de raíces aumenta o que la cantidad, grosor y actividad de una raíz aumenta, como resultado de división, crecimiento y un aumento en el peso de las células de la raíz.
Como se describe en este documento, la "promoción del crecimiento de una raíz" de una planta significa que el crecimiento de una raíz de una planta está más activado que lo habitual, y por tanto la longitud de una raíz y la cantidad de raíces aumenta, o la cantidad, grosor y actividad de una raíz aumenta en comparación con el caso de ausencia de tratamiento.
Como se describe en este documento, el "agente capaz de promover el crecimiento de una raíz de una planta" es un agente que puede promover el crecimiento de una raíz de una planta tratando la planta con la sustancia por diversos
15 métodos. La promoción del crecimiento de una raíz de una planta es aplicable para controlar el crecimiento o desarrollo de una planta útil tal como un cultivo agrícola, que hace posible potenciar el crecimiento prematuro, potenciar la calidad, aumentar el rendimiento, estabilizar el rendimiento incluso en condiciones desfavorables, y ahorrar trabajo en la producción. Por tanto, el "agente capaz de promover el crecimiento de una raíz de una planta" puede usarse como un "regulador del crecimiento vegetal".
Como se usa en este documento, la expresión "establecimiento de posición" significa que una semilla sembrada germina y después echa raíces en el suelo en un estado capaz de crecer normalmente como un cuerpo vegetal, o que una plántula trasplantada de una planta establece raíces en el suelo y después crece normalmente. La promoción del establecimiento de posición conduce a mejora en el crecimiento prematuro de una planta, y de este
25 modo es posible que crezca una planta de forma sana. Además, como resultado de un aumento en la cantidad de plantas que han crecido de forma sana, se espera un aumento en el rendimiento final. Por ejemplo, en el caso de siembra directa de arroz, generalmente es difícil asegurar siempre una cantidad dada de plántulas establecidas a causa de la germinación inestable y establecimiento de posición. El agente capaz de promover el establecimiento de posición de la presente invención puede promover el establecimiento de posición para mejorar la eficacia en la siembra directa de arroz. La expresión "tasa de establecimiento de posición" significa la proporción de plantas establecidas en la cantidad total de semillas sembradas o la cantidad total de plántulas trasplantadas de una planta. En el caso de arroz, como se usa en este documento, la "tasa de establecimiento de posición" puede definirse por la siguiente ecuación.
35 [Tasa de establecimiento de posición (%)] = [Cantidad de plántulas cuyo ápice foliar aparece sobre la superficie del agua] / [Cantidad de semillas sembradas] x 100
El término "macollaje" de una planta significa ramificación durante el crecimiento de una planta, o ramas que surgen como resultado de macollaje. En el caso de plantas gramíneas, por ejemplo, el término "macollaje" significa ramificaciones laterales. La promoción del macollaje incluye macollaje prematuro y un aumento en la cantidad de macollos. Por ejemplo, cuando se usa un regulador del crecimiento vegetal de una planta de la presente invención en condiciones de estrés tales como baja temperatura, alta temperatura y sequía para hacer el macollaje de la planta de forma más prematura y de este modo plántulas sanas puedan fijarse de forma prematura, es posible evitar daños de las plántulas por estrés. Por ejemplo, un macollaje prematuro provoca un periodo de cultivo acortado de
45 una planta. Como la formación de macollos de una planta influye directamente sobre la cantidad de espigas, puede esperarse un aumento del rendimiento dependiendo de las condiciones de cultivo.
Una sustancia activa auxina puede mostrar propiedades desfavorables tales como epinastia de las hojas, torsión de tallos, rotura de tallos, e inducción de nudos en raíces, dependiendo del tipo de planta, la concentración de tratamiento con auxina y similares.
Se cree que las sustancias activas de citoquinina tienen propiedades tanto supresoras como promotoras del crecimiento de una raíz de una planta [por ejemplo, PNAS 101 (23): 8821-8826 (2004)]. Sin embargo, para utilizar dichas propiedades en la práctica agrícola, pueden acumularse un montón de hallazgos. Como es habitualmente
55 difícil ajustar la cantidad de citoquinina en un cuerpo vegetal (particularmente, para reducir la cantidad de citoquinina endógena), no es fácil incluso para un especialista en la técnica investigar específicamente las tareas de citoquinina en una planta.
Se cree que la citoquinina intrínseca de una planta puede controlarse negativamente inhibiendo la transducción de señales de citoquinina para debilitar la sensibilidad a citoquinina. Por ejemplo, la transducción de señales de citoquinina puede inhibirse mutando el propio receptor de citoquinina, y se han aislado mutantes de receptores de citoquinina [The Plant Cell 16:1365-1377 (2004), PNAS 101 (23):8821-8826 (2004)]. Sin embargo, usando los mutantes, es difícil controlar el grado de inhibición por fases. Un mutante único de un receptor de citoquinina muestra el mismo fenotipo que el de tipo silvestre. Por otro lado, un triple mutante de un receptor de citoquinina
65 muestra inhibición de elongación de raíces y crecimiento defectuoso de un cuerpo vegetal.
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expresión de un gen de -galactosidasa que está unido a una región promotora del gen diana cps puede usarse como indicador para determinar la presencia o ausencia o la cantidad de señalización intracelular desde el receptor de citoquinina derivado de plantas. En el caso de Arabidopsis thaliana transformada con un plásmido informador en que un gen informador está unido a una región promotora del regulador de respuesta tipo-A ARR5 o ARR6, puede
5 usarse fluorescencia o color desarrollado dependiente de citoquinina como indicador para determinar la presencia o ausencia o la cantidad de señalización intracelular desde un receptor de citoquinina. Los métodos descritos anteriormente se describen en, por ejemplo, Higuchi et al., Nature 409, 1060-1063 (2001); Suzuki et al., Plant Cell Physiol. 42, 107-113 (2001); Hwang y Sheen, Nature 413, 383-389 (2001), y similares.
Entre diversos métodos para determinar la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula como se ha descrito anteriormente, un ejemplo preferible como método mecánico, cuantitativo y eficaz es un método que comprende determinar el crecimiento de la levadura en crecimiento recombinante dependiente de citoquinina midiendo la turbidez de un medio líquido con un espectrofotómetro. Un ejemplo específico del mismo incluye el método descrito en el documento JP-A 2003-079393.
15 La "actividad de inhibición de la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula" significa la capacidad de reducir la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula. En otras palabras, esto significa la capacidad de reducir la cantidad de transferencia de grupo fosfato que se inicia por autofosforilación de un receptor de citoquinina y en que un grupo fosfato se transfiere desde el receptor de citoquinina hasta un regulador de respuesta. Ejemplos específicos de la actividad de inhibición de la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula incluyen la capacidad de inhibir la actividad histidina quinasa de un receptor de citoquinina, la capacidad de inhibir la transferencia de grupo fosfato desde un receptor de citoquinina a un mediador de transferencia de grupo fosfato, la capacidad de inhibir la transferencia de grupo fosfato desde el mediador de transferencia de grupo fosfato hasta un regulador de respuesta,
25 y la capacidad de inhibir el control de la transcripción del regulador de respuesta. Más específicamente, un ejemplo de la capacidad de inhibir la actividad histidina quinasa de un receptor de citoquinina incluye la capacidad de inhibir la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina mediante un mecanismo en que se determina la presencia o ausencia de inhibición de la señalización intracelular desde el receptor de citoquinina dependiendo de la presencia o ausencia de inhibición de la unión entre una sustancia que tiene una actividad agonista de citoquinina y el receptor de citoquinina, resultante en la inhibición de la actividad histidina quinasa del receptor de citoquinina. En este caso, como un ejemplo de un método para determinar si una sustancia de ensayo realmente inhibe la unión entre una sustancia que tiene una actividad agonista de citoquinina y un receptor de citoquinina incluye un método que comprende el uso de una sustancia radiomarcada que tiene una actividad agonista de citoquinina y un receptor de citoquinina. Por ejemplo, una sustancia que tiene una actividad agonista de citoquinina que está marcada con un
35 radioisótopo de hidrógeno, tritio para llegar a ser altamente radiactiva, y una proteína de receptor de citoquinina preparada a partir de una levadura recombinante en que hay un gen de receptor de citoquinina introducido se dejan coexistir en un tampón adecuado, y después la proteína de receptor de citoquinina se recoge en un filtro de vidrio para medir la radiactividad. Por tanto puede detectarse la sustancia que tiene una actividad agonista de citoquinina que está marcada con tritio para llegar a ser altamente radiactiva y que se une al receptor de citoquinina. Cuando se permite que una sustancia de ensayo coexista con la sustancia radiomarcada que tiene una actividad agonista de citoquinina y la proteína de receptor de citoquinina en un tampón, puede determinarse si la sustancia de ensayo inhibe la unión entre la sustancia que tiene una actividad agonista de citoquinina y el receptor de citoquinina usando una disminución en el valor de medición de radiactividad como indicador. Entonces, cuando la sustancia de ensayo se añade al sistema de reacción descrito anteriormente para determinar la presencia o ausencia o la cantidad de
45 señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas, puede investigarse la influencia de la sustancia de ensayo sobre la señalización intracelular desde el receptor de citoquinina derivado de plantas.
El "agente que tiene una actividad de inhibición de la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula" significa un agente que comprende, como ingrediente activo, una sustancia que tiene una actividad de inhibición de la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula.
Como se describe en este documento, el "agente capaz de controlar el crecimiento o diferenciación de una planta que tiene una actividad de inhibición de la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de
55 plantas de una célula" significa un agente cuya capacidad de inhibir la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula se determina mediante el método descrito anteriormente y que puede controlar el crecimiento o diferenciación de una planta. El agente es deseablemente un agente en que el agente capaz de controlar el crecimiento o diferenciación de una planta es un regulador del crecimiento vegetal.
Como se describe en este documento, el "regulador del crecimiento vegetal" es un agente capaz de controlar el crecimiento o diferenciación de una planta.
Un ejemplo de un método para determinar la capacidad de controlar el crecimiento o diferenciación de una planta incluye un método para determinar una actividad promotora del crecimiento de raíces en una planta así como los
65 métodos descritos en la presente invención. Específicamente, la capacidad de controlar el crecimiento o diferenciación de una planta puede determinarse, por ejemplo, de acuerdo con el siguiente método.
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De acuerdo con la composición descrita a continuación, se prepara un medio convencional Enshi (véase la Tabla 2). Se distribuye una solución de una sustancia química en DMSO en cada 4 l a tubos de agrupación de modo que la concentración final pueda ser de 0,001 ppm a 10 ppm. Después, se añaden 600 l del medio convencional Enshi esterilizado a cada tubo de agrupación, seguido de mezcla. En cada tubo, se ponen de 10 a 20 semillas de Arabidopsis thaliana y se cultivan a 22ºC durante 10 días en un lugar iluminado. Después se mide la longitud promedio de las raíces principales. Se determina un promedio de ocho repeticiones y después se determina una tasa de crecimiento de raíces mediante la siguiente ecuación.
Tabla 2
Composición
Concentración (mg/l)
Nitrato de calcio
Ca(NO3)2·4H2O 950
Nitrato de potasio
KNO3 810
Sulfato de magnesio
MgSO4·7H2O 500
Fosfato de amonio
NH4H2PO4 155
Quelato de hierro
Fe-EDTA 22,62
Ácido bórico
H3BO3 2,86
Sulfato de manganeso
MnSO4·4H2O 1,81
Sulfato de zinc
ZnSO4·7H2O 0,22
Sulfato de cobre
CuSO4·5H2O 0,08
Molibdato de sodio
Na2MoO4·2H2O 0,025
Ajustado a pH 5,8
10 Tasas de crecimiento de raíces (%) = (Longitud promedio de la raíz principal en sección tratada con sustancia química) / (Longitud promedio de la raíz principal en sección de control) x 100
Puede decirse que una sustancia de ensayo que muestra una tasa de crecimiento de raíces significativamente elevada tiene una actividad promotora del crecimiento de raíces. Más preferiblemente, puede juzgarse que una 15 sustancia de ensayo que tiene una tasa de crecimiento de raíces del 120% o más tiene una actividad promotora del crecimiento de raíces.
El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento comprende una sustancia química capaz de inhibir la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula, o una sal 20 agrícolamente aceptable de la misma como ingrediente activo.
En la presente invención, la "sal agrícolamente aceptable" significa una sal en la forma que no hace imposible producir un regulador del crecimiento vegetal y aplicar el producto, y puede ser una sal en cualquier forma. Ejemplos específicos de la sal incluyen sales de ácidos minerales tales como clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, 25 nitrato y fosfato; sales de ácidos orgánicos tales como formiato, acetato, propionato, oxalato, malonato, succinato, fumarato, maleato, lactato, malato, tartrato, citrato, metanosulfonato y etanosulfonato; sales de adición de ácidos, por ejemplo, sales de aminoácidos ácidos tales como aspartato y glutamato; sales metálicas tales como sales de metales alcalinos (sal de sodio, sal de potasio, etc.), sales de metales alcalino-térreos (sal de magnesio, etc.), y sales de aluminio; sales de adición de bases orgánicas tales como metilamina, etilamina y etanolamina y de
30 aminoácidos básicos tales como lisina y ornitina; y sales de amonio.
El regulador del crecimiento sencillo se usa habitualmente en forma de una formulación tal como un concentrado emulsionable, un polvo humectable, una suspensión o un polvo soluble en agua que se puede obtener mezclando con un vehículo sólido, un vehículo líquido o similares y, si fuera necesario, añadiendo (a) uno o más tensioactivos y
35 otros auxiliares de formulación al mismo. La formulación contiene habitualmente del 0,5 al 90% en peso, preferiblemente del 1 al 80% en peso de una sustancia capaz de inhibir la señalización de citoquinina.
Ejemplos del vehículo sólido usado para la formulación incluyen polvos finos y gránulos de arcillas (caolinita, tierra de diatomeas, óxido de silicio hidratado sintético, arcilla Fubasami, bentonita, arcilla ácida, etc.), talco, otros 40 minerales inorgánicos (sericita, polvo de cuarzo, polvo de azufre, carbono activado, carbonato de calcio, etc.) y fertilizantes químicos (sulfato de amonio, fosfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, urea, etc.). Ejemplos del vehículo líquido incluyen agua, alcoholes (metanol, etanol, etc.), cetonas (acetona, metil etil cetona, ciclohexanona, etc.), hidrocarburos aromáticos (tolueno, xileno, etilbenceno, metilnaftaleno, etc.), hidrocarburos no aromáticos (hexano, ciclohexano, queroseno, etc.), ésteres (acetato de etilo, acetato de butilo, etc.), nitrilos
45 (acetonitrilo, isobutironitrilo, etc.), éteres (dioxano, diisopropil éter, etc.), amidas ácidas (dimetilformamida, dimetilacetamida, etc.) e hidrocarburos halogenados (dicloroetano, tricloroetileno, etc.).
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Ejemplos del tensioactivo incluyen sulfatos de alquilo, sulfonatos de alquilo, sulfonatos de alquil arilo, alquil aril éteres y sus compuestos polioxietileno, éteres de polietilenglicol, ésteres de alcohol polihídrico, y derivados alcohólicos de azúcar.
5 Ejemplos de otros auxiliares de formulación incluyen agentes adherentes y agentes de dispersión tales como caseína, gelatina, polisacáridos, almidón, goma arábiga, derivados de celulosa, ácido algínico, etc.), derivados de lignina, bentonita, polímeros solubles en agua sintéticos (alcohol polivinílicos, polivinil pirrolidona, ácido poliacrílico, etc.), y agentes estabilizantes tales como PAP (isopropil fosfato ácido), BHT (2,6-terc-butil-4-metilfenol), BHA (2-/3terc-butil-4-metoxifenol), aceites vegetales, aceites minerales, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos.
Como se describe en este documento, el "regulador del crecimiento vegetal que comprende una sustancia química capaz de inhibir la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula, o una sal agrícolamente aceptable de la misma, como ingrediente activo" es un agente que puede controlar el crecimiento o diferenciación de una planta conteniendo, como ingrediente activo, una sustancia química cuya 15 capacidad de inhibir la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula se determina por el método descrito anteriormente o una sal agrícolamente aceptable de la sustancia química. La sustancia química es deseablemente una sustancia química que tiene la capacidad de inhibir la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina en un sistema de contacto de la levadura en crecimiento recombinante descrita anteriormente que comprende un receptor de citoquinina y una sustancia que tiene una actividad agonista para el receptor de citoquinina. De forma más deseable, un ejemplo de la sustancia química incluye una sustancia química que tiene la capacidad de inhibir la actividad de un receptor de citoquinina en un sistema de contacto de la levadura en crecimiento recombinante descrita anteriormente que comprende un receptor de citoquinina y una sustancia que tiene una actividad agonista para el receptor de citoquinina, de modo que la actividad del receptor de citoquinina puede reducirse en presencia de 0,6 ppm de trans-zeatina y 2 ppm o más de la sustancia química en
25 comparación con el caso en ausencia de la sustancia química. Aún más deseablemente, un ejemplo de la sustancia química incluye una sustancia química que tiene la capacidad de inhibir la actividad de un receptor de citoquinina en un sistema de contacto de la levadura en crecimiento recombinante descrita anteriormente que comprende un receptor de citoquinina y una sustancia que tiene una actividad agonista para el receptor de citoquinina, de modo que la actividad del receptor de citoquinina puede reducirse en un 90% o más en presencia de 0,6 ppm de transzeatina y 2 ppm o más de la sustancia química en comparación con el caso en ausencia de la sustancia química.
Como se describe en este documento, un "método para ensayar la capacidad de una sustancia de ensayo de promover el crecimiento de una raíz de una planta, que comprende:
35 (1) una primera etapa para medir una actividad de inhibición de la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina seleccionado entre el siguiente grupo A (o la presencia o ausencia o la cantidad de la señalización intracelular) en un sistema de contacto que comprende una célula que tiene el receptor de citoquinina, una sustancia que tiene una actividad agonista para el receptor de citoquinina y la sustancia de ensayo; y
(2) una segunda etapa para evaluar la capacidad de la sustancia de ensayo de promover el crecimiento de una raíz de una planta en base a una diferencia obtenida mediante comparación de la actividad medida en la primera etapa con la actividad en el control" es un método que comprende la primera etapa y la segunda etapa entre diversos métodos para ensayar la capacidad de promover el crecimiento de una raíz de una planta de una sustancia de ensayo.
45 El "Grupo A" representa lo siguiente:
(a)
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1,
(b)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº1 en que uno o más aminoácidos están delecionados, añadidos o sustituidos, y que tiene una actividad de funcionamiento como un receptor de citoquinina,
(c)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 45% o más con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, y que tiene una actividad de funcionamiento como un receptor de citoquinina
(d) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la 55 SEC ID Nº2
(e) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido complementario a un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2, y que tiene una actividad de funcionamiento como un receptor de citoquinina.
La primera etapa es una etapa de medir una actividad de inhibición de la señalización intracelular desde el receptor de citoquinina (o la presencia o ausencia o la cantidad de la señalización intracelular) en un sistema de contacto que comprende una célula que tiene los diversos receptores de citoquinina descritos anteriormente, una sustancia que tiene una actividad agonista para el receptor de citoquinina y la sustancia de ensayo. La segunda etapa es una etapa de evaluar la capacidad de la sustancia de ensayo de promover el crecimiento de una raíz de una planta en 65 base a una diferencia obtenida por comparación de la actividad medida en la primera etapa con la actividad en el control. Como se usa en este documento, por ejemplo en el caso donde se añade una solución de una sustancia de
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ensayo en un disolvente a un sistema de reacción, el control significa un ensayo en que se añade solamente el disolvente.
El receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula usado en el método para ensayar la capacidad de una
5 sustancia de ensayo de promover el crecimiento de una raíz de una planta que comprende la primera etapa y la segunda etapa es una proteína mostrada en el grupo A descrito anteriormente. Entre las proteínas del grupo A descrito anteriormente, en las secuencias de aminoácidos de proteínas mostradas en (b), (c), (d) y (e), las diferencias de la secuencia de aminoácidos de (a) que pueden encontrarse ocasionalmente se deben a deleción, sustitución, adición, y similares de algunos aminoácidos. Las diferencias incluyen deleción causada por
10 procesamiento que una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de (a) experimenta en células. Además, las diferencias incluyen deleción, sustitución, adición, y similares de aminoácidos causadas por mutación genética de origen natural debida a diferencia de especie, diferencia individual o similares de organismos de los cuales se obtiene la proteína, o mutación genética introducida artificialmente por mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis aleatoria, tratamiento de mutagénesis o similares.
15 La cantidad de dicha deleción, sustitución, adición o similares de aminoácido puede estar dentro del intervalo en que puede encontrarse la actividad histidina quinasa de un receptor de citoquinina. Ejemplos de la sustitución de aminoácido incluyen sustituciones con aminoácidos que tienen características análogas tales como hidrofobicidad, carga, pK y estructura espacial. Ejemplos específicos de dicha sustitución incluyen sustituciones dentro de los
20 grupos de (1) glicina, alanina; (2) valina, isoleucina, leucina; (3) ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; (4) serina, treonina; (5) lisina, arginina; (6) fenilalanina, tirosina; y similares.
Un ejemplo de un método para realizar de forma artificial dicha deleción, adición o sustitución de aminoácido (a partir de ahora en este documento, ocasionalmente mencionada como alternancia de aminoácido, en general) incluye un 25 método que comprende someter el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de (a) a mutagénesis específica de sitio y después expresar el ADN por una técnica convencional. Ejemplos del método de mutagénesis específica de sitio incluyen un método que comprende usar mutación ámbar (método de dúplex con huecos, Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)), y un método que comprende PCR usando cebadores para introducir mutación. Un ejemplo de un método para realizar de forma artificial alternancia de aminoácido incluye un método que comprende 30 someter el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de (a) a mutagénesis aleatoria y después expresar el ADN por un método convencional. Un ejemplo de un método para mutagénesis aleatoria incluye un método que comprende PCR usando ADN que codifica una cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente como molde y usando un par de cebadores por el cual puede amplificarse la longitud completa del ADN, en unas condiciones de reacción que la concentración de adición de cada uno de dATP, dTTP, dGTP y dCTP
35 usados como sustratos se cambia de las condiciones usuales o en unas condiciones de reacción que la concentración de Mg2+ para promover la reacción de la polimerasa se aumenta de las condiciones generales. Ejemplos de dicha técnica de PCR incluyen un método descrito en Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112, así como un método descrito en el documento WO0009682.
40 Como se usa en este documento, la "identidad de secuencia" significa la identidad entre dos secuencias de nucleótidos o dos secuencias de aminoácidos. La "identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas de forma óptima sobre todas las regiones. La alineación óptima de las secuencias de nucleótidos o las secuencias de aminoácidos puede contener adiciones o deleciones (por ejemplo, hueco). Dicha identidad de secuencia puede calcularse realizando análisis de homología usando programas tales como FASTA
45 [Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 4, 2444-2448 (1988)], BLAST [Altschul et al., Journal of Molecular Biology, 215, 403-410 (1990)], y CLUSTAL W [Thompson, Higgins y Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680 (1994a)] para construir alineaciones. Los programas descritos anteriormente están generalmente disponibles en la página web (http://www.dd-bj.nig.ac.jp) del DNA Data Bank de Japón [banco de datos internacional de ADN dirigido por el Center for Information Biology and DNA Data Bank de Japón; CIB/DDBJ of National Institute of Genetics] o
50 similares. La identidad de secuencia también puede obtenerse usando software de análisis de secuencia disponible en el mercado. Específicamente, por ejemplo, se realiza análisis de homología por el método de Lipman-Pearsen [Lipman, D. J. y Pearson, K.R., Science, 227, 1435-1441, (1985)] y usando GENETYX-WIN Ver.5 (fabricado por Software Development Co., Ltd.) para construir alineaciones, y de este modo, puede calcularse la identidad de secuencia.
55 Las "condiciones rigurosas" descritas en (e) incluyen dicha condiciones en que la hibridación se realiza a 45ºC en una solución que contiene SSC 6 x (SSC 10 x contiene NaCl 1,5 M y citrato trisódico 0,15 M) seguido de lavado con SSC 2 x a 50ºC (molecular Biology, John Wiley y Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6), en hibridación realizada de acuerdo con un método convencional, por ejemplo, como se describe en Molecular Cloning 2ª edición escrito por
60 Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T. expedido por Cold Spring Harbor Laboratory Press. La concentración salina en la etapa de lavado puede seleccionarse entre, por ejemplo, el intervalo de SSC 2 x (condiciones de baja rigurosidad) a SSC 0,2 x (condiciones de alta rigurosidad). La temperatura en la etapa de lavado puede seleccionarse entre, por ejemplo, el intervalo de temperatura ambiente (condiciones de baja rigurosidad) a 65ºC (condiciones de alta rigurosidad). Tanto la concentración salina como la temperatura pueden cambiarse.
65
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Cada una de estas proteínas es una proteína que tiene una actividad que funciona como un receptor de citoquinina. De forma deseable, se usa la siguiente proteína: una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos donde los restos de aminoácido correspondientes a las posiciones (I) 459 y (II) 973 de la SEC ID Nº 1 son respectivamente
(I) histidina en la posición 459 y (II) ácido aspártico en la posición 973, cuando la secuencia de aminoácidos de la
5 proteína está alineada con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 de modo que pueda obtenerse la máxima identidad de secuencia. Como se usa en este documento, "la secuencia de aminoácidos de la proteína está alineada con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 de modo que pueda obtenerse la máxima identidad de secuencia" significa que el análisis de identidad de secuencia de plurales secuencias de aminoácidos de interés incluyendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 se realiza usando el programa descrito anteriormente tal como FASTA, BLAST, o CLUSTAL W para alinear las secuencias de aminoácidos. Como resultado de la alineación de plurales secuencias por dicho método, es posible determinar las posiciones de restos homólogos de aminoácido en cada una de las secuencias de aminoácidos a pesar de la inserción o deleción existente en las secuencias de aminoácidos. Las posiciones homólogas se consideran la misma posición en estructura tridimensional, y pueden estimarse para tener efectos análogos para la función específica de la proteína de interés. Por ejemplo, en el caso
15 de receptores de citoquinina conocidos incluyendo el receptor de citoquinina cuya secuencia se describe en la presente invención, los restos de aminoácido correspondientes a las posiciones (I) 459 y (II) 973 de la SEC ID Nº 1 son respectivamente (I) histidina en la posición 459 y (II) ácido aspártico en la posición 973, cuando la secuencia de aminoácidos del receptor de citoquinina está alineada con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 de modo que se pueda obtener la máxima identidad de secuencia.
El ingrediente activo del agente capaz de controlar el crecimiento o diferenciación de una planta puede buscarse, por ejemplo, determinando la capacidad de promover el crecimiento de una raíz de la planta.
El método para ensayar la capacidad de promover el crecimiento de una raíz de una planta que comprende usarse
25 un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula como se ha descrito anteriormente también puede usarse para buscar una sustancia que tenga la capacidad de controlar el crecimiento o diferenciación de una planta. Específicamente, cuando la capacidad de una sustancia de ensayo de promover el crecimiento de una raíz de una planta se determina en un cierto valor o más o un cierto valor o menos usando el método para ensayar la capacidad de promover el crecimiento de una raíz de una planta que comprende usarse un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula, se selecciona la sustancia. Por tanto, puede buscarse una sustancia que tenga la capacidad de promover el crecimiento de una raíz de una planta.
Como una sustancia seleccionada por el método de búsqueda tiene la capacidad de controlar el crecimiento o diferenciación de una planta, una composición que contiene la sustancia o una sal agrícolamente aceptable de la
35 misma como ingrediente activo puede ser un regulador del crecimiento vegetal.
Ejemplos específicos de la sustancia capaz de inhibir la señalización de citoquinina incluyen antagonistas de citoquinina, y agonistas de citoquinina.
La sustancia inhibidora de la señalización de citoquinina seleccionada por el método de búsqueda descrito anteriormente puede promover el crecimiento de una raíz de una planta. El crecimiento de una raíz incluye la elongación de la raíz principal, la elongación de una raíz lateral, y la elongación de un pelo radicular.
La actividad promotora del crecimiento de raíces de la sustancia inhibidora de la señalización de citoquinina
45 seleccionada por el método de búsqueda descrito anteriormente puede ensayarse usando, por ejemplo, el siguiente método. Por ejemplo, se preparan soluciones acuosas, medios de cultivo hidropónico o medios de cultivo tisular que contienen la sustancia inhibidora de la señalización de citoquinina a diferente concentración dentro del intervalo de 0,0001 a 100 ppm dependiendo del tipo de planta y método de ensayo. En el caso de un ensayo en placa petri, se impregna un papel de filtro extendido sobre una placa petri con la solución, y se ponen semillas de la planta sobre el mismo. En el caso de un ensayo de bolsa, se impregna un papel grueso con la solución, donde el papel grueso se coloca en una bolsa que permite la observación del crecimiento de raíces tal como una bolsa para el crecimiento de semillas, y se siembra semillas de la planta sobre el mismo. Se prepara un medio sólido añadiendo agarosa, agar o similares a la solución en una placa petri de plástico o un tubo de centrífuga de plástico, y se siembran semillas de la planta en la misma. Después de incubación durante un cierto periodo a 10 a 30ºC en luz, se miden las longitudes de
55 la raíz principal y las raíces laterales, la cantidad de raíces laterales, el peso en húmedo de la raíz, el peso seco de la raíz, y similares.
La sustancia inhibidora de la señalización de citoquinina seleccionada por el método de búsqueda descrito anteriormente puede usarse como regulador del crecimiento vegetal.
En los grupos representados por R, X, R1, R2, R3, R4 R5, R6 y R7 en el compuesto representado por la fórmula general (I) usada en la presente invención (en lo sucesivo en el presente documento, denominada, a menudo, como el compuesto (I)), los ejemplos del "grupo hidrocarburo" incluyen un grupo hidrocarburo alifático, un grupo hidrocarburo monocíclico saturado y un grupo hidrocarburo aromático, y se hace referencia a un grupo hidrocarburo
65 que tiene de 1 a 16 átomos de carbono. Los ejemplos específicos de los mismos incluyen un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo cicloalquilo, un grupo aralquilo y un grupo arilo.
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El "grupo alquilo" es preferiblemente, por ejemplo, un grupo alquilo inferior. Los ejemplos específicos del grupo alquilo incluyen grupos alquilo C3-6 tales como metilo, metilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo y tercbutilo, pentilo y hexilo. El "grupo alquenilo" es preferiblemente, por ejemplo, un grupo alquenilo inferior. Los ejemplos específicos del grupo alquenilo incluyen grupos alquenilo C2-6 tales como vinilo, 1-propenilo, alilo, isopropenilo,
5 butenilo e isobutenilo.
El "grupo alquinilo" es preferiblemente, por ejemplo, un grupo alquinilo inferior. Los ejemplos específicos del grupo alquenilo incluyen grupos alquinilo C2-6 tales como etinilo, propargilo y 1-propinilo.
El "grupo cicloalquilo" es preferiblemente, por ejemplo, un grupo cicloalquilo inferior. Los ejemplos específicos del grupo cicloalquilo incluyen grupos cicloalquilo C3-6 tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. El "grupo aralquilo" es preferiblemente, por ejemplo, un grupo aralquilo C7-11 tal como bencilo o fenetilo. Específicamente, por ejemplo, se usa un grupo bencilo.
15 El "grupo arilo" es preferiblemente, por ejemplo, un grupo acrilo C6-14 tal como fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, bifenililo o 2-antrilo. Específicamente, por ejemplo, se usa un grupo fenilo.
Los ejemplos de un sustituyente para el "grupo hidrocarburo" y el "grupo alquilo C1-6" del "grupo hidrocarburo opcionalmente sustituido" y el "grupo alquilo C1-6 opcionalmente sustituido" incluyen un átomo de halógeno (por ejemplo, flúor, cloro, bromo, yodo, etc.), un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo hidroxilo, un grupo alquilo inferior (por ejemplo, un grupo alquilo C1-6 tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo., sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, neopentilo, o hexilo, etc.), un grupo alcoxi inferior (por ejemplo, un grupo alcoxi C1-6 tal como metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi, pentiloxi o hexiloxi, etc.), un grupo amino, un grupo monoalquilamino inferior (por ejemplo, un grupo mono-alquilamino C1-6 tal como metilamino o etilamino, etc.), un grupo 25 di-alquilamino inferior (por ejemplo, un grupo di-alquilamino C1-6 tal como dimetilamino o dietilamino, etc.), un grupo imino, un grupo carboxilo, un grupo alquilcarbonilo inferior (por ejemplo, un grupo alquilcarbonilo C1-6 tal como acetilo o propionilo, etc.), un grupo alcoxicarbonilo inferior (por ejemplo, un grupo alcoxicarbonilo C1-6 tal como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicorbonilo o butoxicarbonilo, etc.), un grupo carbamoílo, un grupo tiocarbamoílo, un grupo mono-alquilcarbamoílo inferior (por ejemplo, un grupo mono-alquilcarbamoílo C1-6 tal como metilcarbamoílo o etilcarbamoílo, etc.), un grupo di-alquilcarbamoílo inferior (por ejemplo, un grupo dialquilcarbamoílo C1-6 tal como dimetilcarbamoílo o dietilcarbamoílo, etc., un grupo arilcarbamoílo (por ejemplo, un grupo arilcarbamoílo C6-10 tal como fenilcarbamoílo o naftilcarbamoílo, etc.), un grupo arilo (por ejemplo, un grupo acrilo C6-10 tal como fenilo o naftilo, etc.), un grupo ariloxi (por ejemplo, un grupo ariloxi C6-13 tal como feniloxi o naftiloxi, etc.), un grupo heterocíclico (por ejemplo, 2-o 3-tienilo, 2-o 3-tetrahidrotienilo, 2-o 3-furilo, 2-o 335 tetrahidrofurilo, 1-, 2-o 3-pirrolilo, 1-, 2-o 3-pirrolidinilo, 2-, 4-o 5-oxazolilo, 3-, 4-o 5-isoxazolilo, 2-, 4-o 5-tiazolilo, 3-, 4-o 5-isotiazolilo, 3-, 4-o 5-pirazolilo, 2-, 3-o 4-pirazolidinilo, 2-, 4-o 5-imidazolilo, 4-o 5-1H-1,2,3-triazolilo, 3-o 5-1,2,4-triazolilo, 5-1H-o 5-2H-tetrazolilo, 2-, 3-o 4-piridilo, 2-, 4-o 5-pirimidinilo, 1-, 2-o 3-tiomorfolinilo, 1-, 2-o 3morfolinilo, 1-, 2-, 3-o 4-piperidino, 2-, 3-o 4-piperidilo, 2-, 3-o 4-tiopiranilo, 2-, 3-o 4-4H-1,4-oxadinilo, 2-, 3-o 44H-1,4-tiazinilo, 1,3-tiazinilo, 1-o 2-piperazinilo, 3-, 5-o 6-1,2,4-triazinilo, 2-1,3,5-triazinilo, 3-o 4-piridarinilo, 2pirazinilo, etc.), un grupo alquilcarbonilamino inferior (por ejemplo, un grupo alquilcarbonilamino C1-6 tal como acetilamino, etc.), un grupo mercapto, un grupo alquiltio C1-6 (por ejemplo, un grupo alquiltio C1-6 tal como metiltio, etc.), un grupo alquilsulfinilo (por ejemplo, un grupo alquilsulfinilo C1-6 tal como metilsulfinilo, etc.), un grupo alquilsulfonilo (por ejemplo, un grupo alquilsulfonilo C1-6 tal como metilsulfonilo, etc.), un grupo ariltio (por ejemplo, un grupo ariltio C6-10 tal como feniltio, etc.), un grupo arilsulfinilo (por ejemplo, un grupo arilsulfinilo C6-10 tal como
45 fenilsulfinilo, etc.), un grupo arilsulfonilo (por ejemplo, un grupo arilsulfonilo C6-10 tal como fenilsulfonilo, etc.), un grupo oxo y un grupo tioxo.
El grupo acilo (por ejemplo, formilo, acetilo, propionilo, pivaloílo, acriloílo, benzoílo, etc.) es un tipo de un grupo hidrocarburo sustituido con un grupo oxo y se incluye en el "grupo hidrocarburo opcionalmente sustituido" y el "grupo alquilo C1-6 opcionalmente sustituido".
El "grupo hidrocarburo" y el "grupo alquilo C1-6" del "grupo hidrocarburo opcionalmente sustituido" y el grupo alquilo C1-6 opcionalmente sustituido" pueden tener 1 o más, preferiblemente de 1 a 3 de los sustituyentes que se han descrito anteriormente en posiciones sustituibles. Cuando el sustituyente es un "átomo de halógeno, el grupo
55 hidrocarburo y el grupo alquilo C1-6 pueden tener el número máximo sustituible de sustituyentes. Cuando tienen 2 o más sustituyentes, los sustituyentes son iguales o diferentes.
Cuando el sustituyente es un grupo alquilo inferior, un grupo alcoxi inferior, un grupo mono-alquilamino inferior, un grupo di-alquilamino inferior, un grupo alquilcarbonilo inferior, un grupo alcoxicarbonilo inferior, un grupo mono alquilcarbamoílo inferior, un grupo di-alquilcarbamoílo inferior, un grupo arilcarbamoílo, un grupo arilo, un grupo ariloxi, un grupo heterocíclico, un grupo alquilcarbonilamino inferior, un grupo alquiltio, un grupo alquilsulfinilo, un grupo alquilsulfonilo, un grupo ariltio, un grupo arilsulfinilo, un grupo arilsulfonilo o similares, el sustituyente está opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados entre el grupo que consiste en un átomo de halógeno (por ejemplo, flúor, cloro, bromo, yodo, etc.), un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo hidroxilo, un grupo 65 alcoxi C1-4 (por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropiloxi, butoxi, isobutiloxi), un grupo arilo, un grupo oxo y similares. Cuando el sustituyente es un grupo arilcarbamoílo, un grupo arilo, un grupo ariloxi, un grupo heterocíclico,
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X está sustituido en la posición 6 y/o la posición.
(15) Un compuesto de fórmula general (I), donde Ar es un grupo fenilo que está opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno o uno o más grupos alquilo C1-3.
5 El compuesto (I) incluye compuestos conocidos y puede prepararse mediante un método conocido o un método análogo al mismo.
Por ejemplo, un compuesto (Ia) en el que 1 es 1 y R es un átomo de cloro puede prepararse calentando un compuesto (II) con oxicloruro de fósforo de acuerdo con el siguiente proceso de producción 1. 10 Documento Ejemplar: JP-A 62-145073
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donde los símbolos son como se han definido anteriormente.
15 La reacción puede realizarse en un disolvente que no afecte de forma adversa a la reacción, y se realiza normalmente en ausencia de un disolvente y usando una cantidad en exceso de oxicloruro de fósforo (5 equivalentes a 30 equivalentes en base al compuesto (II)). La temperatura de reacción es normalmente de 80 ºC a 200 ºC, preferiblemente de 90 ºC a la temperatura de reflujo (105 ºC). El tiempo de reacción es normalmente de 0,1
20 a 96 horas, preferiblemente de 0,5 a 5 horas, más preferiblemente de 0,5 a 2 horas. Cuando la reacción prosigue lentamente incluso a reflujo, la reacción también puede calentarse a aproximadamente 200 ºC y se presuriza por ejemplo, a una presión atmosférica de 1,1 a 100) en un recipiente cerrado resistente a la presión.
Un compuesto (Ib) donde 1 es 1 y R es un grupo R6 que es distinto de un átomo de halógeno puede prepararse, por 25 ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto (III) con un compuesto (IV) de acuerdo con el siguiente proceso de producción 2. Documento Ejemplar: Journal of the Chemical Society of Japan, 1973, pl944; JP-A 58-88369
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30 donde Y representa un grupo saliente (por ejemplo, un átomo de halógeno tal como flúor, cloro, bromo o yodo; un grupo alcano-o areno-sulfoniloxi tal como un grupo metanosulfoniloxi, un grupo bencenosulfoniloxi o un grupo ptoluenosulfoniloxi; un grupo alcano-, areno-o arenoalcano-sulfonilo tal como metanosulfonilo, bencenosulfonilo o fenilmetanosulfonilo, etc.); Ra tiene el mismo significado que el de R, con la condición de que Ra no sea un átomo de halógeno; y otros símbolos son como se han definido anteriormente.
35 La reacción puede realizarse con o sin usar un disolvente. Los ejemplos del disolvente incluyen hidrocarburo alifático, tales como pentano, hexano, heptano, éter de petróleo o ciclohexano; éster, tal como acetato de metilo, acetato de metilo, formiato de etilo o propionato de etilo; cetona, tales como acetona, o metil etil cetona; éter, tales como éter dimetílico, metil terc-butil éter, éter diisopropílico, éter dibutílico, tetrahidrofurano o dioxano; alcohol, tales
40 como metanol, etanol o isopropanol; nitruro, tales como acetonitrilo o propionitrilo; amida de ácido, tales como dimetilformamida o dimetilacetamida; amida cíclica, tal como 1-metil-2-pirrolidona; amida fosfórica, tal como hexametilfosforamida; urea cíclica, tal como 1,3-dimetil-2-imidazolidinona; sulfóxido, tal como dimetilsulfóxido; sulfona, tal como sulfolano; hidrocarburo halogenado, tales como diclorometano, cloroformo, 1,2-dicloroetano o tetracloruro de carbono; amina aromática, tales como piridina, picolina, lutidina o quinolina; sus mezclas, agua y
45 mezclas de los disolventes y agua.
Cuando se usa una mezcla del disolvente y agua y la reacción no es un sistema de reacción homogéneo, puede usarse un catalizador de transferencia de fase (por ejemplo, una sal de amonio cuaternario, tal como cloruro de
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El compuesto (XIV) incluye un compuesto conocido y puede prepararse mediante un método conocido o un método análogo al mismo. Por ejemplo, el compuesto (XIV) puede prepararse haciendo reaccionar un compuesto (XV) con un compuesto (XVI) y clorocarborato de metilo de acuerdo con el siguiente proceso de producción de referencia 12. Documento Ejemplar: Tetrahedron 42, 3697 (1986)
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donde Z representa un átomo de halógeno, tal como cloro, bromo o yodo, y otros símbolos son como se han definido anteriormente.
10 En la reacción, en primer lugar, un compuesto (XV) se hace reaccionar con un compuesto (XVI). Normalmente se usa un disolvente, y los ejemplos del mismo incluyen hidrocarburo alifático, tales como pentano, hexano, heptano o éter de petróleo; hidrocarburo aromático, tales como benceno, tolueno o xileno; éter, tales como éter dietílico, metil terc-butil éter, éter diisopropílico, éter dibutílico, tetrahidrofurano o dioxano, y mezclas de dos o más tipos de ellos.
15 El compuesto (XVI) se usa normalmente en la cantidad de 1 a 5 equivalentes, preferiblemente de 2 a 2,5 equivalentes en base al compuesto (XV).
La temperatura de reacción es normalmente de 40 ºC a 100 ºC, preferiblemente de 50 ºC a 70 ºC.
20 El tiempo de reacción es normalmente de 0,2 a 96 horas, preferiblemente de 0,5 a 24 horas, más preferiblemente de 1 a 3 horas.
Después, al sistema de reacción se le añade clorocarbonato de metilo. Se usa normalmente clorocarbonato de
25 metilo en una cantidad de 1 a 5 equivalentes, preferiblemente de 1 a 2 equivalentes en base al compuesto (XV). En esta fase, se prefiere que se añada clorocarbonato de metilo después de la refrigeración a una temperatura de 0 ºC a 20 ºC seguido de calentamiento. La temperatura de reacción después del calentamiento es normalmente de 40 ºC a 200 ºC, preferiblemente de 50 ºC a 70 ºC. El tiempo de reacción total es normalmente de 0,2 a 96 horas, preferiblemente de 0,5 a 10 horas, más preferiblemente de aproximadamente 1 a 3 horas.
30 El compuesto (XIV) también puede prepararse haciendo reaccionar un compuesto (XVII) con cloruro de tricloroacetilo para dar un compuesto (XVIII) y haciendo reaccionar el compuesto (XVIII) con amoniaco o una sustancia ácida débil de amoniaco de acuerdo con el siguiente proceso de producción de referencia 13. Documento Ejemplar: Chem. Pharm. Bull., 26, 1633 (1978)
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donde los símbolos son como se han definido anteriormente.
40 En la primera reacción, se hace reaccionar cloruro de tricloroacetilo con el compuesto (XVII) en presencia de una base. La reacción puede realizarse en ausencia de un disolvente, y normalmente se realiza en presencia de un disolvente. Los ejemplos del disolvente incluyen hidrocarburo alifático, hidrocarburo aromático, éster, cetona, éter, nitrilo, amida de ácido, amida cíclica, amida fosfórica, urea cíclica, sulfóxido, sulfona, hidrocarburo halogenado descrito en el Ejemplo de Producción 11, y sus mezclas.
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Los ejemplos de la base incluyen las bases descritas en el Ejemplo de Producción 11. Entre estas bases, se prefiere una base orgánica o una base inorgánica, y normalmente se usa trietilamina.
La temperatura de reacción es normalmente de -50 ºC a 100 ºC, preferiblemente de 0 ºC a 20 ºC.
5 El tiempo de reacción es normalmente de aproximadamente 0,1 a 96 horas, preferiblemente de 0,2 a 5 horas, más preferiblemente de 0,5 a 3 horas.
En la segunda reacción, el compuesto (XVIII) preparado en la primera reacción se hace reaccionar con amoniaco o un compuesto que genera amoniaco en el sistema. Los ejemplos del compuesto incluyen sales con sustancias ácidas débiles de amoniaco, tales como carbonato amónico, formiato amónico, o acetato amónico. En la reacción, se usa normalmente el disolvente como se describe en el Ejemplo de Producción 11. Los ejemplos preferibles del disolvente incluyen amida de ácido, amida cíclica, amida fosfórica, urea cíclica, sulfóxido y sulfona.
15 La temperatura de reacción es normalmente de 20 ºC a 200 ºC, preferiblemente de 50 ºC a 120 ºC.
El tiempo de reacción es normalmente de 0,2 a 96 horas, preferiblemente de 0,5 a 10 horas, más preferiblemente de 1 a 5 horas.
El compuesto (XIII), el compuesto (XV), el compuesto (XVI) y el compuesto (XVII) con compuestos conocidos habitualmente, y están disponibles en el mercado o pueden prepararse mediante un proceso de producción conocido.
Particularmente, el compuesto (XVI) es un compuesto denominado reactivo de Grignard. El compuesto (XVI) puede
25 ser un producto disponible en el mercado, o puede prepararse mediante un proceso de producción conocido y después usarse tal cual sin aislamiento ni purificación.
Los compuestos preparados mediante el proceso de producción 11 y los procesos de producción de referencia 11, 12 y 13 pueden aislarse y purificarse por un medio conocido, por ejemplo, concentración, concentración a presión reducida, extracción, disolución, cristalización, recristalización o cromatografía.
El crecimiento de una planta como se describe en este documento se regula habitualmente aplicando una cantidad eficaz de un regulador del crecimiento vegetal a una planta o hábitat de la planta.
35 Cuando se usa el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento para agricultura y silvicultura, la cantidad de aplicación es habitualmente de 0,01 a 1.000 g/1000m2. Cuando el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento está en forma de un concentrado emulsionable, un polvo humectable, una formulación fluida, o una microcápsula, habitualmente se pulveriza después de dilución con agua de modo que tenga una concentración de ingrediente activo de 0,001 a 10.000 ppm. Cuando el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento está en forma de un polvo o gránulo, habitualmente se aplica tal cual.
Con el fin de promover el crecimiento de raíces de plantas en el suelo de un campo cultivado, el suelo puede tratarse directamente con el regulador del crecimiento vegetal así formulado como se describe en este documento o con una dilución del regulador del crecimiento vegetal. Además, el regulador del crecimiento vegetal puede
45 formularse en una formulación de resina en forma de una lámina o cordón. La formulación de resina puede aplicarse por enrollamiento alrededor de plantas, estiramiento en las cercanías de las plantas, deposición sobre la superficie el duelo al pie de la planta, o similares. El regulador del crecimiento vegetal de este documento también puede usarse por tratamiento al follaje o tratamiento de las yemas. También pueden tratarse los semilleros antes de plantar o los hoyos de plantación o pies de planta en plantación con el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento. Las plantas diana se tratan con el regulador del crecimiento vegetal una vez o varias veces.
Cuando el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento se usa para tratamiento al follaje de un cuerpo de planta o tratamiento del suelo, la cantidad de aplicación puede variar dependiendo del tipo de formulación, la cronología, el método y lugar de aplicación, y la planta diana, y es habitualmente de 0,1 a 10.000 g por hectárea.
55 Cuando el regulador del crecimiento vegetal se usa como dilución con agua, la concentración del regulador del crecimiento vegetal puede variar dependiendo del tipo de formulación, la cronología, el método y lugar de aplicación, y la planta diana, y es habitualmente de 0,001 a 10.000 ppm, preferiblemente de 0,01 a 1.000 ppm.
El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento también puede usarse para un tratamiento de una planta antes de su trasplante. Cuando el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento se absorbe directamente en una planta antes de su trasplante, la parte de la raíz o toda la planta puede sumergirse en una solución o suspensión del regulador del crecimiento vegetal con una concentración de 0,001 ppm a 10.000 ppm.
Las semillas de la planta diana pueden tratarse directamente con una formulación del regulador del crecimiento 65 vegetal descrito en este documento.
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Ejemplos de dicho método de tratamiento incluyen un método que comprende sumergir semillas de una planta en el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento preparado de modo que la concentración de un ingrediente activo pueda ser de 1 a 10.000 ppm, un método que comprende pulverizar o recubrir las semillas de una planta con el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento preparado de modo que la concentración
5 de un ingrediente activo pueda ser de 1 a 10.000 ppm, y un método que comprende recubrir las semillas de una planta con polvo del regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento.
El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento puede mezclarse con un medio de cultivo acuoso para cultivo acuoso, o puede usarse como uno de los componentes del medio para cultivo tisular. Cuando el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento se usa para cultivo acuoso, el regulador del crecimiento vegetal puede disolverse o suspenderse en un medio de cultivo acuoso tal como Enshi a una concentración de 0,001 ppm a 10.000 ppm. Cuando el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento se usa para cultivo tisular o cultivo celular, el regulador del crecimiento vegetal puede disolverse o suspenderse en un medio de cultivo tisular vegetal convencionalmente usado, tal como un medio MS a una concentración de 0,001
15 ppm a 10.000 ppm. En este caso, pueden añadirse convencionalmente sacáridos como fuente de carbono y diversas hormonas vegetales al medio.
El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento también puede usarse en combinación con un fungicida, un insecticida, un acaricida, un nematocida, un herbicida, un regulador del crecimiento vegetal y/o un fertilizante.
Sus cantidades de aplicación y concentraciones de aplicación pueden variar dependiendo del tipo de formulación, la cronología, lugar y método de aplicación, el tipo de planta y el efecto a esperar, y por lo tanto pueden aumentarse o disminuirse sin limitación hasta los intervalos anteriores.
25 En el método de regulación del crecimiento vegetal descrito anteriormente, puede usarse el regulador del crecimiento vegetal.
También es posible especificar una sustancia que tenga la capacidad de promover el crecimiento de una raíz de una planta evaluada por el método para ensayar la capacidad de una sustancia de ensayo de promover el crecimiento de una raíz de una planta que comprende la primera etapa y la segunda etapa usando un receptor de citoquinina seleccionado entre el grupo A, y después poner la sustancia especificada que tiene la capacidad de promover el crecimiento de una raíz de una planta en contacto con una planta para promover el crecimiento de una raíz de la planta. Un método para poner la sustancia especificada que tiene la capacidad de promover el crecimiento de una
35 raíz de una planta en contacto con una planta incluye el método de formulación y el método de aplicación descritos anteriormente.
El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento puede usarse con el fin de mejorar el establecimiento de plántulas y mejorar la tasa de arraigamiento en el suelo mediante la promoción del crecimiento de las raíces tras cultivo directo de plántulas de arroz. El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento también puede usarse con el fin de promover el crecimiento de raíces después de cultivar plántulas de arroz en un cajón de vivero. El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento también puede usarse con el fin de mejorar el engrosamiento de la raíz y la resistencia al calor y la sequedad del césped de un campo de golf. En el caso de cultivos tales como soja, maíz y trigo, el regulador del crecimiento vegetal descrito en este
45 documento puede usarse con el fin de mejorar el engrosamiento de la raíz, mejorar la productividad por establecimiento de plántulas en una fase prematura o reducir la cantidad de aplicación de herbicidas. En el caso del cultivo de tomate, papel o similares, el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento puede usarse con el fin de mejorar la tasa de arraigamiento en suelo después de trasplante. En el caso de producción de plántulas de verduras, puede esperarse que el uso del regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento conduzca a un establecimiento uniforme de plántulas y por lo tanto una mejora en la eficacia del trasplante mecánico.
El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento puede usarse para controlar la dominancia apical de una planta. Por ejemplo, el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento puede usarse para 55 inhibir el crecimiento de yemas axilares de tabaco, rosa y similares. El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento puede controlar la formación de yemas florales de cultivos frutales, plantas de floración y similares, y por lo tanto puede usarse como agente debilitador de flores. El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento también puede aumentar las yemas florales, y de este modo aumentar el rendimiento de cultivos frutales
o puede conseguirse mejora de la calidad de plantas de floración. El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento también puede inhibir el crecimiento de ramificaciones de cultivos frutales para disminuir la cantidad de ramificaciones o puede promover el crecimiento de ramificaciones de cultivos frutales para aumentar la cantidad de ramificaciones, y por lo tanto puede utilizarse para controlar el crecimiento de un cuerpo arbóreo.
El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento puede usarse para tecnologías de cultivo tisular
65 tales como desdiferenciación en callos o rediferenciación a partir de callos. Por ejemplo, el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento puede usarse para promover la formación de callos a partir de tejidos vegetales.
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El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento también puede usarse para mejorar la eficacia de rediferenciación a partir de un embrión adventicio de soja o similares.
El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento puede usarse para controlar el envejecimiento de
5 una planta. Por ejemplo, el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento puede usarse para inhibir el envejecimiento de y mejorar el mantenimiento de flores cortadas de plantas de floración tales como claveles. El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento también puede usarse para inhibir la maduración de frutos. El regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento también puede prevenir el envejecimiento de hojas de plántulas de arroz con cáscara, y por tanto puedan cultivarse buenas plántulas. Una planta tal como el
10 algodón puede tratarse con el regulador del crecimiento vegetal descrito en este documento antes de recogerlo para promover el envejecimiento de las hojas.
El receptor de citoquinina derivado de plantas que consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en el grupo B anterior puede usarse como herramienta de estudio. Por ejemplo, puede usarse como herramienta de estudio para
15 realizar estudios tales como el ensayo de la capacidad de promover el crecimiento de una raíz de una planta o la búsqueda de una sustancia química que tenga la capacidad de controlar el crecimiento o diferenciación de una planta como se ha descrito anteriormente. El receptor de citoquinina también puede usarse como herramienta de estudio en estudios para analizar un mecanismo de acción de un fármaco que actúa sobre un receptor de citoquinina.
20 También puede usarse un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos mostrada en el grupo B y un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la misma, una secuencia de nucleótidos parcial de un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos mostrada en el grupo B o un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos parcial, y un polipéptido que
25 comprende una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 ó 4 como herramientas de estudio. Por ejemplo, una parte de ellos puede funcionar como un polinucleótido a usar en el proceso de producción de un receptor de citoquinina como se ha descrito anteriormente. También puede usarse una parte de ellos como una importante herramienta de estudio para obtener un polinucleótido mostrado en el polinucleótido del grupo B usando PCR, o para obtener un polinucleótido mostrado en el polinucleótido del grupo B usando hibridación, como se ha descrito
30 anteriormente.
Cuando se realiza la selección de un regulador del crecimiento vegetal, puede usarse como herramienta de ensayo en experimentos de selección. Específicamente, pueden usarse como herramienta de ensayo en experimentos para el ensayo de la capacidad de promover el crecimiento de una raíz de una planta y la búsqueda de una sustancia
35 química que tenga la capacidad de controlar el crecimiento o diferenciación de una planta como se ha descrito anteriormente.
También se describe un sistema (a partir de ahora en este documento, a veces mencionado como el sistema descrito en este documento) que comprende un medio para introducir, almacenar y gestionar datos de información 40 sobre una actividad (o la presencia o ausencia de señalización intracelular o la cantidad de la misma) de una sustancia de ensayo para inhibir la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula (a partir de ahora en este documento, a veces mencionado como el medio a), un medio para consultar y buscar los datos de información basados en condiciones deseadas (a partir de ahora, a veces mencionado como medio b), y un medio para presentar y extraer los datos consultados y buscados (a partir de ahora en este
45 documento, a veces mencionado como el medio c).
En primer lugar, se describe el medio a. Como se ha descrito anteriormente, el medio a es un medio que introduce datos de información de una actividad de una sustancia de ensayo para inhibir la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula, y después almacena y gestiona la información introducida. 50 Dicha información se introduce mediante un medio de entrada 1 y se memoriza habitualmente en un medio de memoria 2. El medio de entrada incluye un medio capaz de introducir la información, tal como un teclado o un ratón. Cuando se ha completado la introducción, almacenamiento y gestión de la información, la información progresa hasta el posterior medio b. En el almacenamiento y gestión de la información, puede almacenarse y gestionarse de forma eficaz un lote de datos introduciendo información que tenga una estructura de datos usando hardware tal
55 como un ordenador y software tal como OS y bases de datos, y almacenando la información en un dispositivo apropiado de almacenamiento, por ejemplo, un medio de grabación legible en ordenador tal como un disco flexible, un disco fotomagnético, un CD-ROM, un DVD-ROM, o un disco duro.
Se describe el medio b. Como se ha descrito anteriormente, el medio b es un medio que consulta y busca los datos
60 de información almacenados y gestionados por el medio a basados en condiciones para obtener los resultados deseados. Cuando las condiciones de consulta y búsqueda se introducen por el medio de entrada 1 y se selecciona habitualmente la información correspondiente a las condiciones de la información almacenada en el medio de almacenamiento 2, la información progresa hasta el posterior medio c. Los resultados seleccionados se almacenan habitualmente en el medio de almacenamiento 2 y pueden presentarse por la pantalla y el medio de salida 3.
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Se describe el medio c. Como se ha descrito anteriormente, el medio c es un medio que presenta y extrae los resultados consultados y buscados. El medio de presentación y de salida 3 incluyen una pantalla, y una impresora, y los resultados pueden presentarse en un dispositivo de presentación de un ordenador, o extraerse en un papel por impresión.
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Ejemplos
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle por medio de los Ejemplos, pero la presente invención no se limita a los mismos.
El compuesto (I) usado en la presente invención se describirá más específicamente por medio de los Ejemplos de Síntesis y los Ejemplos de Síntesis de Referencia, pero el compuesto (I) no se limita a estos ejemplos.
En los Ejemplos de Síntesis y los Ejemplos de Síntesis de Referencia, "temperatura ambiente" normalmente se
15 refiere a una temperatura de 10 ºC a 30 ºC. "1H RMN" se refiere a un espectro de resonancia magnética de protones. Usando tetrametilsilano como un estándar interno, la medición se realizó con un espectrómetro (400 MHz), Modelo JNM-AL400, fabricado por JEOL Ltd. y los desplazamientos químicos () se expresaron como ppm. "P.f. " se refiere a punto de fusión y se midió con un medidor del punto de fusión, Modelo Mettler FP61.
Las abreviaturas usadas en los siguientes Ejemplos de Síntesis, Ejemplos de Síntesis de Referencia y las Tablas 3 a 7 tienen los siguientes significados. CDCl3: cloroformo deuterado, DMSO-d6: dimetilsulfóxido deuterado, s: singlete,
d: doblete, t: triplete, c: cuadruplete, dd: doblete de dobletes, m: multiplete, a: ancho, J: constante de acoplamiento, Me: metilo, Et: etilo, Pr: propilo, i-Pr: isopropilo, t-Bu: butilo terciario, Ph: fenilo, Ac: acetilo, THF: tetrahidrofurano, DMF: N,N-dimetilformamida, DMSO: dimetilsulfóxido y MTBE: metil terc-butiil éter
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Ejemplo de Síntesis 1 (Preparación de 2,8-dicloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ia1-11))
A 1,24 g de 8-cloro-4-fenil-2(1H)-quinazoclinona (compuesto Nº II-11) se le añadieron 6,65 g de oxicloruro de fósforo seguido de agitación a 95 ºC durante 1 hora. La solución de reacción resultante se vertió en 200 ml de hielo-agua y después se añadió bicarbonato sódico, ajustando de este modo el pH a 9. Después, los cristales precipitados se recogieron por filtración. El producto recogido se recristalizó en etanol para obtener 1,07 g del compuesto del título.
P.f. 154,4 ºC. 1H RMN (CDCl3): 7,52-7,65 (4H, m), 7,76-7,80 (2H, m), 8,02-8,08 (2H, m).
Ejemplo de Síntesis 2 (Preparación de 2-amino-6,8-dicloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ic12-4))
35 Una mezcla de 300 mg de 2,6,8-tricloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ia1-12), 30 g de una solución acuosa al 28 % de amoniaco y 6 ml de acetonitrilo se hizo reaccionar a 105 ºC durante 1,5 horas en un recipiente de reacción resistente a la presión. La solución de reacción resultante se enfrió y después se vertió en 100 ml de agua. La mezcla se extrajo con 60 ml de acetato de etilo y el extracto resultante se concentró. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (cloroformo) para obtener 230 mg del compuesto del título. P.f. 212,7 ºC. 1H RMN (CDCl3): 5,56 (2H, s a., 7,54-7,60 (3H, ml, 7,63-7,68 (2H, m), 7,74 (1H, d, J = 2,3 Hz), 7,79 (1H, d, J = 2,3 Hz).
Ejemplo de Síntesis 3 (Preparación de 6-cloro-2-furfurilamino-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ic3-16))
45 Una mezcla de 275 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ia1-3) y 496 mg de furfurilamina se agitó a 85 ºC durante 40 minutos y después se vertió en 30 ml de agua. La mezcla se extrajo con acetato de etilo y el extracto resultante se lavó con agua y después se concentró. El residuo resultante se recristalizó en etanol para obtener 280 mg del compuesto del título. P.f. 142,0 ºC. 1H RMN (CDCl3): 4,77 (2H, d, J = 5,6 Hz), 5,70 (1H, t a, J = 5,6 H2), 6,29-6,32 (2H, m), 7,36 (1H, dd, J = 1,8, 0,9 Hz), 7,53-7,70 (7H, m), 7,76 (1H, d, J = 2,2 Hz).
Ejemplo de Síntesis 4 (Preparación de 6-cloro-2-etoxicarbonilmetilamino-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ic3-33))
55 A 550 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ia1-3) y 419 mg de clorhidrato de glicina etil éster se les añadieron 3 ml de DMF y 607 mg de trietilamina seguido de agitación a 85 ºC durante 5,5 horas. La solución de reacción resultante se vertió en 100 ml de agua y se extrajo con acetato de etilo. El extracto se concentró. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano:acetato de etilo = 6:1 a 3:1 para obtener 503 mg del compuesto del título. P.f. 146,1 ºC. 1H RMN (CDCl3): 1,30 (3H, t. J = 7,2 Hz), 4,25 (2R, c, J = 7,2 Hz), 4,31 (2H, d, J = 5,2 Hz), 5,97 (1H, s a), 7,54-7,63 (5H, m), 7,67-7,70 (2H, m), 7,79 (1H, s).
Ejemplo de Síntesis 5 (Preparación de 6-cloro-2-metoxiamino-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ic3-22))
A una mezcla de 275 mg de 2, 6-dicloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ia1-3), 10 ml de acetonitrilo y 334 mg de
65 clorhidrato de metoxiamina se le añadieron gota a gota 506 mg de trietilamina a temperatura ambiente para obtener una mezcla. La mezcla se cargó en un recipiente de reacción resistente a la presión hecho de acero inoxidable y la
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reacción se realizó a 105 ºC durante 3,5 horas. Después de un periodo de refrigeración, la solución de reacción se vertió en 100 ml de agua. La mezcla se extrajo con acetato de etilo y el extracto resultante se lavó con agua y después se concentró. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano:acetato de etilo = 3:1) para obtener 156 mg de cristales en bruto. Los cristales en bruto se recristalizaron en
5 acetato de etilo para obtener 55 mg del compuesto del título. P.f. 173,9 ºC. 1H RMN (CDCl3): 3,96 (3H, s), 7,47-7,72 (6H, m), 7,87 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,89 (1H, d, J = 2,2 Hz), 8,03 (1H, s a).
Ejemplo de Síntesis 6 (Preparación de 6-cloro-2-(2-hidroxietiltio)-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ie3-1))
A una solución de 86 mg de 2-mercaptoetanol en DMF (7,5 ml) se le añadieron 44 mg de hidruro sódico (60 %) seguido de agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la mezcla de reacción se le añadieron 275 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ia1-3) seguido de agitación a temperatura ambiente durante 2 horas. La solución de reacción se vertió en 100 ml de agua y se extrajo con acetato de etilo. El extracto resultante se concentró.
15 El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo:hexano = 1:5) para obtener 266 mg del compuesto del título. P.f. 124,4 ºC. 1H RMN (CDCl3): 3,50 (2H, t, J = 5,5 Hz), 3,64 (1H, t a), 4,07 (2H, tipo c, J = 5,5 Hz), 7,57-7,61 (3H, m), 7,71-7,74 (2H, m), 7,77 (1H, dd, J = 8,9, 2,3 H), 7,85 (1H, d, J = 8,9 Hz), 7,97 (1H, d, J = 2,3 Hz).
Ejemplo de Síntesis 7 (Preparación de 6-cloro-2-formamido-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ic3-35))
A una solución de 54 mg de formamida seca en DMF (5 ml) se le añadieron 48 mg de hidruro sódico (60 %) seguido de agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la mezcla de reacción se le añadieron 275 mg de 2,6
25 dicloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ia1-3) seguido de calentamiento a 85 ºC y agitación adicional durante 3 horas. La solución de reacción resultante se vertió en 100 ml de agua y se extrajo con acetato de etilo. El extracto se concentró. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo:hexano = 1:3) para obtener 64 mg del compuesto del título. P.f. 252,1 ºC. 1H RMN: 7,59-7,66 (3H, m), 7,72-7,81 (3H, m), 7,88 (1H, d, J = 8,8 Hz), 8,02 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,37 (1H, d a, J = 10,4 Hz), 9,71 (1H, d, J = 10,4 Hz).
Ejemplo de Síntesis 8 (Preparación de 6-cloro-2-(1-metilhidrazino)-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ic3-27))
Una mezcla de 275 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ia1-3) y 461 mg de monometilhidrazina se agitó a 85 ºC durante 30 minutos. El producto de reacción resultante se enfrió y al mismo se le añadieron 200 ml de
35 agua. Los cristales precipitados se recogieron por filtración y el producto recogido se purificó por cromatografía en columna (acetato de etilo) para obtener 225 mg del compuesto del título. P.f. 155,9 ºC. 1H RMN (CDCl3): 3,52 (3H, s), 4,65 (2H, s), 7,54-7,63 (5H, m), 7,70-7,74 (2H, m), 7,80 (1H, d, J = 2,0 Hz).
Ejemplo de Síntesis 9 (Preparación de 2-(2-aminoetoxi)-6-cloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Id3-1))
De la misma manera que en el Ejemplo de Síntesis 6, se hicieron reaccionar 500 mg de 2,6-dicloro-4fenilquinazolina (compuesto Nº Ia1-3) y 382 mg de N-(2-hidroxietil)ftalimida para obtener 380 mg de 6-cloro-4-fenil-2(2-ftalimidoetoxi)quinazolina. P.f. 154,7 ºC. 1H RMN (CDCl3): 4,25 (2H, t, J = 5,8 Hz), 4,84 (2H, t, J = 5,8 Hz), 7,537,60 (3H, m), 7,67-7,71 (3H, m), 7,72-7,76 (3H, m), 7,78-7,82 (2H, m), 7,97 (1H, d, J = 2,2 Hz).
45 Una mezcla de 380 mg de 6-cloro-4-fenil-2-(2-ftalimidoetoxi)quinazolina, 70 mg de hidrazina hidrato y 6 ml de etanol se calentó a reflujo durante 2 horas. A la solución de reacción resultante se le añadieron 1,2 ml de agua, y después el etanol se retiró por destilación. Al residuo resultante se le añadieron 1,5 ml de ácido clorhídrico concentrado seguido de calentamiento a reflujo durante 1 hora. El producto de reacción resultante se enfrió y se vertió en una solución saturada de bicarbonato sódico en agua y se extrajo con acetato de etilo. El extracto se concentró para obtener 240 mg del compuesto del título. P.f. 134,9 ºC. 1H RMN (CDCl3): 3,59-3,63 (2H, m), 3,84 (2H, t, J = 4,6 Hz), 6,15 (2H, s a), 7,53-7,59 (5H, m), 7,63-7,67 (2H, m), 7,75 (1H, d, J = 1,2 Hz).
Ejemplo de Síntesis 10 (Preparación de 2-(2-acetiltioetilamino)-6-cloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ic355 14))
A una solución de 292 mg de trifenilfosfina en THF deshidratado (3 ml) se le añadieron gota a gota 563 mg de una solución al 40 % de diisopropilcarbodiimida en tolueno en refrigeración con hielo seguido de agitación durante 20 minutos. A la suspensión resultante se le añadió gota a gota una solución de 167 mg de 6-cloro-2-(2hidroxietilamino)-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ic3-1) en THF deshidratado (2 ml) en refrigeración con hielo, e inmediatamente se añadieron gota a gota 127 mg de ácido tioacético. La solución transparente de color amarillo resultante se agitó durante 1 hora en refrigeración con hielo, se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, se vertió en una solución saturada de bicarbonato sódico en agua y después se extrajo con cloroformo. El extracto se concentró. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (cloroformo:acetato de
65 etilo = 10:1) para obtener 170 mg del compuesto del título. P.f. 128,9 ºC. 1H RMN (CDCl3): 2,34 (3H, s), 3,22 (2H, t, J = 6,5 Hz), 3,73 (2H, c, J -6,5 Hz), 5,74 (1H, t a, J = 6,5 Hz), 7,53-7,62 (5H, m), 7,65-7,70 (2H, m), 7,77 (1H, s).
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Ejemplo de Síntesis 11 (6-cloro-2-(2-mercaptoetilamino)-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ic3-13) y disulfuro de bis[2-(6-cloro-4-fenil-2-quinazolinil)aminoetilo] (compuesto Nº Ic3-15))
Una mezcla de 108 mg de 2-(2-acetiltioetilamino)-6-cloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ic3-14), 2 ml de etanol y
5 362 mg de una solución acuosa al 10 % de hidróxido sódico se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se agitó en calentamiento a reflujo durante 30 minutos. Después, las sustancias insolubles se recogieron por filtración de la solución de reacción. El producto recogido (sólido) se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (cloroformo:acetato de etilo = 10:1) para obtener 50 mg de 6-cloro-2-(2-mercaptoetilamino)-4-fenilquinazolina, en primer lugar. P.f. 165,9 ºC. 1H RMN (CDCl3): 1,46 (1H, t, J = 8,5 Hz), 2,84 (2H, tipo c, J = 7,2 Hz), 3,66 (2H, tipo c, J
10 = 6,4 Hz), 5,79 (1H, t a, J = 5,4 Hz), 7,55-7,57 (3H, m), 7,60 (2H, s), 7,66-7,69 (2H, m), 7,77-7,78 (1H, m). Después, se obtuvieron 28 mg de disulfuro de bis[2-(6-cloro-4-fenil-2-quinazolinil)aminoetilo] (compuesto representado por la siguiente fórmula).
imagen23
15 P.f. 159,2 ºC. 1H RMN (CDCl3): 3,02 (4H, t, J = 6,4 Hz), 3,89 (4H, c, J = 6,4 Hz), 5,81 (2H, t a, J = 6,4 Hz), 7,51-7,61 (10H, m), 7,63-7,68 (4H, m), 7,75 (2H, d, J = 2,2 Hz).
Se muestran ejemplos de compuestos que pueden prepararse de la misma manera que en los Ejemplos de Síntesis que se han descrito anteriormente y compuestos disponibles en el mercado en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 5 y la 20 Tabla 6 (incluyendo también los compuestos preparados en los Ejemplos de Síntesis que se han descrito anteriormente).
Ha de apreciarse que "a)", "b)", "c)" y "d)" en la Tabla 4 y la Tabla 5 son como se indica a continuación.
25 Tabla 3
Compuesto Nº
R Ar (X)n Punto de fusión (ºC)
Ia1-1
Cl Ph 5-Cl 125,7
Ia1-2
Cl Ph 6-F 131,9
Ia1-3
Cl Ph 6-Cl 166,2
Ia1-4
Cl Ph 6-Br 185,1 (descomposición)
Ia1-5
Cl Ph 6-Me 137,6
Ia1-6
Cl Ph 6-CF3 117,5 (descomposición)
Ia1-7
Cl Ph 6-NO2 242,5 (descomposición)
Ia1-8
Cl Ph 6-OMe 148,6
Ial-9
Cl Ph 6-ON 206,8 (descomposición)
Ia1-10
Cl Ph 7-Cl 115,4
Ia1-11
Cl Ph 8-Cl 154,4
Ia1-12
Cl Ph 6,8-Cl2 160,3
Ia1-13
Cl p-Cl-Ph 6-Cl 205,6
Ia1-14
Cl m-Cl-Ph 6-Cl 161,3
Ib4-1
CHO o-Cl-Ph 6-Br
Ic0-1
NH(CH2)2OH Ph (n = 0)
Ic1-1
NH(CH2)3OH Ph 5-Cl 175,7
Ic2-1
NH(CH2)2OH Ph 6-F 99,3
Ic3-1
NH(CH2)2OH Ph 6-Cl 137,9
Ic3-2
pirrolidino Ph 6-Cl
Ic3-3
NH(CH2)2OH Ph 6-Cl 135,9
Ic3-4
NH(CH2)OH Ph 6-Cl 115,6
Ic3-5
NH(CH2)5OH Ph 6-Cl 117,2
Ic3-6
NMe(CH2)2OH Ph 6-Cl 128,5
Ic3-7
NH(CH2)2OMe Ph 6-Cl 89,7
Ic3-8
NHn-Pr Ph 6-Cl 158,3
Ic3-9
NMe(CH2)2OMe Ph 6-Cl 88,5
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Tabla 4
Compuesto Nº
R Ar (X)n Punto de fusión (ºC)
Ic3-10
NH(CH2)2CHMe2 Ph 6-Cl 90,1
Ic3-11
NH(CH2)6OH Ph 6-Cl 107,9
Ic3-12
NH(CH2)2CH(Me)CH2OH Ph 6-Cl 112,7
Ic3-13
NH(CH2)2SH Ph 6-Cl 165,9
Ic3-14
NH(CH2)2SAc Ph 6-Cl 128,9
Ic3-15
a) 159,2
Ic3-16
Nhfurfurilo Ph 6-Cl 142,0
Ic3-17
NHCH2CH=CMe2 Ph 6-Cl 95,9
Ic3-18
NHCH2CH=C(Me)CH2OH Ph 6-Cl 154,8
Ic3-19
NH2 Ph 6-Cl 157,8
Ic3-20
NHNH2 Ph 6-Cl 175,0
Ic3-21
NH(CH2)2NMe2 Ph 6-Cl 102,1
Ic3-22
NH(CH2)4NH2 Ph 6-Cl 118,0
Ic3-23
NHMe Ph 6-Cl 186,9
Ic3-24
NHEt Ph 6-Cl 156,7
Ic3-25
NMe2 Ph 6-Cl 141,8
Ic3-26
NHCH2CN Ph 6-Cl 208,6 (descomposición)
Ic3-27
NMeNH2 Ph 6-Cl 155,9
Ic3-28
NHi-Pr Ph 6-Cl 112,5
Ic3-29
NHCH2CH=CH2 Ph 6-Cl 147,3
Ic3-30
NHCH2CCH Ph 6-Cl 168,4
Ic3-31
NHCH2CONH2 Ph 6-Cl 140,3
Ic3-32
NHOMe Ph 6-Cl 173,9
Ic3-33
NHCH2CO2Et Ph 6-Cl 146,1
Ic3-34
NHCH2CH2CN Ph 6-Cl 198,7
Ic3-35
NHCHO Ph 6-Cl 252,1
Ic3-36
guanidina Ph 6-Cl 253,4 (descomposición)
Tabla 5
Compuesto Nº
R Ar (X)n Punto de fusión (ºC)
Ic3-37
NHtetrahidrofurfurilo Ph 6-Cl jarabe, a)
Ic3-38
NH(CH2)3OMe Ph 6-Cl 89,1
Ic3-39
NHCH2CH(OH)CH3 Ph 6-Cl 154,2
Ic3-40
NH(CH2)2O(CH2)2OH Ph 6-Cl 117,4
Ic3-41
NHCH2CH(OH)CH2OH Ph 6-Cl 147,0
Ic3-42
NHCH2CO2Me Ph 6-Cl 190,5
Ic3-43
NHCH2CH2CO2Me Ph 6-Cl 117,1
Ic3-44
NHCH(Me)CH2OH Ph 6-Cl 52,8
Ic3-45
NHCH2CH2OEt Ph 6-Cl jarabe, c)
Ic3-46
NH(CH2)2OEt Ph 6-Cl jarabe, d)
Ic4-1
NH(CH2)2OH Ph 6-Br
Ic4-2
NH(CH2)2OH Ph 6-Br 140,9
Ic4-3
NHCH2CO2Me Ph 6-Br 183,1
(descomposición)
Ic5-1
NH-p-Cl-Ph Ph 6-Me
Ic5-2
NHCH2CONH2 Ph 6-Me
Ic5-3
NHCH2CO2Et Ph 6-Me
Ic5-4
NH2 Ph 6-Me 151,8
Ic5-5
NH(CH2)3OH Ph 6-Me 121,1
Ic6-1
NH2 Ph 6-CF2 160,4
Ic6-2
NH(CH2)3OH Ph 6-CF3 135,1
Ic7-1
NH(CH2)3OH NH(3OH Ph 6-NO2 177,4
Ic8-1
CH2) NH(CH2)2OH Ph 6-OMe 115,9
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Compuesto Nº
R Ar (X)n Punto de fusión (ºC)
Ic9-1
NH(CH2)3OH Ph 6-CN 173,3 (descomposición)
Ic10-1
NH(CH2)3OH Ph 7-Cl 129,7
Tabla 6
Compuesto Nº
R Ar (X) n Punto de fusión (ºC)
Ic11-1
NH(CH2)2OH Ph 8-Cl 115,5
Ic12-1
NH(CH2)3OH Ph 6,8-Cl2 146,2
Ic12-2
NHCH2CH2OH Ph 6,8-Cl2 168,8
Ic12-3
NHfurfurilo Ph 6,8-Cl2 158,6
Ic12-4
NH2 Ph 6,8-Cl2 212,7
Ic12-5
NHCH2CN Ph 6,8-Cl2 204,7
Ic12-6
NHCH2CO2Me Ph 6,8-Cl2 201,4
Id3-1
O(CH2)2NH2 Ph 6-Cl 134,9
Ie3-1
S(CH2)2OH Ph 6-Cl 124,4
Ie3-2
S(CH2)2NH2 Ph 6-Cl 88,3
a) La estructura se describió en el Ejemplo de Síntesis 11. b) 1H RMN (CDCl3): 1,66-1,75 (1H, m), 1,86-2,08 (3H, m), 3,57-3,64 (1H, m), 3,75-3,83 (2H, m), 3,89-3,59 (1H, m), 4,13-4,20 (1H, m), 5,70 (1H, s a), 7,52-7,60 (5H, m), 7,64-7,69 (2H, m), 7,75-7,76 (1H, m). c) 1H RMN (CDCl3): 1,22 (3H, t, J = 7,0 Hz), 3,55 (2H, c, J = 7,0 Hz), 3,68 (2H, t, J = 5,2 Hz), 3,78 (2H, tipo c, J = 5,2 Hz), 5,75 (1H, t a), 7,53-7,60 (5H, m), 7,65-7,69 (2H, m), 7,75-7,77 (1H, m). d) 1H RMN (CDCl3): 1,22 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,96 (2H, quintuplete, J = 6,3 Hz), 3,50 (2H, c, J = 7,0 Hz), 3,58 (2H, t, J = 6,3 Hz), 3,67 (2H, tipo c, J = 6,3 Hz), 5,65 (1H, t a), 7,53-7,60 (5H, m), 7,65-7,69 (2H, m), 7,74-7,76 (1H, m).
5 Ejemplo de Síntesis de Referencia 1 (Preparación de 8-cloro-4-fenil-2(1H)-quinazolinona (compuesto Nº II11))
A 7,10 g de bromuro de fenilmagnesio (solución al 32 % en THF) se le añadió gota a gota una solución de 953 mg de 2-amino-3-clorobenzonitrilo en THF (7 ml) a temperatura ambiente seguido de calentamiento a reflujo durante 30
10 minutos. Al producto de reacción resultante se le añadieron gota a gota 885 mg de clorocarbonato de metilo en refrigeración con hielo seguido de calentamiento a reflujo durante 40 minutos. La solución de reacción resultante se enfrió y se vertió en 40 ml de ácido clorhídrico 2 N, y a la misma se le añadieron 8 g de bicarbonato sódico y 20 ml de MTBE seguido de agitación. Los cristales precipitados se recogieron por filtración para obtener 1,30 g del compuesto del título. 1H RMN (DMSO-d6): 7,24 (1H, t, J = 8,0 Hz), 7,57-7,70 (6H, m), 7,90-7,93 (1H, m), 11,45 (s a).
15
Ejemplo de Síntesis de Referencia 2 (4-fenil-6-trifluorometil-2(1H)-quinazolinona (compuesto Nº II-6))
A una solución de 762 mg de 2-amino-5-trifluorometilbenzofenona en 10 ml de cloroformo se le añadieron gota a gota 349 mg de trietilamina, y después se añadieron gota a gota 627 mg de cloruro de tricloroacetilo en refrigeración
20 con hielo. Después de agitar a la misma temperatura durante 30 minutos, se añadieron 50 ml de agua, separando de este modo la solución. La capa orgánica se recogió y después se concentró. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano:acetato de etilo = 5:1) para obtener 1,08 g de 2'-benzoil-2,2,2tricloro-4'-trifluorometilacetanilida. 1H RMN (CDCl3): 7,53-7,58 (2H, m), 7,66-7,75 (3H, m), 7,90-7,95 (2H, m), 8,81 (1H, d, J = 8,6 Hz), 12,38 (1H, s a).
25 Una mezcla de 1,08 g de 2'-benzoil-2,2,2-tricloro-9'-trifluorometilacetanilida, 10 ml de DMSO y 1,18 g de acetato amónico se agitó a 75 ºC durante 1 hora. Después de un periodo de refrigeración, se añadieron 100 ml de agua y los cristales precipitados se recogieron por filtración. La sustancia recogida resultante se disolvió en una mezcla de hexano:acetato de etilo = 1:1, se deshidrató usando sulfato de magnesio anhidro y después se concentró para
30 obtener 765 mg del compuesto del título. 1H RMN (CDCl3): 7,58-7,68 (3H, m), 7,75 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,79-7,83 (2H, m), 7,53 (1H, dd, J = 8,6, 1,7 Hz), 8,17 (1H, s a), 13,37 (1H, s a).
Se muestran ejemplos de compuestos que pueden prepararse de la misma manera que en los Ejemplos de Síntesis de Referencia que se han descrito anteriormente en la Tabla 7 (incluyendo también los compuestos preparados en 35 los Ejemplos de Síntesis de Referencia que se han descrito anteriormente).
Ha de apreciarse que "a)" a "i)" en la Tabla 7 son como se indica a continuación.
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06-03-2015
Tabla 7
Compuesto Nº
Ar (X)n Punto de fusión (ºC)
II-1
Ph 5-Cl a)
II-2
Ph 6-F b)
II-3
Ph 6-Cl >300
II-4
Ph 6-Br c)
II-5
Ph 6-Me 291,9
II-6
Ph 6-CF3 d)
II-7
Ph 6-NO2 280 (descomposición)
II-8
Ph 6-OMe e)
II-9
Ph 6-CN f)
II-10
Ph 7-Cl g)
II-11
Ph 8-Cl h)
II-12
Ph 6,8-Cl2 i)
II-13
p-Cl-Ph 6-Cl 269,6(descomposición)
II-14
m-Cl-Ph 6-Cl 295(descomposición)
a) 1H RMN (DMSO-d6): 7,27 (1H, dd, J = 7,7, 1,0 Hz), 7,38 (1H, dd, J = 8,3, 1,1 Hz), 7,43-7,55 (5H, m), 7,69 (1H, t, J = 8,1 Hz), 12,18 (1H, s a). b) 1H RMN (DMSO-d6): 7,35 (1H, dd, J = 9,2, 2,7 Hz), 7,43 (1H, dd, J = 9,2, 4,8 Hz), 7,58-7,74 (6H, m), 12,05 (1H, s a). c) 1H RMN (DMSO-d6): 7,35 (1H, d, J = 9,2 Hz), 7,59-7,71 (6H, m), 7,91 (1H, dd, J = 9,2, 2,2 Hz), 12,08 (1H, s a). d) 1H RMN descrita en el Ejemplo de Síntesis de Referencia 2 e) 1H RMN (CDCl3): 3,78 (3H, s), 7,25-7,27 (1H, m), 7,36-7,40 (1H, m), 7,54-7,62 (4H, m), 7,81-7,85 (2H, m), 13,37 (1H, s a). f) 1H RMN (DMSO-d6): 7,48 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,60-7,68 (3H, m), 7,71-7,74 (2H, m), 8,05 (1H, s), 8,08-8,12 (1H, m), 12,36 (1H, s a). g) (sin aislar ni purificar) h) 1H RMN descrita en el Ejemplo de Síntesis de Referencia 1 i) 1H RMN (DMSO-d6): 7,52-7,72 (6H, m), 8,10-8,12 (1H, m), 11,69 (1H, s a).
Ejemplo 1 (Construcción de biblioteca de fagos de ADNc de Arabidopsis thaliana para clonación de CER1)
5 Se estilizaron semillas de Arabidopsis thaliana, línea Wassilewskija con alcohol etílico al 70% durante un minuto y después con hipoclorito sódico al 1,5% durante 10 minutos. Las semillas se lavaron bien con agua estéril y después se cultivaron en un medio GM (mezcla salina basal de Murashige y Skoog 4,3, sacarosa al 1%, 10 ml de MES-KOH al 5% (pH 5,7), Phytagel™ (SIGMA) al 0,3%) durante 2 semanas para obtener 5 g de una planta. La planta se
10 congeló en nitrógeno líquido y después se molió físicamente con un mortero. Al producto molido obtenido se añadió una mezcla de 10 mg de tampón de extracción (Tris-HCl 200 mM (pH 8,5), NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, SDS al 0,5%, -mercaptoetanol 14 mM) y 10 g de fenol. La mezcla se agitó mediante una mezcladora Voltex. Después, se añadieron 10 ml de cloroformo a la mezcla, seguido de agitación minuciosa. Después, la mezcla obtenida se centrifugó a 10.000 rpm durante 20 minutos, y se recogió una capa acuosa. A la capa acuosa recogida se añadió
15 LiCl a una concentración final de 2 M, seguido de reposo a -80ºC durante 3 horas. El producto congelado obtenido se descongeló y después se centrifugó a 10.000 rpm durante 20 minutos. Se recogió un precipitado. El precipitado recogido se disolvió en 2 ml de TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM). Después de añadir 0,2 ml de acetato sódico 3 M (pH 5,2) y 5 ml de etanol a la solución, la mezcla se centrifugó para recoger un precipitado de ADN. Después, se extrajo ARN que contenía poliA del precipitado recogido (ARN) con Oligotex™ dT30super (fabricado
20 por Roche Japan Co., Ltd.).
Se construyó una biblioteca de ADNc en fagos a partir del ARN extraído que contenía poliA usando el kit ZAPcDNASynthesis (fabricado por Stratagene Co., Ltd.) de acuerdo con las instrucciones del kit. El título de la biblioteca de ADNc en fagos construida fue 500.000 PFU.
25
Ejemplo 2 (Preparación de sonda de ADN para CRE1)
Se realizó reacción de PCR usando un líquido de fagos (aproximadamente 1.000.000 PFU) de la biblioteca de ADNc en fagos preparada en el Ejemplo 1 como molde y un ADN de la SEC ID Nº 3 y un ADN de la SEC ID Nº 4 como
30 cebadores, usando el kit TAKARA LA Tag™ (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) para amplificar un ADN. Los detalles se describen a continuación.
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06-03-2015
El líquido de reacción de PCR se preparó añadiendo composiciones de reacción tales como dNTP a 1.000.000 PFU del fago y cada uno de los ADN cebadores 0,2 mM de acuerdo con las instrucciones del kit. La PCR se realizó en condiciones que después de mantenimiento en calor a 94ºC durante 2 minutos, se ejecutaron 40 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y a 68ºC durante 5 minutos, para amplificar el fragmento
5 deseado de ADN. Después, se preparó una sonda marcada con 32P usando el fragmento amplificado de ADN como molde y usando el kit Megaprime DNA-labelling system (fabricado por Amersham Pharmacia). Aquí, se preparó un líquido de reacción (25 l) añadiendo 32PdCTP 2,0 MBg a 25 ng del fragmento amplificado de ADN y después añadiendo composiciones de reacción especificadas por el kit al mismo. La reacción de marcaje se realizó a 37ºC durante 10 minutos.
Ejemplo 3 (Obtención de clon de ADNc en fago que porta el gen CRE1)
El gen DRE1 deseado se clonó por hibridación de placas usando la sonda de ADN preparada en el Ejemplo 2. A continuación se describen los detalles.
15 Se formaron placas usando la biblioteca de ADNc en fagos preparada en el Ejemplo 1 de acuerdo con las instrucciones del kit ZAP-cDNARSynthesis. Los ADN se adsorbieron en un filtro de nitrocelulosa desde las placas formadas, y después se fijaron en el filtro mediante tratamiento ultravioleta. El filtro así preparado se mantuvo a 65ºC en presencia de SSC 6 x (NaCl 0,9 M, citrato sódico 0,09 M), solución de Denhart 5 x (0,1% (p/v), Ficol 400, polivinil pirrolidona al 0,1% (p/v), BSA al 0,1%), SDS al 0,5% (p/v), y 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado o en una solución DIG EASY Hyb (Boehringer Mannheim Co., Ltd.) que contenía 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, mantenido dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en presencia de SSC 1 x (NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M) y SDS al 0,5%, y después mantenido a 68ºC durante 30 minutos en presencia de SSC 0,1 x (NaCl 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M) y SDS al 0,5% para obtener un clon de
25 ADNc en fago hibridado.
Ejemplo 4 (Clonación del ADNc de CRE1)
Se realizó reacción de PCR usando ADNc del clon de ADNc en fago obtenido en el Ejemplo 3 como molde y usando un ADN de la SEC ID Nº 5 y un ADN de la SEC ID Nº 6 como cebadores para amplificar un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 5. A continuación se describen los detalles.
La reacción de PCR se realizó usando ADN polimerasa potenciada Herculase (fabricada por TOYOBO Co., Ltd.) en condiciones de amplificación que después de mantenimiento en calor a 94ºC durante 1 minuto, se ejecutaron 25
35 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y a 72ºC durante 4 minutos. Aquí, se preparó un Líquido de reacción de PCR (50 l) añadiendo composiciones de reacción tales como dNTP a 500 ng de ADNc del clon de ADNc en fago y 100 ng de cada ADN cebador of primer de acuerdo con las instrucciones del kit.
Como se ha descrito anteriormente, se amplificó el fragmento deseado de ADN.
Ejemplo 5 (Construcción de plásmido de expresión de CRE1)
Se digirió un vector de expresión de levadura, p415CYC (Munberg et al. Gene: 156 119-122 (1995), disponible en la biblioteca ATCC (Nº 87382)) con la enzima de restricción Sma I. Después, el fragmento de ADN obtenido en el
45 Ejemplo 4 (un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2) se conectó a una secuencia promotora CYC1 del vector de expresión p415CYC1 usando ADN ligasa T4, y de este modo se incorporó de modo que la proteína deseada podría expresarse en levadura. Se confirmó que la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN estaba insertada en la dirección correcta y era una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2 usando un secuenciador. Por tanto, se obtuvo el plásmido de expresión p415CYC-CRE1.
Ejemplo 6 (Producción de la célula transformada TM182-CRE1 y la célula transformada TM182-p415CYC1)
Cada uno del plásmido de expresión p451CYC-CRE1 obtenido en el Ejemplo 5 y el vector de expresión de levadura p425CYC se usó para transformar una cepa deficiente en el gen Sln1, TM182 (sln1Δ) (Maeda T et al. Nature: 369
55 242-245 (1994)). La transformación se realizó usando un método de transformación mediado por polietilenglicol/acetato de litio (PEG/LiAc) de acuerdo con VII. Library Transformation & Screening Protocols descritos en CLONTECH Co., Ltd.: MATCHMAKER Two-Hybrid System 3 User Manual, página 22. Como desaparece la necesidad nutricional de leucina en la célula transformada obtenida, se seleccionaron levaduras transformadas capaces de crecer en un medio DOLU + Gal para obtener la célula transformada TM182-CRE1 y la célula transformada TM182-p415CYC1.
Ejemplo 7 (Método para buscar sustancia química capaz de inhibir la señalización intracelular desde receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula)
65 La célula transformada TM182-CRE1 y la célula transformada TM182-p415CYC1 obtenidas en el Ejemplo 6 se inocularon cada una en 10 ml de un medio DOLU + Gal, y se preincubaron a 30ºC durante 18 horas para obtener un
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líquido de preincubación para cada una de las células transformadas. El líquido de preincubación se diluyó con un medio DOLU + Glu para la célula transformada TM182-CRE1 o con un medio DOLU + Gal para la célula transformada TM182-p415CYC1 hasta que se alcanzó DO600 = 0,1, para obtener una dilución de preincubación para cada una de las células transformadas.
5 A cada pocillo de una placa de 96 pocillos se añadió 1 l de una solución de 200 ppm de una sustancia de ensayo en dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar una placa de ensayo. Al mismo tiempo, como controles, se añadió solamente 1 l de DMSO a una parte de los pocillos. Se preparó una placa de ensayo para la célula transformada TM182-CRE1 y una placa de ensayo para la célula transformada TM182-p415CYCl.
10 Una solución de 10.000 ppm de trans-zeatina (citoquinina) en DMSO se diluyó 50 veces con un medio DOLU + Gul hasta 200 ppm. La solución de 200 ppm de trans-zeatina se añadió en una cantidad de 3/1.000 de volumen a cada dilución de preincubación descrita anteriormente para preparar cada dilución de preincubación que contiene transzeatina a 0,6 ppm. La dilución de preincubación de 0,6 ppm se añadió en una cantidad de 100 l a cada uno de los
15 pocillos de la placa de ensayo para cada célula transformada. Las placas se incubaron a 30ºC durante 24 horas. Después, se midió la turbidez (DO 600) de cada pocillo usando un lector de placa. La actividad de la sustancia de ensayo para inhibir la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula se ensayó comparando la turbidez medida con la turbidez del pocillo de control. Los resultados se muestran en las Tablas 8 y 9.
20 Para la célula transformada TM182-CRE1, se seleccionó una sustancia de ensayo que tenía una turbidez inferior que la turbidez del pocillo de control como sustancia química capaz de inhibir la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula. Para la célula transformada TM182-p415CYC1, sin embargo, una sustancia de ensayo que tenía una turbidez inferior que la turbidez del pocillo de control en que el
25 grado de disminución es equivalente a o mayor que en el caso de la célula transformada TM182-CRE1 era tóxica para la levadura, y por lo tanto no se seleccionó como sustancia química capaz de inhibir la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula.
(Tasa de crecimiento relativo en la sección de ensayo respecto a la sección de control) [%] = [(Turbidez 30 en la sección de ensayo) -(Turbidez en el blanco)] / [(Turbidez en la sección de control) -(Turbidez en el blanco)] x 100
(Actividad de inhibición de la señalización intracelular desde receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula) [%] = 100 -(Tasa de crecimiento relativo en la sección de ensayo respecto a la sección de 35 control)
Tabla 8
Sustancia química (compuesto Nº)
Tasa de crecimiento relativo (%) en la sección de ensayo de sustancia de ensayo respecto a la sección de control Actividad (%) de sustancia de ensayo para inhibir la señalización intracelular desde receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula
Célula transformada TM182-CRE1
Célula transformada TM182-p415CYC1
Ia1-3
5,5 113,9 94,5
Ial-7
1,2 78,8 98,8
Ib4-1
8,7 110,9 91,3
Ic11-1
2,2 114,5 97,8
Ic12-1
2,8 106,3 97,2
Ic2-1
2,8 124,6 97,2
IC3-1
5,4 114,1 94,6
Ic3-3
1,4 108,6 98,6
Ic3-4
1,4 106,4 98,6
Ic3-5
3,5 115,4 96,5
Ic3-6
2,8 114,6 97,2
Ic3-7
2,8 104,1 97,2
Ic3-9
1,5 122,0 98,5
Ic3-11
3,9 84,6 96,1
Ic3-12
5,6 90,9 94,4
Ic3-16
3,2 97,0 96,8
Ic3-18
4,0 105,3 96,0
Ic3-19
2,4 102,7 97,6
Ic3-20
5,0 86,5 95,0
Ic3-21
5,0 121,6 95,0
Ic3-22
4,9 110,6 95,1
Ic3-23
4,1 108,1 95,9
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Sustancia química (compuesto Nº)
Tasa de crecimiento relativo (%) en la sección de ensayo de sustancia de ensayo respecto a la sección de control Actividad (%) de sustancia de ensayo para inhibir la señalización intracelular desde receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula
Célula transformada
Célula transformada
Ic3-24
2,1 112,5 97,9
Ic3-25
6,0 122,0 94,0
Ic3-26
5,3 110,7 94,7
Ic3-27
2,3 107,4 97,7
Ic3-29
1,6 92,7 98,4
En todos los casos, la concentración existente de trans-zeatina se ajustó a 0,6 ppm y la concentración existente de una sustancia química se ajustó a 2 ppm.
Tabla 9
Sustancia química (compuesto Nº)
Tasa de crecimiento relativo (%) en la sección de ensayo de sustancia de ensayo respecto a la sección de control Actividad (%) de sustancia de ensayo para inhibir la señalización intracelular desde receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula
Célula transformada TM182-CRE1
Célula transformada TM182-p415CYC1
Inc3-30
2,2 108,9 97,8
Ic3-32
4,5 89,2 95,5
Ic3-33
1,0 114,6 99,0
Ic3-34
0,2 118,5 99,8
Ic3-37
3,5 114,2 96,5
Ic3-38
1,2 99,4 98,8
Ic3-39
-1,3 108,1 101,3
Ic3-40
0,7 123,4 99,3
Ic3-41
8,8 123,3 91,2
Ic3-42
-0,7 111,5 100,7
Ic3-43
0,8 122,0 99,2
Ic3-44
7,0 101,4 93,0
Ic3-45
0,8 98,7 99,2
Ic3-46
1,3 92,2 98,7
Ic4-1
4,6 95,0 95,4
Ic4-2
0,9 109,3 99,1
Ic5-4
8,9 116,6 91,1
Ic5-5
7,2 126,3 92,8
Ic7-1
6,7 115,8 93,3
Id3-1
2,1 112,5 97,9
Ie3-1
2,3 110,7 97,7
5 En todos los casos, la concentración existente de trans-zeatina se ajustó a 0,6 ppm y la concentración existente de una sustancia química se ajustó a 2 ppm.
Ejemplo 8 (Método para ensayar la respuesta a dosis de sustancia química capaz de inhibir la señalización 10 intracelular desde receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula)
Las sustancias químicas (que inhiben la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula) seleccionados en el Ejemplo 7 se ensayaron a variables concentraciones de ensayo del mismo modo que en el Ejemplo 7. La célula transformada TM182-CRE1 y la célula transformada TM182-p415CYC1 15 obtenidas en el Ejemplo 6 se incubaron en las mismas condiciones que en el Ejemplo 7 excepto que las concentraciones de ensayo de las sustancias químicas (que inhiben la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula) seleccionadas en el Ejemplo 7 se variaron dentro del intervalo de 0,06 ppm a 6 ppm. La concentración de la sustancia química ensayada se ajustó con DMSO. Después de completar la incubación, se examinó la respuesta a dosis para la actividad de inhibición de la señalización intracelular desde un
20 receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula a partir de la concentración de ensayo mínima a la que no se observó estado proliferativo de la célula transformada TM182-CRE1, o a partir de una curva de inhibición de crecimiento de respuesta a dosis obtenida por un método como se describe a continuación.
Para hacer una curva de inhibición de crecimiento de respuesta a dosis, primero se calculó una tasa de crecimiento 25 relativo del siguiente modo.
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(Tasa de crecimiento relativo) [%] = (B) / (A) x 100
(A)
= [(Turbidez en la sección de ensayo de 0,06 ppm) -(Turbidez en el blanco)] / [(Turbidez en la sección de control) -(Turbidez en el blanco)]
(B)
= [(Turbidez en cada sección de ensayo) -(Turbidez en el blanco)] / [(Turbidez en la sección de control) -(Turbidez en el blanco)]
5
Entonces, se hizo un gráfico en que el eje X mostraba la concentración de una sustancia química de ensayo y el eje
10 Y mostraba una tasa de crecimiento relativo (véase la Fig. 1, figuras de la izquierda: célula transformada TM182-CRE1, figuras de la derecha: célula transformada TM182-p415CYC1) para obtener una curva de inhibición del crecimiento de respuesta a dosis.
Ejemplo 9 (Ensayo de actividad promotora del crecimiento de raíces)
15 Se preparó medio convencional Enshi que tenía la siguiente composición (véase la Tabla 10). Se distribuyeron en tubos de agrupación en cada uno 4 l de una solución de una sustancia química en DMSO hasta una concentración final de 0,001 ppm a 10 ppm, y después, se distribuyeron en cada uno 600 l del medio convencional Enshi esterilizado. Después se mezcló bien la solución resultante. En cada uno de los tubos de agrupación, se sembraron
20 10-20 semillas de Arabidopsis thaliana, y se cultivaron a 22ºC durante 10 días en luz. Después, se midió la longitud de las raíces principales (raíces principales promedio) generadas a partir de las semillas de Arabidopsis thaliana. Se determinó un promedio de ocho repeticiones, y se determinó una tasa de crecimiento de raíces de acuerdo con la siguiente ecuación. Como resultado, pudo juzgarse que una sustancia química que mostraba una tasa significativa de crecimiento de raíces (por ejemplo, una tasa de crecimiento de raíces del 120% o más) tenía una actividad
25 promotora del crecimiento de raíces.
Como resultados detallados, se mostraron concentraciones finales que mostraban las tasas de crecimiento de raíces más altas en la Tabla 11 y la Tabla 12.
30 Tasa de crecimiento de raíces (%) = (Longitud primerio de raíz principal en la sección tratada con sustancia química) / (Longitud promedio de raíz principal en la sección de control) x 100
Tabla 10
Composición
Concentración (mg/l)
Nitrato de calcio
Ca (NO3)2·4H2O 950
Nitrato de potasio
KNO3 810
Sulfato de magnesio
MgSO4·7H2O 500
Fosfato de amonio
NH4H2PO4 155
Quelato de hierro
Fe-EDTA 22,62
Ácido bórico
H3BO3 2,86
Sulfato de manganeso
MnSO4·4H2O 1,81
Sulfato de zinc
ZnSO4·7H2O 0,22
Sulfato de cobre
CuSO4·5H2C 0,08
Molibdato de sodio
Na2MoO4·2H2O 0,025
Ajustado a pH 5,8
Tabla 11
Compuesto Nº
Concentración final de ensayo (ppm) Actividad promotora del crecimiento de raíces
Ic3-3
5 163,4
Ic3-4
0,625 129,5
Ic3-5
0,625 134,0
Ic3-6
0,625 122,4
Ic3-7
1,25 142,5
Inc3-8
1,25 136,4
Ia1-3
5 137,5
Ie3-1
5 120,9
Ie3-2
10 147,6
Ic3-10
10 120,6
Ic3-11
1,25 128,2
Ic3-12
1,25 128,9
Ic3-13
10 140,5
Ic3-14
2,5 126,2
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Compuesto Nº
Concentración final de ensayo (ppm) Actividad promotora del crecimiento de raíces
Ic3-15
5 131,0
Ic3-16
5 155,3
Ic3-17
10 121,3
Ic3-18
2,5 139,5
Ic3-19
1,25 155,6
Ic3-20
10 137,8
Ic3-21
2,5 131,7
Ic3-22
0,156 129,3
Ic3-23
10 150,0
Ic3-24
1,25 122,6
Ic3-25
10 140,0
Ic3-26
5 136,4
Ic3-27
2,5 127,8
Ic5-4
2,5 136,6
Ic5-5
2,5 157,8
Ic3-28
10 120,4
Ic3-29
10 122,4
Ic3-31
10 142,2
Ic3-32
5 123,4
Ic3-33
5 123,9
Tabla 12
Compuesto Nº
Concentración final de ensayo (ppm) Actividad promotora del crecimiento de raíces
Ic3-35
10 144,4
Ic3-36
2,5 123,1
Ia1-1
5 133,3
Ia1-2
10 139,7
Ic2-1
2,5 127,4
Ic9-1
10 141,5
Ic1-1
2,5 150,9
Ic10-1
10 163,6
Ic11-1
5 143,9
Ic12-1
2,5 184,6
Ic6-2
2,5 155,9
Ia1-6
0,625 126,9
Ic8-1
10 162,1
Ic3-37
5 138,5
Ic3-38
5 141,9
Ic3-39
10 169,0
Ic3-40
0,625 125,8
Ic3-41
5 134,5
Ic3-42
0,625 128,6
Ic3-43
2,5 137,9
Ic3-44
1,25 126,5
Ic3-46
2,5 121,6
IC12-3
2,5 138,8
Ia1-14
0,156 129,3
II-5
10 124,4
II-7
5 124,4
II-14
2,5 126,1

Ejemplo 10 (Evaluación usando lechuga de la actividad promotora del crecimiento de raíces de la sustancia capaz de inhibir la señalización de citoquinina)
5 Con respecto a la sustancia química Ic3-1 y la sustancia química Ic7-1 (que inhiben la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula) seleccionadas en el Ejemplo 7, se evaluó una actividad promotora del crecimiento de la raíz principal usando lechuga (Lactuca sativa Red wave). Se prepararon soluciones acuosas de la sustancia química que tenían diferentes concentraciones (0,6 ppm, 1,2 ppm, 2,5 ppm, 5
10 ppm, 10 ppm, 20 ppm, conteniendo cada una DMSO al 0,1%), y se añadieron en una cantidad de 1 ml en un papel de filtro que tenía un diámetro de 50 mm en una placa petri de plástico de 60 . Después, se sembraron 30 semillas de lechuga en la placa petri de plástico. Después de cultivar en luz a 22ºC durante 4 días, se midió la longitud de
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se centrifugaron a 4ºC y 1.000xg durante 5 minutos para recoger células de la célula transformada TM 182-p425GPD-CRE1. Las células resultantes se suspendieron de nuevo en el tampón fosfato enfriado hasta 4ºC y después se centrifugaron a 4ºC y 1.000xg durante 5 minutos para recoger células de la célula transformada TM182-p425GPD-CRE1. Las células resultantes se suspendieron de nuevo en un tampón fosfato que contenía DTT 5 (ditiotreitol) y PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) (preparado añadiendo DTT 5 mM y PMSF 0,5 mM al tampón fosfato descrito anteriormente) en una cantidad de 3 veces (basada en células). Después, se distribuyeron 200 l de la suspensión en un tubo de 1,5 ml que contenía 250 l de perlas de vidrio (0,25 a 0,5 mm de diámetro) previamente enfriadas a 4ºC. El tubo de 1,5 ml se agitó con una mezcladora de microtubos (MT-360 fabricada por TOMY) a la potencia máxima durante 30 segundos y después se enfrió en hielo durante 1 minuto, y esta operación se repitió una 10 vez más. Además, el tubo de 1,5 ml se agitó con un impactador de múltiples perlas (MB-200, Yasui Kikai Corporation) a una potencia (MEDIDOR DE VELOCIDAD) de 2.000 durante 30 segundos y después se enfrió en hielo durante 1 minuto, y esta operación se repitió dos veces adicionales. Después, el tubo de 1,5 ml se centrifugó a 4ºC y 1.500xg durante 10 minutos para recoger el sobrenadante. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de 1,5 ml y se centrifugó a 4ºC y 10.000xg durante 3 minutos para recoger el sobrenadante. El sobrenadante se
15 centrifugó a 4ºC y 100.000xg durante 1 hora usando una supercentrífuga para recoger el precipitado. El precipitado resultante se disolvió en un tampón fosfato que contenía monocaprato de sacarosa al 1% (preparado añadiendo monocaprato de sacarosa al 1% al tampón fosfato descrito anteriormente) para obtener una fracción de proteína de membrana de la célula transformada TN182-p425GPD-CRE1.
20 Del mismo modo, se preparó una fracción de proteína de membrana de la célula transformada TM182-p425GPD.
Ejemplo 19 (Método para examinar la inhibición de la unión de citoquinina al receptor de citoquinina por sustancia química)
25 La fracción de proteína de membrana de la célula transformada TM182-p425GPP-CRE1 obtenida en el Ejemplo 18 y citoquinina que estaba marcada con un radioisótopo of hidrógeno, tritio de modo que llegara ser altamente radioactiva se usaron para examinar que una sustancia de ensayo inhibía la unión de citoquinina a un receptor de citoquinina. A continuación se describen los detalles.
30 Como citoquinina marcada con un radioisótopo of hidrógeno, tritio de modo que llegara a ser altamente radiactiva, se usó [3H]N-6-(isopent-2-enil)adenina fabricada por Amersham Biosciences (a partir de ahora en este documento, mencionada como radiomarcador 2IP). Tenía una radiactividad específica de 74,0 GBq/mmol y una concentración de radiactividad de 37,0 MBq/ml.
35 Primero, se mezclaron 100 g de la fracción de proteína de membrana de la célula transformada TM182-p415CYC1, una dilución de radiomarcador 2IP a una concentración predeterminada con un tampón fosfato y 1 l de una dilución de sustancia de ensayo a una concentración predeterminada con DMSO, en un tampón fosfato para preparar 100 l de un líquido de reacción. Después, el líquido de reacción se dejó en reposo en hielo durante 1 hora y después se filtró con un filtro de vidrio GF/B (fabricado por Whatman) para recoger una fracción de proteína de membrana de la
40 célula transformada TM182-p425GPD-CRE1. El filtro de vidrio se sumergió en un cóctel de centelleo líquido Ultima Gold (fabricado por PerkinElmer Co., Ltd.), y se midió la radiactividad mediante un contador de centello líquido. Para el control, se realizó el mismo ensayo usando una fracción de proteína de membrana de la célula transformada TM182-p425GPD. Para eliminar la influencia de la radiactividad debida a unión no específica del radiomarcador 2IP, se sustrajo un valor de radiactividad obtenido en el ensayo usando la fracción de proteína de membrana de la célula
45 transformada TM182-p425GPD de un valor de radiactividad obtenido en el ensayo usando la fracción de proteína de membrana de la célula transformada TM182-p425GPD-CRE1. Los resultados de ensayo se muestran en la Fig. 10.
En el caso donde la sustancia de ensayo era trans-zeatina o Ic3-4, la radiactividad estaba disminuida en comparación con el caso donde la sustancia de ensayo no se añadía (solamente DMSO que se usó como disolvente
50 de una sustancia de ensayo) o la sustancia de ensayo era ácido abscísico.
Ejemplo 20 (Evaluación de la actividad promotora del establecimiento de posición de arroz de sustancia capaz de inhibir la señalización de citoquinina mediante tratamiento de semillas en un ensayo directo de siembra sobre campo inundado)
55 Se trataron semillas de arroz (Oryza sativa japonica Nipponbare) con la sustancia química Ic3-1 (que inhibe la señalización intracelular desde un receptor de citoquinina derivado de plantas de una célula) seleccionada en el Ejemplo 7, y se cultivaron en condiciones de siembra directa. Después, se examinó una tasa de establecimiento de posición, y por tanto se evaluó una actividad promotora del establecimiento de posición de arroz de la sustancia
60 química.
Primero, se preparó una solución de plasta blanco que contenía Color Coat Red al 5% (v/v) (fabricado por BECKER UNDERWOOD), CF-Clear al 5% (v/v) (fabricado por BECKER UNDERWOOD) y Maxim-XL al 0,42% (v/v) (fabricado por Syngenta). En 1,3 ml de la solución de plasta blanco, se disolvieron 6,25 mg, 12,5 mg, 25 mg o 50 mg de la 65 sustancia química Ic3-3. Las semillas se trataron con la solución en una cantidad de 1,3 ml por 50 g de semillas
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cromatografía en columna sobre gel de sílice (cloroformo) para obtener 230 mg del compuesto del título. P.f. 212,7 ºC. 1H RMN (CDCl3): 5,56 (2H, s a), 7,54-7,60 (3H, m), 7,63-7,68 (2H, m), 7,74 (1H, d, J = 2,3 Hz), 7,79 (1H, d, J = 2,3 Hz).
5 Ejemplo de Síntesis 13 (Preparación de 6-cloro-2-furfurilamino-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ib-8))
Una mezcla de 275 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº II-2) y 486 mg de furfurilamina se agitó a 85 ºC durante 40 minutos y después se vertió en 50 ml de agua. La mezcla se extrajo con acetato de etilo, y el extracto resultante se lavó con agua y después se concentró. El residuo resultante se recristalizó en etanol para
10 obtener 280 mg del compuesto del título. P.f. 142,0 ºC. 1H RMN (CDCl3): 4,77 (2H, d, J = 5,6 Hz), 5,70 (1H, t a, J = 5,6 Hz), 6,29-6,32 (2H, m), 7,36 (1H, dd, J -1,8, 0,9 Hz), 7,53-7,70 (7H, m), 7,78 (1H, d, J = 2,2 Hz).
Ejemplo de Síntesis 14 (Preparación de 6-cloro-2-etoxicarbonilmetilamino-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ib-15))
15 A 550 mg de 2,6-dicloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº II-2) y 419 mg de clorhidrato de glicina etil éster se les añadieron 3 ml de DMF y 607 mg de trietilamina seguido de agitación a 85 ºC durante 5,5 horas. La solución de reacción resultante se vertió en 100 ml de agua y se extrajo con acetato de etilo, y después el extracto se concentró. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano:acetato de etilo = 6:1 a
20 3:1) para obtener 503 mg del compuesto del título. P.f. 146,1 ºC. 1H RMN (CDCl3): 1,30 (3H, t, J = 7,2 Hz), 4,25 (2H, c, J = 7,2 Hz), 4,31 (2H, d, J = 5,2 Hz), 5,97 (1H, a, s), 7,54-7,63 (5H, m), 7,67-7,70 (2H, m), 7,79 (1H, s).
Ejemplo de Síntesis 15 (Preparación de 6-cloro-2-formamido-4-fenilquinazolina (compuesto Nº Ib-17))
25 A una solución de 54 mg de formamida seca en DMF (5 ml) se le añadieron 48 mg de hidruro sódico (60 %) seguido de agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la mezcla de reacción se le añadieron 275 mg de 2,6dicloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº II-2) seguido de calentamiento a 85 ºC y agitación adicional durante 3 horas. La solución de reacción resultante se vertió en 100 ml de agua, se extrajo con acetato de etilo, y después el extracto se concentró. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de
30 etilo:hexano = 1:3) para obtener 64 mg del compuesto del título. P.f. 252,1 ºC. 1H RMN: 7,59-7,66 (3H, m), 7,72-7,81 (3H, m), 7,88 (1H, d, J = 8,8 Hz), 8-02 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,37 (1H, d a, J = 10,4 Hz), 9,71 (1H, d, J = 10,4 Hz).
Se muestran ejemplos de compuestos que pueden prepararse de la misma manera que en los Ejemplos de Síntesis que se han descrito anteriormente en la Tabla 14 y la Tabla 15 (incluyendo también los compuestos preparados en 35 los Ejemplos de Síntesis que se han descrito anteriormente). Ha de apreciarse que "a)", "b)" y "c)" en la Tabla 14 y la Tabla 15 son como se indica a continuación.
a) 1H RMN (CDCl3): 1,66-1,75 (1H, m), 1,86-2,08 (3H, m), 3,57-3,64 (1H, m), 3,75-3,83 (2H, m), 3,89-3,59 (1H, m), 4,13-4,20 (1H, m), 5,70 (1H, s a), 7,52-7,60 (5H, m), 7,64-7,69 (2H, m), 7,75-7,76 (1H, m).
40 b) 1H RMN (CDCl3): 1,22 (3H, t, J = 7,0 Hz), 3,55 (2H, c, J = 7,0 Hz), 3,68 (2H, t, J = 5,2 Hz), 3,78 (2H, tipo c, J = 5,2 Hz), 5,75 (1H, t a), 7,53-7,60 (5H, m), 7,65-7,69 (2H, m), 7,75-7,77 (1H, m). c) 1H RMN (CDCl3): 1,22 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,96 (2H, quintuplete, J = 6,3 Hz), 3,50 (2H, c, J = 7,0 Hz), 3,58 (2H, t, J = 6,3 Hz), 3,67 (2H, tipo c, J = 6,3 Hz), 5,65 (1H, t a), 7,53-7,60 (5H, m), 7,65-7,69 (2H, m), 7,74-7,76 (1H, m).
45 Tabla 14
Compuesto Nº
R11 m X1 n X2 Punto de fusión (ºC)
Ia-1
(CH2)3OH 1 5-Cl 0 - 175,7
Ib-1
(CH2)4OH 0 - 1 Cl 115,6
Ib-2
(CH2)5OH 0 - 1 Cl 117,2
Ib-3
(CH3)2OMe 0 - 1 Cl 89,7
Ib-4
n-Pr 0 - 1 Cl 158,3
Ib-5
(CH2)2CHMe2 0 - 1 Cl 90,1
Ib-6
(CH2)6OH 0 - 1 Cl 107,9
Ib-7
(CH2)2CH(Me)CH2OH 0 - 1 Cl 112,7
Ib-8
furfurilo 0 - 1 Cl 142,0
Ib-9
CH2CH=CMe2 0 - 1 Cl 95,9
Ib-10
CH2CH=C(Me)CH3OH 0 - 1 Cl 154,8
Ib-11
Et 0 - 1 Cl 156,7
Ib-12
i-Pr 0 - 1 Cl 112,5
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Compuesto Nº
R11 m X1 n X2 Punto de fusión (ºC)
Ib-13
CH2CH=CH2 0 - 1 Cl 147,3
Ib-14
CH2CCH 0 - 1 Cl 168,4
Ib-15
CH2CO2Et 0 - 1 Cl 146,1
Ib-16
CH2CH2CN 0 - 1 Cl 198,7
Ib-17
CHO 0 - 1 Cl 252,1
Ib-18
tetrahidrofurfurilo 0 - 1 Cl jarabe, a)
Ib-19
(CH2)3OMe 0 - 1 Cl 89,1
Ib-20
CH2CH(OH)CH3 0 - 1 Cl 154,2
Ib-21
(CH2)2(CH2)2OH 0 - 1 Cl 117,4
Ib-22
C2CH(OH)CH2OH 0 - 1 Cl 197,0
Ib-23
CH2CO2Me 0 - 1 Cl 190,5
Ib-24
CH2CH2CO2Me 0 - 1 Cl 117-1
Ib-25
CH(Me)CH2OH 0 - 1 Cl 52,8
Ib-26
CH2CH2OEt 0 - 1 Cl jarabe, a)
Ib-27
(CH2)3CEt 0 - 1 Cl jarabe, c)
Tabla 15
Compuesto Nº
R11 m X1 n X2 Punto de fusión (ºC)
Ic-1
(CH2)3OH 1 7-Cl 0 - 129,7
Id-1
(CH2)3OH 1 8-Cl 0 - 115,5
Ie-1
(CH2)3OH 1 8-Cl 1 Cl 146,2
Ie-2
CH2CH2OH 1 8-Cl 1 Cl 168,8
Ie-3
furfurilo 1 8-Cl 1 Cl 158,6
Ie-4
H 1 8-Cl 1 Cl 212,7
Ie-5
CH2CN 1 8-Cl 1 Cl 204,7
Ie-6
CH2CO2Me 1 8-Cl 1 Cl 201,4
If-1
(CH2)3OH 0 - 1 Br 140,9
If-2
CH2CO2Me 0 - 1 Br 183,1 (descomposición)
Ig-1
H 0 - 1 CF3 160,4
Ig-2
(CH2)3OH 0 - 1 CF3 135,1
Ih-1
(CH2)3OH 0 - 1 CN 173,3 (descomposición)
Ejemplo de Síntesis de Referencia 3 (Preparación de 2,8-dicloro-4-fenilquinazolina (compuesto Nº II-4))
5 A 1,24 g de 8-cloro-4-fenil-2(1H)-quinazolinona (compuesto Nº IV-4) se le añadieron 6,65 g de oxicloruro de fósforo seguido de agitación a 95 ºC durante 1 hora. La solución de reacción resultante se vertió en 200 ml de hielo-agua y a la misma se le añadió bicarbonato sódico, ajustando de este modo el pH a 9. Después, los cristales precipitados se recogieron por filtración y se recristalizaron en etanol para obtener 1,07 g del compuesto del título. P.f. 154,4 ºC. 1H
10 RMN CDCl3): 7,52-7,65 (4H, m), 7,76-7,80 (2H, m), 8,02-8,08 (2H, m).
Se muestran ejemplos de compuestos que pueden prepararse de la misma manera que en el Ejemplo de Síntesis de Referencia 3 que se ha descrito anteriormente en la Tabla 16 (incluyendo también los compuestos preparados en el Ejemplo de Síntesis de Referencia 3).
15
imagen28
imagen29
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Tabla 19
Compuesto Nº
Concentración final de ensayo (ppm) Actividad promotora del crecimiento de raíces
Ia-1
2,5 150,9
Ib-1
0,625 129,5
Ib-2
0,625 139,0
Ib-3
11,25 142,5
Ib-4
1,25 136,4
Ib-5
10 120,6
Ib-6
1,25 128,2
Ib-7
1,25 128,9
Ib-8
5 155,3
Ib-9
10 121,3
Ib-10
2,5 139,5
Ib-11
1,25 122,8
Ib-12
10 120,4
Ib-13
10 122,4
Ib-15
10 140,4
Ib-17
2,5 134,0
Ib-18
5 138,5
Ib-19
5 141,9
Ib-20
10 169,0
Ib-21
0,625 125,8
Ib-22
1,5 134,5
Ib-23
0,625 128,6
Ib-24
2,5 137,9
Ib-25
1,25 126,5
Ib-27
2,5 121,6
Ic-1
10 163,6
Id-1
5 143,9
Ie-1
2,5 184,6
Ie-3
2,5 138,8
Ig-2
2,5 155,9
Ih-1
10 141,5
A continuación se describen formulaciones de medios usados en la presente invención.
(a) medio DOLU + Go 5 Base de nitrógeno Eacto-yeast sin aminoácidos 6,7 g Glucosa 20 g SC-HIS-LEU-URA (Q-BIOgene) 1,66 g Histidina 0,076 g Agua destilada 1000 ml 10 (b) medio DOLU + Gal Base de nitrógeno Bacto-yeast sin aminoácidos 6,7 g Glucosa 20 g SC-HIS-LEU-URA (Q-BIOgene) 1,66 g Histidina 0,076 g 15 Agua destilada 1000 ml
Aplicabilidad industrial
De acuerdo con la presente invención, es posible proporcionar un agente capaz de controlar el crecimiento o 20 diferenciación de na planta, y un método para buscar una sustancia química que tenga una actividad biológica útil cuya diana haya quedado clara, es decir, un método para seleccionar una sustancia química usando una actividad sobre una diana específica como indicador para controlar químicamente un sitio diana. Lista de secuencias texto libre SEC ID Nº 3 25 Cebador oligonucleotídico diseñado para PCR SEC ID Nº 4 Cebador oligonucleotídico diseñado para PCR SEC ID Nº 5 Cebador oligonucleotídico diseñado para PCR 30 SEC ID Nº6

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  1. imagen1
    imagen2
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