ES2542688T3 - Planta de maíz MON88017 y composiciones y procedimientos de detección de la misma - Google Patents

Planta de maíz MON88017 y composiciones y procedimientos de detección de la misma Download PDF

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ES2542688T3 ES04813968.7T ES04813968T ES2542688T3 ES 2542688 T3 ES2542688 T3 ES 2542688T3 ES 04813968 T ES04813968 T ES 04813968T ES 2542688 T3 ES2542688 T3 ES 2542688T3
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Abstract

Una planta de maíz, progenie, semilla o parte de la misma, tolerante a glifosato y resistente al gusano de la raíz del maíz, el genoma de dicha planta, progenie, semilla o parte que comprende el inserto transgénico mostrado en la Figura 2 y las secuencias de unión transgénica/genómica de SEC ID Nos: 1 y 2, el inserto transgénico mostrado en la Figura 2 que está presente en el evento de maíz MON88017 depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con número de acceso PTA-5582.

Description

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que son útiles como cebadores o sondas y que son homólogas o complementarias de al menos una porción de SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, o 5. Las moléculas de ADN se pueden usar en procedimientos de amplificación de ADN (PCR) o como sondas en procedimientos de hibridación de ácidos polinucleicos, es decir, el análisis southern, análisis northern. El vector plásmido pMON53616 usado para producir el evento de maíz MON88017 contiene dos casetes de expresión: el casete de expresión uno comprende el promotor CaMV 35S con potenciador duplicado unido al líder CAB 5’ del trigo unida al intrón de actina 1 de arroz unida a la región de codificación 1 de Cry3Bb unido a la secuencia de poliadenilación Hsp17 3’ del trigo; y unido al casete de expresión dos que comprende el promotor de actina 1 de arroz unido al intrón de actina 1 de arroz que conduce la transcripción de un péptido de tránsito al cloroplasto fusionado a la región de codificación CP4 EPSPS y unido a la región de poliadenilación 3’ NOS, la secuencia de los casetes de expresión unidos están contenidos en la SEC ID Nº: 5.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ejemplos de ciertas divulgaciones preferidas. Se debería apreciar por los expertos en la técnica que las técnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan enfoques que los inventores han encontrado que funcionan bien en la práctica de la divulgación, y por lo tanto se puede considerar para constituir ejemplos de modos preferidos para su práctica.
Ejemplos
Ejemplo 1
La planta de maíz transgénico MON88017 se generó mediante una transformación mediada por un Agrobacterium de células de maíz con un fragmento de ADN derivado de pMON53616 (Fig. 1). La construcción de transformación de la planta, pMON53616 se acopló en Agrobacterium usando un procedimiento de apareamiento triparental (Ditta et ál, Proc Natl Acad Sci 77:7347-7351, 1980). El fragmento de ADN de pMON53616 que contiene dos casetes de expresión de la planta transgén se insertó en el genoma de una célula vegetal de maíz, la célula de la planta de maíz se regeneró en la planta de maíz MON88017. La configuración del inserto en el genoma de MON88017 se muestra en la (Figura 2). El MON88017 y su progenie tienen tolerancia al glifosato y son resistentes al daño por la alimentación de las larvas del gusano de la raíz del maíz. La transformación del maíz se realizó esencialmente como se describe en el presente documento.
Los cultivos líquidos de Agrobacterium que contiene pMON53616 se inician a partir de los caldos de glicerol o de una placa recién rayada y se cultivan durante la noche a 26 ºC-28 ºC con agitación (aproximadamente 150 revoluciones por minuto , rpm) a la fase semilogarítmica de crecimiento en medio líquido LB, pH 7,0, que contiene 50 mg/l (miligramos por litro) de kanamicina, y, o bien 50 mg/l de estreptomicina o 50 mg/l de espectinomicina, y 25 mg/l de cloranfenicol con 200 M de acetosiringona (AS). Las células de Agrobacterium se resuspenden en el medio de inoculación (CM4C líquido, tal como se describe en la Tabla 8 de la Patente de Estados Unidos Nº. 6.573.361) y la densidad celular se ajusta de tal manera que las células resuspendidas tienen una densidad óptica de 1 cuando se mide en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 660 nm (es decir, OD660). Embriones inmaduros de maíz de tipo II HillxLH198 y Hill recién aislados se inoculan con Agrobacterium y se cocultivan durante 2-3 días en la oscuridad a 23 ºC. Después, los embriones se transfieren a medios de retardo (N6 1-100-12; como se describe en la Tabla 1 de la patente de Estados Unidos. Nº. 5.424.412), complementados con 500 mg/l de carbenicilina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y 20 M de AgNO3) y se incuban a 28 ºC durante 4 a 5 días. Todos los cultivos posteriores se mantienen a esta temperatura.
Los coleóptilos del maíz se extraen una semana después de la inoculación. Los embriones se transfieren al primer medio de selección (N61-0-12, como se describe en la Tabla 1 de la Patente de Estados Unidos Nº. 5.424.412), complementado con 500 mg/l de carbenicilina y 0,5 mM de glifosato. Dos semanas más tarde, los tejidos supervivientes se transfieren al medio de la segunda selección (N61-0-12) complementado con 500 mg/l de carbenicilina y 1,0 mM de glifosato. Los callos supervivientes se subcultivan cada 2 semanas en aproximadamente 3 subcultivos en 1,0 mM de glifosato. Cuando se identifican los tejidos tolerantes a glifosato, se aumenta el peso del tejido respecto a la regeneración. Respecto a la regeneración, los tejidos de los callos se transfieren al medio de regeneración (MSOD, como se describe en la Tabla 1 de la patente de Estados Unidos Nº. 5.424.412.) complementado con 0,1 M de ácido abscísico (ABA; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y se incuban durante dos semanas. Los callos regenerados se transfieren a un medio alto en sacarosa y se incuban durante dos semanas. Las plántulas se transfieren al medio MSOD (sin ABA) en un recipiente de cultivo y se incuban durante dos semanas. Después, las plantas con raíces se transfieren al suelo. Los expertos en la técnica de procedimientos de transformación de células de maíz pueden modificar este procedimiento para proporcionar plantas de maíz transgénicas que contienen la construcción de ADN de la presente invención, o usar otros procedimientos, tales como, la pistola de partículas, que se sabe que proporcionan plantas monocotiledóneas transgénicas.
La planta y la semilla MON88017 tiene partes regenerables. Las partes regenerables de la semilla incluyen, pero no se limitan al embrión, al cotiledón, y al meristemo del brote o la raíz. La invención también incluye partes de la planta de la planta de maíz MON88017 que incluyen, pero no se limitan a polen, óvulo, brotes, raíces, y hojas. La invención también incluye componentes extraíbles de la semilla MON88017 que incluyen, pero no se limitan a proteína, maicena, harina y aceite.
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(continuación)
Paso
Reactivo Cantidad Comentarios
5
Cebador del evento 2 (SEC ID Nº:7) (resuspendido en tampón TE1X o nucleasa sin agua a una concentración de 10 M) 0,4 l 0,2 M de concentración final
6
RNasa, DNasa libre (500 ng/l) 0,1 l 50 ng/reacción
7
ADN polimerasa REDTaq (1 unidad/l) 1,0 l (recomendado cambiar pipetas antes de la siguiente etapa) 1 unidad/reacción
8
ADN extraído (molde): • Muestras a analizarse * hojas individuales * hojas agrupadas (máximo de 20 hojas/grupo) • Control negativo • Control negativo • Control positivo • 10-200 ng de ADN genómico • 200 ng de ADN genómico • 50 ng de ADN genómico (no MON88017) • ADN sin molde • 50 ng de ADN genómico MON88017 -
9
Mezclar suavemente y añadir 1-2 gotas de aceite mineral en la parte superior de cada reacción
Tabla 3. Parámetros de PCR sugeridos para diversos termocicladores disponibles en el mercado
Nº de ciclo
Ajustes: Stratagene Robocycler
1
94°C 3 minutos
38
94°C 30 segundos 59°C 1 minuto 72°C 1 minuto
1
72°C 10 minutos
Nº de ciclo
Ajustes: MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 or Eppendorf Mastercycler Gradient
1
94°C 3 minutos
38
94°C 15 segundos 59°C 30 segundos 72°C 1 minuto
1
72°C 10 minutos
5 Continuar con la amplificación de ADN en un termociclador Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 o Eppendorf Mastercycler Gradient usando los siguientes parámetros de ciclación. El termociclador MJ Engine o Eppendorf Mastercycler Gradient se pondría en funcionamiento en el modo calculado. Poner en funcionamiento el termociclador Perkin-Elmer 9700 con la escala de velocidad fija al máximo.
Ejemplo 5
10 El análisis de transferencia Southern se realizó en el ADN genómico que se aisló a partir del MON88017 y del tejido del maíz de control como se describe en el Ejemplo 3. La cuantificación de muestras de ADN se realizó usando un Fluorómetro Hoefer DyNA Quant 200 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) con el marcador de tamaño molecular IX de Roche como un patrón de calibración de ADN.
Aproximadamente se usaron 20 g de ADN genómico de la sustancia de ensayo y 10 g de ADN genómico de la
15 sustancia de control para las digestiones con enzimas de restricción. Para el análisis de la estabilidad del inserto, se usaron aproximadamente 10 g de ADN genómico de la sustancia de ensayo. La digestión durante la noche se
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realizó a 37 ºC en un volumen total de ~ 500 l usando 100 unidades de la enzima de restricción apropiada. Después de la digestión, las muestras se precipitaron mediante la adición de un volumen 1/10 (50 l) de NaOAc 3 M (pH 5,2) y 2 volúmenes (1 ml relativo al volumen de digestión original) de etanol al 100%, seguido de incubación en un congelador a -20 ºC durante al menos 30 minutos. El ADN digerido se sedimentó a la máxima velocidad en una microcentrífuga, se lavó con etanol al 70%, se secó, y se redisolvió en tampón TE.
Las sondas de ADN se prepararon mediante amplificación por PCR de la parte del casete de expresión de la planta de la molde de ADN pMON53616. Aproximadamente 25 ng de cada sonda (excepto las secuencias de poliadenilación 3’ NOS y 3’TaHsp17) se marcaron con 32 P-dCTP (6000 Ci/mmol) mediante un procedimiento de cebado aleatorio (RadPrime DNA Labeling System, Life Technologies). Las secuencias de poliadenilación 3’ NOS y 3’ Tahsp17 se marcaron mediante PCR usando 25 ng de la molde de la sonda de ADN de la siguiente manera: cebadores sentido y antisentido específicos para la molde (0,25 mM cada uno); 1,5 mM MgCl2; 3 mM de cada dATP, dGTP y dTTP; ~ 100 mCi de 32P-dCTP (6000 Ci/mmol); y 2,5 unidades de ADN polimerasa Taq en un volumen final de 20 ml. Las condiciones del ciclo fueron las siguientes: 1 ciclo a 94 ºC durante 3 minutos; 2 ciclos a 94 ºC durante 45 segundos, 52 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 2 minutos; y 1 ciclo a 72 ºC durante 10 minutos. Todas las sondas radiomarcadas se purificaron usando una columna de Sephadex G-50 (Roche, Indianapolis, Ind.).
Las moléculas de ADN sintéticas para su uso como sondas para procedimientos de replicación asistida por marcadores o para la detección del ADN MON88017 en una muestra pueden hacerse comprendiendo la secuencia de ADN de la molécula de ADN de unión transgénica/genómica descrita en SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 2 o una parte sustancial de la misma.
Ejemplo 6
Los procedimientos usados para identificar los heterocigotos de la progenie homocigótica que contiene el evento MON88017 se describen en un ensayo de cigosidad para los que se describen ejemplos de condiciones en la Tabla 4 y Tabla 5. Los cebadores de ADN usados en el ensayo de cigosidad son cebadores (SEC ID Nº: 30), (SEC ID Nº: 31), (SEC ID Nº: 32), el cebador marcado con 6FAM (SEC ID Nº: 33) y el cebador marcado con VIC (SEC ID Nº: 34), 6FAM y Vic son productos colorantes fluorescentes de Applied Biosystems (Foster City, Calif) unidos al cebador de ADN.
Cuando las SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 31 y SEC ID Nº: 32 se usan en estos procedimientos de reacción producen un amplicón de ADN para el maíz no transgénico, dos amplicones de ADN para los heterocigotos de maíz que contienen el ADN del evento MON88017, y un amplicón de ADN para los homocigotos de maíz MON88017 que es distinto de cualquier otra planta de maíz no MON88017. Los controles para este análisis deberían incluir un control positivo de maíz homocigoto y heterocigoto que contiene el ADN del evento MON88017, un control negativo de maíz no transgénico, y un control negativo que no contiene molde de ADN. Este ensayo se optimiza para su uso con un termociclador Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, o Eppendorf Mastercycler Gradient. Están dentro de la experiencia de la técnica otros procedimientos y aparatos conocidos por los expertos en la técnica que producen amplicones que identifican la cigosidad de la progenie de cruces realizados con las plantas MON88017.
Tabla 4. Soluciones de reacción del ensayo de cigosidad
Paso
Reactivo Cantidad Comentarios
1
Nucleasa sin agua añadir a 10 ml de volumen final -
2
Universal Master Mix 2X (número de catálogo 4304437 de Applied Biosystems) 5 l concentración final 1X
3
Cebadores SEC ID Nº: 30, 31, y 32 (resuspendidos en nucleasa sin agua a una concentración de 20 M) 0,5 l concentración final de 0,25 M
4
Cebador 6FAM (resuspendido en nucleasa sin agua a una concentración de 10 M) 0,2 l concentración final de 0,4 M
5
Cebador VIC (resuspendido en nucleasa sin agua a una concentración de 10 M) 0,2 l concentración final de 0,15 M
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Paso
Reactivo Cantidad Comentarios
6
Polimerasa de ADN REDTaq (1 unidad/l) 1.0 l (recommended to switch pipets prior to next step) 1 unidad/reacción
7
ADN extraído (molde): • Muestras a analizarse (hojas individuales) • Control negativo • Control negativo • Control positivo • Control positivo 3,0 l • 4-80 ng de ADN genómico • 4 ng de ADN genómico no transgénico del maíz • molde sin ADN (solución en la que el ADN se resuspendió) • 4 ng de ADN genómico de un evento conocido de maíz heterocigoto MON88017 • 4 ng de ADN genómico de un evento conocido de maíz homocigótico MON88017 Diluido en agua
8
Mezclar suavemente y añadir 1-2 gotas de aceite mineral en la parte superior de cada reacción
Tabla 5. Condiciones del termociclador del ensayo de cigosidad
Nº de ciclo
Ajustes: Stratagene Robocycler
1
94°C 3 minutos
38
94°C 1 minuto 60°C 1 minuto 72°C 1 minuto y 30 segundos
1
72°C 10 minutos
Nº de ciclo
Ajustes: MJ Engine o Perkin-Elmer 9700
1
94°C 3 minutos
38
94°C 30 segundos 60°C 30 segundos 72°C 1 minuto y 30 segundos
1
72°C 10 minutos
Nº de ciclo
Ajustes: Eppendorf Mastercycler Gradient
1
94°C 3 minutos
38
94°C 15 segundos 60°C 15 segundos 72°C 1 minuto y 30 segundos
1
72°C 10 minutos
5 Continuar con la amplificación del ADN en un termociclador Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 o Eppendorf Mastercycler Gradient usando los siguientes parámetros de ciclación. Cuando se ejecuta la PCR en el Eppendorf Mastercycler Gradient o MJ Engine, el termociclador se debe ejecutar en el modo calculado. Cuando se ejecuta la PCR en el Perkin-Elmer 9700, ejecute el termociclador con la escala de velocidad ajustada al máximo.
Se realizado un depósito de semillas de maíz MON88017, descrito anteriormente y enumerado en las
10 reivindicaciones, en el marco del Tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110. El número de acceso es ATCC PTA-5582. El depósito se mantendrá en el depósito por un período de 30 años, o 5 años después de la última solicitud, o durante la vida efectiva de la patente, lo que sea más tiempo, y será reemplazado según sea necesario durante ese período.
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Claims (1)

  1. imagen1
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