ES2547016T3 - Direccionamiento de ABCB5 para terapia para el cáncer - Google Patents

Direccionamiento de ABCB5 para terapia para el cáncer Download PDF

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Abstract

Una composición para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene melanoma, comprende un anticuerpo anti- ABCB5 o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene al menos una región humana, el anticuerpo anti- ABCB5 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende 1) un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina, en el que: (i) CDR1-H1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3; (ii) CDR2- H2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4; y (iii) la secuencia de CDR3-H3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5, y comprende adicionalmente 2) un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina, en el que: (i) CDR1-L1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6; (ii) CDR2-L2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 7; y (iii) la secuencia de CDR3-L3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8.

Description

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maligno humano, definida por la expresión del mediador de quimiorresistencia a ABCB5. Como se muestra en los Ejemplos indicados más adelante, el direccionamiento específico de esta población minoritaria tumorigénica anula el crecimiento tumoral.
5 Recientemente, los inventores clonaron y caracterizaron ABCB5, un nuevo transportador de resistencia a múltiples fármacos humanos, que se muestra que se expresa preferentemente por células de linaje melanocítico. La inhibición de ABCB5 hace que las células de melanoma normalmente resistentes sean susceptibles a la doxorrubicina. Los inventores han demostrado que la expresión de ABCB5 1) marca las células de melanoma tumorigénicas de fenotipo y función de células madre; y 2) el direccionamiento específico del compartimento de células madre de melanoma ABCB5+ constituye un nuevo enfoque celular dirigido por células madre altamente prometedor para el tratamiento del melanoma. Los datos se describen con más detalle en la sección de Ejemplos.
Además, en experimentos de xenotrasplante de ser humano a ratón, las células de melanoma ABC5+ tenían mayor capacidad tumorigénica que las poblaciones en masa de ABCB5-. Por otra parte, el seguimiento in vivo del destino
15 celular genético demostró que las células cancerígenas ABCB5+ tumorigénicas eran capaces de generar progenie de ABCB5+ y ABCB5-, mientras que las células ABCB5-daban lugar exclusivamente a progenie de ABCB5-. Esta identificación de una relación específica entre un mecanismo de quimiorresistencia y células madre cancerígenas en una neoplasia humana tiene implicaciones importantes para los enfoques dirigidos por células madre para terapia para el cáncer.
También se ha descubierto que la anulación de las células de melanoma ABCB5+ mediante enfoques inmunoterapéuticos dirigidos puede representar una nueva estrategia para conseguir respuestas clínicas más duraderas que las obtenidas con estrategias terapéuticas dirigidas predominantemente al grueso de la población de células tumorales. Por lo tanto, los inventores investigaron si la anulación selectiva de células madre de melanoma
25 ABCB5+ humano tumorigénicas, quimiorresistentes mediante la administración sistémica de un anticuerpo monoclonal anti-ABCB5 (clon 3C2-1 D 12 de mAb) facilita la inhibición de la formación de tumor/erradicación del tumor en un modelo animal preclínico relevante de melanoma maligno humano que implica xenoinjertos tumorales de ser humano a ratón atímico.
Tal como se muestra con más detalle a continuación, los inventores examinaron la biodisponibilidad y la eficacia/especificidad de unión melanoma de mAb anti-ABCB5 administrado in vivo en un modelo de xenoinjerto de melanoma de ser humano a ratón. Con el fin de examinar si la administración de mAb anti-ABCB5 da como resultado niveles en suero in vivo detectables, se incubaron sueros de ratón con cultivos de células de melanoma humano recién cosechadas, seguido de contratinción de células con Ab secundario de Ig de cabra anti-ratón 35 conjugado con FITC y posterior análisis mediante citometría de flujo de un solo color. Se observó una unión significativa de Ab secundario de Ig de cabra anti-ratón conjugado con FITC para los cultivos de melanoma incubados previamente con sueros a todas las diluciones sometidas a ensayo derivadas de ratones tratados con mAb anti-ABCB5. No se observó unión con sueros derivados de animales tratados de control de isotipo o sin tratar. La detección de una positividad para ABCB5 de un 5,4 % a las diluciones de sueros tan bajas como a 1:100 (Figura 1A) era coherente con la frecuencia de células ABCB5+ informada anteriormente entre células de melanoma G3361 cultivadas in vitro (Frank, N. Y. et al. ABCB5-mediated doxorubicin transport and chemoresistance in human malignant melanoma. Cancer Res 65, 4320-33 (2005); Frank, N. Y. et al. Regulation of progenitor cell fusion by ABCB5 P-glycoprotein, a novel human ATP-binding cassette transporter. J Biol Chem 278, 47156-65 (2003)). Estos hallazgos demuestran que el mAb anti-ABCB5 administrado de forma sistémica da como resultado niveles en suero
45 de mAb in vivo eficaces. Los datos que se describen en el presente documento demuestran adicionalmente que el mAb anti-ABCB5 administrado de forma sistémica se une de forma eficaz y preferente a células de melanoma humano ABCB5+ xenoinjertado in vivo, lo que proporciona una evidencia de su idoneidad para enfoques de direccionamiento terapéutico in vivo. Usando xenoinjertos de células de melanoma humano en ratones atímicos, se demostró que el direccional y específico del compartimento de células madre de melanoma ABCB5+ con anticuerpos era un enfoque dirigido por células madre eficaz para el tratamiento del melanoma.
La invención se basa en parte en el descubrimiento, aislamiento y caracterización de moléculas de unión a ABCB5, tales como anticuerpos monoclonales humanos que se unen a ABCB5 y son útiles en el tratamiento del cáncer. El ABCB5 es un transportador de resistencia a múltiples fármacos que está presente en las células madre
55 cancerígenas.
Por lo tanto, las composiciones que se describen en el presente documento pueden ser útiles en el tratamiento de un sujeto que tiene o que está en riesgo de tener cáncer. Un sujeto hará referencia a un ser humano o vertebrado mamífero que incluye, pero no se limita a, un perro, gato, caballo, cabra y primate, por ejemplo, mono. Por lo tanto, las composiciones que se describen en el presente documento también se pueden usar para tratar enfermedades o afecciones en sujetos no humanos. Por ejemplo, el cáncer es una de las causas principales de muerte en los animales de compañía (por ejemplo, gatos y perros). Preferentemente, el sujeto es un ser humano.
Como se usa en el presente documento, el término tratar, tratado, o que trata cuando se usa con respecto a un
65 trastorno como el cáncer se refiere a un tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia de un sujeto al desarrollo de la enfermedad o, en otras palabras, disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle la enfermedad, así
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como un tratamiento después de que el sujeto haya desarrollado la enfermedad con el fin de luchar contra la enfermedad, evitar que la enfermedad empeore, o retrasar la evolución de la enfermedad en comparación con la ausencia de la terapia.
5 Un sujeto con riesgo de desarrollar un cáncer es el que tiene una alta probabilidad de desarrollar cáncer. Estos sujetos incluyen, por ejemplo, sujetos que tienen una anomalía genética, cuya presencia se ha demostrado que tiene una relación correlativa con una mayor probabilidad de desarrollar un cáncer y sujetos expuestos a agentes que causan cáncer tales como tabaco, asbesto, u otras toxinas químicas, o un sujeto que se ha tratado previamente para el cáncer y está en remisión aparente. Un sujeto en riesgo de padecer cáncer también incluye un sujeto que tiene lesiones precancerígenas. Una lesión precancerígena es una zona de tejido que tiene propiedades alteradas y porta el riesgo de convertirse en cáncer de piel. Las lesiones precancerígenas pueden ser causadas, por ejemplo, por radiación UV, genética, exposición a agentes carcinógenos tales como arsénico, alquitrán o radiación de rayos x.
Un sujeto que tiene un cáncer es un sujeto que tiene células cancerígenas detectables. El cáncer puede ser un
15 cáncer maligno o no maligno. Los cánceres o tumores incluyen, pero no se limitan a, cáncer del tracto biliar; cáncer de cerebro; cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer de endometrio; cáncer de esófago; cáncer gástrico; neoplasias intraepiteliales; linfomas; cáncer de hígado; cáncer de pulmón (por ejemplo, microcítico y no microcítico); melanoma; neuroblastomas; cáncer oral; cáncer de ovarios; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer rectal; sarcomas; cáncer de piel; cáncer testicular; cáncer de tiroides; y cáncer renal, así como otros carcinomas y sarcomas. Preferentemente, el cáncer incluye células madre cancerígenas que expresan ABCB5.
Opcionalmente, antes del tratamiento, la presencia de células madre positivas para ABCB5 se puede detectar usando las moléculas de unión que se describen en el presente documento. Los métodos de detección o diagnóstico
25 proporcionados por lo general implican poner en contacto una o más moléculas con una muestra en o de un sujeto. Preferentemente, la primera muestra se extrae del sujeto, aunque también se contemplan métodos de detección in vivo. La muestra puede incluir cualquier tejido o fluido corporal que se sospecha que alberga células madre cancerígenas. Por ejemplo, las células madre se encuentran normalmente en o alrededor de la masa tumoral.
En el presente documento se desvelan moléculas tales como péptidos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y moléculas pequeñas. Las moléculas se unen a ABCB5 y aumentan la eliminación del tumor. En el presente documento, las moléculas de unión se denominan moléculas aisladas que se unen de forma selectiva a ABCB5. Se debe observar que tales anticuerpos son capaces de unirse a ABCB5 independientemente de su fuente. Por consiguiente, los anticuerpos se definen como por unión, por ejemplo, a ABCB5 de células de melanoma y porque
35 son capaces de detectar y/o mejorar los efectos antitumorales, por ejemplo, en células del melanoma, así como en otros tipos de cáncer, tales como el cáncer de mama.
Aunque no se pretende quedar ligado por ninguna teoría particular, se cree que el tratamiento de tumores y cánceres puede fallar porque las células madre tumorigénicas no están dirigidas de manera eficaz por los tratamientos convencionales. Las moléculas de unión a ABCB5 se dirigen de forma específica y están implicadas en la destrucción de estas células. Por lo tanto, cuando se usan estas moléculas solas o en combinación con terapias convencionales se pueden eliminarlas más agresivas del tumor.
Hay varios posibles mecanismos mediante los cuales el tratamiento con mAb anti-ABCB5 puede inhibir el
45 crecimiento tumorigénico in vivo y la viabilidad tumoral de xenoinjertos de melanoma humano en este modelo de ratón atímico receptor, que incluye citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), citotoxicidad mediada por complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por macrófago dependiente de anticuerpo (ABMC), y/o inhibición o función de ABCB5, que puede contribuir a la tumorigenicidad de las células madre. Se predice que cualquiera de estos mecanismos se dirige solamente al subconjunto de células tumorales que expresan ABCB5 en comparación con los controles. Los inventores también esperan el direccionamiento terapéutico in vivo de mAb mediado por anti-ABCB5 de las células madre de melanoma ABCB5+ a través de estrategias de anulación celular mediada por quimiosensibilización o inmunotoxina. Dado que la administración de toxinas dirigidas por ABCB5 (toxinas químicas o biológicas, radionúclidos) o de los ARNsi conjugados con mAb de ABCB5 hacia dianas genéticas específicas de células madre tumorales adicionales podría requerir internalización de toxina interna, los
55 inventores también examinaron la internalización celular de mAb anti-ABCB5 después de la unión superficial a células de melanoma humano ABCB5+. Los resultados indican que las toxinas conjugadas con mAb anti-ABCB5 se pueden administrar de forma específica a compartimentos intracelulares en células de melanoma humano ABCB5+ quimiorresistentes, destacando una ventaja terapéutica de este nuevo enfoque para el tratamiento de melanoma clínico y otros cánceres. Una molécula que se une de forma selectiva a ABCB5 como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula, por ejemplo, molécula pequeña, péptido, anticuerpo, fragmento, que interactúa con ABCB5 y, opcionalmente, interfiere con la actividad ABCB5. En algunas realizaciones, las moléculas son péptidos.
Los péptidos comprenden mínimamente regiones que se unen a ABCB5. Las regiones de unión a ABCB5, en
65 algunas realizaciones se derivan de las regiones de unión a ABCB5 de los anticuerpos, o como alternativa, son variantes funcionalmente equivalentes de tales regiones. Por consiguiente, dos clases particularmente importantes
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de regiones de unión a ABCB5 derivadas de anticuerpo son regiones variables y CDR de los anticuerpos que se describen en el presente documento. Los ácidos nucleicos de CDR y de región variable se pueden clonar a partir de células que producen anticuerpos o se pueden preparar de forma sintética basándose en las secuencias que se describen en el presente documento.
5 El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en su sentido más amplio y cubre de forma específica anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, fragmentos de anticuerpo, siempre y cuando presenten la actividad biológica deseada, y moléculas similares a anticuerpo tales como scFv. Un anticuerpo nativo
10 normalmente se refiere a glicoproteínas heterotetraméricas formadas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena pesada y ligera tiene puentes disulfuro intracadenas espaciados de forma regular. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena
15 pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los restos de aminoácidos en particular forman una superficie de contacto entre los dominios variables de cadena ligera y pesada.
Ciertas partes de los dominios variables difieren en gran medida en las secuencias entre y se usan en la unión y
20 especificidad de cada anticuerpo en particular para su antígeno en particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente por todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres o cuatro segmentos denominados "regiones que determinan la complementariedad" (CDR) o "regiones hipervariables" en los dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pasada. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan en la región de marco conservada (FR). Cada uno de los dominios variables de
25 cadenas pesada y ligera nativas comprende cuatro o cinco regiones FR, que en gran medida adoptan una configuración de lámina β, conectada por las CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina β. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en proximidad cercana por las regiones de FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen en la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Publ. del NIH Nº 91-3242, Vol. I, páginas 647-669 (1991)). Los dominios constantes
30 no están necesariamente implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo.
Una región hipervariable o CDR como se usa en el presente documento define una subregión dentro de la región
35 variable de variabilidad de secuencias extrema del anticuerpo, que forma el sitio de unión al antígeno y son los determinantes principales de la especificidad del antígeno. De acuerdo con una definición, pueden ser los restos (nomenclatura de Kabat) 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la región variable de cadena ligera y los restos (nomenclatura de Kabat 31-35 (H1), 50-65 (H2), 95-102 (H3) en la región variable de cadena pesada. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda,
40 Md. [1991]).
Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende una región variable de unión al antígeno así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y los dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia narrativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia
45 narrativa humana) o variante de secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferentemente con el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban a través de digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)).
50 Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente mediante células hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar a partir bibliotecas de fagos de anticuerpo. Como alternativa, los fragmentos de Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y se pueden acoplar de forma química para formar fragmentos de F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos de F(ab')2 se pueden aislar directamente a partir de cultivos de células
55 hospedadoras recombinantes.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una parte de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión al antígeno o variable del anticuerpo intacto. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; moléculas de anticuerpos de una sola cadena; y anticuerpos multiespecíficos
60 formados a partir de fragmentos de anticuerpo. La digestión con papaína produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión al antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento de F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación con el antígeno y además es capaz de reticulación con el antígeno.
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"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y de unión del antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada en asociación no covalente y estrecha. Es en esta configuración en la que las tres CDR de cada dominio radial interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. De forma colectiva, las seis CDR confieren una especificidad de unión al
5 antígeno con respecto al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres CDR específicas para antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad menor que todo el sitio de unión.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos restos en el extremo carboxi del dominio CH1 de cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. En el presente documento, Fab'-SH es la denominación para Fab' en la que el resto o restos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Originalmente se produjeron fragmentos de anticuerpo F(ab')2 como precursores de fragmentos Fab' que tenían cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros
15 acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
La expresión "región Fc" se usa para definir la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que se puede generar mediante digestión con papaína de un anticuerpo intacto. La región Fc puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región de Fc variante. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región Fc de cadena pesada de IgG humana normalmente se definen para el tramo de un resto de aminoácidos aproximadamente en la posición de Cys226, o aproximadamente en la posición de Pro230, con respecto al extremo carboxilo de la región Fc. La región Fc de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio CH4. En el presente documento, por "cadena de la región Fc" se hace referencia a una de las dos cadenas de
25 polipéptidos de una región Fc.
"Región bisagra", y variaciones de la misma, como se usa en el presente documento, incluye el significado que se conoce en la técnica, que se ilustra, por ejemplo, en Janeway et al., Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4ª ed., 1999)
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, and y varias de éstas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de
35 inmunoglobulinas se denominan α, δ, ε, γ, y µ, respectivamente. Se conocen bien las estructuras subunitarias y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (K) y lambda (λ), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Preferentemente, los péptidos de unión a ABCB5 incluyen de forma mínima al menos una CDR de las que se describen en el presente documento o las que se pueden derivar de las secuencias que se describen en el presente documento. Como se usa en el presente documento, una CDR de unión a ABCB5 es una CDR que se describe en el
45 presente documento. La región de unión a ABCB5 puede ser una CDR1 de unión a ABCB5, una CDR2 de unión a ABCB5, o una CDR3 de unión a ABCB5, todas las cuales se derivan de los anticuerpos y cadenas variables de anticuerpos que se desvelan en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, una "CDR1 de unión a ABCB5" es una CDR1 que se une, preferentemente de forma específica, a ABCB5, y se deriva de cualquiera de las regiones variables de cadena pesada o ligera de los anticuerpos que se describen en el presente documento. Puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEC ID Nº: 3 y la SEC ID Nº: 6. Una " CDR2 de unión a ABCB5" es una CDR2 que se une, preferentemente de forma específica, a ABCB5, y se deriva de cualquiera de las regiones variables de cadena pesada o ligera de los anticuerpos que se describen en el presente documento. Puede tener una secuencia
55 de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en la grupo que consiste en la SEC ID Nº: 4 y la SEC ID Nº: 7. Una "CDR3 de unión a ABCB5" es una CDR3 que se une, preferentemente de forma específica, a ABCB5, y se deriva de cualquiera de las regiones variables de cadena pesada o ligera de los anticuerpos que se describen en el presente documento. Puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEC ID Nº: 5 y la SEC ID Nº: 8.
Además de las secuencias que se enumeran en el presente documento, se incorporan variantes funcionalmente equivalentes de estas secuencias que incluyen variantes de sustitución conservativa ya sea en la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos, como se describe con más detalle a continuación.
65 Los péptidos son útiles, entre otros, en métodos de diagnóstico dirigidos a detectar, en una muestra o de un sujeto, el antígeno de ABCB5 o las células que expresan ABCB5. A un mínimo, los péptidos útiles en estos métodos solo
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fuentes y se unirá con menor afinidad (en su caso) a compuestos no derivados de ABCB5. La afinidad menor puede incluir menor en menos de un 10 %, menos de un 20 %, menos de un 30 %, menos de un 40 %, menos de un 50 %, menos de un 60 %, menos de un 70 %, menos de un 80 %, menos de un 90 %, o menos de un 95 %.
5 Como se usa en el presente documento, "anticuerpos aislados" se refieren a anticuerpos que están básicamente separados de forma física de otro material celular (por ejemplo, separados de células que producen los anticuerpos)
o de otro material que dificulta su uso ya sea en los métodos de diagnóstico o terapéuticos que se describen en el presente documento. Preferentemente, los anticuerpos aislados están presentes en una población homogénea de anticuerpos (por ejemplo, una población de anticuerpos monoclonales). Sin embargo, algunas composiciones de anticuerpos aislados se pueden combinar con otros componentes tales como, pero que no se limitan a, vehículos, adyuvantes, y similares farmacéuticamente aceptables.
Las "células que producen anticuerpo aislado" que incluyen hibridomas aislados y células recombinantes aisladas (tales como las que se describen en el presente documento), como se usa en el presente documento, se refieren a
15 células que producen anticuerpos que están básicamente separados de forma física de otras células, otro material corporal (por ejemplo, tejido y fluido ascítico), y otro material que dificulta su uso en la producción, por ejemplo, de una población aislada y preferentemente homogénea de anticuerpos.
Por lo tanto, en una realización, el péptido es un anticuerpo monoclonal soluble intacto aislado específico para ABCB5. Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población homogénea de inmunoglobulinas que se une de forma específica a un epítopo idéntico (es decir, determinante antigénico). Por ejemplo, en una realización, el péptido es un anticuerpo monoclonal que tiene una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2. Están incluidos los anticuerpos monoclonales
25 que tienen cualquier combinación de regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada.
Se describen anticuerpos distintos de, por ejemplo, las secuencias de 3C2-1D12, con la condición de que tales anticuerpos tengan las características de unión de los anticuerpos monoclonales que se describen en el presente documento. Opcionalmente, estos anticuerpos adicionales también aumenta la eliminación del tumor de células cancerígenas que expresan ABCB5. Un experto habitual en la materia por identificar fácilmente anticuerpos que tienen las características funcionales de este anticuerpo monoclonal usando los ensayos de identificación sistemática y de unión que se establecen con detalle en el presente documento.
A menos que se indique de otro modo, la expresión "anticuerpo monoclonal 3C2-1D12" o "mAb3C2-1D12" se refiere 35 a un anticuerpo que tiene restos de unión a antígeno de, o derivados del, anticuerpo 3C2-1D12 murino.
La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos básicamente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose frente a un solo sitio antigénico. Además, al contrario que las preparaciones convencionales de anticuerpo (policlonal) que por lo general incluyen diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige frente a un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se sintetizan mediante el cultivo del hibridoma, sin contaminar por otras
45 inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como siendo obtenidos a partir de una población básicamente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que se necesita la producción del anticuerpo mediante cualquier método en particular.
Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de la población de anticuerpos básicamente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que se producen de forma natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos separados.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando el método del hibridoma que se describió
55 primero en Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), o se pueden preparar mediante métodos de ADN recombinante (documento de Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567). En el método del hibridoma, un ratón u otro animal hospedador apropiado, tal como un hámster, se inmuniza tal como se a descrito anteriormente en el presente documento para obtener linfocitos que produce no son capaces de producir anticuerpos que se unirán de forma específica a la proteína usada para la inmunización. Como alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. A continuación, los linfocitos se fusionan con células de mieloma cells usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que
65 contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento por la supervivencia de las células de mieloma precursoras, sin fusionar. Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la enzima
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implicadas en la unión al antígeno. Un anticuerpo a partir del que se ha escindido de forma enzimática la región pFc',
o que se ha producido sin la región pFc', denominada un fragmento F(ab')2, mantiene ambos de los sitios de unión al antígeno de un anticuerpo intacto. Un fragmento aislado F(ab')2 hace referencia a un fragmento monoclonal bivalente debido a sus dos sitios de unión al antígeno. De forma análoga, un anticuerpo a partir del que se ha
5 distinguido de forma enzimática la región de Fc, o que se ha producido sin la región Fc, denominado un fragmento Fab, mantiene uno de los sitios de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. Evolucionando aún más, los fragmentos de Fab consisten en una cadena ligera de anticuerpo unido de forma covalente y una parte de la cadena pesada del anticuerpo denominada Fd (región variable de cadena pesada). Los fragmentos de Fd son el determinante principal de la especificidad del anticuerpo (un solo fragmento de Fd puede estar asociado con hasta diez cadenas ligeras diferentes sin alterar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos de Fd mantienen su capacidad de unión al epítopo en el aislamiento.
Los términos Fab, Fc, pFc', F(ab')2 y Fv se usa en con cualquiera de los significados inmunológicos convencionales [Klein, Immunology (John Wiley, Nueva York, NY, 1982); Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of
15 Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., Nueva York); Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7ª Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford); y Pier GB, Lyczak JB, Wetzler LM, (eds). Immunology, Infection and Immunity (2004) 1ª Ed. American Society for Microbiology Press, Washington D.C.].
En otras realizaciones, las partes de Fc de los anticuerpos se pueden sustituir con el fin de producir IgM así como anticuerpos de IgG humana que portan algunas o todas las CDR de los anticuerpos monoclonales que se describen en el presente documento. De importancia en particular es la inclusión de una región CDR3 de unión a ABCB5 y, en menor medida, las otras CDR y partes de las regiones marco conservadas de los anticuerpos monoclonales que se describen en el presente documento. Tales anticuerpos humanos tendrán una utilidad clínica en particular porque reconocerán y se unirán, preferentemente de forma selectiva, a ABCB5, pero no suscitarán una respuesta
25 inmunitaria en seres humanos contra el propio anticuerpo.
Se pretende incluir variantes funcionalmente equivalentes de los péptidos de unión a ABCB5. Una "variante funcionalmente equivalente" es un compuesto que tiene la misma función (es decir, la capacidad de unirse a ABCB5) como los péptidos. Una variante funcionalmente equivalente puede ser de naturaleza peptídica pero no se limita de este modo. Por ejemplo, puede ser un carbohidrato, un peptidomimético, etc. En realizaciones importantes, la variante funcionalmente equivalentes un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una región variable o de una CDR con sustituciones conservativas en la misma, que además es capaz de unirse a ABCB5. Un ejemplo de una variante funcionalmente equivalente de CDR3 de unión a ABCB5 de la región variable de cadena pesada (es decir, la SEC ID Nº: 1) es un péptido que tiene sustituciones conservativas en la SEC ID Nº: 1 que se une,
35 preferentemente de forma específica, a ABCB5, y que opcionalmente aumenta la eliminación del tumor de células que expresan ABCB5.
La expresión "variante de secuencia de aminoácidos" se refiere a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren en cierta medida de un polipéptido de la secuencia nativa. Las variantes de la secuencia de aminoácidos poseen sustituciones, supresiones, y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa.
"Homología" se define como el porcentaje de restos en la variante de la secuencia de aminoácidos que son idénticos después de la alineación de las secuencias y que introducen huecos, si fuera necesario, para conseguir el
45 porcentaje máximo de homología. Algunos métodos y programas informáticos para la alineación se conocen bien en la técnica.
Se contemplan modificaciones de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos que se describen en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Algunas variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo, o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, restos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución se realiza para llegar al constructo final, con la condición de que el constructo final posea las características deseadas. Las
55 alteraciones en el aminoácidos se pueden introducir en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo objeto en el momento en el que se prepara la secuencia.
Un método útil para la identificación de ciertos restos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferentes para mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" tal como se describe en Cunningham y Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. Aquí, un resto o grupo de restos diana se identifican (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se sustituyen con un aminoácido neutro o con carga negativa (lo más preferentemente alanina o polialanina) para influir en la interacción de los aminoácidos con antígenos. Esas ubicaciones de los aminoácidos que demuestran una sensibilidad funcional para las sustituciones se refinan a continuación mediante la introducción adicional u otras variantes, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, aún 65 que el sitio para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos se determina previamente, no es necesario determinar previamente la naturaleza de la mutación per se. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una
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mutación en un sitio dado, se realiza barrido de ala o mutagénesis aleatorio en el codón o región diana y las inmunoglobulinas expresadas se identifican sistemáticamente para la actividad deseada.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales que tienen una
5 longitud que varía de un resto polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de un solo aminoácido o de múltiples aminoácidos. Algunos ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto de metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado con un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C el anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo.
Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un resto de aminoácido en la molécula de anticuerpo sustituido con un resto diferente. Los sitios del mayor interés para mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR.
15 Como se usa en el presente documento, "sustitución conservativas" se refiere a una sustitución de aminoácidos que no altera la carga relativa o características de tamaño del péptido en el que se realiza la sustitución del aminoácido. Algunas sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen instituciones realizadas entre aminoácidos con los siguientes grupos: (1) M, I, L, V; (2) F, Y, W; (3) K, R, H; (4) A, G; (5) S, T; (6) Q, N; y, (7) E, D.
Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se consiguen mediante la selección de sustituciones que difieren de forma significativa en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal polipeptídico a en la zona de la sustitución, por ejemplo, en forma de una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L.
25 Lehninger, en Biochemistry, segunda ed., pp. 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975)):
(1)
no polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2)
polar sin carga: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3)
ácido: Asp (D), Glu (E)
(4)
básico: Lys (K), Arg (R), His (H).
Como alternativa, los restos de origen natural se pueden dividir en grupos basándose en propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6)
35 aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Tales restos sustituidos también se pueden introducir en los sitios de sustitución conservativa o, más preferentemente, en los sitios restantes (no conservados).
Un tipo de variante de sustitución implica la sustitución de uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la variante o variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo adicional habrán mejorado sus propiedades biológicas con respecto al anticuerpo precursor a partir del que se generan. Una manera conveniente para generar tales variantes de 45 sustitución implica la maduración por afinidad usando presentación de fagos. En resumen, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los anticuerpos generados de este modo se presentan a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes que presentan fagos se identifican sistemáticamente a continuación por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se desvela en el presente documento. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, se puede realizar mutagénesis de barrido de alanina para identificar restos de la región hipervariable que contribuyen de forma significativa a la unión al antígeno. Como alternativa, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales restos de contacto y restos vecinos son candidatos para la sustitución de
55 acuerdo con las técnicas elaboradas en el presente documento. Una vez que se generan tales variantes, el panel de variantes se somete a identificación sistemática tal como se describe en el presente documento y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes se pueden seleccionar para un mayor adicional.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural)
o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR, y mutagénesis de casete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo.
65 Puede ser deseable introducir una o más modificaciones de aminoácidos en una región Fc de los polipéptidos de inmunoglobulina, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede
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compuesto tiene un núcleo molecular común y uno o más elementos de diversidad estructural variable. Los compuestos en tal matriz de compuesto se producen en paralelo en recipientes de reacción separados, con cada compuesto identificado y trazado mediante su dirección espacial. Algunos ejemplos de mezclas de síntesis en paralelo y métodos de síntesis en paralelo se proporcionan en la solicitud de patente publicada de PCT
5 WO95/18972, publicada el 13 de julio de 1995 y el documento de la Patente de Estados Unidos Nº 5.712.171 concedida al 27 de enero de 1998 y su correspondiente solicitud de patente de PCT publicada WO96/22529.
En la técnica se conocen bien algunos ensayos de unión convencionales, y un número de éstos son adecuados incluyendo ELISA, ensayos de unión por competición (como se ha descrito anteriormente), ensayos de sándwich, ensayos de radiorreceptor usando péptidos marcados de forma radiactiva o anticuerpos radiomarcados, inmunoensayos, etc. La naturaleza del ensayo no es esencial siempre que sea lo suficientemente sensible para detectar la unión de un número pequeño de péptidos.
Una diversidad de otros reactivos también se puede incluir en la mezcla de unión. Estos incluyen reactivos tales
15 como sales, tampones, proteínas neutras (por ejemplo, albúmina), detergentes, etc., que se pueden usar para facilitar la unión óptima. Un reactivo de este tipo también puede reducir las interacciones no específicas o de fondo de los componentes de reacción. También se pueden usar otros reactivos que mejoran la eficacia del ensayo. La mezcla de los materiales de ensayo anteriores se incuba en condiciones en las que el anticuerpo monoclonal se une normalmente de forma específica a ABCB5. Tales condiciones imitarán preferentemente las condiciones fisiológicas. El orden de adición de los componentes, temperatura de incubación, tiempo de incubación, y otros parámetros del ensayo se pueden determinar fácilmente. Tal experimentación simplemente implica la optimización de los parámetros del ensayo, no la composición fundamental del ensayo. Las temperaturas de incubación por lo general se encuentran entre 4 ºC y 40 ºC. Los tiempos de incubación se minimizan preferentemente para facilitar la identificación sistemática de alto rendimiento, y por lo general son entre 0,1 y 10 horas. Después de la incubación, la
25 presencia o ausencia de unión específica entre el péptido y ABCB5 se detecta mediante cualquier método conveniente disponible para el usuario.
Por lo general, una pluralidad de mezclas de ensayo se ejecuta en paralelo con diferentes péptidos o diferentes concentraciones de péptido para obtener una respuesta diferente a las diversas concentraciones. Una de estas concentraciones sirve como control negativo, es decir, a concentración cero de ABCB5 o a una concentración de ABCB5 por debajo de los límites de detección del ensayo.
A menudo se usa una etapa de separación para separar el péptido o anticuerpo unido o no unido. La etapa de separación se puede conseguir en una diversidad de maneras. De forma conveniente, al menos uno de los
35 componentes (por ejemplo, péptido o anticuerpo) se inmoviliza sobre un sustrato sólido a través de la unión a ABCB5. Los componentes no unidos se pueden separar fácilmente de la fracción unida. El sustrato sólido puede estar formado por una amplia diversidad de materiales y en una amplia variedad de formas, por ejemplo, columnas o geles de poliacrilamida, agarosa o Sepharose, placas de microtitulación, microperlas, partículas de resina, etc. La etapa de separación incluye preferentemente múltiples aclarados o lavados. Por ejemplo, cuando el sustrato sólido es una placa de microtitulación, los pocillos se pueden lavar varias veces con una solución de lavado, que por lo general incluye los componentes de la mezcla de incubación que no participan en enlaces específicos, tales como sales, tampón, detergente, proteína no específica, etc. Cuando el sustrato sólido es una perla magnética, las perlas se pueden lavar una o más veces con una solución de lavado y se pueden aislar usando un imán.
45 Las moléculas que se describen en el presente documento se pueden usar solas o en conjugados con otras moléculas tales como detección o agentes citotóxicos en los métodos de detección y tratamiento que se describen en el presente documento, tal como se describe con más detalle en el presente documento.
Por lo general, uno de los componentes comprende normalmente, o se acopla o se conjuga con una marca detectable. Un marcador detectable es un resto, cuya presencia se puede determinar directa o indirectamente. Generalmente, la detección de la marca implica una emisión de energía por la marca. La marca se puede detectar directamente por su capacidad para emitir y/o absorber fotones u otras partículas atómicas de una longitud de onda en particular (por ejemplo, radiactividad, luminiscencia, densidad óptica o electrónica, etc.). Una marca se puede detectar indirectamente por su capacidad para unirse, reclutar y, en algunos casos, escindir otro resto que por sí 55 mismo puede emitir o absorber luz de una longitud de onda en particular (por ejemplo, marca de epítopo tal como el epítopo FLAG, marca enzimática tal como peroxidasa de rábano picante, etc.). Un ejemplo de detección indirecta es el uso de una primera marca que escinde un sustrato en productos visibles. La marca puede ser de una naturaleza química, péptido o molécula de ácido nucleico, aunque no se limita de este modo. Otros marcadores detectables incluyen isótopos radiactivos tales como P32 o H3, marcadores luminiscentes tales como fluorocromos, marcadores de densidad óptica o electrónica, etc., o marcas de epítopo tales como el epítopo FLAG o el epítopo HA, biotina, avidina, y las marcas enzimáticas tales como peroxidasa de rábano picante, β-galactosidasa, etc. La marca se puede unir a un péptido durante o después de su síntesis. Existen muchas marcas y métodos de marcado diferentes conocidos por los expertos habituales en la materia. Algunos ejemplos de los tipos de marcas que se pueden usar incluyen enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimioluminiscentes y 65 compuestos bioluminiscentes. Los expertos habituales en la materia conocerán otras marcas adecuados para los péptidos que se describen en el presente documento, o serán capaces de determinarlas, usando experimentación
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Las secuencias reguladoras en la posición 3' definen al menos un codón de terminación (parada) en marco con y unido de forma operativa al polipéptido de fusión heterólogo.
En un hospedador de expresión procariota, el vector usado incluye un origen de replicación procariota o replicón, es
5 decir, una secuencia de ADN que tiene la capacidad de dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante de forma extracromosómica en una célula hospedadora procariota, tal como una célula hospedadora bacteriana, transformada a partir del mismo. Tales orígenes de replicación se conocen bien en la técnica. Algunos orígenes de replicación preferentes son los que son eficaces en el organismo hospedador. Una célula hospedadora procariota, por ejemplo, es E. coli. Para el uso de un vector en E. coli, un origen de replicación preferente es ColE1 que se encuentra en pBR322 y una diversidad de otros plásmidos comunes. También es preferente el origen de replicación p15A encontrado en pACYC y sus derivados. Los replicones ColEl y p15A usados ampliamente en biología molecular, están disponibles en una diversidad de plásmidos y se describen en Sambrook. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
15 Además, las realizaciones que incluyen un replicón procariota también incluyen preferentemente un gen cuya expresión confiere una ventaja selectiva, tal como resistencia a fármacos, con respecto a un hospedador bacteriano transformado con el mismo. Algunos genes de resistencia a fármacos bacterianos habituales son aquellos que confieren resistencia a la ampicilina, tetraciclina, neomicina/kanamicina o cloranfenicol. Por lo general, los vectores también contienen sitios de restricción convenientes para inserción de secuencias de ADN que se pueden traducir. Algunos lectores a modo de ejemplo son los plásmidos pUC18 y pUC19 y vectores derivados tales como pcDNAII disponibles en Invitrogen (San Diego, CA).
Cuando el péptido es un anticuerpo que incluye secuencias tanto de cadena pesada como de cadena ligera, esta secuencia se puede codificar en vectores separados o, más convenientemente, se pueden expresar con un solo
25 vector. La cadena pesada y ligera puede formar, después de la traducción o después de la secreción, la estructura heterodimérica de moléculas de anticuerpos naturales. Tal anticuerpo heterodimérico se puede estabilizar o no con enlaces disulfuro entre las cadenas pesada y ligera.
Un vector a la expresión de anticuerpos heterodiméricos, tal como los anticuerpos intactos o los anticuerpos de fragmento F(ab')2, Fab o Fv, es una molécula de ADN recombinante adaptada para recibir y expresar una primera y segunda secuencias de ADN. Es decir, un vector de expresión de ADN para expresar un anticuerpo heterodimérico proporciona un sistema para clonar (insertar) de forma independiente las dos secuencias de ADN que se pueden traducir en dos casetes separados presentes el vector, para formar dos cistrones separados para expresar el primer y segundo polipéptidos de un anticuerpo heterodimérico. El vector de expresión de ADN para expresar dos cistrones
35 se denomina vector de expresión dicistrónico.
Preferentemente, el vector comprende un primer casete que incluye secuencias reguladoras de ADN corriente arriba y corriente abajo unidas de forma operativa a través de una secuencia de nucleótidos adaptada para ligación direccional a un ADN inserto. La secuencia cadena arriba que se puede traducir codifica preferentemente la señal de secreción como se ha descrito anteriormente. El casete incluye secuencias reguladoras de ADN para la expresión del primer polipéptido del anticuerpo que se produce cuando una secuencia de ADN inserto que se puede traducir se inserta direccionalmente en el casete a través de la secuencia de nucleótidos adaptada para la ligación direccional.
El vector de expresión dicistrónico también contiene un segundo casete para la expresión del segundo polipéptido
45 del anticuerpo. El segundo casete incluye una segunda secuencia de ADN que se puede traducir que codifica preferentemente una señal de secreción, como se ha descrito anteriormente, única de forma operativa a su extremo en la posición 3' a través de una secuencia de nucleótidos adaptada para ligación direccional a una secuencia de ADN cadena abajo del vector que por lo general define al menos un codón de parada en el marco de lectura del casete. La segunda secuencia de ADN que se debe traducirse una de forma operativa en su extremo en la posición 5' secuencias reguladoras de ADN que forman los elementos en la posición 5'. El segundo casete es capaz, después de la inserción de una secuencia de ADN que se puede traducir (ADN inserto), de expresar el segundo polipéptido de fusión que comprende una señal de secreción con un polipéptido codificado por el ADN inserto.
Los péptidos también los pueden producir células eucariotas tales como células CHO, hibridomas humanos, células
55 B-linfoblastoides inmortalizadas, y similares. En este caso, se construye un vector en el que las secuencias reguladoras eucariotas están unidas de forma operativa a las secuencias de nucleótidos que codifican el péptido. El diseño y la selección de un vector eucariota apropiado están dentro de la habilidad y criterio de un experto habitual en la materia. La purificación posterior de los péptidos se puede conseguir mediante cualquiera de una diversidad de medios convencionales conocidos en la técnica.
En otra realización, se desvelan células hospedadoras, tanto procariotas como eucariotas, transformará su transfectadas con, y por lo tanto que incluyen, los vectores.
Algunas células hospedadoras adecuadas para la expresión de anticuerpo anti-ABCB5 glucosilado proceden de
65 organismos pluricelulares. Algunos ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes células hospedadoras de
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insecto tolerantes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Una diversidad de cepas virales para transfección están disponibles al público, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus se pueden usar como el virus en el presente documento, en particular para
5 transfección de células de Spodoptera frugiperda.
Como huéspedes también se pueden usar cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.
Las células de vertebrados también son de interés en particular como células hospedadas. Algunos ejemplos de líneas celulares hospedadora es de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de monos transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216
15 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma del cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); cédulas de hígado de rata Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); cédulas de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mamá de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).
Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión o clonación que se han descrito anteriormente para producción de anticuerpo anti-ABCB5 y se cultivan en un medio de nutrientes convencional modificado según sea apropiado para inducción de promotores, selección de transformantes, o amplificación de los
25 genes que codifican la secuencias deseadas.
Las células hospedadoras usadas para producir el anticuerpo anti-ABCB5 se pueden cultivar en una diversidad de medios. Los medios disponibles en el mercado tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), en Medio de Eagle Modificado con Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para el cultivo de las células hospedadoras. Además, cualquiera de los medios que se describen en Ham et al., Meth. Enz.
58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), en las Patentes de Estados Unidos Nos 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; en el documento de patente WO 90/03430; documento de patente WO 87/00195; o Re. de Pat. de Estados Unidos Nº 30.985 se pueden usar como medio de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios se puede complementar, si fuera necesario, con hormonas y/u otros
35 factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio, y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN.TM.), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o cualquier fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario cambio se puede incluir en concentraciones apropiadas que son conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, similares, son las que se han usado anteriormente con la célula hospedadora seleccionada para expresión, y serán evidentes para el experto habitual en la materia.
Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir por vía intracelular, en el espacio
45 periplasmático, o se puede secretar directamente en el medio. Sin anticuerpo se produce por vía intracelular, como una primera etapa, las partículas de residuos, ya sean células hospedadoras o fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. La composición del anticuerpo preparado a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía por afinidad, siendo la cromatografía por afinidad la técnica de purificación preferente. La matriz a la que se une el ligando de afinidad de forma más habitual es la agarosa, pero existe disponibilidad de otras matrices. Algunas matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden conseguir con la agarosa. Después de cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla se puede someter a cromatografía de interacción hidrófoba a pH bajo usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, realizada
55 preferentemente a concentraciones bajas de sal (por ejemplo, sal de aproximadamente 0-0,25 M).
Como se usa en el presente documento con respecto a ácidos nucleicos, el término "aislado" se refiere al: (i) amplificado in vitro, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR); (ii) producido de forma recombinante por clonación; (iii) purificado, tal como mediante escisión y separación en gel; o (iv) sintetizado, por ejemplo, mediante síntesis química. Un ácido nucleico aislado es uno que se puede manipular fácilmente mediante técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos contenida en un vector en el que se conocen sitios de restricción en las posiciones 5' y 3' o para el que se han desvelado secuencias cebadoras para reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se considera aislada pero una secuencia de ácido sulfúrico se existe en su estado nativo en su hospedador natural no lo está. Un ácido nucleico aislado puede 65 estar básicamente purificado, pero no es necesario que sea de este mundo. Por ejemplo, un ácido nucleico que se aísla dentro de un lector de la nación o de expresión no es puro porque puede comprender solamente un pequeño
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porcentaje del material en la célula en la que reside. Sin embargo, tal ácido nucleico se aísla, tal como se usa el término en el presente documento, porque se puede manipular fácilmente mediante técnicas convencionales conocidas por las personas con experiencia habitual en la materia.
5 Como se usa en el presente documento, se dice que una secuencia de codificación y secuencias reguladoras están "unidas de forma operativa" cuando se unen de forma covalente de una manera tal como para colocar la expresión o transcripción de la secuencia genética bajo la influencia o control de las secuencias reguladoras. Si se desea que las secuencias de codificación se traduzcan en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están unidas de forma operativa si la inducción de un promotor en las secuencias reguladoras en la posición 5' da como resultado la transcripción de la secuencia de codificación y si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación del desplazamiento del marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias de codificación, o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente a traducir en una proteína. Por lo tanto, una región promotora se unía de forma operativa a una secuencia de codificación si la región promotora fuera capaz de realizar la
15 transcripción de esa secuencia de ADN de modo que el transcrito resultante se pudiera traducir en la proteína o polipéptido deseado.
La naturaleza precisa de las secuencias reguladoras necesarias para la expresión genética puede variar entre especies o tipos celulares, pero en general incluirán, si fuera necesario, secuencias de no transcripción en la posición 5' y secuencias de no traducción en la posición 5' implicadas con el inicio de la transcripción y la traducción respectivamente, tales como una caja TATA, secuencia de protección, secuencia de CAAT, y similares. Especialmente, tales secuencias reguladoras de no transcripción en la posición 5' incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control de la transcripción del frente unido de forma operativa. Si se desea, algunas secuencias reguladoras también pueden incluir secuencias potenciadoras o secuencias activadoras
25 cadena arriba.
Las composiciones y métodos que se describen en el presente documento se pueden potenciar mediante el uso en combinación con otros procedimientos para el cáncer y lesiones pre cancerígenas. En algunos casos, el procedimiento de tratamiento implica la administración de otro agente terapéutico tal como un agente anticáncer, que incluye, pero no se limita, agentes de quimioterapéuticos y radiación. Algunos agentes quimioterapéuticos se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en metotrexato, vincristina, adriamicina, cisplatino, taxol, paclitaxel, cloroetilnitrosoureas que no contienen azúcar, 5-fluorouracilo, mitomicina C, bleomicina, doxorrubicina, dacarbazina, taxol, fragilina, Meglamina GLA, valrubicina, carmustina y poliferposán, MMI270, BAY 12-9566, inhibidor de la RAS famesil transferasa, inhibidor de la famesil transferasa, MMP, dacarbazina, LY294002, PX866, MTA/LY231514, 35 LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, Hycamtin/Topotecán, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantrona/Mitroxantrona, Metaret/Suramin, Batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32/Valrubicina, Metastron/derivado de estroncio, Temodal/Temozolomidla, Evacet/doxorrubicina liposomal, Yewtaxan/Paclitaxel, Taxol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabina, Furtulón/Doxifluridina, Ciclopax/paclitaxel oral, Taxoide Oral, SPU-077/Cisplatino, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inhibidor de oncogén RAS, BMS-182751/platino oral, UFT(Tegafur/Uracilo), Ergamisol/Levamisol, Eniluracilo/776C85/potenciador de 5FU, Campto/Levamisol, Camptosar/Irinotecán, Tumodex/Ralitrexed, Leustatina/Cladribina, Paxex/Paclitaxel, Doxil/doxorrubicina liposomal, Caelyx/doxorrubicina liposomal, Fludara/Fludarabina, Pharmarrubicina/Epirrubicina, DepoCyt, ZD1839, LU 45 79553/Bis-Naftalimida, LU 103793/Dolastaína, Caetyx/doxorrubicina liposomal, Gemzar/Gemcitabina, ZD 0473/Anormed, YM 116, semillas de yodo, inhibidores de CDK4 y CDK2, inhibidores de PARP, D4809/Dexifosamida, Ifes/Mesnex/Ifosamida, Vumon/Tenipósido, Paraplatino/Carboplatino, Plantinol/cisplatino, Vepesid/Etopósido, ZD 9331, Taxotere/Docetaxel, profármaco de arabinósido de guanina, Análogo de taxano, nitrosoureas, agentes de alquilación tales como melfalán y ciclofosfamida, Aminoglutetimida, Asparaginasa, Busulfán, Carboplatino, Clorombucilo, HCI de Citarabina, Dactinomficina, HCl de Daunorrubicina, fosfato sódico de Estramustina, Etopósido (VP16-213), Floxuridina, Fluorouracilo (5-FU), Flutamida, Hidroxiurea (hidroxicarbamida), Ifosfamida, Interferón Alfa2a, Alfa-2b, acetato de Leuprolida (análogo del factor de liberación de LHRH), Lomustina (CCNU), HCl de Mecloretamina (mostaza de nitrógeno), Mercaptopurina, Mesna, Mitotano), HCl de Mitoxantrona, Octreótido, Plicamicina, HCl de Procarbazina, Estreptozocina, citrato de Tamoxifeno, Tioguanina, Tiotepa, sulfato de Vinblastina,
55 Amsacrina (m-AMSA), Azacitidina, Eritropoyetina, Hexametilmelamina (HMM), Interleuquina 2, Mitoguazona (metil-GAG; metil glioxal bis-guanilhidrazona; MGBG), Pentostatina (2'desoxicoformicina), Semustina (metil-CCNU), Tenipósido (VM-26) y sulfato de Vindesina, pero no se limita a los mismos.
Los métodos que se describen en el presente documento se pueden realizar con terapias para el tratamiento del cáncer tales como cirugía y radiación. Los métodos que se describen en el presente documento sazone se pueden realizar en combinación con un agente terapéutico que es un ARN corto aislado que dirige la degradación específica de la secuencia de un ARNm específico de cáncer a través de un proceso conocido como ARN de interferencia (ARNi). En algunas realizaciones, el ARNm específico de cáncer es ABCB5. Se sabe que el proceso se produce en una gran diversidad de organismos, que incluyen embriones de mamíferos y otros vertebrados. Se ha demostrado 65 que el ARNds se procesa en 21-23 nucleótidos (nt) de longitud de segmentos de ARN, y además que median el ARN de interferencia en ausencia de ARNds más largo. Por lo tanto, estos fragmentos de 21-23 nt son mediadores
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Ejemplo 8
Para determinar el mecanismo de inhibición de la formación y crecimiento tumoral mediados por mAb anti-ABCB5, las respuestas efectoras inmunes ADCC y la citotoxicidad dependiente de complementos (CDC) se evaluaron 5 mediante citometría de flujo en color dual tal como se ha descrito anteriormente. Cultivos diana de melanoma tratados con mAb anti-ABCB5, tratados con mAb de control o sin tratar se marcaron con el colorante de membrana fluorescente de color verde DiO y se contratiñeron con yoduro de propidio fluorescente de color rojo (PI, al que solamente son permeables las células lisadas), seguido de cocultivo con células inmunes efectoras sin marcar o derivadas de suero de bazos de ratones atímicos Balb/c. El de mAb anti-ABCB5 pero no el mAb de control de isotipo indujo de forma significativa la muerte de células diana de melanoma mediada por ADCC (2,1 ± 0.4 % con respecto a 0,2 ± 0,2 %, respectivamente, P < 0,05) en una subpoblación de melanoma de tamaño comparable con el del subconjunto que expresa ABCB5 (Frank, N. Y. et al. ABCB5-mediated doxorubicin transport and chemoresistance in human malignant melanoma. Cancer Res 65, 4320-33 (2005)), tal como se determina a partir del porcentaje de células con doble positivo para DiO/PI (Figura 4e). La adición de suero a cultivos tratados con Ab en ausencia de
15 células efectoras, o la adición de mAb anti-ABCB5 solo en estas condiciones experimentales no indujo una muerte celular significativa en comparación con los controles (los resultados no se ilustran), lo que sugiere que los efectos de mAb en CDC o tóxico directo no son causas significativas de inhibición de tumor en este sistema experimental.
Los efectos del direccionamiento de ABCB5 en xenoinjertos de melanoma establecidos de seres humanos ratones atímicos (n = 13 derivados de tres pacientes distintos n = 10 derivados de cultivos de melanoma establecidos), se examinaron con el fin de someter al ensayo la hipótesis de que la sección negativa para MMIC a través de la supresión de células ABCB5+ mediada por ADCC inhibe el crecimiento tumoral. Tal resultado se observaría en una situación in vivo dinámica si el subconjunto de melanoma de ABCB5+ es crítico para la tumorigénesis sólida.
25 Se realizó la caracterización de de melanoma humano ABCB5+ o ABCB5-usadas en experimentos de xenotrasplante. La administración de mAb anti-ABCB5 in vivo, comenzara 14 días después de la inoculación de células tumorales cuando se establecieron los xenoinjertos (día 0), anula el crecimiento tumoral significativo observado en grupos tratados con mAb de control de isotipo o sin tratar durante el transcurso de un periodo de tratamiento de 21 días (P < 0,001 y P < 0,001, respectivamente) e inhibían de forma significativa el volumen tumoral medio en comparación con el determinado ya sea en ratones tratados con mAb de control o sin tratar (TV para ratones tratados con mAb anti-ABCB5 (n = 23 ratones) con respecto a ratones tratados con mAb de control (n = 22 ratones) o con respecto a ratones sin tratar (n = 22 ratones): 32,7 ± 9,4 con respecto a 226,6 ± 53,8 mm3, P < 0,001,
o con respecto a 165,4 ± 36,9 mm3, respectivamente, media ± etm, P < 0,01). Los efectos inhibidores de mAb de ABCB5 también eran estadísticamente significativos cuando los subconjuntos de tumores de xenoinjerto de 35 melanoma derivados de paciente recientes se analizaron independientemente, con anulación del crecimiento tumoral significativo observado en ratones tratados con mAb de control de isotipo o grupos sin tratar (P < 0,05 y P < 0,001, respectivamente) que inhibían de forma significativa el TV medio en comparación con el determinado ya sea en ratones tratados con mAb de control o sin tratar ( ratones tratados con mAb anti-ABCB5 (n = 13 ratones) con respecto a ratones tratados con mAb de control (n = 12 ratones) o con respecto a ratones sin tratar (n = 12 ratones): 29,6 ± 9,2 con respecto a 289,2 ± 91,8 mm3, P < 0,05, o con respecto a 222,9 ± 57,5 mm3, respectivamente, media ± etm, P < 0,001). El tratamiento con mAb de control –no mostró efectos significativos en el crecimiento del tumor ni en el volumen del tumor en comparación con ningún tratamiento en ninguno de los grupos analizados. Los animales se sacrificaron después del intervalo de tratamiento cuando era necesario de acuerdo con el protocolo animal experimental aplicable debido a la carga tumoral y la patología en los grupos de control tumoral derivados de
45 paciente (TV máximo medido: 971,5 mm3).
El análisis inmunohistoquímico de xenoinjertos de melanoma derivados de paciente tratados con mAb anti-ABCB5 reveló solamente pequeños focos de expresión de ABCB5 (en conjunto <1 % de las células) corresponde a mAb anti-ABCB5 unido in vivo en una sección adyacente. Una sección adyacente adicional tenida para CD11b desveló infiltración de macrófagos que corresponde a regiones de localización de mAb anti-ABCB5, que normalmente rodean a las zonas de degeneración y necrosis celular. Por el contrario, los xenoinjertos tratados con de mAb de control revelaron un 10-15 % de células creativas para ABCB5, el mAb anti-Ig secundario falló en la localización de las secciones respectivas en una sección adyacente pero detectó regiones de inmunoglobulina de murino intravascular, y los macrófagos CD11b+ fracasaron en la infiltración del tejido tumoral. Algunos efectos similares se observaron en
55 xenoinjertos de melanoma derivados de línea celular, con aumento de la necrosis tumoral en animales tratados con mAb anti-ABCB5 con respecto a animales tratados con mAb de control de isotipo (30-40 % con respecto a < 5 % de células de necróticas, respectivamente). Estos hallazgos apoyan adicionalmente la idea de que la población minoritaria enriquecida con MMIC y definida por ABCB5 es necesaria para la tumourigenicidad.
Se realizó la caracterización de xenoinjertos de melanoma G3361 en ratones atímicos Balb/c. Las regiones de ABCB5+ se segregaron con áreas sin melanizar, mientras que las regiones de ABCB5 se correlacionan correcciones que muestran melanización con partículas de color marrón-negro. La inmunohistoquímica de un xenoinjerto de melanoma tratado con mAb anti-ABCB5 y teñido con mAb anti-ABCB5, Ab anti-Ig secundario o mAb CD11b reveló resultados coherentes con los que se han descrito anteriormente. Al igual que en xenoinjertos derivados de paciente 65 primarios, el análisis inmunohistoquímico de secciones de tumor adyacentes reveló que el mAb anti-ABCB5 administrado de forma sistémica se unía a las regiones de tumor ABCB5+, que también se correlacionan con la
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2411101C (en) 2000-06-05 2018-01-16 Brigham And Women's Hospital, Inc. A gene encoding a multidrug resistance human p-glycoprotein homologue on chromosome 7p15-21 and uses thereof
CA2685492C (en) * 2006-05-31 2018-01-16 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Abcb5 positive mesenchymal stem cells as immunomodulators
PL2155248T3 (pl) 2007-04-12 2015-12-31 Brigham & Womens Hospital Inc Celowanie w ABCB5 w terapii nowotworowej
ES2796111T3 (es) * 2008-11-14 2020-11-25 Brigham & Womens Hospital Inc Métodos terapéuticos relacionados con células madre cancerosas
US11542328B2 (en) 2008-11-14 2023-01-03 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Therapeutic and diagnostic methods relating to cancer stem cells
WO2010065711A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 Adimab, Inc. An abcb5 epitope and antibodies thereto for the treatment of cancer
WO2011140828A1 (en) * 2010-05-14 2011-11-17 The University Of Hong Kong Gep antibody and uses thereof
ES2860573T3 (es) 2013-02-19 2021-10-05 Childrens Medical Center Células madre ABCB5(+) para el tratamiento de enfermedades oculares
BR112015028193B8 (pt) 2013-05-10 2023-04-18 Childrens Medical Center Suporte para cicatrização de feridas
US9177410B2 (en) 2013-08-09 2015-11-03 Ayla Mandel System and method for creating avatars or animated sequences using human body features extracted from a still image
US20180134771A1 (en) * 2015-05-07 2018-05-17 Bioxcel Corporation Novel immunomodulatory therapeutic strategies targeting tumors in cancer
CA2991628C (en) 2015-07-16 2020-04-07 Bioxcel Therapeutics, Inc. A novel approach for treatment of cancer using immunomodulation
CA3097875A1 (en) * 2018-04-25 2019-10-31 Children's Medical Center Corporation Abcb5 ligands and substrates
US12014835B2 (en) 2020-02-19 2024-06-18 Vanderbilt University Methods for evaluating therapeutic benefit of combination therapies
CA3180226A1 (en) * 2020-04-15 2021-10-21 Children's Medical Center Corporation Targeting abcb5 in glioblastoma multiforme
JP2023524102A (ja) * 2020-04-30 2023-06-08 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション Ａｂｃｂ５に特異的な抗体およびその使用
CN116836291B (zh) * 2023-08-25 2023-11-07 宝船生物医药科技(上海)有限公司 抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体及其制备方法和应用

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US565354A (en) 1896-08-04 James h
US3854480A (en) 1969-04-01 1974-12-17 Alza Corp Drug-delivery system
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
GB2047543B (en) * 1978-12-06 1983-04-20 Svedman Paul Device for treating tissues for example skin
US4355023A (en) 1980-09-30 1982-10-19 The Massachusetts General Hospital Antibody fragment compositions and process
US4675189A (en) 1980-11-18 1987-06-23 Syntex (U.S.A.) Inc. Microencapsulation of water soluble active polypeptides
US4470925A (en) 1982-05-05 1984-09-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies
US4462334A (en) 1982-08-19 1984-07-31 Kim Ho K Solar animal structure
AT379688B (de) * 1982-11-22 1986-02-10 List Hans Sensorelement zur bestimmung des o2-gehaltes einer probe
US4452775A (en) 1982-12-03 1984-06-05 Syntex (U.S.A.) Inc. Cholesterol matrix delivery system for sustained release of macromolecules
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
DE3587465T2 (de) 1984-09-10 1994-01-20 Hsc Res Dev Corp Vielfache Drogen-Resistenz in Säugetierzellinien und Isolierung der determinanten Glykoprotein-DNS.
US4837306A (en) 1985-02-25 1989-06-06 The Ontario Cancer Institute Method for selecting hybridomas producing antibodies specific to the P-glycoprotein cell suface antigen and a cDNA clone encoding the C-terminal portion of the antigen
GB8509978D0 (en) * 1985-04-18 1985-05-30 Juhasz L Wound dressings
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US5565354A (en) * 1986-09-05 1996-10-15 Sandoz Ltd. Production of human monoclonal antibodies specific for hepatitis B surface antigen
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
WO1990003430A1 (en) 1988-09-23 1990-04-05 Cetus Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5211657A (en) 1988-11-07 1993-05-18 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Laminin a chain deduced amino acid sequence, expression vectors and active synthetic peptides
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5399483A (en) * 1989-03-30 1995-03-21 Suntory Limited Expression of MDR-related gene in yeast cell
US5133974A (en) 1989-05-05 1992-07-28 Kv Pharmaceutical Company Extended release pharmaceutical formulations
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
ES2246502T3 (es) * 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5434075A (en) 1992-03-20 1995-07-18 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Monoclonal antibody to a human MDR1 multidrug resistance gene product, and uses
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69233528T2 (de) 1991-11-25 2006-03-16 Enzon, Inc. Verfahren zur Herstellung von multivalenten antigenbindenden Proteinen
US5407686A (en) 1991-11-27 1995-04-18 Sidmak Laboratories, Inc. Sustained release composition for oral administration of active ingredient
US6436078B1 (en) * 1994-12-06 2002-08-20 Pal Svedman Transdermal perfusion of fluids
EP0626012B1 (en) 1992-02-11 2003-07-09 Cell Genesys, Inc. Homogenotization of gene-targeting events
US6231881B1 (en) * 1992-02-24 2001-05-15 Anton-Lewis Usala Medium and matrix for long-term proliferation of cells
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
IT1257893B (it) 1992-06-17 1996-02-16 Ist Superiore Sanita Anticorpi monoclonali che riconoscono un epitopo della p-glicoproteina umana.
ATE139900T1 (de) 1992-11-13 1996-07-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
GB2272645B8 (en) * 1992-11-23 2010-02-10 Johnson & Johnson Medical Wound dressing
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
CA2180526A1 (en) 1994-01-05 1995-07-13 Joseph C. Hogan, Jr. Method of identifying chemical compounds having selected properties for a particular application
GB9403135D0 (en) * 1994-02-18 1994-04-06 Univ Glasgow Wound healing device
EP0804249A2 (en) 1994-03-15 1997-11-05 Brown University Research Foundation Polymeric gene delivery system
US5534615A (en) * 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5686578A (en) * 1994-08-05 1997-11-11 Immunomedics, Inc. Polyspecific immunoconjugates and antibody composites for targeting the multidrug resistant phenotype
US5712171A (en) 1995-01-20 1998-01-27 Arqule, Inc. Method of generating a plurality of chemical compounds in a spatially arranged array
US5736152A (en) 1995-10-27 1998-04-07 Atrix Laboratories, Inc. Non-polymeric sustained release delivery system
EP0922666B1 (en) * 1996-06-28 2004-09-08 Matsushita Electric Works, Ltd. Reforming apparatus for making a CO-reduced reformed gas.
US5904659A (en) * 1997-02-14 1999-05-18 Exogen, Inc. Ultrasonic treatment for wounds
US6152142A (en) 1997-02-28 2000-11-28 Tseng; Scheffer C. G. Grafts made from amniotic membrane; methods of separating, preserving, and using such grafts in surgeries
DE19722075C1 (de) * 1997-05-27 1998-10-01 Wilhelm Dr Med Fleischmann Vorrichtung zur Applikation von Wirkstoffen an einer Wundoberfläche
US6420622B1 (en) * 1997-08-01 2002-07-16 3M Innovative Properties Company Medical article having fluid control film
US6071267A (en) * 1998-02-06 2000-06-06 Kinetic Concepts, Inc. Medical patient fluid management interface system and method
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
GB9808836D0 (en) * 1998-04-27 1998-06-24 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Microfabricated apparatus for cell based assays
JP4220058B2 (ja) * 1998-06-30 2009-02-04 浜松ホトニクス株式会社 半導体位置検出器
US6479072B1 (en) * 1999-02-11 2002-11-12 The General Hospital Corporation Microfabricated membranes and matrices
US6277574B1 (en) 1999-04-09 2001-08-21 Incyte Genomics, Inc. Genes associated with diseases of the kidney
PL366290A1 (en) * 1999-11-29 2005-01-24 Hill-Rom Services, Inc. Wound treatment apparatus
KR20080023768A (ko) 2000-03-30 2008-03-14 화이트헤드 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치 Ｒｎａ 간섭의 ｒｎａ 서열 특이적인 매개체
CA2411101C (en) 2000-06-05 2018-01-16 Brigham And Women's Hospital, Inc. A gene encoding a multidrug resistance human p-glycoprotein homologue on chromosome 7p15-21 and uses thereof
US6930169B2 (en) * 2000-06-12 2005-08-16 University Of Baltimore Biotechnology Institute Method of controlling the binding of calmyrin to presenilin
IL153375A0 (en) 2000-06-22 2003-07-06 Genentech Inc Agonist anti-trk-c monoclonal antibodies
EP1322936A2 (en) * 2000-10-03 2003-07-02 California Institute Of Technology Microfluidic devices and methods of use
AU2002241569A1 (en) 2000-10-27 2002-05-27 Incyte Genomics, Inc. Transporters and ion channels
US6685681B2 (en) * 2000-11-29 2004-02-03 Hill-Rom Services, Inc. Vacuum therapy and cleansing dressing for wounds
US6855135B2 (en) * 2000-11-29 2005-02-15 Hill-Rom Services, Inc. Vacuum therapy and cleansing dressing for wounds
US8015677B2 (en) 2000-12-01 2011-09-13 Aard-Balm Limited Embalming fluid
EP1350029B1 (en) * 2001-01-08 2014-09-10 President and Fellows of Harvard College Valves and pumps for microfluidic systems and method for making microfluidic systems
US6899873B2 (en) * 2001-02-02 2005-05-31 The Regents Of The University Of Michigan Method of forming micro-tubular polymeric materials
WO2002083046A1 (en) * 2001-04-16 2002-10-24 Pamela Howard Wound dressing system
US7195624B2 (en) * 2001-12-26 2007-03-27 Hill-Rom Services, Inc. Vented vacuum bandage with irrigation for wound healing and method
CA2468309A1 (en) * 2001-12-26 2003-07-17 Robert Petrosenko Wound vacuum therapy dressing kit
US8034904B2 (en) * 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
JP2006502110A (ja) * 2002-07-03 2006-01-19 イミュノジェン・インコーポレーテッド 非放出Ｍｕｃ１およびＭｕｃ１６に対する抗体、およびその使用
DE60334303D1 (de) 2002-07-03 2010-11-04 Tasuku Honjo Immunpotenzierende zusammensetzungen
DK1578446T3 (en) * 2002-11-07 2015-06-29 Immunogen Inc ANTI-CD33 ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR TREATING ACUTE MYELOID LEUKEMIA BY USING IT
ES2367430T3 (es) 2002-12-23 2011-11-03 Wyeth Llc Anticuerpos contra pd-1 y sus usos.
US20060019256A1 (en) 2003-06-09 2006-01-26 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
GB0325130D0 (en) 2003-10-28 2003-12-03 Smith & Nephew Apparatus with scaffold
US7829336B2 (en) 2003-11-24 2010-11-09 The Rockefeller University Method for isolating a self-renewing, multipotent, slow-cycling cell
ES2689328T3 (es) 2004-01-07 2018-11-13 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Anticuerpo monoclonal M-CSF-específico y usos del mismo
WO2005079257A2 (en) * 2004-02-12 2005-09-01 Dexcom, Inc. Biointerface with macro- and micro- architecture
GB0416168D0 (en) * 2004-07-20 2004-08-18 Vernalis Cambridge Ltd Pyrmidothiophene compounds
WO2006051405A2 (en) 2004-11-12 2006-05-18 Cambridge University Technical Services Ltd. Methods and means related to cancer stem cells
AU2006259583A1 (en) 2005-06-13 2006-12-28 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US20070099209A1 (en) 2005-06-13 2007-05-03 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
CA2685492C (en) 2006-05-31 2018-01-16 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Abcb5 positive mesenchymal stem cells as immunomodulators
US20080118432A1 (en) * 2006-09-07 2008-05-22 Ivan Bergstein Monitoring cancer stem cells
PL2155248T3 (pl) 2007-04-12 2015-12-31 Brigham & Womens Hospital Inc Celowanie w ABCB5 w terapii nowotworowej
ES2796111T3 (es) 2008-11-14 2020-11-25 Brigham & Womens Hospital Inc Métodos terapéuticos relacionados con células madre cancerosas
ES2860573T3 (es) 2013-02-19 2021-10-05 Childrens Medical Center Células madre ABCB5(+) para el tratamiento de enfermedades oculares
BR112015028193B8 (pt) 2013-05-10 2023-04-18 Childrens Medical Center Suporte para cicatrização de feridas

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Publication number Publication date
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US9855342B2 (en) 2018-01-02
JP6268237B2 (ja) 2018-01-24
AU2008239633A1 (en) 2008-10-23
US20160136297A1 (en) 2016-05-19
JP2018052979A (ja) 2018-04-05
EP2644205B1 (en) 2018-06-13
CY1121046T1 (el) 2019-12-11
AU2008239633B2 (en) 2014-05-29
PT2644205T (pt) 2018-10-19
HUE027593T2 (en) 2016-11-28
JP6530044B2 (ja) 2019-06-12
PT2155248E (pt) 2015-10-23
DK2644205T3 (en) 2018-09-24
CA2718573C (en) 2020-07-14
DK2155248T3 (en) 2015-09-14
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