ES2550621T3 - Anticuerpos anti-CD19 y usos en oncología - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-CD19 quimerizado, o humanizado que (a) es del isotipo humano IgG1 o IgG3, o (b) media la citotoxicidad humana celular dependiente de anticuerpo (ADCC), en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el anticuerpo comprende las secuencias expuestas como los aminoácidos 33 a 37, los aminoácidos 51 a 68 y los aminoácidos 101 a 115 de la SEC ID Nº 2 y las secuencias expuestas como los aminoácidos 43 a 58, los aminoácidos 74 a 80 y los aminoácidos 113 a 121 de la SEC ID Nº 16, o las secuencias expuestas como los aminoácidos 33 a 37, los aminoácidos 51 a 68 y los aminoácidos 101 a 114 de la SEC ID Nº 4 y las secuencias expuestas como los aminoácidos 44 a 58, los aminoácidos 74 a 80 y los aminoácidos 113 a 121 de la SEC ID Nº 18, en la que se introduce una sustitución de aminoácido en una o más de dichas secuencias y en la que el anticuerpo es capaz de reducir las células B que expresan CD19 de la médula ósea.

Description

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policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, los anticuerpos humanos, los anticuerpos humanizados, los anticuerpos camelizados, los anticuerpos quiméricos, los Fv de cadena simple (scFv), los anticuerpos de una sola cadena, los anticuerpos de dominio único, los dominios de anticuerpos, los fragmentos Fab, los fragmentos F (ab') 2, los fragmentos de anticuerpos que exhiben la actividad biológica deseada, los Fv enlazados por disulfuro (sdFv) y los anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (se incluyen, por ejemplo, los anticuerpos anti-Id de los anticuerpos de la invención), los intracuerpos y los fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulinas y fragmentos de moléculas de inmunoglobulinas inmunológicamente activos, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclases.

Los anticuerpos nativos son generalmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150 000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH), seguido por varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo, el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y pesada. Tales anticuerpos pueden derivarse de cualquier mamífero, que incluye, aunque sin limitación, seres humanos, monos, cerdos, caballos, conejos, perros, gatos, ratones, etc.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y son responsables de la especificidad de unión de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en segmentos llamados regiones determinantes de la complementariedad (CDR), tanto en los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones flanqueantes (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, en gran medida adoptan una configuración en lámina  conectadas por tres CDR, que forman lazos que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura en lámina . Las CDR en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes generalmente no están involucrados directamente en la unión al antígeno, pero pueden influir en la afinidad de unión al antígeno y pueden presentar diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la ADCC, la CDC, y/o la apoptosis.

El término "región hipervariable" cuando se usa en este documento se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que están asociados con su unión al antígeno. Las regiones hipervariables abarcan los restos de aminoácidos de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de la cadena ligera y los restos 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) del dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada;. Chothia y Lesk, J. Mol Biol., 196:901-917 (1987)). Los restos de "flanqueantes" o "FR" son los restos del dominio variable que flanquean las CDR. Los restos FR están presentes en los dominios de los anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos y los diacuerpos, los vaccicuerpos, los anticuerpos lineales, y los anticuerpos biespecíficos.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, están dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en cuanto a que pueden sintetizarse por las células del hibridoma que no están contaminadas por las células productoras de otras inmunoglobulinas. Como alternativa, las células transfectadas de forma estable o transitoria con los genes de las cadenas pesada y ligera que codifican el anticuerpo monoclonal pueden producir el anticuerpo monoclonal. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere la ingeniería del anticuerpo por cualquier método particular. El término "monoclonal" se usa en este documento para referirse a un anticuerpo que se deriva de una población clonal de células, que incluye cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no el

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método por el cual el anticuerpo se modificó por ingeniería. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para el uso de acuerdo con la presente invención pueden hacerse por el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden hacerse por cualquier método de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 4.816.567), que incluye el aislamiento a partir de bibliotecas de anticuerpos en fagos por medio del uso de las técnicas descritas, por ejemplo, en Clackson et al., Nature, 352:624628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991). Estos métodos pueden usarse para producir anticuerpos de mamíferos monoclonales, quiméricos, humanizados, humanos, de dominio, diacuerpos, vaccicuerpos, anticuerpos lineales, y anticuerpos biespecíficos.

El término anticuerpos "quiméricos" incluye los anticuerpos en los que al menos una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, y al menos otra parte de la cadena(s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como los fragmentos de tales anticuerpos, mientras que muestren la actividad biológica deseada (patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; Morrison et al., Proc Natl Acad Sci. Estados Unidos, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en este documento incluyen los anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de los dominios variables de unión al antígeno derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Mono del Viejo Mundo, tal como monos babuinos, rhesus o cinomolgos) y secuencias de las regiones constantes humanas (patente de Estados Unidos Nº 5.693.780).

Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no-humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los restos de las CDR nativas se reemplazan por los restos de las correspondientes CDR de una especie no-humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no-humano que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, restos de la región FR de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes restos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más la función del anticuerpo. En general, una cadena pesada o ligera del anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno o más dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las CDR corresponden a las de la inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. En ciertas realizaciones, el anticuerpo humanizado comprenderá al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

Un "anticuerpo humano" puede ser un anticuerpo derivado de un humano o un anticuerpo obtenido a partir de un organismo transgénico que se "modificó por ingeniería" para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a estímulos antigénicos y pueden producirse por cualquier método conocido en la técnica. En ciertas técnicas, los elementos de los loci de las cadenas pesada y ligera humanas derivadas de líneas de células madre que contienen alteraciones específicas de los loci de las cadenas pesada y ligera endógenas se introducen en cepas del organismo. El organismo transgénico puede sintetizar anticuerpos humanos específicos para los antígenos humanos, y el organismo puede usarse para producir hibridomas que secretan anticuerpos humanos. Un anticuerpo humano también puede ser un anticuerpo donde las cadenas pesada y ligera son codificadas por una secuencia de nucleótidos derivada de una o más fuentes de ADN humano. Un anticuerpo totalmente humano también puede construirse por métodos de transfección genética o cromosómica, así como por la tecnología de fagos, o en células B activadas in vitro, todos los cuales se conocen en la técnica.

El antígeno "CD19" se refiere a un antígeno de aproximadamente 90 kDa identificado, por ejemplo, por el anticuerpo HD237 o B4 (Kiesel et al., Leukemia Research II, 12:1119 (1987)). CD19 se encuentra en células a través de la diferenciación de células de linaje B desde la fase de célula madre a través de la diferenciación terminal en células plasmáticas incluyendo, aunque sin limitación, células pre-B, células B (incluyendo células B vírgenes, células B estimuladas con antígeno, células B de memoria, células plasmáticas, y linfocitos B) y células dendríticas foliculares. CD19 también se encuentra en células B en tejido fetal humano. En realizaciones preferidas, el antígeno CD19 abordado por los anticuerpos de la invención es el antígeno CD19 humano.

La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la cual las células citotóxicas no específicas (por ejemplo, células citolíticas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido a una célula diana y causan posteriormente la lisis de la célula diana. En una realización, estas células son células humanas. Si bien no se desea limitarse a ningún mecanismo de acción particular, estas células citotóxicas que median la ADCC generalmente expresan receptores Fc (FcR). Las células primarias que median la ADCC, las células NK, expresan el FcRIII, mientras que los monocitos expresan FcRI, FcRII, FcRIII y/o FcRIV. La expresión del FcR en las células hematopoyéticas se resume en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula, puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes de Estados Unidos Nº 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para estos ensayos incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las

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células citolíticas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de las moléculas de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos), 95:652-656 (1998).

La "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para iniciar la activación del complemento y lisar una diana en presencia de complemento. La vía de activación de complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que forma complejo con un antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods,

202:163 (1996).

"Las células efectoras" son leucocitos que expresan uno o más FcR y llevan a cabo las funciones efectoras. Las células expresan al menos FcRI, el FcRII, FcRIII y/o FcRIV y llevan a cabo la función efectora de la ADCC. Los ejemplos de los leucocitos humanos que median la ADCC incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), las células citolíticas naturales (NK), los monocitos, las células T citotóxicas y los neutrófilos; siendo preferidas las PBMC y células NK. En realizaciones preferidas las células efectoras son células humanas.

Los términos "receptor de Fc" o "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. En una realización, el FcR es una secuencia humana nativa de FcR. Además, en ciertas realizaciones, el FcR se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye los receptores de las subclases FcRI, FcRII, FcRIII, y FcRIV, se incluyen variantes alélicas y formas de estos receptores empalmadas alternativamente. Los receptores FcRII incluyen el FcRIIA (un "receptor activador") y FcRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de éstos. El receptor activador FcRIIA contiene en su dominio citoplasmático un motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM). El receptor inhibidor FcRIIB contiene en su dominio citoplasmático un motivo de inhibición del inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM). (Véase, Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:45792 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo aquellos a identificar en el futuro, están incluidos por el término "FcR" en este documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., Immunol., 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).

El "Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión al antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y ligera en una estrecha asociación, no covalente o covalente. Es en esta configuración en que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Las seis CDR colectivamente confieren al anticuerpo la especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión completo.

La "afinidad" de un anticuerpo por un epítopo para usarse en el tratamiento (s) descrito en este documento, es un término bien entendido en la técnica y significa la medida, o la fuerza, de unión del anticuerpo al epítopo. La afinidad puede medirse y/o expresarse de varias formas conocidas en la técnica, se incluyen, aunque sin limitación, la constante de disociación de equilibrio (KD o Kd), la constante de disociación de equilibrio aparente (KD' o Kd'), e IC50 (cantidad necesaria para provocar el 50% de la inhibición en un ensayo de competencia). Se entiende que, para los propósitos de esta invención, una afinidad es una afinidad promedio de una población dada de anticuerpos que se unen a un epítopo. Los valores de KD' informados en este documento en términos de mg de IgG por ml o mg/ml indican los mg de Ig por ml de suero, aunque puede usarse el plasma. Cuando la afinidad de los anticuerpos se usa como base para la administración de los métodos de tratamiento descritos en este documento, o la selección de los métodos de tratamiento descritos en este documento, la afinidad de los anticuerpos puede medirse antes y/o durante el tratamiento, y un médico puede usar los valores obtenidos para evaluar si un paciente humano es un candidato apropiado para el tratamiento.

Un "epítopo" es un término bien entendido en la técnica y significa cualquier resto químico que muestre unión específica a un anticuerpo. Un "antígeno" es un resto o molécula que contiene un epítopo, y, como tal, también se une específicamente al anticuerpo.

Un "marcador de superficie de células B" como se usa en este documento es un antígeno expresado en la superficie de una célula B, que puede fijarse como diana con un agente que se una al mismo. Los marcadores de superficie de células B incluyen los marcadores de superficie de leucocitos CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CD75, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85 y CD86. Un marcador de superficie de célula B de interés particular se expresa preferiblemente en células B en comparación con otros tejidos de células no-B de un mamífero y puede expresarse tanto en células precursoras B como células del linaje B maduras. En una realización, el marcador es el CD19, el cual se encuentra en las células B en diversas etapas de la diferenciación.

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El término "vida media del anticuerpo" como se usa en este documento, significa una propiedad farmacocinética de un anticuerpo que es una medida del tiempo de supervivencia media de las moléculas de anticuerpos después de su administración. La vida media del anticuerpo puede expresarse como el tiempo requerido para eliminar el 50 por ciento de una cantidad conocida de inmunoglobulina del cuerpo del paciente o de un compartimento específico de éste, por ejemplo, según se mida en el suero o plasma, es decir, la vida media circulante, o en otros tejidos. La vida media puede variar de una inmunoglobulina o clase de inmunoglobulina a otra. En general, un aumento de la vida media de los anticuerpos resulta en un aumento en el tiempo medio de residencia (MRT) en circulación para el anticuerpo administrado.

El término "isotipo" se refiere a la clasificación de la región constante de las cadenas pesada o ligera de un anticuerpo. Los dominios constantes de los anticuerpos no están implicados en la unión al antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras. En dependencia de la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada, un anticuerpo humano dado o inmunoglobulina puede asignarse a una de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Varias de estas clases pueden dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1 (gamma 1), IgG2 (gamma 2), IgG3 (gamma 3), e IgG4 (gamma 4), e IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman , , , , y , respectivamente. Las estructuras y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. De las diversas clases de inmunoglobulinas humanas, sólo la IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM humanas se conoce que activan el complemento. Se sabe que las IgG1 e IgG3 humanas actúan como mediadoras en la ADCC en seres humanos.

Como se usa en este documento, el término "inmunogenicidad" significa que un compuesto es capaz de provocar una respuesta inmune (estimular la producción de anticuerpos específicos y/o la proliferación de las células T específicas).

Como se usa en este documento, el término "antigenicidad" significa que un compuesto es reconocido por un anticuerpo o puede unirse a un anticuerpo e inducir una respuesta inmune.

Como se usa en este documento, el término "avidez" es una medida de la fuerza total de unión (es decir, ambos brazos del anticuerpo) con que un anticuerpo se une a un antígeno. La avidez del anticuerpo puede determinarse por la medición de la disociación del enlace antígeno-anticuerpo en exceso del antígeno por medio del uso de cualquier medio conocido en la técnica, tal como, aunque sin limitación, la modificación de la fluorescencia indirecta de los anticuerpos como se describió por Gray et al., J. Virol. Meth., 44:11-24. (1993).

Por los términos "tratar", "que trata" o "tratamiento de" (o términos gramaticalmente equivalentes) se entiende que la gravedad de la afección del sujeto se reduce o al menos mejora parcialmente o se atenúa y/o se logra algún alivio, mitigación o disminución de al menos un síntoma clínico y/o no hay una inhibición o retraso en la progresión de la afección y/o la prevención o retraso del comienzo de una enfermedad o dolencia. Por lo tanto, los términos "tratar", "que trata" o "tratamiento de" (o términos gramatical equivalentes) se refieren a los regímenes de tratamiento, tanto profilácticos como terapéuticos.

Como se usa en este documento, una "cantidad suficiente" o "una cantidad suficiente para" lograr un resultado particular se refiere a una cantidad de un anticuerpo o la composición de la invención que es eficaz para producir un efecto deseado, que es opcionalmente un efecto terapéutico (es decir, por la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz). Por ejemplo, una "cantidad suficiente" o "cantidad suficiente para" puede ser una cantidad que es eficaz para reducir las células B.

Una cantidad "terapéuticamente eficaz" como se usa en este documento, es una cantidad que proporciona una cierta mejora o beneficio al sujeto. Dicho de otra manera, una cantidad "terapéuticamente eficaz" es una cantidad que proporciona algún alivio, mitigación y/o una disminución de al menos un síntoma clínico. Los síntomas clínicos asociados con los trastornos que pueden tratarse por los métodos de la invención son bien conocidos por los especialistas en la técnica. Además, los especialistas en la técnica apreciarán que los efectos terapéuticos no necesitan ser completos o curativos, siempre y cuando se proporcione algún beneficio al sujeto.

4. Breve descripción de las figuras

Las Fig. 1A-1E ilustran la expresión de CD19 por líneas de ratón hCD19TG. La Fig. 1A muestra la expresión de CD19 humano y de ratón por células B de ratones hCD19TG (TG-1+/-). La Fig. 1B muestra las densidades medias relativas de la expresión de CD19 humano y de ratón por células B sanguíneas CD19+ de ratones hCD19TG. La Fig. 1C muestra las densidades relativas de la expresión de hCD19 y mCD19 por células B CD19+ de tejidos de ratón TG-1+/-. La Fig. 1D muestra la densidad de unión de anticuerpos anti-CDC19 en células B B220+ de sangre y bazo de ratón de ratones TG-1+/-. La Fig. 1E muestra la unión del anticuerpo anti-CD19 a células 300.19 transfectadas por ADNc de hCD19. Las Fig. 2A-2D muestran la reducción de células B de sangre, bazo, y ganglio linfático en ratones hCD19TG. La Fig. 2A muestra la reducción representativa de células B de sangre, bazo, y ganglio linfático 7 días después de

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tratamiento con anticuerpo anti-CD19 o de control de isotipo coincidente (CTL) de ratones TG-1+/-. La Fig. 2B muestra un curso de tiempo de reducción de células B en circulación por anticuerpos anti-CD19. La Fig. 2C y Fig. 2D muestran las cantidades de células B en bazo y ganglio linfático (±DTM), respectivamente, después de tratamiento de ratones TG-1+/-con anticuerpo anti-CD19 (barras rellenas) o control (barras abiertas) a las dosis indicadas. Las Fig. 3A-3F representan la reducción de células B en médula ósea después de tratamiento con anticuerpo anti-CD19. La Fig. 3A muestra la expresión representativa de hCD19 y mCD19 por subpoblaciones de células B de médula ósea TG-1+/-evaluadas por tinción de inmunofluorescencia de cuatro colores con análisis de citometría de flujo. La Fig. 3B muestra la reducción de células hCD19+ en la médula ósea de ratones hCD19TG siete días después de tratamiento con anticuerpo FMC63 o de control de isotipo coincidente (250 g) evaluada por tinción de inmunofluorescencia de dos colores con análisis de citometría de flujo. La Fig. 3C muestra la reducción de células B B220+ representativas en la médula ósea siete días después de tratamiento con anticuerpo anti-CD19 o de control de isotipo coincidente (250 g) de ratones TG-1+/-. La Fig. 3D muestra la reducción del subconjunto de células B representativo siete días después de tratamiento con anticuerpo FMC63

o de control de isotipo coincidente (250 g) de ratones TG-1+/-evaluado por tinción de inmunofluorescencia de tres colores. Las células IgM-B220lo pro-/pre-B se subdividieron adicionalmente en base a la expresión de CD43 (paneles inferiores). La Fig. 3E muestra reducción representativa de células CD25+a220lo pre-B siete días después de tratamiento con anticuerpo FMC63 o de control de isotipo coincidente (250 g) de líneas de ratón hCD19TG evaluado por tinción de inmunofluorescencia de dos colores. La Fig. 3F muestra gráficos de barras que indican cantidades (±DTM) de células pro-B, pre-B, B inmaduras, y maduras dentro de fémures bilaterales siete días después de tratamiento con anticuerpo FMC63 (barras cerradas) o de control (barras abiertas) de ≥ 3 parejas de camada. Las Fig. 4A-4C demuestran que las células B de la cavidad peritoneal son sensibles a tratamiento con anticuerpo anti-CD19. La Fig. 4A muestra la expresión de CD19 humano y de ratón por células B CD5+B220+ B1a y CD5-B220hi B2 de la cavidad peritoneal (convencionales). La Fig. 4B muestra reducción de células B220+ de la cavidad peritoneal de ratones TG-1+/-tratados con anticuerpos anti-CD19 (HB12a, HB12b, y FMC63 a 250 g; B4 y HD237 a 50 g) o anticuerpo de control (250 g). La Fig. 4C muestra la reducción representativa de células B CD5+B220+ B1a y CD5-B220hi B2 siete días después de tratamiento con anticuerpo anti-CD19 o de control de ratones hCD19TG. La Fig. 5A representa las secuencias de nucleótidos (SEC ID Nº 1) y de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 2) para secuencias de unión de cadena pesada VH-D-JH del anticuerpo anti-CD19 HB12a. La Fig. 5B representan las secuencias de nucleótidos (SEC ID Nº 3) y de aminoácido predicha (SEC ID Nº 4) para secuencias de unión de cadena pesada VH-D-JH del anticuerpo anti-CD19 HB12b. La Fig. 6A representan las secuencias de nucleótidos (SEC ID Nº 15) y de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 16) para secuencias de cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 HB12a. La Fig. 6B representa las secuencias de nucleótidos (SEC ID Nº 17) y de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 18) para secuencias de cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 HB12b. Las Fig. 7A-7B representan la alineación de secuencia de aminoácidos de anticuerpos publicados de ratón anti-CD19 (humano). La Fig. 7A muestra una alineación de secuencia para secuencias de unión de cadena pesada VH-D-JH incluyendo una secuencia consenso (SEC ID Nº 5), HB12a (SEC ID Nº 2), 4G7 (SEC ID Nº 6), HB12b (SEC ID Nº 4), HD37 (SEC ID Nº 7), B43 (SEC ID Nº 8), y FMC63 (SEC ID Nº 9). La Fig. 7B muestra análisis de secuencia de aminoácidos de cadena ligera V de anticuerpos anti-CD19. Están alineadas la secuencia consenso (SEC ID Nº 10), HB12a (SEC ID Nº 16), HB12b (SEC ID Nº 18), HD37 (SEC ID Nº 11), B43 (SEC ID Nº 12), FMC63 (SEC ID Nº 13), y 4G7 (SEC ID Nº 14). Las Fig. 8A-8C demuestran que la densidad de CD19 influye en la eficacia de la reducción de células B por anticuerpos anti-CD19 in vivo. Se muestra la reducción representativa de células B en sangre y bazo en ratones hCD19TG después de tratamiento con anticuerpo HB12b (Fig. 8A) o FMC63 (Fig. 8B) (siete días, 250 g/ratón). La Fig. 8C muestra las densidades relativas de unión de anticuerpo anti-CD19 y anti-CD20 en células B de sangre B220+ de ratones TG-1+/-. La Fig. 8D muestra las densidades relativas de unión de anticuerpo anti-CD19 y anti-CD20 en células B de bazo B220+ de ratones TG-1+/-. Las Fig. 9A-9D demuestran que la reducción de células B después de tratamiento con anticuerpo anti-CD19 es dependiente de FcR y monocitos. Fig. 9A Reducción representativa de células B de sangre y bazo 7 días después de tratamiento con anticuerpo contra CD19 o de control de isotipo de camadas hCD19 TG-1+/-FcR+/-o TG-1+/-FcR-/-. Fig. 9B Reducción de células B en sangre y tejido siete días después de tratamiento con anticuerpo de camadas FcR-/-en el día cero. Fig. 9C Cantidades representativas de células B en ratones hCD19TG-1+/-con reducción de monocitos. Fig. 9D Reducción de células B de sangre y tejido siete días después de tratamiento con anticuerpo. Las Fig. 10A-10D demuestran la duración y respuesta a dosis de la reducción de células B después de tratamiento con anticuerpo anti-CD19. La Fig. 10A muestra las cantidades de células B de sangre B220+ y células T Th-1+ después de tratamiento con anticuerpo FMC63 o de control de isotipo de ratones TG-1+/-en el día cero. Las Fig. 10B-C muestran reducción representativa de células B tisulares en ratones mostrados en la Fig. 10A a las 11, 16, y 30 semanas después de tratamiento con anticuerpo, la Fig. 10D muestra respuestas a dosis de anticuerpo anti-CD19 para reducción de células B de sangre, médula ósea, y bazo.

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Las Fig. 11A-11C demuestran que CD 19 no se internaliza después de la unión del anticuerpo in vivo. Expresión de CD19 en superficie celular y eliminación de células B en ratones TG-1+/-tratados con anticuerpo HB12a (Fig. 11A), HB12b (Fig. 11B), FMC63 (Fig. 11C) o de control de isotipo coincidente. (250 g) in vivo. Las Fig. 12A-12C demuestran la saturación de CDC19 después de la unión del anticuerpo anti-CD19 in vivo. La Fig. 12A muestra la eliminación de células B en ratones TG-1+/-tratados con anticuerpo FMC63 o de control de isotipo coincidente (250 g) in vivo. La Fig. 12B muestra que el tratamiento con anticuerpo FMC63 (250 g) satura los sitios de unión del anticuerpo en hCD19 en 1 hora de administración. La Fig. 12C muestra que el tratamiento con anticuerpo anti-CD19 HB12b (250 g) satura los sitios de unión del anticuerpo en hCD19 en 1 hora de administración evaluado en la Fig. 12B. Las Fig. 13A-13B demuestran que el tratamiento con anticuerpo anti-CD19 reduce los niveles séricos de inmunoglobulina y autoanticuerpo en ratones TG-1+/-. La Fig. 13A representa los niveles séricos de inmunoglobulina y la Fig. 13B los niveles de autoanticuerpo anti-ADNbc, anti-ADNmc y anti-histona después de tratamiento con anticuerpo anti-CD19. Las Fig. 14A-14B demuestran que el tratamiento con anticuerpo anti-CD19 bloquea las respuestas inmunes humorales en ratones TG-1+/-. Los ratones tratados con anticuerpo se inmunizaron con Fig. 14A TNP-LPS, Fig. 14B DNP-Ficoll y Fig. 14C-14D DNP-KLH. Las camadas se trataron con anticuerpo FMC63 (círculos cerrados) o de control (círculos abiertos) (250 g) (A-C) 7 días antes o (D) 14 días después de las inmunizaciones primarias en el día 0. La Fig. 15 demuestra que los tratamientos simultáneos de anticuerpo anti-CD19 y anti-CD20 son aditivos. La Fig. 16 demuestra que la administración subcutánea (s.c.), intraperitoneal (i.p.) e i.v. de anticuerpo anti-CD19 reduce de forma eficaz las células B en circulación y tejido in vivo. Fig. 17A-17B. El tratamiento con anticuerpo anti-CD19 previene el crecimiento de linfoma hCD19+ in vivo (Fig. 17A) y aumenta la tasa de supervivencia (Fig. 17B).

5. Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a composiciones y anticuerpos inmunoterapéuticos para su uso en métodos para el tratamiento de enfermedades y trastornos de células B en sujetos humanos tales como, aunque sin limitación, neoplasias de células B, usando anticuerpos terapéuticos que se unen al antígeno CD19 y preferiblemente median ADCC humana. La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-CD19 humanizados, o quiméricos del isotipo humano IgG1 o IgG3. La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-CD19 humanizados del isotipo humano IgG2 o IgG4 que preferiblemente median ADCC humana. En ciertas realizaciones, la presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-CD19 monoclonales humanizados, o quimerizados que pueden producirse por medios conocidos en la técnica.

Se describen formulaciones y regímenes terapéuticos para tratar sujetos humanos diagnosticados con neoplasias de células B que derivan de células B y sus precursores incluyendo, aunque sin limitación, leucemias linfoblásticas agudas (ALL), linfomas de Hodgkin, linfomas no Hodgkin, leucemias linfocíticas crónicas de células B (CLL), mieloma múltiple, linfoma folicular, linfoma de células del manto, leucemias pro-linfocíticas, leucemias de células capilares, leucemias linfocíticas agudas comunes y algunas leucemias linfoblásticas nulas-agudas.

5.1 Generación de anticuerpos anti-CD19

5.1.1. Anticuerpos policlonales anti-CD19

Los anticuerpos policlonales se crean preferiblemente en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (i.p.) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que sea inmunogénica en la especie a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobertzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de restos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de restos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2.

Los animales se inmunizan frente al antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados combinando, por ejemplo, 100 g o 5 g de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después los ratones se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante incompleto de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días después se extrae sangre de los animales y se ensaya el suero para el título de anticuerpo. Los animales se refuerzan hasta que el título alcanza un nivel constante. Preferiblemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero se conjuga con una proteína diferente y/o a través de un reactivo diferente de reticulación. Los conjugados también pueden prepararse en cultivo celular recombinante como fusiones proteicas. Además, se usan adecuadamente agentes de agregación tales como alumbre para potenciar la respuesta inmune.

5.1.2. Anticuerpos monoclonales anti-CD19

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a la secuencia de codificación de una inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia de codificación de un polipéptido que no es una inmunoglobulina.

5.1.5. Anticuerpos quiméricos

Los anticuerpos anti-CD19 en este documento específicamente incluyen anticuerpos quiméricos (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que otra porción de la (s) cadena (s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como los fragmentos de tales anticuerpos, mientras que exhiban la actividad biológica deseada (patente de Estados Unidos Nº 4.816.567, Morrison et al., Proc Natl. Acad Sci Estados Unidos, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en este documento incluyen los anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias del dominio variable de unión al antígeno derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del viejo mundo, tales como babuinos, monos rhesus o cinomolgos) y secuencias de la región constante humana (patente de Estados Unidos Nº 5.693.780).

5.1.6. Anticuerpos anti-CD19 humanizados

Un anticuerpo humanizado puede producirse usando una diversidad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, aunque sin limitación, injerto de CDR (véase, por ejemplo, la patente europea Nº EP 239.400; la publicación internacional Nº WO 91/09967, y las patentes de Estados Unidos Nº 5.225.539, 5.530.101, y 5.585.089), recubrimiento o remodelado (véase, por ejemplo, las patentes europeas Nº EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28 (4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7 (6) :805-814; y Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad.Sci., 91:969-973), intercambio de cadenas (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.565.332, y las técnicas descritas en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 6.407.213, la patente de Estados Unidos Nº 5.766.886, la publicación internacional Nº WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13 (5) :353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20 (3) :267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272 (16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9 (10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (Sup. 23):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55 (8):1717-22 (1995), Sandhu JS, Gene, 150 (2):409-10 (1994) y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235 (3):959-73 (1994). A menudo, restos FR en las regiones FR se sustituirán con el resto correspondiente del anticuerpo donante de la CDR para alterar, preferiblemente mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones en los FR se identifican por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por la modelación de las interacciones de las CDR y los restos de los FR para identificar restos de los FR importantes para la unión al antígeno y la comparación de secuencia para identificar los restos de los FR inusuales en posiciones particulares (véase, por ejemplo, Queen et al., patente de Estados Unidos Nº 5.585.089; y Riechmann et al., 1988, Nature, 332: 323).

Un anticuerpo humanizado anti-CD19 tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en él de una fuente nohumana. Estos restos de aminoácidos no humanos se denominan a menudo como restos "importados", los cuales se toman típicamente de un dominio variable "importado". Así, los anticuerpos humanizados comprenden una o más CDR de moléculas de inmunoglobulina no humanas y las regiones flanqueantes humanas. La humanización de anticuerpos es bien conocida en la técnica y esencialmente puede realizarse según el método de Winter et al. (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:15341536 (1988)), por la sustitución de las CDR del roedor o secuencias de las CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano, es decir, el injerto de CDR (documento EP 239.400; publicación PCT Nº WO91/09967; y patentes de Estados Unidos Nº 4.816.567; 6.331.415; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 6.548.640). En tales anticuerpos quiméricos humanizados, se sustituye sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos restos de las CDR y posiblemente algunos restos de los FR se sustituyen por restos de sitios análogos en los anticuerpos de roedores. La humanización de los anticuerpos anti-CD19 también puede lograrse por recubrimiento o remodelación (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5):489498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7 (6):805-814 (1994); y Roguska et al., Proc Natl Acad. Sci., 91:969-973 (1994)) o el intercambio de cadenas (patente de Estados Unidos Nº 5.565.332).

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se usan para hacer los anticuerpos humanizados es para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se selecciona contra la biblioteca entera de secuencias de dominiovariable humanas conocidas. Las secuencias humanas que están más estrechamente relacionadas con las del roedor se seleccionan por la presencia de restos específicos que pueden ser críticos para la unión del antígeno, la formación estructural adecuada y/o la estabilidad del mAb humanizado previsto (Sims et al., J. Immunol, 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987). Las secuencias de los FR resultantes que coinciden con los criterios deseados se usan luego como las regiones de los FR humanos donantes para el anticuerpo humanizado. Otro método usa un FR particular, derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo FR puede usarse para varios anticuerpos anti-CD19

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Los anticuerpos humanos también pueden obtenerse de bibliotecas de presentación en fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech., 14:309 (1996)). La tecnología de presentación en fagos (McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990)) puede usarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios génicos de dominio variable

(V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, se clonan genes del dominio V de anticuerpo en fase en un gen de proteína de envuelta principal o minoritaria de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partícula fágica. Como la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también provocan la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas propiedades. Por tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La presentación en fagos puede realizarse en una diversidad de formatos; para su revisión véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Pueden usarse varias fuentes de segmentos génicos V para la presentación en fagos. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron una serie diversas de anticuerpos anti-oxazolona de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse los anticuerpos contra una serie diversa de antígenos (incluyendo auto-antígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993). Véanse, también, las patentes de Estados Unidos Nº 5.565.332 y 5.573.905.

Los anticuerpos humanos también pueden generarse por células N activadas in vitro (véanse, las patentes de Estados Unidos 5.567.610 y 5.229.275). Los anticuerpos humanos también pueden generarse in vitro usando técnicas de hibridoma tales como, aunque sin limitación, las descritas por Roder et al. (Methods Enzymol., 121:140167 (1986)).

5.1.8. Anticuerpos alterados/mutantes

Los anticuerpos anti-CD19 de las composiciones y para su uso en los métodos de la invención pueden ser anticuerpos mutantes. Como se usa en este documento, "anticuerpo mutante" o "anticuerpo alterado" se refiere a una secuencia de aminoácidos variante de un anticuerpo anti-CD19 donde uno o más de los restos de aminoácido de un anticuerpo anti-CD19 se han modificado. Las modificaciones en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD19 incluyen modificaciones en la secuencia para mejorar la afinidad o avidez del anticuerpo por su antígeno, y/o modificaciones de la parte Fc del anticuerpo para mejorar la función efectora. Las modificaciones pueden hacerse para anticuerpos anti-CD19 conocidos o anticuerpos anti-CD19 identificados como se describe en este documento. Dichos anticuerpos alterados necesariamente tienen menos del 100% de identidad o similitud de secuencia con un anticuerpo anti-CD19 conocido. El anticuerpo alterado puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, o 75% de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD19, más preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 85%, más preferiblemente al menos un 90%, y mucho más preferiblemente al menos un 95%. El anticuerpo alterado puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, o 75% de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la CDR1, CDR2, o CDR3 de cadena pesada de un anticuerpo anti-CD19, más preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 85%, más preferiblemente al menos un 90%, y mucho más preferiblemente al menos un 95%. En una realización preferida, el anticuerpo alterado mantendrá la capacidad de unión a CD19 humano. El anticuerpo anti-CD19 de la invención puede comprender una cadena pesada que es aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 (Fig. 5A) correspondiente a la cadena pesada de HB12a. El anticuerpo anti-CD19 de la invención puede comprender una cadena pesada que es aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 4 (Fig. 5B) correspondiente a la cadena pesada de HB12b. El anticuerpo anti-CD19 de la invención puede comprender una cadena ligera que es aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 16 (Fig. 6A) correspondiente a la cadena ligera de HB12a. El anticuerpo anti-CD19 de la invención puede comprender una cadena ligera que es aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 18 (Fig. 6B) correspondiente a la cadena ligera de HB12b. Los hibridomas que producen anticuerpos anti-CD19 HB12a y HB12b se han depositado con los números de depósito de la ATCC PTA-6580 y PTA-6581.

La identidad o similitud con respecto a una secuencia se define en este documento como el porcentaje de restos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos (es decir, el mismo resto) o similar (es decir el resto de aminoácido del mismo grupo basado en las propiedades de las cadenas laterales comunes, ver más adelante) a restos de anticuerpos anti-CD19, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, deleciones o inserciones Nterminales, C-terminales, o internas, en la secuencia del anticuerpo fuera del dominio variable se interpretará como que afecta la identidad o similitud de secuencia.

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El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse por medio del uso de técnicas similares a las descritas anteriormente, que permiten o no huecos. En el cálculo de porcentaje de identidad, por lo general se cuentan las coincidencias exactas.

Preferiblemente, el programa Bestfit se usa para determinar el % de identidad de una secuencia de un polinucleótido

o de un polipéptido de consulta con respecto a una secuencia de polinucleótido o de polipéptido de la presente invención, la consulta y la secuencia de referencia se alinean de forma óptima y los parámetros del programa se fijan en el valor predeterminado.

Para generar un anticuerpo alterado, se introducen una o más alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en una o más de las regiones hipervariables del anticuerpo dependiente de las especies. También pueden introducirse una o más alteraciones (por ejemplo, sustituciones) de restos de la región de marco en un anticuerpo anti-CD19 cuando éstas dan como resultado una mejora en la afinidad de unión del anticuerpo mutante por el antígeno de la segunda especie de mamífero. Los ejemplos de los restos de la región de marco para modificar incluyen aquellos que se unen directamente de forma no covalente al antígeno (Amit et al., Science, 233:747-753 (1986).); interactúan/afectan la conformación de una CDR (Chothia et al., J.Mol. Biol., 196:901-917 (1987)); y/o participan en la interfase VL-VH (documento EP 239 400B1). La modificación de uno o más de tales restos de la región de marco puede resultar en una mejor afinidad de unión del anticuerpo por el antígeno de la segunda especie de mamífero. Por ejemplo, desde aproximadamente uno a aproximadamente cinco restos flanqueantes pueden modificarse en esta realización de la invención. A veces, esto puede ser suficiente para producir un anticuerpo mutante adecuado para su uso en ensayos preclínicos, incluso cuando ninguno de los restos de la región hipervariable se modifica. Normalmente, sin embargo, un anticuerpo alterado comprenderá alteración(es) adicional(es) en la región hipervariable.

Los restos de la región hipervariable que están alterados pueden cambiarse aleatoriamente, especialmente cuando la afinidad inicial de unión de un anticuerpo anti-CD19 por el antígeno de la segunda especie de mamífero es tal que esos anticuerpos alterados producidos al azar pueden seleccionarse fácilmente.

Un procedimiento útil para generar tal anticuerpo alterado se llama "mutagénesis por barrido de alanina" (Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)). Aquí, uno o más de los restos de la(s) región(es) hipervariable(s) se sustituyen por un resto de alanina o polialanina(s) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno de la segunda especie de mamífero. Aquellos restos de la región hipervariable(s) que comprenden sensibilidad funcional a las sustituciones luego se refinan mediante la introducción de mutaciones adicionales u otras mutaciones en o para los sitios de sustitución. Así, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita estar predeterminada. Los mutantes Ala que se producen de esta manera se seleccionan por su actividad biológica como se describe en este documento.

Otro procedimiento para generar ese anticuerpo alterado implica la maduración de afinidad por medio del uso de la expresión en fagos (Hawkins et al., J.Mol. Biol., 254:889-896 (1992) y Lowman et al., Biochemistry, 30 (45):1083210837 (1991)). Brevemente, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los mutantes de anticuerpos así generados se presentan de forma monovalente en las partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen III del M13 empaquetado dentro de cada partícula. Los mutantes presentados en los fagos se seleccionan por su actividad biológica (por ejemplo, la afinidad de unión) como se describe en este documento.

Las mutaciones en las secuencias de anticuerpos pueden incluir sustituciones, deleciones, que incluye deleciones internas, adiciones, que incluye adiciones que producen proteínas de fusión, o sustituciones conservadoras de restos de aminoácidos dentro de y/o adyacentes a la secuencia de aminoácidos, pero que resultan en un cambio "silencioso", ya que el cambio produce un anticuerpo anti-CD19 funcionalmente equivalente. Pueden hacerse sustituciones conservadoras de aminoácidos sobre la base de la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los restos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos positivamente cargadas (básico) incluyen arginina, lisina, histidina y, los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Además, la glicina y la prolina son los restos que pueden influir en la orientación de la cadena. Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Además, si se desea, pueden introducirse aminoácidos no clásicos o análogos químicos de aminoácidos como una sustitución o adición en la secuencia del anticuerpo. Los aminoácidos no clásicos incluyen, aunque sin limitación, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido -amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, -Abu, -Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, -alanina , fluoroaminoácidos, aminoácidos de diseño tales como -metil aminoácidos, C-metil aminoácidos, N-metil  aminoácidos, y los análogos de aminoácidos en general.

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Puede madurarse la afinidad de los sitios seleccionados para la modificación mediante la expresión en fagos (véase anteriormente).

Cualquier técnica para mutagénesis conocida en la técnica puede usarse para modificar los nucleótidos individuales en una secuencia de ADN, con el propósito de hacer sustitución de aminoácido (s) en la secuencia del anticuerpo, o para crear/eliminar sitios de restricción para facilitar las manipulaciones posteriores. Tales técnicas incluyen, aunque sin limitación, mutagénesis química, mutagénesis dirigida in vitro (Kunkel, Proc Natl. Acad Sci Estados Unidos,

82:488 (1985); Hutchinson, C. et al., J. Biol. Chem., 253: 6551 (1978)), mutagénesis dirigida a oligonucleótidos (Smith, Ann Rev. Genet, 19:423-463 (1985.); Hill et al., Methods Enzymol, 155:558-568 (1987)), extensión por solapamiento basada en la PCR (Ho et al., Gene, 77:51-59 (1989)), mutagénesis con megacebador basada en la PCR (Sarkar et al., Biotechniques, 8:404-407 (1990)), etc. Las modificaciones pueden confirmarse por secuenciación de dideoxi-ADN bicatenario.

En ciertas realizaciones de la invención los anticuerpos anti-CD19 pueden modificarse para producir proteínas de fusión, es decir, el anticuerpo, o un fragmento del mismo, se fusiona a una proteína heteróloga, polipéptido o péptido. En ciertas realizaciones, la proteína fusionada a la porción de un anticuerpo anti-CD19 es un componente enzimático de la terapia enzimática con pro-fármaco dirigida por anticuerpo (ADEPT). Los ejemplos de otras proteínas o polipéptidos que pueden modificarse por ingeniería como una proteína de fusión con un anticuerpo anti-CD19 incluyen, aunque sin limitación las toxinas tales como la ricina, la abrina, la ribonucleasa, la DNasa I, la enterotoxina-A de estafilococos, la proteína anti-viral de la hierba carmín, la gelonina, la toxina diftérica, la exotoxina de Pseudomonas, y la endotoxina de Pseudomonas. Véase, por ejemplo, Pastan et al., Cell, 47:641 (1986), y Goldenberg et al., Cancer Journal for Clinicians, 44:43 (1994). Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de éstas que pueden usarse incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos sin unión de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, la alfa-sarcina, las proteínas de Aleurites fordii, las proteínas de la diantina, las proteínas de la Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), el inhibidor de la Momordica charantia, la curcina, el crotino, el inhibidor de la Sapaonaria officinalis, la gelonina, la mitogelina, la restrictocina, la fenomicina, la enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado en el 28 de octubre de 1993.

Pueden generarse proteínas de fusión adicionales mediante las técnicas de intercambio de genes, intercambio de motivos, intercambio de exones y/o intercambio de codones (referidos colectivamente como "intercambio de ADN "). El intercambio de ADN puede emplearse para alterar las actividades de SYNAGIS® o fragmentos del mismo (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo con mayor afinidad y menor tasa de disociación). Véase, en general, las patentes de Estados Unidos Nº 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252 y 5.837.458, y Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol, 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2): 76-82; Hansson et al., 1999,

J. Mol. Biol., 287:265-76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques 24 (2): 308 -313. El anticuerpo puede ser una proteína de fusión de dominio de unión de inmunoglobulina como se describe en la publicación de Estados Unidos 20030118592, la publicación de Estados Unidos 200330133939, y la publicación PCT WO 02/056910, todo de Ledbetter et al.

5.1.9. Anticuerpos de dominio

Los anticuerpos anti-CD19 de las composiciones y para su uso en los métodos de la invención pueden ser anticuerpos de dominio, por ejemplo, anticuerpos que contienen las pequeñas unidades funcionales de unión de los anticuerpos, que corresponden a las regiones variables de las cadenas pesada (VH) o ligera (VL) de los anticuerpos humanos. Los ejemplos de anticuerpos de dominio incluyen, aunque sin limitación, los disponibles de Domantis Limited (Cambridge, Reino Unido) y Domantis Inc. (Cambridge, MA, Estados Unidos) que son específicos para dianas terapéuticas (véase, por ejemplo, el documento WO04/058821; documento WO04/003019, las patentes de Estados Unidos Nº 6.291.158, 6.582.915, 6.696.245 y 6.593.081). Las bibliotecas disponibles en el mercado de dominios de anticuerpos pueden usarse para identificar anticuerpos anti-CD19 de dominio. Los anticuerpos anti-CD19 de la invención pueden comprender una unidad funcional de unión al CD19 y una unidad funcional de unión al receptor Fc gamma.

5.1.10. Diacuerpos

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, dichos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Por medio del uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el acoplamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a acoplarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más detalladamente en, por ejemplo, los documentos EP 404.097, WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc Natl. Acad Sci Estados Unidos, 90:6444-6448 (1993).

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En este documento se describen proteínas variantes de Fc que tienen propiedades de unión alteradas para un ligando de Fc (por ejemplo, un receptor de Fc, C1q) relativas a una molécula similar (por ejemplo, una proteína que tiene la misma secuencia de aminoácidos, excepto que tiene un tipo de región Fc silvestre). Los ejemplos de propiedades de unión incluyen aunque sin limitación, la especificidad de unión, la constante de equilibrio de disociación (KD), las tasas de disociación y de asociación (koff y kon respectivamente), la afinidad y/o avidez de la unión. En general se entiende que una molécula de unión (por ejemplo, una proteína variante de Fc tal como un anticuerpo) con una baja KD puede ser preferible a una molécula de unión con una alta KD. Sin embargo, en algunos casos el valor de kon o koff puede ser más relevante que el valor de la KD. Un especialista en la técnica puede determinar qué parámetro cinético es más importante para una aplicación dada del anticuerpo.

Las afinidades y las propiedades de unión de un dominio Fc para su ligando pueden determinarse por una variedad de métodos de ensayo in vitro (ensayos bioquímicos o inmunológicos) conocidos en la técnica para la determinación de las interacciones Fc-FcR, es decir, la unión específica de una región Fc a un FcR que incluye pero no se limita a, los métodos de equilibrio (por ejemplo, el ensayo de inmunoabsorción enzimático (ELISA), o el radioinmunoensayo (RIA)), o cinéticos (por ejemplo, análisis BIACOR®), y otros métodos tales como los ensayos de unión indirectos, los ensayos de inhibición competitiva, la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET), la electroforesis en gel y la cromatografía (por ejemplo, la filtración en gel). Estos y otros métodos pueden usar un marcador en uno o más de los componentes que se examinan y/o emplear una variedad de métodos de detección que incluyen aunque sin limitación los cromogénicos, los marcadores fluorescentes, los luminiscentes, o los marcadores isotópicos. Una descripción detallada de las afinidades y la cinética de unión puede encontrarse en Paul W.E., ed., Fundamental Immunology, 4ª Ed., Lippincott-Raven, Filadelfia (1999), que se centra en las interacciones anticuerpo-inmunógeno.

La proteína variante de Fc puede tener una mayor unión a uno o más ligandos Fc en relación con una molécula comparable. La proteína variante de Fc puede tener una afinidad por un ligando Fc que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces,

o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces mayor que la de una molécula comparable. La proteína variante de Fc puede tener una mayor unión a un receptor de Fc. La proteína variante de Fc puede tener una mayor unión a los receptores de Fc, FcRIIIA. La proteína variante de Fc puede tener una mayor unión a los receptores de Fc, FcRIIB. La proteína variante de Fc puede tener una mayor unión a los receptores de Fc, FcRn. La proteína variante de Fc puede tener una mayor unión a C1q en relación con una molécula comparable.

La vida media en suero de las proteínas que comprenden regiones Fc puede aumentarse mediante el aumento de la afinidad de unión de la región Fc para el FcRn. La proteína variante de Fc puede tener una mayor vida media en el suero en relación con una molécula comparable.

La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo " o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en el que las Ig secretadas unidas a los receptores Fc (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, asesinas naturales (células NK), neutrófilos y macrófagos) permite a estas células efectoras citotóxicas unirse específicamente a una célula diana portadora de antígeno y posteriormente matar la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos IgG específicos de alta afinidad dirigidos a la superficie de las células diana "arman" a las células citotóxicas y son absolutamente necesarios para tal muerte. La lisis de la célula diana es extracelular, requiere contacto directo célula-célula, y no implica al complemento. Se contempla que, además de los anticuerpos, otras proteínas que comprenden regiones Fc, específicamente las proteínas de fusión de Fc, que tienen la capacidad de unirse específicamente a una célula diana que porta el antígeno será capaz de efectuar la citotoxicidad mediada por células. Por simplicidad, la citotoxicidad mediada por células resultante de la actividad de una proteína de fusión Fc también se menciona en este documento como actividad ADCC.

La capacidad de cualquier proteína variante de Fc particular para mediar la lisis de la célula diana por ADCC puede probarse. Para ensayar la actividad ADCC una proteína variante de Fc de interés se añade a las células diana en combinación con células efectoras inmunes, que pueden activarse por los complejos antígeno-anticuerpo lo que resulta en la citólisis de la célula diana. La citólisis generalmente se detecta por la liberación de uno de los marcadores (por ejemplo, los sustratos radiactivos, los colorantes fluorescentes o las proteínas naturales intracelulares) de las células muertas. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células citolíticas naturales (NK). Los ejemplos específicos de los ensayos ADCC in vitro se describen en Wisecarver et al., 1985 79:277-282; Bruggemann et al., 1987, J. Exp. Med. 166:1351-1361; Wilkinson et al., 2001, J. Immunol. Mthods 25:183-191; Patel et al., 1995 J Immunol. Methods 184:29-38. La actividad ADCC de la proteína variante de Fc de interés también puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al., 1998, Proc Natl. Acad Sci Estados Unidos 95:652-656.

Una proteína variante de Fc puede tener una mejor actividad ADCC en relación con una molécula comparable. Una proteína variante de Fc puede tener actividad ADCC que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces o al menos 10 veces o al menos 50 veces o al menos 100 veces mayor que la de una molécula similar. Una proteína variante de Fc puede tener una mejor unión al receptor de Fc, FcRIIIA y tener una mejor actividad ADCC

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al metotrexato (Wigler et al., Proct. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 77:357 (1980); O'Hare et al., Proct. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 78:1527 (1981)); el gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proct. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 78:2072-(1-981)); el neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Wu y Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev, Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993), y Morgan y Anderson, Ann Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIB TECH 11 (5):155-2 15 (1993)); y el hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene, 30:147 (1984)). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología del ADN recombinante pueden aplicarse de rutina para seleccionar el clon recombinante deseado, y tales métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al., (Eds, ), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laborator y Manual, Stockton Press, Nueva York (1990), y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al., (Eds, ), Current Protocols en Human Genetics, John Wiley & Sons, Nueva York (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1.

Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden aumentarse mediante la amplificación del vector (para una revisión, véase, Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol, 3, Academic Press, Nueva York (1987)). Cuando un marcador en el sistema del vector de expresión del anticuerpo es amplificable, un aumento en el nivel del inhibidor presente en cultivo de la célula hospedadora aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse et al., Mol. Cell Biol., 3:257 (1983)). Los niveles de expresión de anticuerpos pueden ser amplificados a través del uso de métodos recombinantes y herramientas conocidas por los especialistas en la técnica de producción de proteínas recombinantes, incluidas las tecnologías que remodelan la cromatina circundante y potencian la expresión del transgén en la forma de un dominio activo transcripcional artificial.

La célula hospedadora puede cotransfectarse con dos vectores de expresión, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de una cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos o diferentes. Un solo vector que codifica, y es capaz de expresar, ambos polipéptidos de cadena pesada y ligera puede también usarse. En tales situaciones, la cadena ligera se debe colocar 5' de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature 322:562-65 (1986); y Kohler, 1980, Proct. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 77:2197 (1980)). Las secuencias codificantes para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.

Una vez que una molécula de anticuerpo se produce por expresión recombinante, puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, en particular por afinidad por los antígenos específicos en Proteína A o Proteína G, y la cromatografía por talla), la centrifugación, la solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos de la presente invención o sus fragmentos pueden fusionarse con secuencias de polipéptidos heterólogos descritos en este documento o de otro tipo conocido en la técnica para facilitar la purificación.

5.2.2. Purificación y aislamiento de los anticuerpos

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o directamente secretarse en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como un primer paso, los restos de partículas, ya sean células hospedadoras o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan en el espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta de células se descongela en presencia de acetato sódico (pH 3,5), EDTA, y fluorurofenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares pueden eliminarse por centrifugación. Cuando el anticuerpo mutante se secreta en el medio, los sobrenadantes procedentes de tales sistemas de expresión generalmente primero se concentran por medio del uso de un filtro para la concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasa, tal como el PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición de anticuerpos que se prepara a partir de las células puede purificarse por medio del uso, por ejemplo, de la cromatografía en hidroxilapatita, la cromatografía de interacción hidrofóbica, la cromatografía de intercambio iónico, la electroforesis en gel, la diálisis y/o la cromatografía de afinidad ya sea sola o en combinación con otras etapas de purificación. La idoneidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpos mutante. La proteína A puede usarse para purificar los anticuerpos basados en las cadenas pesadas humanos y1, y2, o y4 (Lindmark et al.,

J. Immunol, Methods, 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para y3 humana (Guss et al., EMBO J., 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual está unido el ligando de afinidad es frecuentemente agarosa, pero otras matrices están disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como el vidrio de poro controlado o poli (estirenodivinil) benceno permiten velocidades de flujo más rápido y tiempos más cortos de procesamiento que los que pueden lograrse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio

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5.3.1. Selección de anticuerpos por unión a CD19 humano

Pueden usarse ensayos de unión para identificar los anticuerpos que se unen al antígeno CD19 humano. Los ensayos de unión pueden realizarse ya sea como ensayos de unión directa o como ensayos de competencia por la unión, La unión puede detectarse mediante ELISA convencional o ensayos convencionales de citometría de flujo. En un ensayo de unión directa, un anticuerpo candidato se prueba por su unión al antígeno CD19 humano. En ciertas realizaciones, los ensayos de selección comprenden, en un segundo paso, la determinación de la capacidad de causar la muerte celular o la apoptosis de las células B que expresan el CD19 humano. Los ensayos de competencia de unión, por otro lado, evalúan la capacidad de un anticuerpo candidato para competir con un anticuerpo anti-CD19 conocido u otro compuesto que se une a CD19 humano.

En un ensayo de unión directa, el antígeno CD19 humano se pone en contacto con un anticuerpo candidato bajo condiciones que permiten la unión del anticuerpo candidato al antígeno CD19 humano. La unión puede tener lugar en solución o en una superficie sólida. El anticuerpo candidato puede marcarse previamente para la detección. Cualquier compuesto detectable puede usarse para el marcaje, tal como, aunque sin limitación, un isótopo luminiscente, fluorescente o radiactivo o un grupo que contiene los mismos, o un marcador no isotópico, tal como una enzima o colorante. Después de un período de incubación suficiente para que tenga lugar la unión, la reacción se expone a condiciones y manipulaciones que eliminan el anticuerpo en exceso o unido inespecíficamente. Típicamente, se trata de un lavado con un tampón apropiado. Por último, se detecta la presencia de un complejo CD19-anticuerpo.

En un ensayo de unión competitiva, se evalúa un anticuerpo candidato por su capacidad para inhibir o desplazar la unión de un anticuerpo anti-CD19 conocido (u otro compuesto) al antígeno CD19 humano. Un enlazador de CD19 conocido marcado puede mezclarse con el anticuerpo candidato, y se coloca bajo condiciones en las que la interacción entre ellos normalmente se produce, con y sin la adición del anticuerpo candidato. La cantidad de enlazador de CD19 conocido marcado que se une al CD19 humano puede compararse con la cantidad unida en presencia o ausencia del anticuerpo candidato.

Para facilitar la formación de complejo anticuerpo-antígeno y su detección, el ensayo de unión puede realizarse con uno o más componentes inmovilizados sobre una superficie sólida para facilitar la formación y detección del complejo anticuerpo antígeno. El soporte sólido puede ser, aunque sin limitación, fluoruro de polivinilideno, policarbonato, poliestireno, polipropileno, polietileno, vidrio, nitrocelulosa, dextrano, nailon, poliacrilamida y agarosa. La configuración de soporte puede incluir perlas, membranas, micropartículas, la superficie interior de un recipiente de reacción, tal como una placa de microtitulación, tubo de ensayo u otros recipientes de reacción. La inmovilización del CD19 humano, u otro componente, puede lograrse mediante uniones covalentes o no covalentes. En una realización, la unión puede ser indirecta, es decir, a través de un anticuerpo unido. En otra realización, el antígeno CD19 humano y los controles negativos se marcan con un epítopo, tal como la glutatión S-transferasa (GST) de manera que la fijación a la superficie sólida puede mediarse por un anticuerpo disponible en el mercado, tal como el anti-GST (Santa Cruz Biotechnology).

Por ejemplo, puede realizarse dicho ensayo de afinidad de unión usando el antígeno CD19 humano que está inmovilizado en un soporte sólido. Típicamente, el componente inmovilizado de la reacción de unión, en este caso el anticuerpo anti-CD19 candidato, se marca para permitir la detección. Una variedad de métodos de marcaje están disponibles y pueden usarse, tales como el luminiscente, el cromóforo, el fluorescente, o el isótopo radiactivo o un grupo que contiene los mismos, y marcadores no isotópicos, tales como enzimas o colorantes. El anticuerpo anti-CD19 candidato puede marcarse con un fluoróforo tal como isotiocianato de fluoresceína (FITC, disponible de Sigma Chemicals, St, Louis).

Finalmente, el marcaje que queda sobre la superficie sólida puede detectarse por cualquier método de detección conocido en la técnica. Por ejemplo, si el anticuerpo anti-CD19 candidato está marcado con un fluoróforo, puede usarse un fluorímetro para detectar los complejos.

El antígeno CD19 humano puede añadirse a los ensayos de unión en forma de células intactas que expresan el antígeno CD19 humano, o membranas aisladas que contienen el antígeno CD19 humano. Así, la unión directa al antígeno CD19 humano puede probarse en células intactas en cultivo o en modelos animales, en presencia y ausencia del anticuerpo anti-CD19 candidato. Un anticuerpo anti-CD19 candidato marcado puede mezclarse con células que expresan el antígeno CD19 humano, o con extractos crudos obtenidos a partir de tales células, y el anticuerpo anti-CD19 candidato puede añadirse. Las membranas aisladas pueden usarse para identificar anticuerpos anti-CD19 candidatos que interactúan con el CD19 humano. Por ejemplo, en un experimento típico que usa membranas aisladas, las células pueden modificarse genéticamente para expresar el antígeno CD19 humano. Las membranas pueden cosecharse mediante técnicas convencionales y usarse en un ensayo de unión in vitro. El anticuerpo anti-CD19 candidato marcado (por ejemplo, anticuerpo marcado fluorescente) está unido a las membranas y se ensaya para la actividad específica; la unión específica se determina por comparación con los ensayos de unión que se realizan en presencia de un exceso de anticuerpo anti-CD19 candidato no marcado (frío). El antígeno CD19 humano soluble también puede expresarse recombinantemente y usarse en ensayos no basados en células para identificar anticuerpos que se unen al antígeno CD19 humano. Los polipéptidos de CD19 humanos

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recombinantemente expresados pueden usarse en los ensayos de selección no basados en células. Los péptidos correspondientes a una o más de las porciones de unión del antígeno CD19 humano, o proteínas de fusión que contienen una o más de las porciones de unión del antígeno CD19 humano también pueden usarse en sistemas de selección no basados en células para identificar anticuerpos que se unen a las porciones del antígeno CD19 humano. En ensayos no basados en células el CD19 humano recombinante expresado está unido a un sustrato sólido tal como un tubo de ensayo, pozo de microtitulación o una columna, por medios bien conocidos para los especialistas en la técnica (véase, Ausubel et al., Supra). Los anticuerpos de prueba se ensayaron para determinar su capacidad para unirse al antígeno CD19 humano.

Como alternativa, la reacción de unión puede realizarse en solución. En este ensayo, al componente marcado se le permite interactuar con su pareja de unión (s) en solución. Si las diferencias de tamaño entre el componente marcado y su pareja de unión (s) permiten tal separación, la separación puede lograrse al pasar los productos de la reacción de unión a través de un ultrafiltro cuyos poros permiten el paso del componente marcado no unido pero no el de su pareja de unión (s) o del componente marcado unido a su pareja (s). La separación también puede lograrse por medio del uso de cualquier reactivo capaz de capturar una pareja de unión del componente marcado de la solución, tal como un anticuerpo contra la pareja de unión y así sucesivamente.

Por ejemplo, una biblioteca de fagos puede seleccionarse al pasar fago a partir de una biblioteca de fagos continua a través de una columna que contiene el antígeno CD19 humano purificado, o un derivado, análogo, fragmento o dominio del mismo, ligado a una fase sólida, tal como perlas de plástico. Al alterar la astringencia de la solución de lavado, es posible enriquecerla en fagos que expresan péptidos con afinidad elevada por el antígeno CD19 humano. El fago aislado de la columna puede clonarse y medir la afinidad directamente. Al saber qué anticuerpos y sus secuencias de aminoácidos confieren la unión más fuerte al antígeno CD19 humano, los modelos de ordenadores pueden usarse para identificar los contactos moleculares entre el antígeno CD19 y el anticuerpo candidato.

El soporte sólido es una membrana que contiene el antígeno CD19 humano unido a una placa de microtitulación. Los anticuerpos candidatos, por ejemplo, pueden unirse a células que expresan bibliotecas de anticuerpos que se cultivan bajo condiciones que permiten la expresión de los miembros de la biblioteca en la placa de microtitulación. Se cosechan los miembros de las bibliotecas que se unen al CD19 humano. Tales métodos, se describen generalmente a modo de ejemplo en Parmley y Smith, 1988, Gene, 73:305-318; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques, 13:422-427; publicación PCT Nº WO94/18318, y en las referencias citadas anteriormente. Los anticuerpos identificados con unión al antígeno humano CD19 pueden ser de cualquiera de los tipos o modificaciones de los anticuerpos descritos anteriormente.

5.3.2. Selección de anticuerpos por función efectora de ADCC humana

Se prefieren anticuerpos de la clase IgG humana para su uso en la invención porque tienen características funcionales tales como una larga vida media en el suero y la capacidad de mediar diversas funciones efectoras se usan en ciertas realizaciones de la invención (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Capítulo 1 (1995). Los anticuerpos humanos de clase IgG se clasifican en las siguientes 4 subclases: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Un gran número de estudios se llevan a cabo para la ADCC y la CDC como funciones efectoras de los anticuerpos de clase IgG, y se informó que entre los anticuerpos de la clase IgG humana, la subclase IgG1 tiene la mayor actividad ADCC y CDC en seres humanos (Chemical Immunology. 65, 88 (1997)).

La expresión de la actividad ADCC y la actividad CDC por los anticuerpos de la subclase IgG1 humana en general involucra la unión de la región Fc del anticuerpo a un receptor para un anticuerpo (en lo sucesivo como "FcR") existente en la superficie de las células efectoras tales como las células asesinas, las células citolíticas naturales o los macrófagos activados. Pueden enlazarse varios componentes del complemento. En cuanto a la unión, se sugiere que varios restos de aminoácidos en la región de bisagra y el segundo dominio de la región C (en lo sucesivo como "dominio C2 ") del anticuerpo son importantes (Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Inmunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) y que una cadena de azúcar en el dominio C2 (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) también es importante.

Los anticuerpos anti-CD19 de la invención pueden modificarse con respecto a la función efectora, por ejemplo, con el fin de mejorar la ADCC y/o la citotoxicidad del anticuerpo dependiente del complemento (CDC). Esto puede lograrse mediante la introducción de una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo. También puede introducirse un resto de cisteína (s) en la región Fc, lo que permite la formación de un enlace disulfuro intercatenario en esta región. De esta manera puede generarse un anticuerpo homodimérico que puede tener una mayor capacidad de internalización y una muerte celular mediada por el complemento y ADCC incrementadas (Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)). También pueden usarse enlazadores heterobifuncionales para generar anticuerpos homodiméricos con mayor actividad anti-tumoral (Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)). Los anticuerpos también pueden diseñarse para tener dos o más regiones Fc lo que resulta una capacidad mejorada para la lisis por complemento y la ADCC (Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, (3) 219-230 (1989)).

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Se conocen en la técnica otros métodos de ingeniería de regiones Fc de anticuerpos con el fin de alterar las funciones efectoras (por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos Nº 20040185045 y la publicación PCT Nº WO 2004/016750, ambas de Koenig et al., las cuales describen la alteración de la región Fc para mejorar la afinidad de unión de Fc al FcRIIB en comparación con la afinidad de unión para el FCRIIA; ver también la publicación PCT Nº WO 99/58572 de Armour et al., WO 99/51642 de Idusogie et al., y US 6, 395, 272 de Deo et al. También se conocen en la técnica métodos para modificar la región Fc para disminuir la afinidad de unión al FcRIIB (por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos Nº 20010036459 y la publicación PCT Nº WO 01/79299, ambas de Ravetch et al.). También se describieron anticuerpos modificados que tienen regiones Fc variantes con una mayor afinidad de unión por FcRIIIA y/o FcRIIA en comparación con una región Fc de tipo silvestre (por ejemplo, la publicación PCT Nº WO2004/063351, de Stavenhagen et al.).

Se han encontrado al menos cuatro tipos diferentes de FcR que se denominan respectivamente, FcRI (CD64), FcRII (CD32), FcRIII (CD16), y FcRIV. En humanos, los FcRII y FcRIII se clasifican en FcRIIA y FcRIIB, y FcRIIIa y FcRIIIb, respectivamente. El FcR es una proteína de membrana que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, FcRII, FcRIII, y FcRIV tienen una cadena a que tiene una región extracelular que contiene dos dominios del tipo inmunoglobulina, el FcRI tiene una cadena a con una región extracelular que contiene tres dominios de tipo inmunoglobulina, como un componente constitutivo, y la cadena a está implicada en la actividad de unión de la IgG. Además, FcRI y FcRIII tienen una cadena y o C como un componente constitutivo la cual tiene una función de transducción de señales en asociación con la cadena a (Annu. Rev. Immunol., 18, 709 (2000), Annu. Rev. Immunol., 19, 275 (2001)). El FcRIV se describió por Bruhns et al., Clin. Inves., Med., (Canadá) 27:3 D (2004).

Para evaluar la actividad ADCC de un anticuerpo anti-CD19 de interés, puede usarse un ensayo in vitro de la ADCC, tal como el que se describe en las patentes de Estados Unidos Nº 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células citolíticas naturales (NK). Por ejemplo, puede ensayarse la capacidad de cualquier anticuerpo particular para mediar la lisis de la célula diana por la activación del complemento y/o la ADCC. Las células de interés se cultivan y marcan in vitro; el anticuerpo se añade al cultivo celular en combinación con las células inmunes que pueden activarse por los complejos antígeno-anticuerpo; es decir, las células efectoras implicadas en la respuesta ADCC. El anticuerpo también puede ensayarse para la activación del complemento. En cualquier caso, la citólisis de las células diana se detecta por la liberación del marcador desde las células lisadas. De hecho, los anticuerpos pueden seleccionarse por medio del uso de suero del propio paciente como una fuente de complemento y/o células del sistema inmune. Los anticuerpos que son capaces de mediar la ADCC humana en el ensayo in vitro pueden usarse después terapéuticamente en ese paciente en particular. Alternativa o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés también puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al., Proc. Natl. Acad Sci. Estados Unidos 95:652-656 (1998). Además, las técnicas para modular (es decir, aumentar o disminuir) el nivel de la ADCC, y opcionalmente de la actividad CDC, y opcionalmente la actividad apoptótica de un anticuerpo son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 6.194.551 (véase, por ejemplo, Chaouchi et al., J. Immunol., 154(7): 3096-104 (1995); Pedersen et al., Blood, 99(4): 1314-1318 (2002); Alberts et al., Molecular Biology of the Cell; Steensma et al., Methods Mol Med., 85: 323-32, (2003)). Los anticuerpos de la presente invención pueden ser capaces o pueden modificarse para tener la capacidad de inducir la ADCC y/o la CDC y/o una respuesta apoptótica. Preferiblemente, dichos ensayos para determinar la función ADCC se practican usando células efectoras humanas para evaluar la función ADCC humana.

5.3.3. Inmunoconjugados y proteínas de fusión

De acuerdo con ciertos aspectos de la invención, los agentes terapéuticos o toxinas pueden conjugarse a anticuerpos anti-CD19 quimerizados o humanizados para su uso en las composiciones y para su uso en los métodos de la invención. En ciertas realizaciones, estos conjugados pueden generarse como proteínas de fusión (véase la Sección 5.1.8). Los ejemplos de agentes terapéuticos y toxinas incluyen, aunque sin limitación, los miembros de la familia de las moléculas enediina, tales como caliceamicina y esperamicina. Las toxinas químicas también pueden tomarse del grupo que consiste en duocarmicina (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.703.080, la patente de Estados Unidos Nº 4.923.990), metotrexato, doxorrubicina, melfalán, clorambucilo, ARA-C, vindesina, mitomicina C, cisplatino, etopósido, bleomicina y 5-fluorouracilo. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos también incluyen adriamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina (Ara-C), ciclofosfamida, tiotepa, taxotere (docetaxel), busulfán, citoxina, Taxol, metotrexato, cisplatino, melfalán, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (véase, la patente de Estados Unidos Nº 4.675.187), melfalán y otras mostazas relacionadas con nitrógeno.

Por ejemplo, puede usarse "CVB" (1,5 g/m2 de ciclofosfamida, 200-400 mg/m2 de etopósido, y 150-200 mg/m2 de carmustina) en las terapias de combinación de la invención. CVB es un régimen usado para tratar linfoma no Hodgkin (Patti et al., Eur. J. Haematol., 51:18 (1993)). Otros regímenes quimioterapéuticos de combinación adecuados son bien conocidos para los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Freedman et al., "NonHodgkin's Lymphontas," en Cancer Medicine, Volumen 2, 3ª Edición, Holland et al. (eds.), pág. 2028-2068 (Lea & Febiger 1993). Como ilustración, regímenes quimioterapéuticos de primera generación para el tratamiento de

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linfoma no Hodgkin de grado intermedio incluyen C-MOPP (ciclofosfamida, vincristina, procarbazina y prednisona) y CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, y prednisona). Un régimen quimioterapéutico de segunda generación útil es m-BACOD (metotrexato, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona, y leucovorina), mientras que un régimen de tercera generación adecuado es MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina y leucovorina). Fármacos útiles adicionales incluyen butirato de fenilo y brostatina-1.

Otras toxinas que pueden usarse en inmunoconjugados de la invención incluyen lectinas venenosas, toxinas de plantas tales como la ricina, la abrina, la modecina, la botulínica, y las toxinas diftéricas. Por supuesto, combinaciones de las diversas toxinas también pueden acoplarse a una molécula de anticuerpo, y se logra de esta forma una citotoxicidad variable. Los ejemplos ilustrativos de las toxinas que se emplean adecuadamente en terapias de combinación de la invención son la ricina, la abrina, la ribonucleasa, la ADNasa I, las enterotoxinas estafilocócicas-A, la hierba carmín, la anti-proteína viral, la gelonina, la toxina difterina, la exotoxina de Pseudomonas, y la endotoxina de Pseudomonas, véase, por ejemplo, Pastan et al., Cell, 47:641 (1986) y Goldenberg et al., Cancer Journal for Clinicians, 44:43 (1994). Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de éstas que pueden usarse incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activo de no-unión de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, la alfa-sarcin, las proteínas de Aleurites fordii, las proteínas de diantina, las proteínas de Phytolaca american (PAPI, PAPII, y PAPS), el inhibidor de la Momordica charantia, la curcina, el crotino, el inhibidor de la Sapaonaria officinalis, la gelonina, la mitogelina, la restrictocina, la fenomicina, la enomicina y los tricotecenos, véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993.

Las toxinas y los agentes quimioterapéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19na Ed. (Mack Publishing Co. 1995), y en Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 7ma Ed. (MacMillan Publishing Co.1985). Los especialistas en la técnica conocen otras toxinas adecuadas y/o agentes quimioterapéuticos.

El anticuerpo anti-CD19 de la presente invención también puede usarse en ADEPT por la conjugación del anticuerpo a una enzima activadora de profármaco, la cual convierte el profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidilo, véase, WO81/01145) en un fármaco anti-cáncer activo. Véase, por ejemplo, WO 88/07378 y la patente de Estados Unidos Nº 4.975.278. El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de forma que la convierte a su forma citotóxica más activa.

Las enzimas que son útiles en los métodos descritos en este documento incluyen, aunque sin limitación, la fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres, la arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir la 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cáncer 5-fluorouracilo; las proteasas, tales como la proteasa serratia, la termolisina, la subtilisina, las carboxipeptidasas y las catepsinas (tales como la catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptido en fármacos libres; las Dalanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácidos; las enzimas que escinden carbohidratos tales como la -galactosidasa y la neuraminidasa útiles para convertir profármacos glucosilados en fármacos libres; la -lactamasa útil para la conversión de fármacos derivatizados con -lactamas en fármacos libres, y la penicilina amidasas, tales como la penicilina V amidasa o la penicilina G amida, útiles para convertir fármacos derivatizados a sus nitrógenos amínicos con fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas", pueden usarse también para convertir los profármacos en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpoabzima pueden prepararse como se describe en este documento para la entrega de la abzima como se desee a las partes de un ser humano afectadas por una neoplasia de células B.

Las enzimas descritas en este documento pueden unirse covalentemente al anticuerpo por técnicas bien conocidas en la técnica tales como el uso de los reactivos heterobifuncionales entrelazantes discutidos anteriormente. Como alternativa, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión al antígeno del anticuerpo anti-CD19 ligada a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima pueden construirse por medio del uso de las técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984)).

Las modificaciones covalentes de un anticuerpo anti-CD19 se incluyen dentro del alcance de esta descripción. Pueden hacerse por síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo, si es aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes de un anticuerpo anti-CD19 se introducen en la molécula al hacer reaccionar los restos de aminoácidos diana con un agente orgánico de derivatización que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los restos N-o C-terminales.

Los restos cisteinilo reaccionan comúnmente con a-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para rendir derivados carboximetilo o carboxiamidometilo. De manera similar, también pueden usarse reactivos de yodo. Los restos cisteinilo también se derivatizan por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-p-(5-imidozoil) propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas,

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disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, 2-metil piridil disulfuro, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7nitrobenzoico-2-oxa-1,3-diazol.

Los restos histidilo se derivatizan por reacción con el dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 ya que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo es útil también; la reacción puede realizarse en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los restos de lisilo y los amino-terminales reaccionan con anhídridos de ácido succínico o carboxílico. La derivatización de estos agentes tiene el efecto de revertir la carga de los restos lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar los restos que contienen -amino y/o restos que contienen -amino incluyen imidoésteres tales como el picolinimidato de metilo, el fosfato de piridoxal, el piridoxal, el cloroborohidruro, el ácido trinitrobencenosulfónico, la 0-metilisourea, la 2, 4 pentanodiona, y la reacción con glioxilato catalizada por la transaminasa.

Los restos arginilo se modifican por la reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2, 3butanodiona, 1, 2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivatización de los restos arginilo requiere generalmente que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido a la alta pKa del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos -amino de la lisina así como el grupo épsilon-amino de la arginina.

La modificación específica de los restos tirosilo puede hacerse, con interés particular en la introducción de marcadores espectrales en los restos de tirosilo por reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Más comúnmente, N-acetilimidizol y tetranitrometano se usan para formar las especies O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los restos tirosilo se yodan por medio del uso de 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para su uso en radioinmunoensayos.

Los grupos carboxilo laterales (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente mediante la reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R'), donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2 morfolinil-4etil)carbodiimida o 1etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los restos aspartilo y glutamilo se convierten a restos asparaginilo y glutaminilo por una reacción con iones amonio.

Los restos glutaminilo y asparaginilo están frecuentemente desamidados a los correspondientes restos aspartilo y glutamilo, respectivamente. Estos restos se desamidan en condiciones neutras o básicas. La forma desamidada de estos restos cae dentro del alcance de esta invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los restos serilo o treonilo, la metilación de los grupos -amino de la lisina, la arginina, y las cadenas laterales de histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pág. 79-86 (1983)), la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente implica acoplar químicamente o enzimáticamente glicósidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos ya que no requieren la producción del anticuerpo en una célula hospedadora con capacidades para N-u O-glucosilaciones. En dependencia del modo de acoplamiento que se usa, el azúcar (s) puede unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres de cisteína tales como los de la cisteina (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) restos aromáticos tales como los de la fenilalanina, tirosina, triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit, Rev. Biochem., pág. 259-306 (1981).

5.4. Formulaciones farmacéuticas, administración y dosificación

Las formulaciones farmacéuticas de la invención contienen como ingrediente activo anticuerpos anti-CD19 humanizados o quiméricos. Las formulaciones contienen el anticuerpo desnudo, inmunoconjugado, o proteína de fusión en una cantidad eficaz para producir la respuesta deseada en una unidad de peso o volumen adecuada para la administración a un paciente humano, y de preferencia son estériles. La respuesta se puede, por ejemplo, medir por la determinación de los efectos fisiológicos de la composición de anticuerpo anti-CD19, tales como, aunque sin limitación, reducción de células B circulantes, reducción de células B de tejido, regresión de un neoplasia de células B, o disminución de síntomas de la enfermedad. Un especialista en la técnica conocerá otros ensayos y los podrá emplear para medir el nivel de la respuesta.

5.4.1. Formulaciones farmacéuticas

Una composición de anticuerpo anti-CD19 puede formularse con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "farmacéuticamente aceptable" significa uno o más técnicales no tóxicos que no interfieren con la eficacia de la actividad biológica de los ingredientes activos. Las preparaciones de este tipo pueden contener de forma rutinaria, sales, agentes tamponantes, conservantes, vehículos compatibles, y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Las preparaciones farmacéuticamente aceptables de este tipo pueden contener también de forma rutinaria rellenos sólidos o líquidos compatibles, diluyentes o sustancias de encapsulación que son adecuadas para la administración

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La circulación sérica in vivo de los anticuerpos anti-CD19 puede prolongarse también por la unión de moléculas de polímeros inertes tales como polietilenglicol de alto peso molecular (PEG) a los anticuerpos con o sin un enlazador multifuncional ya sea a través de la conjugación sitio-específico del PEG al N-o C-terminal de los anticuerpos o a través de los grupos épsilon-amino presentes en los restos de lisilo. La derivación lineal o ramificada del polímero que resulte en pérdida mínima de la actividad biológica se usará. El grado de conjugación puede ser estrechamente controlado por SDS-PAGE y espectrometría de masas para asegurar la conjugación apropiada de moléculas de PEG a los anticuerpos. El PEG no reactivo se puede separar de los conjugados anticuerpos-PEG por cromatografía de exclusión molecular o por intercambio iónico. Los anticuerpos derivados de PEG se pueden probar para la actividad de unión, así como para la eficacia in vivo por medio del uso de los métodos conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, por los inmunoensayos que se describen en este documento.

Además, los anticuerpos de las composiciones y para su uso en los métodos de la invención se pueden conjugar con albúmina para preparar el anticuerpo más estable in vivo o que tenga una vida media más larga in vivo. Las técnicas se conocen bien en la técnica, véase, por ejemplo, las publicaciones internacionales Nº WO 93/15199, WO 93/15200, y WO 01/77137; y la patente europea Nº EP 413.622.

5.4.3. Administración y dosificación

La administración de las composiciones de la invención a un paciente humano puede ser por cualquier vía, que incluyen, aunque sin limitación, la administración intravenosa, intradérmica, transdérmica, subcutánea, intramuscular, inhalación (por ejemplo, a través de un aerosol), bucal (por ejemplo, sublingual), tópica (es decir, tanto las superficies de la piel y mucosas, incluyendo superficies de las vías respiratorias), intratecal, interarticular, intraplural, intracerebral, infra-arterial, intraperitoneal, oral, intralinfática, intranasal, rectal o vaginal, por perfusión a través de un catéter regional, o mediante inyección intralesional dirigida. Las composiciones de la invención pueden administrarse por presión intravenosa o infusión intravenosa administradas por el período definido (por ejemplo, 0,5 a 2 horas). Las composiciones de la invención se pueden entregar mediante medios peristálticos o en forma de un depósito, a pesar de que la vía más adecuada en cualquier caso dado dependerá, como es bien conocido en la técnica, de factores tales como la especie, edad, sexo y condición general del sujeto, la naturaleza y gravedad de la afección que se trata y/o de la naturaleza de la composición en particular (es decir, dosis, formulación) que está siendo administrada. La vía de administración puede ser a través de infusión en bolo o continua durante un período de tiempo, una vez o dos veces por semana. La vía de administración puede ser por inyección vía subcutánea, opcionalmente una o dos veces semanal. Las composiciones y/o métodos de la invención pueden administrarse en un régimen ambulatorio.

En ciertas realizaciones, la dosis de una composición que comprende el anticuerpo anti-CD19 se mide en unidades de mg/kg de peso corporal del paciente. La dosis de una composición que comprende el anticuerpo anti-CD19 puede medirse en unidades de mg/kg de peso corporal magro del paciente (es decir, peso corporal menos el contenido de grasa corporal). La dosis de una composición que comprende el anticuerpo anti-CD19 puede medirse en unidades de mg/m2 de área de superficie corporal del paciente. La dosis de una composición que comprende el anticuerpo anti-CD19 se mide en unidades de mg por dosis administrada a un paciente. Cualquier medición de dosis puede usarse junto con las composiciones y métodos de la invención y las unidades de dosificación pueden convertirse por medios convencionales en la técnica.

Los especialistas en la técnica apreciarán que las dosificaciones se pueden seleccionar en base a varios factores que incluyen la edad, el sexo, la especie y la afección del sujeto (por ejemplo, el estadío de neoplasia de células B), el grado deseado de reducción celular, la enfermedad que se trata y/o el anticuerpo en particular o fragmento de unión al antígeno que se usa y se puede determinar por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, las cantidades efectivas de las composiciones de la invención pueden extrapolarse de curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba in vitro o de sistemas de prueba en modelo animal (por ejemplo, la rata algodonera o mono). Los modelos y métodos para la evaluación de los efectos de los anticuerpos se conocen en la técnica (Wooldridge et al., Blood, 89 (8) : 2994-2998 (1997)). Para neoplasias de células B, los regímenes terapéuticos convencionales en la técnica para la terapia con anticuerpo se pueden usar con composiciones y anticuerpos para su uso en los métodos de la invención.

Los ejemplos de regímenes de dosificación que se pueden usar incluyen, aunque sin limitación, diariamente, tres veces por semana (intermitente), semanalmente, o cada 14 días. En determinadas realizaciones, la dosificación de regímenes incluye, aunque sin limitación, dosificación mensual o dosificación cada 6-8 semanas.

Los especialistas en la técnica apreciarán que las dosificaciones son generalmente superiores y/o mayor la frecuencia de administración para el tratamiento inicial en comparación con los regímenes de mantenimiento.

Los anticuerpos anti-CD19 descritos en este documento se unen a las células B y pueden producir deplación más eficaz (es decir, en dosis baja) de células B (como se describe en este documento). Los grados superiores de unión pueden alcanzarse cuando la densidad del CD19 humano sobre la superficie de las células B de un paciente sea alta. Las dosis del anticuerpo (opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable como parte de una composición farmacéutica) pueden ser al menos aproximadamente 0,0005, 0,001, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25, 0,375, 0,5,

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5.5. Diagnóstico del paciente, estadificación y regímenes terapéuticos

El régimen de tratamiento y dosis usados con las composiciones y anticuerpos para su uso en los métodos de la invención pueden elegirse en base a varios factores incluyendo, aunque sin limitación, el estadío de la enfermedad o trastorno de células B que se trata. Los regímenes de tratamiento apropiados se pueden determinar por los especialistas en la técnica para los estadíos particulares de una enfermedad o trastorno de células B en un paciente

o población de pacientes. Las curvas de dosis-respuesta se pueden generar por medio del uso de los protocolos convencionales en la técnica para determinar la cantidad eficaz de las composiciones de la invención para el tratamiento de los pacientes que tienen diferentes estadíos de una enfermedad o trastorno de células B. En general, los pacientes con estadíos más avanzadas de una enfermedad o trastorno de células B necesitarán dosis más altas y/o dosis más frecuentes que pueden administrarse durante periodos de tiempo más largos en comparación con los pacientes que tienen un estadío inicial de la enfermedad o trastorno de células B.

Los anticuerpos anti-CD19 de las composiciones y para su uso en los métodos de la invención pueden usarse para tratar las enfermedades de células B, incluyendo los neoplasias de células B. El término "neoplasia de células B" incluye cualquier tumor maligno que se deriva de una célula del linaje de células B. Los neoplasias de células B ejemplares incluyen, aunque sin limitación: linfoma no Hodgkin (NHL) de células del subtipo de células B incluyendo NHL de bajo grado/folicular, NHL linfocítico pequeño (SL), NHL folicular de grado intermedio, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de célula pequeña no hendida de alto grado; linfoma de células del manto, y NHL de enfermedad voluminosa; linfoma de Burkitt; mieloma múltiple; leucemia linfoblástica aguda de células pre-B y otros tumores malignos que se derivan de precursores tempranos de células B; leucemia linfocítica aguda común (ALL); leucemia linfocítica crónica (CLL) incluyendo CLL de inmunoglobulina mutada y CLL de inmunoglobulina sin mutación; leucemias de células pilosas; leucemia linfoblástica aguda nula; macroglobulinemia de Waldenstrom; linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), incluyendo DLBCL de células similares a B centro germinales (GCB), DLBCL de células similares a B activadas (ABC), y DLBCL tipo 3; leucemia pro-linfocítica; enfermedad de cadena ligera; plasmocitoma; mieloma osteosclerótico; leucemia de célula plasmática; gammapatía monoclonal de significado incierto (MGUS); mieloma múltiple quiescente (SMM), mieloma múltiple indolente (IMM); linfoma de Hodgkin incluyendo el tipo clásico y de predominio linfocítico nodular; linfoma linfoplasmacítico (LPL), y linfoma de zona marginal, incluyendo el linfoma de tejido linfoide asociado a la mucosa gástrica (MALT).

Los inventores han demostrado que los anticuerpos y composiciones de la invención pueden reducir células B maduras. La invención se puede emplear para tratar neoplasias de células B maduras (es decir, expresa Ig en la superficie celular) incluyendo pero no se limita a linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, el mieloma múltiple, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), incluyendo DLBCL de células similares a B centro germinales (GCB), DLBCL de células similares a B activadas (ABC), y DLBCL tipo 3, linfoma de Hodgkin incluyendo el tipo clásico y de predominio linfocítico nodular, linfoma linfoplasmacítico (LPL), y linfoma de zona marginal, incluyendo el linfoma de tejido linfoide asociado a la mucosa gástrica (MALT), y leucemia linfocítica crónica (CLL) incluyendo CLL de inmunoglobulina mutada y CLL de inmunoglobulina sin mutación.

Además, CD19 se expresa más temprano en el desarrollo de células B que, por ejemplo, CD20, y por lo tanto es particularmente adecuado para el tratamiento de tumores malignos de células pre-B y células B inmaduras (es decir, no expresan Ig en la superficie celular), por ejemplo, en la médula ósea. Los tumores malignos ilustrativos de células pre-B y células B inmaduras incluyen, aunque sin limitación, leucemia linfoblástica aguda.

La invención puede practicarse para tratar tumores extraganglionares.

5.5.1. Diagnóstico y estadificación de neoplasias de células B

La progresión del cáncer, tal como una enfermedad o trastorno de células B capaz de la formación de tumor (por ejemplo, linfoma no-Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, y linfoma de Burkitt) se caracteriza típicamente por el grado en que el cáncer se ha diseminado a través del cuerpo y con frecuencia se divide en los siguientes cuatro estadíos que se pronostican a partir del resultado. Estadío I: El cáncer se localiza en un tejido en particular y no se ha diseminado a los ganglios linfáticos. Estadío II: El cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos cercanos, es decir, metástasis. Estadío III: El cáncer se encuentra en los ganglios linfáticos dentro de regiones del cuerpo alejadas de los tejidos de origen y puede comprender una masa o múltiples tumores a diferencia de uno. Estadío IV: El cáncer se ha extendido a una parte distante del cuerpo. La estadío de un cáncer se puede determinar por las observaciones clínicas y métodos de prueba que son bien conocidos por los especialistas en la técnica. Las estadíos del cáncer que se describieron anteriormente se usan tradicionalmente junto con el diagnóstico clínico de los cánceres que se caracterizan por la formación de tumores, y puede usarse en conjunción con las composiciones y métodos de la presente invención para tratar enfermedades y trastornos de células B. Típicamente el estadío temprano de la enfermedad significa que la enfermedad se mantiene localizada en una parte de un cuerpo del paciente o que no ha metastatisado.

Con respecto a las enfermedades y trastornos de células B que no forman tumor, tal como, aunque sin limitación, mieloma múltiple, difieren los criterios para determinar el estadío de la enfermedad. El Sistema de estadificación de

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Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004); T. Lister et al., Follicular Lymphoma, pág. 309-324, en Malignant Lymphoma, B. Hancock et al., ediciones, Oxford University Press, Nueva York, N.Y. (2000)).

El diagnóstico de NHL folicular en general, se basa en la biopsia de un ganglio extirpado para evaluar la arquitectura del tejido y las características citológicas. Las aspiraciones con aguja fina no son adecuadas en general, ya que con este procedimiento es menos probable proporcionar tejidos que se puedan evaluar y fracasa al proporcionar suficiente tejido para pruebas adicionales. Las biopsias bilaterales de médula ósea se indican también ya que la afectación puede ser irregular. Procedimientos de diagnóstico adicionales incluyen rayos-x de tórax, análisis por tomografía axial computarizada (CT) de tórax, abdomen, cuello y pelvis, hemograma completo y perfil químico. La citometría de flujo e inmunohistoquímica se pueden usar para distinguir entre NHL folicular y otros linfomas de células B maduras. (Véase, S. Freedman, et al., Follicular Lymphoma, pág. 367-388, en Non-Hodgkin's Lymphomas,

P. Mauch et al., ediciones., Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004); T. Lister et al., Follicular Lymphoma, pág. 309-324, en Malignant Lymphoma, B. Hancock et al., ediciones, Oxford University Press, Nueva York, N.Y. (2000)).

5.5.2.2. Linfoma de células del manto

El linfoma de células del manto se localiza en la región del manto de los folículos secundarios y se caracteriza por un patrón de crecimiento nodular y/o difuso. Los pacientes con linfoma de células del manto tienen la edad media de 60-65 años con la enfermedad afectando predominantemente a masculinos. Para los propósitos de diagnóstico, la característica de presentación habitual es una linfadenopatía generalizada. Además, el bazo se dilata con frecuencia. Este linfoma de células B se relaciona con un t (11;14) entre el locus IgH y el gen de ciclina D1, lo que resulta en la sobreexpresión de ciclina D1. Más del 50% de los casos muestran anormalidades cromosómicas adicionales. El linfoma de células del manto no se caracteriza típicamente por SHM. (Véase, W. Hiddemann et al., Mantle Cell Lymphoma, pág. 461-476, en Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch et al., ediciones., Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004); D. Weisenburger et al., Mantle Cell Lymphoma, pág. 28-41, en Malignant Lymphoma, B. Hancock et al., ediciones., Oxford University Press, Nueva York, N.Y. (2000)).

El inmunofenotipado (citometría de flujo o sección congelada) por inmunohistoquímica de las células del linfoma celular del manto muestra que ellas casi siempre son monoclonales, portadoras de IgM de superficie. Las células del linfoma celular del manto se observaron también que portan IgD de superficie. Las células expresan los antígenos CD19, CD20, CD22 y CD24, pero no CD23. Expresan también antígenos de superficie CD5, pero no de CD10, que las distingue de los linfomas verdaderos de células centro folicular que casi siempre son CD5 negativo. Con frecuencia, se encuentra incluida en la afectación extraganglionar la infiltración de médula ósea y tumores del hígado y tracto gastrointestinal. La anemia leve y expresión leucémica no es rara con el linfoma de células del manto. (Véase, Lal et al., Role of Fine Needle Aspiration in Lymphoma, pág. 181-220, en W. Finn et al., ediciones, Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, Massachusett (2004); W. Hiddemann et al., Mantle Cell Lymphoma, pág. 461-476, en NonHodgkin's Lymphomas, P. Mauch et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004)).

El diagnóstico de linfoma de células del manto involucra el examen de la sangre periférica, así como las biopsias de médula ósea y ganglios linfáticos. Además, los estudios citogenéticos y de inmunofenotipo son útiles en el diagnóstico diferencial. (Véase, W. Hiddemann, et al., Mantle Cell Lymphoma pág. 461-476, en Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004); D. Weisenburger, et al., Mantle Cell Lymphoma, pág. 28-41, en Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., ediciones., Oxford University Press, Nueva York, N.Y. (2000)).

5.5.2.3. Linfoma de Burkitt

El linfoma de Burkitt es un linfoma de células B agresivo típicamente se observa en niños y adultos jóvenes, y se asocia generalmente con enfermedad voluminosa de la mandíbula y/o abdomen. Aproximadamente el 20% de los pacientes tienen afectación de la médula ósea. Una forma endémica del linfoma de Burkitt involucra la infección de células malignas por virus de Epstein-Barr (EBV); la forma esporádica es independiente de la infección por EBV. Una translocación de c-myc a los loci de inmunoglobulina, que resulta en la desregulación del gen c-myc, es característico de esta enfermedad (t (8;14) (q24;q32)). Interesantemente, las supresiones de las secuencias de cmyc parece que se involucran en la forma esporádica de la enfermedad, mientras que la forma endémica involucra por lo general mutaciones puntuales o inserciones. (Véase, V. Pappa, et al., Molecular Biology, pág. 133-157, en Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., ediciones, Oxford University Press, Nueva York, N.Y. (2000)). El linfoma de Burkitt se caracteriza también por SHM, y las células malignas tienen un perfil de expresión génica similar a las células B de GC, lo que sugiere que este tumor maligno se deriva de las células B de GC.

El inmunofenotipo del linfoma de Burkitt muestra que las células de esta enfermedad expresan CD19, CD20, CD22 y CD79a, pero no CD5, CD23, ciclina D o desoxinucleotidil transferasa terminal. Con frecuencia, estas células son positivas para CD10 y BCL6 y negativas por lo general para BCL2. (Véase, I. Magrath, et al., Burkitt's Lymphoma, pág. 477-501, en Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004)).

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El linfoma de alto grado de células B similar a Burkitt es un linfoma límite entre el linfoma de Burkitt y el linfoma de células B grandes. Las células de este linfoma expresan CD19, CD20, y CD22, pero se ausenta con frecuencia la expresión de CD10, que está casi siempre presente en el verdadero linfoma de Burkitt. Debido a esta y otras características, algunos creen que este linfoma se debe clasificar como un linfoma difuso de células B grandes. (Véase, K. Maclennan, Diffuse Aggressive B cell Lymphoma, pág. 49-54, en Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., ediciones, Oxford University Press, Nueva York, N.Y. (2000)).

El diagnóstico del linfoma de Burkitt se basa en general, en la detección de la translocación asociada con este linfoma, de este modo se realiza generalmente el análisis citogenético convencional. Las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa a larga distancia e hibridación fluorescente de in situ (FISH) se usaron para detectar las uniones Ig-myc en las translocaciones y otras alteraciones genéticas asociadas con esta enfermedad. (Véase, R. Siebert, et al., Blood 91:984-990 (1998); T. Denyssevych, et al., Leukemia, 16:276-283 (2002)).

5.5.2.4. Linfoma difuso de células B grandes (DLBCL)

El DLBCL es el más común linfoma no Hodgkin y puede derivar de un linfoma de células B pequeñas, linfoma folicular o linfoma de zona marginal. Típicamente, los pacientes se presentan con linfoadenopatía; sin embargo, un gran por ciento de pacientes presenta también en sitios extraganglionares, siendo el más común con afectación gastrointestinal. La afectación de la médula ósea se observa en aproximadamente el 15% de los pacientes. (Véase, Armitage, et al., Diffuse Large B cell Lymphoma, pág. 427-453, en Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004)). La heterogeneidad en las características clínicas, biológicas y morfológicas de este grupo de linfomas lo hace difícil de subclasificar. Sin embargo, dos subgrupos diferentes se identificaron uno con los genes que expresan la característica de las células B centro germinal (GC-DLBCL) y el otro con genes que se sobreexpresan en las células B de sangre periférica. Las tasas de supervivencia son significativamente mejores para los pacientes con GC-DLBCL que aquellos con DLBCL de células B activadas tipo (ABC). (Véase, W. Chan, Archives of Pathology and Laborator y Medicine 128 (12) : 1379-1384 (2004)).

Los DLBCL expresan los antígenos de superficie celular CD19, CD20, CD22 y CD79a. CD10 se expresa en la gran mayoría de los casos y la expresión CD5 se observa en aproximadamente el 10% de los casos. (Véase, K. Maclennan, Diffuse Aggressive B cell Lymphoma, pág. 49-54, en Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., ediciones, Oxford University Press, Nueva York, N.Y. (2000)). El DLBCL se marca con frecuencia por anomalías de BCL6 y/o translocaciones de BCL2 para el locus IgH. El DLBCL (GC) similar a las células B de GC se caracteriza por la SHM con genes de inmunoglobulinas altamente mutados y la SHM continua en los clones de tumores malignos con un perfil de expresión génica similar al de células B de GC. La mayoría de DLBCL GC ha experimentado el cambio de clase de inmunoglobulina. El DLBCL-ABC se caracteriza por el alto nivel de expresión de los genes diana de NF-kB como BCL2, factor regulador de interferón 4, CD44, FLIP y ciclina D. La SHM, pero no la SHM continúa, está presente y el DLBCL-ABC no tiene un perfil de expresión génica de células B de GC. La mayor parte de DLBCL-ABC expresa un alto nivel de IgM.

5.5.2.5. Linfoma extraganglionar de zona marginal

El linfoma extraganglionar de zona marginal es un linfoma extraganglionar que se produce en órganos que carecen normalmente de tejido linfoide organizado (por ejemplo, estómago, glándulas salivales, pulmones y glándulas tiroides). Es una enfermedad que afecta en gran medida a los adultos mayores con una edad media de más de 60 años. Con frecuencia, la inflamación crónica o procesos autoinmunes preceden el desarrollo del linfoma. El linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa gástrica (MALT), el tipo de linfoma de zona marginal más común, se asocia con la infección por Helicobacter pylori. Los estudios mostraron una solución de los síntomas con la erradicación de la infección por H. pylori seguido de un régimen de antibióticos. Los síntomas que se presentan para el linfoma gástrico MALT incluyen dispepsia inespecífica, dolor epigástrico, náuseas, hemorragia gastrointestinal y anemia. Los síntomas sistémicos no son comunes, como son los niveles elevados de lactato deshidrogenasa ácida. (Véase, J. Yahalom, et al., Extraganglionar Marginal Zone B cell Lymphoma of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue, pág. 345360, en Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004); J. Radford, Other Low-Grade Non-Hodgkin's Lymphomas, pág. 325-330, en Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., ediciones, Oxford University Press, Nueva York, N.Y. (2000). Los síntomas sistémicos de B incluyen fiebre mayor que 38 °C durante más de 2 semanas sin signos de infección, sudores nocturnos, fatiga extrema, pérdida de peso involuntaria, de mayor o igual al 10% del peso corporal en los 6 meses anteriores).

El inmunofenotipo del linfoma MALT se caracteriza por la expresión de CD19, CD20, CD79a, CD21 y CD35 y la carencia de expresión de CD5, CD23 y CD10. Aproximadamente la mitad de los linfomas MALT expresan CD43. La inmunoglobulina que se expresa típicamente en las células tumorales de esta enfermedad es la IgM mientras la IgD no se expresa. Estas características son de importancia para distinguir este linfoma de otros linfomas de células B pequeñas, tales como linfoma de células del manto, linfoma linfocítico y linfoma folicular. La trisomía 3 se ha reportado en 60% de los casos de linfoma MALT. En un 25-40% de los linfomas MALT gástricos y pulmonares se observa una t (11;18). Esta translocación se observa con mucho menos frecuencia que en otros linfomas MALT. La t

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con la ALL infantil (se observa en aproximadamente el 25% de los casos). (Véase, M. Kinney, et al., Classification and Differentiation of the Acute Leukemias, pág. 2209-2240, en Wintrobe's Clinical Hematology, Décima Edición, G. Lee, et al., ediciones Williams & Wilkins, Baltimore, Mar y land (1999); J Whitlock, et al., Acute Lymphocytic Leukemia, pág. 2241-2271; En Wintrobe's Clinical Hematology, Décima Edición, G. Lee, et al., ediciones Williams & Wilkins, Baltimore, Mar y land, (1999)).

El diagnóstico preciso de la leucemia aguda se basa generalmente en un aspirado y biopsia de médula. Los frotis de aspirado se usan para las evaluaciones morfológicas, inmunológicas y citológicas. La demostración de linfoblastos en la médula ósea es diagnóstico de ALL. La presencia mayor que 5% de células leucémicas de linfoblastos en la médula ósea confirma el diagnóstico de ALL, pero la mayoría requieren mayor que 25% para un diagnóstico definitivo. Las punciones lumbares se usan para diagnosticar la afectación del sistema nervioso central. Los niveles séricos de ácido úrico y niveles séricos de lactato deshidrogenasa se encontraron que se elevan en ALL. (Véase, M. Kinney, et al., Classification and Differentiation of the Acute Leukemias, pág. 2209-2240, en Wintrobe's Clinical Hematology, Décima Edición, G. Lee, et al., ediciones Williams & Wilkins, Baltimore, Mar y land (1999); J. Whitlock, et al., Acute Lymphocytic Leukemia, pág. 2241-2271; En Wintrobe's Clinical Hematology, Décima Edición, G. Lee, et al., ediciones Williams & Wilkins, Baltimore, Mar y land, (1999)).

5.5.2.9. Leucemia linfocítica crónica (CLL) /linfoma linfocítico de células B pequeñas (SLL)

La CLL/SLL es el tipo más común de leucemia. Cuando la enfermedad involucra la sangre periférica y médula ósea se le denomina como CLL. Sin embargo, cuando los ganglios linfáticos y otros tejidos se infiltran por células que son inmunológicamente y morfológicamente idénticas a las de CLL, pero donde las características leucémicas de la enfermedad están ausentes, entonces la enfermedad se denomina como SLL. Esta enfermedad afecta grandemente a los ancianos presentándose con una mayor incidencia de la enfermedad en hombres que en mujeres. La linfadenopatía indolora es el hallazgo más común de la presentación. La hipogammaglobulinemia es común con la mayoría de los casos de CLL/SLL que presentan niveles reducidos de todas las inmunoglobulinas en lugar de cualquier subclase de las inmunoglobulinas en particular. Los pacientes asintomáticos se diagnostican con frecuencia durante los recuentos de sangre de rutina (recuento de linfocitos de más de 5000 x 109/l). Hasta el 20% de los casos de CLL/SLL reportan síntomas de B. Una característica adicional de diagnóstico es la infiltración de la médula ósea con más del 30% de linfocitos inmaduros. Las biopsias de ganglios linfáticos en general, muestran la infiltración de ganglios involucrados con linfocitos bien diferenciados. Los fenómenos autoinmunes se asocian con frecuencia al CLL/SLL incluyendo anemia hemolítica autoinmune y trombocitopenia inmune. (Véase, J. Gribben, et al., Small B cell Lymphocytic Lymphomal Chronic Lymphocytic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, pág. 243261, en Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004); K. Maclennan, Diffuse Indolent B cell Neoplasms, pág. 43-47, en Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., ediciones, Oxford University Press, Nueva York, N.Y. (2000); Clinical Oncology, A. Neal, et al., Neal, Hoskin y Oxford University Press, co-publicación, Nueva York, NY (2003)).

A diferencia de muchos de los neoplasias de células B de grado bajo, las translocaciones recíprocas no aleatorias rara vez se encuentran en la CLL/SLL. Sin embargo, otras anormalidades citogenéticas se reportaron como supresiones en 13q14, 11q22-23 y 17q13, con los dos últimos involucrando el locus p53. Aproximadamente el 20% de los casos presentan la trisomía 12. Un nivel elevado de -2microglobulina, niveles superiores de expresión de CD38 y la producción del factor de necrosis tumoral-alfa son todas características del CLL/SLL. El inmunofenotipo de CLL/SLL se diagnóstica bien e incluye la débil expresión de inmunoglobulina de superficie generalmente IgM, o IgM e IgG, así como la expresión de los antígenos celulares CD19, CD22, CD20 y generalmente CD5 y CD23. (Véase, J. Gribben, et al., Small B cell Lymphocytic Lymphoma/Chronic Lymphocytic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, pág. 243-261, en NonHodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004); K. Maclennan, Diffuse Indolent B cell Neoplasms, pág. 43-47, en Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., ediciones, Oxford University Press, Nueva York, N.Y. (2000)).

5.5.2.10. Leucemia prolinfocítica de células B (PLL)

La PLL, considerada una vez una variante de CLL, se entiende ahora como una enfermedad distinta. La PLL es generalmente una enfermedad de hombres ancianos y se caracteriza por un muy alto recuento de glóbulos blancos (más de 200x109/l) y esplenomegalia. Los síntomas adicionales incluyen la anemia y trombocitopenia. Los prolinfocitos en PLL comprenden más del 55% de las células en la sangre y médula ósea. A diferencia de CLL, los fenómenos autoinmunes se observan rara vez en PLL. (Véase, J. Gribben, et al., Small B cell Lymphocytic Lymphoma/Chronic Lymphocytic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, pág. 243-261, en Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004)).

El inmunofenotipo de PLL se caracteriza por la expresión de CD19, CD21, CD22, CD24 y FMC7. Las células de PLL no expresan CD23 y la mayoría no expresan CD5. Las células de PLL presentan anomalías cromosómicas complejas, con supresiones siendo algunas de las más frecuentes en 13q14 y 11q23. El patrón de mutación p53 en las células de PLL es diferente de la observada para CLL. El diagnóstico diferencial se basa por lo general, en el hemograma completo, análisis histológico, inmunofenotípico y genético. (Véase, J. Gribben, et al., Small B cell

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455-460, en Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004)). La evaluación diagnóstica para el linfoma primario mediastínico de células B grandes incluye generalmente un examen físico completo, análisis hematológico y bioquímico completo, tomografía computarizada de todo el cuerpo y biopsia de médula ósea. La detección de galio-67 es una prueba útil para la estadificación, respuesta al tratamiento y para la evaluación de la recaída. (Véase, P. Zinzani et al., Primar y Mediastinal Large B cell Lymphoma, pág. 455460, en NonHodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004)).

5.5.2.14. Linfoma linfoplasmacítico (LPL)/inmunocitoma linfoplasmacítico/macroglobulinemia de Waldström

El LPL/Inmunocitoma linfoplasmacítico/Macroglobulinemia de Waldström es un linfoma ganglionar que es generalmente indolente, e involucra con frecuencia a la médula ósea, ganglios linfáticos y bazo. Esto es generalmente una enfermedad de adultos mayores con predominio ligero de hombres. La mayoría de los pacientes tienen paraproteína IgM monoclonal en sus sueros (>3g/dl), lo que resulta en la hiperviscosidad del suero. Las células tumorales tienen una morfología plasmacítica. Un subconjunto de LPL se caracteriza por translocaciones recurrentes entre los cromosomas 9 y 14, que involucra la PAX5 y los loci de inmunoglobulina de cadena pesada. La LPL se caracteriza por SHM, así como SHM continua, y se cree que se deriva de células B post-GC. (Véase, A. Rohatiner, et al., Lymphoplasmacytic Lymphoma and Waldström's Macroglobulinemia, pág. 263-273, en NonHodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004); K. Maclennan, Diffuse Indolent B cell Neoplasms, pág. 43-47, en Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., ediciones, Oxford University Press, Nueva York, N.Y. (2000); A. Lal, et al., Role of Fine Needle Aspiration in Lymphoma, pág. 181-220, en W. Finn, et al., ediciones, Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, Massachusett (2004)).

El inmunofenotipo de esta enfermedad muestra la expresión de las células B asociadas a los antígenos CD19, CD20, CD22, y CD79a y una carencia de expresión de CD5, CD10, y CD23. La presencia de inmunoglobulina de superficie sólida y CD20, la carencia de expresión de CD5, y CD23 y la presencia de inmunoglobulina citoplásmica son características que ayudan a distinguir esta enfermedad de la leucemia linfocítica crónica. El diagnóstico de esta enfermedad es también t (9;14) (p13;q32). (Véase, A. Rohatiner, et al., Lymphoplasmacytic Lymphoma and Waldström's Macroglobulinemia, pág. 263-273, en Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004); K. Maclennan, Diffuse Indolent B cell Neoplasms, pág. 43-47, en Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., ediciones, Oxford University Press, Nueva York, N.Y. (2000); R. Chaganti, et al., Cytogenetics of Lymphoma, pág. 809-824, en Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004)). Los ensayos de diagnóstico incluyen típicamente un hemograma completo, pruebas de función renal y hepática, análisis por CT, biopsia y aspiración de médula ósea, electroforesis de proteínas para cuantificar y caracterizar la paraproteína y viscosidad del suero. La medición de la ß2-microglobulina se usa como una prueba de pronóstico. (Véase, A. Rohatiner, et al., Lymphoplasmacytic Lymphoma and Waldström's Macroglobulinemia, pág. 263-273, en Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania (2004)).

5.5.2.15. Leucemia linfoblástica aguda nula

La leucemia linfoblástica aguda nula es un subconjunto de ALL que carece de las características de células B o T. El análisis fenotípico de los blastos leucémicos muestra un patrón típico de ALL nulo, es decir, negativo a CD10 (antígeno común a ALL), fuertemente positivo a HLADR, y positivo a CD-19 (B4) (ver Katz et al. (1988) Blood 71 (5):1438-47).

5.5.2.16. Linfoma de Hodgkin

El linfoma de Hodgkin se deriva generalmente de los ganglios linfáticos de los adultos jóvenes. Se puede dividir en subtipo clásico y un subtipo ganglionar con predominio linfocítico menos frecuente. El tipo clásico presenta SHM, pero no SHM continua, y no tiene un perfil de expresión génica de células B de GC. El tipo ganglionar con predominio linfocítico, a diferencia, se caracteriza por SHM y SHM continua y un perfil de expresión génica de células B de GC. Mientras que los dos tipos difieren clínica y biológicamente, comparten determinadas características, tales como una carencia de células neoplásicas dentro de un entorno de células inflamatorias benignas. B. Schnitzer et al., Hodgkin Lymphoma, pág. 259-290, en W. Finn y L. Peterson, ediciones, Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, Massachusetts (2004)).

Las características más comunes de presentación son el aumento indoloro de los ganglios linfáticos, generalmente en el cuello, pero ocasionalmente en la región inguinal. El crecimiento y disminución de los ganglios es característico también de esta enfermedad. Los síntomas de B se observan en aproximadamente un tercio de los pacientes. La afectación extraganglionar aislada es rara y en los casos donde la difusión se presentó la afectación extraganglionar se observa aproximadamente del 10-20% de las veces. (Véase, P. Johnson et al., Hodgkin's Disease: Clinical Features, pág. 181204, en Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., ediciones, Oxford University Press, Nueva York,

N.Y. (2000)).

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Los pacientes con mieloma múltiple típicamente se clasifican en los siguientes tres grupos que ayudan a definir los regímenes de tratamiento eficaces. La gammapatía monoclonal de significado incierto (MGUS) típicamente se caracteriza por un nivel de proteína M sérica de menos de 3 g/dl, células plasmáticas clonales de la médula ósea de menos del 10%, no hay evidencia de otros trastornos de células B, y ningún deterioro de órgano o tejido asociado, tales como hipercalcemia (niveles séricos de calcio aumentado a 156), deterioro de la función que se observa por el aumento de la creatinina sérica, anemia o lesiones óseas. Los mielomas asintomáticos típicamente están en el estadío I e incluyen el mieloma múltiple quiescente (SMM) y el mieloma múltiple indolente (IMM). El SMM se caracteriza por la proteína M sérica mayor que o igual a 3 g/dl y el IMM se caracteriza por las células plasmáticas clonales de médula ósea mayores que o iguales a 10% de las células de médula ósea. El mieloma sintomático se caracteriza por la proteína M en suero y/u orina e incluye el estadío II del mieloma múltiple caracterizado por la presencia de células plasmáticas clonales de médula ósea o plasmacitoma y el estadío III del mieloma múltiple caracterizado por el deterioro de órgano o tejido asociado.

El mieloma osteosclerótico es un componente del síndrome raro de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammapatía monoclonal y lesiones en la piel). El pico de incidencia es de 40 a 50 años de edad. Las características sistémicas incluyen lesiones óseas, células plasmáticas de la médula < 5%, un CBC normal, aumento de plaquetas, y organomegalia. El CSF tiene un alto valor proteico, sin células presentes. Los niveles de proteína-M son bajos (<3 g/dl, media = 1,1 g/dl); de cadena pesada clase -por lo general  o  ; de cadena ligera clase -por lo general A; monoclonal en orina raro y crioglobulinemia ocasional. La neuropatía ocurre en el 50% de los pacientes con debilidad tanto proximal como distal, la pérdida sensorial es mayor en las fibras más largas que pequeñas; y desmielinización y latencia distal larga.

Los pacientes con mieloma múltiple quiescente por lo general se presentan con la enfermedad estable durante meses/años, sin anemia, lesiones óseas, insuficiencia renal o hipercalcemia; tienen> 10% de células plasmáticas en la médula ósea y proteína monoclonal sérica. Los criterios para el mieloma múltiple ardiente son compatibles con el diagnóstico de mieloma múltiple; sin embargo, no existe evidencia de curso progresivo. Estos son casos con una progresión lenta, la masa celular tumoral es pequeña en el momento del diagnóstico y el porcentaje de células plasmáticas de la médula ósea en la fase S es bajo (<0,5%). Los rasgos característicos clínicos son: niveles séricos de proteína M >3 g/dl y/o células plasmáticas de la médula ósea ≥10%; ausencia de anemia, insuficiencia renal, lesiones osteolíticas.

El mieloma múltiple indolente (o asintomático) es un mieloma múltiple que se diagnostica por cambios en la ausencia de síntomas, por lo general después de evaluar los estudios de laboratorio. El mieloma múltiple indolente es similar al mieloma ardiente, pero con pocas lesiones óseas y anemia leve. La mayoría de los casos de mieloma múltiple indolente desarrollan mieloma múltiple ostensible dentro de los 3 años. Los criterios de diagnóstico son los mismos que para el mieloma múltiple, excepto: sin lesiones óseas o una lesión asintomática lítico (reconocimiento por rayos X); nivel de componente M <3 g/dl para IgG, 2 g/dl para IgA, cadena ligera en orina <4 g/24 horas; hemoglobina > 10 g/dl, calcio sérico normal, creatinina sérica <2 mg/dl, y sin infecciones.

5.5.2.18. Plasmacitoma solitario

El plasmocitoma solitario es una de un espectro de neoplasias de células plasmáticas que se extiende desde la gammapatía monoclonal benigna al plasmocitoma solitario en el mieloma múltiple. Aproximadamente el setenta por ciento de todos los casos de plasmocitoma solitario resultan eventualmente en el mieloma múltiple. Estas enfermedades se caracterizan por una proliferación de células B que producen la paraproteína característica. Los resultados del plasmocitoma solitario en una proliferación de células plasmáticas clonales en un sitio solitario, por lo general un sitio óseo simple o en el tejido extramedular. Los criterios de diagnóstico de plasmocitoma solitario incluyen una lesión simple histológicamente confirmada, biopsia ósea normal, reconocimiento óseo negativo, sin anemia, calcio y función renal normal. La mayoría de los casos presentan la proteína M sérica (paraproteína) mínimamente elevada. La edad media en el diagnóstico es de 50-55, aproximadamente 5-10 años más joven que la edad media para el mieloma múltiple. (Véase, C. Wilson, The Plasma Cell Dycrasias, pág. 113-144, en W. Finn and

L. Peterson, ediciones, Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004), S. Chaganti, et al., Cytogenetics of Lymphoma, pág. 809-824, en Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., ediciones, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania, (2004)).

Las características inmunofenotípicas y genéticas de plasmocitoma parecen ser similares al mieloma múltiple.

5.5.2.19. Enfermedad de cadena ligera/enfermedad de deposición de cadena ligera (LCDD)

La LCDD es un trastorno de discrasia de células plasmáticas causado por el exceso de síntesis de las cadenas ligeras de inmunoglobulina (por lo general las cadenas ligeras kappa) que se depositan en los tejidos. Los pacientes se presentan comúnmente con disfunción de órganos, debilidad, fatiga y pérdida de peso. Aproximadamente en el 80% de los casos de LCDD se detecta una inmunoglobulina monoclonal. La detección de las cadenas ligeras kappa monoclonales por medio del uso de las técnicas de inmunofluorescencia está limitada por la tendencia de las cadenas ligeras a dar la tinción de fondo en exceso, por lo tanto, puede ser necesario el inmunomarcaje

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ultraestructural con oro. (Véase, C. Wilson, The Plasma Cell Dycrasias, pág. 113-144, en W. Finn y L. Peterson, ediciones, Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004)).

5.5.2.20. Leucemia de células plasmáticas (PCL)

La PCL, una discrasia de células plasmáticas, es una variante agresiva rara del mieloma múltiple. Los criterios para la leucemia de células plasmáticas es un recuento absoluto de células plasmáticas en sangre periférica mayor que 2x109/l o células plasmáticas mayores que 20% de glóbulos blancos. La determinación mediante citometría de flujo de la presencia de una población CD138+ con restricción de cadena ligera citoplásmica por citometría de flujo distinguirá a PCL del neoplasma linfoide con características plasmacíticas. Las células de PCL se caracterizan también por la carencia de cadena ligera de superficie, expresión CD19 y CD22, y, ninguna o débil expresión de CD45. Aproximadamente el 50% de los casos de PCL expresan CD20 y aproximadamente el 50% carecen de expresión de CD56. Las anomalías genéticas observadas en los pacientes de PCL son iguales a aquellas observadas para los pacientes con mieloma múltiple pero se encuentran en frecuencia superior en PCL. (Véase, C. Wilson, The Plasma Cell Dycrasias, pág. 113-144, en W. Finn y L. Peterson, ediciones, Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, Massachusetts, (2004)).

La leucemia de células plasmáticas tiene dos formas: si el diagnóstico inicial se basa en la fase leucémica del mieloma entonces se presenta la forma primaria, de lo contrario, es secundaria. La leucemia de células plasmáticas primaria se asocia a una edad juvenil, hepatoesplenomegalia, linfadenopatía, y lesiones osteolíticas menores, pero con peor pronóstico que la forma secundaria. La sangre periférica de pacientes leucémicos de células plasmáticas tiene mayor que 20% de células plasmáticas con el recuento absoluto de 2000/ml o más.

5.5.2.21. Gammapatía monoclonal de significado incierto (MGUS)

La MGUS es una afección relativamente común caracterizada por la presencia de inmunoglobulinas electroforéticamente homogéneas o componentes-M benignos. La presencia de esta afección parece aumentar con la edad. La mayoría de los individuos que portan componentes-M nunca desarrollan discrasia maligna de células plasmática, tal como mieloma múltiple. Sin embargo, algunos sujetos con esta afección se han asociado a afecciones malignas. Cuando los pacientes se vuelven sintomáticos pueden tener hígado o bazo dilatado y pleuroneuropatía (Véase, J. Foerster, Plasma Cell Dycrasias: General Considerations, pág. 2612-2630, en Wintrobe's Clinical Hematology, Décima Edición, G. Lee et al., ediciones Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)).

La MGUS se puede diferenciar del mieloma múltiple por la presencia de cantidad aumentada de células plasmáticas monoclonales circulantes en la sangre periférica. Las características serológicas de los componentes-M son idénticas a otras afecciones de discrasia de células plasmáticas, sin embargo, la concentración total del componente-M es por lo general menos que 30 g/l. La paraproteína es por lo general IgG, sin embargo múltiples paraproteínas pueden presentarse incluyendo IgG, IgA, IgM. La cantidad relativa de cada una de las clases de individuales inmunoglobulinas típicamente es proporcional a la que se encuentra en el suero normal. La proteinemia

o proteinuria es rara. Las determinaciones seriadas de los niveles de proteína-M en la sangre y orina, y el monitoreo continuo de las características clínicas y de laboratorio (incluyendo la electroforesis de proteínas) es el método más fiable de diferenciar MGUS de discrasias de células plasmáticas en etapa temprana. En Wintrobe's Clinical Hematology, Décima Edición, G. Lee et al., ediciones Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)).

5.5.2.22. Neoplasias de células B maduras

Los inventores han demostrado que las composiciones anti-CD19 de la invención pueden reducir las células B maduras. Por tanto, como otro aspecto, la invención se puede practicar para tratar neoplasias de células B maduras que incluyen aunque sin limitación linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), incluyendo DLBCL similar a células B centro germinal (GCB), DLBCL similar a células B activadas (ABC), y DLBCL tipo 3, linfoma de Hodgkin incluyendo clásico y tipo nodular con predominio de linfocitos, linfoma linfoplasmacítico (LPL), linfoma de zona marginal, incluyendo linfoma de mucosa gástrica asociada a tejido linfoide (MALT), y leucemia linfocítica crónica (CLL), incluyendo CLL de inmunoglobulina mutada y CLL de inmunoglobulina no mutada.

5.5.2.23. Neoplasias de células pre-B

Además, el CD19 se expresa más temprano en el desarrollo de las células B que, por ejemplo, CD20, y por lo tanto es particularmente adecuado para el tratamiento de tumores malignos de células pre-B y células B inmaduras, por ejemplo, en la médula ósea. Los tumores malignos representativos de las células pre-B y células B inmaduras incluyen aunque sin limitación linfoma de células del manto, leucemia linfoblástica aguda de células pre-B, linfoma linfoblástico de células B precursoras, et al. tumores malignos caracterizados por la expresión de CD19.

5.5.3. Determinación de la densidad de CD19 en una muestra o sujeto

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antes de, simultáneamente con, o a continuación de la administración de uno o más agentes terapéuticos. Los agentes terapéuticos que se pueden usar en regímenes terapéuticos de combinación con composiciones de la invención incluyen cualquier sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o causa la destrucción de las células. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitación, isótopos radiactivos, agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como las toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.

Los regímenes terapéuticos descritos en este documento, o cualquier régimen de tratamiento deseado se pueden ensayar para la eficacia usando un modelo de animal transgénico tal como el modelo de ratón descrito a continuación en la Sección 6.2, que expresa el antígeno CD19 humano en lugar del antígeno CD19 nativo. De este modo, un régimen de tratamiento con anticuerpo anti-CD19 se puede probar en un modelo animal para determinar la eficacia antes de la administración a un ser humano.

Los anticuerpos anti-CD19 de las composiciones y para su uso en los métodos de la invención se pueden usar para tratar enfermedades de células B, incluyendo neoplasias de células B. El término "neoplasia de células B" incluye cualquier tumor maligno que se deriva de una célula del linaje de células B. Los ejemplos de neoplasias de células B incluyen, aunque sin limitación: linfoma no Hodgkin subtipo de células B (NHL), incluyendo NHL de grado bajo/folicular, NHL, NHL linfocítico pequeño (SL), NHL de grado intermedio/folicular, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de célula pequeñas no hendidas de alto grado; linfoma de células del manto, y NHL enfermedad de gran masa tumoral; linfoma de Burkitt; mieloma múltiple; leucemia pre-B linfoblástica aguda y otros tumores malignos que se derivan de los precursores tempranos de células B; leucemia linfocítica aguda común (ALL); leucemia linfocítica crónica (LLC) incluyendo CLL con inmunoglobulina mutada y LLC con inmunoglobulina no mutada; leucemia de células peludas; leucemia linfoblástica aguda nula; macroglobulinemia de Waldenström, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), incluyendo DLBCL célula similar a B central germinal (GCB), DLBCL de célula similar a B activado (ABC), y DLBCL tipo 3; leucemia pro-linfocítica, enfermedad de cadena ligera; plasmocitoma; mieloma osteosclerótico; leucemia de células plasmáticas; gammapatía monoclonal de significado incierto (MGUS); mieloma múltiple quiescente (SMM); mieloma múltiple indolente (IMM), linfoma de Hodgkin incluyendo tipo pre-dominante linfocito nodular y clásico; linfoma linfoplasmacítico (LPL); y linfoma de la zona marginal, incluyendo el linfoma de tejido linfoide asociado a la mucosa gástrica (MALT).

Los inventores han descubierto que los anticuerpos y composiciones de la invención pueden reducir las células B maduras. Por tanto, como otro aspecto, la invención se puede emplear para tratar neoplasias de células B maduras (es decir, expresa Ig en la superficie celular), incluyendo pero no limitado a linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple y linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), incluyendo DLBCL similar a célula B del centro germinal (GCB), DLBCL similar a células B activadas (ABC), y DLBCL tipo 3, linfoma de Hodgkin incluyendo tipo pre-dominante linfocito nodular y clásico, linfoma linfoplasmacítico (LPL), linfoma de la zona marginal incluyendo el linfoma de tejido linfoide asociado a la mucosa gástrica (MALT) y leucemia linfocítica crónica (LLC), incluyendo CLL con inmunoglobulina mutada y CLL con inmunoglobulina no mutada.

Además, CD19 se expresa más temprano en el desarrollo de células B que, por ejemplo, CD20, y es por tanto particularmente adecuado para tratar los tumores malignos de células pre-B y células B inmaduras (es decir, no expresan Ig en la superficie celular), por ejemplo, en la médula ósea. Los tumores malignos ilustrativos de células pre-B y células B inmaduras incluyen aunque sin limitación la leucemia linfoblástica aguda.

La invención se puede practicar para tratar tumores extraganglionares.

5.6.1. Inmunoterapia anti-CD19

De acuerdo con la presente invención, "inmunoterapia anti-CD19" incluye la administración de cualquiera de los anticuerpos anti-CD19 de la invención de acuerdo con cualquier régimen terapéutico descrito en este documento. Los anticuerpos anti-CD19 se pueden administrar como anticuerpos desnudos, o inmunoconjugados o proteínas de fusión.

La inmunoterapia anti-CD19 incluye la administración del anticuerpo anti-CD19 como un agente terapéutico único para el tratamiento de un neoplasia de células B. La inmunoterapia anti-CD19 incluye los métodos de tratamiento de una enfermedad en etapa temprana que resulta de un tumor maligno de célula B. La inmunoterapia anti-CD19 incluye los métodos de tratamiento de un tumor maligno de célula B donde un anticuerpo anti-CD19 media la ADCC. La inmunoterapia anti-CD19 incluye los métodos de tratamiento de un tumor maligno de célula B donde un anticuerpo anti-CD19 se administra antes de que el paciente haya recibido cualquier tratamiento para el tumor maligno, ya sea que la terapia es quimioterapia, terapia basada en radio química o terapia quirúrgica.

En una realización preferida, un sujeto humano que tiene una neoplasia de células B se puede tratar por la administración de un anticuerpo humano o humanizado que puede ser capaz de mediar la ADCC humana. En los casos de enfermedad en etapa temprana, o terapias de agente único, cualquier anticuerpo anti-CD19 que puede

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Las composiciones de la invención pueden administrarse a un paciente humano, siempre y cuando el paciente sea sensible a la terapia. Las composiciones de la invención pueden administrarse a un paciente humano, siempre y cuando la enfermedad del paciente no progrese. Las composiciones de la invención pueden administrarse a un paciente humano hasta que la enfermedad de un paciente no progrese o no ha progresado durante un período de tiempo, entonces al paciente no se le administra composiciones de la invención a menos que la enfermedad recurra

o comience a avanzar de nuevo. Por ejemplo, un paciente se puede tratar con cualquiera de las dosis anteriores durante aproximadamente 4 a 8 semanas, tiempo durante el cual el paciente se monitorea para la progresión de la enfermedad. Si la progresión de la enfermedad se detiene o se invierte, entonces paciente no se le podrá administrar las composiciones de la invención hasta que el paciente recaiga, es decir, la enfermedad que está siendo tratada recurra o progrese. En esta recurrencia o progresión, el paciente se puede tratar de nuevo con el mismo régimen de dosificación usado inicialmente o usar otras dosis descritas anteriormente.

Las composiciones de la invención se pueden administrar como una dosis de carga seguida de múltiples dosis inferiores (dosis de mantenimiento) durante un período de tiempo. Las dosis pueden programarse y la cantidad ajustar para mantener efectivo la reducción de las células B. La dosis de carga podría ser de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18 mg/kg de peso corporal del paciente y la dosis de mantenimiento puede ser al menos aproximadamente de 5 a 10 mg/kg de peso corporal del paciente. La dosis de mantenimiento puede administrarse a intervalos de cada 7, 10, 14 o 21 días. Las dosis de mantenimiento se pueden continuar indefinidamente, hasta que la toxicidad se presente, hasta que se reduzca el recuento de plaquetas, hasta que no exista progresión de la enfermedad, hasta que el paciente presente inmunogenicidad, o hasta que la enfermedad progresa a un estado terminal. Las composiciones de la invención pueden administrarse a un paciente humano hasta que la enfermedad progresa a una fase terminal.

Cuando los niveles de monocitos circulantes de un paciente se controlan como parte de un régimen de tratamiento, las dosis de anticuerpo anti-CD19 administradas pueden espaciarse para permitir la recuperación del recuento de monocitos. Por ejemplo, una composición de la invención puede administrarse a intervalos de cada 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 días.

Cuando un anticuerpo anti-CD19 se conjuga con o administra junto con una toxina, los especialistas en la técnica apreciará que la dosis de anticuerpo anti-CD19 se puede ajustar basado en la dosis de toxina y que la dosis de toxina dependerá del tipo específico de toxina que se use. Típicamente, cuando una toxina se usa, la dosis de anticuerpo anti-CD19 será menor que la dosis usada con un anticuerpo desnudo anti-CD19. La dosis apropiada se puede determinar para una toxina particular por medio del uso de técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un estudio del intervalo de dosis se puede llevar a cabo para determinar la dosis máxima tolerada de anticuerpo anti-CD19 cuando se administra con o conjuga con una toxina.

Cuando un anticuerpo anti-CD19 se conjuga con o administra junto con un agente radioterapéutico, la dosis del anticuerpo anti-CD19 variará dependiendo del radioterapéutico usado. Un proceso de dos etapas puede usarse. En primer lugar, el paciente humano se le administra una composición que comprende un anticuerpo desnudo anti-CD19 y aproximadamente 6, 7, 8, 9 o 10 días después se administra una pequeña cantidad de radioterapéutico. En segundo lugar, una vez que se determina la tolerancia, distribución y aclaramiento de la terapia de dosis baja, al paciente se le administra una dosis de anticuerpo desnudo anti-CD19 seguido por una cantidad terapéutica de la radioterapéutica que se administra. Los regímenes de tratamiento de ese tipo son similares a aquellos aprobados para el tratamiento del linfoma no Hodgkin usando Zevalin™ (mAb anti-CD20 marcado con indio) (Biogen Idec) o BEXXAR ™ (GSK, Coulter Pharmaceutical).

5.6.2. Combinación con agentes quimioterápeuticos

La inmunoterapia anti-CD19 (usando anticuerpo desnudo, inmunoconjugados, o proteínas de fusión) se puede usar junto con otras terapias que incluyen aunque sin limitación, quimioterapia, la radioinmunoterapia (RIT), quimioterapia y radiación de haz externo (terapia de realización combinada, CMT), o radioinmunoterapia de realización combinada (CMRIT) solo o en combinación, etc. En determinadas realizaciones, una terapia con el anticuerpo anti-CD19 de la presente invención se puede administrar junto con CHOP (ciclofosfamida-Hidroxidoxorubicin-Oncovin (vincristina) prednisolona), el régimen de quimioterapia más común para el tratamiento del linfoma no Hodgkin. Como se usa en este documento, el término "administrar junto con" significa que una inmunoterapia anti-CD19 se puede administrar antes, durante, o posterior a la otra terapia empleada.

La inmunoterapia anti-CD19 puede ser junto con un radionúclido citotóxico o isótopo radioterapéutico. Por ejemplo, un isótopo que emite alfa tal como 225Ac, 224Ac, 211At, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 224Ra, o 223Ra. Como alternativa, el radionúclido citotóxico puede ser un isótopo que emite beta tal como 186Re, 188Re, 90Y, 131I, 67Cu, 177Lu, 153Sm, 166Ho,

o 64Cu. Además, el radionúclido citotóxico puede emitir electrones Auger y de baja energía, e incluir los isótopos 251I,123I o 77Br. El isótopo puede ser 198Au, 32P, y similares. La cantidad del radionúclido administrado al sujeto puede estar entre aproximadamente 0,001 mCi/kg y aproximadamente 10 mCi/kg.

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La inmunoterapia anti-CD19 pude ser junto con una o más moléculas de caliceamicina. La familia de antibióticos de caliceamicina es capaz de producir rupturas de ADN bicatenario en concentraciones sub-picomolares. Los análogos estructurales de caliceamicina que pueden usarse incluyen, aunque sin limitación, 11, 21, 31, N-acetil-11, PSAG y 011 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993) y Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)).

Como alternativa, puede prepararse una proteína de fusión que comprende un anticuerpo anti-CD19 y un agente citotóxico, por ejemplo, por técnicas recombinantes o de síntesis de péptidos.

Un anticuerpo anti-CD19 de la invención puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para su utilización en pre-direccionamiento tumoral donde se administra el conjugado receptor-antagonista al paciente, seguido por la eliminación del conjugado no unido de la circulación usando un agente de limpieza y después por la administración de un "ligando" (por ejemplo, biotina) que se conjuga con un agente terapéutico (por ejemplo, un radionucleótido).

Un régimen de tratamiento puede incluir compuestos que atenúan los efectos citotóxicos de una composición del anticuerpo anti-CD19 de la invención. Los compuestos de ese tipo incluyen analgésicos (por ejemplo, acetaminofeno), bifosfonatos, antihistamínicos (por ejemplo, maleato de clorfeniramina) y esteroides (por ejemplo, dexametasona, retinoides, deltoides, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, deshidrotestosterona, glucocorticoides, mineralocorticoides, estrógenos, testosterona, progestinas).

El agente terapéutico usado en combinación con la inmunoterapia anti-CD19 de la invención puede ser una molécula pequeña (es decir, compuestos inorgánicos u orgánicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 2500 dalton). Por ejemplo, pueden obtenerse en el mercado bibliotecas de moléculas pequeñas en Specs y BioSpecs BV (Rijswijk, Países Bajos), ChemBridge Corporation (San Diego, CA), Comgenex USA Inc. (Princeton, NJ), y Maybridge Chemicals Ltd. (Cornwall PL34 OHW, Reino Unido).

La inmunoterapia anti-CD19 se puede administrar en combinación con un agente anti-bacteriano. Los ejemplos no limitantes de agentes antibacterianos incluyen proteínas, polipéptidos, péptidos, proteínas de fusión, anticuerpos, moléculas de ácidos nucleicos, moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas, y moléculas pequeñas que inhiben y/o reducen una infección bacteriana, inhiben y/o reducen la replicación de la bacteria, o inhiben y/o reducen la propagación de las bacterias a otras células o sujetos. Los ejemplos específicos de agentes antibacterianos incluyen, aunque sin limitación, antibióticos tales como penicilina, cefalosporina, imipenem, axtreonam, vancomicina, cicloserina, bacitracina, cloranfenicol, eritromicina, clindamicina, tetraciclina, estreptomicina, tobramicina, gentamicina, amikacina, kanamicina, neomicina, espectinomicina, trimetoprim, norfloxacina, rifampicina, polimixina, anfotericina B, nistatina, ketoconazol, isoniazida, metronidazol, y pentamidina.

La inmunoterapia anti-CD19 de la invención se puede administrar en combinación con un agente anti-fúngico. Los ejemplos específicos de agentes anti-fúngicos incluyen, aunque sin limitación, fármacos de azol (por ejemplo, miconazol, ketoconazol (NIZORAL®), acetato de caspofungina (CANCIDAS®), imidazol, triazoles (por ejemplo, fluconazol (DIFLUCAN®) e itraconazol SPORANOX (®)), polieno (por ejemplo, nistatina, anfotericina B (FUNGIZONE®), complejo lipídico de anfotericina B ("ABLC") (ABELCET®), anfotericina B de dispersión coloidal ("ABCD") (AMPHOTEC ®), anfotericina liposómica B (AMBISONE®)), yoduro de potasio (KI), pirimidina (por ejemplo, flucitosina (ANCOBON®) y voriconazol (VFEND ®)). La administración de agentes anti-bacterianos y antifúngicos puede atenuar los efectos o aumento de las enfermedades infecciosas que pueden ocurrir en los métodos de la invención donde las células B de un paciente están significativamente reducidas.

La inmunoterapia anti-CD19 de la invención se puede administrar en combinación con uno o más de los agentes descritos anteriormente para atenuar los efectos secundarios tóxicos que pueden acompañar a la administración de las composiciones de la invención. La inmunoterapia anti-CD19 se puede administrar en combinación con uno o más agentes que se conocen bien en la técnica para el uso en la atenuación de los efectos secundarios de la administración de anticuerpo, quimioterapia, toxinas, o fármacos.

Como se describe en este documento, cuando la inmunoterapia anti-CD19 de la invención se administra para tratar el mieloma múltiple, las composiciones de la invención pueden administrarse en combinación con o en los regímenes de tratamiento con quimioterapia de altas dosis (melfalán, melfalán/prednisona (MP), vincristina/doxorrubicina/ dexametasona (VAD), doxorrubicina liposomal/vincristina, dexametasona (DVd), ciclofosfamida, etopósido/dexametasona/citarabina, cisplatino (EDAP)), trasplantes de células madre (por ejemplo, trasplante autólogo de células madre o el trasplante alogénico de células madre, y/o trasplante de células madre mini-alogénico (no mieloablativo)), radioterapia, esteroides (por ejemplo, corticosteroides, dexametasona, talidomida/dexametasona, prednisona, melfalán/prednisona), terapia de apoyo (por ejemplo, bifosfonatos, factores de crecimiento, antibióticos, inmunoglobulina intravenosa, radioterapia de dosis baja, y/o intervenciones ortopédicas), Thalomid™ (talidomida, Celgene), y/o Velcade™ (bortezomib, Millennium).

Como se describe en este documento, cuando la inmunoterapia anti-CD19 de la invención se administra en combinación con otro anticuerpo o anticuerpos y/o agente, el anticuerpo adicional o anticuerpos y/o agentes se

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pueden administrar en cualquier secuencia relativa a la administración del anticuerpo de esta invención. Por ejemplo, el anticuerpo adicional o anticuerpos se pueden administrar al sujeto humano antes, simultáneamente con, y/o posterior a la administración de un anticuerpo anti-CD19 o inmunoconjugado. El anticuerpo adicional o anticuerpos se pueden presentar en la misma composición farmacéutica como un anticuerpo de la invención, y/o presentar en una composición farmacéutica diferente. La dosis y el modo de administración de un anticuerpo de esta invención y la dosis del anticuerpo adicional o anticuerpos pueden ser iguales o diferentes, de acuerdo con cualquiera de las enseñanzas de las cantidades de dosis y modos de administración según se proporciona en esta solicitud y según se conoce bien en la técnica.

5.7. Uso de anticuerpos anti-CD19 en el diagnóstico de neoplasias de células B

La presente invención incluye también anticuerpos anti-CD19 de la invención, y composiciones de los mismos, que se unen inmunoespecíficamente al antígeno CD19 humano, cuyos anticuerpos anti-CD19 se conjugan con un agente de diagnóstico o detectable. Los anticuerpos anti-CD19 de ese tipo pueden ser útiles para el monitoreo o pronóstico del desarrollo o progresión de un neoplasia de células B como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, tales como determinar la eficacia de una terapia particular. El diagnóstico y detección de ese tipo se pueden lograr por el acoplamiento de un anticuerpo anti-CD19 que se une inmunoespecíficamente al antígeno CD19 humano con una sustancia detectable, que incluyen aunque sin limitación, diversas enzimas, tales como, aunque sin limitación, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como, aunque sin limitación, estreptavidina biotina y avidina/biotina; técnicas fluorescentes, tales como, aunque sin limitación, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; técnicales luminiscentes, tales como aunque sin limitación, luminol; técnicales bioluminiscentes, tales como aunque sin limitación, luciferasa, luciferina, y aequorina, técnicales radiactivos, tales como, aunque sin limitación, yodo (131I, 125I, 123I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, 111In), y tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge,57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Tin; metales emisores de positrones por medio del uso de diversas tomografías por emisión de positrones, iones metálicos paramagnéticos no radioactivos, y moléculas que se radiomarcan o conjugan con radioisótopos específicos. Cualquier marcador detectable que se puede medir fácilmente se puede conjugar a un anticuerpo anti-CD19 y usar en el diagnóstico de enfermedades de células B. La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse ya sea directamente con un anticuerpo o indirectamente, a través de un intermedio (tal como, por ejemplo, un enlazador conocido en la técnica), por medio del uso de técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 4.741.900 para los iones metálicos que se pueden conjugar con anticuerpos para el uso como un diagnóstico de acuerdo con la presente invención. Como se describe en este documento, la presente descripción proporciona kits de diagnóstico que comprenden un anticuerpo anti-CD19 conjugado con una gente de diagnóstico o detectable.

5.8. Kits

La presente descripción proporciona un envase o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenados con una composición de la presente descripción para la prevención, tratamiento, control o mejora de una neoplasia de células B, o uno o más síntomas de la misma, potenciados por o que potencian una neoplasia de células B.

La presente descripción proporciona kits que pueden usarse en los métodos descritos anteriormente. Un kit comprende una composición de la presente descripción, en uno o más recipientes. En otra realización, un kit comprende una composición de la invención, en uno o más recipientes, y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos diferentes útiles para la prevención, control o tratamiento de una neoplasia de células B, o uno o más síntomas de la misma, potenciados por o que potencian una neoplasia de células B en uno o más recipientes diferentes. El comprende adicionalmente instrucciones para prevenir, tratar, controlar o mejorar una neoplasia de células B, así como información sobre los efectos secundarios y dosificación para el método de administración. Opcionalmente, asociado con dicho recipiente o recipientes puede haber una notificación en forma prescrita por una agencia gubernamental que regula fa fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, reflejando dicha notificación la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o venta para administración a seres humanos.

6. Ejemplos

En los siguientes ejemplos se usó un modelo de ratón transgénico para evaluar inmunoterapias dirigidas a CD19 humano. Estos datos muestran que anticuerpos que se unen al antígeno CD19 y que también median ADCC son eficaces para inducir la reducción de células B in vivo, en sujetos que tienen células efectoras que expresan FcR, (preferiblemente, FcRIII o FcRIV) y realizan ADCC. Dichos anticuerpos pueden usarse para inducir una reducción duradera de células B in vivo, y en ciertas realizaciones pueden eliminar casi todas las células B de la circulación, el bazo y los ganglios linfáticos. Sorprendentemente, las células B de médula ósea y sus precursores que expresan densidades relativamente bajas del antígeno CD19 se reducen también. La eficacia de reducción de células B no es dependiente de la región de CD19 humano en que se une un anticuerpo anti-CD19, pero se ve influenciada por la densidad de CD19 (en la muestra del paciente). La eficacia de eliminación de células B puede correlacionarse con la

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ligera. Se secuenciaron las regiones de cadena pesada y ligera de HB12a y HB12b completamente en ambas hebras de ADN, con sentido y antisentido.

Anticuerpos y análisis de inmunofluorescencia. Los anticuerpos anti-CD19 descritos anteriormente, que se unen al antígeno CD19 humano, se pueden usar en los enfoques descritos a continuación. Otros anticuerpos, que pueden emplearse en los experimentos descritos a continuación incluyen los anticuerpos monoclonales de ratón anti-CD22 que se unen a CD22 de ratón, por ejemplo el HIB22 (Abcam; Dorken B et al., J Immunol 136:4470-9 (1986)); anticuerpos monoclonales de ratón específico a CD20 (Uchida et al., Intl. Immunol, 16:119-129 (2004)); anticuerpo B220 RA3-6B2 (DNAX Corp., Palo Alto, California), y los anticuerpos CD5, CD43 y CD25 (BD PHARMINGEN ™, Franklin Lakes, NJ). Los anticuerpos anti Ig o IgM de ratón de isotipo específico se pueden obtener de Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham, AL).

La línea celular pre-B de ratón, 300.19 (Alt et al., Cell, 27:381-388 (1981)), transfectada con ADNc de hCD19 (Tedder e Isaacs, J. Immunol., 143:712-717 (1989)), o suspensiones de leucocitos de una única célula, se tiñeron en hielo usando concentraciones óptimas, predeterminadas, de cada anticuerpo durante 20-30 minutos de acuerdo con métodos establecidos (Zhou et al., Mol. Cell. Biol., 14:3884-3894 (1994)). Las células con las propiedades de dispersión de luz directa y lateral de los linfocitos se analizaron en citómetros de flujo FACSCAN® o FACSCALIBUR® (Becton Dickinson, San Jose, California). La tinción del fondo se determinó usando los anticuerpos de control no reactivos (CALTAG™ Laboratories, Burlingame, California) con marcos posicionados para excluir ≥ 98% de las células. Para cada muestra examinada, diez mil células con las propiedades de dispersión de luz directa y lateral de las células mononucleares se analizaron siempre que fue posible, con la intensidad de fluorescencia mostrada en una escala logarítmica de cuatro decenas.

Ratones. Se produjeron ratones transgénicos que expresaban (hCD19) y sus camadas de tipo silvestre (TS) como se ha descrito previamente (Zhou et al., Mol. Cell. Biol., 14:3884-3894 (1994)). Se generaron ratones TG-1 a partir de los fundadores originales h19-1 (C57BL/6 x B6/SJL), y se cruzaron en un fondo C57BL/6 durante al menos 7 generaciones. Se generaron ratones TG-2 a partir de los fundadores originales h19-4 (C57BL/6 x B6/SJL). Después de múltiples generaciones de retrocruzamiento, se obtuvieron ratones TG-1+/+ cuyas células B expresaban densidad en superficie celular de CD19 humano en aproximadamente la misma densidad encontrada en células B humanas. Los ratones que expresan CD19 humano se han descrito adicionalmente y usado como modelo en varios estudios (Engel et al., Immunity, 3:39-50 (1995); Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11558-11562 (1995); Sato et al., J. Immunol., 157:4371-4378 (1996); Tedder et al., Immunity, 6:107-118 (1997); Sato et al., J. Immunol., 158:4662-4669 (1997); Sato et al., J. Immunol., 159:3278-3287 (1997); Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:13158-13162 (1997); Inaoki et al., J. Exp. Med., 186:1923-1931 (1997); Fujimoto et al., J. Immunol., 162:7088-7094 (1999); Fujimoto et al., Immunity, 11:191-200 (1999); Satterthwaite et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6687-6692 (2000); Fujimoto et al., Immunity, 13:47-57 (2000); Sato et al., J. Immunol., 165:6635-6643 (2000); Zipfel et al., J. Immunol., 165:6872-6879 (2000); Qian et al., J. Immunol., 166:2412-2419 (2001); Hasegawa et al., J. Immunol., 167:2469-2478 (2001); Hasegawa et al., J. Immunol., 167:3190-3200 (2001); Fujimoto et al., J. Biol. Chem., 276:44820-44827 (2001); Fujimoto et al., J. Immunol., 168:5465-5476 (2002); Saito et al., J. Clin. Invest., 109:1453-1462 (2002); Yazawa et al., Blood, 102:1374-80 (2003); Shoham et al., J. Immunol., 171:4062-4072 (2003)). También se han descrito previamente ratones CD19-deficientes (CD19-/-) y sus camadas TS (Engel et al., Immunity, 3:39-50 (1995)). La expresión de CD19 humano en ratones transgénicos ha demostrado reducir la expresión endógena de CD19 de ratón (Sato et al., J. Immunol., 157:4371-4378 (1996); y Sato et al., J. Immunol., 158:4662-4669 (1997)) y también se han evaluado hipótesis respecto a esta disminución de la expresión endógena de CD19 de ratón (Shoham et al., J. Immunol., 171:4062-4072 (2003)). Las densidades de expresión de CD19 en ratones transgénicos que expresan CD19 human también se han evaluado (Sato et al., J. Immunol., 165:6635-6643 (2000)).

Se cruzaron ratones TG-1+/+ con ratones deficientes en FcR (receptor de Fc) de cadena  común (FcR)-(FcR-/-, B6.129P2-Fcerg1tm1) de Taconic Farms (Germantown, NY) para generar camadas hCD19+/-FcR-/-y TS. También se describieron ratones hemicigóticos para un transgén c-Myc (E-cMycTG, C57B1/6J-TgN(IghMyc); The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) (Harris et al., J. Exp. Med., 167:353 (1988) y Adams et al., Nature, 318:533 (1985)). Se cruzaron ratones c-MycTG (fondo B6/129) con ratones hCD19TG-1+/+ para generar descendencia hemicigótica hCD19TG-1+/-cMycTG+/-determinada por exploración por PCR. Los ratones Rag1-/-(B6.129S7-Rag1tm1Mom/J) fueron de The Jackson Laboratory. Se generaron ratones deficientes en macrófagos mediante inyecciones en la vena de la cola de clodronato encapsulado en liposomas (0,1 ml/10 gramos de peso corporal; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en ratones C57BL/6 en el día -2, 1 y 4 de acuerdo con métodos convencionales (Van Rooijen y Sanders, J. Immunol. Methods, 174:83-93 (1994)). Todos los ratones se alojaron en una instalación de con barrera libre de patógenos específicos y se usaron por primera vez a las 6-9 semanas de edad.

ELISA. Las concentraciones de Ig en el suero se determinaron por ELISA usando IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgA de ratón purificadas por afinidad (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama) para generar las curvas patrón como se ha descrito (Engel et al., Immunity, 03:39 (1995)). Los niveles de autoanticuerpos IgM e IgG en suero contra ADNbc, ADNmc e histona se determinaron por ELISA usando placas de microtitulación recubiertas como se ha descrito (Sato et al., J. Immunol., 157:4371 (1996)) con ADN bicatenario (bc) de timo de ternera (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri), ADN hervido de timo de ternera (que contiene ADN monocatenario (mc))

o histona (Sigma-Aldrich).

Inmunoterapia. Los anticuerpos control de isotipo no reactivo, y anti-CD19 estériles (0,5-250 μg) en 200 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) se inyectaron a través de las venas laterales de la cola. Todos los experimentos usaron 250 g de anticuerpo salvo que se indique otra cosa. Los números de leucocitos en la sangre se cuantificaron mediante hemocitómetro después de lisis de glóbulos rojos, las frecuencias de células B B220+ se determinaron mediante la tinción por inmunofluorescencia con análisis de citometría de flujo. Las dosis de anticuerpos en humanos y ratones se compararon usando la herramienta de Oncología para calcular la dosis (www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm).

Inmunizaciones. Los ratones TS de dos meses se inmunizaron i.p. con 50 μg de 2,4,6-trinitrofenilo (TNP) conjugado a lipopolisacárido (LPS) (Sigma, St. Louis, Missouri) o 25 μg de 2,4-dinitrofenol (DNP) conjugado a FICOLL® (Biosearch Technologies, San Rafael, CA) en solución salina. Los ratones se inmunizaron también i.p. con 100 μg de DNP conjugada a hemocianina de lapa californiana (DNP-KLH, CALBIOCHEM®-NOVABIOCHEM® Corp., La Jolla, California) en adyuvante completo de Freund y se reforzó 21 días más tarde con DNP-KLH en adyuvante incompleto de Freund. Se tomaron muestras de sangre de los ratones antes y después de las inmunizaciones, según se indica. Los títulos de anticuerpos específicos para DNP o TNP en muestras individuales de suero se midieron por duplicado usando placas ELISA recubiertas con DNP-BSA (CALBIOCHEM®-NOVABIOCHEM® Corp., La Jolla, CA) o TNP-BSA (Biosearch Technologies, San Rafael, CA) de acuerdo con métodos convencionales (Engel et al., Immunity, 3:39-50 (1995)). Los sueros de ratones inmunizados con TNP-LPS se diluyeron 1:400, diluyendo los sueros de ratones inmunizados con DNP-FICOLL ® y DNP-BSA 1:1000 para el análisis ELISA.

Estudios en tumor. Se aisló y expandió in vivo tumor espontáneo de ganglio linfático de un ratón hCD19TG-1+/-cmycTG+/-. Se administraron células tumorales (10-5/ratón) i.v. a ratones receptores Rag-/-en el día 0, con mAb FMC63 y de control de isotipo coincidente (250 g/ml) dados i.v. en los días 1 y 7. Se aislaron leucocitos sanguíneos de los ratones receptores semanalmente con la cantidad de células CD19+ B220+ de ratón en circulación cuantificada por tinción inmunofluorescente con análisis de citometría de flujo.

Análisis estadístico. Todos los datos se muestran como las medias ± DTM. Se usó ensayo t de Student para determinar la significancia de las diferencias entre las medias de las muestras.

6.2. Ejemplo 1: Expresión de CD 19 humano en ratones transgénicos

Pueden usarse los ratones transgénicos hCD 19Tg descritos en este documento u otros animales transgénicos que expresen CD 19 humano para evaluar diferentes regímenes terapéuticos que comprenden anticuerpos anti-CD19 humanos, humanizados, o quiméricos, tales como variaciones en la concentración de dosificación, cantidad, o cronología. La eficacia en pacientes humanos de diferentes regímenes terapéuticos puede predecirse usando los dos indiciadores descritos a continuación, es decir, reducción de células B en ciertos fluidos corporales y/o tejidos y la capacidad de un anticuerpo anti-CD19 humano o humanizado monoclonal de unirse a células B. Los regímenes de tratamiento que son eficaces en ratones transgénicos para CD19 humano pueden usarse con las composiciones y anticuerpos para su uso en los métodos de la invención para tratar neoplasias de células B en seres humanos.

Para determinar si CD19 humano se expresaba en células B de ratones transgénicos (hemicigóticos TG-1+/-) que expresan el transgén de CD19 humano, se extrajeron células B de la médula ósea, sangre, bazo y lavado peritoneal de estos ratones. Se evaluó la expresión de CD19 humano y CD19 de ratón en estas células poniendo en contacto las células con anticuerpos anti-CD19 monoclonales de ratón que se unen a CD19. La unión del anticuerpo a las células del linaje B se detectó usando tinción de inmunofluorescencia de dos colores con análisis de citometría de flujo.

Los resultados se muestran en la Fig. 1A en gráficos de la expresión detectada de CD19 murino (mCD19) (eje-x) representado frente a la expresión detectada de CD19 humano (hCD19) (eje-y) para médula ósea (BM), sangre, bazo y lavado peritoneal (PL). Las unidades del eje representan una escala log de cuatro decenas que empieza con 1 en la parte inferior izquierda. El anticuerpo anti-CD19 B4 que se une a CD19 humano (Beckman/Coulter) se usó para visualizar la expresión de CD19 humano y el anticuerpo anti-CD19 1D3 que se une a CD19 de ratón (PharMingen) se usó para visualizar la expresión de CD19 de ratón (también usado para las Fig. 1B y 1C). Aunque la expresión de CD19 humano aumenta de forma creciente durante el desarrollo de células B humanas, CD19 murino se expresa a altos niveles durante el desarrollo de células B de médula ósea de ratón. La Fig. 1A muestra que la expresión de CD19 humano es paralela a la expresión de CD19 de ratón en células B periféricas encontradas en la sangre, el bazo y lavado peritoneal (PL) lo que demuestra que el anticuerpo anti-hCD19 de ratón (que se une a CD19 humano) se une a las poblaciones de células B periféricas. Además, una pequeña población de células B derivadas de médula ósea (BM) expresa CD19 de ratón endógeno pero no CD19 humano (anticuerpo de ratón monoclonal anti-CD19 que se une a CD19 humano). Por tanto, las células B de médula ósea entran dentro de dos categorías en ratones hemicigóticos TG-1+/-, células del linaje B maduras que son hCD19+mCD19+ y células del linaje B menos maduras que son solamente mCD19+ (Fig. 1A). Estos resultados son coherentes con los hallazgos de Zhou et al. (Mol. Cell. Biol., 14:3884-3894 (1994)) que indicaron que la expresión de CD19 humano en estos ratones transgénicos se correlaciona con la maduración de células B. Todas las células B maduras en la sangre, bazo, y cavidad peritoneal eran tanto hCD19+ como mCD19+.

Los niveles de expresión relativa de mCD19 y hCD19, evaluados midiendo la intensidad de fluorescencia media (anti-CD19 de ratón para hCD19 y anti-CD19 de ratón mCD19) respectivamente, se muestran en la Fig. 1B. Entre los ratones TG-1 homocigóticos para el transgén hCD19 (TG-1+/+), la expresión de hCD19 en células B transportadas en la sangre era comparable con la expresión de hCD19 en células B humanas. Para comparar las densidades relativas de expresión de hCD19 y mCD19 en líneas de ratón transgénicas TG-1+/+, TG-1+/-, y TG-2+/+, se extrajeron células B derivadas de la sangre y se ensayaron para la expresión de CD19 como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Fig. 1B en histogramas que muestran el porcentaje de expresión de CD19 humano para células B de sangre humana, células B sanguíneas TG-1+/+, TG-1+/-, y TG-2+/+ de ratones hCD19TG (izquierda) y el porcentaje de expresión de CD19 de ratón para células B de sangre de ratón de tipo silvestre (TS), células B sanguíneas TG-1+/+, TG-1+/-, y TG-2+/+ de ratones hCD19TG (derecha). Los valores (valores lineales de intensidad fluorescente media) representan las densidades relativas medias de la expresión de CD19 (±DTM) en comparación con células B sanguíneas de seres humanos o ratones de tipo silvestre (TS) (mostrado como 100%). Los resultados muestran que en ratones homocigóticos TG-1+/+, las células B sanguíneas expresaban hCD19 a densidades medidas por intensidades de fluorescencia media aproximadamente un 72% mayores que células B sanguíneas humanas. Las células B sanguíneas en ratones TG-1+/+ expresaban hCD19 a densidades similares a células B sanguíneas humanas, mientras que las células B sanguíneas en ratones TG-2+/+ expresaban hCD19 a densidades un 65% inferiores que células B sanguíneas humanas.

Se muestran comparaciones adicionales de las densidades relativas de la expresión de hCD19 y mCD19 en células B de tejidos de ratón TG-1+/-en la Fig. 1C en histogramas que muestran las intensidades de fluorescencia media (MFI±DTM) de anticuerpo anti-CD19 que tiñe células B de médula ósea, sangre, bazo, ganglio linfático, y PL para hCD19 (izquierda) y mCD19 (derecha). Los resultados demuestran que en ratones TG-1+/-, hCD19 se expresaba a niveles crecientes por células B220+ en la médula ósea (63% de niveles en sangre humana) < sangre (100%) < bazo (121%) = ganglio linfático (120%) y < cavidad peritoneal (177%). La expresión de CD19 humano tuvo una pequeña influencia sobre la expresión de mCD19. Los niveles de ARNm para hCD19 y mCD19 no cambiaron.

Para determinar si anticuerpos de ratón anti-hCD19 (que se unen a CD19 humano) de los isotipos IgG1 (HB12a, HB12b, B4), IgG2a (FMC63) e IgG2b (HD237) reaccionan de forma diferente, se aislaron células B220+ de sangre y bazo de ratones TG-1+/-. Las células aisladas se pusieron en contacto in vitro con los anticuerpos mencionados anteriormente anti-CD19 y se evaluaron para su capacidad de unirse a células B de ratón transgénico (hCD 19TG) que expresan CD19 humano usando tinción con anticuerpo monoclonal que se visualizó usando anticuerpos secundarios específicos de isotipo conjugados con PE con análisis de citometría de flujo.

Los resultados se muestran en la Fig. 1D en gráficos de la intensidad de fluorescencia (eje-x) frente a la cantidad relativa de células B (eje-y) para anticuerpos anti-CD19 IgG2b (isotipo murino), IgG2a (isotipo murino), e IgG1 (isotipo murino) a 5 µg/ml. La intensidad de fluorescencia de células B220+ teñidas con anticuerpo anti-CD19 se muestra como líneas continuas y la intensidad de fluorescencia del control de isotipo coincidente (CTL) se muestra como una línea discontinua. Cada anticuerpo alcanzó niveles saturantes de reactividad con células B de bazo a una concentración de 5 µg/ml. Los resultados demuestran que la densidad de unión del anticuerpo anti-CD19 en células B220+ de sangre y bazo de ratones TG-1+/-es uniforme para los isotipos de anticuerpo ensayados y para células B tanto de sangre como de bazo.

Para determinar si las intensidades de fluorescencia media eran independientes del isotipo de anticuerpo anti-CD19, se evaluó la actividad de unión de anticuerpos anti-CD19 individuales (a 5 µg/ml) tiñendo una línea celular pre-B de ratón, 300.19, transfectada con un ADNc de hCD19 usando el mismo anticuerpo secundario anti-Ig de ratón. La tinción con anticuerpo (MFI±DTM) se visualizó usando anticuerpo secundario de ratón específico de Ig conjugado con PE con análisis de citometría de flujo. Los resultados se muestran en la Fig. 1E en un histograma de unión de anticuerpo anti-CD19 (como se muestra por la intensidad de tinción, eje-y) a células 300.19 transfectadas con ADNc de hCD19, para anticuerpos anti-CD19 HB12a, HB12b, B4, FMC63, HD237 y un anticuerpo de control (CTL). Cada anticuerpo tiñó las células con intensidades características de fluorescencia media que fueron independientes del isotipo de anticuerpo anti-CD19, mostrando HB12b los niveles inferiores de tinción y demostrando HD237 los mayores. Por tanto, los resultados mostrados demuestran que las células 300.19 son un sistema in vitro modelo para la comparación de la capacidad de anticuerpos anti-CD19 de unirse a CD19 in vitro.

Por tanto, tomados en conjunto, los resultados mostrados en la Fig. 1 demuestran que ratones hCD 19TG y las células 300.19 representan sistemas modelo apropiados in vitro e in vivo para evaluar la capacidad de anticuerpos anti-hCD19 de unirse a células B cuando se expresa hCD19 sobre un intervalo de densidades.

Las Fig. 1A-D representan resultados obtenidos con ≥3 ratones de cada genotipo.

6.2. Ejemplo 2: Reducción por anticuerpos anti-CD19 de células B in vivo

Se evaluaron anticuerpos anti-CD19 de ratón (que se unen a CD19 humano) para su capacidad de reducir las células B de sangre, bazo, y ganglio linfático en hCD19TG (TG-1+/-) in vivo. Cada anticuerpo se dio a los ratones a 250 o 50 µg/ratón, una única dosis aproximadamente 10 a 50 veces inferior que la dosis de 375 mg/m2 dada cuatro

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hCD19 son inferiores. Por tanto, el tratamiento con anticuerpo contra CD19 reducía las células B1 y B2 peritoneales dependiendo de su densidad de expresión de CD19 evaluado usando intensidad de fluorescencia media, aunque las células B peritoneales eran más resistentes a la reducción mediada por anticuerpo anti-CD19 que las células B de bazo y ganglio linfático.

La Fig. 4C muestra reducción representativa de células B CD5+B220+ B1a y CD5-B220hi B2 siete días después del tratamiento con anticuerpo anti-CD19 o anticuerpo de control de ratones hCD19TG. Los números representan las frecuencias relativas de cada subconjunto de células B dentro de los marcos indicados. Los valores del gráfico de barras representan la cantidad total (±DTM) de cada subconjunto celular dentro del peritoneo de ratones tratados con anticuerpo (≥3 ratones por grupo). Se indican las diferencias significativas entre las medias de muestra; *p<0,05, **p<0,01.

6.3.3. Distintos anticuerpos anti-CD19 median la eliminación de células B

Para determinar si los anticuerpos anti-CD19 HB12a y HB12b son distintos de los anticuerpos anti-CD19 conocidos, se analizó la secuencia de aminoácidos de cada región variable de anticuerpo anti-CD19 usada en este documento (Fig. 5A y 5B, 6A y 6B, 7Ay 7B).

La Fig. 5A representa las secuencias de nucleótidos (SEC ID Nº 1) y de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 2) para secuencias de unión de cadena pesada VH-D-JH del anticuerpo anti-CD19 HB12a. Las secuencias que solapan con el cebador de PCR 5' se indican por doble subrayado y pueden variar de la secuencia real de ADN ya que se usaron cebadores redundantes. Los límites de unión aproximados entre las secuencias V, D, y J se designan en las secuencias por barras verticales (|). Los nucleótidos en letras minúsculas indican cualquier adición de nucleótido en los límites de unión o sitios potenciales para hipermutación somática. El resto aminoterminal del anticuerpo (E) está marcado como resto 1.

La Fig. 5B representa las secuencias de nucleótidos (SEC ID Nº 3) y de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 4) para secuencias de unión de cadena pesada VH-D-JH del anticuerpo anti-CD19 HB12b. Las secuencias que solapan con el cebador de PCR 5' se indican por doble subrayado y pueden variar de la secuencia real de ADN ya que se usaron cebadores redundantes. Los límites de unión aproximados entre las secuencias V, D, y J se designan en las secuencias por barras verticales (|). Los nucleótidos en letras minúsculas indican cualquier adición de nucleótido en los límites de unión o sitios potenciales para hipermutación somática. El resto aminoterminal del anticuerpo (E) está marcado como resto 1.

La Fig. 6A representa la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 15) y de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 16) para secuencias de unión de cadena ligera V-J del anticuerpo anti-CD19 HB12a. La Fig. 6B representa las secuencias de nucleótidos (SEC ID Nº 17) y de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 18) para las secuencias de unión de cadena ligera V-J del anticuerpo anti-CD19 HB12b. El aminoácido aminoterminal de la proteína secretada madura deducida por análisis de secuencia de aminoácidos está numerado como número 1. Las secuencias que solapan con el cebador de PCR 3' se indican por doble subrayado. Los límites de unión predichos para las regiones V-J-C están indicados (/) representando los nucleótidos de la región J sitios potenciales para hipermutación somática en negrita.

Las Fig. 7A y 7B representan la alineación de secuencia de aminoácidos de anticuerpos publicados anti-CD19 de ratón. La Fig. 7A muestra una alineación de secuencia para secuencias de unión de cadena pesada VH-D-JH incluyendo una secuencia consenso (SEC ID Nº 5), HB12a (SEC ID Nº 2), 4G7 (SEC ID Nº 6), HB12b (SEC ID Nº 4), HD37 (SEC ID Nº 7), B43 (SEC ID Nº 8), y FMC63 (SEC ID Nº 9). La numeración y designación de aminoácidos de los orígenes de las secuencias codificantes para cada región de anticuerpo V, D, y J son de acuerdo con métodos convencionales (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological. Interest., U.S. Government Printing Office, Bethesda, MD (1991)) donde las posiciones de aminoácido 1-94 y las regiones determinantes de complementariedad CDR1 y 2 están codificadas por un gen VH. Los guiones indican un hueco insertado en la secuencia para maximizar la alineación de secuencias similares de aminoácidos. Los puntos indican identidad entre cada anticuerpo anti-CD19 y la secuencia consenso de aminoácidos para todos los anticuerpos. Las regiones CDR están resaltadas por motivos de claridad. La Fig. 7B muestra el análisis de secuencia de aminoácidos de cadena ligera V de anticuerpos anti-CD19. La secuencias consenso (SEC ID Nº 10), HB12a (SEC ID Nº 16); HB12b (SEC ID Nº 18); HD37 (SEC ID Nº 11), B43 (SEC ID Nº 12), FMC63 (SEC ID Nº 13), y 4G7 (SEC ID Nº 14) están alineadas. La numeración y designación de aminoácidos de los orígenes de la secuencia codificante para cada anticuerpo anti-CD19 es de acuerdo con métodos convencionales (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest., U.S. Government Printing Office, Bethesda, MD). El aminoácido detrás del sitio de escisión de la secuencia señal predicha está numerado 1. Los guiones indican un hueco insertado en la secuencia para maximizar la alineación de secuencias similares de aminoácidos. Las regiones CDR están resaltadas (recuadro) por motivos de claridad.

Como cada anticuerpo anti-CD19 examinado en este estudio redujo cantidades significativas de células B in vivo, la secuencia de aminoácidos de cada región variable de anticuerpo anti-CD19 se evaluó para determinar si estos anticuerpos diferían en secuencia y se unían potencialmente a diferentes epítopos CD19. Los anticuerpos se unen a antígenos diana a través de interacciones moleculares que están mediadas por aminoácidos específicos dentro de

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las regiones variables de cada molécula de anticuerpo. Por tanto, las complejas interacciones entre antígenos proteicos y los anticuerpos que se unen a epítopos específicos en estos antígenos son casi únicas para cada anticuerpo y su secuencia específica de aminoácidos. Este nivel de complejidad en las interacciones de antígeno y anticuerpo es un reflejo de un diverso repertorio de anticuerpos para la mayoría de antígenos proteicos. Aunque las interacciones de los anticuerpos con los antígenos diana están principalmente mediadas por aminoácidos dentro de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de moléculas de anticuerpo, también son críticos los aminoácidos flanqueantes para la actividad de unión a antígeno. Por tanto, anticuerpos estructuralmente similares probablemente se unen a los mismos antígenos o región de una molécula diana, mientras que anticuerpos estructuralmente distintos con diferentes regiones V y CDR probablemente interaccionan con diferentes regiones de antígenos a través de diferentes interacciones moleculares.

Como los anticuerpos que interaccionan con y se unen a la misma región molecular (o epítopo) de un antígeno diana son estructuralmente similares por definición, se compararon las secuencias de aminoácidos de HB12a, HB12b, FMC63 y otros anticuerpos publicados anti-CD19 incluyendo los anticuerpos HD37 (Kipriyanov et al., J. Immunol. Methods, 196:51-62(1996); Le Gall et al., FEBS Letters, 453:164-168 (1999)), 2G7 (Meeker et al., Hybridoma, 3:305320 (1984); Brandl et al., Exp. Hematol., 27:1264-1270 (1999)), y B43 (Bejcek et al., Cancer Res., 55:2346-2351 (1995)). Las cadenas pesadas de los anticuerpos anti-CD19 se generaron a través de diferentes combinaciones de segmentos génicos V(D)J con las regiones V derivadas de los segmentos génicos V1S39, V1S56, V1S136, o V2S1, regiones D derivadas de segmentos génicos FL16.1, y regiones J derivadas de segmentos génicos J2 o J4 (Tabla 2). Las regiones variable de cadena pesada y ligera publicadas de los anticuerpos B43 y HD37 eran casi idénticas en secuencia de aminoácidos (Fig. 7A-B). Este nivel de conservación refleja el hecho de que cada uno de estos anticuerpos también es remarcadamente similar a nivel nucleotídico, teniendo uniones VH(D)JH y VLJL idénticas, con las mayores diferencias justificadas por el uso de cebadores redundantes para amplificar por PCR cada secuencia de ADNc. Esto indica que los anticuerpos HD37 y B43 comparten un origen común, sino idéntico, y por lo tanto se unen a epítopos idénticos en la proteína CD19. Los anticuerpos HB12a y 4G7 también eran distintos de otros anticuerpos anti-CD19. Aunque las regiones de cadena pesada de los anticuerpos HB12a y 4G7 son similares y probablemente han derivado de los mismos segmentos génicos VH(D)JH de la línea germinal, se usaron diferentes límites de unión para el ensamblaje D-JH (Fig. 7A). El anticuerpo HB12b utilizó un segmento génico VH distinto (Tabla 2) y obtuvo secuencias CDR3 netamente diferentes (Fig. 7A) de los otros anticuerpos anti-CD19. El anticuerpo FMC63 también obtuvo una secuencia de aminoácidos muy distinta de los otros anticuerpos anti-CD19.

Tabla 2

Cadena pesada

Cadena ligera

Va

D J Nº de accesob V J Nº de acceso

V1-133*

J2*

HB12a

V1S136 (12,8) FL16.1 J2 01 01 J4 *

HB12b 4G7

V1S56 (27,14) V1S136 (10,8) FL16.1 F16.1 J2 J2 AJ555622 V3-2*01 V2-137 01 J5 AJ555479

B43 HD37 FMC63

V1S39 (37,17) V1S39 (34,16) V2S1 (20,16) FL16.1 FL16.1 FL16.1 J4 J4 J4 S78322 X99230 Y14283 V3-4 V3-4 V10-96 J1 J1 J2 S78338 X99232 Y14284

N.D., no determinado.

aLos números entre paréntesis indican el número de diferencias de nucleótidos entre el gen que codifica el

anticuerpo contra CD19 y la secuencia más homóloga de la línea germinal identificada en bases de datos

actuales, excluyendo regiones solapantes con los cebadores de PCR.

bNúmeros de acceso a GENBANK® para secuencias génicas.

Como se muestra en la Fig. 7B, los anticuerpos HB12a, HB12b, FMC63, 4G7, y HD37/B43 utilizan cada uno distintos genes de cadena ligera (Fig. 7B). Se generaron cadenas ligeras a partir de múltiples segmentos génicos V y J. La ausencia de homogeneidad entre estas seis secuencias de cadena H y L de anticuerpos anti-CD19 sugiere que estos anticuerpos se unen a varios sitios distintos en CD19 humano. Una comparación de secuencias de aminoácidos de cadenas pesada y ligera emparejadas indica adicionalmente que la mayoría de estos anticuerpos anti-CD19 son estructuralmente distintos y por lo tanto se unirán a CD19 humano a través de diferentes interacciones moleculares. Por tanto, la capacidad de los anticuerpos anti-CD19 de reducir las células B in vivo no está restringida a una cantidad limitada de anticuerpos que se unan a CD19 en sitios idénticos, sino que es una propiedad general de los anticuerpos anti-CD19 como una clase.

6.3.4. La densidad de CD19 influye en la eficacia de la reducción de células B inducida por anticuerpo contra CD19

Para determinar si la capacidad de un anticuerpo anti-CD19 de reducir células B es dependiente de la densidad de CD19, se administraron los anticuerpos anti-CD19 HB 12b y FMC63 a ratones que tenían niveles variables de expresión de CD19. Los resultados demuestran que la densidad de CD19 humano en células B y el isotipo de anticuerpo pueden influir en la reducción de células B en presencia de un anticuerpo anti-CD19. Puede usarse el mismo ensayo para determinar si otros anticuerpos anti-CD19 pueden reducir de forma eficaz las células B y los resultados pueden correlacionarse con el tratamiento de pacientes humanos con niveles variables de expresión de

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tiene efectos más drásticos sobre las cantidades de células B en ratones tratados con clodronato. Asimismo, el tratamiento con anticuerpo anti-CD19 y anti-CD20 disminuyó las cantidades de células B220+ en médula ósea en un 55% en ratones tratados con clodronato en el día 7 respecto a camadas tratadas con anticuerpo de control, mientras que el tratamiento con anticuerpo anti-CD19 disminuyó las cantidades de células B220+ en médula ósea en un 88% en ratones tratados con PBS. El tratamiento con anticuerpo anti-CD19 disminuyó las cantidades de células B de bazo en un 52% en ratones tratados con clodronato en el día 7 respecto a camadas tratadas con anticuerpo de control, mientras que el anticuerpo anti-CD20 redujo las células B mínimamente, y el tratamiento con anticuerpo anti-CD19 disminuyó las cantidades de células B de bazo en un 89% en ratones tratados con PBS. El tratamiento tanto con anticuerpo anti-CD19 como anticuerpo anti-CD20 disminuyó las cantidades de células B en ganglio linfático en un 48-53% en ratones tratados con clodronato en el día siete respecto a camadas tratadas con anticuerpo de control, mientras que el tratamiento con anticuerpo anti-CD19 disminuyó las cantidades de células B en ganglio linfático en un 93% en ratones tratados con PBS. En la sangre, el bazo y los ganglios linfáticos, el tratamiento con anticuerpo anti-CD19 fue significativamente menos eficaz en ratones tratados con clodronato que en camadas tratadas con PBS (p<0,01). Estos hallazgos implican a los macrófagos como células efectoras principales para la reducción de células B CD19+ y CD20+ in vivo, e indican que la terapia con anticuerpo anti-CD19 puede ser más eficaz que la terapia con anticuerpo anti-CD20 cuando están reducidas las cantidades o la función de los monocitos.

6.4. Ejemplo 4: La reducción de células B inducida por anticuerpo anti-CD19 es duradera

Para evaluar la eficacia y duración de la reducción de células B, a los ratones hCD19TG se les administró una única inyección de dosis baja de 250 g de anticuerpo anti-CD19. Las Fig. 10A-10C demuestran la duración y respuesta a dosis de la reducción de células B después de tratamiento con anticuerpo anti-CD19.La Fig. 10A muestra las cantidades de células B de sangre B220+ y células T Thy-1+ después de tratamiento con anticuerpo FMC63 o de control de isotipo de ratones TG-1+/-en el día cero. Los valores representan resultados medios (±DTM) de seis ratones en cada grupo. Los resultados demuestran que las células B en circulación se reducían durante 13 semanas con una recuperación gradual de las células B transportadas en la sangre sobre las siguientes 13 semanas. La representación de células T Thy-1+ no estuvo alterada como resultado del tratamiento anti-CD19.

Las Fig. 10B-10C muestran la reducción representativa de células B tisulares en los ratones mostrados en la Fig. 10A a las 11, 16, y 30 semanas después de tratamiento con anticuerpo. Los números indican el porcentaje de linfocitos B220+ dentro de los marcos indicados. Los resultados de la Fig. 10B muestran que la médula ósea, la sangre, el bazo, el ganglio linfático, y la cavidad peritoneal estaban esencialmente desprovistos de células B 11 semanas después del tratamiento con anticuerpo (se indican las diferencias significativas entre las medias de muestra; *p<0,05, **p<0,01). Después de la primera aparición de células B en circulación, las cantidades de células B en circulación tardaron >10 semanas adicionales en alcanzar el intervalo normal. En la semana 16 después del tratamiento con anticuerpo, las cantidades de células B en sangre, bazo, LN y PL habían comenzado a recuperarse mientras que el compartimiento de células B en BM no fue significativamente diferente de los controles no tratados como se muestra en la Fig. 10C. En la semana 30, todos los tejidos estaban repoblados con células B a niveles comparable a los de controles normales.

La Fig. 10D muestra las respuestas a dosis de anticuerpo anti-CD19 para la reducción de células B de sangre, médula ósea y bazo. Los ratones se trataron con anticuerpos anti-CD19 en el día cero con la representación de células B tisulares evaluada en el día siete. Los resultados representan los obtenidos con tres ratones en cada grupo para cada dosis de anticuerpo. Las dosis de anticuerpo de control fueron de 250 g. Se indican las diferencias significativas entre las medias de muestra; *p<0,05, **p<0,01. Una única dosis de anticuerpo FMC63 tan baja como 2 g/ratón redujo cantidades significativas de células B en circulación, mientras que fueron necesarios 10 g del anticuerpo HB12b para reducir significativamente las cantidades de células B en circulación (Fig. 10D). La reducción significativa de células B en médula ósea y bazo en el día siete requirió dosis de anticuerpo 5 veces mayores de 1050 g/ratón. Por tanto, el tratamiento con anticuerpo contra CD19 a dosis relativamente bajas puede reducir la mayoría de las células B en circulación y tejido durante periodos significativos de tiempo.

6.5.1. CD19 persiste en la superficie de células B después de la administración de anticuerpo anti-CD19

Se evaluó si la internalización de CD19 influía en la reducción de células B in vivo comparando la expresión en superficie celular de CD19 después de tratamiento con anticuerpo HB12a, HB12b y FMC63 (250 g).

Las Fig. 11A-11C muestran la expresión en superficie celular de CD19 y la eliminación de células B en ratones TG1+/-tratados con anticuerpo HB12a (Fig. 11A), HB12b (Fig. 11B), FMC63 (Fig. 11C) o de control de isotipo coincidente (250 g) in vivo. A tiempo cero (antes de la administración de anti-CD19), y a las 1, 4, y 24 horas después del tratamiento con anticuerpo, se recogieron y evaluaron células B de bazo para la unión de anticuerpo a CD19 (línea gruesa) y de control (línea delgada) tratando las células con anticuerpo secundario específico de isotipo in vitro con análisis de citometría de flujo. Las células B aisladas también se trataron in vitro con concentraciones saturantes de cada anticuerpo contra CD19 más anticuerpo secundario específico de isotipo in vitro con análisis de citometría de flujo para visualizar la expresión total en superficie celular de CD19. Cada punto temporal representa resultados con un ratón. Los resultados presentados en las Fig. 11A-11C demuestran que CD19 de superficie celular no se elimina de la superficie celular después de la unión del anticuerpo in vivo y muestran que la mayoría de las células B de bazo expresaban niveles altos uniformes de hCD19 de superficie celular durante hasta 24 horas después del tratamiento con anticuerpo aunque un subconjunto de células B expresaba niveles reducidos de hCD19 a 1 hora después del tratamiento con anticuerpo FMC63 (Fig. 11C). Los resultados mostrados en las Fig. 11A-11C también demuestran que la cantidad de CD19 sobre la superficie de células B es constante, lo que indica que se mantiene la capacidad de las células B de mediar la ADCC.

Los resultados demuestran que CD19 mostraba sorprendentemente niveles de internalización inferiores de lo esperado después de la administración de anticuerpos anti-CD19. En particular, los resultados demuestran que CD19 persiste inesperadamente sobre la superficie celular después de la unión de un anticuerpo anti-CD19, por tanto, la célula B permanece accesible para la actividad ADCC. Estos resultados demuestran, en parte, porqué los anticuerpos anti-CD19 y regímenes de tratamiento de la invención son eficaces en tratar neoplasias de células B.

Las Fig. 12A-12C documentan el grado de reducción de células B y la capacidad de los anticuerpos anti-hCD19 de unirse a hCD19 y por tanto de inhibir la unión de otros anticuerpos anti-hCD19. Los resultados de la Fig. 12A demuestran que una única administración de FMC63 (250 g) a ratones TG-1+/-provoca reducción significativa de células B tanto de sangre como de bazo en 1 hora de administración de anticuerpo. En este experimento, se recogieron y evaluaron células de sangre y bazo para las frecuencias de células B antes de la administración de anticuerpo anti-CD19 o en diversos momentos después de ello (1, 4, o 24 horas). Las muestras de sangre se tiñeron con anti-Thy1.2 y anti-B220 para identificar las células B en el cuadrante derecho inferior. Las células de bazo se tiñeron con anticuerpos anti-IgM y anti-B220 para identificar las células B dentro del marco indicado. Cada punto temporal representa los resultados con un ratón. Inesperadamente, se eliminaron las células B de sangre más rápidamente que las células B esplénicas.

La reducción de células B descrita en la Fig. 12A sugirió que el anticuerpo administrado saturaba rápidamente los sitios disponibles de unión a anticuerpo en hCD19 en una hora de administración. Para confirmar esta observación, los ratones se trataron con anticuerpo FMC63 (anticuerpo de unión a hCD19) o de control de isotipo. En diversos momentos después de ello se tiñeron células B de sangre y bazo con el anticuerpo B4 conjugado con fluorocromo para identificar los sitios de unión a anticuerpo no ocupados en la superficie de células B mCD19+ o mCD20+. Se indican las frecuencias de células dentro de los cuadrantes derecho inferior y superior. Cada punto temporal representa los resultados obtenidos de un ratón. Los resultados indican que el tratamiento con FMC63 provocó una reducción progresiva de células que albergan hCD19 sobre el curso del experimento siendo las células B sanguíneas reducidas más rápidamente que las de bazo. Las células B que permanecían en cada punto temporal pudieron identificarse por su expresión de mCD19 o mCD20, pero no se tiñeron por B4 lo que sugiere que el FMC63 administrado se unía a las células B restantes. Este hallazgo confirma la capacidad de FMC63 de unirse y reducir las células B in vivo. Además, FMC63 evita la unión de B4 lo que sugiere que estos anticuerpos reconocen epítopos solapantes en hCD19. Los resultados de la Fig. 12C confirman que el tratamiento con anticuerpo HB12b (250 g) también satura los sitios de unión a anticuerpo en hCD19 en 1 hora de administración y provoca la reducción de células B hCD19 positivas. Inesperadamente, el anticuerpo HB12b no inhibió completamente la unión del anticuerpo B4 lo que sugiere que a diferencia de FMC63, HB12b reconoce un epítopo en hCD19 que es distinto del reconocido por B4. Los resultados mostrados en las Fig. 12B-12C demuestran que la mayoría de los anticuerpos anti-CD19 inhiben la unión de la mayoría de los demás anticuerpos anti-CD19, lo que indica que la mayoría de los anticuerpos anti-CD19 se unen a regiones o epítopos similares, los mismos, o solapantes en la proteína CD19. Como alternativa, estas observaciones también puede resultar del tamaño relativamente pequeño del dominio extracelular de CD19 en comparación con el tamaño de las moléculas de anticuerpo.

6.6. Ejemplo 5: El tratamiento con anticuerpo anti-CD19 anula la inmunidad humoral y la autoinmunidad

Los ensayos descritos en este ejemplo pueden usarse para determinar si un anticuerpo anti-CD19 es capaz de eliminar o atenuar las respuestas inmunes. Los anticuerpos anti-CD19 identificados en estos ensayos pueden usarse para diseñar por ingeniería anticuerpos anti-CD19 quiméricos, humanos o humanizados usando las técnicas descritas anteriormente en la Sección 5.1. Dichos anticuerpos pueden usarse, a su vez, en las composiciones y para su uso en los métodos de la invención para el tratamiento de neoplasias de células B en seres humanos.

Se evaluó el efecto de la reducción de células B inducida por anticuerpo anti-CD19 sobre los niveles séricos de anticuerpos dando a ratones hCD19TG+/-una única inyección de anticuerpo anti-CD19. La Fig. 13A muestra que el tratamiento con anticuerpo contra CD19 reduce los niveles séricos de inmunoglobulina en ratones TG-1+/-. Se trataron camadas de dos meses de edad con una única inyección de anticuerpo FMC63 (círculos cerrados) o de control (círculos abiertos) (250 g) en el día 0. Se determinaron los niveles de anticuerpo por ELISA, con valores medios (±DTM) mostrados para cada grupo de ≥ 5 ratones. Las diferencias entre los ratones tratados con mAb contra CD19 o de control fueron significativas; *p<0,05, **p<0,01. Los resultados muestran que después de 1 a 2 semanas, los niveles séricos de anticuerpo IgM, IgG2b, IgG3, e IgA estaban significativamente reducidos, y permanecían reducidos durante al menos 10 semanas (Fig. 13A). Los niveles séricos de IgG1 e IgG2a estaban significativamente por debajo de lo normal a las 6 y 4 semanas después del tratamiento.

Como los ratones hCD19TG+/-producen autoanticuerpos detectables después de 2 meses de edad (Sato et al., J. Immunol, 157:4371(1996)), se evaluó la unión de autoanticuerpos séricos a ADNmc, ADNbc e histonas. La Fig. 13B muestra que el tratamiento con anticuerpo anti-CD19 reduce los niveles de autoanticuerpos anti-ADNbc, anti-ADNmc y anti-histona después de tratamiento con anticuerpo anti-CD19. Los resultados muestran que el tratamiento con anticuerpo anti-CD19 reducía significativamente los niveles séricos de autoanticuerpos IgM después de 2 semanas y evitaba la generación de autoanticuerpos IgG de isotipo cambiado durante hasta 10 semanas (Fig. 13B). Por tanto, la reducción de células B redujo sustancialmente las respuestas agudas y a largo plazo de anticuerpos y atenuó el cambio de clase de respuestas inmunes normales y patogénicas.

Se evaluó la influencia de la reducción de células B en respuestas de anticuerpos tipo 1 (TI-1) y tipo 2 (TI-2) independientes de células T inmunizando ratones hCD19TG+/-con TNP-LPS o DNP-Ficoll (en el día cero), 7 días después de tratamiento con anticuerpo anti-CD19 (FMC63) o anticuerpo de control. No se observaron respuestas significativas de anticuerpos IgM, IgG, e IgA específicos de hapteno en ratones tratados con anticuerpo anti-CD19 inmunizados con cualquier antígeno (Fig. 14A y 14B). También se evaluaron las respuestas de anticuerpos contra el Ag dependiente de células T (TD), DNP-KLH, usando ratones tratados con anticuerpo anti-CD19 7 días antes de la inmunización (Fig. 14B). La Fig. 14C muestra que ratones inmunizados con DNP-KLH tratados con anticuerpo anti-CD19 mostraban inmunidad humoral reducida. Las camadas se trataron con anticuerpo FMC63 (círculos cerrados) o de control (círculos abiertos) (250 g) siete días antes de las inmunizaciones primarias en el día cero, con suero obtenido en el día indicado. Para inmunizaciones con DNP-KLH, todos los ratones se expusieron con 100 g de DNP-KLH en el día 21. Todos los valores son unidades de DO ELISA medias (±DTM) obtenidas usando sueros de cinco ratones de cada grupo. Las diferencias entre los ratones tratados con anticuerpo anti-CD19 o de control fueron significativas; *p<0,05, **p<0,01. Los resultados muestran que las camadas tratadas con anticuerpo de control generaban respuestas primarias de anticuerpo IgM 7 días después de inmunización con DNP-KLH y respuestas secundarias después de la exposición a antígeno en el día 21 (Fig. 14C). Sin embargo, no se detectaron respuestas significativas de anticuerpos IgM, IgG o IgA específicos de hapteno en ratones tratados con mAb contra CD19 inmunizados o re-expuestos con antígenos. Para evaluar el efecto de la reducción de células B sobre las respuestas secundarias de anticuerpo, los ratones también se inmunizaron con DNP-KLH y se trataron con anticuerpo anti-CD19 14 días después (flechas) (Fig. 14D). En el día 21, las respuestas de anticuerpos séricos IgM, IgG, y IgA anti-DNP habían disminuido en ratones tratados con mAb contra CD19 hasta niveles por debajo de los de ratones inmunizados tratados con mAb de control. Sin embargo, la re-exposición de ratones tratados con mAb de control con DNP-KLH en el día 21 indujo respuestas secundarias significativas de anticuerpo, mientras que los ratones tratados con mAb contra CD19 no produjeron anticuerpos anti-DNP después de re-exposición a DNP-KLH. Por tanto, la reducción de células B inducida por mAb contra CD19 redujo sustancialmente las respuestas tanto primarias como secundarias de anticuerpo y evitó el cambio de clase durante respuestas inmunes humorales.

6.7. Ejemplo 6: Tratamiento con anticuerpo anti-CD19 junto con tratamiento con anticuerpo anti-CD20

Puede usarse el ensayo descrito en este documento para determinar si otras terapias de combinación o conjugado, por ejemplo, anticuerpos anti-CD19 en combinación con quimioterapia, terapia con toxinas o radioterapia, tienen efectos beneficiosos, tales como reducción aditiva o más que aditiva de células B. Los resultados de las terapias de combinación ensayadas en modelos animales pueden correlacionarse con seres humanos por medios bien conocidos en la técnica.

Los anticuerpos anti-CD20 son eficaces en reducir las células B humanas y de ratón in vivo. Por lo tanto, se evaluó el beneficio de tratamiento simultáneo con anticuerpos anti-CD19 (FMC63) y anti-CD20 (MB20-11) para determinar si esto potenciaba la eliminación de células B. Los ratones se trataron con dosis subóptimas de 2 g de cada anticuerpo individualmente, o una combinación de ambos anticuerpos a 1 g, o con dosis combinadas de 2 g. La Fig. 15 muestra los resultados de ratones TG-1+/-tratados con anticuerpos de control (250 g), FMC63 (CD19, 2 g), MB20-11 (CD20, 2 g), FMC63+MB20-11 (1 g cada uno), o FMC63+MB20-11 (2 g cada uno) en el día cero. Se midieron las cantidades de células B en sangre a tiempo cero, una hora, y en los días uno, cuatro y siete. Las cantidades de células B tisulares se determinaron en el día siete. Los valores representan la media (±DTM) de grupos de tres ratones. Los resultados mostrados en la Fig. 15 demuestran que las tratamientos simultáneos con anticuerpo anti-CD 19 y anti-CD20 son beneficiosos. La reducción de células B en ratones tratados con una combinación de ambos anticuerpos a 1 g fue intermedia o similar a la reducción observada después del tratamiento de los ratones con 2 g de cada anticuerpo individual (Fig. 15). Sin embargo, el tratamiento simultáneo de los ratones con ambos anticuerpos a 2 g condujo a significativamente más reducción de células B que lo observado con cualquier anticuerpo solo. Por tanto, las terapias combinadas de anticuerpo anti-CD 19 y anti-CD20 tuvieron efectos beneficiosos que potenciaron la reducción de células B. Esto probablemente resulta de la acumulación de moléculas de anticuerpo más terapéuticamente eficaces sobre la superficie de células B individuales.

6.8. Ejemplo 7: La administración subcutánea (s.c.) de anticuerpo anti-CD19 es terapéuticamente eficaz

Puede usarse el ensayo descrito en este documento para determinar si una vía subcutánea de administración de un anticuerpo anti-CD19 puede reducir de forma eficaz las células B. Los resultados de la eficacia de diferentes vías de

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