ES2552218T3

ES2552218T3 - Oligosacáridos de algina y derivados de los mismos, así como fabricación y uso de los mismos

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Publication number: ES2552218T3
Application number: ES05706657.3T
Authority: ES
Inventors: Meiyu Geng; Xianliang Xin; Guangqiang Sun
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2004-03-24
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2015-11-26
Anticipated expiration: 2025-02-25
Also published as: ZA200608813B; NO341226B1; BRPI0509217A; NO20064825L; BRPI0509217B8; EP1736160A4; BRPI0509217B1; HUE028071T2; EA011417B1; MA28971B1; KR100844918B1; US20150105344A1; CA2561873C; US8835403B2; US9493496B2; JP2007530718A; US10213456B2; UA85226C2; PT1736160E; WO2005089776A1

Abstract

Derivados del oligosacárido de alginato de acuerdo con la siguiente fórmula (II), o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en los que el oligosacárido de alginato está compuesto por ácido β-D-manurónico unido mediante enlaces α-1,4 glucosídicos:**Fórmula** en la que n representa 0 o un número entero de 1 a 19.

Description

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energético de las neuronas del cerebro. Sin embargo, su actividad aumenta considerablemente tras el tratamiento con el oligosacárido de alginato a tres diferentes dosificaciones, en el que la actividad aumenta significativamente tras el tratamiento con 60 mg/kg en el hipocampo en comparación con la HBY, indicando que la mejora del nivel del metabolismo energético en el cerebro puede ser uno de los mecanismos del oligosacárido de alginato para proteger las funciones cerebrales y como anti-EA. Los resultados se muestran en la tabla 12.

Tabla 12 Efectos del 6-mero sobre la actividad Na+, K+-ATPasa en el córtex cerebral y el hipocampo en ratones con EA inducida por la Aβ1-40 (n = 10,x ± SE)

Actividad ATPasa (µmol Pi/mg prot. /hora)

Grupo Dosis (mg/kg)

córtex cerebral hipocampo Control -1,06 ± 0,05 2,65 ± 0,38 Modelo -0,89 ± 0,06# 1,62 ± 0,17# 6-mero 15 1,08 ± 0,06* 2,10 ± 0,29 30 1,09 ± 0,08* 2,07 ± 0,23 60 1,08 ± 0,05* 2,52 ± 0,25* HBY 0,2 0,91 ± 0,05 2,35 ± 0,43

# P < 0,05 vs control; * P < 0,05 vs modelo

5.2 Efectos protectores del 6-mero sobre las neuronas dañadas por la Aβ in vitro

Se cultivan neuronas primarias de córtex cerebral de ratas como método de referencia (Banker GA, et al., "Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture" Brain Res, 1977, 126: 397-425). Se usan en este experimento células cultivadas durante 1 semana. Es decir, el 8º día las células se pretratan con una serie de concentraciones de 6-mero (concentración final de 0, 10, 50, 100 µg/ml) durante 24 h, seguido de la adición de Aβ25-35 envejecida (disuelta previamente en agua destilada con una concentración de 1 mg/ml, mantenida después a 37 °C durante 7 días para obtener Aβ25-35 envejecida, y almacenada a -20 °C hasta su uso) con una concentración final de 30 µM. Después de 24 h a 37 °C, se añaden 10 µl de MTT con una concentración de 5 mg/ml. Después de 4 h a 37 °C, el sobrenadante se retira y se añaden 150 µl de DMSO. Después se registra la absorbancia a 570 nm (630 nm como referencia) con un lector de ELISA (Rainbow, TECAN, Austria).

Se descubre que después de incubar las neuronas primarias con Aβ25-35 envejecida 30 µM, la reducción del MMT disminuye considerablemente y la tasa de supervivencia de las células se reduce significativamente hasta 54,5 ± 8,9 % (P < 0,001) tras el tratamiento con Aβ25-35 envejecida. El 6-mero a dosificaciones de 10, 50, 100 µg/ml podría aumentar considerablemente las células supervivientes dañadas por la Aβ25-35 de un modo dependiente de la dosis (la tasa de supervivencia es del 72,0 ± 11,2 %, 77,1 ± 8,1 % y 82,3 ± 11,6 % respectivamente).

El 6-mero tiene efectos protectores similares sobre la línea de células neuronales SH-SY5Y como en las neuronas primarias. Las SH-SY5Y dañadas por la Aβ25-35 envejecida 30 µM (Fig. 7) y la Aβ1-40 2 µM (Fig. 8) durante 48 h podrían inducir una serie de cambios, por ejemplo, un daño a las células, una reducción del número de células, la aparición de algunas células redondeadas y células en suspensión. Asimismo, la tasa de supervivencia de las células se reduce al 73,3 ± 9,4 % y al 64,1 ± 2,5, respectivamente. Sin embargo, el oligosacárido de alginato a una dosificación de 50 y 100 µg/ml podría inhibir significativamente la neurotoxicidad de la Aβ, por ejemplo, la aparición de células en suspensión se reduce y la tasa de supervivencia aumenta.

Los experimentos anteriores revelan que el 6-mero podría acortar la latencia de escape e incrementar el número de cruces de la placa original y acortar el tiempo de llegada a la placa original en ratones con EA inducida por la Aβ1-40, lo que implica su actividad de mejora del comportamiento en ratones tratados con la Aβ. Este resultado in vivo, así como los efectos protectores in vitro sobre neuronas primarias y líneas de células neuronales, sugieren que el 6mero tiene actividad anti-EA.

6 Estudio del mecanismo de acción del 6-mero sobre la EA

6.1 Efectos del 6-mero sobre la apóptosis de la línea celular SH-SY5Y inducida por la Aβ25-35

Se incuban células SH-SY5Y en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 x 105 células por pocillo. Un día después de disponerlas en las placas, las células se pretratan con concentraciones variables (0, 50, 100 µg/ml) de 6-mero durante 24 h, seguido de la adición de Aβ25-35 envejecida 30 µM (comprada a Sigma Co.). Al cabo de 48 h a 37 °C, las células se digieren, se recogen, se lavan, se centrifugan a 1200 rpm y se incuban con 200 ml de una mezcla de 5 mg/ml de yoduro de propidio (Hyclone Co.) y 100 U/ml de RNasa (Hyclone Co.). A continuación, las células se miden mediante citometría de flujo (BD Co., EE.UU.), con 8000 células por muestra.

Se descubre que las células SH-SY5Y estimuladas con la Aβ25-35 envejecida 30 µM durante 48 h muestran un 24,8 ± 1,9 % de células hipodiploides. Sin embargo, el pretratamiento con 50 y 100 µg/ml de 6-mero durante 24 h suprime

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significativamente la apóptosis inducida por la Aβ25-35 envejecida, y los porcentajes observados de células hipodiploides son del 10,2 ± 1,3 % y 5,1 ± 0,7 %, respectivamente. Además, se descubre que el 6-mero detiene también significativamente la cascada apóptotica invirtiendo la sobrecarga de ion calcio intracelular y la acumulación de ROS, y regulando a la alza la expresión de la Bcl-2 y regulando a la baja la expresión de la P53 y la Caspasa-3 inducida por la Aβ. Todos estos factores contribuyen al potencial terapéutico del 6-mero en el tratamiento de la EA.

6.2 Mecanismo molecular del 6-mero sobre la toxicidad anti-neuronal de la Aβ

(1) Efectos del 6-mero sobre la formación de fibrillas de Aβ1-40

Se incuba Aβ1-40 fresca sola o con el 6-mero (concentración final de 10, 50, y 100 µg/ml, respectivamente) a 37 °C durante 24 h. Tras la incubación, se añade Th-T y se controla la intensidad de la fluorescencia a Em = 450 nm y Ex = 480 nm.

Los resultados muestran que el 6-mero (a una dosificación de 10, 50, y 100 µg/ml) puede inhibir la acumulación de la Aβ1-40, siendo el efecto inhibidor de 100 µg/ml de 6-mero el más obvio. La intensidad de la fluorescencia es de 10,46 ± 0,94, 9,18 ± 1,32 y 7,81 ± 1,38 (p < 0,05, 0,05 y 0,001, respectivamente), respectivamente. Se estudian los mismos efectos del 6-mero sobre la formación de fibrillas de Aβ1-40 con un TEM (Fig. 9), indicando que el 6-mero puede inhibir significativamente la formación de fibrillas de Aβ1-40. Asimismo, se descubre que el 6-mero muestra un efecto inhibidor significativo sobre la formación de fibrillas de Aβ1-40 facilitadas por la heparina usando un TEM. En la Fig. 9 A muestra el resultado de la incubación con Aβ1-40 sola durante 24 h; B muestra el resultado de la incubación con una mezcla de Aβ1-40 y heparina durante 24 h; C muestra el resultado de la incubación con una mezcla de Aβ1-40 y 6mero durante 24 h; D muestra el resultado de la incubación con una mezcla de Aβ1-40, heparina y 6-mero durante 24 h; E muestra el resultado de la incubación con Aβ1-40 sola durante 48 h; F muestra el resultado de la incubación con una mezcla de Aβ1-40 y heparina durante 48 h; G muestra el resultado de la incubación con una mezcla de Aβ1-40 y 6-mero durante 48 h; y H muestra el resultado de la incubación con una mezcla de Aβ1-40, heparina y 6-mero durante 48 h.

(2): Efectos desestabilizantes del 6-mero sobre las fibrillas de Aβ1-40

Se envejece 1 mg/ml de Aβ1-40 disuelta en agua destilada a 37 °C durante 7 días, tras lo cual se expone al 6-mero durante 3 días. Se efectúa una tinción de la muestra con acetato de uranio y el TEM (JEM 1200EX) revela que la Aβ1-40 sola lleva a la formación de fibras retorcidas y largas después de un envejecimiento de 7 días (Fig. 10A). En presencia de heparina durante 24 h adicionales, las fibras retorcidas y largas se hacen mucho más densas y largas en comparación con aquellas formadas en ausencia de heparina (Fig. 10B). En particular, en presencia del 6-mero durante 3 días adicionales, las fibras de Aβ largas y agregadas se convierten en pequeñas fibras cortas e irregulares (Fig. 10C). Estos descubrimientos sugieren que el 6-mero es capaz de revertir las fibrillas de Aβ preformadas, destacando la acción desestabilizante del 6-mero sobre las fibrillas de Aβ preformadas y, por tanto, su intervención potencialmente terapéutica.

(3): Efectos desestabilizantes del 6-mero sobre la conformación de la Aβ1-40

Los espectros de DC (J-500A, JASCO, Japón) de la Aβ1-40 monomérica (250 µg/ml en TBS (Tris 100 mM, NaCl 50 mM, pH 7,4)) incubada a 37 °C durante 12 h se caracterizan principalmente mediante una estructura secundaria de láminas β (Fig. 11A). La exposición simultánea de la Aβ1-40 monomérica al 6-mero (100 µg/ml) durante 12 h evita la formación de láminas β (Fig. 11C). Sin embargo, la heparina acelera significativamente la transición conformacional a la estructura de láminas β (Fig. 11B).

(4): Interacción entre el 6-mero y la Aβ

Se usa la técnica de SPR (BIAcore X, Uppsala, Suecia) para caracterizar la interacción del 6-mero y la Aβ. Se hace fluir la Aβ1-40 con diferentes grados de envejecimiento (envejecida durante 0, 0,5, 1, 2, 4, y 6 d a 37 °C) en solución amortiguadora HBS EP (HEPES 0,01 M, 150 mmol/l de NaCl, 3,4 mmol/l de EDTA-Na2 , 0,005 % v/v de Tween-20, pH 7,4) con cinco concentraciones a través del chip sensor con el 6-mero inmovilizado. La velocidad de flujo es 5 µl/min, y el volumen de inyección es 10 µl. Se registra el sensorgrama de unión y el chip sensor se regenera con NaCl 2 M.

Se descubre que todos los diferentes grados de la Aβ1-40 envejecida se pueden unir al 6-mero. La afinidad de unión es más débil para la Aβ1-40 fresca y el 6-mero con un valor de la KD de 6,85E-07 M. La afinidad de unión aumenta con el grado de envejecimiento (los valores de la KD son 1,07E-07, 9,06E-08, 5,43E-08, 2,15E-08, 1,45E-08 M, respectivamente) y llega a ser esencialmente estable después de un envejecimiento de 2 días.

Estudios adicionales revelan que el 6-mero se une a toda la longitud de la Aβ a través de His13~Lys16, y se une a la Aβ25-35 a través de Ser26~Lys28. La unión del 6-mero con la Aβ fresca podría contribuir a su efecto inhibidor sobre la

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fibrilogénesis de la Aβ. La unión del 6-mero con la Aβ envejecida podría contribuir a la desestabilización de las fibrillas de Aβ.

Los estudios anteriores revelan que los mecanismos moleculares se atribuyen al hecho de que el 6-mero por un lado impide el proceso de fibrilogénesis global y, por otro, desensambla en particular las fibrillas de Aβ. Estos resultados indican que el 6-mero, actuando como un antagonista de la cascada entera de la Aβ, es un candidato preventivo y terapéutico potencial para la EA, lo que proporciona la prueba del principio para una nueva estrategia del tratamiento de la EA.

7 Estudio del 6-mero sobre modelos de diabetes

7.1 Efectos protectores del 6-mero sobre células beta pancreáticas dañadas por la amilina in vitro

Se cultiva una línea de células beta pancreáticas humanas NIT con medio DMEM que contiene FBS al 10 %. Las células se incuban en placas de 96 pocillos con una densidad de 1 x 104 células/pocillo. Un día después de disponerlas en las placas, las células se pretratan con concentraciones variables de 6-mero (concentración final de 0, 10, 50, 100 µg/ml) durante 24 h mediante la adición de amilina envejecida con una concentración final de 30 µM. Al cabo de 48 h a 37 °C, se mide la supervivencia de las células mediante el método MTT.

Los resultados muestran que el 6-mero podría aumentar la supervivencia de las células dañadas por la amilina de un modo dependiente de la dosis (Fig. 12). Cada grupo comprende 6 animales. Los datos se presentan como la media ± SE. ## significa una diferencia estadística en comparación con el grupo de control (P < 0,01). * y * significa una diferencia estadística en comparación con el grupo tratado con la IAPP (p < 0,05 y p < 0,01). Los datos sugieren que el 6-mero tiene efectos protectores sobre las células beta pancreáticas dañadas por la amilina.

7.2 Efectos del 6-mero sobre ratones con diabetes inducida por la estreptozotocina (STZ) in vivo

Se dividen aleatoriamente sesenta ratones NIH machos (con un peso de 18-22 g) en el grupo de control, el grupo modelo, los grupos tratados con 50, 150, y 450 mg/kg del 6-mero y los grupos tratados con 5 mg/kg de dimetilbiguanida. El día 1 se inyecta a los ratones por vía intraperitoneal 150 mg/kg de STZ, a excepción del grupo de control. A continuación, se les administra a los ratones los fármacos correspondientes de modo consecutivo durante 10 días y el día 11 se les extirpa los glóbulos oculares para extraer sangre. La sangre se extrae para medir la concentración de glucosa. La concentración en cada grupo tratado con el 6-mero es significativamente menor que la del grupo modelo, indicando que el 6-mero tiene efectos terapéuticos sobre ratones con diabetes inducida por la STZ (tabla 13).

Tabla 13 Efectos del 6-mero sobre la concentración de glucosa en sangre de ratones con diabetes inducida por la STZ (x ± SD)

Grupo Dosis (mg/kg) Número de ratones

Concentración de glucosa en sangre (mg/dl) Control -10 150,6 ± 36,8 Modelo -10 312,4 ± 89,2## 6-mero 50 10 219,4 ± 67,8*

150 10 179,6 ± 69,8** 450 10 162,5 ± 3** Dimetilbiguanida 5 10 201,6 ± 58,9** ## P < 0,05 vs control; * P < 0,05, **P < 0,01 vs modelo

Se efectúan los mismos experimentos con del 2-mero al 22-mero solos o con mezclas de los mismos, o los productos de degradación oxidativa de los mismos. Los resultados son similares a los del 6-mero, indicando su potencial actividad sobre la EA y la diabetes. Las figuras 13 a 16 muestran los resultados de la mezcla de productos de degradación oxidativa del oligosacárido de alginato sobre el comportamiento de ratones con EA inducida por la Aβ1-40 inyectada en el cerebro. Cada grupo comprende 8 animales. Los datos se presentan como la media ± SE. Los símbolos # y ## significan una diferencia estadística en comparación con el grupo de control (p < 0,05, p < 0,01), y * y ** significan una diferencia estadística en comparación con el grupo modelo (p < 0,05, p < 0,01). Los datos revelan que la mezcla de productos de degradación oxidativa de los oligosacáridos puede mejorar significativamente la capacidad de aprendizaje y memoria en ratones con EA. La Figura 17 muestra los resultados protectores de la mezcla de productos degradación oxidativa de los oligosacáridos de alginato sobre la línea de células beta pancreáticas NIT dañadas por la IAAp (amilina). Cada grupo comprende 6 animales. Los datos se presentan como la media ± SD. El símbolo ## significa una diferencia estadística en comparación con el grupo de control (p < 0,01), y * y ** significan una diferencia estadística en comparación con el grupo modelo (p < 0,05, p < 0,01). Los datos revelan que la mezcla de productos de degradación oxidativa de los oligosacáridos de alginato tiene un significativo efecto preventivo y terapéutico sobre la diabetes.

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