ES2553435T3

ES2553435T3 - Infidelidad de la transcripción, su detección y sus usos

Info

Publication number: ES2553435T3
Application number: ES11173357.2T
Authority: ES
Inventors: Bernard Bihain
Original assignee: Genclis
Current assignee: Genclis
Priority date: 2006-07-20
Filing date: 2007-07-20
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2027-07-20
Also published as: PT2046986E; IL196600A0; CA2658305A1; PT2468885E; AU2007275068A1; PL2468885T3; DK2046986T3; KR101502179B1; EP2046986A2; SI2468885T1; WO2008009751A2; EP2468885A2; EP2468885A3; AU2007275068B2; HUE028135T2; US8288091B2; DK2468885T3; EP2046986B1; BRPI0714563B1; US20090317386A1

Abstract

Uso un péptido sintético con una longitud de 100 aminoácidos o menos, que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 1 a 5, 7 a 13, 15 a 18 y 20 a 32 para detectar o controlar trastornos de células proliferativas.

Description

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DESCRIPCION

Infidelidad de la transcripcion, su deteccion y sus usos

La presente invencion se refiere a peptidos y composiciones para usos terapeuticos, de diagnostico, farmacogenomicos o para diseno de farmacos. Tal como se describira, la invencion resulta particularmente adecuada para detectar, controlar o tratar trastornos de celulas proliferativas.

Introduccion a la invencion

Los acidos nucleicos ADN y ARN son macromoleculas que actuan para almacenar informacion genetica en el nucleo celular (ADN) y para tranferir informacion genomica hacia el citoplasma despues de un proceso denominado transcripcion, que genera un ARN mensajero para producir una protema. Ambos son polfmeros lineales compuestos de monomeros denominados nucleotidos. El ADN y el ARN representan cada uno combinaciones de cuatro tipos de nucleotidos. Todos los nucleotidos tienen una estructura comun: un grupo fosfato unido mediante un enlace fosfodiester a una pentosa que, a su vez, esta unida a una base organica: adenina, citosina, timina y guanina (A, C, T, G) para el ADN, y adenina, citosina, uracilo y guanina (A, C, U, G) para el ARN. En el ARN, la pentosa es ribosa, y en el ADN, es desoxirribosa. La molecula de ADN esta organizada como una doble cadena de nucleotidos ordenados dispuestos en forma de una doble helice. Las moleculas de ARN son polinucleotidos monocatenarios que principalmente producen 4 tipos de moleculas: 1) ARN mensajero (ARNm), que son nucleotidos monocatenarios que se transcriben desde el ADN y se traducen en protemas en el citoplasma, 2) ARN de transferencia (ARNt), que adopta una estructura tridimensional bien definida y se une a aminoacidos (AA) espedficos que son transferidos a cadenas polipeptfdicas para formar protemas con secuencias de AA espedficas en un proceso denominado traduccion, 3) ARN ribosomico (ARNr), que son moleculas mas grandes que, junto con protemas espedficas, constituyen el ribosoma, una estructura que permite el ensamblaje de AA para producir protemas siguiendo la informacion proporcionada por la secuencia especificada por los codones (un codon = 3 nucleotidos) presentes en un orden concreto sobre el ARNm, y 4) ARN corto regulador, denominado ARN no codificador (ARNnc). La secuencia de ARNm entonces se transforma en un lenguaje diferente, es decir, el lenguaje de AA, mediante un proceso denominado traduccion.

En la presente, los inventores demuestran que, por primera vez, la fidelidad de la transcripcion, es decir, la transferencia de informacion del ADN al ARNm, se reduce notablemente en celulas patologicas, en particular en celulas del cancer. Esta falta de fidelidad en la transcripcion en las celulas del cancer es un fenomeno general que afecta a todos los canceres y a la mayona de los genes ensayados en los ejemplos ofrecidos, asf como a la mayona de las transcripciones presentes en las bases de datos disponibles, y que tiene varias implicaciones inmediatas e importantes. En particular, el descubrimiento de la infidelidad de la transcripcion permite mejorar las estrategias proteomicas y transcriptomicas que se emplean en la actualidad para la investigacion de trastornos patologicos. El descubrimiento de la infidelidad de la transcripcion tambien permite una mejor clasificacion de las enfermedades con respecto a su gravedad, y mejora la prediccion del efecto terapeutico y el diseno de nuevos metodos para seleccionar farmacos con respecto a su eficacia basandose en su capacidad para corregir la falta o una modificacion en la fidelidad de la transcripcion. La presente invencion, por tanto, tiene implicaciones y utilidades muy importantes en el diagnostico y en el desarrollo de farmacos, asf como en el tratamiento, la deteccion y el control de pacientes y en la eficacia de farmacos.

Para comprender el impacto del descubrimiento descrito a continuacion, es importante reconocer que, en la actualidad, se cree que es necesaria una absoluta fidelidad en la transcripcion del ADN al ARN para la funcion celular normal. Sin embargo, en la actualidad se sigue planteando una cuestion importante aun no resuelta. En efecto, la secuenciacion y la anotacion del genoma humano condujo a la idea de que estan codificados 30-40 mil genes. Este calculo sigue siendo mucho menor que el numero de protemas que pueden identificarse en la actualidad mediante metodos proteomicos: se han identificado hasta 300 mil protemas. Para reconciliar estas diferencias, se ha propuesto que un unico gen pueda producir varios ARNm diferentes que codifiquen diferentes protemas mediante un proceso denominado corte y empalme alternativo. El corte y empalme alternativo elimina diferentes partes de un ARN premensajero (ARNpm), conduciendo con ello a la eliminacion de diferentes elementos que corresponden a intrones espedficos, y produce diferentes ARNm maduros. El analisis de la base de datos RefSeq indica que contiene 11259 transcripciones que corresponden a 6946 genes. Por tanto, el corte y empalme alternativo puede aumentar la heterogeneidad de las transcripciones en 76%. El mecanismo que describen en la presente los inventores es diferente del corte y empalme alternativo, e induce una heterogeneidad de protemas mucho mayor. En efecto, los inventores demuestran la aparicion de modificaciones no aleatorias en la secuencia del ARNm que producen cambios en los AA codificados, la introduccion de codones de fin prematuros que producen isoformas de protemas mas cortas, y la alteracion de los codones de fin naturales que implica la introduccion de nuevas secuencias codificadoras que producen isoformas de protemas alargadas. La introduccion de huecos e inserciones modifica asf el marco de lectura del ARNm y crea de ese modo secuencias de protemas insospechadas. Los datos descritos en esta invencion demuestran que este fenomeno de infidelidad de la transcripcion esta presente en celulas normales pero esta notablemente potenciado en celulas patologicas, tales como celulas derivadas de un cancer. Por tanto, se propone que la infidelidad de la transcripcion (IT) contribuye a la diversificacion de la informacion transferida desde el ADN al ARN. Los resultados de los investigadores tambien establecen que la infidelidad de la transcripcion no se produce de modo aleatorio, sino que sigue unas reglas espedficas en las que

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resulta importante el contexto que rodea a b0, las bases afectadas por el acontecimiento de IT.

Es posible imaginarse otro mecanismo para explicar que la heterogeneidad del ARN no aparece a nivel genomico sino a nivel de ARN: la edicion de ARN. Sin embargo, la edicion de ARN no puede explicar dos tipos del acontecimiento de IT, la introduccion de huecos y la insercion. La edicion de ARN se caracteriza por unos cambios de bases postranscripcionales en el ARNm y ARNt en eucariotas. La inmensa mayona de los acontecimientos de edicion de sustitucion conocidos consisten en conversiones de C a U, o de A a I (lefdo como G) (Gott, J.M. y Emeson, R.B. (2000), Annu. Rev. Genet., 34, 499-531; Maas, S. y Rich, A. (2000), Bioessays, 22, 790-802; Niswender, C.M. (l998), Cell Mol. Life Sci., 54, 946-964). Diferentes trabajos han demostrado que estas conversiones surgen a traves de mecanismos de desaminacion, catalizados por adenosina y citidina desaminasas. Otro acontecimiento de edicion de sustitucion es la convercion de “U a C”. Aunque la teona de la reversibilidad microscopica dicta que la reaccion de la citidina desaminasa puede ir hacia atras para generar esta conversion, tambien se ha propuesto que una actividad de tipo CTP sintetasa puede ser responsable. Se ha demostrado en varios ejemplos que la edicion de ARN puede ser espedfica de celulas de cancer frente a celulas normales. Ademas, la tasa de este fenomeno puede verse afectada en condiciones de cancer.

En el conjunto con cancer, a nivel de ADNc, los inventores observaron cambios de 5,7% de C ^ T, 9,2% de T ^ C, y 4,7% de A ^ G. Por tanto, la edicion de ARNm puede justificar no mas que 20% de las sustituciones de una sola base descritas en la presente. En efecto, las sustituciones de bases mas comunes, A ^ C (24,6%) y T ^ G (16,8%), representan cambios en la familia de bases que, en la actualidad, no pueden explicarse por los procesos de edicion del ARN enzimaticos humanos conocidos.

Ademas, se espera que la infidelidad de la transcripcion provoque deleciones y/o inserciones de bases a traves de un mecanismo (o mecanismos) diferente de la edicion del ARNm. Ademas, un estudio reciente ha demostrado que una serie de registros de dbSNP (“Single Nucleotide Polymorphism dababase”, base de datos de polimorfismos de nucleotidos individuales) son, de hecho, sitios de edicion (Eisenberg, E. et al. (2005), Nucleic Acids Res., 33 (14), 4612-4617). En la estrategia de los inventores, no se han considerado todos los SNP de dbSNP, por tanto se excluyen los SNP conocidos o los SNP falsos que corresponden a sitios de edicion.

Por tanto, el mecanismo para explicar la heterogeneidad del ARNm en el cancer observada es la infidelidad de la transcripcion.

Otro estudio (Ruiz et al., 2004, Clinical cancer Research 10 (8), 2560-2567) se refiere a la identificacion de linfocitos T colaboradores determinantes de antfgeno carcinoembrionico, y que se predice que son potenciales enlaces a moleculas HLA-DR. Sin embargo, este documento no describe ninguna secuencia ni peptido sintetico, como reivindican los presentes inventores.

Sumario de la presente invencion

La presente invencion se refiere a peptidos sinteticos, composiciones y usos de los mismos para fines terapeuticos y de diagnostico, por ejemplo, para detectar y/o tratar enfermedades de celulas proliferativas El objeto de esta invencion se refiere al uso de un peptido sintetico como se define en las reivindicaciones.

La invencion tambien describe el uso de un compuesto que altera (por ejemplo, reduce o aumenta) la tasa de la infidelidad de la transcripcion de un gen de mairnfero para la fabricacion de una composicion farmaceutica para su uso en un metodo de tratamiento de un ser humano o de un animal, en particular para tratar enfermedades tales como trastornos de celulas proliferativas incluyendo, pero no limitandose a, canceres, enfermedades inmunes, enfermedades inflamatorias o envejecimiento.

La invencion tambien describe metodos y productos (tales como sondas, cebadores, anticuerpos o sus derivados) para detectar o medir (el nivel de) la infidelidad de la transcripcion en una muestra, asf como los correspondientes kits.

La invencion describe ademas metodos para identificar secuencias de infidelidad de la transcripcion en protemas o en acidos nucleicos, asf como su uso, por ejemplo, como marcadores, inmunogenos y/o para generar ligandos espedficos para ellos.

A este respecto, la invencion describe un metodo para identificar y/o producir biomarcadores, comprendiendo dicho metodo identificar, en una muestra procedente de un sujeto, la presencia de un sitio o sitios de infidelidad de la transcripcion en una protema o un acido nucleico diana y, opcionalmente, determinar la secuencia de dicho sitio o sitios de infidelidad de la transcripcion.

La invencion tambien describe un metodo para identificar y/o producir un ligando espedfico para un rasgo o un trastorno patologico, comprendiendo dicho metodo identificar, en una muestra procedente de un sujeto que tiene dicho rasgo o trastorno patologico, la presencia de al menos un sitio de infidelidad de la transcripcion en una o varias protemas o acidos nucleicos diana, opcionalmente determinando la secuencia de dicho al menos un sitio de infidelidad de la transcripcion, y produciendo un ligando que se une de modo espedfico a dicha al menos una protema (o dominio) o acido nucleico creado mediante la infidelidad de la transcripcion.

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La invencion resulta particularmente adecuada para identificar biomarcadores de trastornos de celulas proliferativas, tales como canceres, enfermedades inmunes, enfermedades inflamatorias o envejecimiento. Es particularmente util para producir ligandos que son espedficos de tales trastornos en mairnferos, en particular ligandos que pueden detectar la presencia o gravedad de un trastorno proliferativo en un sujeto.

Esta invencion tambien describe un ligando que se une de modo espedfico a una protema (o dominio) o a un acido nucleico creado mediante la infidelidad de la transcripcion. El ligando puede ser un anticuerpo (o cualquier fragmento (tal como Fab, Fab', CDR, etc.) o un derivado de este, tal como se describira a continuacion), que se une de modo espedfico a una protema (o dominio) creado mediante la infidelidad de la transcripcion. El ligando tambien puede ser un acido nucleico que se une de modo espedfico con un acido nucleico creado mediante la infidelidad de la transcripcion (por ejemplo, una sonda, un cebador, un ARNi (ARN de interferencia), etc.).

Esta invencion tambien describe un peptido que comprende un dominio de una protema creada mediante la infidelidad de la transcripcion, en particular de una protema de mamnfero, mas preferiblemente de una protema humana. El peptido es generalmente un peptido sintetico, es decir, un peptido que se ha preparado de modo artificial, por ejemplo, mediante smtesis qmmica, smtesis y/o extension de aminoacidos, digestion de protemas, ensamblaje de peptidos, expresion recombinante, etc. El peptido comprende generalmente la secuencia de un fragmento C-terminal de dicha protema. El peptido comprende preferiblemente menos de 100, 80, 75, 70, 65, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25 o incluso 20 aminoacidos (aunque, en otras realizaciones, la longitud del peptido puede ser mayor). La protema puede ser una protema de la superficie celular (por ejemplo, un receptor, etc.), una protema segregada (por ejemplo, una protema plasmatica, etc.) o una protema intracelular.

Otro aspecto de esta invencion reside en el uso de un peptido sintetico como se define anteriormente con una longitud de 100 aminoacidos o menos y, en particular, que comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NOs:1 a 5, 7 a 13, 15 a 18 y 20 a 32 para detectar o controlar trastornos de celulas proliferativas.

La invencion tambien describe una composicion de vacuna que comprende un peptido que comprende una parte de una protema creada mediante la infidelidad de la transcripcion. Un objetivo adicional de la invencion reside en una composicion de vacuna que comprende un peptido sintetico, como se define anteriormente, con una longitud de 100 aminoacidos o menos, que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 1 a 5, 7 a 13, 15 a 18 y 20 a 32, y opcionalmente un vehmulo, excipiente y/o adyuvante adecuado.

Esta invencion tambien se describe un metodo para producir un anticuerpo, comprendiendo dicho metodo inmunizar a un marnffero no humano con un peptido creado mediante la infidelidad de la transcripcion. Un objetivo adicional de esta invencion reside en un metodo para producir un anticuerpo, comprendiendo el metodo inmunizar a un marnffero no humano con un peptido sintetico con una longitud de 100 aminoacidos o menos, que comprende una secuencia seleccionada de sEq ID NOs: 1 a 5, 7 a 13, 15 a 18 y 20 a 32, como se define anteriormente, y recuperando anticuerpos que se unen a dicho peptido, o las correspondientes celulas productoras de anticuerpos. Opcionalmente, pueden producir derivados del anticuerpo.

La invencion tambien describe un metodo para producir un anticuerpo, comprendiendo dicho metodo (i) identificar un dominio de una protema creada mediante la infidelidad de la transcripcion, y (ii) producir un anticuerpo que se une de modo espedfico a ese dominio. Opcionalmente, pueden producirse derivados del anticuerpo.

Esta invencion tambien describe un anticuerpo que se une de modo espedfico a una parte de una protema creada mediante la infidelidad de la transcripcion, o un derivado de dicho anticuerpo que tiene sustancialmente la misma espedficidad de antfgeno. En particular, la invencion reside en un anticuerpo, o derivado del mismo, que se une espedficamente a un peptido sintetico con una longitud de 100 aminoacidos o menos, que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 1 a 5, 7 a 13, 15 a 18 y 20 a 32. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. El termino derivado incluye cualquier fragmento (tal como Fab, Fab', CDR, etc.) u otro derivado, tal como anticuerpos monocatenarios, anticuerpos bifuncionales, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos quimericos, etc.

Otro aspecto de esta invencion se refiere a un anticuerpo o su derivado, segun se definio anteriormente, que esta conjugado con una molecula. La molecula puede ser un farmaco, un marcador, una molecula toxica, un radioisotopo, etc.

La invencion tambien describe al uso de un anticuerpo o su derivado, tal como se definio anteriormente, para detectar o cuantificar (por ejemplo, in vitro) la infidelidad de la transcripcion de un gen.

La invencion tambien se refiere al uso de un anticuerpo conjugado o su derivado, tal como se definio anteriormente, como medicamento o reactivo de diagnostico.

La invencion tambien describe un dispositivo o producto que comprende, inmovilizado sobre un soporte, un reactivo que se une de modo espedfico con una protema o un acido nucleico creado mediante la infidelidad de la transcripcion. El reactivo puede ser, por ejemplo, una sonda, o un anticuerpo o su derivado.

La invencion tambien describe un metodo para provocar o inducir o estimular la infidelidad de la transcripcion en una

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celula, tejido u organismo. Este metodo puede comprender, generalmente, la introduccion de un sitio de infidelidad de la transcripcion en secuencias genomicas normales, por ejemplo, mediante un vector de terapia genica. Esta modificacion puede dar como resultado la destruccion de una celula o un tejido. En particular, es posible crear un marco de lectura abierto en cualquier secuencia genica que de como resultado la produccion de compuestos o protemas toxicas celulares. Tambien es posible provocar la expresion, en una celula enferma (o diana), de un biomarcador espedfico que pueda fijarse como objetivo para moleculas toxicas o terapeuticas. Utilizando esta estrategia, es por tanto posible provocar la muerte celular o una terapia cuando la infidelidad de la transcripcion aparezca o exceda una tasa concreta.

La invencion tambien describe el uso de un acido nucleico que contiene un sitio o sitios de infidelidad de la transcripcion para la fabricacion de una composicion farmaceutica para su uso en un metodo de tratamiento de un ser humano o animal. El gen puede ser cualquier gen, incluyendo un gen de mamffero o un gen procedente de un agente patogeno, tal como un gen vmco, un gen bacteriano, etc. A este respecto, la invencion se refiere a un metodo para tratar una enfermedad provocada por un patogeno, comprendiendo dicho metodo provocar o estimular la infidelidad de la transcripcion de un gen codificado por dicho patogeno.

En una realizacion particular, la invencion se refiere a una molecula de acido nucleico sintetico que codifica un peptido de 100 aminoacidos o menos, que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 1 a 5, 7 a 13, 15 a 18 y 20 a 32 para detectar o controlar trastornos de celulas proliferativas.

La invencion tambien describe metodos para producir polipeptidos recombinantes in vitro con una infidelidad de la transcripcion reducida. Estos metodos permiten una reduccion en la microheterogeneidad en polipeptidos recombinantes. El metodo comprende utilizar celulas hospedantes que comprenden un acido nucleico recombinante con una utilizacion de codones adaptada, para reducir la aparicion de la infidelidad de la transcripcion. El metodo tambien puede incluir el uso de cualquier compuesto o tratamiento que reduzca la aparicion de la infidelidad de la transcripcion. El metodo puede utilizarse en celulas hospedantes procariotas o eucariotas, por ejemplo, en cepas de E. coli o CHO.

La invencion puede utilizarse en cualquier sujeto mairnfero, en particular cualquier sujeto humano, para detectar, controlar o tratar una diversidad de trastornos patologicos asociados con trastornos de celulas proliferativas (por ejemplo, canceres) y/o para producir, disenar o seleccionar farmacos terapeuticamente activos.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Principio de construccion y secuenciacion de bancos de ADNc.

Figura 2: (a-q) Secuencias de referencia de ARNm utilizadas para el analisis. Para evitar distorsionar BLAST, la cola de poliA de las secuencias de referencia de ARNm se elimino sistematicamente. La figura 2r proporciona una lista de genes ensayados.

Figura 3: Archivos de salida MegaBLAST tfpicos.

Figura 4: Porcentaje de desviacion de la secuencia de nucleotidos en cualquier posicion para cada gen estudiado. Figura 5: TPT1, VIM = numero de EST y analisis del ensayo de proporcion.

Figura 6: Variacion en los EST antes y despues de la aplicacion secuencial de filtros electronicos. Efectos de la eliminacion de lmeas celulares y Clip 400.

Figura 7: Contexto del ADN: a) Efecto de la composicion de bases del ARNpm sobre la heterogeneidad de las bases b0. b) Composicion de la base de sustitucion para cada base sustituida. c) Reparto de bases afectadas y de sustitucion dentro de ensayos C>N estadfsticamente significativos. d) Efecto de la composicion de bases del ARNpm sobre la base de sustitucion que corresponde a la repeticion de b-1 o b+1.

Figura 8: Variante de ARNm virtual y protema para VIM.

Figura 9: Impacto en la codificacion.

Figura 10: Protemas de interes = secuencias de aminoacidos en las que el codon de fin se ve estadfsticamente afectado.

Figura 11: DHPLC = principio y lfmites de la deteccion.

Figura 12: DHPLC = cebadores y productos de la PCR esperados.

Figura 13: Lista de 60 protemas estudiadas.

Figura 14: Produccion de anticuerpos.

Figura 15: Resultados de DHPLC.

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Figura 16: Sensibildad de Sanger

Figura 17: Deteccion de PSP de APOAII y APOCII en plasma de pacientes cancerosos.

Figura 18: PSP potencial en protemas plasmaticas.

Figura 19: Evaluacion de las predicciones de sustituciones en la secuencia del ARNm.

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones

Infidelidad de la transcripcion

La expresion infidelidad de la transcripcion indica un nuevo mecanismo mediante el cual se producen varias moleculas de ARN diferenciadas en una celula a partir de una unica secuencia genica. Este mecanismo recien identificado afecta potencialmente a muchos genes, no es aleatorio, y sigue una reglas concretas, tal como se describira a continuacion. Tal como se muestra en los ejemplos, la infidelidad de la transcripcion puede introducir sustituciones, deleciones e inserciones en moleculas de ARN, creando con ello una diversidad de protemas a partir de un unico gen. La infidelidad de la transcripcion tambien puede afectar a secuencias de ARN no codificadoras, modulando con ello sus funciones. La medicion, la modulacion o la localizacion de la infidelidad de la transcripcion, por tanto, representa una nueva estrategia para detectar o tratar trastornos, asf como para el desarrollo de farmacos.

Sitio de infidelidad de la transcripcion

La expresion sitio de infidelidad de la transcripcion indica una secuencia y/o una posicion afectada por la infidelidad de la transcripcion. Puede ser un dominio de acido nucleico o de aminoacido que contenga al menos una modificacion generada como resultado de la infidelidad de la transcripcion. Dicha modificacion puede ser el resultado, por ejemplo, de una conmutacion en el marco de lectura (insercion y/o delecion), de la introduccion o supresion de codones de fin, de la introduccion de nuevos codones de inicio, de una sustitucion o sustituciones de nucleotidos (que impliquen o no cambios en AA), etc. Un sitio de infidelidad de la transcripcion puede comprender una o varias variaciones de la secuencia que sean el resultado de la infidelidad de la transcripcion. Un sitio de infidelidad de la transcripcion puede comprender, por ejemplo, un resto nucleotido o aminoacido modificado hasta, por ejemplo, 150 restos nucleotidos o aminoacidos modificados, o incluso mas. El sitio de infidelidad de la transcripcion generalmente se diferencia de la secuencia que resulta de una transcripcion fiel en al menos una modificacion de nucleotido o de aminoacido (por ejemplo, sustitucion, delecion, insercion, inversion, etc.). Una protema o un dominio creado mediante la infidelidad de la transcripcion (protema-IT) generalmente comprende de 1 a 50 aminoacidos (o incluso mas), con al menos un resto aminoacidos modificado. Una secuencia de infidelidad de la transcripcion de un acido nucleico comprende generalmente de 1 a 150 nucleotidos (o incluso mas), con al menos un resto nucleotido modificado.

Reglas e identificacion de la infidelidad de la transcripcion

Basandose en tecnicas espedficas de deteccion y/o reglas concretas de la infidelidad de la transcripcion segun se define en la presente solicitud, ahora es posible predecir e identificar sitios de infidelidad de la transcripcion en cualquier gen o protema. Estos sitios tambien pueden obtenerse mediante el alineamiento de secuencias disponibles para un ARN concreto y la identificacion de las sustituciones de bases. En ultima instancia pueden validarse mediante diversas tecnicas, por ejemplo, utilizando ligandos espedficos para una protema-IT predicha.

Un metodo particular para identificar un sitio de infidelidad de la transcripcion comprende:

- proporcionar la secuencia de un gen, molecula de ARN o ADNc concretos, o una porcion de estos, e

- identificar, dentro de dicha secuencia, la presencia de un cambio en algun nucleotido (por ejemplo, sustitucion, delecion, insercion, inversion) que resulte de la infidelidad de la transcripcion, siguiendo las reglas de la infidelidad de la transcripcion, por ejemplo, tal como se analiza en (iii) a continuacion.

Otro metodo particular para identificar un sitio de infidelidad de la transcripcion comprende:

- proporcionar la secuencia de una protema concreta, o una porcion de esta, e

- identificar, dentro de dicha secuencia, la presencia de un cambio en algun aminoacido (por ejemplo, sustitucion, delecion, insercion, inversion) que resulte de la infidelidad de la transcripcion, siguiendo las reglas de la infidelidad de la transcripcion, por ejemplo, tal como se analiza en (iii) a continuacion.

La presencia de un cambio resultante de la infidelidad de la transcripcion en una molecula puede identificarse en un proceso en tres etapas, que comprende:

(i) la identificacion de sitios de infidelidad de la transcripcion con una maquina de aprendizaje que se basa en la

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discriminacion cuadratica de factores de analisis factorial de correspondencia multiple (MCFA),

(ii) la identificacion de la categona de los sitios de infidelidad de la transcripcion (b-1 o b+1 u otros) con el mismo metodo, y

(iii) la prediccion de la base de sustitucion utilizando las siguiente reglas de la infidelidad de la transcripcion:

■ Para cualquier base presente como un singleton, es decir, cualquier base que no este precedida ni seguida por ella misma, entonces es muy probable que la base sustituida sea identica a la base que precede a la que esta sustituida (en caso de la categona b-1), o identica a la base que sigue a la que esta sustituida (en el caso de la categona b+1). Por ejemplo, CAT sera CTT (regla b-1); ATG sera AgG (regla b+1);

■ Cuando las sustituciones se producen dentro de tres A consecutivas, la sustitucion de la segunda A preferentemente es a C;

■ Cuando las sustituciones se producen dentro de tres T consecutivas, la sustitucion de la segunda T preferentemente es a C, despues a A, despues a G;

■ Los tramos de C y G raramente estan sustituidos en la segunda, pero si se produce, la sustitucion de la segunda C preferentemente es a A, y la sustitucion de la segunda G preferentemente es a C;

■ Para otros casos, la base de sustitucion es preferentemente C.

Otros metodos para identificar sitios de infidelidad de la transcripcion dentro de la secuencia de cualquier protema o acido nucleido diana comprenden, por ejemplo, la comparacion de marcadores de secuencia expresados (“expressed sequence tag”, EST) existentes, la amplificacion directa de secuencias identificadas y la secuenciacion de productos de la amplificacion con un metodo de secuenciacion espedfico (Sanger, qmmico, pirosecuenciacion). Esta estrategia produce secuencias variantes que implican cambios en AA, modificaciones de la longitud de la protema, etc. Entonces pueden disenarse oligonucleotidos que se aparean de modo selectivo con ARNm o ADNc que portan sitios de infidelidad de la transcripcion, permitiendo la amplificacion selectiva de nucleotidos con sitios de infidelidad de la transcripcion a partir de un agrupacion de secuencias. Tambien pueden producirse anticuerpos que se dirijan a una protema-IT.

Como alternativa, es posible identificar un sitio de infidelidad de la transcripcion mediante el analisis de la secuencia

0 mediante reglas bioinformaticas. La secuencia resultante puede clonarse en cualquier vector de transfeccion. Tambien es posible disenar una construccion que comprenda dicha secuencia de infidelidad de la transcripcion dentro de marco con un gen indicador, que sera transcrito y traducido solo si se produce la infidelidad de la transcripcion. El gen indicador puede ser una enzima o una protema fluorescente o cualquier gen que haga que la celula diana sea sensible, o resistente a la exposicion a una toxina.

Un metodo detallado que permite la identificacion de los sitios de infidelidad de la transcripcion (o sustituciones) incluye el metodo TDG segun se describe a continuacion.

Una tecnica descrita por Pan y Weissman y Liu et al. (PNAS, 2002, 99 (14), 9346-9351; y Anal. Biochem., 1 de septiembre, 2006, 356 (1):117-124) puede adaptarse para detectar un sitio o sitios de infidelidad de la transcripcion en el ARN. Esta tecnica se basa en el uso de una enzima, la timina ADN glicosilasa (TDG), que es capaz de enriquecer por separado duplex de ADN que contienen desapareamientos en mezcla complejas. Estas enzimas reconocen de modo espedfico los desapareamientos de nucleotidos y generan sitios abasicos (el enlace entre la desoxirribosa y una de las bases del aDn esta roto). Entonces, la tDg puede unirse de modo reversible a estos sitios abasicos y, por tanto, puede utilizarse para la purificacion por afinidad de los fragmentos de ADN que contienen desapareamientos. En un experimento tfpico, el ARN se extrae de 2 tipos celulares (normal y canceroso) y se somete a una transcripcion inversa para fabricar ADNc bicatenario. Despues de una desnaturalizacion termica y una lenta renaturalizacion de cada muestra, se genera un ADNc con uno o mas desapareamientos y puede separarse de los duplex perfectos. Estos ADNc entonces pueden analizarse mediante secuenciacion directa, o compararse mediante DHPLC (vease a continuacion).

Otras tecnicas que pueden adaptarse para identificar sitios de infidelidad de la transcripcion o mutaciones se describen, por ejemplo, en los documentos US 6.329.147, US 4.979.330, WO 02/077286 o US 6.120.992.

Generalmente, los metodos para identificar sitios de infidelidad de la transcripcion comprenden tambien una etapa de validar la secuencia del sitio de infidelidad de la transcripcion produciendo una molecula que comprende la secuencia identificada, generando un ligando que se une de modo espedfico a dicha molecula, y verificando en una muestra biologica la presencia de un antfgeno que es reconocido de modo espedfico por dicho ligando.

Una secuencia de infidelidad de la transcripcion tfpica de un acido nucleico es una secuencia con una longitud entre

1 y 150 nucleotidos que comprende al menos una sustitucion, delecion o insercion de bases provocada por la infidelidad de la transcripcion, preferiblemente siguiendo una regla segun se describe en el ejemplo 5. La secuencia de infidelidad de la transcripcion puede ser mayor.

Un dominio tipico de una protema-IT es una secuencia de aminoacidos con una longitud entre 1 y 50 aminoacidos que comprende al menos una sustitucion de un aminoacido (o mas cambios debidos a la modificacion en el marco de lectura como resultado de una delecion o insercion de bases) provocada por la infidelidad de la transcripcion, preferiblemente siguiendo una regla segun se describe en el ejemplo 5. El dominio de una protema-IT puede ser 5 mayor. Los ejemplos de protemas-IT se proporcionan en la seccion experimental, por ejemplo, en las figuras 13 y 14.

Detectar o medir la infidelidad de la transcripcion

Esta invencion describe un descubrimiento inesperado de que se produce una alta tasa de anomalfas de secuencias naturales durante o al poco tiempo despues de la transcripcion del ADN a ARN. El proceso puede estar presente en 10 celulas normales, pero aumenta mucho en celulas patologicas, por ejemplo, celulas del cancer. El descubrimiento de que la transcripcion del ADN en ARN esta introduciendo variaciones en la secuencia siguiendo unas reglas que son diferentes de las definidas por las complementariedades de bases una a una permite el diseno logico de nuevos reactivos (por ejemplo, sondas, cebadores, anticuerpos, aptameros, etc.) que sean espedficos para el acido nucleico o la protema creada mediante la infidelidad de la transcripcion. Estos reactivos por tanto permiten detectar o 15 medir la infidelidad de la transcripcion, y discriminar entre condiciones normales o enfermas, asf como el transporte dirigido de moleculas a celulas que muestren una infidelidad de la transcripcion.

Ademas, la invencion tambien describe el diseno logico de reactivos (por ejemplo, sondas, cebadores, anticuerpos, aptameros) que sean predictivos de la gravedad de una enfermedad (por ejemplo, cancer). En efecto, se espera que una mayor tasa de infidelidad de la transcripcion se correlacione con la gravedad de la enfermedad, y esta tasa 20 aumenta progresivamente a medida que mas y mas productos genicos se ven afectados. La medicion directa de la (in)fidelidad de la transcripcion en una celula o celulas enfermas utilizando los metodos descritos en la presente o cualquier otra tecnologfa permite detectar celulas en diferentes etapas de avance de la enfermedad en cualquier tejido concreto. La medicion precisa de estas variaciones en la expresion genica (transcripciones y protemas) tambien mejora la capacidad para evaluar la eficacia de farmacos con respecto a la gravedad de la enfermedad. En 25 la actualidad, diversas tecnicas de micromatrices permiten la medicion de los cambios en la expresion genica. Sin embargo, la fiabilidad y, de modo mas importante, la reproducibildad de estos datos en la actualidad no es suficiente. Los inventores ahora pueden postular que una gran parte de la variabilidad de estos experimentos transcriptomicos es provocada, en parte, por la infidelidad de la transcripcion segun ha sido descubierta por los inventores. Por tanto, el descubrimiento de este fenomeno comun permite el diseno de reactivos de expresion genica que se vean 30 mmimamente afectados por la infidelidad de la transcripcion, o que directamente reflejen la infidelidad de la

transcripcion que se produce en secuencias espedficas siguiendo las reglas descritas en la presente solicitud.

Tambien es posible e incluso probable que la infidelidad de la transcripcion este modulada por la tasa de transcripcion. Los inventores especulan que un aumento en la expresion de un gen concreto en un trastorno patologico aumentara la IT y asf aumentara la heterogeneidad de protemas.

35 La infidelidad de la transcripcion puede detectarse o medirse utilizando una serie de tecnicas conocidas per se en la tecnica, que pueden adaptarse. En particular, la infidelidad de la transcripcion puede medirse utilizando reactivos espedficos para acidos nucleicos o protemas creadas mediante la infidelidad de la transcripcion, tales como sondas, cebadores o anticuerpos espedficos, mediante electroforesis, analisis de migracion en gel, espectrometna, etc., que permitan la deteccion entre varias formas de una protema o de un acido nucleico. La tasa de la infidelidad de la 40 transcripcion puede determinarse evaluando el numero de genes en una celulas que estan sometidos a la infidelidad de la transcripcion y/o el numero de sitios de infidelidad de la transcripcion generados para un gen concreto. Esta tasa puede determinarse comparando el nivel de acidos nucleicos o protemas creados mediante la infidelidad de la transcripcion en una muestra de ensayo, con el obtenido en una muestra de referencia.

Deteccion de la infidelidad de la transcripcion a nivel de acidos nucleicos

45 Tal como se analizo anteriormente, la infidelidad de la transcripcion introduce una variacion o variaciones en la secuencia de moleculas de ARN. La deteccion o la medicion de la infidelidad de la transcripcion por tanto puede realizarse detectando la presencia o la cantidad (absoluta o relativa) de dicha variacion o variaciones en la secuencia de los ARN codificados por uno o varios genes, o en una celula entera o tejido o muestra. La deteccion de la infidelidad de la transcripcion en acidos nucleicos puede realizarse mediante diversas tecnicas, tales como 50 hibridacion, amplificacion, formacion de heteroduplex, etc.

Casi todas las tecnologfas utilizadas para la identificacion de nucleotidos presentes en diversos tipos de tejidos se basa en un proceso denominado hibridacion. La hibridacion resulta cntica para tecnologfas, tales como micromatrices, utilizadas para identificar polimorfismos y para buscar variaciones en la expresion genica. Esta tecnica se aplica para medir el nivel de expresion genica. La hibridacion de sondas oligonucleotidicas tambien se 55 emplea para retirar secuencias de genes que se expresan con abundancia para permitir un mejor estudio de los mensajes de baja abundancia; este procedimiento se denomina hibridacion sustractiva. La hibridacion tambien es la primera etapa de la reaccion de amplificacion de genes que se emplea habitualmente en experimentos de PCR, en la forma directa o despues de la aplicacion de la transcriptasa inversa para convertir la secuencia del mensaje desde una secuencia de tipo ARN a una secuencia de tipo ADN.

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El mecanismo basico que subyace a la hibridacion es que la secuencia o secuencias de nucleotidos monocaternarias pueden unirse entre sf con la condicion de que sus respectivas secuencias sean complementarias. Tanto la longitud como la ordenacion espedfica de cada una de las 4 bases define la eficacia de la hibridacion y la especificidad de la secuencia. Esto implica que cada base espedfica se une de manera no covalente a su base complementaria: A a T, y C a G, y viceversa. Esta union no covalente en un apareamiento de secuencias esta condicionada por la ordenacion de la base. Asf, en la practica general, una secuencia definida de bases se une a una unica secuencia complementaria. Esta reaccion de union espedfica proporciona la base para la hibridacion que permite la identificacion de cualquier secuencia complementaria en cualquier mezcla concreta de nucleotidos. La eficacia de la hibridacion viene determinada por el numero de bases que, en el orden apropiado, se aparean entre sf (se tolera un cierto grado de desapareamientos) y tambien por las condiciones del experimento, tales como la rigurosidad del tampon de union, el contenido relativo en CG frente a TA (CG y TA estan unidos mediante 3 y 2 enlaces de hidrogeno, respectivamente) y por la temperatura de fusion, es decir, la temperatura necesaria para permitir la disociacion del 50% del ADN bicatenario.

La deteccion de la infidelidad de la transcripcion empleando la hibridacion generalmente comprende colocar una muestra en contacto con una sonda de acido nucleico que sea espedfica para una secuencia de infidelidad de la transcripcion, y detectar la presencia (o cantidad) de los hfbridos formados, siendo dicha presencia o cantidad una indicacion directa de la presencia o la tasa de la infidelidad de la transcripcion. En una realizacion preferida, el metodo emplea un conjunto de sondas de acidos nucleicos que son espedficas para secuencias de infidelidad de la transcripcion diferenciadas de uno o varios genes, respectivamente. Pueden prepararse sondas de acidos nucleicos espedficas para una secuencia de infidelidad de la transcripcion para cualquier gen, empleando la informacion de la secuencia y las reglas de sustitucion, insercion o delecion de nucleotidos segun se describe en la presente solicitud (vease, por ejemplo, el ejemplo 5).

Una “sonda” de acido nucleico se refiere a un acido nucleico u un oligonucleotido que tiene una secuencia polinucleotfdica que es capaz de una hibridacion selectiva con una secuencia de infidelidad de la transcripcion o su complemento, y que es adecuada para detectar la presencia (o su cantidad) en una muestra que contiene dicha secuencia o complemento. Las sondas preferiblemente son perfectamente complementarias con una secuencia de infidelidad de la transcripcion, aunque se tolera un cierto grado de desapareamiento. Las sondas comprenden generalmente acidos nucleicos monocatenarios con una longitud de 8 a 1500 nucleotidos, por ejemplo entre 10 y 1000, mas preferiblemente entre 10 y 800, generalmente entre 20 y 700. Debe entenderse que tambien pueden emplearse sondas mas largas. Por ejemplo, una sonda puede ser una molecula de acido nucleico monocatenario de 8 a 400 nucleotidos de longitud, que puede hibridarse de modo espedfico con una secuencia de infidelidad de la transcripcion.

Tfpicamente una sonda de acido nucleico se hibrida de modo selectivo con una region de una molecula de acido nucleico que no contiene una secuencia de infidelidad de la transcripcion.

La selectividad, cuando se emplea para indicar la hibridacion de acidos nucleicos, indica que la hibridacion de la sonda con la secuencia diana es diferente de la hibridacion de dicha sonda con otra secuencia. A este respecto, aunque no sea necesaria una complementariedad perfecta entre la sonda y la secuencia diana, sera lo suficientemente elevada como para permitir una hibridacion selectiva.

Las sondas tfpicamente comprenden una secuencia que es complementaria con una secuencia de infidelidad de la transcripcion en una molecula de ARN (o la correspondiente molecula de ADNc) que codifica una protema de la superficie celular o una protema segregada. Ejemplos de sondas se seleccionan de sondas que tienen una secuencia complementaria con una secuencia de infidelidad de la transcripcion, o codifican una secuencia peptfdica de una cualquiera de SEQ ID NO:1 a 32.

La secuencia de las sondas puede modificarse, por ejemplo, qmmicamente, por ejemplo para aumentar la estabilidad de los hfbridos (por ejemplo, grupos intercalantes o nucleotidos modificados, tales como 2'- alcoxirribonucleotidos) o para marcar la sonda. Los ejemplos tfpicos de marcadores incluyen, sin limitacion, radiactividad, fluorescencia, luminiscencia, marcaje enzimatico y similares. La sonda puede hibridarse con el acido nucleico diana en disolucion, suspension, o unido a un soporte solido tal como, sin limitacion, una esfera, una columna, una placa, un sustrato (para producir chips o matrices de acidos nucleicos), etc.

La infidelidad de la transcripcion se puede detectar o medir mediante amplificacion selectiva utilizando cebadores espedficos. La deteccion de la infidelidad de la transcripcion mediante amplificacion selectiva generalmente comprende colocar una muestra en contacto con un cebador de acido nucleico que amplifica de modo espedfico una secuencia de infidelidad de la transcripcion, y detectar la presencia (o la cantidad) de los productos de la amplificacion formados, siendo dicha presencia o cantidad una indicacion directa de la presencia o la tasa de la infidelidad de la transcripcion. En una realizacion preferida, el metodo utiliza un conjunto de cebadores de acidos nucleicos que permiten una amplificacion espedfica de una secuencia de infidelidad de la transcripcion diferenciada de uno o varios genes, respectivamente. La amplificacion puede realizarse segun diversas tecnicas conocidas per se en la tecnica tales como, sin limitacion, la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la reaccion en cadena de la ligasa (LCR), la amplificacion mediada por la transcripcion (TMA), la amplificacion por desplazamiento de hebra (SDA), y la amplificacion basada en la secuencia del acido nucleico (NASBA).

Los cebadores de acidos nucleicos espedficas para una secuencia de infidelidad de la transcripcion pueden prepararse para cualquier gen utilizando la informacion de la secuencia y las reglas de sustitucion, insercion o delecion de nucleotidos segun se describe en la presente solicitud (vease, por ejemplo, el ejemplo 5).

El termino “cebador” indica un acido nucleico o un oligonucleotido que tiene una secuencia polinucleotidica que es 5 capaz de una hibridacion selectiva con una secuencia de infidelidad de la transcripcion o su complemento, o con una region de un acido nucleico que flanquea un sitio de infidelidad de la transcripcion, y que es adecuado para amplificar todo o parte de dicho sitio de infidelidad de la transcripcion en una muestra que contenga dicha secuencia o complemento. Tfpicamente los cebadores se pueden seleccionar entre moleculas de acidos nucleicos monocatenarios con una longitud de aproximadamente 5 a 60 nucleotidos, mas preferiblemente una longitud de 10 aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleotidos, aun mas preferiblemente una longitud de aproximadamente 10 a 40, 35, 30 o 25 nucleotidos. Se prefiere una complementariedad perfecta, para asegurar una alta especificidad. Sin embargo, pueden tolerarse ciertos desapareamientos, tal como se analizo anteriormente para las sondas.

El termino “flanquea” indica que la region debe localizarse a una distancia del sitio de infidelidad de la transcripcion que sea compatible con las actividades polimerasa convencionales, por ejemplo, no mas de 250 pb, preferiblemente 15 no mas de 200, 150, 100 o, mas preferiblemente, 50 pb cadena arriba de dicho sitio.

Esta invencion tambien describe al menos un par de cebadores de acidos nucleicos, en el que dicho par de cebadores comprende un cebador directo y un cebador inverso, y en el que dichos cebadores directo e inverso permiten la amplificacion selectiva de una secuencia de infidelidad de la transcripcion, o de la secuencia exactamente complementaria, por ejemplo, en la figura 12.

20 La infidelidad de la transcripcion se puede medir mediante una cromatograffa lfquida de alta resolucion desnaturalizante (DHPLC). El principio de este metodo se describe, por ejemplo, en la figura 11. Basicamente, los productos de la amplificacion se desnaturalizan y se reasocian. Durante la reasociacion se forman homoduplex y heteroduplex, como resultado de la presencia de secuencias de infidelidad de la transcripcion. La mezcla entonces se analiza mediante DHPLC. Puesto que las estructuras de ADN heteroduplex y homoduplex son diferentes en la 25 temperatura del analisis se eluyen de modo diferente y su cantidad (relativa) puede evaluarse.

Como verificacion de que las secuencias de infidelidad de la transcripcion existen en celulas cancerosas con una frecuencia mas alta que en celulas normales, la infidelidad de la transcripcion predicha de genes seleccionados (ENO1, GAPDH, TMSB4X) se amplifica mediante RT-PCR utilizando los oligonucleotidos indicados (vease el ejemplo 6). Se verificaron las variaciones de homo- y heteroduplex (figura 15).

30 Otra tecnica adecuada para detectar acidos nucleicos puede utilizarse o adaptarse para detectar, cuantificar o controlar la infidelidad de la transcripcion.

Deteccion de la infidelidad de la transcripcion a nivel de protemas

Debido a que la infidelidad de la transcripcion conduce a cambios en la secuencia de protemas, la presencia o el nivel de infidelidad de la transcripcion tambien puede medirse detectando la presencia o la cantidad de protemas-IT.

35 Pueden utilizarse y/o adaptarse diversas tecnicas conocidas per se en la tecnica para medir la infidelidad de la

transcripcion en protemas. En particular, puesto que la infidelidad de la transcripcion provoca modificaciones en las protemas que conducen a cambios directos en su comportamiento, estos cambios puede detectarse, por ejemplo, mediante una electroforesis en gel bidimensional y espectrometna de masas, o mediante ionizacion de desorcion por laser inducida en superficie. Como verificacion de que una protema-IT esta presente en plasma humano, los 40 inventores muestran el perfil de espectrometna de masas de un peptido localizado despues del codon de fin canonico de ApoAII. Los datos de la espectrometna de masas muestran que la arginina esta sustituida en el codon de fin canonico. Ademas, puesto que la infidelidad de la transcripcion provoca la aparicion de isoformas de protemas (celulares y plasmaticas) mas largas y mas cortas (como resultado del codon de fin prematuro debido a la sustitucion de bases, o una conmutacion en el marco de lectura abierto en el caso de deleciones o inserciones), dichas

45 isoformas pueden detectarse o cuantificarse utilizando sus ligandos espedficos y/o estrategias de secuenciacion de

protemas. A este respecto, los inventores demuestran que los cambios en la longitud de la protema y de la secuencia primaria de AA se producen predominantemente en el dominio carboxi-terminal de la protema. Por consiguiente, las estrategias de secuenciacion deben dirigirse principalmente al extremo C-terminal de las protemas, una region previamente insospechada (en efecto, los metodos de secuenciacion de protemas directos que se 50 emplean en la actualidad solo pueden realizarse comenzando en el AA NH2-terminal).

La deteccion de la infidelidad de la transcripcion utilizando ligandos espedficos generalmente comprende colocar una muestra en contacto con un ligando que sea espedfico para un dominio de una protema-IT, y detectar la presencia (o cantidad del complejo formado, siendo dicha presencia o cantidad una indicacion directa de la presencia o la tasa de la infidelidad de la transcripcion. En una realizacion preferida, el metodo emplea un conjunto 55 de ligandos que son espedficos para dominios diferenciados de una o varias protemas-IT, respectivamente. Los ligandos espedficos para estos dominios pueden prepararse para cualquier protema utilizando la informacion de la secuencia y las reglas de sustitucion de aminoacidos segun se describe en la presente solicitud (vease, por ejemplo, el ejemplo 5). El ligando puede utilizarse en forma soluble, o puede revestirse sobre una superficie o un soporte.

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La invencion tambien describe ligandos que se unen de modo selectivo a un dominio de una protema-IT. Pueden contemplarse diferentes tipos de ligandos, tales como anticuerpos espedficos, moleculas sinteticas, aptameros, peptidos y similares.

El ligando puede ser un anticuerpo, o su fragmento o derivado. Por consiguiente, un aspecto concreto de esta invencion reside en un anticuerpo que se une de modo espedfico a un dominio de una protema-IT.

Dentro del contexto de esta invencion, un anticuerpo indica un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, asf como sus fragmentos o derivados que tienen sustancialmente la misma especificidad de antigeno. Los fragmentos incluyen, por ejemplo, Fab, Fab'2, regiones CDR, etc. Los derivados incluyen anticuerpos monocatenarios, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos polifuncionales, etc.

Los anticuerpos contra dominios de protemas-IT pueden producirse mediante procedimientos conocidos en general en la tecnica. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos policlonales inyectando el dominio de la protema-IT (por ejemplo, como una protema o un peptido) solo o acoplado con una protema adecuada en un animal no humano. Despues de un periodo apropiado se sangra al animal, se recupera el suero y se purifica mediante tecnicas conocidas en la tecnica (Paul, W.E., “Fundamental Immunology”, 2a ed., Raven Press, NY, p. 176, 1989; Harlow et al., “Antibodies: A Laboratory Manual”, CSH Press, 1988; Ward et al., Nature, 341 (1989), 544).

Pueden producirse peptidos con la misma secuencia que las protemas-IT mediante procedimientos conocidos en general en la tecnica. Estos peptidos pueden acoplarse a un soporte adecuado y utilizarse para la deteccon de autoanticuerpos presentes en muestras biologicas (por ejemplo, fluidos corporales).

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales contra dominios de protemas-IT, por ejemplo, mediante la tecnica de Kohler-Millstein (2) (Kohler-Millstein, Galfre, G., y Milstein, C., Methods Enz., 73, p. 1 (1981)) que implica la fusion de un linfocito B inmunologico con celulas de mieloma. Por ejemplo, un inmunogeno, segun se describio anteriormente, puede inyectarse en un mamffero no humano, segun se ha descrito. Posteriormente se retira el bazo y se realiza la fusion con el mieloma segun una diversidad de metodos. Las celulas de hibridoma resultantes entonces pueden ensayarse para la secrecion de anticuerpos contra dominios de protemas-IT.

Un anticuerpo “selectivo” para un dominio concreto de protemas-IT indica un anticuerpo cuya union a dicho dominio (o a su fragmento que contiene un epitopo) puede discriminarse de modo fiable de la union no espedfica (es decir, de la union a otro antfgeno, en particular a la protema nativa que contiene dicho dominio). Los anticuerpos selectivos para los dominios de las protemas-IT permiten la deteccion de la presencia de protemas que contienen dichos dominios en una muestra.

Diagnostico

La presente invencion describe la realizacion de ensayos de deteccion o de diagnostico que pueden emplearse, entre otras cosas, para detectar la presencia, la ausencia, la predisposicion, el riesgo o la gravedad de una enfermedad a partir de una muestra derivada de un sujeto. Debe considerarse que el termino “diagnostico” incluye metodos de farmacogenomica, prognostico, etc.

La invencion describe un metodo para detectar in vitro o ex vivo la presencia, la ausencia, la predisposicion, el riesgo o la gravedad de enfermedades en una muestra biologica, preferiblemente una muestra biologica humana, que comprende colocar dicha muestra en contacto con un ligando que se une de modo espedfico a un sitio de infidelidad de la transcripcion, y determinar la formacion de un complejo.

Esta invencion tambien describe un metodo para detectar la presencia, la ausencia, la predisposicion, el riesgo o la gravedad de canceres en un sujeto, comprendiendo dicho metodo colocar in vitro o ex vivo una muestra procedente de un sujeto en contacto con un ligando que se une de modo espedfico a un sitio de infidelidad de la transcripcion expresado por las celulas del cancer, y determinar la formacion de un complejo.

Esta invencion tambien describe un metodo para evaluar la respuesta o la sensibilidad de un sujeto a un tratamiento de un cancer, comprendiendo dicho metodo detectar la presencia o la tasa de la infidelidad de la transcripcion en una muestra procedente del sujeto en diferentes momentos antes y durante el desarrollo del tratamiento.

Esta invencion tambien describe un metodo para determinar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad cancerosa, comprendiendo dicho metodo (i) proporcionar una muestra de tejido procedente del sujeto durante o despues de dicho tratamiento, (ii) determinar la presencia y/o la tasa de la infidelidad de la transcripcion en dicha muestra, y (iii) comparar dicha presencia y/o tasa con la cantidad de infidelidad de la transcripcion en una muestra de referencia procedente de dicho sujeto tomada antes o en una etapa mas temprana del tratamiento.

La presencia (o aumento) de la infidelidad de la transcripcion en una muestra es indicativa de la presencia, la predisposicion o la etapa de avance de una enfermedad cancerosa. Por tanto, la invencion describe el diseno de la intervencion terapeutica apropiada, que sera mas eficaz y personalizada. Ademas, esta determinacion a nivel presintomatico permite aplicar un regimen preventivo.

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Los metodos de diagnostico descritos en la presente invencion pueden realizarse in vitro, ex vivo o in vivo, preferiblemente in vitro o ex vivo. La muestra puede ser cualquier muestra biologica derivada de un sujeto, que contenga acidos nucleicos o polipeptidos, segun sea apropiado. Los ejemplos de dichas muestras incluyen fluidos corporales, tejidos, muestras de celulas, organos, biopsias, etc. Las muestras mas preferidas son sangre, plasma, suero, saliva, orina, fluido seminal y similares. La muestra puede tratarse antes de realizar el metodo, para rendir o mejorar la disponiblidad de los acidos nucleicos o los polipeptidos para el ensayo. Los tratamientos pueden incluir, por ejemplo, uno o mas de los siguientes: lisis celular (por ejemplo, mecanica, ffsica, qrnmica, etc.), centrifugacion, extraccion, cromatograffa en columna, y similares.

Un metodo descrito en la presente invencion consiste en determinar la presencia en muestras humanas de anticuerpos dirigidos contra nuevos peptidos producidos mediante la infidelidad de la transcripcion, y generar una estimulacion inmunologica que conduzca a la produccion de anticuerpos. Un segundo metodo de esta invencion se dirige a la deteccion de celulas que portan estructuras inmunologicas dirigidas contra los peptidos de infidelidad de la transcripcion.

Disenos de farmacos y terapia

Tal como se analizo anteriormente, la invencion describe el diseno (o la seleccion) de nuevos farmacos evaluando la capacidad de una molecula candidata para modular la infidelidad de la transcripcion. Estos metodos incluyen ensayos de union y/o ensayos (de actividad) funcionales, y pueden realizarse in vitro (por ejemplo, en sistemas celulares o en ensayos no celulares), en animales, etc.

Esta invencion describe un metodo para seleccionar, caracterizar, buscar u optimizar un compuesto biologicamente activo, comprendiendo dicho metodo determinar in vitro si un compuesto de ensayo modula la infidelidad de la transcripcion. La modulacion de la infidelidad de la transcripcion puede evaluarse con respecto a un gen o una protema concretos, o con respecto a un conjunto predefinido de genes o protemas, o de modo global.

La presente invencion tambien describe un metodo para seleccionar, caracterizar, buscar u optimizar un compuesto biologicamente activo, comprendiendo dicho metodo colocar in vitro un compuesto de ensayo en contacto con un gen, y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo para modular la produccion, a partir de dicho gen, de moleculas de ARN que contengan sitios de infidelidad de la transcripcion.

La invencion tambien describe un metodo para seleccionar, caracterizar, buscar y/u optimizar un compuesto biologicamente activo, comprendiendo dicho metodo poner en contacto un compuesto de ensayo con una celula, y determinar, en dicha celula, si el compuesto de ensayo modula la infidelidad de la transcripcion.

Los anteriores ensayos de seleccion pueden realizarse en cualquier dispositivo adecuado, tal como placas, tubos, platos, matraces, etc. Generalmente, el ensayo se realiza en placas de microvaloracion de multiples pocillos. Por ejemplo pueden ensayarse varios compuestos en paralelo. Ademas, el compuesto de ensayo puede tener diversos ongenes, naturaleza y composicion. Puede ser una sustancia organica o inorganica, tal como un lfpido, un peptido, un polipeptido, un acido nucleico, una molecula pequena, aislados o mezclados con otras sustancias. Los compuestos pueden ser todo o parte de un banco combinatorio de compuestos, por ejemplo.

Los compuestos que modulan la infidelidad de la transcripcion pueden tener muchas utilidades, tales como utilidades terapeuticas, para reducir o aumentar la infidelidad de la transcripcion en una celula. Dichos compuestos pueden utilizarse para tratar (o prevenir) enfermedades provocadas o asociadas con una infidelidad de la transcripcion anomala, tales como enfermedades proliferativas (por ejemplo, canceres), enfermedades inmunologicas, envejecimiento, enfermedades inflamatorias, etc.

Otros compuestos descritos en la presente invencion son compuestos que se dirigen a la infidelidad de la transcripcion, es decir, compuestos que se unen de modo selectivo a sitios de infidelidad de la transcripcion. Estos compuestos (por ejemplo, anticuerpos, ARNi, etc.) pueden utilizarse como reactivos de diagnostico, o como agentes terapeuticos, solos o conjugados con un marcador.

Los compuestos que modulan o se dirigen a la infidelidad de la transcripcion que se describen en la presente invencion pueden administrarse mediante cualquier via adecuada, que incluye la via oral, o mediante administracion sistemica, por inyecciones intravenosas, intraarteriales, intracerebrales o intratecales. La dosificacion puede variar dentro de amplios lfmites, y debera ajustarse a las necesidades del individuo en cada caso concreto, dependiendo de diversos factores conocidos por los expertos en la tecnica. Puede utilizarse cualquier forma de dosificacion farmaceuticamente aceptable conocida en la tecnica, tal como cualquier disolucion, suspension, polvo, gel, etc., incluyendo disoluciones isotonicas, disoluciones tamponadas y disoluciones salinas, etc. Los compuestos pueden administrarse por sf solos, pero en general se administran con un vehfculo farmaceutico, con respecto a la practica farmaceutica convencional (tal como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing). Los anticuerpos pueden administrarse segun metodos y protocolos conocidos per se en la tecnica, que se emplean en la actualidad en terapias y ensayos humanos.

Efecto de la infidelidad de la transcripcion sobre la funcion celular normal

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En general se acepta que las protemas son responsables de la mayona de las funciones celulares. Sin embargo, tambien es evidente que el ARN conocido como ARN no codificador tambien es una molecula funcional en sf misma. Estas transcripciones, cuya importante ha sido subestimada, estanan presentes en muchos organismos y regulan muchas funciones celulares. Entre estos, se encuentran ARNr, ARNt, ARNtm (ARN transmensajero), pero tambien otros ARN no codificadores (ARNsno, ARNsn, etc.) que intervienen en las modificaciones postranscripcionales del ARN, en el corte y empalme u otras funciones celulares. Las funciones del ARN y de las protemas pueden verse afectadas por la falta de infidelidad de la transcripcion descrita en esta solicitud. La secuencia de ADN se transcribe en ARNm en el nucleo por la accion de una protema denominada ARN polimerasa II que reconoce la secuencia de la molecula de ADN y sintetiza un polfmero monocatenario de nucleotidos que es complementario con el molde de ADN de origen. El orden y el tipo de base del ARN en cualquier posicion concreta viene determinado por el orden y el tipo de base presente en la hebra de ADN que actua como molde. El extremo 5' del ARN transcrito, que se corresponde con la primera base del ARNm, se une a 7-metilguanilato unido al nucleotido inidical, constituyendo asf 5' CAP que protege al ARN de la degradacion. Esta modificacion se produce antes de que se haya completado la transcripcion. El procesamiento en el extremo 3' de la transcripcion primaria implica la ruptura por una endonucleasa para producir un grupo 3'-hidroxilo libre al cual se anade una cadena de restos adenina por una enzima denominada poli(A) polimerasa. La cola de poli(A) resultante contiene entre 100-250 nucleotidos. La etapa final del procesamiento es el corte y empalme, que consiste en la escision de la transcripcion primaria del elemento que corresponde a las secuencias intronicas, seguido del acoplamiento de los exones. Este proceso es controlado por numerosas protemas y ARNnc, parte de los cuales se une al ARN. Es posible que esta union sea una etapa que se vea afectada por la falta de infidelidad de la transcripcion. En efecto, todas estas protemas estan codificadas por un ARN espedfico; por tanto, la funcion de estas protemas puede verse potencialmente afectada por la falta de infidelidad de la transcripcion. El proceso, muy complejo, de la maduracion conduce a la produccion de ARNm que sera exportado desde el nucleo para que se produzca la traduccion. Es importante reconocer que, en esta etapa, no todos los tripletes de nucleotidos que estan presentes en el ARNm maduro seran traducidos a AA. El ARN mensajero maduro contiene regiones no codificadoras denominadas regiones 5' y 3' no traducidas que tienen importancia funcional para determinar la estabilidad global del ARNm y otros papeles en la traduccion. Para trasladar de forma eficaz la informacion contenida en el ADN a la secuencia de AA apropiada de la protema, se requiere una fidelidad absoluta de la transcripcion. En efecto, cualquier error que se produzca durante la transcripcion o durante los procesos de maduracion dara como resultado potencialmente la introduccion de cambios en la estabilidad del ARNm y, en ultimo termino, una variacion en la secuencia primaria de AA de la protema. Estas variaciones en la secuencia de la protema pueden entonces exacerbar el fenomeno de la infidelidad de la transcripcion mediante la alteracion de la secuencia de la protema implicada en el inicio de la transcripcion, en la propia transcripcion, en la formacion del casquete 5' del ARN, en la poliadenilacion 3', en el corte y empalme del ARN y/o en la exportacion del ARN. Por tanto, la demostracion descrita en esta invencion de que la infidelidad de la transcripcion afecta a un gran numero de genes aislados a partir de celulas del cancer abre la posibilidad de que el fenomeno pueda exacerbarse, conduciendo a un aumento progresivo en la gravedad de la enfermedad. La variacion en las secuencias de ARN introducida por la infidelidad de la transcripcion puede tener consecuencias inmediatas sobre la funcion celular. En efecto, la introduccion de bases en la transcripcion primaria del ARN que no son complementarias con las del molde de ADN tiene consecuencias potenciales inmediatas sobre la secuencia primaria de AA de la protema resultante. Cuando el cambio afecta a las primeras 2 bases del codon, generalmente ejerce un impacto directo sobre la secuencia de AA. Las variaciones que afectan a la tercera base del codon tendran un impacto menor sobre la secuencia de AA de la protema, porque el codigo genetico esta degenerado. Por tanto, los cambios en la base localizada en la tercera posicion del codon pueden no influir directamento a la secuencia de AA de la protema. Basandose en los datos descritos a continuacion, los inventores creen que la infidelidad de la transcripcion es un fenomeno que afecta a todas las bases independientemente de su posicion en el codon y, por tanto, impacta sobre la secuencia primaria de AA de la protema. Los cambios en la protema pueden ser neutros o provocar una modificacion de la funcion de la protema, tanto un aumento como la perdida de actividad. El fenomeno de la infidelidad de la transcripcion se observa predominantemente despues de codificar y completar al menos las primeras 400-500 bases del ARNm maduro; el extremo 5' del ARNm se ve relativamente menos afectado. Se cree que estaran presentes fragmentos mas cortos, y tambien mas largos, de la protema en las celulas del cancer, asf como en el plasma de los pacientes con cancer. Estas isoformas mas cortas y mas largas pueden deducirse directamente de las reglas de la infidelidad de la transcripcion descritas a continuacion. Esto permite la produccion de metodos disenados de forma logica para la identificacion de marcadores espedficos del cancer o de la gravedad de la enfermedad inmunologica. Debido a que la tasa de transcripcion de la mayona de los genes esta controlada para adaptarse a las necesidades celulares, se propone que la infidelidad de la transcripcion provoca cambios en la expresion genica directamente debidos a una excesiva funcion de la protema o a la falta de funcion de esta. Por tanto, el fenomeno de la infidelidad de la transcripcion ejerce un profundo efecto sobre la capacidad celular para realizar su tarea. La identificacion de este defecto como una caractenstica comun a la mayona de los genes aislados de todos los tipos de celulas del cancer proporciona, por tanto, un fundamento para la busqueda de nuevos metodos que permitan la medicion cuantitativa de la tasa de la infidelidad de la transcripcion en cualquier celula concreta. Este ensayo de seleccion permite el ensayo de nuevos farmacos capaces de limitar la infidelidad de la transcripcion, evitando asf el avance de la enfermedad y restableciendo la funcion celular normal.

Infidelidad de la transcripcion y patolog^a

La presente invencion describe que la infidelidad de la transcripcion conduce a importantes cambios en la secuencia

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de las protemas. La funcion de cualquier protema concreta viene determinada por su estructura tridimensional que depende directamente de su secuencia de AA. Las protemas con un AA variante, un truncamiento de la protema o un alargamiento de la protema pueden producir una modificacion profunda de la actividad de la protema o permanecer neutras. Los ejemplos de protemas modificadas que inhiben significativamente la funcion de sus homologos normales se han descritos. La infidelidad de la transcripcion es un fenomeno que afecta a un gran numero de genes, produciendo con ello un gran numero de protemas. Debido a que varias de estas protemas participan en mantener estable la estructura del ADN y participan en la reparacion del ADN, una funcion defectuosa de estas protemas puede producir una reparacion defectuosa del ADN y dar como resultado una capacidad significativamente disminuida de las celulas para reparar con exito el ADN danado. Debido a que la fidelidad de la transcripcion en las celulas normales es debida a la actividad de varios complejos de protemas que controlan la transcripcion, es bastante probable que unas pequenas alteraciones iniciales de estas protemas puedan exacerbar progresivamente el fenomeno. Esto producira, en ultimo termino, una mayor tasa de infidelidad de la transcripcion que, por consiguiente, suprimira el estado de diferenciacion celular y conducira a formas cada vez mas graves de la enfermedad. La demostracion de que la infidelidad de la transcripcion realmente se produce en las celulas del cancer y que conduce a una amplia diversificacion de las protemas codificadas por cualquier gen concreto abre un area nueva para la seleccion de nuevas sondas de diagnostico y para el diseno de nuevas dianas terapeuticas.

La presente invencion describe un nuevo fenomeno que contribuye a la diversificacion de la informacion presente en el ADN y que sigue una reglas espedficas. Este proceso de infidelidad de la transcripcion no aleatoria se ve muy exacerbado en celulas del cancer, pero tambien se produce en celulas normales siguiendo las mismas reglas. Este mecanismo introduce bases nuevas en el ARNm, provocando asf cambios profundos en el mensaje que sera traducido a nivel de ribosomas. Es probable que el fenomeno sea bastante general, porque esta presente en la mayona de los genes ensayados. La consecuencia inmediata de la infidelidad de la transcripcion es que un unico gen puede producir muchas mas protemas de las sospechadas. Por tanto, el descubrimiento de los inventores tiene el potencial de explicar en parte la relativa discrepancia entre el numero limitado de genes presentes en el genoma y el gran numero de protemas presentes en las muestras biologicas. Los inventores han demostrado que la infidelidad de la transcripcion es un proceso no aleatorio y esta gobernado por reglas espedficas, algunas de las cuales ya se han descrito en la presente. Algunas sera reveladas por una mayor caracterizacion del proceso utilizando metodos de bioinformatica y biologicos. Los inventores se han centrado en la presente en la implicacion de la infidelidad de la transcripcion en el cancer. Sin embargo, creen que el proceso es general y que puede contribuir a generar la diversidad de protemas. Esta diversificacion de las protemas puede ejercer una influencia significativa sobre la capacidad del sistema inmunologico para reconocer un patron de protemas espedfico. A este respecto, se cree que la infidelidad de la transcripcion desempena un papel en la patogenesis de las enfermedades inmunologicas. Los inventores han considerado en la presente los acontecimientos de infidelidad de la transcripcion que conducen a la sustitucion de una sola base. Se han centrado en las sustituciones de una sola base porque no es probable que este mecanismo provoque una desestabilizacion significativa de la estructura del ARNm. Por tanto, las sustituciones de una sola base no debenan interferir con la traduccion, sino ser reconocidas como un nuevo mensaje autentico. A continuacion se vera que tambien se espera que la infidelidad de la transcripcion provoque deleciones y/o inserciones de bases. El mismo metodo descrito anteriormente detectara mecanismos alternativos de infidelidad de la transcripcion.

El nuevo proceso descrito en esta solicitud tiene varias aplicaciones practicas inmediatas.

Optimizacion de los experimentos proteomicos para identificar nuevos biomarcadores espedficos de enfermedades y para disenar nuevos anticuerpos que se dirigiran a protemas de la enfermedad espedficas

Basandose en las indicaciones de la presente solicitud, ahora es posible predecir los cambios que pueden producirse en cualquier secuencia de protema como resultado de la infidelidad de la transcripcion y, por tanto, predecir los cambios en las propiedades fisicoqmmicas, tales como las masas moleculares aparentes y los puntos isoelectricos. Esto puede producir unos patrones de protemas modificados en geles bidimensionales y en espectrometna de masas. Debido a que la infidelidad de la transcripcion afecta a la mayona de los genes, ahora es posible centrarse en un conjunto limitado de protemas y caracterizar sus cambios para identificar biomarcadores espedficos de enfermedades (por ejemplo, canceres). Los algoritmos de la infidelidad de la transcripcion pueden acelerar el proceso de descubrimiento de biomarcadores. Como alternativa, es posible disenar anticuerpos espedficos dirigidos contra dominios de protemas-IT, es decir, los dominios de las protemas que contienen AA modificados, asf como nuevos AA adicionales que extienden la protema nativa generada mediante la infidelidad de la transcripcion. Los anticuerpos dirigidos contra estos dominios seran espedficos para el variante de la protein y, por tanto, estaran dirigidos hacia protemas espedficas de enfermedades (por ejemplo, cancer) presentes en un fluido corporal, en la superficie celular, o en el interior de las celulas del cancer. Estos anticuerpos se emplearan para detectar protemas caractensticas de un trastorno patologico en fluidos corporales, para detectar celulas enfermas circulando en el plasma, para identificar celulas enfermas en muestras histologicas, para evaluar la gravedad de una enfermedad, y tambien para dirigir medicaciones hacia celulas enfermas espedficas. Esto puede lograrse mediante la transferencia genica de secuencias propensas a la infidelidad de la transcripcion mediante un vector de terapia genica, por ejemplo, adenovirus, liposomas, etc. Como alternativa, los inventores han disenado peptidos espedficos que tienen la misma secuencia que un dominio que se produce como consecuencia de la IT. Estos pueden utilizarse para detectar autoanticuerpos espedficos y naturales dirigidos contra los dominios de protemas-IT presentes, por ejemplo, en fluidos corporales.

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La infidelidad de la transcripcion se produce de modo no aleatorio y con frecuencia afecta a los codones de fin del ARNm en una gran proporcion de los genes ensayados. Ademas, puesto que es posible calcular que hasta 6% de cualquier poblacion concreta de ARNm contiene estas secuencias adicionales, por tanto es posible detectar, en una celula cancerosa concreta, una poblacion espedfica de protemas que muestre una nueva secuencia en el extremo carboxi-terminal. La localizacion de estas secuencias, por tanto, no resultaba concebible porque ningun proceso expuesto, excepto las enfermedades geneticas raras que afectan al ADN, ha sido capaz de introducir la lectura dentro del marco de secuencias que siguen inmediatamente a los codones de fin canonicos. Previamente no se sospechaba la existencia de estas secuencias ocultas. El descubrimiento de la infidelidad de la transcripcion que conduce a la sustitucion de una sola base que se produce en los codones de fin canonicos revela la existencia de dichas secuencias codificadoras y tambien demuestra que su presencia aumenta en celulas del cancer porque la infidelidad de la transcripcion esta potenciada en estas celulas. Por tanto, es posible identificar y localizar estas secuencias que normalmente estan escondidas para disenar nuevos farmacos espedficos del cancer.

Una delecion o insercion de una sola base en relacion con la IT que se produce en las secuencias codificadoras conduce a una conmutacion en el marco de lectura. Como convergencia, las secuencias en la protema correspondiente se modifican (un cambio en la secuencia de AA y en la longitud de la protema). Por tanto, se puede detectar, en un celula cancerosa concreta, una poblacion espedfica de protemas que muestren una secuencia nueva. Por tanto, es posible identificar y localizar estas secuencias que normalmente estan escondidas para disenar nuevos farmacos espedficos del cancer.

Debido a la existencia de secuencias de protemas nuevas o modificadas, y considerando que estas alteraciones estan presentes en las protemas presentes sobre la superficie celular, se propone utilizar estas secuencias para vacunar contra secuencias espedficas de enfermedades. Estas vacunaciones se utilizaran para activar respuestas inmunologicas en pacientes diagnosticados con cualquier forma concreta de enfermedad (por ejemplo, cancer) o para iniciar respuestas inmunologicas preventivas en pacientes con mayor riesgo de desarrollar enfermedades espedficas (por ejemplo, cancer) debido a una predisposicion genetica o debido a una mayor exposicion a riesgos o toxinas ambientales.

Por tanto, esta invencion describe un metodo para detectar la presencia o la etapa de una enfermedad en un sujeto, comprendiendo dicho metodo evaluar (in vitro o ex vivo) la presencia o la tasa de la infidelidad de la transcripcion en una muestra procedente de dicho sujeto, siendo dicha presencia o tasa una indicacion de la presencia o etapa de una enfermedad en dicho sujeto. La muestra puede ser cualquier tejido, celula, fluido, biopsia, etc., que contenga acidos nucleicos y/o protemas. La muestra puede tratarse antes de la reaccion, es decir, mediante dilucion, concentracion, lisis, etc. El metodo comprende generalmente evaluar la infidelidad de la transcripcion de una serie de genes o protemas diferenciados, tales como protemas plasmaticas, protemas de la superficie celular, etc.

Esta invencion tambien describe un metodo para tratar a un sujeto que lo necesite, el metodo comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un compuesto que altera (p. ej., reduce o aumenta) la tasa de la infidelidad de la transcripcion de un gen de mairnfero.

Esta invencion tambien describe el uso de un compuesto que altera (por ejemplo, reduce o aumenta) la tasa de la infidelidad de la transcripcion de un gen de marnffero para la fabricacion de una composicion farmaceutica para su uso en un metodo de tratamiento de un ser humano o animal, en particular para tratar un trastorno de celulas proliferativas, tal como canceres y enfermedades inmunes.

La invencion tambien describe un metodo para evaluar la eficacia de un farmaco o de un candidato a farmaco, comprendiendo dicho metodo una etapa de evaluar si dicho farmaco altera la tasa de la infidelidad de la transcripcion de un gen de mam^era, de forma que dicha alteracion es una indicacion de la eficacia del farmaco.

La invencion tambien describe un metodo para identificar y/o producir biomarcadores, comprendiendo dicho metodo identificar, en una muestra procedente de un sujeto, la presencia de un sitio o sitios de infidelidad de la transcripcion en una protema, ARN o gen diana y, opcionalmente, determinar la secuencia de dicho sitio o sitios de infidelidad de la transcripcion. Por ejemplo, la protema diana es una protema de la superficie celular o una protema segregada, en particular una protema de la superficie celular o una protema plasmatica.

La invencion describe un metodo para producir o identificar ligandos espedficos para un rasgo o un trastorno patologico, comprendiendo dicho metodo identificar, en una muestra procedente de un sujeto que tiene dicho rasgo o trastorno patologico, la presencia de un sitio o sitios de infidelidad de la transcripcion en una o varias protemas, ARN o genes diana, opcionalmente determinando la secuencia de dicho sitio o sitios de infidelidad de la transcripcion, y produciendo un ligando o ligandos que se unen de modo espedfico a dicho sitio o sitios de infidelidad de la transcripcion.

La invencion es particularmente adecuada para identificar biomarcadores de trastornos de celulas proliferativas, tales como canceres, enfermedades inmunes, inflamacion o envejecimiento. Es particularmente util para producir

ligandos que son espedficos para tales trastornos en mamnferos, en particular ligandos que pueden detectar la presencia o gravedad de un trastorno de celulas proliferativas en un sujeto.

En particular, esta invencion describe un peptido (sintetico) que comprende un sitio de infidelidad de la transcripcion de una protema, en particular de una protema de mamnfero, mas preferiblemente de una protema humana. El 5 peptido generalmente comprende un fragmento interno de la protema, o la secuencia de un fragmento C-terminal de dicha protema. El peptido preferiblemente comprende menos de 100, 80, 75, 70, 65, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25 o incluso 20 aminoacidos. La protema puede ser una protema de la superficie celular (por ejemplo, un receptor, etc.), una protema segregada (por ejemplo, una protema plasmatica), o una protema intracelular. Los ejemplos de dichas protemas plasmaticas se proporcionan, por ejemplo, en la figura 13, e incluyen apolipoprotemas (por ejemplo, AI, 10 AII, CI, CII, CIII, D, E), componentes del complemento (por ejemplo, C1s, C3, C7), protema reactiva C, inhibidores de serpina peptidasa, fibrinogeno (por ejemplo, FGA1, FGA2), plasminogeno, transferrina, transtiretina, etc. Los ejemplos de receptores de la superficie celular incluyen, por ejemplo, receptores de citoquinas y receptores de hormonas, etc. En una realizacion espedfica, la invencion se refiere a un peptido sintetico que comprende un sitio de infidelidad de la transcripcion de una protema plasmatica humana o un receptor de la superficie celular 15 abundantes, tal como se listo anteriormente.

Los ejemplos espedficos de dichos peptidos se describen en las figuras 10, 14 y 18. De modo mas espedfico, los ejemplos de peptidos sinteticos de la presente invencion comprenden toda o un fragmento de las siguientes secuencias de aminoacidos:

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QMWQLFWIYHLSS (TPT1) (SEQ ID NO: 1)KLHTLSAAIYYQQE (VIM) (SEQ ID NO: 2)

DFLSNK (RPS6) (SEQ ID NO: 3)MYTVEFSVHKNN (RPL7A) (SEQ ID NO: 4)NGSLGDMSDLCT (RPS4X) (SEQ ID NO: 5)ASG (FTH1) (SEQ ID NO: 6) EPSEPSDF (FTL) (SEQ ID NO: 7)

APSIFPTLPAKPGTKQPRSPVTALSLHMLLMVSSAPSCGLIQTVSSFTVYIFTL (TPI1) (SEQ ID NO:

8)ARHGRDEEVWHRKHSHHFVQAWAWVGGLVCWPRKCHMRSTLISSLDSLLPVIPHRTEAEWW VMFDRRH (AHSG) (SEQ ID NO: 9)

RSKAYSSVFLFRWCKANTLSKKHKFL (ALB) (SEQ ID NO: 10) GLDSTRALENEMTV (APCS) (SEQ ID NO: 11)

GARRRPPSRCSE (APOA1) (SEQ ID NO: 12)

SVQTIVFQPQLASRTPTGQS (APOA2) (SEQ ID NO: 13)

IVFQPQLASRTPTGQS (APOA2) (SEQ ID NO: 14)QPDPPSVDKGRVPYSPDPPGSD (APOC2) (SEQ ID NO: 15) DPPSVDKGRVPYSPD (APOCII) (SEQ ID NO: 16)

DLNTPSPPAYPSCELLGSCNLQGCPCRLLKRDSILSALLPHLMPGPPPGMLASQ (APOC3) (SEQ ID NO: 17)

PGSTGRLHPLHVTSASLSPTPPPPHKDKPINHDKGS (APOD) (SEQ ID NO: 18) TPKPAAMRPHATPCLLPPRSLQRETLSPPQPSSWGGP (APOE) (SEQ ID NO: 19)

EARVGGNVGSQTQ (AZGP1) (SEQ ID NO: 20) PSVLHTARGPRMPRPPLAPAGREPDHLPC (CHI3L1) (SEQ ID NO: 21)

DVDVAFAPTGASESSSPQDELQPPRESSARHQVTRPQPPGPQLRPASPRSGSCTLTLDSAAHGK NRIAPACN (CLU) (SEQ ID NO: 22)

NVIPLKRKMNNTLN (HRG) (SEQ ID NO: 23)

TPAARLMWSSNMPYFAQKTAKDMTSSWLQPRFIFLFVVN (IGFBP3) (SEQ ID NO: 24)

GWGVFLLNPMAGGHAPTIISWEERQSWEIDGSHSSLLSLLCLWATLPTPLLSQ (INHA) (SEQ ID NO: 25)

TGPTHHSPSPSISTWCLVPVHSVNKKP (KLK11) (SEQ ID NO: 26) WTPEPLLQPLSHPLPPAHPLGQQRL (PKM2) (SEQ ID NO: 27)

LDGRQSDALTHLEAGTWVGI (PLG) (SEQ ID NO: 28)

SLPSS'SGALSKELGMQAGCLGLWAQPGPCAPSGHGMCGPVCLSLEGDSDSLCSSHMHRGPWTLQ SGGSWAS (SERPINA3) (SEQ ID NO: 29)

NLRGRAATKVKMGTQMIHEFALVSLAQWCANHVCLHSSVLPCVLNKK (TF) (SEQ ID NO: 30)

GPAPPRPAPAGPAPPRPAPAALPMGAVFKDTRAPSPPGAPLKMERGLRISVSLGACLGSPS'LTF PHSHSLSLPLCLLLPVCTIPLPGIKAQGTSGEHYCS (TGFB1) (SEQ ID NO: 31)

GTSPPVDLKDEGWDFM (TTR) (SEQ ID NO: 32)

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Otro aspecto de esta invencion se refiere al uso de un peptido con una longitud de 100 aminoacidos o menos, que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 1 a 5, 7 a 13, 15 a 18 y 20 a 32 para detectar o controlar trastornos de celulas proliferativas.

Un aspecto adicional de esta invencion se refiere al uso de un peptido, tal como se describio anteriormente, como inmunogeno. La invencion tambien se refiere a una composicion de vacuna que comprende dicho peptido, tal como se definio anteriormente, y opcionalmente un vehmulo, excipiente y/o adyuvante adecuado.

La invencion tambien describe un dispositivo o producto que comprende, inmovilizado sobre un soporte, un reactivo que se une de modo espedfico con sitio de infidelidad de la transcripcion. El reactivo puede ser, por ejemplo, una sonda, o un anticuerpo o su derivado.

La invencion puede utilizarse en cualquier sujeto mairnfero, en particular cualquier sujeto humano, para detectar, controlar o tratar una diversidad de trastornos patologicos asociados con trastornos de celulas proliferativas (p. ej., canceres) y/o para producir, disenar o seleccionar farmacos terapeuticamente activos.

Produccion y utilizacidn de agentes que se dirigen a sitios de infidelidad de la transcripcion

Utilizando las indicaciones de la presente invencion, es posible producir agentes que puedan dirigirse a sitios de infidelidad de la transcripcion, por ejemplo, que se unan a protemas o acidos nucleicos que contengan un sitio de infidelidad de la transcripcion, o a celulas o tejidos que contengan o expresen estas protemas o acidos nucleicos. El agente de transporte dirigido puede ser un anticuerpo (o su derivado), una sonda, un cebador, un aptamero, etc., tal como se describio anteriormente.

Estos agentes de transporte dirigido pueden utilizarse, por ejemplo, como agentes de diagnostico, para detectar, controlar, etc. la infidelidad de la transcripcion en una muestra, tejido, sujeto, etc. Para este fin, el agente puede acoplarse a un resto marcador, tal como un radiomarcador, una enzima, un marcador fluorescente, un tinte luminiscente, etc.

Los agentes de transporte dirigido tambien pueden utilizarse como molecula terapeutica, por ejemplo, para tratar una celula o tejido u organismo que muestre una infidelidad de la transcripcion anomala. El agente puede utilizarse como tal, o preferiblemente puede acoplarse a una molecula activa, tal como una molecula toxica, un farmaco, etc.

Esta invencion describe un metodo para producir un agente que se dirige a la infidelidad de la transcripcion, comprendiendo dicho metodo (i) identificar un sitio de infidelidad de la transcripcion de una protema o un acido nucleico, y (ii) producir un agente que se una de modo selectivo a dicho sitio. El sitio de infidelidad de la transcripcion puede identificarse, por ejemplo, mediante el alineamiento de secuencias disponibles para una molecula de ARN concreta y la identificacion de las variaciones de la secuencia, en particular en el extremo 3'. Los sitios de infidelidad de la transcripcion tambien pueden identificarse aplicando las reglas de la infidelidad de la transcripcion, segun se describe en la presente solicitud (vease, por ejemplo, el ejemplo 5) o reglas nuevas que se describan despues, a cualquier secuencia genica. Entonces puede producirse una molecula de peptido o de acido nucleico que comprenda dicho sitio identificado utilizando metodos convencionales. La invencion describe la etapa (i) del metodo que comprende identificar un sitio de infidelidad de la transcripcion de una protema segregada o de la superficie celular (por ejemplo, un receptor, etc.), o de un acido nucleico. En efecto, las protemas segregadas y las protemas de la superficie celular pueden ser localizadas con facilidad utilizando un agente de transporte dirigido que se pone en contacto con la celula o se administra a un sujeto. Los ejemplos de dominios de dichas protemas-IT se describen en los ejemplos.

Produccion y utilizacion de una vacuna que provoca o estimula o inhibe una respuesta inmunologica contra un dominio de una protena-IT

Utilizando las indicaciones de la presente invencion es posible producir una composicion de vacuna que provoca o inhibe una respuesta inmunologica contra protemas-IT, o contra celulas o tejidos que contengan o que expresen dichas protemas-IT o los correpondientes acidos nucleicos.

Generalmente, la composicion de vacuna comprende, como inmunogeno, una molecula que comprende la secuencia de un sitio de infidelidad de la transcripcion. La composicion de vacuna puede comprender cualquier vehmulo, excipiente o adyuvante farmaceuticamente aceptable. La composicion de vacuna puede utilizarse para generar una respuesta inmunologica contra una celula o tejido enfermo que exprese protemas-IT, que de como resultado la destruccion de dicha celula o tejido por el sistema inmunologico. Como alternativa, la composicion de vacuna puede utilizarse para inducir una tolerancia contra los sitios de infidelidad de la transcripcion implicados en enfermedades autoinmunologicas.

La invencion tambien describe un metodo para producir un inmunogeno que provoca, estimula o inhibe una respuesta inmunologica contra un dominio de protemas-IT, o contra una celula o tejido que exprese dicha protema, comprendiendo dicho metodo (i) identificar un sitio de infidelidad de la transcripcion de una protema o de un acido nucleico, y (ii) producir un peptido que comprenda dicho sitio o su variante. El sitio de infidelidad de la transcripcion puede identificarse, por ejemplo, mediante el alineamiento de las secuencias disponibles para una molecula de ARN

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concreta, y la identificacion de las variaciones en las secuencias, en particular en el extremo 3'. El sitio de infidelidad de la transcripcion tambien puede identificarse aplicando las reglas de la infidelidad de la transcripcion, tal como se describe en la presente solicitud (vease, por ejemplo, el ejemplo 5) o reglas nuevas que se describan despues, a cualquier secuencia genica. Entonces puede producirse una molecula de peptido que comprenda dicho sitio identificado utilizando metodos convencionales. En una realizacion preferida, la invencion se refiere a un metodo para producir un anticuerpo, que comprende inmunizar un mairnfero no humano con un peptido de acuerdo con la invencion y recuperar anticuerpos que se unen a dicho peptido o las correspondientes celulas que productoras de anticuerpos.

Reduccion de la infidelidad de la transcripcion en sistemas de produccion de protemas recombinantes

Esta invencion tambien describe un metodo para prevenir o reducir la infidelidad de la transcripcion que puede producirse en sistemas de produccion recombinantes, en particular en sistemas de produccion de protemas terapeuticas. En efecto, dicha infidelidad de la transcripcion puede disminuir el rendimiento de produccion del sistema, o dar como resultado la produccion de mezclas de protemas no caracterizadas que pueden mostrar diversos perfiles de actividad. Por tanto, se recomienda y resulta muy valioso poder reducir la aparicion o la tasa de la infidelidad de la transcripcion en sistemas de produccion recombinantes, tales como sistemas de produccion bacterianos (si las reglas de la infidelidad de la transcripcion son las mismas para sistemas procariotas), sistemas de produccion eucariotas (por ejemplo, levaduras, celulas de mai^ero, etc.). Esta reduccion puede lograrse, por ejemplo adaptando la secuencia de la molecula de acido nucleico codificadora y/o inhibiendo las moleculas de ARN generadas mediante la infidelidad de la transcripcion. Como alternativa, las protemas que contienen sitios de infidelidad de la transcripcion pueden retirarse del medio.

Reduccion de la sensibilidad a la infidelidad de la transcripcion para un gen

Esta invencion tambien describe un metodo para prevenir o reducir la IT que puede producirse en un gen. En efecto, dicha IT puede afectar a la expresion o a la actividad de una protema, o dar como resultado la produccion de mezclas de protemas no caracterizadas que pueden mostrar diversos perfiles de actividad. Por tanto, se recomienda y resulta muy valioso poder reducir la aparicion o la tasa de la infidelidad de la transcripcion para dicho gen. Esta reduccion puede lograrse, por ejemplo, modificando la secuencia del gen (terapia genica) y/o inhibiendo las moleculas de ARN generadas mediante la infidelidad de la transcripcion. Como alternativa, las protemas que contienen sitios de infidelidad de la transcripcion pueden degradarse de modo espedfico (por ejemplo, pueden localizarse de modo espedfico para su degradacion).

Medicion de la infidelidad de la transcripcion a nivel de ARN

La transcriptomica es la ciencia que mide la variacion a nivel de ARN (preferiblemente ARNm) que aparece en una diversidad de trastornos patologicos, de los cuales el cancer es el mas frecuente. La transcriptomica se basa en la hibridacion de ADNc con un conjunto espedfico de oligonucleotidos que identifican subconjuntos predefinidos de genes. La eficacia de la hibridacion depende de las secuencias espedficas de cualquier ARN concreto que tendra su transcripcion inversa en el ADNc. La introduccion de una variacion insospechada en la secuencia de un ARN concreto disminuira la eficacia de la hibridacion y, por tanto, provocara una variacion en la senal percibida por los chips transcriptomicos. El descubrimiento de que la infidelidad de la transcripcion provoca alteraciones en la secuencia de bases del ARN tiene dos consecuencias inmediatas: en primer lugar, permite la optimizacion de los chips transcriptomicos para minimizar la consecuencia del desapareamiento de bases debido a la infidelidad de la transcripcion y, por tanto, mejora la precision del experimento transcriptomico. En efecto, la limitacion actual de los experimentos transcriptomicos es su falta de reproducibilidad entre estudios. Los inventores ahora creen que una parte importante de dicha variabilidad esta provocada por la infidelidad de la transcripcion. La comprension de las reglas de la infidelidad de la transcripcion, tal como describio anteriormente, permite ahora el diseno de chips de micromatrices que miden de modo espedfico la tasa de la infidelidad de la transcripcion en cualquier mezcla concreta de ADNc obtenido a partir de celulas normales o enfermas. El control de la tasa de la infidelidad de la transcripcion a nivel de ARN permite una seleccion de alta capacidad de procesamiento de la tasa relativa de infidelidad de la transcripcion que se produce en una celula concreta. Esto proporciona una informacion esencial para determinar la gravedad de una enfermedad, para definir las estrategias terapeuticas, y para clasificar a las celulas enfermas segun su perfil de sensibilizacion farmacologico. La misma seleccion tambien permite ensayar la eficacia de nuevos farmacos, por ejemplo, en la terapia del cancer.

Otras aplicaciones de la infidelidad de la transcripcion

La infidelidad de la transcripcion es un mecanismo natural recien descubierto que anade diversificacion al codigo genetico bien establecido. Los inventores han observado que la infidelidad de la transcripcion se produce, aunque a tasas bajas, incluso en tejidos normales. Los inventores proponen que la infidelidad de la transcripcion contribuye a explicar la relativamente baja abundancia de genes identificados en el genoma y la mucha mayor diversidad de protemas presentes en las celulas vivas de tejidos y fluidos biologicos.

Los inventores proponen que la infidelidad de la transcripcion tiene una funcion espedfica a nivel inmunologico. Tambien proponen que el sistema inmunologico depende, al menos en parte, en que una tasa concreta de

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infidelidad de la transcripcion afecte preferentemente a genes espedficos para identificar al propio individuo. Por tanto, las anomaKas en la tasa de infidelidad de la transcripcion que se producen por razones aun desconocidas podnan contribuir a activar una respuesta inmunologica espedfica y contribuir a la patogenesis de enfermedades autoinmunologicas y alegicas. Las diferencias interindividuales en la infidelidad de la transcripcion tambien podnan estar condicionadas por los polimorfismos de genes del sistema inmunologico, determinando por tanto la tasa de infidelidad de la transcripcion que se produce en las celulas en circulacion del sistema inmunologico, por ejemplo, linfocitos T o B, y tambien podnan contribuir a la evaluacion de la idoneidad del donante y receptor de injertos, y para determinar la gravedad de las enfermedades de injerto frente al receptor.

Los inventores tambien postulan que la infidelidad de la transcripcion se produce a una tasa mayor durante el proceso normal del envejecimiento. Esto creana unas condiciones de reduccion progresiva de la actuacion que afectanan a todas las enzimas en general, y de forma mas espedfica a las protemas que estan implicadas en la replicacion celular, la reparacion del ADN y el mantenimiento de la tasa normal de fidelidad de la transcripcion. El concepto descrito anteriormente, por tanto, podna redirigir las investigaciones sobre los mecanismos del envejecimiento. Los metodos bioqmmicos, proteomicos, transcriptomicos y otros metodos que permiten seleccionar secuencias de ARNm y ADNc, y la fidelidad a las especificadas por el ADN, podnan utilizarse, por tanto, para cuantificar la tasa de infidelidad de la transcripcion que se produce en un individuo concreto. El ensayo de nuevas moleculas que reduzcan la tasa de infidelidad de la transcripcion, por tanto, podna someterse a una seleccion biologica y conducir al desarrollo de farmacos que reduzcan la velocidad de envejecimiento.

Otros aspectos y ventajas de la invencion se describen en la siguiente seccion experimental.

Seccion experimental

Ejemplo 1. Principio de construccion y secuenciacion de un banco de ADNc tipico (vease la figura 1)

La primera etapa para preparar un banco de ADN complementario (ADNc) es aislar el ARNm maduro del tipo de celula o tejido de interes. Debido a su cola de poli(A), resulta sencillo obtener una mezcla de todo el ARNm celular mediante hibridacion con oligo dT complementarios unidos de forma covalente a una matriz. El ARNm unido entonces se eluye con un tampon de salinidad baja. La cola de poli(A) del ARNm entonces se deja hibridar con oligo dT en presencia de una transcriptasa inversa, una enzima que sintetiza una hebra de ADN complementaria a partir del molde de ARNm. Esto produce nucleotidos bicatenarios que contienen el molde de ARNm original y su secuencia de ADN complementaria. Despues se obtiene ADN monocatenario retirando la hebra de ARN mediante un tratamiento alcalino o mediante la accion de la ARNasa H. Entonces se anade una serie de dG al extremo 3' del ADN monocatenario mediante la accion de una enzima denominada terminal transferasa, una ADN polimerasa que no requiere un molde, sino que anade desoxioligonucleotidos al extremo 3' libre de cada hebra de ADNc. El oligo dG se deja hibridar con oligo dC, que actua como cebador para sintetizar, mediante la ADN polimerasa, una hebra de ADN complementaria con la hebra de ADNc original. Estas reacciones producen una molecula de ADN bicatenario completa que se corresponde con las moleculas de ARNm que se encuentran en la preparacion original. Cada una de estas moleculas de ADN bicatenario se denominan habitualmente ADNc, y cada una contiene una doble cadena de oligo dC-oligo dG en un extremo, y una region de doble cadena de oligo dT-oligo dA en el otro extremo. Este ADN entonces se protege mediante metilacion en los sitios de restriccion. Entonces se acoplan conectores de restriccion cortos en ambos extremos. Son segmentos de ADN sintetico bicatenario que contienen el sitio de reconocimiento para una enzima de restriccion concreta. El acoplamiento es realizado por la ADN ligasa del bacteriofago T4 que puede unir moleculas de ADN bicatenario con “extremos romos”. El ADN con extremos romos bicatenario resultante con un sitio de restriccion en cada extremidad entonces se trata con una enzima de restriccion que crea extremos pegajosos. La etapa final en la construccion de bancos de ADNc es el acoplamiento de la doble cadena rota por enzimas de restriccion con un plasmido espedfico que se transfecta en una bacteria. Las bacterias recombinantes entonces se cultivan para producir un banco de plasmidos, en presencia de antibioticos que se corresponden con la resistencia a antibioticos espedfica del plasmido. Cada clon porta un ADNc derivado de una unica parte del ARNm. Cada uno de estos clones entonces se aisla y se secuencia utilizando metodos de secuenciacion clasicos. Un ensayo tfpico de secuenciacion comienza en el sitio de insercion y produce secuencias de 400 a 800 pares de bases para cada clon. Esta secuencia actua como molde para comenzar la segunda ejecucion de la secuenciacion. Este avance conduce a la secuenciacion progresiva del inserto del plasmido completo. Los resultados de la secuenciacion de numerosos ADNc denominados EST se han depositado en varias bases de datos publicas.

Ejemplo 2. Anotaciones de las bases de datos

Las bases de datos de EST contienen informacion de la secuencia que se corresponde con la secuencia de ADNc obtenida en los bancos de ADNc y, por tanto, se corresponde fundamentalmente con la secuencia del ARNm individual presente en cualquier momento concreto en el tejido que se utilizo para producir estos bancos. La calidad de estas secuencias se ha puesto en cuestion por varios motivos. En primer lugar, tal como se analizo anteriormente, el proceso para producir bancos de ADNc inicialmente se basaba en gran medida en la presencia de una cola de poli(A) en el extremo 3' del ARNm eucariota. En segundo lugar, los ARNm son moleculas bastante fragiles que son digeridas con facilidad por unas nucleasas muy abundantes, denominadas ARNasas. En tercer lugar, mientras se estaban construyendo y secuenciando estos bancos, no se presto mucha atencion a la calidad del

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material original utilizado ni a su conservacion. Debido a esto, se han utilizado secuencias de EST para anotar informacion genetica, es decir, para determinar si un segmento de ADN genomico identificado y totalmente secuenciado codifica algun ARNm espedfico. En este contexto, las secuencias de EST fueron utiles para identificar la secuencia codificadora genomica. Sin embargo, no se presto atencion a la informacion que portaba la propia secuencia EST. En efecto, la secuencia genomica de ADN se considera mucho mas fiable, con potentes argumentos tecnicos que apoyan esta opinion. Los inventores especulan que la diversidad incluida en las secuencias EST podna contener informacion importante desde el punto de vista biologico, analttico o clmico. En efecto, las bases de datos de EST fueron producidas por una serie de investigadores que utilizaron diversos metodos: esto condujo a los inventores a especular que cada sesgo metodologico debena contribuir a un nivel de ruido de fondo con un cierto numero de errores. Sin embargo, si existiesen diferencias en los errores debidas a la fuente del material utilizado para generar el banco, entonces la diferencia en la tasa de error estana directamente relacionada con la fuente subyacente.

Para ensayar esto, los inventores recuperaron las bases de datos est_human disponibles en el sitio de NCBI ftp. Se seleccionaron estas bases de datos porque estas secuencias no estaba anotadas ni curadas con herramientas humanas ni bioinformaticas.

Los inventores utilizaron un sistema de identificacion del banco para determinar si un EST se obtuvo de un tejido canceroso o normal. Cada banco se denomino normal o canceroso. Mediante el emparejamiento del numero de registro de cada EST con el identificador del banco correspondiente se clasificaron 2,6 millones de EST como obtenidos de tejidos cancerosos, y 2,8 millones de EST como obtenidos de tejidos normales.

Para obtener las alineaciones de los EST, los inventores utilizaron el programa informatico disponible para el publico megaBLAST 2.2.13 (Basic Local Alignment Search Tool, Zheng Zhang, A greedy algorithm for nucleotide sequence alignment search, J. Comput. Biol., 2000) y se especificaron los siguientes parametros de seleccion:

-d est_human: base de datos para la seleccion (todos EST humanos de dbEST)

-i sequences.fasta: formato de archivo FASTA que contiene la secuencia de referencia que se corresponde con genes expresados con abundancia (figura 2)

-D 2: salida de BLAST tradicional

-q -2: puntuacion de -2 para un desapareamiento de nucleotidos

-r 1: puntuacion de 1 para un unico apareamiento de nucleotidos

-b 100000: numero maximo de secuencias para las cuales se indica el alineamiento

-p 90: porcentaje de coincidencia mmimo entre EST y la secuencia de referencia

-S 3: toma en cuentra EST que se aparean con la secuencia de referencia

-W 16: longitud del mejor apareamiento perfecto para comenzar con la extension del alineamiento

-e 10: valor esperado (valor E), numero de alineamientos que se espera encontrar simplemente por azar para una secuencia concreta y una base de datos concreta, segun el modelo estocastico de Karlin y Altschul (1990)

-F F: no se filtra la secuencia de referencia

-o NonFiltre_test_90.out: archivo de salida de informe de megaBLAST

-v 0: numero maximo de secuencias que muestran una lmea de descripcion

-R T (T de “true”, verdadero): indica la informacion logantmica al final de la salida de megaBLAST

-I T: muestra los GI en la definicion de lmea [T/F]

La lmea de comando para el BLAST es:

megablast -d est_human -i C:/SeqRef/TPT1/sequences.fasta

-o C:/blast/NonFiltre_test_90.out -R T -D 2 -I T -q -2 -r 1 -v 0 -b 100000 -p 90,00 -S 3 -W 16 -e 10,0 -F F

La figura 2(a-q) muestra las 17 secuencias utilizadas para el analisis; para evitar distorsionar el BLAST se elimino sistematicamente la cola de poliA de las secuencias de referencia de ARNm. La figura 2r proporciona una lista de genes que se utilizaron para ensayar la aparicion de variaciones en la secuencia.

Ejemplo 3. Identificacion de las variaciones en la secuencia entre EST procedentes de origenes normales y cancerosos

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Se seleccionaron 17 genes basandose en su gran representacion en la base de datos. Cada secuencia EST entonces se alineo frente a su secuencia de referencia de ARNm curada (RefSeq) procedente de NCBI utilizando el MegaBLAST. Esto crea una matriz en la que cualquier base concreta se define por el numero de EST que se aparean en esta posicion. Entonces los inventores midieron la proporcion de EST que se desvfan de RefSeq en cualquier posicion concreta. La comparacion de las secuencias de EST alineadas segun el tejido de origen condujo a la identificacion de las variaciones en las secuencias que producen en cada posicion de las bases en el grupo de cancer o normal. La figura 4 proporciona una representacion grafica de estas variaciones que se producen en los conjuntos normales y cancerosos para los 17 genes seleccionados. El examen visual de los datos revelo que la variacion en la secuencia se produda con mas frecuencia en el conjunto de cancer, y tambien que el fenomeno pareda predominar mas sitios del ARNm espedficos. La mayona de las observaciones se localizaron al menos 400500 bases despues del comienzo de la secuencia del ARNm, por tanto predominantemente en la parte 3' del gen. Este numero tan alto de variaciones no puede ser explicado por los SNP. En la grafica se muestran los SNP putativos (□) y los SNP biologicamente validados (O); estos SNP se obtuvieron en la base de datos NCBI (dbSNP, construida 126, septiembre, 2006) (Sherry, S.T. et al. (2001), Nucleic Acids Res., 29, 308-311). Los SNP putativos y biologicamente validados que conducen a variaciones en EST (n = 442) se excluyeron de posteriores analisis (por tanto, tambien se excluyeron los sitios de edicion del ARN (SNP falsos)).

La siguiente etapa de este analisis fue ensayar la significancia estadfstica de las diferencias en la variacion en la secuencia que se producen entre EST de cancer y normales. Para cada posicion, los inventores compararon la proporcion de la base de RefSeq con la de las tres otras bases entre los grupos normal y con cancer utilizando un ensayo de proporcion bilateral. Este ensayo se aplico sistematicamente siempre que se cumpliesen las siguientes condiciones: n > 70, y (ni. * n.j)/n > 5, i = 1, 2, j = 1, 2 (siendo n = el numero de eSt de cancer y normales para un gen, n-i. = el numero de EST de cancer, n2. = el numero de EST normales, n.1 = el numero de EST que tienen la RefSeq, n.2 = el numero de EST que tienen una sustitucion). Se dice que un ensayo estadfstico es positivo al nivel umbral de 5% cuando el correspondiente valor de P es menor que 0,05; en este caso, la hipotesis nula (es decir, ambas proporciones son iguales) se rechaza.

Ademas, se consideraron los siguientes dos ensayos de proporcion unilateral para precisar en que conjunto la variabilidad era mayor. El primero permitio concluir que las variabilidades eran diferentes en ambos grupos cuando el ensayo estadfstico es positivo, y entonces se midio en esta caso si la variabilidad era estadfsticamente mayor en el conjunto del cancer. Por el contrario, el segundo ensayo verifico la hipotesis de que la variabilidad era significativamente mayor en el conjunto normal. Ambos ensayos unilaterales se realizaron cuando se cumplieron las mismas condiciones que los ensayos bilaterales.

La figura 3 proporciona una descripcion de los resultados de BLAST tfpicos. Tal como se muestra en las figuras 5a y 5b, para el gen representativo TPT1, el numero de EST en cualquier posicion concreta sobre el gen es similar en los grupos de cancer y normales. La figura 5c muestra que 489 de 830 ensayos de proporcion posibles cumplfan los criterios asignados. Los ensayos de proporcion que eran estadfsticamente significativos al nivel de 5% se muestran en la figura 5d. Puede calcularse un error estimado resultante de los multiples ensayos, definido por el estimador basado en la localizacion (C. Dalmasso, P. Broet (2005), Journal de la Societe FranQaise de Statistique, tomo 146, n1-2, 2005). Los 26 ensayos de proporcion positivos son debidos a las sustituciones de bases que aparecen en el tejido normal (N>C) en la figura 5d (n = 26; LBE = 33). Esto contrasta con la acumulacion de ensayos de proporcion estadfsticamente significativos que aparecen debido a las variaciones en la secuencia en el grupo de cancer (C>N) (n = 145; LBE = 15). Se realizo un analisis similar para un segundo gen, VIM (figura 5e-5h). De nuevo, el numero de EST en cualquier posicion concreta de un gen es superponible en los grupos de cancer y normales. 752 de los 1847 ensayos de proporcion cumplfan los criterios. De nuevo, se observo una gran diferencia en el numero de ensayos de proporcion positivos: n = 78 variaciones son debidas al grupo normal (LBE = 50), n = 269 variaciones son debidas al grupo de cancer (LBE = 24). Se repitio el mismo analisis en 17 genes que estan presentes en abundancia en la base de datos de EST. La figura 5i es un resumen de los resultados estadfsticos obtenidos. De los 17 genes ensayados, 15 muestran mayores variaciones en la secuencia en los EST obtenidos de tejidos con cancer (figura 5j). En esta etapa, el analisis estadfstico cubre solo del 9% al 91% de las posiciones de cada gen (una media de 32%) debido a las restricciones del ensayo estadfstico.

La conclusion de esta primera ronda de analisis es que los EST del mismo gen fueron diferentes cuando se comparan segun la fuente del tejido (normal frente a canceroso) de la cual se extrajo el ARNm. Suponiendo que la tasa de errores tecnicos que produce la variacion en la secuencia de EST no es diferente segun los ongenes normal o canceroso del tejido, y considerando el hecho de que 15 de 17 de los genes ensayados mostraron variaciones en la secuencia debidas a la fuente del tejido, los inventores proponen que estas diferencias son el resultado directo del estado de las celulas (normal frente a canceroso) a partir de las cuales se produjeron los EST.

Se realizaron experimentos similares para estudiar las inserciones y las deleciones. Los resultados se obtuvieron despues de aplicar el filtro F3 (vease el ejemplo 4). Se emplearon condiciones mas rigurosas para evitar acontecimientos no biologicos (errores de la secuenciacion, alineamientos erroneos de MegaBLAST...): se considero un hueco o una insercion solo si no habfa otras modificaciones presentes en una ventana -10/+10. Para cada posicion, los inventores compararon la proporcion de ventanas con delecion (o insercion) con otras ventanas entre los grupos normales y de cancer utilizando un ensayo de proporcion bilateral como se describio anteriormente. La figura 5k es un resumen de los resultados estadfsticos obtenidos. De los 17 genes ensayados, 14 (o 10 para la

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insercion) muestran mayores variaciones en la secuencia (deleciones e inserciones) en los EST obtenidos de tejidos cancerosos (figura 5l).

Ejemplo 4. Verificacion del exceso de variacion en el conjunto de cancer C>N frente al conjunto normal N>C

Se procesaron bancos que se habfan originado de muestras de cancer o muestras normales fundamentalmente de la misma manera. Por tanto, se espera que aparezcan errores aleatorios de la construccion del banco o la secuenciacion del clon en la misma proporcion en ambos conjuntos y que no justifiquen las diferencias observadas entre los grupos de EST normales y de cancer. El analisis matematico es coherente con esta interpretacion (Brulliard M. et al., PnAs, 1 de mayo, 2007, vol. 104, n° 18, 7522-7527, vease el material suplementario, figura 7).

Despues se realizo una busqueda para eliminar otras fuentes de heterogeneidad de los EST aplicando secuencialmente procedimientos de filtrado basados en el siguiente fundamento. Los requerimientos iniciales fueron que los EST se alinearan con RefSeq con 100% de coincidencia en al menos 16 bases consecutivas, y con >90% de coincidencia en al menos 50 bases. Tal como se muestra en la figura 6b, esto produce, cuando se comparan los conjuntos de cancer y normales para los 17 genes, 2281 y 725 diferencias estadfsticamente significativas C>N y N>C, respectivamente (columna F1), y diferenciadas de los SNP putativos o biologicamente validados. El segundo filtro (F2) requiere que cada EST se alinee con RefSeq continuamente en mas del 70% de su longitud. El tercer filtro (F3) retira los EST con una secuencia mas relacionada con los paralogos y los pseudogenes que con la RefSeq autentica. El cuarto filtro (F4) deleciona del analisis las primeras y ultimas 50 bases de cada alineamiento de EST. Se empleo este filtro para eliminar los desapareamientos en los bordes 3' y 5' de los EST que pueden ser creados por el programa MegaBLAST para optimizar aun mas los alineamientos y/o que resultan de la acumulacion de errores en las extremidades de EST alineadas. El ultimo filtro (F5) normaliza las longitudes de secuencia de EST para cada gen para eliminar cualquier diferencia en la longitud entre los conjuntos normales y de cancer. En efecto, los inventores advirtieron que, despues de aplicar los primeros 4 filtros, la longitud de los EST de cancer media fue mayor que la de los EST normales (640 + 248, y 554 + 229 bases, respectivamente). Sin embargo, tambien observaron una heterogeneidad de los EST de cancer significativamente mayor en 5 genes cuando la longitud media de los EST no era diferente entre los conjuntos normales y de cancer (TPT1, VIM, HSPA8, LDHA, CALM2).

El numero de ensayos C>N estadfsticamente significativos siguio siendo mayor que el numero de ensayos N>C, pero la proporcion C/N disminuyo de 3,15 (F1) a 2,05 (F5) (figura 6c).

Para determinar aun mas que la heterogeneidad de los EST de cancer no era debida a la acumulacion de errores al final del ensayo de secuenciacion, se tomo en cuenta solo la informacion proporcionada despues de las primeras 50 bases y no mas larga de 450 bases en cualquier ensayo de secuenciacion. Despues de este filtrado drastico, los ensayos C>N estadfsticamente significativos fueron 455 (LBE = 92), y los ensayos N>C fueron 292 (LBE = 119) para los 17 genes. Por tanto, puede considerarse de modo razonable que las variaciones en la secuencia que provocan la mayor heterogeneidad en los EST del grupo de cancer son un reflejo directo de la heterogeneidad del ARNm de las celulas cancerosas (figura 6d).

Despues los inventores verificaron de forma independiente que una mayor heterogeneidad de EST estadfsticamente significativa persistfa en el conjunto de cancer despues de eliminar los EST producidos a partir de celulas cancerosas cultivadas. Despues de este filtrado, los ensayos C>N estadfsticamente significativos fueron 1009 (LBE = 117), y los ensayos N>C fueron 445 (LBE = 193) para los 17 genes (figura 6e).

Ejemplo 5. La ruptura del codigo de sustitucion de bases se produce debido a la infidelidad de la transcripcion en celulas cancerosas

El siguiente objetivo de los inventores fue determinar si el fenomeno descrito de la sustitucion de bases debido a la infidelidad de la transcripcion es un fenomeno aleatorio o sigue reglas espedficas. Para lograr esto, se centraron en las variaciones de EST en las que C>N es estadfsticamente significativo. Para evitar sesgos que podnan ser introducidos por los procedimientos de filtrado, se emplearon todos los datos no filtrados disponibles. La primera indicacion de que la infidelidad de la transcripcion no es un proceso aleatorio fue que las sustituciones de bases raramente aparecen en la region 5' de los genes ensayados. Para todos los genes ensayados, muy raramente se observo la aparicion del fenomeno de sustitucion de bases en las primeras 400-500 bases del ARNm maduro. La segunda observacion que indica que la infidelidad de la transcripcion no es aleatoria surge de la observacion de que existe una diferencia en la composicion de bases en el molde de ADN genomico observado cuando se comparan secuencias cadena arriba y cadena debajo de los acontecimientos de sustitucion (heterogeneos, H, n = 2281) con aquellas en que no se detectaron acontecimientos de sustitucion (no heterogeneos, NH, n = 12273). El criterio para los sitios NH fueron unas variaciones en el conjunto de cancer menores que 0,5% y no estadfsticamente diferentes de las variaciones del conjunto normal (figura 7a). En este analisis, se denomina a la base que sufre la sustitucion como b0, las bases localizadas en el extremo 5' del ARNpm se denominan b-n, y las bases localizadas en el extremo 3' se denominan b+n. Para mayor claridad, en este analisis los inventores hacen referencia a la composicion de bases del ARNpm: esto se corresponde en el ADN con la hebra que no es el molde (la hebra no transcrita por ARNP). Los datos demuestran que no todas las 4 bases son igualmente susceptibles a la variacion: b0 = A (33%) « T (32%) >> C (21%) >> G (14%). Ademas, las composiciones de las 4 bases cadena arriba y las 3 bases cadena abajo del sitio del acontecimiento fueron estadfsticamente diferentes (resultados del analisis de chi-

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cuadrado) de las de los sitios sin una variacion de EST significativa (figura 7a, la composicion de bases se expresa en porcentaje, y el gris claro muestra las bases enriquecidas; el gris oscuro muestra las bases insuficientes). De modo espedfico, los sitios en los que se producen variaciones fueron precedidos y seguidos con mas frecuencia por A > G > T « C.

Por tanto, la aparicion de heterogeneidad en las EST de cancer no es aleatoria, sino que esta determinada en primer lugar por la naturaleza de la base que esta siendo sustituida y en segundo lugar por la naturaleza de las bases que preceden y siguen inmediatamente al acontecimiento.

Despues los inventores se preguntaron si la base de sustitucion se selecciona de modo aleatorio. Resulta evidente a partir de la figura 7b que no es el caso. La significancia estadfstica de la diferencia en las proporciones se calculo con la hipotesis nula de que la base de sustitucion se selecciona de modo aleatorio (ensayo de ajuste de las tres bases de sustitucion a la distribucion uniforme). A fue sustituida preferentemente por C (p = 2,8 x l0-125), T por G (p = 5,7 x 10-29), y G por A (p = 2,2 x 10-32). La sustitucion de C mostro una distribucion mas uniforme, con una ligera insuficiencia de T (p = 0,007).

Despues se buscaron las causas subyacentes a la sustitucion de bases preferente. Para lograr esto, los inventores distinguieron entre dos conjuntos de acontecimientos informativos y no informativos.

Los acontecimientos informativos son situaciones en las que la base sustituida es diferente de la base precedente (b-1) o de la base siguiente (b+1) (n = 1676) (figura 7c). Los acontecimientos no informativos son situaciones que no cumplen estos criterios. Cuando se analizan acontecimientos informativos aparecen dos casos: la base sustituida es reemplazada por b-1 o b+1 (79%) o por otra base, diferente de b-1 y b+1 (21%). 1) En el primer subconjunto, la base de sustitucion fue identica a b-1 (n = 799, figura 7c, panel B) o b+1 (n = 530, figura 7c, panel C). Cuando la base de sustitucion fue b-1, entonces b0 = A (36%) > C (30%) >> T (21%) >> G (13%) (figura 7d, panel A). A fue sustituida preferentemente por C (71% de los casos). Cuando la base de sustitucion fue b+1, entonces b0 = T (47%) >> A (21%) > C (19%) >> G (13%) (figura 7a, panel B). T fue sustituida preferentemente por G (71%). De manera interesante, la importancia estadfstica de las bases circundantes tambien fue diferente (figura 7d, panel A, y figura 7d, panel B). Para las sustituciones b-1, el patron de influencia relativa de la composicion de bases fue b0 > b-1 > b- 2 > b+1 > b-3 > b+2. Para las sustituciones b+1, la influencia relativa de las bases circundantes sigue el patron de b0 > b+1 > b-1 > b+2 > b-3 > b-2. 2) En el segundo subconjunto de acontecimientos informativos, la base de sustitucion no se correponde con b-1 ni b+1 (n = 347, figura 7c, panel D). Las bases afectadas tuvieron el siguiente orden: A (47%) > T (29%) > C (14%) > G (10%). A fue reemplazada mas habitualmente por C (91% de los casos), T por C (50%) y A (42%), C por G (46%), y G por C (73%). Por tanto, cuando la base de sustitucion no se corresponde con b-1 ni b+1, la base de sustitucion no se selecciona de modo aleatorio, sino que es C en muctnsimas ocasiones.

Despues los inventores consideraron el conjunto de acontecimientos no informativos, es decir, las situaciones en las que 1) b-1 = b+1, y en las que 2) b-1 = b0 = b+1 (figura 7c). Cuando b-1 y b+1 son identicos pero diferentes de b0 (n = 339, figura 7c, panel E), las bases sustituidas tuvieron el siguiente orden: T (34,8%) > G (23,6%) > C (21,2%) < A (20,4%), y siguieron el mismo patron de preferencia que en la figura 7b: T ^ G, G ^ A, A ^ C. Las sustituciones que se produce en la base central de repeticion de tres bases identicas (n = 266, figura 7c, panel F) se observaron en el siguiente orden: A (46,2%) > T (36,9%) > G (10,5%) > C (6,4%). En este caso, los acontecimientos de sustitucion mas comunes fueron: A ^ C, y T ^ C y A. Las raras sustituciones de GGG fueron reemplazadas, de modo mas habitual, por GCG y CCC por cAc (figura 7c).

Por tanto, cuando las sustituciones aparecen dentro de tres bases identicas consecutivas, y cuando las sustituciones no se corresponden con b-1 ni b+1, entonces C es la base de sustitucion mas habitual (figura 7c). Cuando la base de sustitucion se corresponde con b-1, la sustitucion mas habitual es A ^ C; cuando la base de sustitucion se corresponde con b+1, la sustitucion mas habitual es T ^ G.

Por tanto, puede concluirse que ni la base que se sustituye ni la base de sustitucion se seleccionan de modo aleatorio. Ambos fenomenos siguen patrones predecibles definidos por la composicion de la base que se sustituye y la de las bases localizadas cadena arriba y cadena debajo de este acontecimiento.

Pueden definirse algoritmos espedficos para identificar con precision la composicion del motivo que determina la aparicion de la sustitucion de bases en cualquier secuencia concreta.

Despues, los inventores separaron el conjunto C>N en dos conjuntos en los que N es estable (no se observa desviacion en la misma posicion en el conjunto normal) o no lo es. La desviacion se considera solo si excede de un cierto umbral definido como el porcentaje medio de desviacion en el conjunto normal. La figura 7e demuestra que el conjunto C>N porta la firma -4/+3 en el que N se desvfa. La longitud del contexto es menos importante en el otro conjunto. La figura 7f muestra una acumulacion en el intervalo 500-1000 que es mas importante en el conjunto C>N en el que N se desvfa, que en el conjunto C>N en el que N es estable. En este ultimo, parece que aparecieron acontecimientos mas tempranos (intervalo 0-500). Las bases de sustitucion para los sitios C>N fueron similares entre los dos conjuntos (figura 7g).

En el caso de deleciones o inserciones, los resultados demuestran que las bases omitidas (398 casos C>N) tuvieron

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el siguiente orden: C (46,0%) > T (37,9%) >> A (9,3%) > G (6,8%) (figura 5m), y que las bases insertadas (225 casos C>N) tuvieron el siguiente orden: G (36,0%) > C (30,2%) > A (21,8%) > T (12,0%) (figura 5o). Los inventores observaron que los acontecimientos de delecion o insercion a menudo se producen en bases identicas conservadas. Un programa espedfico disenado para analizar estos acontecimientos muestra efectivamente que 94,7% de las deleciones y 81% de las inserciones se producen en tramos de longitudes variables. Los tramos pueden ser bipolares y asimetricos (por ejemplo, AAATAA) o no (por ejemplo, CCCGG) o repeticiones de nucleotidos individuales (por ejemplo, AAA) (veanse los motivos en la figura 5m-5p). En el caso de las deleciones, las bases omitidas son identicas a la base b-1 o b+1 (tramo) en 84% de los casos. La mayona de los motivos son dobletes o tripletes de C > T > A « G. Se observan resultados similares en el caso de las inserciones. De hecho, los motivos de los tramos no parecen ser diferentes entre C>N y N>C. La especificidad de C>N o N>C surgina de otra informacion alrededor de los tramos. Otros analisis en mas genes confirmaran estas observaciones.

Tomando en cuenta los 17 genes, los inventores observaron una heterogeneidad de EST con una tasa de 10 por 100 bases (figura 5j y figura 8a-c). Esta tasa es mayor que cualquier tasa de mutacion descrita producida en el ADN genomico. Como referencia, se puede calcular que los polimorfismos de un solo nucleotido se producen aleatoriamente en el genoma una vez cada 300 bases. La tasa de polimorfismos de un solo nucleotido que afectan al ADN transcrito es mucho menor: se calcula que aparece una vez cada 3000 bases. Es evidente que las mutaciones en el ADN se producen con mas frecuencia en el cancer. Sin embargo, los trabajos en profundidad de secuenciacion de ADN de cancer de mama y colon que inclrnan 14 de los 17 genes utilizados en este estudio, condujeron a una tasa de mutacion somatica estimada de 3,1 mutaciones por 10° bases (Sjoblom, T. et al. (2006), Science, 314, 268-274). Por tanto, la infidelidad de la transcripcion que se describe en esta invencion se produce con una tasa mucho mayor que las mutaciones que afectan al ADN. De manera mas importante, la mayona de las sustituciones de bases en el ADN tienen consecuencias limitadas a nivel de protemas, porque menos del 10% del ADN genomico se transcribe a ARNm. En contraste, la sustitucion de bases debido a la infidelidad de la transcripcion a menudo tiene consecuencias directas sobre la funcion de la protema. En efecto, 1179 de 2281 sustituciones descritas en la presente (1548 CDS - 369 sustituciones silenciosas) condujeron a unas sustituciones de bases con un impacto inmediato sobre la secuencia primaria de AA de la protema (figura 8d). De manera mas importante, se observaron unas sustituciones de bases significativas que afectan al codon de fin en 9 de los 17 genes ensayados. Sin embargo, antes del concepto de la infidelidad de la transcripcion no se habfa propuesto que las protemas humanas contuviesen secuencias codificadoras adicionales codificadas por secuencias de aRn consideradas hasta la fecha “regiones no traducidas”. Los inventores ahora demuestran que la sustitucion de bases que se produce en los codones de fin naturales debido a la infidelidad de la transcripcion revela nuevas regiones codificadoras que codifican AA espedficos. Estas nuevas regiones codificadoras estan en fase con el marco de lectura abierto nativo. El codon de fin natural se transforma en un codon codificador. El siguiente triplete de bases entonces se lee como un AA y la traduccion avanza con una nueva region codificadora hasta que se alcanza un nuevo codon de fin. Los inventores han verificado que este es el caso en 8 de los 17 genes que mostraron infidelidad de la transcripcion. Estos 8 conternan codones de fin alternativos dentro del marco con la correspondiente RefSeq (GAPDH no contiene un codon de fin alternativo). Esto tiene una consecuencia inmediata porque, en cada caso, se crean nuevas secuencias codificadoras de 14, 7, 13, 15, 13, 4, 9, 55 AA en TPT1, RPS6, RPL7A, VIM, RPS4X, FTH1, FTL y TPI1, respectivamente (figura 10). La adicion de estos AA tiene el potencial de crear motivos que seran muy potenciados en el cancer; estos motivos daran o no como resultado una nueva funcion de las protemas. La prediccion de este acontecimiento conduce al posible desarrollo de herramientas utiles que puedan ser utilizadas en el diagnostico, con objetivos terapeuticos u otros objetivos. La prediccion de este acontecimiento tambien conduce al posible desarrollo de anticuerpos espedficos que reconoceran secuencias espedficas del cancer en el extremo carboxi-terminal de la protema. Ningun metodo analttico actual es capaz de unaa secuenciacion de protemas directa en el extremo carboxi-terminal. Sin embargo, es posible romper las protemas de forma enzimatica y secuenciar los productos de la ruptura desde su extremo NH2 terminal. Tambien es posible analizar el contenido de AA de los peptidos generados mediante proteolisis utilizando espectrometna de masas. Los inventores ademas han demostrado que estos codones de fin alternativos tambien se ven afectados por la infidelidad de la transcripcion (7/9 genes tiene el segundo codon de fin alternativo afectado). El mismo fenomeno descrito anteriormente puede expandir aun mas la lectura a un nuevo conjunto de secuencias. La anotacion de todas las secuencias de protemas utilizando el metodo de los inventores revelara varias secuencias de ARNm codificadoras insospechadas que seran transcritas con mas o menos eficacia dependiendo de la utilizacion de los codones, asf como de la capacidad de la maquinaria de traduccion para traducir correctamente o no las sustituciones de las bases. De hecho, las sustituciones de las bases pueden conducir a cambios en la estructura del ARNm, que pueden modificar la velocidad de lectura ribosomica. No obstante, los inventores suponen que las sustituciones de bases no implicaran cambios en la estructura del ARN. Basandose en la aparicion de alteraciones en los codones de fin, calculan, en los genes afectados, que hasta 4% del ARNm en los tejidos cancerosos contiene estas regiones codificadoras adicionales.

Un programa espedfico basado en varios filtros puede utilizarse para anotar todas las secuencis de protemas para la presencia de un peptido de post-fin (PSP) putativo. Despues de recuperar la secuencia nucleica que se corresponde con las protemas estudiadas, el programa busca la presencia o la ausencia de una secuencia nucleica en fase despues del fin canonico, con otro fin en fase (la posibilidad de pasar por encima de uno o mas codones de fin en el caso de que la infidelidad de la transcripcion afecte a estos codones de fin alternativos debe tomarse en cuenta). Puede fijarse una longitud minima (por ejemplo, solo las secuencias que codifiquen mas de 12 aminoacidos

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pero, en ultimo termino, la longitud del peptido puede ser menor) segun un criterio mmimo para la prediccion de un patron antigenico potencial. Entonces los PSP antigenicos se almacenan (figura 18). Se emplea otra etapa para validar los candidates con la anotacion mediante la formacion de la maquina de aprendizaje del fin canonico: en efecto, puede determinarse la probabilidad de que una o mas bases del codon de fin puedan ser sustituidas mediante la infidelidad de la transcripcion. Tambien es posible analizar el contenido en AA de los peptidos generados mediante proteolisis utilizando espectrometna de masas.

Los inventores tambien han descubierto que, ademas de crear condiciones que permiten la traduccion de nuevas secuencias de protemas, la infidelidad de la transcripcion puede introducir codones de fin prematuros en el ARNm. Se identificaron 24 nuevos codones de fin que aparedan dentro del marco de lectura abierto canonico en 13 de los 17 genes. Esto indica que la infidelidad de la transcripcion puede dar como resultado la produccion de protemas mas cortas que carecen de dominios espedficos. Estas protemas truncadas pueden producir un aumento o la perdida de la funcion. Es probable que la estructura tridimensional de la protema se vea afectada y, por tanto, se crean nuevas entidades que pueden ser reconocidas por el sistema inmunologico.

Por ultimo, la infidelidad de la transcripcion en los 17 genes ensayados revela que 50% de todas las sustituciones C>N identificadas conducen a cambios en los AA. 17% se corresponden con la sustitucion de AA por otros AA de la misma familia, y 33% se corresponden con sustituciones de AA por una clase diferente de AA. Por tanto, la infidelidad de la transcripcion es capaz de generar protemas con nuevas secuencias de AA con funciones o actividad potencialmente modificadas. La prediccion de la infidelidad de la transcripcion utilizando las reglas descritas anteriormente permitira la prediccion logica de cambios en el comportamiento de protemas y el resultado de experimentos proteomicos.

Ejemplo 6. Validaciones biologicas

Las validaciones biologicas se realizan a dos niveles: ARNm y protemas. En primer lugar, se detectaran las sustituciones en el ARNm de los 17 genes de interes en tejidos cancerosos humanos. Los inventores utilizaron DHPLC (cromatograffa lfquida de alta resolucion desnaturalizante), que es un metodo cromatografico a gran escala para detectar mutaciones en las secuencias. El principio del experimento se describe en la figura 11a-c. Primero los inventores desarrollaron un metodo para ensayar el umbral de DHPLC transgenomico para estimar el porcentaje de ADN mutado en la muestra que es suficiente para permitir la formacion y la deteccion de heteroduplex. En efecto, se emplearon fragmentos de pCr de 300 pb con 1 y 3 sustituciones de bases. Se prepararon diferentes proporciones de estos fragmentos: 0%, 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 20% o 50%. La DHPLC permite distinguir el ADN normal y el ADN normal mas mutado en cuanto la muestra contenga del 2,5% al 5% de ADN mutado (figura 11d).

Estos resultados indican que los inventores fueron capaces de distinguir el ARNm de tejidos normales y cancerosos para los genes de interes. Se empleo ARNm extrafdo de tejidos adyacentes normales y cancerosos (Biochain Inc.) para ensayar tres genes: GAPDH, ENO1 y TMSB4X. Como la DHPLC se aplica al ADN, las muestras de ARNm se convierten en ADNc utilizando transcriptasa inversa. Los inventores elegieron regiones que muestran sustituciones mucho mas significativas en EST procedentes de tejidos de cancer que EST procedentes de tejidos normales. Los cebadores utilizados para la amplificacion se muestran en la figura 12.

En un primer conjunto de experimentos, varios ADNc de tejido adyacente normal y canceroso (Idgado, rinon, mama y colon) se amplificaron mediante PCR con dichos cebadores y se inyectaron en el sistema DHPLC. La temperatura de la estufa se selecciono con el programa informatico Navigator (Transgenomic). Se obtuvieron perfiles para los genes descritos anteriormente, y un experimento representativo se presenta en la figura 15 para los genes ENO1, GAPDH y TMSB4X. Tal como se muestra en las figuras 15a a 15c, los perfiles del cancer son claramente diferentes de los perfiles normales para los genes GAPDH y ENO1. No se observaron diferencias para el gen TMSB4X, tal como se esperaba (tiene muchos menos sitios de infidelidad de la transcripcion). Las inyecciones del mismo producto de PCR y de otros 2 productos de PCR se realizaron por triplicado (figura 15b y 15c), y los perfiles fueron muy reproducibles en el mismo experimento. Sin embargo, la naturaleza de la diferencia no puede deducirse de este experimento.

Por consiguiente, se realiza la continuacion de esta validacion biologica basada en ARNm. De hecho, la secuenciacion de los productos de PCR procedentes de tejidos cancerosos puede permitir una deteccion precisa de las mutaciones mas abundantes.

El metodo de secuenciacion de Sanger clasico de ARNm amplificado con PCR de transcripcion inversa no detecta los variantes de secuencia que se producen a unas tasas inferiores a 15-30% en una posicion espedfica (figura 16). En efecto, la lectura automatica de nucleotidos mutados obtenida mediante la secuenciacion de mezclas de productos de la amplificacion de secuencias conocidas mutadas y no mutadas se obtiene en mezclas del 50-50% y se detectan picos secundarios del 15%. La pirosecuenciacion y la PCR de emulsion son metodos mas sensibles que permiten la deteccion de la heterogeneidad del ADNc, y por tanto es posible el analisis de los productos de RT-PCR obtenidos de celulas cancerosas y normales (Thomas, R.K. et al. (2006), Nat. Med., 12, 852-855).

Un gen afectado por la infidelidad de la transcripcion se clona por completo, o se clona un fragmento que comprende y que no comprende su sitio de infidelidad de la transcripcion. La construccion con y sin el codon de fin canonico se

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acopla dentro del marco con el gen que codifica la resistencia a la neomicina. Se transfectan celulas cancerosas y normales con esta construccion quimerica, primero de forma transitoria y despues estable. Los inventores predicen que la infidelidad de la transcripcion conducira a cambiar el codon de fin canonico, permitiendo con ello la traduccion del gen de neomicina y creando una celula resistente a la neomicina. Tambien predicen que las celulas cancerosas que sean resistentes a la neomicina creceran con mas rapidez, y que la forma de estas celulas sera significativamente diferente de la de las celulas normales. Ademas, predicen que estas celulas seran mas invasivas y pueden compararse con las celulas de una etapa mas tardfa del avance del cancer. Por tanto, esta tecnica puede utilizarse para determinar la fase cancerosa de diferentes celulas procedentes de un paciente individual.

La prueba final de que la resistencia a la neomicina aparece como resultado de la infidelidad de la transcripcion se obtendra secuenciando la construccion insertada amplificada a partir del ADN genomico y demostrando que la informacion genomica permanece inalterada. Los inventores tambien verificaran que el ARNm de la celula resistente a la neomicina contiene un codon de fin mutado debido a la infidelidad de la transcripcion.

Una tecnica que permite la deteccion de sitios de infidelidad de la transcripcion es la construccion de bancos de ADNc que consisten en clonar ADNc obtenido mediante transcripcion inversa a partir del ARN extrafdo de tejidos de pacientes cancerosos y normales. Cada ADNc, amplificado o no a partir de un gen espedfico, se clona en plasmidos diferentes que se tranforman en Escherichia coli. Se escogen diferentes colonias de E. coli y los plasmidos se secuencian. El numero de clones que deben secuenciarse depende del porcentaje de sustituciones en el fragmento de ADNc clonado. Un analisis estadfstico proporcionara la variacion en la secuencia en los sitios de infidelidad de la transcripcion. Esta tecnica puede mejorarse. En efecto, despues de la transcripcion inversa y de la amplificacion con cebadores espedficos, el ADNc puede clonarse en un plasmido que porte un gen indicador, por ejemplo, el gen lacZ. El ADNc y el gen indicador pueden clonarse en fase. Cuando aparece una sustitucion en la secuencia del codon de fin del ARNm, el gen indicador se expresa. Cuando las celulas de E. coli se transforman con esta construccion, las colonias que portan el plasmido en el que el ADNc esta mutado en el codon de fin se seleccionan con la expresion del gen indicador. Despues de esto, el plasmido puede secuenciarse para verificar si la sustitucion del codon de fin esta presente.

Se emplea otra tecnica basada en la PCR a tiempo real con cebadores espedficos para detectar los sitios de infidelidad de la transcripcion. Estos cebadores se disenan para que se apareen con un ADNc con una variacion o variaciones en la secuencia basadas en un analisis estadfstico. Se disena un segundo cebador para que se aparee con el ADNc sin la variacion en la secuencia (referencia). El numero de variaciones en la secuencia del cebador es muy importante, y los inventores han determinado que, en un experimento de ensayo con una variacion conocida en la secuencia, son necesarias dos mutaciones fuera de la posicion que se estudia para obtener una senal fluorescente espedfica. Cuando el cebador es complementario con el ADNc sin una sustitucion en la secuencia (referencia), la senal fluorescente se detecta tras un numero espedfico de ciclos de amplificacion. El mismo ADNc amplificado con el cebador que porta la sustitucion en la secuencia conduce a una senal de fluorescencia que aparece con un numero grande de ciclos de amplificacion. La diferencia entre el numero de ciclos de amplificacion entre los dos cebadores es una estimacion directa de la presencia de un ADNc con una sustitucion en la secuencia. Ademas, los inventores han verificado que el metodo es lo suficientemente sensible como para detectar 1% de la secuencia mutada en una mezcla de secuencias conocidas.

En un experimento tfpico, un ARN extrafdo de tejidos de pacientes cancerosos y normales se somete a transcripcion inversa y se amplifica con cada uno de dichos cebadores espedficos. Entonces se mide la diferencia entre los ciclos de amplificacion con ambos cebadores.

Por ultimo, los inventores se centraron en las nuevas protemas inducidas cuando el codon de fin natural se ve afectado. Los inventores demostraron que el codon de fin se ve significativamente afectado en 9 de los 17 genes de interes. Esto conduce a poblaciones espedficas de protemas diferenciadas con una nueva secuencia en el extremo carboxi-terminal. Los inventores han calculado que los tejidos cancerosos con genes afectados contienen 4% de protemas que son mas largas que las normales.

A la vista de esta hipotesis, se analizaron 60 protemas plasmaticas abundantes (figura 13) y se buscaron posibles PSP. Se descubrieron 22 genes para los cuales un PSP era lo suficientemente largo y antigenico (figura 18). Despues se buscaron secuencias de protemas mas largas putativas inducidas (figura 18b-c). Despues se buscaron nuevos peptidos putativos en el plasma obtenido de individuos normales y cancerosos (figura 18). Se seleccionaron 3 de estas 22 protemas interesantes: APOAI, APOAII y APOCII. Basandose en los anteriores analisis, se espera encontrar protemas mas largas en el plasma de los pacientes cancerosos (13, 16 y 17 AA mas largas). Se predice que estas secuencias peptfdicas de infidelidad de la transcripcion seran inmunogenicas, y los anticuerpos dirigidos contra estas nuevas secuencias representan ligandos espedficos para medir la infidelidad de la transcripcion (figura 14). Puesto que el analisis de Kyte-Doolittle indica que estas secuencias no son hidrofobas, se espera que estas tres nuevas protemas se segreguen hacia la circulacion (vease a continuacion).

Identificacion del peptido de post-fin (PSP) de ApoII y ApoCII debido a la sustitucion en el codon de fin canonico

Los PSP que resultan de las sustituciones de bases en el codon de fin canonico pueden identificarse y caracterizarse de la siguiente manera. Se preparan anticuerpos policlonales de conejo que reconocen una porcion o

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porciones inmunogenicas del PSP en cuestion. Estos anticuerpos antipeptido pueden comprobarse mediante un analisis de la transferencia de puntos utilizando el peptido purificado para verificar que, en efecto, reconocen el PSP. Entonces puede realizarse un analisis de la transferencia Western con muestras de plasma obtenidas de pacientes cancerosos utilizando anticuerpos dirigidos contra el PSP. La figura 17a (panel derecho) demuestra que el anticuerpo anti-PSP de ApoAII reconoce una banda en las transferencias Western realizadas con muestras de plasma obtenidas de pacientes con cancer de prostata, que no se observa cuando se emplea suero preinmunologico de conejo como control negativo (figura 17a, panel izquierdo). La banda de PSP de ApoAII tambien se observa en pacientes con cancer en la fase metastasica (figura 17b, panel derecho). Esta banda tiene una masa molecular ligeramente mayor (11,4 kDa) comparada con la de la forma de monomero nativa de la ApoII (figura 17a, panel central, figura 17b, panel izquierdo). Esta masa molecular se corresponde con la predicha basada en el secuencia peptfdica adicional. Tambien pueden prepararse geles bidimensionales para caracterizar aun mas esta banda.

Pueden realizarse experimentos de cromatograffa de afinidad para aislar la forma de PSP de ApoAII utilizando el anticuerpo anti-PSP (figura 17e). El anticuerpo anti-PSP se inmoviliza sobre esferas de matriz y esta columna se incuba en presencia de plasma o HDL deslipidado, y despues se lava secuencialmente para eliminar las protemas unidas no espedficamente y, por ultimo, se eluye con detergente o reactivos caotropicos. La fraccion eluida se analiza mediante transferencia Western utilizando los anticuerpos anti-PSP y los anticuerpos comerciales anti- ApoAII. Dos bandas a 9 kDa y 11,4 kDa son reconocidas por el anticuerpo comercial anti-ApoAII, mientras que solo la banda de 11,4 kDa es reconocida por el anticuerpo anti-PSP. Por tanto, la banda de 9 kDa se corresponde con la forma nativa de ApoAII y la de 11,4 kDa se corresponde con la forma de PSP de ApoAII. La presencia de ApoAII nativa en la fraccion eluida sugiere que la protema PSP de ApoAII puede formar dfmeros con la protema ApoAII nativa bajo condiciones no reductoras nativas. En efecto, la ApoAII existe normalmente en el plasma como un dfmero de dos monomeros unidos mediante un unico puente disulfuro.

La ApoAII se localiza principalmente en la fraccion de HDL del plasma, que puede aislarse mediante ultracentrifugacion secuencial. Unos analisis de la transferencia Western demuestran que la PSP de ApoAII no se detecta en la fraccion de d < 1,07 g/ml que contiene VLDL y LDL, sino en la fraccion de d > 1,07 g/ml que contiene HDL y protemas plasmaticas (figura 17c). Despues de mas etapas de ultracentrifugacion para purificar y lavar el HDL (d = 1,07-1,21 g/ml), la transferencia Western revela que la PSP de ApoAII permanece asociada con la fraccion HDL en lugar de con la fraccion d > 1,21 g/ml, tambien denominada suero deficiente en lipoprotemas (LPDS). Una cantidad correspondiente del plasma demuestra, en la transferencia Western, que esto no es debido a una dilucion de la fraccion de d > 1,21 g/ml durante las etapas de purificacion. La separacion de las lipoprotemas del plasma mediante una filtracion en gel utilizando Superose 6B (Amersham, GE Healthcare) tambien demuestra que la PSP de ApoAII eluye de una manera similar a la de la ApoAII asociada con HDL.

La asociacion de PSP de ApoAII con HDL permite la purificacion de la forma de PSP de ApoAII de una manera similar a la de la ApoAII. En primer lugar, el HDL se deslipida para eliminar todos los lfpidos. El sedimento de protemas exento de lfpidos resultante entonces se resuspende en tampon Tris 10 mM que contiene urea o guanidina en presencia o en ausencia de un agente reductor, y se aplica a una columna de filtracion en gel (por ejemplo, Superdex 200, Amersham, GE Healthcare). Un analisis de la transferencia Western (figura 17d) demuestra que la forma de PSP de ApoAII sigue estando presente en HDL deslipidado. Se logro una mayor purificacion mediante una electroforesis preparativa (por ejemplo, DE52). La forma de pSp de ApoAII fue rastreada mediante un analisis de la transferencia Western. La forma de PSP de ApoAII purificada entonces se rompio de forma enzimatica (tripsina), y los peptidos resultantes se analizan en MS-MS para la secuenciacion completa de los AA. Los resultados demuestran que el codon de fin canonico esta reemplazado preferentemente por arginina, con una sustitucion (U a C) o (U a A), seguido de serina, valina, acido glutamico, treonina, isoleucina, valina, fenilalanina, acido glutamico, prolina, acido glutamico, leucina, alanina, serina, arginina. Esta es la secuencia exacta de aminoacidos que se predice que aparecera tras pasar por encima del codon de fin canonico de ApoAII. Por tanto, el codon de fin canonico UGA de ApoAII se sustituye por AGA o CGA que conduce a una arginina. Una hipotesis aun inexplorada es que UGA se convierte en GGA, que conduce a la glicina, pero la deteccion de este variante mediante espectrometna de masas todavfa se encuentra fuera de los lfmites tecnologicos actuales.

Otro ejemplo se ilustra con el PSP de ApoCII. La figura 17f muestra un experimento similar al de la figura 17a, con la excepcion de que los analisis de la transferencia Western se realizan con anticuerpos comerciales anti-ApoCII y con anticuerpos anti-PSP de ApoCII. Puede seguirse un procedimiento similar al del PSP de ApoAII para ApoCII. Sin embargo, ApoCII es menos abundante en el plasma. Por tanto, se requiere una cantidad mucho mayor de plasma que contenga PSP de ApoCII para obtener una cantidad suficiente para el analisis con MS-MS.

Conclusiones

Los inventores describen en la presente un nuevo mecanismo que conduce a unas sustituciones de bases que se producen en su mayor parte en el extremo 3' de la secuencia codificadora y la region no traducida del ARNm. Estas sustituciones de bases conducen a cambios en la secuencia de AA de protemas debido a cambios en la identidad de los AA, la introduccion de codones de fin prematuros, asf como la modificacion de los codones de fin naturales que resultan en la introduccion de nuevas regiones codificadoras. Este fenomeno de infidelidad de la transcripcion tambien puede afectar al mundo del ARNnc y alterar la regulacion mediada por estos ARN. Se produce en la mayona de los genes con una tasa que excede cualquier fenomeno descrito que conduzca a una mutacion en el

ADN. La infidelidad de la transcripcion aumenta muchnsimo en celulas cancerosas. La infidelidad de la transcripcion proporciona un nuevo paradigma para comprender la patologfa del cancer, la gravedad de la enfermedad y el avance de la enfermedad. Tiene implicaciones importantes no solo en el diseno de nuevos experimentos transcriptomicos y proteomicos, sino tambien para el desarrollo de diagnosticos y productos terapeuticos 5 espedficos.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Uso un peptido sintetico con una longitud de 100 aminoacidos o menos, que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 1 a 5, 7 a 13, 15 a 18 y 20 a 32 para detectar o controlar trastornos de celulas proliferativas.
2. El uso de un peptido de la reivindicacion 1, para detectar o controlar trastornos de celulas proliferativas, donde el peptido es inmunogenico.
3. Una composicion de vacuna que comprende un peptido de la reivindicacion 1, y opcionalmente un vehnculo, excipiente y/o adyuvante adecuado.
4. Una molecula de acido nucleico sintetica que codifica un peptido de 100 aminoacidos o menos que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 1 a 5, 7 a 13, 15 a 18 y 20 a 32 para detectar o controlar trastornos de celulas proliferativas.
5. Un metodo para producir un anticuerpo, comprendiendo el metodo inmunizar a un mairnfero no humano con un peptido de la reivindicacion 1 y recuperar anticuerpos que se unen a dicho peptido, o las correspondientes celulas productoras de anticuerpos.
6. Un anticuerpo, o derivado del mismo, que se une espedficamente a un peptido de la reivindicacion 1.
7. Un anticuerpo, o derivado del mismo, segun la reivindicacion 6, donde dicho anticuerpo es el conjugado de una molecula, tal como un farmaco, un marcador, una molecula toxica o un radioisotopo.
8. El anticuerpo conjugado, o derivado del mismo, de la reivindicacion 7, para usar como medicamento o reactivo de diagnostico.