TR201112295Y - transkripsiyon infidelitesi, tespit edilmesi ve kullanımları - Google Patents

transkripsiyon infidelitesi, tespit edilmesi ve kullanımları Download PDF

Info

Publication number
TR201112295Y
TR201112295Y TR2011/12295U TR201112295U TR201112295Y TR 201112295 Y TR201112295 Y TR 201112295Y TR 2011/12295 U TR2011/12295 U TR 2011/12295U TR 201112295 U TR201112295 U TR 201112295U TR 201112295 Y TR201112295 Y TR 201112295Y
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
infidelity
protein
sequence
transcriptional
transcription
Prior art date
Application number
TR2011/12295U
Other languages
English (en)
Inventor
Bihain Bernard
Original Assignee
Transmedi Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Transmedi Sa filed Critical Transmedi Sa
Publication of TR201112295Y publication Critical patent/TR201112295Y/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Glass Compositions (AREA)
  • Pit Excavations, Shoring, Fill Or Stabilisation Of Slopes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Bu buluş hücrelerde transkripsiyon infidelitesi (sadakatsizliği) için özgün bir mekanizmanın tanımlanması ile ilgilidir. Bu buluş bir örnek içerisindeki transkripsiyon infidelitesinin seviyesinin belirlenmesi için kompozisyonlar ve yöntemlerin yanı sıra bunların örnek olarak terapötik, tanısal, farmakogenomik veya ilaç dizaynı için kullanımlarını da sunmaktadır. Açıklanacağı üzere, bu buluş özellikle hastalıklaeın (örnek olarak proliferatif hücre hastalıkları gibi) belirlenmesi, izlenmesi veya tedavi edilmesi için, ilaçların dizayn edilmesi ve/veya taranması için, hasta veya hastalık profilinin çıkarılması, hastalığın derecesinin tahmin edilmesi ve ilaç etkisinin değerlendirilmesi için uygundur.

Description

Teknik Alan Bu bulus hucrelerde transkripsiyon infidelitesi (sadakatsizligi) için ozgun bir mekanizmanin tanimlanmasi ile ilgilidir. Bu bulus bir ornek içerisindeki transkripsiyon infidelitesinin seviyesinin belirlenmesi için kompozisyonlar ve yontemlerin yani sira bunlarin örnek olarak terapotik, tanisal, farmakogenomik veya ilaç dizayni için kullanimlarini da sunmaktadir. Açiklanacagi uzere, bu bulus ozellikle hastaliklarin (ornek olarak proliferatif hucre hastaliklari gibi) belirlenmesi, izlenmesi veya tedavi edilmesi için, ilaçlarin dizayn edilmesi ve/veya taranmasi için, hasta veya hastalik profilinin çikarilmasi, hastaligin derecesinin tahmin edilmesi ve ilaç etkisinin degerlendirilmesi için uygundur. Önceki Teknik Nukleik asit DNA ve RNA hucre çekirdeginde genomik bilgilerin depolanmasi (DNA) ve protein uretmek için haberci RNA ureten ve transkripsiyon olarak adlandirilan islemin ardindan genomik bilgilerin sitoplazma içerisine transfer edilmesi islevini saglayan makro-molekullerdir. Her ikisi de nukleotidler olarak adlandirilan monomerlerden olusan dogrusal polimerlerdir. DNA ve RNA'nin her biri dort tip nükleotidin kombinasyonlarini temsil etmektedir. Tum nukleotidler ortak bir yapiya sahiptir: bir fosfodiester tarafindan organik bir baza bagli olan bir pentoza baglanmis olan bir fosfat grubu: DNA için adenin, sitosiz, timin ve guanin (A, C, T, G) ve RNA için adenin, sitosin, urasil ve guanin (A, C, U, G). RNA içerisinde pentoz ribozdur ve DNA içerisinde ise deoksiribozdur. DNA molekulu bir çift helis olarak duzenlenmis çift kollu duzenli nukleotidler olarak organize edilmislerdir. RNA molekulleri ana olarak 4 tip molekul veren tek kollu polinukleotidlerdir: 1) DNA'dan kopyalanmis ve sitoplazma içerisinde proteinlere donüstürulmus tek kollu nukleotidler olan haberci RNA (mRNA), 2) iyi tanimlanmis 3 boyutlu bir yapiyi benimsemis olan ve donusum adi verilen bir sureç içerisinde spesifik AA sekanslari (dizileri) ile protein olusturmak uzere polipeptid zincirlerine transfer edilmis spesifik amino asitlere (AA) baglanan transfer RNA (tRNA), 3) mRNA uzerinde belirli bir sirada mevcut olan kodonlar (bir kodon = 3 nukleotid) tarafindan belirlenen sekans araciligi ile saglanan bilgiyi muteakip AA'nin proteine çevrilmesine olanak veren bir yapi olan ribozomu olusturan spesifik proteinler ile birlikte daha buyuk molekuller olan nbozomal RNA (rRNA) ve 4) kodlama yapmayan RNA olarak adlandirilan kisa duzenlemeli RNA (ncRNA). mRNA sekansi daha sonra donusum olarak adlandirilan bir sureç ile farkli bir dile, yani AA diline donusturulmektedir.
Burada ilk defa transkripsiyon fidelitesinin (bagliliginin), yani DNA bilgisinin mRNA içerisine transferinin, patolOJik hucrelerde, ozellikle kanser hucrelerinde dramatik olarak dustugunu göstermekteyiz. Kanser hücrelerinde transkripsiyon fidelitesinin bu eksikligi, mevcut veritabanlarinda bulunan transkriptlerin çogunlugunun yani sira rapor edilen orneklerde test edilen genlerin çogunu ve tum kanserleri etkiIeyen genel bir olgudur ve çok sayida acil ve onemli sonuçlari bulunmaktadir. Ozellikle transkripsiyon infidelitesinin kesfedilmesi patoloiik vakalarin incelenmesi için mevcut durumda kullanilan proteomik ve transkriptomik yaklasimlarin iyilestirilmesine olanak saglamaktadir. Transkripsiyon infidelitesinin kesfi ayrica siddetleri açisindan hastaliklarin daha iyi siniflandirilmasina da olanak saglamakta, terapotik etkinin tahmin edilmesini iyilestirmekte ve transkripsiyon fîdelitesinin eksikligini veya modifikasyonunu duzeltebilme kabiliyetleri açisindan ilaçlarin etkisinin izlenmesi için özgun yontemlerin dizayn edilmesine de olanak saglamaktadir.
Bu bulus bu nedenle hastalarin tedavi edilmesi, tespit edilmesi ve izlenmesi ve ilaç etkisinin yani sira tanilama ve ilaç gelistirme için buyuk sonuçlara (implikasyonlara) ve faydalara sahiptir.
Asagida açiklanan kesfin etkisinin anlasilmasi için mevcut durumda normal hucre islevi için DNA'nin RNA'ya transkripsiyonu esnasinda mutlak fidelitenin gerekli olduguna inanildiginin kavranmasi onemlidir. Ancak, mevcut durumda onemli ve çozulmemis bir husus devam etmektedir. Aslinda, insan genomunun siralanmasi ve açiklanmasi (numaralandirilmasi) 30-40 bin genin kodlanmis oldugu (sifrelendigi) fikrine sebep olmustur. Bu tahmin proteomik yontemler tarafindan tanimlanabilen proteinlerin mevcut sayisinin çok altinda kalmaktadir: 300 bin'e yakin protein tanimlanmistir. Bu farkliligin bagdastirilmasi için, alternatif ekleme (splays) adi verilen bir su'reç vasitasi ile tek bir genin farkli proteinleri kodlayan çesitli farkli mRNA'lar uretebilecegi onerilmektedir.
Alternatif ekleme haberci-oncesi RNA (meNA)'nin farkli kisimlarini uzaklastirmakta, bu sayede spesifik intronlara karsilik gelen farkli elementlerin uzaklastirilmasina sebep olmakta ve farkli olgun mRNA'lar uretmektedir. RefSeq veri tabaninin analizi 6946 gene karsilik gelen 11259 transkript içerdigini belirtmektedir. Bu nedenle, alternatif ekleme transkriptlerin heteroienligini %76 arttirabilmektedir. Burada açikladigimiz mekanizma alternatif eklemeden farklidir ve çok daha buyuk protein heterOJenIigi meydana getirmektedir. Aslinda, kodlanmis AA içerisinde degisiklikler ile sonuçlanan mRNA sekansinin rasgele-olmayan modifikasyonlarinin ortaya çikisini, daha kisa protein izoformlari veren premature stop kodonlarinin sunulmasini, uzatilmis protein izoformlari veren ozgün kodon sekanslarinin sunuldugunu belirten dogal stop kodonlarindaki degisimi gostermekteyiz. Aralik ve araya sokmanin yapilmasi mRNA okuma çerçevesini modifiye etmekte ve bu sayede suphelenilmeyen protein sekanslari yaratmaktadir. Bu bulusta açiklanan veriler bu transkripsiyon infidelitesi olgusunun normal hucrelerde mevcut oldugunu, ancak kanser-turevi hucreler gibi patoloiik hucrelerde dramatik olarak gelistigini gostermektedir. Bu nedenle transkripsiyon infidelitesinin (TI) DNA'dan RNA'ya transfer edilen bilgilerin farklilasmasina (diversifikasyonuna) katkida bulundugu onerilmektedir. Sonuçlarimiz transkripsiyon infidelitesinin rasgele ortaya çikmadigini ancak bO'yu, yani TI olayi tarafindan etkilenen bazlari, saran sartlarin onemli oldugu spesifik kurallari takip etmektedir.
Alzheimer hastaligi gibi norodeJeneratif hastaliklara sahip deneklerde molekuler yanlis okumanin bir gozlemi yapilmistir (Hoi Elly M ve digerleri: J. Biol. Chem., vol. 278, no. 11498 ; Gerez L ve digerleri: Neurobiology Of Aging, Tarrytown, Ny, Us Lnkd- W001/40804). Bu referanslarda hiçbir mekanizma karakterize edilmemistir.
RNA heterOJenliginin genomik degil RNA seviyesinde ortaya çikmasinin açiklanmasi için diger bir mekanizma tasawur edilebilir: RNA düzenleme. Ancak RNA duzenleme iki tip TI olayini açiklayamamaktadir, aralik ve araya sokmanin sunulmasi. RNA duzenleme okaryot içerisindeki mRNA ve tRNA'daki post-transkripsiyonel baz degisimleri ile karakterize edilmektedir. Bilinen ikame duzenleme olaylarinin buyuk bir çogunlugu C'den U'ya veya A'dan I'ya (G olarak okuyun) donusumleri içermektedir (Gott, J. M. & sayfa 305-312; veya Maas ve adenosin ve sitidin deaminleri tarafindan katalize edilen deaminasyon mekanizmalari tarafindan açiga çiktigini gostermektedir. Diger bir ikame duzenleme olayi ise “U'dan C'ye" donusumdur. Mikroskobik tersine çevrilebilirlik teorisi sitidin deaminaz reaksiyonunun bu donusumu olusturmak uzere geriye gidebilecegini soylerken, bir CTP sentetaz-tipi aktivitenin bundan sorunlu olabilecegini de onermektedir. Çesitli orneklerde RNA duzenlemenin normal hucrelere karsin kanser hucrelerine spesifik olabilecegi gosterilmistir. Ilaveten, bu olgunun orani kanser kosullarinda etkilenebilmektedir.
Kanser setinde cDNA seviyesinde %5.7 C->T, %9.2 T->C ve %4.7 A->G degisiklikleri gozlenmistir. Bu nedenle mRNA duzenlemesi burada açiklanan tek baz ikamelerinin (%246) ve T-> G (%168) bilinen insan enzimatik RNA duzenleme sureçleri ile halihazirda açiklanmayan baz ailesi degisikliklerini temsil etmektedir. mekanizmalar) vasitasi ile baz silinmelerine ve/veya yerlestirmelerine neden olmasi beklenmektedir. Ayrica, son zamanlarda yapilan bir çalisma dbSNP kayitlarinin (Tek Nukleotid Polimorfizm veri tabani) sayisinin aslinda duzenleme alanlari oldugunu Bizim yaklasimimizda dbSNP'deki tum SNP'ler goz onune alinmamaktadir, bu nedenle bilinen SNP'ler veya düzenleme alanlarina karsilik gelen yanlis SNP'ler hariç tutulmaktadir.
Bu nedenle, gozlemlenen kanser mRNA heteroienligini açiklayan mekanizma transkripsiyon infidelitesidir.
Bulusun Kisa Açiklamasi Bu bulus hucrelerde ve ozellikle memeli hucrelerindeki transkripsiyon infidelitesini kullanmak, belirlemek veya degistirmek için kompozisyonlar ve yontemler ile ilgilidir. Bu bulus ornek olarak artan veya azalan transkripsiyon inf'idelitesi ile iliskili olan veya bundan kaynaklanan hastaliklann teshis edilmesi ve/veya tedavi edilmesi için terapotik ve tanilama amaçlari için ozellikle uygundur.
Bu bulusun spesifik bir amaci bir vakada kanserin varliginin veya asamasinin belirlenmesi için bir yontem ile ilgilidir, bu yontem bahsedilen vakadan alinan bir ornekte transkripsiyon infidelitesinin varliginin veya oraninin (in wtro veya ex vitro) degerlendirilmesini içermektedir, bahsedilen varlik veya oran bahsedilen vakada kanserin varliginin veya asamasinin bir belirtecidlr.
Bu bulusun diger bir amaci bir ilacin taranmasi, belirlenmesi veya optimize edilmesi için bir yontemdir, bu yontem bahsedilen ilacin bir genin transkripsiyon infîdelite oranini degistirip degistirmediginin (ornek olarak arttirmasi veya azaltmasi) degerlendirilmesi adimini içermektedir.
Bu bulusun bir diger amaci bir insan veya hayvanin, ozellikle kanserlerin tedavi edilmesi için bir yontem içerisinde kullanilmak uzere farmasotik bir kompozisyonun uretilmesi için bir memeli geninin transkripsiyon infîdelite oranini degistiren (ornek olarak arttiran veya azaltan) bir bilesigin kullanimi ile ilgilidir.
Bu bulusun diger bir amaci bir ilaç veya aday ilacin etkisinin degerlendirilmesi için bir yontem ile ilgilidir, bu yontem bahsedilen ilacin bir memeli geninin transkripsiyon infidelite oranini degistirip degistirmediginin (ornek olarak arttirdiginin veya azalttiginin) degerlendirilmesi adimini içermektedir, bu tur bir degisiklik ilaç etkisinin bir belirtecidir.
Bu bulus ayrica bir ornek içerisindeki transkripsiyon infidelitesinin (seviyesinin) belirlenmesi veya olçülmesi için yöntemler, ürünler (problar, primerler, antikorlar veya bunlarin turevleri gibi) ve bunlara karsilik gelen kitleri de sunmaktadir.
Bu bulus ilaveten proteinler veya nukleik asitler içerisindeki transkripsiyon inûdelite sekanslarinin tanimlanmasi için ve bunlarin ornek olarak isaretleyiciler, immunOJenler olarak ve/veya bunlarin spesifik ligandlarinin uretilmesi için kullanimi için yontemler de sunmaktadir.
Bu baglamda, bu bulus kanser biyo-isaretleyicilerinin tanimlanmasi için bir yontem ile ilgilidir ve bu yontem bir ozneden alinan bir ornekte bir hedef protein veya nukleik asit içerisindeki transkripsiyon infidelite alan(lar)inin tanimlanmasini ve tercihe bagli olarak bahsedilen transkripsiyon infidelite alan(lar)inin diziliminin belirlenmesini içermektedir.
Belirli ve tercih edilen bir uygulamada, hedef protein bir hucre yuzeyi proteini veya salgilanmis bir proteindir, ozellikle bir hucre yuzeyi proteini veya bir plazma proteinidir.
Bu bulus ayrica bir ozellik veya patoloiik duruma ozel bir ligandin tanimlanmasi ve/veya uretilmesi için bir yontemi de açiklamaktadir, bu yontem bahsedilen ozellik veya patol01ik duruma sahip bir ozneden alinan ornekte bir veya daha fazla hedef protein veya nukleik asit içerisinde en az bir transkripsiyon infidelite alaninin varliginin tanimlanmasini, tercihe bagli olarak bahsedilen en az bir adet transkripsiyon infidelite alaninin diziliminin belirlenmesini ve transkripsiyon infîdelitesi tarafindan olusturulan bahsedilen en az bir protein (veya alan) veya nukleik aside spesifik olarak baglanan bir ligandin uretilmesini içermektedir.
Bu bulus ozellikle kanser biyo-isaretleyicilerinin tanimlanmasi için uygundur. Memeli oznelerde bu tür rahatsizliklara ozel Iigandlarin, ozellikle bir oznedeki bir hucre proliferatif rahatsizligin varligini veya seviyesini belirleyebilen ligandlarin uretilmesi için ozellikle uygundur.
Bu bulus ayrica spesifik olarak transkripsiyon infîdelitesi tarafindan olusturulan bir protein (veya alan) veya nukleik aside baglanan bir ligandi açiklamaktadir. Bu ligand spesifik olarak transkripsiyon infidelitesi tarafindan olusturulan bir proteine (veya alana) baglanan bir antikor (veya daha sonra açiklanacagi gibi herhangi bir kismi (Fab, Fab', CDR vb. gibi) veya turevi) olabilir. Bu ligand ayrica spesifik olarak transkripsiyon infîdelitesi tarafindan olusturulmus bir nukleik aside baglanan bir nukleik asit de (ornek olarak prob, primer, RNAi (girisim RNA'si) vb.) olabilir.
Bu bulus iIaveten transkripsiyon infidelitesi tarafindan olusturulan bir proteinin, ozellikle bir memeli proteinin ve daha çok tercih edilen haliyle bir insan proteinin bir alanini içeren bir peptidi açiklamaktadir. Bu peptid tipik olarak sentetik bir peptiddir: yani örnek olarak kimyasal sentez, amino asit sentezi ve/veya uzatmasi, protein sindirimi, peptid birlestirme, rekombinant ekspresyon vb. gibi yontemlerle yapay olarak hazirlanmis bir peptiddir. Bu peptid tipik olarak bahsedilen proteinin bir C-terminal uygulamalarda, peptid uzunlugu daha fazla olabilir). Protein bir hücre yuzeyi proteini (ornek olarak bir reseptor vb.), salgilanmis bir protein (ornek olarak bir plazma proteini vb.) veya bir hucre içi proteini olabilir.
Bu bulusta ayrica yukarida tanimlandigi gibi transkripsiyon in'ridelitesi tarafindan olusturulan bir peptidin bir immunoien olarak kullanimi da açiklanmaktadir. Bu bulus ayrica yukarida tanimlandigi gibi transkripsiyon infidelitesi tarafindan olusturulmus bir proteinin bir parçasini içeren bir peptidi ve tercihe bagli olarak uygun bir tasiyici, eksipiyan ve/veya adJuvani içeren bir asi kompozisyonunu da açiklamaktadir.
Bu bulus içerisinde ilaveten bir antikorun uretilmesi için bir yontem de açiklanmaktadir, bu yontem insan olmayan bir memelinin yukarida tanimlandigi gibi transkripsiyon infidelitesi ile olusturulmus bir peptid ile imunize edilmesini ve bahsedilen peptide baglanan antikorlarin veya karsilik gelen antikor-üreten hucrelerin geri toplanmasini içermektedir. Tercihe bagli olarak antikorun turevleri de uretilebilir.
Spesifik bir uygulamada, bu bulus bir antikor uretimi için bir yontemi açiklamaktadir, bu yontem (i) transkripsiyon infidelitesi tarafindan olusturulmus bir protein alaninin tanimlanmasini ve (ii) bahsedilen alana spesifik olarak baglanan bir antikorun uretilmesini içermektedir. Tercihe bagli olarak, antikorun turevleri de uretilebilir.
Bu bulusta ayrica transkripsiyon infidelitesi tarafindan olusturulan bir proteinin bir parçasina spesifik olarak baglanan bir antikor veya buyuk oranda ayni antiJen ozelligine sahip bu tur bir antikorun bir turevi de açiklanmaktadir. Antikor poliklonal veya monoklonal olabilir. Turevi terimi herhangi bir kismini (Fab, Fab', CDR, vb. gibi) veya tek zincirli antikorlar, bi-fonksiyonel antikorlar, insanlastirilmis antikorlar, insan antikorlari, kimerik antikorlar vb. gibi diger turevleri içermektedir.
Bu bulusun diger bir açiklamasi yukarida açiklandigi gibi bir molekule konJuge olmus (baglanmis) bir antikor veya bunun bir t'urevi ile ilgilidir. Molekul bir ilaç, bir etiket, toksik bir molekul, bir radyoizotop vb. olabilir.
Bu bulus ayrica yukarida tanimlandigi gibi bir antikor veya turevinin bir genin transkripsiyon inHdelitesinin (ornek olarak in wtro) belirlenmesi veya nicel hale getirilmesi için kullanilmasi ile de iIgiIidir.
Bu bulus ayrica yukarida tanimlandigi gibi bir konJuge bir antikor veya turevinin bir tedavi veya tanilama reaktifi (ayiraci) olarak kullanimi ile de ilgilidir.
Bu bulus ilaveten spesifik olarak transkripsiyon infidelitesi tarafindan olusturulmus bir protein veya nukleik aside baglanan bir reaktifi içeren, bir destek üzerine sabitlenmis bir cihaz veya urunu de açiklamaktadir. Reaktif ornek olarak bir prob veya bir antikor veya bir turevi olabilir.
Bu bulusta ilaveten bir hucre veya doku veya organizma içerisinde transkripsiyon infidelitesine neden olunmasi veya baslatilmasi veya uyarilmasi için bir yontem de açiklanmaktadir. Bu tur bir yontem tipik olarak bir transknpsiyon in'r`idelitesi alaninin normal genomik sekanslar içerisinde örnek olarak bir gen terapisi vektorü araciligi ile sokulmasini içerebilir. Bu tur bir modifikasyon bir hucre veya dokunun yikimi ile sonuçlanabilir. Ozellikle hucre toksik proteinlerinin veya bilesiklerinin uretimi ile sonuçlanan herhangi bir gen sekansi içerisinde açik bir okuma çerçevesi olusturmak mumkundur. Hasta (veya hedef) bir hucre içerisinde, toksik veya terapotik molekuller kullanilarak hedeflenen spesifik bir biyo-isaretleyicinin ekspresyonu da mumkundur. Bu nedenle bu yaklasimi kullanarak, transkripsiyon infidelitesi meydana geldiginde veya belirli bir orani astiginda hücrenin olumune veya tedavi edilmesine neden olunmasi mumkundur.
Bu bulus içerisinde ayrica bir insan veya hayvanin tedavisi için bir yontemde kullanilmak uzere farmasotik bir kompozisyonun uretilmesi için transkripsiyon infidelitesi alan(lar)i içeren bir nukleik asidin kullanimi da açiklanmaktadir. Bu gen; bir memeli geni veya viral bir gen, bakteriyel bir gen vb. gibi patojenik bir ajandan gelen bir gen dahil olmak üzere herhangi bir gen olabilir. Bu baglamda, bu bulus bir patOJen tarafindan kaynaklanan bir hastaligin tedavisi için bir yontem ile ilgilidir, bu yontem bahsedilen patoien tarafindan kodlanmis bir genin transkripsiyon infîdelitesine neden olunmasini veya uyarilmasini içermektedir.
Bu bulus ayrica azaltilmis transkripsiyon infidelitesi ile in vitro olarak rekombinant polipeptidlerin uretim yontemleri ile de ilgilidir. Bu tur yontemler rekombinant polipeptid|erde mikro-heterOJenlikte bir dususe olanak vermektedir. Bu yontem transkripsiyon infidelitesinin ortaya çikis sikligini dusurmek için rekombinant bir nukleik asit içeren konakçi hucrelerin uyarlanmis kodon kullanimi ile birlikte kullanimini içermektedir. Bu yontem ayrica transkripsiyon infidelitesinin ortaya çikma sikligini azaltan herhangi bir bilesik veya tedavinin kullanimini da içermektedir. Yontem prokaryotik veya okaryotik konakçi hucrelerde, ornek olarak E. coli veya CHO suslarinda kullanilabilir.
Bu bulus ornek olarak hucre proliferatif hastaliklar (ornek olarak kanserler), bagisiklik rahatsizliklari (ornek olarak oto-immun hastaliklar (çoklu skleroz, Amiyotropik Lateral Skleroz (ALS)), gref reddi), yaslanma, inflamatuvar hastaliklar, diyabetler vb. gibi artan veya azalan transkripsiyon infidelitesi orani ile iliskili çesitli patoloiik durumlarin belirlenmesi, izlenmesi veya tedavi edilmesi için ve/veya terapotik olarak aktif ilaçlarin uretilmesi, dizayn edilmesi veya taranmasi için herhangi bir memeli oznede, ozellikle herhangi bir insan oznede kullanilabilir. Bu bulus ayrica prokaryotik hucreler, alt okaryotlar (ornek olarak mayalar), bocek hucreleri, bitki hucreleri, mantar vb. gibi herhangi diger dokular veya hücre türlerinde transkripsiyon infidelitesinin belirlenmesi, izlenmesi, module edilmesi veya hedeflenmesi için de kullanilabilir.
Sekillerin Kisa Açiklamasi Sekil 1: cDNA kutuphanesi olusturulmasi ve dizilmesi (sekanslama) prensibi Sekil 2: (a-q) Analiz için kullanilan mRNA referans sekanslari. Blastin çarpilmasini onlemek için mRNA referans sekanslarinin poIiA kuyrugu sistematik olarak uzaklastirilmistir. Sekil 2r test edilen genlerin bir Iistesini sunmaktadir.
Sekil 3: Tipik MegaBLAST çikti dosyalari.
Sekil 4: Incelenen her bir gen için herhangi bir pozisyondaki nukleotid sekans sapmasinin yuzdesi.
Sekil 5: TPT1, VIM = EST 'ler ve oran testi analizlerinin sayisi.
Sekil 6: Elektronik filtrelerin arka arkaya uygulanmasindan once ve sonra EST 'lerdeki degisimler. Clip 400 ve hucre hatti uzaklastirma etkileri.
Sekil 7: DNA içerigi: a) Baz bO heteroienligi uzerinde meNA baz kompozisyonunun etkisi, b) Ikame edilen her bir baz için yerine geçen bazin kompozisyonu, c) Istatistiksel olarak belirgin C>N testleri içerisinde etkilenen ve degistirilen bazlarin yeniden bolunmesi, cl) b-1 veya b+1'in tekrarina karsilik gelen ikame bazi uzerinde meNA baz kompozisyonunun Sekil 8: VIM için sanal varyant mRNA ve protein.
Sekil 9: Kodlama etkisi Sekil 10: Ilgilenilen protein = stop kodonu istatistiksel olarak etkilendiginde amino asit dizilimleri.
Sekil 11: DHPLC = belirleme prensibi ve Iimitleri.
Sekil 12: DHPLC = primerler ve beklenen PCR urunleri.
Sekil 13: Incelenen 60 proteinin listesi.
Sekil 14: Antikor uretimi.
Sekil 15: DHPLC Sonuçlari Sekil 16: Sanger hassasiyeti Sekil 17: Kanserli hasta plazmasinda APOAII ve APOCII PSP'nin belirlenmesi Sekil 18: Plazma proteinleri uzerinde potansiyel PSP Sekil 19: mRNA dizilim ikame tahminlerinin degerlendirilmesi Bulusun Ayrintili Açiklamasi Tanimlar Transkrmsivon Infîdelitesi Transkripsiyon infidelitesi terimi bir hucre içerisinde çesitli ayri RNA molekullerinin tek bir gen sekansindan uretildigi ozgun bir mekanizmayi tanimlamaktadir. Bu yeni tanimlanan mekanizma potansiyel olarak her turlu geni etkilemektedir, rasgele degildir ve asagida açiklanacagi üzere belirli kurallari takip etmektedir. Orneklerde gosterildigi gibi, transkripsiyon infidelitesi RNA molekulleri içerisinde ikameler, silmeler ve araya sokmalara neden olabilir ve bu sekilde tek bir genden farkli proteinler yaratabilmektedir. Transkripsiyon infidelitesi ayrica kodlama yapmayan RNA sekanslarini da etkileyebilir ve bu sekilde islevlerini module edebilir. Bu nedenle transkripsiyon infidelitesinin olçulmesi, module edilmesi veya hedeflenmesi hastaliklarin belirlenmesi veya tedavi edilmesi ve ilaç gelistirilmesi için ozgun bir yaklasimi temsil etmektedir.
Transkripsiyon Infidelite Alani Bu bulusun kapsami içerisinde, Transkripsiyon Infidelite Alani terimi transkripsiyon infidelitesi tarafindan etkilenen bir sekans ve/veya pozisyonu ifade etmektedir. Bu transkripsiyon infidelitesinin bir sonucu olarak olusturulan en az bir modifikasyon içeren bir nukleik asit veya amino asit alani olabilir. Bu tür bir modifikasyon ornek olarak kodlama çerçevesinde bir degisimden (ilave ve/veya silme), stop kodonlarinin sunulmasi veya bastirilmasindan, yeni bir baslatma kodonunun sunulmasindan, nukleotid(ler)in ikame(ler)inden (AA'nin degisiminin ima edilmesi veya edilmemesi) vb. kaynaklanabilir.
Bir transkripsiyon infidelite alani transkripsiyon infidelitesinden kaynaklanan bir veya daha fazla sekans varyasyonlan içerebilir. Bir transkripsiyon infidelite alani ornek olarak 1 adet modifiye edilmis nukleotid veya amino asit rezidusu ila ornek olarak 150 adet modifiye edilmis nukleotid veya amino asit rezidusunden veya daha fazlasindan olusmaktadir. Transkripsiyon infidelite alani tipik olarak sadakatli transknpsiyondan kaynaklanan sekanstan en az bir nükleotid veya amino asit modifikasyonu (ornek olarak ikame, silme, yerlestirme, ters çevirme vb.) ile ayrilmaktadir. Transkripsiyon infidelitesi tarafindan olusturulan bir protein veya alan (T I-proteini) tipik olarak en az bir adet modifiye edilmis amino asit rezidusune sahip olan 1 ila 50 arasinda (veya hatta daha fazla) amino asit içermektedir. Bir nukleik asit transkripsiyon infidelite sekansi tipik olarak en az bir adet modifiye edilmis nükleotid rezidüsune sahip 1 ila 150 arasinda (ve hatta daha fazla) nukleotid içermektedir.
Transkriosivon Infidelitesi Kurallari ve Tanimlanmasi Bu uygulamada tanimlandigi gibi transkripsiyon infidelitesinin spesifik belirleme tekniklerine ve/veya spesifik kurallarina dayanarak, herhangi bir gen veya protein için Transkripsiyon Infidelite Alanlarinin tahmin edilmesi ve tanimlanmasi artik mumkundur.
Bu alanlar ayrica verilen RNA için mevcut sekanslari hizalayarak ve baz ikamelerini tanimlayarak da elde edilebilir. Bunlar nihayetinde ornek olarak tahmin edilen bir TI- proteini için spesifik ligandlar kullanilarak çesitli teknikler ile dogrulanabilir.
Bir transkripsiyon infidelite alanini tanimlamak için spesifik bir yontem: - verilen bir gen, RNA veya cDNA molekulunun veya bir kisminin diziliminin (sekansinin) saglanmasi, ve - bahsedilen sekans içerisinde, ornek olarak asagida (iii) içerisinde anlatildigi glbi transkripsiyon infidelitesi kurallarini takip ederek, transkripsiyon infidelitesinden kaynaklanan bir nukleotid degisiminin (ornek olarak ikame, silme, yerlestirme, tersine çevirme) tanimlanmasi, adimlarini içermektedir.
Bir transkripsiyon infidelite alaninin tanimlanmasi için diger bir spesifik yontem: - verilen bir protein veya bir kisminin diziliminin saglanmasi, ve - bahsedilen sekans içerisinde, ornek olarak asagida (iii) içerisinde anlatildigi gibi transkripsiyon infidelitesi kurallarini takip ederek, transkripsiyon infidelitesinden kaynaklanan bir amino asit degisiminin (örnek olarak ikame, silme, yerlestirme, tersine çevirme) tanimlanmasi, adimlarini içermektedir.
Bir molekul içerisinde transkripsiyon infidelitesinden kaynaklanan bir degisikligin varligi uç adimlik bir sureç ile tanimlanabilmektedir ve bu sureç: (i) Çoklu Karsilik Gelme Faktoryel Analizi (MCFA) faktorleri uzerinde kuadratik diskriminasyona dayali bir ogrenme makinesi ile transkripsiyon infidelite alanlarinin tanimlanmasi (ii) ayni yontem ile transkripsiyon infîdelite alanlarinin (b-1 veya b+1 veya diger) kategorisinin tanimlanmasi ve (iii) asagidaki transkripsiyon infidelite kurallarini kullanarak degistirilecek bazin tahmin edilmesi: . Bir tekil olarak mevcut olan herhangi bir baz için, yani oncesinde veya sonrasinda kendisi tarafindan takip edilmeyen herhangi bir baz için, ikame edilecek baz buyuk ihtimalle ikame edilecek olandan onceki ile aynidir (b-1 kategorisi durumunda) veya ikame edilecek olandan sonraki baz ile aynidir (b+1 kategorisi durumunda). Ornek olarak CAT, CCT haline gelecek (b-1 kurali); ATG, AGG haline gelecektir (b+1 kurali); . Uç arka arkaya A içerisinde ikameler meydana geldiginde, ikinci A'nin ikamesi tercihen C'ye gitmektedir; . Uç arka arkaya T içerisinde ikameler meydana geldiginde, ikinci T'nin ikamesi tercihen C'ye, daha sonra A' a ve sonrasinda ise G'ye gitmektedir; . C ve G'nin uzatmalari ikincide çok nadir ikame edilmektedir, ancak eger varsa, ikinci C'nin ikamesi tercihen A'ya ve ikinci G'nin ikamesi tercihen C'ye gitmektedir; . Diger durumlar için degistirme bazi tercihen C'dir.
Herhangi bir hedef protein veya nukleik asidin dizilimi içerisindeki transkripsiyon infidelite alanlarinin tanimlanmasi için diger yontemler 'ornek olarak ifade edilen mevcut dizilim etiketlerinin (EST'ler) karsilastirilmasini, tanimlanan dizilimlerin dogrudan guçlendirilmesini ve guçlendirme urunlerinin spesifik dizilim yontemleri (Sanger, kimyasal, Payro-sekanslama) ile dizilmesini içermektedir. Bu tur bir yaklasik AA degisiklikleri, protein uzunlugunda modifikasyonlar vb. içeren varyant dizilimler vermektedir. Daha sonra transkripsiyon inndelite alanlari tasiyan mRNA veya cDNA ile seçici olarak eslesen oligonukleotid dizayn edilebilir ve bu bir dizilim havuzundan transkripsiyon infidelitesine sahip nukleotidin seçici amplifikasyonuna olanak vermektedir. ayrica TI-proteinini hedefleyen antikorlar da uretilebilir.
Alternatif olarak, bir transkripsiyon infidelite alaninin sekans analizi veya biyoinformatik kurallari vasitasi ile de tanimlanmasi mumkundur. Sonuçta ortaya çikan sekans (dizilim) herhangi bir transfeksiyon vektoru içerisinde klonlanabilir. Ayrica sadece transkripsiyon infidelitesi meydana gelirse kopyalanacak veya donusturulecek olan bir raportor gen ile çerçeve içerisinde bu tur bir transkripsiyon infidelite alani içeren bir yapinin dizayn edilmesi de mumkündur. Raportor gen bir enzim veya floresan protein olabilir veya hedef hucreyi bir toksine karsi hassas veya dayanikli yapan herhangi bir gen olabilir.
Transkripsiyon infidelite alanlarinin (veya ikamelerinin) tanimlanmasina olanak veren detayli bir yontem asagida açiklandigi uzere TDG yontemini içermektedir: RNA içerisindeki transkripsiyon infidelite alan(Iar)inin belirlenmesi için Pan ve Weissman karisimlardan yanlis-eslesme içeren DNA çiftlerinin ayri ayri zenginlestirilmesi kabiliyetine sahip bir enzim olan Tiamin DNA glikosilaz (T DG)'in kullanimina dayanmaktadir. Bu enzimler spesifik olarak nukleotid yanlis eslesmelerini tanimakta ve abazik alanlar meydana getirmektedir (deoksiriboz ile DNA'nin bazlarindan biri arasindaki bag parçalanmaktadir). Daha sonra, TDG geri döndürülebilir sekilde bu abazik alanlari baglayabilmekte ve bu sayede yanlis-eslesme içeren DNA parçalarinin afinite saflastirmasi için kullanilabilmektedir. Tipik bir denemede, RNA'lar 2 hucre turunden (normal ve kanserli) ekstrakte edilmekte ve çift-kollu cDNA yapmak uzere ters kopyalanmaktadir. Her bir örnegin isi ile denaturasyonu ve yavas renaturasyonundan sonra, yanlis-eslesme(ler)e sahip cDNA'Iar olusturulmakta ve mukemmel çiftlerden ayrilabilmektedir. Bu cDNA'Iar daha sonra ya dogrudan sekanslama ile analiz edilebilmekte veya DHPLC ile karsilastirilabilmektedir (ileride açiklanacaktir).
Transkripsiyon infidelitesi alanlarinin veya mutasyonlarinin tanimlanmasi için adapte U56,120,992 dokumanlarinda açiklanmaktadir.
Tipik olarak transkripsiyon infidelite alanlarinin tanimlama yontemleri ilave olarak tanimlanan sekansi içeren bir molekulun uretilmesi, bahsedilen molekule spesifik olarak baglanan bir ligandin olusturulmasi ve biyoloiik bir ornek içerisinde bahsedilen ligand tarafindan spesifik olarak taninan bir antiJenin varliginin dogrulanmasi ile transkripsiyon infidelite alaninin dogrulanmasi adimini da içermektedir.
Bir nukleik asidin tipik bir transkripsiyon infidelite sekansi; transkripsiyon infidelitesinden kaynaklanan en az bir baz ikamesi, silinmesi veya yerlestirilmesi içeren, tercihen Ornek 'te açiklanan bir kurali takip eden, uzunlugu 1 ila 150 nukleotid arasinda olan bir sekanstir. Transkripsiyon infidelite sekansi daha yuksek olabilir.
Bir TI-proteininin tipik bir alani transkripsiyon infidelitesinden kaynaklanan en az bir amino asit ikamesi (veya baz silinmesi veya yerlestirilmesi nedeniyle kodlama çerçevesindeki modifikasyondan dolayi daha fazla degisiklik) içeren, tercihen Ornek 5'te açiklanan bir kurali takip eden, uzunlugu 1 ila 5 amino asit arasinda olan bir amino asit sekansidir. Bir TI-proteininin alani daha yuksek olabilir.TI-proteinlerinin alanlarinin ornekleri deneysel bolumde, ornek olarak Sekil 13 ve 14'de sunulmaktadir.
Transkripsiyon Infidelitesinin Belirlenmesi veya Ölçülmesi Bu bulus DNA'nin RNA'ya transkripsiyonu sirasinda veya hemen sonrasinda ortaya çikan yuksek oranda dogal sekans anormalliklerinin beklenmeyen kesfîne dayanmaktadir. Bu sureç normal hucrelerde mevcut olabilir, ancak patoloiik hucrelerde, ornek olarak kanser hucrelerinde buyuk oranda artmaktadir. DNA'nin RNA'ya transkripsiyonunun bire bir baz tamamlayicilar tarafindan tanimlananlardan farkli kurallari takip ederek sekans varyasyonlarini olusturdugunun kesfi transkripsiyon infîdelitesi tarafindan olusturulan nukleik asit veya proteinlere spesifik ozgun reaktiflerin (ornek olarak problar, primerler, antikorlar, aptamerler) rasyonel dizaynina olanak vermektedir. Bu tur reaktifler bu nedenle transkripsiyon infidelitesinin tespit edilmesine veya olçulmesine, normal veya hastalikli durumlar arasinda ayrim yapilabilmesine ve transkripsiyon infidelitesi ortaya koyan hucrelere molekullerin hedeflenebilmesine olanak verebilmektedir. edicisi) olan reaktiflerin (ornek olarak problar, primerler, antikorlar, aptamerler) rasyonel dizaynina da olanak vermektedir. Aslinda, hastaligin seviyesi (siddeti) ile daha yuksek oranda transkripsiyon infidelitesinin korelasyon gostermesi beklenmektedir ve daha fazla gen urunu etkilendikçe bu oran kademeli olarak artmaktadir. Hastalikli hucre(ler)de transkripsiyon (in)f`idelitesinin burada açiklanan yontemle veya diger herhangi bir teknol03i ile dogrudan olçumu verilen herhangi bir dokuda hastalik surecinin farkli asamalarinda hücrelerin tespit edilmesine olanak vermektedir. Gen ekspresyonundaki bu varyasyonlarin dogru sekilde olçulmesi (transkriptler ve proteinler) de hastaligin derecesine gore ilaç etkisinin degerlendirilme kapasitesini arttirmaktadir. Mevcut durumda, çesitli mikro-dizi teknikleri gen ekspresyonundaki degisimlerin olçulmesine olanak vermektedir. Ancak, bu verilerin guvenilirligi ve en onemlisi yeniden uretilebilirligi (tekrar edilebilirligi) hali hazirda yeterli degildir. Bu transkriptomik deneylerin degiskenliginin buyuk bir kisminin bu bulusun mucitleri tarafindan kesfedildigi uzere kismen transkripsiyon infidelitesi tarafindan kaynaklandigini kabul edebiliriz. Bu nedenle, bu ortak olgunun kesfi transkripsiyon infidelitesinden minimum seviyede etkilenen veya bu bulusta açiklanan kurallari takip eden spesifik dizilimlerde ortay çikan transkripsiyon infidelitesini dogrudan yansitan gen ekspresyon reaktiflerinin dizayn edilmesine olanak vermektedir.
Ayrica transkripsiyon infidelitesinin transkripsiyon orani tarafindan module edilmesi de olasidir ve hatta buyuk ihtimalle boyledir. PatOIOJIk durumdaki verilen bir genin artan ekspresyonunun TI'yi arttiracagi ve bu sekilde protein heterOJenligini arttiracagini tahmin etmekteyiz.
Transkripsiyon infidelitesi bu teknik alanda bilinen ve bu bulusa uyarlanabilen birkaç adet teknik kullanilarak tespit edilebilmekte veya olçulebilmektedir. Ozellikle bir protein veya nukleik asidin çesitli formlari arasinda tespite olanak veren spesifik problar, primerler veya antikorlar, elektroporoz, Jel migrasyon analizi, spektrometri vb. gibi transkripsiyon infidelitesi tarafindan olusturulan nukleik asit veya proteine spesifik reaktifler kullanilarak transkripsiyon infîdelitesi olçulebilir. Transkripsiyon infidelitesi orani transkripsiyon infîdelitesine maruz kalan bir hucrede genlerin sayisi ve/veya verilen bir gen için olusan transkripsiyon infidelite alanlarinin sayisi degerlendirilerek tespit edilebilir. Bu tur bir oran bir test ornegi içerisindeki transkripsiyon infidelitesi tarafindan olusturulan nukleik asit veya protein seviyesi ile referans bir ornekten elde edilenler karsilastirilarak belirlenebilir.
Transkripsiyon Infidelitesinin nukleik asit seviyesinde tespit edilmesi Yukarida açiklandigi uzere, transkripsiyon infidelitesi RNA molekulleri içerisinde dizilim varyasyon(lar)i meydana getirmektedir. Bu nedenle transkripsiyon infidelitesinin tespit edilmesi veya olçulmesi, bir veya daha fazla gen tarafindan kodlanmis RNA'lar veya tum bir hucre veya doku veya ornek içerisindeki bu tur varyasyon(lar)in varliginin veya (mutlak veya nispi) miktarinin tespit edilmesi ile gerçeklestirilebilir. Nukleik asitler içerisinde transkripsiyon infidelitesinin tespiti hibridizasyon, amplifikasyon, heterodubleks formasyon vb. gibi çesitli teknikler ile gerçeklestirilebilir. Çesitli farkli doku turleri içerisinde mevcut olan nukleotidlerin tanimlanmasinda kullanilan hemen hemen tum teknol01iler hibridizasyon adi verilen bir surece dayanmaktadir.
Hibridizasyon, polimorfizmin belirlenmesi ve gen ekspresyonundaki varyasyonlarin aranmasi için kullanilan mikro-diziler gibi teknoloiiler için kritiktir. Bu teknik gen ekspresyonunun seviyesinin olçulmesi için uygulanmaktadir. Oligonukleotid problarinin hibridizasyonu ayrica dusu'k fazlalik mesajlarinin daha iyi incelenmesine olanak vermek üzere fazla miktarda eksprese edilen gen dizilimlerinin çikartilmasi için de kullanilmaktadir - bu prosedur çikartimci (eksiltici-subtraktif) hibridizasyon olarak adlandirilmaktadir. Hibridizasyon ayrica, mesaJ dizilimini RNA tipinden DNA tipi dizilime donüsturmek için ters transkriptaz uygulanmasindan sonra ya da dogrudan PCR deneylerinde yaygin olarak kullanilan gen amplifikasyon reaksiyonunun da birinci Hibridizasyonun altinda yatan temel mekanizma, ilgili dizilimlerin birbirlerini tamamlayici olmasi kosulu ile, tek kollu nukleotid(ler) dizilimlerinin birbirlerine baglanabilmesidir. 4 bazin her birinin hem uzunlugu hem de spesifik sirasi hibridizasyonun etkisini ve dizilimin belirliligini (spesifitesini) belirlemektedir. Bu her bir spesifik bazin kovalent olmayan bir sekilde tamamlayici bazina baglandigini ima etmektedir: A T'ye ve C G'ye ve bunlarin tersi. Bir dizilim eslesmesindeki bu kovalent olmayan baglanma bazin sirasi ile kosullandirilmaktadir. Bu nedenle genel uygulamada bazlarin tanimlanmis bir dizilimi tek bir tamamlayici dizilime baglanmaktadir. Bu spesifik baglanma reaksiyonu verilen herhangi bir nukleotid karisimi içerisindeki herhangi bir tamamlayici dizilimin tanimlanmasina olanak veren hibridizasyon için temel teskil etmektedir. Hibridizasyonun etkinligi, uygun sirada, birbirlerine eslesen bazlarin sayisi (bazi seviyedeki yanlis eslesmeler tolere edilmektedir) ile belirlenmekte ve baglama tamponunun katiligi (sikiligi), CG ve TA'nin nispi miktarlari (CG ve TA sirasiyla 3 ve 2 hidrOJen bagi ile baglanmaktadir) ve erime sicakligi, yani çilt-kollu DNA'nin %50 çözunmesine olanak vermek için gerekli olan sicaklik gibi deney kosullari tarafindan belirlenmektedir.
Hibridizasyon kullanilarak transkripsiyon infidelitesinin tespit edilmesi tipik olarak bir ornegin bir transkripsiyon infidelitesi için spesifik olan bir nukleik asit probu ile temas ettirilmesi ve olusan hibridlerin (melezlerin) varliginin (veya miktarinin) tespit edilmesini içermektedir, bahsedilen varlik veya miktar transkripsiyon infîdelitesinin varliginin veya oraninin dogrudan bir göstergesidir. Tercih edilen bir uygulamada, bu yontem sirasiyla bir veya daha fazla genin farkli transkripsiyon infidelitesi dizilimlerin için spesink olan bir nukleik asit seti kullanmaktadir. Bir transkripsiyon infidelitesi dizilimi için spesifik olan nukleik asit problari, bu uygulamada açiklanan dizilim bilgisi ve nukleotid ikame, yerlestirme veya silme kurallarini kullanarak, herhangi bir gen için hazirlanabilir (bakiniz ornek olarak Ornek 5).
Bu bulusun kapsami içerisinde bir nukleik asit “probu” bir transkripsiyon infidelite dizilimi veya bunun bir tamamlayicisi ile seçici hibridizasyon kabiliyetine sahip olan ve bahsedilen dizilim veya tamamlayiciyi içeren bir ornek içerisinde bunlarin varligini (veya miktarini) tespit etmeye uygun olan bir polinukleotid dizilimi içeren bir nukleik asit veya oligonukleotid anlamina gelmektedir. Problar tercihen bir transkripsiyon infidelite dizilimine tam olarak tamamlayicidir, ancak bazi yanlis eslesmelere tolere edilebilir. arasinda olan tek kollu nukleik asitleri içermektedir. Daha uzun problarin da kullanilabilecegi anlasilmalidir. Bu bulusa ait tercih edilen bir prob uzunlugu 8 ila 400 nukleotid arasinda olan ve bir transkripsiyon in'r`idelite dizilimine spesifik olarak hibritlesebilen tek kollu bir nukleik asit molekuludur.
Bu bulusun spesifik bir uygulamasi bir transkripsiyon infidelite dizilimi içermeyen bir nukleik asit molekulu bolgesine seçici olarak hibritlesen bir nukleik asit probudur.
Nukleik asit hibridizasyonunu belirtmek için kullanildiginda seçicilik, probun hedef dizilime hibridizasyonunun bahsedilen probun diger bir dizilime hibridizasyondan farkli oldugunu belirtmektedir. Bu baglamda, her ne kadar prob ile hedef dizilim arasinda mukemmel tamamlayicilik gerekli olmasa da, seçici hibridizasyona olanak vermek için yeterli miktarda yuksek olmalidir.
Bu bulusa ait tercih edilen problar, bir hucre yuzeyi proteinini veya salgilanmis bir proteini kodlayan bir RNA molekulu (veya karsilik gelen cDNA molekülu) içerisindeki bir transknpsiyon infidelite dizilimine tamamlayici (tümleyen) olan bir dizilimi içennektedir.
Bu bulusa ait spesifik prob ornekleri bir transkripsiyon infidelite dizilimini tamamlayan veya 1'den 32'ye kadar SEQ ID'lerinden herhangi birinin bir peptid dizilimini kodlayan bir dizilime sahiptir. Örnek olarak hibridlerin kararliligini arttirmak (ornek olarak 2'alkoksiribonükleotidler gibi modifiye edilmis nukleotidler veya gruplarinin araya ilave edilmesi) veya probun etiketlenmesi için problarin dizilimi ornek olarak kimyasal olarak modifiye edilebilir. Tipik etiket orneklerine, kisitlayici olmaksizin, radyoaktivite, floresans, Iuminosans, enzimatik etiketleme ve benzerleri dahildir. Prob hedef nukleik aside bir solusyon veya suspansiyon içerisinde hibritlestirilebilir veya kisitlama olmaksizin bir boncuk, kolon, plaka, substrat (nukleik asit dizileri veya parçalari uretmek için) vb. gibi kati bir destege bitistirilebilir.
(Hibridizasyon problari ile birIikte kullanilabilen) diger bir uygulamaya gore transkripsiyon infidelitesi spesifik primerler kullanilarak seçici amplinkasyon ile tespit edilmekte veya olçulmektedir. Transkripsiyon inûdelitesinin seçici amplifikasyon ile tespit edilmesi tipik olarak bir transkripsiyon infidelite dizilimini spesiûk olarak guçlendiren (amplifiye eden) bir nukleik asit primeri ile bir ornegin temas ettirilmesini ve olusan amplifikasyon urunlerinin varliginin (veya miktarinin) tespit edilmesini içermektedir, bahsedilen varlik veya miktar transkripsiyon infidelitesinin varliginin veya oraninin dogrudan bir gostergesidir. Tercih edilen bir uygulamada, bu yontem sirasiyla bir veya daha fazla farkli transkripsiyon infidelite diziliminin spesifik amplifikasyonuna olanak veren bir nukleik asit primeri setini kullanmaktadir. Amplifikasyon, kisitlayici olmaksizin, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), ligaz zincir reaksiyonu (LCR), transkripsiyon tarafindan aracilik edilen amplifikasyon (T MA), kol (sarmal) oteleme amplifikasyonu (SDA) ve nukleik asit dizilimi temelli amplifikasyon (NASBA) gibi bu teknik alanda bilinen çesitli tekniklere gore gerçeklestirilebilmektedir.
Bir transkripsiyon infidelite dizilimine spesifik olan nukleik asit primerleri, bu uygulamada açiklanan dizilim bilgileri ve nukleotid ikame, yerlestirme ve dilme kurallarini kullanarak, herhangi bir gen için hazirlanabilir (bakiniz ornek olarak Ornek veya bir transkripsiyon infidelite alaninin bitisiginde bulunan bir nukleik asit bolgesi ile seçici hibridizasyon kabiliyetine sahip olan ve bahsedilen dizilim veya tamamlayiciyi içeren bir ornekte bahsedilen transkripsiyon infidelite alaninin tamamini veya bir kismini amplifiye etmeye uygun olan bir polinukleotid dizilimi içeren bir nukleik asit veya oligonükleotidi ifade etmektedir. Bu bulusa ait tipik primerler uzunlugu 5 ila 60 nukleotid arasinda olan, daha tercih edilen haliyle uzunlugu 8 ila 50 nukleotid arasinda arasinda olan tek-kollu nukleik asit molekulleridir. Yuksek spesifitenin saglanmasi için mukemmel tamamlayicilik tercih edilmektedir. Ancak, belirli yanlis eslesmeler yukarida problar için açiklandigi gibi tolere edilebilmektedir. polimeraz aktiviteleri ile uyumlu bir mesafede, ornek olarak bahsedilen alandan 250 bp'yi asmayan bir mesafede yukarida konumlandirilmis olmasi gerektigini belirtmektedir.
Bu bulusun diger bir yönü de en az bir çift nükleik asit primeri içermektedir ve bahsedilen primer çifti bir algilama ve bir ters primer içermektedir ve bahsedilen algilama ve ters primerler bir transkripsiyon infidelite diziliminin veya tam olarak tamamlayici olan bir dizilimin seçici amplifikasyonuna olanak vermektedir. Bu bulusa ait spesifik primer örnekleri ornek olarak Sekil 12'de açiklanmaktadir.
Bulusun diger bir uygulamasina gore, transkripsiyon infidelitesi Denature Edici Yuksek Performansli Sivi Kromatografi (DHPLC) ile olçulmektedir. Bu yontemin prensibi ornek olarak Sekil 11'de açiklanmaktadir. Temel olarak, amplifikasyon urunleri denature edilmekte ve yemden tavlanmaktadir. Yeniden tavlama esnasinda transkripsiyon infidelite dizilimlerinin varliginin bir sonucu olarak hem homodubleksler hem de heterodubleksler olusmaktadir. Daha sonra bu karisim DHPLC ile analiz edilmektedir.
Heterodubleksler ve homodublekslerin DNA yapilari analiz sicakliginda farkli oldugundan, farkli sekilde ayristirilmakta ve (nispi) miktarlari tayin edilebilmektedir.
Transkripsiyon infidelite dizilimlerinin (sekanslarinin) kanser hücrelerinde normal hucrelerdekine gore daha buyük bir frekansta mevcut oldugunun dogrulanmasi için seçilen genlerin tahmin edilen transkripsiyon infideliteleri belirtilen oligonukleotidler (bakiniz Ornek 6) kullanilarak RT-PCR ile amplifiye edilmistir. Homo- ve hetero- dublekslerin varyasyonlari dogrulanmistir (Sekil 15).
Transkripsiyon infidelitesinin tespit edilmesi, nicel hale getirilmesi veya izlenmesi için bu bulus içerisinde kullanilmak uzere nukleik asitlerin tespit edilmesi için uygun olan herhangi bir diger teknik de kullanilabilir.
Transkripsiyon Infidelitesinin proteinler seviyesinde tespit edilmesi Transkripsiyon in'r`idelitesi protein diziliminde degisikliklere neden oldugundan transkripsiyon infidelitesinin varligi veya seviyesi de T1-proteinlerinin varligi veya miktari tespit edilerek dlçulebilir.
Proteinlerde transkripsiyon infîdelitesinin olçulmesi için bu teknik alanda bilinen çesitli teknikler kullanilabilmekte ve/veya adapte edilebilmektedir. Ozellikle, transkripsiyon infîdelitesi proteinlerde davranislarini dogrudan degistiren modif'ikasyonlara neden oldugundan, bu degisiklikler örnek olarak 2-boyutlu Jel elektroporozu ve kutle spektrometrisi ile veya yuzey gelistirilmis lazer salinim iyonizasyonu ile tespit edilebilmektedir. TI proteininin insan plazmasinda var oldugunun bir dogrulamasi olarak, ApoAll'nin kurallara uygun (kanonik) ST OP'un ardindan konumlandirilmis bir peptidin kutle spektrometn proûlini gostermekteyiz. Kutle spektrometri verilen argininin kurallara uygun STOP ile ikame edildigini gostermektedir. Ilaveten, transkripsiyon infîdelitesi daha uzun veya daha kisa (hucresel veya plazma) protein izoformlarinin olusmasina neden oldugundan (baz ikamesinden dolayi premature stop kodonunun veya silmeler veya yerlestirmeler durumunda açik okuma çerçevesinde bir yer degistirmeden dolayi), bu tur izoformlar bunlarin spesif'ik ligandlari ve/veya protein dizilim strateJileri kullanilarak tespit edilebilir veya nicel hale getirilebilir. Bu baglamda, protein uzunlugunda ve AA birincil dizilimindeki degisikliklerin baskin olarak proteinin karboksi-terminal alaninda meydana geldigini gostermekteyiz. Buna gore, dizilim (sekanslama) strateJileri, onceden suphelenilmeyen bir bolge olan, proteinlerin C-terminaline dogru yonlendirilmelidir (gerçekte, mevcut durumda kullanilan dogrudan protein dizilimi yontemleri sadece NH2 terminal AA'da baslayarak elde edilebilmektedir).
Spesifik ligandlar kullanilarak transkripsiyon infidelitesinin tespit edilmesi tipik olarak bir ornegin bir TI-proteininin bir alani için spesifik olan bir ligand ile temas ettirilmesini ve olusan kompleksin varliginin (veya miktarinin) tespit edilmesini içermektedir, bahsedilen varlik veya miktar transkripsiyon infidelitesinin varliginin veya oraninin dogrudan bir gostergesidir. Tercih edilen bir uygulamada, bu yontem sirasiyla bir veya daha fazla TI- proteinin farkli alanlari için spesifik olan bir ligand setini kullanmaktadir. Bu alanlar için spesifik olan ligandlar bu uygulamada açiklanan dizilim bilgileri ve amino asit ikame kurallari kullanilarak herhangi bir protein için hazirlanabilmektedir (bakiniz ornek olarak Ornek 5). Ligand çozunebilir formda kullanilabilir veya bir yuzey veya destek uzerine kaplanabilir.
Bu baglamda, bu bulus ayrica bir TI-proteininin bir alanina seçici olarak baglanan herhangi bir ligand ile de ilgilidir. Spesifîk antikorlar, sentetik molekuller, aptamerleri peptidler ve benzerleri gibi farkli tur ligandlar ele alinabilir.
Spesiûk bir uygulamada, ligand bir antikor veya bunun bir kismi veya turevidir. Buna gore bu bulusun belirli bir yonu bir TI-proteininin bir alanina spesifik olarak baglanan bir antikor ile ilgilidir.
Bu bulusun kapsami içerisinde bir antikor poliklonal bir antikoru, monoklonal bir antikoru ve bunlarin buyuk oranda ayni antiJen ozelliklerine sahip olan parçalarini veya turevlerini tanimlamaktadir. Parçalara ornek olarak Fab, Fab'2, CDR bolgeleri vb. dahildir. Turevlerine ise tek zincirli antikorlar, insanlastirilmis antikorlar, insan antikorlari, poIi-klonal antikorlar vb. dahildir.
TI-proteinlerinin alanlarina karsi antikorlar bu teknik alanda genellikle bilinen prosedurler ile uretilebilmektedir. Ornek olarak TI-proteinin alanini (ornek olarak bir peptid veya protein olarak) tek basina veya uygun bir proteinle birlestirerek insan olmayan bir hayvana enjekte ederek poliklonal antikorlar uretilebilir. Uygun bir periyodun ardindan, hayvan kanatilir, sera (serum) geri toplanir ve bu teknik alanda bilinen teknikler ile saflastirilir (Paul, W.E. "Fundamental Immunology" Second Ed. Raven Press, NY, sayfa 176,1989; Harlow ve digerleri "Antibodies: A laboratory Manual", CSH T1-proteinleri ile ayni dizilime sahip peptidler bu teknik alanda genel olarak bilinen prosedurler ile uretilebilmektedir. Bu tur peptidler uygun bir destek ile birlestirilebilmekte ve biyol03ik ornekler (ornek olarak vucut sivilari) içerisinde mevcut olan oto-antikorlarin tespit edilmesi için kullanilabilmektedir.
Ornek olarak immun bir B-lenfositin miyeloma hucrelerine fuzyonunu içeren Kah/er- M///ste/n (2) teknigi (Kohler-Millstein, Galfre, G. ve Milstein, C, Methods Enz. 73 sayfa 1 (1981)) ile TI-proteinlerinin alanlarina karsi monoklonal antikorlar hazirlanabilir. Ornek olarak, yukarida açiklandigi gibi bir immunOJen açiklandigi gibi insan olmayan bir memeliye enjekte edilebilir. Daha sonra, dalak disari çikartilir ve miyeloma ile fuzyon islemi çesitli yontemlere gore gerçeklestirilir. Sonuçta ortaya çikan hibridoma hucreleri daha sonra TI-proteinlerinin alanlarina karsi salgilanan antikorlar için test edilebilir.
TI-proteinlerinin belirli bir alani için “seçici” olan bir antikor bahsedilen alana (veya bunun bir epitop-içeren kismina) baglanmasi spesifik olmayan baglanmasindan (yani diger bir antiJene, ozellikle bahsedilen alani içermeyen dogal bir proteine baglanmasindan) guvenilir sekilde ayirt edilebilen bir antikoru tarif etmektedir. TI- proteinlerinin alanlari için seçici olan antikorlar bir ornek içerisinde bu tur alanlari içeren proteinlerin varliginin tespit edilmesine olanak vermektedir.
Teshis (Tanilama) Bu bulus bir ozneden alinan bir ornekteki bir hastaligin diger seyler yaninda varliginin, yoklugunun, yatkinliginin, riskinin veya siddetinin belirlenmesi için kullanilabilecek tespit veya tani testlerinin uygulanmasina da olanak vermektedir. “Teshis (tani)” teriminin farmakogenomik, prognostik (gelecege yonelik tahmin) ve benzeri yontemleri içerdigi ele alinmalidir.
Belirli bir yonu ile bu bulus biyol01ik bir ornek içerisinde, tercihen bir insan biyoloiik ornegi içerisinde in vitro veya ex i/ii/o olarak kanserlerin varliginin, yoklugunun, yatkinliginin, riskinin veya siddetinin tespit edilmesi için bir yontem ile ilgilidir ve bu yontem bahsedilen ornegim bir transkripsiyon infîdelite alanina spesifik olarak baglanan bir ligand ile temas ettirilmesini ve bir kompleksin olusumunun belirlenmesini içermektedir.
Bu bulusun spesifik bir amaci bir oznedeki kanserlerin varliginin, yoklugunun, yatkinligin, riskin veya siddetinin tespit edilmesi için bir yontem ile ilgilidir ve bu yontem ozneden alinan bir ornegin in vitro veya ex V/VO olarak kanser hucreleri tarafindan eksprese edilen bir transkripsiyon infidelite alanina spesifik olarak baglanan bir ligand ile temas ettirilmesini ve bir kompleksin olusumunun belirlenmesini içermektedir.
Bu bulusun diger bir uygulamasi bir oznenin bir kanser tedavisine tepkisinin veya tepki verme yeteneginin degerlendirilmesi için bir yonteme yoneliktir, bu yontem ozneden alinan bir ornek içerisindeki transkripsiyon infidelitesinin varliginin veya oraninin tedaviden once veya tedavi suresince farkli zamanlarda tespit edilmesini içermektedir.
Bu bulus ayrica bir kanser hastaliginin tedavisinin etkisinin belirlenmesi için bir yontem ile de ilgilidir, bu yontem (i) bahsedilen tedavi esnasinda veya sonrasinda ozneden bir doku ornegi saglanmasini, (ii) bahsedilen ornek içerisinde transkripsiyon infidelitesinin varliginin ve/veya oraninin tespit edilmesini ve (iii) bahsedilen transkripsiyon infîdelitesinin varliginin ve/veya oraninin bahsedilen ozneden tedavinin oncesinde veya erken bir asamasinda alinan bir referans ornegindeki transkripsiyon infidelitesi miktari ile karsilastirilmasini içermektedir.
Bir ornek içensindeki transkripsiyon infidelitesinin varligi (ve artisi) bir kanser hastaliginin varliginin, yatkinligin veya ilerleme seviyesinin bir gostergesidir. Bu nedenle bu bulus daha etkili ve duruma ozel uygun terapotik mudahalelerin dizaynina olanak saglamaktadir. Ayrica, semptomatik-oncesi seviyedeki bu teshis onleyici bir reJimin uygulanmasina da olanak vermektedir.
Bu bulusa ait tani yontemleri /n i/itro, ex VIVO veya in i//i/o, tercihen /n vitro veya ex i//i/o olarak gerçeklestirilebilir. Ornek bir ozneden elde edilen ve hangisi uygunsa nukleik asitler veya polipeptidler içeren herhangi bir biyoloiik ornek olabilir. Bu tur orneklere ornek olarak vucut sivilari, dokular, hucre ornekleri, organlar, biyopsiler vb. dahildir. En çok tercih ediIen ornekler kan, plazma, serum, salya, urin, seminal sivi ve benzerleridir.
Nukleik asitlerin veya polipeptidlerin test için mevcudiyetinin olusturulmasi veya gelistirilmesi için yontem uygulanmadan once ornek isleme tabi tutulabilir. Bu islemlere ornek olarak asagidakilerden bir veya daha fazlasi dahil olabilir: hucre kinmi (Iizis) (ornek olarak mekanik, fiziksel, kimyasal vb.), santrifugasyon, ekstraksiyon, kolon kromatografisi ve benzerleri.
Bu bulusa ait bir yontem insan ornekleri içerisinde transkripsiyon infidelitesi tarafindan uretilen ozgun peptidlere karsi yonlendirilmis olan ve antikor uretimine neden olan immun uyarim olusturan antikorlarin varliginin belirlenmesini içermektedir. Bu bulusa ait ikinci bir yontem transkripsiyon infidelite peptidlerine karsi yonlendirilmis immunoIOJik yapi tasiyan hucrelerin tespit edilmesine yoneliktir.
Ilaç Dizayni ve Terapi Yukarida belirtildigi uzere, bu bulus aday bir molekulun transkripsiyon infidelitesini module etme kabiliyetinin degerlendirilmesi ile ozgun iIaçlarin dizaynina (veya taranmasina) olanak vermektedir. bu tur yontemlere baglama testleri ve/veya fonksiyonel (aktivite) testleri dahildir ve hayvanlarda ve benzerlerinde in vitro (ornek olarak hucre sistemleri içerisinde veya hucresel olmayan deneylerde) gerçeklestirilebilir.
Bu bulusum spesifik bir amaci bIYOIOJIk olarak aktif bir bilesigin seçilmesi, karakterize edilmesi, taranmasi veya optimize edilmesi için bir yontem ile ilgilidir ve bu yontem bir test bilesiginin transkripsiyon infîdelitesini module edip etmediginin /n vitro olarak belirlenmesini içermektedir. Transkripsiyon infidelitesinin modulasyonu belirli bir gen veya proteine gore veya onceden belirlenmis bir gen veya protein setine gore veya Bu bulusun diger bir uygulamasi biyoIOJik olarak aktif bir bilesigin seçilmesi, karakterize edilmesi, taranmasi veya optimize edilmesi ile ilgilidir ve bahsedilen yontem bir test bilesiginin /n vitro olarak bir gen ile temas ettirilmesini ve bahsedilen test bilesiginin bahsedilen genden transkripsiyon infidelite alanlari içeren RNA molekullerinin uretimini module etme kabiliyetinin belirlenmesini içermektedir.
Bu bulusun diger bir uygulamasi bIyOIOJlk olarak aktif bir bilesigin seçilmesi, karakterize edilmesi, taranmasi ve/veya optimize edilmesi için bir yontem ile ilgilidir ve bahsedilen yontem bir test bilesiginin bir hucre ile temas ettirilmesini ve bahsedilen hucre içerisinde test bilesiginin transkripsiyon infidelitesini module edip etmediginin belirlenmesini içermektedir.
Yukaridaki tarama testleri plakalar, tupler, siseler vb. gibi herhangi bir uygun cihaz içerisinde gerçeklestirilebilir. Tipik olarak test çok-kuyucuklu mikro-titer plakalari uzerinde gerçeklestirilmektedir. Bu bulus kullanilarak, çesitli test bilesikleri paralel olarak test edilebilir. Ilaveten, test bilesigi çesitli oriJinli, tabiatta veya kompozisyonda olabilir. Izole olarak veya diger maddelerle karisim halinde, lipid, peptid, polipeptid, nukleik asit, kuçuk molekul gibi herhangi bir organik veya inorganik madde olabilir.
Bilesikler ornek olarak birlesik bir bilesik kutuphanesinin tamami veya bir kismi olabilir.
Transkripsiyon infidelitesini module eden bu bulusa ait bilesikler bir hucre içerisindeki transkripsiyon infldelitesinin azaltilmasi için terapotik fayda gibi pek çok faydaya sahiptirler. Bu tur bilesikler proliferatif hastaliklar (ornek olarak kanserler), immun hastaliklar, yaslanma, inflamatuvar rahatsizliklar vb. gibi anormal transkripsiyon infidelitesi ile ilisklli veya anormal transkripsiyon infidelitesi nedeniyle olusan hastaliklarin tedavi edilmesi (veya onlenmesi) için kullanilabilir.
Bu bulusa ait diger bilesikler transkripsiyon infidelitesini hedef alan bilesikler, yani seçici olarak transkripsiyon inf`idelite alanlarina baglanan bilesiklerdir. Bu tur bilesikler (ornek olarak antikorlar, RNAi vb.) tek baslarina veya bir etikete konJuge olarak tani reaktifleri olarak veya terapotik ajanlar olarak kullanilabilirler.
Transkripsiyon infidelitesini module eden veya hedefleyen bulusa ait bilesikler oral veya sistemik verme, intravenoz, intra-arteriyel, intra-serebral veya intraathekal enjeksiyonlarin dahil oldugu herhangi bir uygun yolla verilebilirler. DozaJ genis bir limit içerisinde degisiklik gosterebilir ve bu teknik alanda uzman kisilerce bilinen çesitli faktorlere bagli olarak kisisel gereksinimlere gore her bir spesifik durum için ayarlanmasi gerekecektir. Izotonik solusyon, tamponlanmis veya salin solusyonlar vb. gibi herhangi bir solusyon, suspansiyon, toz, Jel vb. gibi bu teknik alanda bilinen farmasotik olarak kabul edilebilir herhangi bir dozaj formu kullanilabilir. Bilesikler tek baslarina verilebilirler, ancak genellikle standart farmasotik uygulamaya gore (Remington'un Farmasotik Bilimleri, Mack Yayinlari'nda açiklandigi gibi) farmasotik bir tasiyici ile birlikte verilmektedirler. Antikorlar ise hali hazirda insan deneylerinde ve terapilerinde kullanilan ve bu teknik alanda bilinen yontemler ve protokollere gore verilebilir.
Transkripsiyon infidelitesinin normal hücre islevi üzerine etkisi Genel olarak çogu hucre fonksiyonundan proteinlerin sorumlu oldugu kabul edilmektedir. Ancak kodlama yapmayan RNA olarak bilinen RNA'nin da bu nedenle kendi baslarina fonksiyonel molekuller oldugu da açiktir. Onemleri daha onceden hafife alinan bu transkriptler pek çok organizma içerisinde mevcutturlar ve pek çok hucre fonksiyonunu duzenlemektedirler. Bunlarin arasinda rRNA, tRNA, tmRNA (trans-haberci RNA) bulunmaktadir, ancak RNA'nin transkripsiyonel-sonrasi modifikasyonlarina eklemede veya diger hucresel islevlerde mudahale eden kodlama yapmayan RNA (snoRNA, snRNA vb.) da bunlarin arasindadir. Hem RNA'nin hem de proteinin islevleri bu uygulamada açiklanan transkripsiyon infîdelitesinin eksikliginden etkilenebilir. DNA dizilimi çekirdek içensinde RNA polimeraz II olarak adlandirilan ve DNA molekulunun dizilimini algilayan ve ana DNA sablonuna tumleyici olan tek kollu bir nukleotid polimeri sentezleyen bir proteinin faaliyeti ile mRNA'ya donusturulmektedir (kopyalanmaktadir).
RNA bazinin verilen herhangi bir pozisyondaki duzeni ve tipi bir sablon olarak hizmet eden DNA kolu uzerinde mevcut olan bazin duzeni ve tipi tarafindan belirlenmektedir. mRNA'nin birinci bazina karsilik gelen, kopyalanan RNA'nin 5' ucu baslangiçtaki nukleotide ilistirilmis olan 7-metilguanilat'a baglidir ve bu sayede RNA'yi bozunmadan koruyan 5' CAP'i olusturmaktadir. Bu modifikasyon transkripsiyon (kopyalama) tamamlanmadan once olusmaktadir. Birinci transkriptin 3' ucundaki islem poli(A) polimerazi olarak adlandirilan bir enzim tarafindan bir adenin dizisi rezidusunun eklendigi bir serbest 3'-hidroksil grubu vermek uzere bir endonukleaz ile bolunmeyi içermektedir.
Sonuçta ortaya çikan poli(A) kuyrugu 100-250 arasinda nukleotid içermektedir. Islemin son adimi elementin intronik dizilimlerine karsilik gelen ana transkriptinden bolunmeyi ve ardindan ekzonlar ile ligasyonu içeren ekleme (splays) islemidir. Bu sureç bazilari RNA'ya baglanan çesitli proteinler ve ncRNA'lar tarafindan kontrol edilmektedir. Bu baglanma isleminin transkripsiyon inûdelitesinin eksikligi tarafindan etkilenebilen tek bir adim olmasi mumkundur. Aslinda, bu proteinlerin tümunun kendisi spesifik RNA tarafindan kodlanmaktadir; bu nedenle bu proteinlerin islevi potansiyel olarak transkripsiyon infidelitesinin eksikligi tarafindan etkilenmektedir. RNA olgunlasmasinin yuksek seviyede kompleks olan sureci donusumun olusmasi için çekirdekten disari ihraç edilecek olan mRNA'nin uretimine neden olmaktadir. Bu asamada, olgun mRNA uzerinde mevcut tum nukleotid uçlulerinin AA'ya donusturulmeyeceginin anlasilmasi onemlidir. Olgun haberci RNA'lar mRNA'nin genel stabilitesinin belirlenmesinde ve dönüsumde diger rollerde islevsel onem tasiyan 5' ve 3' donusturulmemis bolgeler olarak adlandirilan kodlama yapmayan bolgeler içermektedir. DNA içerisinde bulunan bilgilerin uygun protein AA dizilimine etkili olarak tasinmasi için transkripsiyonun mutlak sadakati (fidelitesi) gereklidir. Aslinda, transkripsiyon esnasinda veya olgunlastirma esnasinda meydana gelen herhangi bir hata muhtemelen mRNA stabilitesinde degisikliklerin olusmasina ve nihai olarak protein AA ana diziliminde bir varyasyona neden olacaktir. Protein dizilimindeki bu varyasyonlar transkripsiyonun baslangici, transkripsiyonun kendisi, RNA'nin 5' ile kapanmasi, 3' poliadenilasyon, RNA eklenmesi ve/veya RNA'nin ihraci ile iliskiIi protein diziliminin degistirilmesi ile transkripsiyon infidelitesi olgusunu daha kotu duruma getirebilir. Bu nedenle, bu bulusta transkripsiyon infidelitesinin kanser hucrelerinden izole edilmis çok sayida geni etkilediginin gosterilmesi bu olgunun kendi kendisini azdirmasi ve bu nedenle hastaligin siddetinin artmasi olasiligini açmaktadir.
Transkripsiyon infidelitesinin neden oldugu RNA dizilimlerindeki varyasyon hucre islevi uzerinde ani sonuçlara sahip olabilir. Aslinda, RNA ana transkripti içerisine DNA sablonununkilere tumleyen olmayan bazlarin sokulmasi sonuçta ortaya çikan protein AA ana dizilimi uzerinde potansiyel ani sonuçlara sahiptirler. Degisiklik kodonun ilk 2 bazini etkilediginde, AA dizilimi üzerinde tipik olarak dogrudan bir etki ortaya koymaktadir.
Kodonun uçuncu bazini etkileyen varyasyonlar protein AA dizilimi üzerinde daha az bir etkiye sahip olacaktir, çunku genetik kod dejenere edilmistir. Bu nedenle, kodonun uçuncu pozisyonunda konumlandirilmis olan bazdaki degisiklikler proteinin AA dizilimini dogrudan etkilemeyebilir. Asagida açiklanan verilere dayanarak, transkripsiyon infidelitesinin kodon uzerindeki pozisyonuna bagli olmaksizin tum bazlari etkileyen bir olgu olduguna ve bu nedenle protein AA ana dizilimini etkiledigine inanilmaktadir.
Protein içerisindeki degisiklikler tarafsiz olabilir veya protein islevinde bir modifikasyona (bir artis veya aktivite kaybi) neden olabilir. Transkripsiyon infidelitesi olgusu agirlikli olarak yetiskin mRNA'nin en azindan ilk 400-500 bazinin kodlanmasindan sonra gozlenen bir olgudur; mRNA'nin 5' ucu nispeten daha az etkilenmektedir. Kanser hastalarindan alinan kanser hucrelerinde ve plazma içerisinde daha kisa ve daha uzun protein parçalarinin mevcut olacagina inanilmaktadir. Bu daha kisa ve daha uzun izoformlar asagida açiklanan transkripsiyon infidelite kurallarindan dogrudan çikarilabilir.
Bu durum kanser veya immunoIOJik hastalik siddetinin spesifik isaretleyicilerinin belirlenmesi için rasyonel dizayn edilmis yontemlerin uretimine olanak vermektedir. Çogu genin transkripsiyon orani hucresel ihtiyaçlara uyum saglamak uzere kontrol edildiginden, transkripsiyon infidelitesinin dogrudan asiri veya eksik protein islevinden dolayi gen ekspresyonunda degisikliklere neden oldugu onerilmektedir. Bu nedenle, transkripsiyon infidelitesi olgusu hucre kapasitesi uzerinde gorevini yapabilmesi için temel bir etki ortaya koymaktadir. Bu nedenle tum kanser hucresi turlerinden izole edilen çogu genin ortak bir ozelligi olarak bu hasarin belirlenmesi, verilen herhangi bir hucre içerisinde transkripsiyon infidelitesi oraninin nicel olçumune olanak veren yeni yontemlerin aranmasi için bir mantik sunmaktadir. Bu tarama deneyi transkripsiyon inf`idelitesini kisitlayabilen ozgun ilaçlarin test edilmesine olanak vermekte ve bu sayede hastaligin ilerlemesini onlemekte ve normal hucre islevini geri getirmektedir.
Transkripsiyon inf'idelitesi ve Patoloji Bu bulus transkripsiyon infidelitesinin protein diziliminde onemli degisikliklere neden oldugunu gostermektedir. Verilen herhangi bir proteinin islevi dogrudan AA dizilimine bagli olan 3-D (3 boyutlu) yapisi tarafindan belirlenmektedir. Degisken bir AA, protein kesimi veya protein uzatimina sahip proteinler protein aktivitesinde koklu bir modifikasyon ile sonuçlanabilir veya etkisiz kalabilir. Normal homologlarinin fonksiyonunu buyuk oranda engelleyen modifîye ediImis protein ornekleri açiklanmistir.
Transkripsiyon infidelitesi çok sayida geni etkileyen ve bu nedenle çok sayida protein ortaya çikaran bir olgudur. Bu proteinlerden bazilari DNA yapisinin kararli halde tutulmasi ve DNA'nin onariminda rol aldigindan, bu proteinlerin arizali islemesi DNA onariminin bozulmasina ve hucrelerin herhangi bir hasarli DNA'yi basarili sekilde onarma kapasitesinin buyuk oranda dusmesine neden olabilir. Normal hucreleri içerisinde transkripsiyon fidelitesinin (sadakatinin), transkripsiyonu kontrol eden çesitli protein komplekslerinin faaliyetinden dolayi olmasi nedeni ile bu proteinlerdeki baslangiçtaki ufak degisikliklerin bu olguyu kademeli olarak arttirmasi oldukça mumkundur. Bu sonrasinda hucre farklilasma durumunu bastiracak ve hastaligin artan siddette formlanna neden olacak daha büyuk oranda transkripsiyon infidelitesi ile sonuçlanacaktir. Transkripsiyon infidelitesinin gerçekten kanser hucreleri içerisinde ortaya çiktiginin ve verilen herhangi bir gen tarafindan kodlanmis proteinlerde genis bir çesitlilige neden oldugunun gosterilmesi ozgun tani problarinin taranmasi ve ozgun terapotik hedeflerin dizayn edilmesi için ozgun bir alan açmistir.
Bu bulus DNA uzerinde mevcut bilgilerin çesitlendirilmesine katkida bulunan ve spesifîk kurallari takip eden ozgun bir olguyu açiklamaktadir. Bu rasgele olmayan transkripsiyon infidelitesi sureci kanser hucreleri içerisinde buyuk oranda siddetlenmektedir ancak ayrica ayni kurallari takip eden normal hucrelerde de gorulmektedir. Bu mekanizma mRNA içerisinde ozgun bazlar ortaya koymakta ve bu sayede ribozom seviyesinde donusturulecek mesajda koklu degisikliklere neden olmaktadir. Bu olgu buyuk ihtimalle oldukça geneldir, çunku test edilen çogu gen içerisinde mevcuttur. Transkripsiyon infidelitesinin ani sonucu tek bir genin suphelenilenden çok daha fazla protein uretebilmesidir. Bu nedenle bulusumuz genom uzerindeki kisitli sayidaki gen ile biyoloiik orneklerde mevcut olan çok sayida protein arasindaki nispi uyumsuzlugu kismen açiklama potansiyeline sahiptir. Transkripsiyon inndelitesinin rasgele olmayan bir sureç oldugunu ve bazilari burada açiklanmis olan spesifik kurallar tarafindan yonetildigini gosterdik. Bazilari biyoinformatik ve biyoIOJik yontemler kullanilarak surecin daha da karakterizasyonu ile açiga çikacaktir. Biz burada transkripsiyon infîdelitesinin kanser uzerindeki uygulamalarina odaklanmaktayiz. Ancak, surecin genel olduguna ve protein çesitliligi olusumuna katki saglayabilecegine inanmaktayiz. Proteinlerin bu çesitlenmesi spesifik bir protein paterninin taninmasi için bagisiklik sisteminin kapasitesi uzerinde belirgin bir etki ortaya koyabilir. Bu baglamda, transkripsiyon infîdelitesinin immun rahatsizliklarin patOJenezinde bir rol oynadigina inanilmaktadir. Burada transkripsiyon infidelite olaylarinin tek bazin ikamesine neden oldugu dusun'ulmektedir.
Biz tek baz ikameleri uzerine odaklandik, çunku bu mekanizmanin mRNA yapisinda buyuk bir kararsizliga (destabilizasyona) neden olma olasiligi dusuktur. Bu nedenle, tek bazli ikameler donusume mudahale etmemelidir, ancak gerçekten ozgun bir mesaj olarak taninmalidir. Transkripsiyon infidelitesinin ayrica baz silinmesine ve/veya yerlestirilmesine neden olmasinin da beklendigini gorecegiz. Yukarida açiklanan ayni yontem transkripsiyon inndelitesinin alternatif mekanizmalarini tespit edecektir.
Bu uygulamada açiklanan ozgun sureç çesitli ani pratik uygulamalara sahiptir.
Hastaliga spesifik özgün biyo-isaretleyicilerin optimizasyonu ve spesifik hastalik proteinlerine yönelik hedeflenecek özgün antikorlarin dizayni.
Bu uygulamanin ogretileri dogrultusunda, herhangi bir protein diziliminde transkripsiyon infidelitesinin bir sonucu olarak meydana gelebilen degisikliklerin tahmin edilmesi ve bu nedenle asikar molekuler kutleler ve izoelektrik noktalar gibi ûziko-kimyasal ozelliklerdeki degisikliklerin tahmin edilmesi artik mumkundur. Bu 2-D Jellerde ve kutle spektrometrisinde modifiye edilmis protein paternleri verebilir. Transkripsiyon infîdelitesi çogu geni etkiledigi için kisitli bir protein seti uzerine odaklanmak ve hastaliga (ornek olarak kanser) ozel biyo-isaretleyicilerin tanimlanmasi için degisikliklerinin karakterize edilmesi artik mumkundur. Alternatif olarak TI-proteinleri alanlarina yonelik, yani modifiye edilmis AA ve transkripsiyon infidelitesi tarafindan olusturulan dogal proteini uzatan ilave yeni AA içeren protein alanlarina yonelik spesifik antikorlarin dizayn edilmesi mumkundur. Bu alanlara yonlendirilmis antikorlar protein varyantina ozel olacak ve bu nedenle vucut sivisi içerisinde, hucre yuzeyinde veya kanser hucreleri içerisinde mevcut hastaliga (ornek olarak kanser) ozel proteinlere dogru hedeflenmis olacaktir. Bu antikorlar vucut sivilari içerisindeki patoloyk bir durumun protein karakteristiklerinin belirlenmesi için, plazma içerisinde dolasan hastalikli hucrelerin belirlenmesi için, histoloyk ornekler içerisindeki hastalikli hucrelerin belirlenmesi için, hastalik siddetinin belirlenmesi için ve ayrica spesifik hastalik hucrelerine yonelik ilaçlarin hedeflenmesi için kullanilacaktir. Bu ornek olarak adenovirusler, Iipozomlar vb. gen terapi vektorleri araciligi ile transkripsiyon infidelitesine meyilli dizilimlerin gen transferi ile basarilabilir. Alternatif olarak TI'dan kaynaklanan bir alan ile ayni dizilime sahip olan spesink peptidler dizayn edilmistir.
Bunlar ornek olarak vucut sivilari içerisinde mevcut olan T1-proteinlerinin alanlarina dogru yonlendirilmis spesifik ve dogal oto-antikorlarin belirlenmesi için kullanilabilir.
Transkripsiyon infidelitesi rasgele olmayan bir sekilde meydana gelmekte ve test edilen genlerin buyuk bir kisminda mRNA stop kodonlarini siklikla etkilemektedir. Ilaveten, verilen herhangi bir mRNA populasyonunun %6'ya kadarinin bu ilave dizilimleri içerdigi tahmin edilebildiginden, verilen bir kanser hucresi içerisinde karboksi-terminal ucunda ozgun bir dizilim ortaya koyan spesifik bir protein populasyonu belirlenebilir. Bu nedenle bu dizilimlerin hedeflenmesi olasi degildir, çunku DNA'yi etkileyen nadir genetik hastaliklar haricinde kanonik stop kodonlarini hemen takip eden dizilimlerin çerçeve-içi okunmasini saglayabilen hiçbir sureç rapor edilmemistir. Bu gizli dizilimlerin varligindan daha once suphelenilmemistir. Kanonik stop kodonlari uzerinde olusan tek bazli ikamelere neden olan transkripsiyon infidelitesinin kesfi, bu tur kodlama dizilimlerinin varligini ortaya koymakta ve ilaveten bu hucreler içerisindeki gelismis transkripsiyon infîdelitesi nedeniyle kanser hucreleri içerisinde artmis varliklarini gostermektedir. Bu nedenle ozgun kansere-ozel ilaçlarin dizayn edilmesi için normalde gizli olan bu dizilimlerin belirlenmesi ve hedeflenmesi mumkundur.
Kodlama dizilimi uzerinde olusan tek bazli silme ve yerlestirme ile ilgili TI kodlama çerçevesinde bir degis tokusa neden olmaktadir. Bir konverjans (yakinsama) olarak, karsilik gelen protein içerisindeki dizilimler modifiye edilmektedir (AA dizilimi ve protein uzunlugunda degisiklik). Bu nedenle verilen bir kanser hucresi içerisinde ozgun bir dizilim ortaya koyan spesifik bir protein populasyonu tespit edilebilir. Bu sekilde ozgun kansere ozel ilaçlarin dizayn edilmesi için bu normalde sakli olan dizilimlerin tanimlanmasi ve hedeflenmesi mumkundur.
Ozgun veya modifiye edilmis protein dizilimlerinin varligi nedeniyle ve bu degisikliklerin hucre yuzeyindeki protein uzerinde mevcut oldugu ele alindiginda, hastaliga ozel dizilimlere karsi asilama için bu dizilimlerin kullanilmasi onerilmektedir. Bu asilar verilen herhangi bir hastalik (ornek olarak kanser) formu ile tanilanan hastalarda immun tepkilerin tetiklenmesi veya genetik yatkinlik nedeniyle veya çevresel bir toksin veya riske artan maruz kalma nedeniyle spesifik hastaliklarin (ornek olarak kanser) artan gelisme riskine sahip hastalarda onleyici immun tepkilerin baslatilmasi için kullanilacaktir.
Bu bulusun spesifik bir amaci bu nedenle bir oznede bir kanserin varliginin veya asamasinin belirlenmesi için bir yontem ile ilgilidir ve bu yontem bahsedilen ozneden alinan bir ornek içerisinde transkripsiyon infidelitesinin varliginin veya oraninin (in i//tro veya ex V/VO) test edilmesini içermektedir, bahsedilen varlik veya oran bahsedilen oznede bir hastaligin varliginin veya asamasinin bir gostergesidir. Ornek nukleik asitler ve/veya proteinler içeren herhangi bir doku, hucre, sivi, biyopsi vb. olabilir. Ornek reaksiyon oncesinde seyreltme, konsantrasyon, lisiz vb. ile islenebilir. Yontem tipik olarak plazma proteinleri, hucre yuzey proteinleri vb. gibi birkaç adet farkli genin veya proteinin transkripsiyon inûdelitesinin test edilmesini içermektedir.
Bu bulusun diger bir amaci bir insan veya hayvanin tedavisi, ozellikle kanserlerin tedavisi için bir yontemde kullanmak için farmasotik bir kompozisyonun uretiminde bir memeli geninin transkripsiyon infidelitesi oranini degistiren (ornek olarak arttiran veya azaltan) bir bilesigin kullanimi ile ilgilidir.
Bu bulusun diger bir amaci bir ilaç veya aday ilacin etkisinin test edilmesi için bir yontem ile ilgilidir, bu yontem bahsedilen ilacin bir memeli geninin transkripsiyon infidelite oranini degistirip degistirmediginin test edilmesi adimini içermektedir ve bu tur bir degisiklik ilacin etkisinin bir gostergesidir.
Bu bulus ilaveten bir ornek içerisindeki transkripsiyon infidelitesinin tespit edilmesi veya (seviyesinin) olçulmesi için yöntemler ve urunler (problar, primerler, antikorlar veya bunlarin turevleri gibi) ile ve bunlara karsilik gelen kitler ile de ilgilidir.
Bu bulus ayrica kanser biyo-isaretleylcilerinin tanimlanmasi için bir yontem ile de ilgilidir ve bu yontem bir ozneden alinan bir ornek içerisindeki bir hedef protein, RNA veya gen içerisindeki transkripsiyon infidelite alan(lar)inin varliginin belirlenmesini ve tercihe bagli olarak bahsedilen transkripsiyon infidelite alan(lar)inin diziliminin belirlenmesini içermektedir. Spesifik ve tercih edilen bir uygulamada, hedef protein bir hucre yuzey proteini veya salgilanmis bir proteindir, ozellikle bir hucre yuzey proteini veya bir plazma proteinidir.
Bu bulusun diger bir açiklamasi bir ozellik veya patoloiik bir duruma özel ligandlarin uretilmesi veya tanimlanmasi için bir yontem ile ilgilidir ve bu yontem bahsedilen ozellik veya patoloiik duruma sahip bir ozneden alinan bir ornek içensinde bir veya daha fazla hedef protein, RNA veya gen içerisindeki transkripsiyon infidelite alan(lar)inin varliginin belirlenmesini, tercihe bagli olarak bahsedilen transkripsiyon infidelite alan(lar)inin diziliminin belirlenmesini ve bahsedilen transkripsiyon infidelite alan(lar)ina spesifik olarak baglanan ligand(lar)in uretilmesini içermektedir.
Bu bulusun diger bir açiklamasi bir proteinin, ozellikle bir memeli proteininin, daha tercih edilen haliyle bir insan proteininin bir transkripsiyon infidelite alanini içeren (sentetik) bir peptid ile ilgilidir. Bu peptid tipik olarak bir proteinin dahili bir kismini veya bahsedilen proteinin bir C-terminal kisminin dizilimini içermektedir. Bu peptid tercihen içermektedir. Protein bir hucre yuzey proteini (ornek olarak bir reseptor vb.), salgilanmis bir protein (ornek olarak bir plazma proteini) veya bir hucre içi protein olabilir. Bu tur plazma proteini ornekleri ornek olarak Sekil 13'te sunulmustur ve bunlara apolipoproteinler (ornek olarak AI, All, C1, C1 I, CI 11, D,E), tumleyici bilesenler (ornek olarak Cls, C3, C7), C-reaktif protein, serpin peptidaz inhibitorler, fîbnnOJen (ornek olarak FGA1, FGA2), plazminOJen, transferin, transhiretin vb. dahildir. Hucre yuzeyi reseptor orneklerine ornek olarak sitokin reseptorlen ve hormon reseptorleri vb. dahildir. Spesiük bir uygulamada, bu bulus yukarida listelendigi uzere bol miktarda mevcut olan bir insan plazma proteininin veya hucre yuzey reseptorunun bir transkripsiyon infîdelite alanini içeren sentetik bir peptid ile ilgilidir.
Bu tur peptidlerin spesifik ornekleri Sekiller 10, 14 ve 18'de açiklanmaktadir. Daha spesifik olarak, bu bulusa ait sentetik peptid ornekleri asagidaki amino asit dizilimlerinin (sekanslarinin) tamamini veya bir kismini içermektedir: QMWQLFWIYHLSS (TPTI) (SEO ID NO: IJKLHTLSAAIYYQQE (VIM) ( DFLSNK (KPSS) (SEO ID NO: 3)MYTVEFSVHKNN (RPLîAl (SEO ID NO: 4)NGSLGDMSDLCT (npsqx) ISEQ ID NO: SJASG (FTHI) (SEO ID NO: 6) EPSEPSDF (FTL) (SEQ ID NO: 7) APSIFPTLPAKPGTKQPRSPVTALSLHMLLMVSSAPSCGLIQTVSSETVYIFTL (TPII) (SEO ID NO: 8)ARHGRDEEVWHRKHSEHFVQAWAWVGGLVCWPRKCHMRSTLISSLDSLLPVIPHRTEAEWVV VMFDRRH (AHSG) [SEQ ID No: 9) RSKAXSSVFLFRWCKANTLSKKHKFL (ALB) (SEO ID NO: 10› GLDSTRALENEMTV (APCS) (SEO ID NO: 11) GARRRPPSRCSE (APOAI) (SEO ID NO: 12) SVQTIVFQPQLASRTPTGQS (APOA2) (SEO ID NO: 13) (59002) (SEQ ID NO: 15! DPPSVDKGRVPYSPD (APOCII) [SEO ID NO: 16! DLNTPSPPAYPSCELLGSCNLQGCPCRLLKRDSILSALLPHLMPGPPPGMLASQ (APOC3) {SEQ ID NO: 17) PGSTGRLHPLHVTSASLSPTPPPPHKDKPINHDKGS (APOD) (SEQ ID NO: EARVGGNVGSQTQ (AZGPI) (SEO ID NO: (SEO ID NO: 211 DVDVÂFAPTGASESSSPQDELQPPRESSARHQVTRPQPPGPQLRPASPRSGSCTLTLDSAAHGK NVIPLKRKMNNTLN (HRG) [SEO ID NO: 23) TPAARLMWSSNMPYFAQKTAKDMTSSWLQPRFIFLFVVN (IGFBP3I (SEO ID NO: 24) GWGVFLLNPMAGGHAPTIISWEERQSWEIDGSHSSLLSLLCLWÄTLPTPLLSQ (INHAI (SEO ID NO: 25) TGPTHHSPSPSISTWCLVPVHSVNKKP (KLKII) (SEO ID NO: 26) WTPEPLLOPLSHPLPPAHPLGQQRL (PKM2) (SEO ID NO: 27) LDGRQSDRLTHLEAGTWVGI (PLC) iSEQ ID NO: 23) SLPSSSGALSKELGManCLGLWâQPGPCAPSGHGMCGPVCLSLEGDSDSLCSSHMHRGPWTLQ SGGSWAS (SERPINA3) (SEO ID NO: 29) NLRGRAATKVKMGTQMIHBFALVSLAQVVCBNHVCLHSSVLPCVLNKK (TF) (SEO ID GPAPPRPAPRGPÄPPRPÄPAALPMGHVEKDTRAPSPPGBPLKMBRGLRISVSLGBCLGSPSLTF PHSHSLSLPLCLLLPVCTIPLPGIKAQGTSGEHYCS (TGFBI) (SEO ID NO: 31) GTSPPVDLKDEGWDFM (TTR) (SEO ID NO: 32) Bu bulusun diger bir açiklamasi yukarida tanimlandigi gibi bir immunOJen olarak bir transkripsiyon infidelite alanini içeren bir peptidin kullanimi ile ilgilidir. Bu bulus ayrica yukarida tanimlandigi gibi bir transkripsiyon infidelite alanini içeren bir peptidi ve tercihe bagli olarak uygun bir tasiyici, eksipiyan ve/veya adJuvan içeren bir asiyi da açiklamaktadir.
Bu bulus ayrica bir destek uzerinde hareketsiz hale getirilmis olan ve spesifik olarak bir transkripsiyon infidelite alanina baglanan bir reaktif içeren bir cihaz veya urunu de açiklamaktadir. Reaktif ornek olarak bir prob veya bir antikor veya bunlarin turevi olabilir.
Bu bulus ornek olarak proliferatif bozukluklar (ornek olarak kanserler), immun hastaliklar (ornek olarak oto-immun hastaliklar (çoklu skleroz, ALS), graft reddi), yaslanma, inflamatuvar hastaliklar, diyabetler ve benzeri gibi transkripsiyon infidelitesi oraninin artmasi veya azalmasi ile iIiskili çesitli patoloiik durumlarin tespit edilmesi, izIenmesi veya tedavi edilmesi için ve/veya terapotik olarak aktif ilaçlarin uretilmesi, dizayn edilmesi veya taranmasi için herhangi bir memeli ozne uzerinde, ozellikle herhangi bir insan ozne uzerinde kullanilabilir. Bu bulus ayrica prokaryotik hucreler, alt okaryotik hucreler (ornek olarak maya), bocek hucreleri, bitki hücreleri, mantar vb. gibi herhangi bir diger hucre turunde transkripsiyon infidelitesinin tespit edilmesi, izlenmesi, module edilmesi veya hedeflenmesi için de kullanilabilir.
Transkripsiyon inüdelite alanlarini hedefleyen ajanlarin üretimi ve kullanilmasi Bu bulusun ogretilerini kullanarak, ornek olarak bir transkripsiyon infidelite alani içeren proteinlere veya nukleik asitlere veya bu tur protein veya nukleik asitleri içeren veya eksprese eden hucrelere veya dokulara baglanan transkripsiyon infidelite alanlarini hedef alabilen aJanlarin uretilmesi mumkündur. Hedefleme ajani yukarida açiklandigi gibi bir antikor (veya bir turevi), bir prob, bir primer, bir aptamer vb. olabilir.
Bu tur hedefleme ajanlari ornek olarak bir ornek, doku, ozne vb. içerisindeki transkripsiyon infidelitesinin tespit edilmesi, izlenmesi ve benzerleri için tanilama ajanlari olarak kullanilabilir. Bu amaçla, ajan bir radyo-etiket, bir enzim, bir floresan etiket, isildayan (luminesan) bir boya vb. bir etiketleme kismi ile bagli olabilir.
Hedefleme aJanIari ayrica ornek olarak anormal transkripsiyon infidelitesi ortaya koyan bir hucre veya doku veya organizmanin tedavi edilmesi için terapotik bir molekül olarak da kullanilabilir. AJan bu sekilde veya tercihen toksik bir molekul, bir ilaç vb. gibi aktif bir molekul ile baglanmis olarak kullanilabilir.
Bu bulusun spesifik bir uygulamasi bu nedenle transkripsiyon infîdelitesini hedefleyen bir ajanin bir uretim yontemini açiklamaktadir ve bu yontem (i) bir protein veya nukleik asidin bir transkripsiyon infidelite alaninin tanimlanmasini ve (ii) bahsedilen alana seçici olarak baglanan bir aJanin uretilmesini içermektedir. Transkripsiyon infidelite alani ornek olarak verilen bir RNA molekulu için mevcut dizilimler hizalanarak ve ozellikle 3' ucundaki dizilim varyasyonlari belirlenerek tanimlanabilir. Transkripsiyon infidelite alanlari ayrica herhangi bir gen dizilimine bu uygulamada açiklandigi gibi (bakiniz ornek olarak Ornek 5) transkripsiyon infidelitesi kurallari veya ileride açiklanacak yeni kurallar uygulanarak da tanimlanabilir. Bahsedilen tanimlanmis alani içeren peptid veya nukleik asit molekulu daha sonra konvansiyonel yontemler kullanilarak uretilebilir. Tercih edilen bir uygulamada yontemin (i) adimi bir salgilanmis veya hucre yuzey proteininin (ornek olarak bir reseptor vb.) veya bir nukleik asidin bir transkripsiyon infîdelite alninin tanimlanmasini içermektedir.
Aslinda, bir hucreye temas ettirilmis veya bir ozneye verilmis bir hedefleme aJani kullanilarak salgilanan proteinler veya hucre yuzey proteinleri kolaylikla hedeflenebilir. Bu tur TI-proteinlerinin alanlarinin ornekleri orneklerde açiklanmaktadir.
Bir TI-proteininin alanina karsi bir immün tepkiye neden olan veya uyaran veya engelleyen bir asinin üretilmesi ve kullanilmasi Bu bulusun ogretisi kullanilarak, TI-proteinlerine karsi veya bu tur TI-proteinlerini veya karsilik gelen nukleik asitleri içeren veya eksprese eden hucreler veya dokulara karsi bir immun tepkiye neden olan veya engelleyen bir asi bilesiminin uretilmesi mumkundur.
Tipik olarak asi kompozisyonu bir immunOJen olarak bir transkripsiyon inf`idelite alaninin diziIimini içeren bir molekul içermektedir. Asi kompozisyonu herhangi bir farmasotik olarak kabul edilebilir tasiyici, eksipiyan veya adJuvan içerebilir. Asi kompozisyonu, TI- proteinleri eksprese eden hastalikli bir hucre veya dokuya karsi, bahsedilen hucre veya dokunun bagisiklik sistemi tarafindan yok edilmesi ile sonuçlanan bir immun tepki uretilmesinde kullanilabilir. Alternatif olarak, asi kompozisyonu oto-immün rahatsizliklarda mevcut olan transkripsiyon infidelite alanlarina karsi bir tolerans olusturulmasi için kullanilabilir.
Bu bulusun spesifik bir uygulamasi bu nedenle TI-proteinlerinin bir alanina karsi bir immun tepkiye neden olan, uyaran veya engelleyen bir immunoienin bir uretim yontemini açiklamaktadir ve bu yontem (i) bir protein veya nukleik asidin bir transkripsiyon infidelite alaninin tanimlanmasini ve (ii) bu tur bir alani veya bir varyantini içeren bir peptidin uretilmesini içermektedir. Transkripsiyon infidelite alani ornek olarak verilen bir RNA molekulu için mevcut diziIimler hizalanarak ve ozellikle 3' ucundaki dizilim varyasyonlari belirlenerek tanimlanabilir. Transkripsiyon infidelite alanlari ayrica herhangi bir gen dizilimine bu uygulamada açiklandigi gibi (bakiniz ornek olarak Ornek 5) transkripsiyon infidelitesi kurallari veya ileride açiklanacak yeni kurallar uygulanarak da tanimlanabilir.
Bahsedilen tanimlanmis alani içeren peptid molekulu daha sonra konvansiyonel yontemler kullanilarak uretilebilir. Tercih edilen bir uygulamada yontemin (i) adimi bir salgilanmis veya hucre yuzey proteininin (ornek olarak bir reseptor vb.) veya bir nukleik asidin bir transkripsiyon infidelite alninin tanimlanmasini içermektedir. Aslinda, salgilanmis proteinler ve hucre yuzey proteinleri bagisiklik sistemi tarafindan bir tepkiye daha fazla maruzdurlar.
Bu tur TI-proteinlerinin alanlarinin ornekleri omeklerde açiklanmaktadir.
Rekombinant Protein Üretim Sistemlerinde Transkripsiyon Infidelitesinin Azaltilmasi Bu bulusun spesifik bir açiklamasi rekombinant uretim sistemlerinde, ozellikle terapotik protein uretim sistemlerinde meydana gelebilecek transkripsiyon infidelitesinin onlenmesi veya azaltilmasi için bir yontem ile ilgilidir. Aslinda, bu tur bir transkripsiyon infidelitesi sistemin uretim miktarini dusurebilir veya çesitli faaliyet profilleri ortaya koyabilen karakterize edilmemis proteinler uzerinde karisimlarin uretimi ile sonuçlanabilir. Bu nedenle bakteriyel uretim sistemleri (eger transkripsiyon infidelitesi kurallari prokaryotik sistemler için ayni ise), okaryotik uretim sistemleri (ornek olarak mayalar, memeli hucreleri vb.) gibi rekombinant uretim sistemlerinde transkripsiyon infidelitesinin olusumunun veya oraninin azaltilabilmesi tavsiye edilmektedir ve yuksek degerdedir. Bu tur bir azaltma islemi ornek olarak kodlama yapan nukleik asit molekulunun dizilimi uyarlanarak ve/veya transkripsiyon infidelitesi yolu ile uretilen RNA molekulleri engellenerek basarilabilir. Alternatif olarak, transkripsiyon inndelite alanlari içeren proteinler ortamda uzaklaStirilabilir.
Bir gen için Transkripsiyon Infîdelitesine hassasiyetin azaltilmasi Bu bulusun spesifik bir açiklamasi bir gen içerisinde olusabilecek TI'nin onlenmesi veya azaltilmasi için bir yontem ile ilgilidir. Aslinda, bu tur TI bir proteinin ekspresyonunu veya aktivitesini etkileyebilir veya çesitli faaliyet profilleri ortaya koyabilen karakterize edilmemis proteinlerin karisimlarinin uretilmesi ile sonuçlanabilir. Bu nedenle, bahsedilen gen için TI'nin ortaya çikisinin veya oraninin azaltilabilmesi tavsiye edilmektedir ve yüksek degerdedir. Bu tur bir azaltma islemi ornek olarak genin dizilimi modifiye edilerek (gen terapisi) ve/veya transkripsiyon infidelitesi tarafindan olusturulan RNA molekulleri engellenerek gerçeklestirilebilir. Alternatif olarak, TI alanlarini içeren proteinler spesifik olarak bozunabilirler (ornek olarak bozunma için ozellikle hedefleme).
RNA seviyesinde transkripsiyon infidelitesinin ölçülmesi.
Transkriptomik en yaygini kanser olan çesitli patoIOJik durumlarda olusan RNA (tercihen mRNA) seviyelerindeki degisimleri olçen bilimdir. Transkriptomik onceden tanimlanmis bir alt kumesini tanimlayan spesifik bir oligonukleotid seti ile cDNA'nin hibridizasyonuna dayanmaktadir. Hibridizasyon verimliligi cDNA' a ters kopyalanacak olan herhangi bir RNA'nin spesifik dizilimlerine baglidir. Verilen bir RNA içerisindeki suphelenilmeyen dizilim varyasyonlarinin olusmasi hibridizasyonun verimini dusurecek ve bu nedenle transkriptomik çipler tarafindan alinan sinyallerde degisiklige neden olacaktir.
Transkripsiyon infidelitesinin RNA baz diziliminde degisiklige neden oldugunun kesfi iki birincil sonuca sahiptir: birincisi, transkripsiyon infidelitesinden dolayi baz yanlis eslesmesi sonucu minimize etmek için transkriptomik çiplerin optimizasyonuna olanak verir ve bu sekilde transkriptomik deneyin hassasiyetini arttirir. Aslinda, transkriptomik deneylerin mevcut kisitlamasi çalismalar arasinda yeniden uretilebilirligin olmamasidir.
Bahsedilen varyasyonun buyuk kisminin transkripsiyon infidelitesinden kaynaklandigina inanmaktayiz. Yukarida açiklandigi uzere transkripsiyon infidelitesinin kurallarinin anlasilmasi, normal veya hastalikli hucrelerden elde edilen herhangi bir cDNA karisimi içerisindeki transkripsiyon inf`idelitesi oranini spesifîk olarak olçen mikro-dizi çiplerin dizaynina artik olanak vermektedir. RNA seviyesinde transkripsiyon infidelite oraninin takip edilmesi verilen herhangi bir hucre içerisinde olusan transkripsiyon infidelitesinin nispi oraninin yuksek verimli taranmasina olanak vermektedir. Bu hastaligin siddetinin belirlenmesi, terapotik strateJiIerin tanimlanmasi ve farmakoIOJik duyarlilasma (sensitizasyon) profillerine gore hastalikli hucrelerin siniflandirilmasi için temel bilgileri saglamaktadir. Ayni tarama ornek olarak kanser terapisinde ozgun ilaçlarin etkisinin test edilmesine de olanak vermektedir.
Transkripsiyon infidelitesinin diger uygulamalari Transkripsiyon infidelitesi saglam kurulmus genetik koda çesitlilik ekleyen yeni kesfedilmis dogal bir mekanizmadir. Transkripsiyon infidelitesinin dusuk oranlarda da olsa normal dokularda bile olustugu gozlemlenmistir. Transkripsiyon infidelitesinin genom içerisinde tanimlanan genlerin nispeten dusuk miktarinin açiklanmasina ve biyoIOJik sivilar ile dokularin canli hucreleri içerisinde mevcut olan proteinlerin çok daha fazla olan çesitliliginin açiklanmasina katkida bulundugunu onermekteyiz.
Transkripsiyon infidelitesinin immunoloJik seviyede spesifik bir isleve sahip oldugunu onermekteyiz. Ayrica bagisiklik sisteminin en azindan kismen kendini tanimlamak için tercihen spesifik genleri etkileyen, verilen bir orandaki transkripsiyon infidelitesi oranina dayandigini da onermekteyiz. Bu nedenle, henuz bilinmeyen nedenlerle ortaya çikan transkripsiyon inûdelitesi oranindaki anormallikler belirli immun tepkileri tetiklemeye katkida bulunuyor olabilir ve oto-immun ve alerJik hastaliklarin patojenezine katkida bulunuyor olabilir. Transkripsiyon infidelitesindelq bireysel-arasi farkliliklar da bagisiklik sisteminin genlerinin polimorhzmi tarafindan kosullandiriliyor, bu nedenle bagisiklik sisteminin dolasan hucrelerinde ortaya çikan transkripsiyon infîdelitesi oranini belirliyor olabilir, ornek olarak T veya B lenfositleri, ve ayrica graftlarin donor ve alicilarinin uygunlugunun degerlendirilmesine ve hastaliklarin konakçi siddetine karsi graft siddetinin belirlenmesine katkida bulunuyor olabilir.
Ayrica transkripsiyon infidelitesinin normal yaslanma sureci içerisinde daha buyuk bir oranda meydana geldigini varsaymaktayiz. Bu durum genel olarak tum enzimleri ve en spesifik olarak hucre replikasyonu, DNA onarimi ve normal transkripsiyon infldelitesi oraninin surdurulmesinde gorevi bulunan proteinleri etkileyen, performansta zamanla dusus durumlari yaratacaktir. Yukarida açiklanan konsept bu nedenle arastirmayi yaslanma mekanizmalarina dogru yeniden yonlendirebilir. Bu nedenle mRNA ve cDNA dizilimleri için taramaya izin veren biyokimyasal, proteomik, transkriptomik ve diger yontemler ve DNA tarafindan belirlenen fidelite verilen bir sahista olusan transkripsiyon infidelitesi oraninin nicel hale getirilmesi için kullanilabilir. Transkripsiyon infidelitesi oranini dusuren ozgun molekullerin test edilmesi bu nedenle biyol01ik taramadan etkilenecek ve yaslanma oranini dusuren ilaçlarin gelistirilmesine neden olacaktir.
Bu bulusun diger yonleri ve avantajlari bulusu orneklerle gosteren ve bu uygulamanin kapsamini kisitlamayan asagidaki deneysel bolumde açiklanacaktir.
Deneysel Bolum Örnek 1. Tipik cDNA kütüphanesi olusturma ve dizilim prensibi (bakiniz Sekil Tumleyici bir DNA (cDNA) kutuphanesi hazirlamanin birinci adimi olgunlasmis mRNA'nin ilgili hucre veya dokudan izole edilmesidir. Poli(A) kuyruklarindan dolayi, bir matrise kovalent olarak baglanmis tumleyen oligo dT ile hibridizasyon vasitasi ile tum hucre mRNA'larinin bir karisiminin elde edilmesi basittir. Baglanmis mRNA daha sonra dusuk bir tuz tamponu ile ayristirilir. Daha sonra mRNA'nin poli(A) kuyrugunun, mRNA sablonundan tumleyici bir DNA kolu sentezleyen bir enzim olan bir ters transkriptazin varliginda oligo dT ile hibritlesmesine olanak verilir. Bu oriJinal mRNA sablonunu içeren çiFt kollu nukleotidler ve onun tumleyici DNA dizilimini verir. Sonrasinda RNA kolu alkali islemi ile veya RNase H'in faaliyeti ile uzaklastirilarak tek kollu DNA elde edilir. Daha sonra terminal transferaz olarak adlandirilan ve bir sablona ihtiyaç duymayan ancak her bir cDNA kolunun serbest 3' ucuna deoksioligonukleotid ekleyen bir DNA polimeraz olan bir enzimin faaliyeti vasitasi ile tek kolu DNA'nin 3' ucuna bir seri dG eklenir. Oligo dG'nin oriJinal cDNA kolunun tumleyicisi olan bir DNA kolu olan DNA polimeraz vasitasi ile, sentezleme için bir primer olarak hareket eden oligo dC iIe hibritlesmesine izin verilir. Bu reaksiyonlar oriJinal preparasyonda bulunan mRNA molekullerine karsilik gelen tam bir çift kollu DNA molekulu uretmektedir. Bu çift kollu DNA molekullerinin her biri yaygin olarak cDNA olarak adlandirilmaktadir ve her biri bir uçta bir oligo dC - oligo dG çift kolu ve diger uçta bir oligo dT - oligo dA çiFt kol bolgesi içermektedir. Bu DNA daha sonra kisitlama alanlarinda metilasyon ile korunmaktadir. Kisa kisitlama baglayicilari daha sonra her iki uçta baglanmaktadir. Bunlar belirli bir kisitlama enzimi için tanima alanlari içeren çift kollu sentetik DNA segmentleridir. Ligasyon (baglama) islemi, “kor uçlu” çift kollu DNA molekullerini birlestirebilen bakteriyofaJ T4'ten DNA sahip, kor uçlu çift kollu DNA daha sonra yapiskan bir uç olusturan bir kisitlama enzimi ile isleme tabi tutulmaktadir. cDNA kutuphanelerinin olusturulmasindaki nihai adim kisitlama bolunmesine tabi tutulmus çift kolun bir bakteriyum içerisinde transfekte edilmis spesifîk bir plazmid ile Iigasyonudur. Daha sonra rekombinant bakteriler bir plazmid kutuphanesi olusturmak uzere buyutulmektedir - plazmidin spesif`ik antibiyotik direncine karsilik gelen antibiyotiklerin varliginda. Her bir klon mRNA'nin tek bir parçasindan turetilen bir cDNA tasimaktadir. Bu klonlarin her biri daha sonra izole edilmekte ve klasik dizilim yontemleri kullanilarak dizilmektedir (sekanslanmaktadir).
Tipik bir dizilim islemi yerlestirme alaninda baslamakta ve her bir klon için 400 ila 800 arasinda baz çift dizilimi vermektedir. Bu dizilim, dizilimin ikinci defa yapilmasinin baslangici için bir sablon gorevi gormektedir. Bu iIeri dogru ilerleme tum plazmid yerlesiminin asamali dizilimine gitmektedir. Çesitli cDNA olarak belirlenmis EST 'Ierin dizilmesinin sonuçlari çesitli açik veri tabanlarinda biriktirilmistir. Örnek 2. Veri tabaninin açiklanmasi EST veri tabanlari cDNA kutuphane|erinden elde edilen cDNA dizilimlerine karsilik gelen dizilim bilgilerini içermekte ve bu nedenle temelde bu kutuphanelerin olusturulmasinda kullanilan dokularin içerisinde verilen herhangi bir zamanda mevcut olan ayri mRNA'Iarin dizilimine karsilik gelmektedir. Bu dizilimlerin kalitesi çesitli nedenlerle sorgulanmaktadir. Ilk olarak, yukarida açiklandigi gibi, cDNA kutuphanelerinin olusturulma sureci baslangiçta okaryotik mRNA'nin 3' ucundaki bir poli(A) kuyrugunun varligina buyuk oranda baglidir. Ikinci olarak, mRNA'lar RNase'ler olarak adlandirilan bol miktardaki nukleazlar tarafindan kolaylikla sindirilebilen oldukça kirilgan molekullerdir.
Uçuncusu, bu kutuphaneler olusturulup dizilirken, kullanilan oriJinaI malzemenin kalitesine ve depolanmasina az onem verilmistir. Bu nedenle EST dizilimleri genomik bilgilerin (notlarla) açiklanmasi için, yani tanimlanmis ve tam olarak dizilmis bir genomik DNA segmentinin herhangi bir spesiûk mRNA'yi kodlayip kodlamadiginin belirlenmesi için kullanilmistir. Bu baglamda, kodlama yapan genomik dizilimlerin tanimlanmasi için EST dizilimleri faydali olmustur. Ancak EST diziliminin kendisinden dogan bilgilere az dikkat edilmistir. Aslinda, bu pozisyonun destegi altinda guçlu teknik argumanlar ile DNA genomik diziliminin çok daha fazla guvenilir oldugu dusunulmektedir. EST dizilimleri içerisindeki çesitliliklerin biyol03ik, analitik veya klinik olarak ilgili bilgiler içerebilecegini tahmin ediyoruz. Gerçekte, EST veri tabanlari hepsi çesitli yontemler kullanan birkaç adet arastirmaci tarafindan olusturulmustur: bu bizim her bir metodolo;iik egilimin belirli bir sayida hataya sahip bir arka plan gurultusune katkida bulunmus olabilecegini dusunmemize sebep olmaktadir. Ancak, eger hatalardaki farklar kutuphanenin olusturulmasinda kullanilan malzemenin kaynagindan dolayi olussaydi, hata oranindaki fark dogrudan altinda yatan kaynak ile iliskili olurdu.
Bunun test edilmesi için NCBI ftp sitesinde mevcut olan est_ human veri tabanini aldik. Bu veri tabanlarini seçtik, çunku bu dizilimler insan veya biyo-enformatik araçlari tarafindan açiklanmamis veya tedavi edilmemisti.
Bir EST 'nin kanserli bir dokudan mi yoksa normal bir dokudan mi elde edildigini belirlemek uzere bir kutuphane tanimlama sistemi kullanilmistir. Her bir kutuphane normal veya kanserli olarak etiketlenmistir. Her bir EST 'nin erisim numarasi ile karsilik gelen kutuphanenin tanimlayicisi eslestirilerek 2.6 milyon EST kanserli dokulardan elde edilmis olarak ve 2.8 milyon EST ise normal dokulardan elde edilmis olarak siniflandirilmistir.
EST hizalamalarinin elde edilmesi için kamuya açik olarak mevcut olan megaBLAST 2.2.13 yazilimi (Basic Local Alignment Search Tool, Zheng Zhang, A greedy algorithm for-nucleotide sequence alignment search, J Comput Biol, 2000) kullanilmis ve asagidaki seçim parametreleri belirlenmistir: - d est_human: aranacak veri tabani (dbEST 'den tum insan EST 'Ieri), - i sequences.fasta : bol miktarda eksprese edilen genlere (Seki/29 karsilik gelen referans dizilimini içeren FAST A dosya formati, - D 2 : geleneksel blast çiktisi, - q -2 : bir nukleotid yanlis eslesmesi için skor -2, - r 1 : tek bir nukleotid eslesmesi için skor 1, - b 100000 : hizalamanin rapor edildigi dizilimlerin maksimum sayisi, - p 90 : EST ile referans dizilim arasindaki minimum yuzde tanimlamasi, - S 3 : referans dizilimleri ile eslesen EST 'Ieri hesaba katar, - W 16 : hizalama uzantisi ile baslamak için en mukemmel eslesmenin uzunlugu - e 10 : Beklenti degeri (E-degeri), Karlin ve Altschul (1990) stokastik modeline gore verilen bir dizilim ve verilen bir veri tabani için sadece sansla bulunmasi beklenen hizalama sayisi, - F F : referans dizilimi filtrelenmemekte. - o NonFiltre_test_90.out: megaBLAST rapor çikti dosyasi - v 0 : tek satir açiklama için gosteren dizilimlerin maksimum sayisi, - R T : (Dogru için T) : megaBLAST çiktisinin sonundaki kayit (log) bilgisini - IT : GI'Ieri defline içerisinde goster [T/ F] Blast için komut satiri: megablast -d est_human -i C:\SeciRef\TPT1\seciuences.fasta 3 - W 16-e 10.0-FF Sekil 2 (a-q) anaIiz için kullanilan 17 dizilimi gostermektedir; blastin bozulmasinin onlenmesi için mRNA referans dizilimlerinin poIiA kuyruklari sistematik olarak uzaklastirilmistir.
Sekil 2r dizilim varyasyonlarinin olusumunun test edilmesi için kullanilmis olan genlerin bir listesini sunmaktadir. Örnek 3. Normal ve kanser orijinli EST'Ier arasindaki dizilim varyasyonlarinin tanimlanmasi.
Veri tabani içerisindeki genis temsillerine dayanarak 17 gen seçilmistir. Her bir EST dizilimi daha sonra Mega BLAST kullanilarak NCBI'dan islenmis mRNA referans dizilimine (RefSeq) karsi hizalanmistir. Bu verilen herhangi bir bazin bu pozisyona eslesen EST 'Ierin sayisi ile tanimlandigi bir metris olusturmaktadir. Daha sonra verilen herhangi bir pozisyonda RefSeq'ten sapan EST 'Ierin orani olçulmustur. Doku oriJinine gore hizalanmis EST dizilimlerinin karsilastirilmasi kanserli veya normal grup içerisindeki her bir baz pozisyonunda olusan dizilim varyasyonlarinin belirlenmesine yol açmistir.
Sekil 4 seçilen 17 gen için normal ve kanserli setler içerisinde olusan bu varyasyonlarin grafik bir temsilini sunmaktadir. Verilerin gorsel incelemesi dizilim varyasyonunun en sik olarak kanserli grupta meydana geldigini ve ilaveten bu olgunun en baskin olarak spesifik mRNA alanlarinda goruldugunu ortaya çikarmistir. Gozlemlerin çogunlugu mRNA diziliminin baslangicindan en az 400-500 baz sonra, yani agirlikli olarak genin 3' kisminda konumlanmistir. Bu çok yuksek sayidaki varyasyonlar SNP'ler ile açiklanamamaktadir. Varsayilan SNP'ler (m) ve biyoIOJik olarak dogrulanmis SNP'ler (O) grafikte gosterilmektedir; bu SNP'ler NCBI veri tabanindan elde edilmistir (dbSNP, build varyasyonlarina yol açan hem varsayilan hem de biyoloiik olarak dogrulanan SNP'ler (n=442) diger analizlere dahil edilmemistir (bu nedenle RNA duzenleme alanlari da (yanlis SNP'ler) hariç tutulmustur).
Bu analizin bir sonraki adimi kanserli ve normal EST 'ler arasinda olusan dizilim varyasyonlarindaki farklarin istatistiksel oneminin test edilmesidir. Her bir pozisyon için iki tarafli oran testi kullanilarak RefSeq bazinin normal ve kanserli gruplar arasindaki diger uç baza orani karsilastirilmistir. Asagidaki kosullarin saglanmasi kosulu ile bu test sistematik olarak uygulanmistir: n>70 ve (n..*n.])/n>5 i=1,2; J=1,2 (n = bir gen için kanserli ve normal EST 'lerin sayisi), ni = kanser EST 'Ierin sayisi; nz = normal EST 'lerin sayisi, n 1=RefSeq'e sahip EST 'Ierin sayisi, n 2 = bir ikameye sahip olan EST 'lerin sayisi).
Karsilik gelen P-degeri 0.05'ten dusuk oldugunda istatistiksel bir testin %5 esik seviyesinde pozitif oldugu soylenmektedir; bu durumda farksizlik hipotezi (yani her iki oran aynidir) reddedilmektedir. hassasiyeti arttirmak uzere ele alinmistir. Birincisi istatistiksel test pozitif iken her iki grupta degiskenliklerin farkli oldugu sonucuna varilmasina olanak vermis, sonrasinda bu durumda degiskenligin kanser seti içerisinde istatistiksel olarak daha buyuk olup olmadigini olçmustur. Bunun aksine, ikinci test degiskenligin normal set içerisinde belirgin sekilde daha yuksek oldugu onermesini dogrulamistir. Iki tarafli testlerden ayni kosullarin karsilandigi her seferinde her iki tek tarafli test gerçeklestirilmistir.
Sekil 3 tipik blast sonuçlarinin bir açiklamasini sunmaktadir. Sekil 5a ve 5b'de gosterildigi uzere, temsili gen TPT1 için, gen uzerinde verilen herhangi bir pozisyondaki EST 'Ierin sayisi hem kanser hem de normal gruplarda aynidir. Sekil 5c olasi 830 oran testinden 489'unun atanan kriterleri karsiladigini gostermektedir. %5 seviyesinde istatistiksel olarak onemli olan oran testleri Sekil 5d'de gosterilmektedir. Location Based Estimator (Konum Bazli Tahmin Edici) (C.Dalmasso, P.Broet (2005) Journal de la Societe Francaise de Statistique, cilt 146, n1-2, 2005) iIe tanimlanmis olan çoklu testlerden kaynaklanan tahmini bir hata hesaplanabilir. 26 oran testi sekil 5d'deki normal dokularda (N>C) olusan baz ikamelerinden dolayi pozitiftir (n=26; LBE=33). Bu kanser grubundaki (C>N) dizilim varyasyonlari nedeniyle olusan istatistiksel olarak onemli oran testlerinin toplami ile zitlik ortaya koymaktadir (n=. Benzer bir analiz ikinci bir gen olan VIM için gerçeklestirilmistir (Sekil 5e-5h). Yine verilen herhangi bir gen pozisyonundaki EST 'Ierin sayisi kanser ve normal gruplarda ust uste eklenebilmektedir. 1847 oran testinden 752'si kriterler ile eslesmistir. Yine, pozitif oran testlerinin sayisinda buyuk bir fark gozlenmistir: n=78 varyasyon normal gruptan (LBE=50) dolayidir ve n=269 varyasyon kanser grubundan (LBE=24) dolayidir. EST veri tabaninda bolca bulunan 17 gen uzerinde ayni analiz tekrarlanmistir. Sekil 5i elde edilen istatistiksel sonuçlarin bir ozetidir. Test edilen 17 genden 15'i kanser dokularindan elde edilen EST 'lerde daha buyuk dizilim varyasyonlari ortaya koymaktadir (Sekil 51). Bu asamada, istatistiksel analizler istatistiksel testlerin kisitlamalarindan dolayi her bir genin sadece %9'u ila Analizlerin bu birinci asamasinin sonucu, mRNA'Iarin ekstrakte edildigi dokunun kaynagina gore (normale karsi kanserli) karsilastirildiginda ayni genin EST 'lerinin farkli oldugudur. EST dizilim varyasyonlarini veren teknik hata oraninin normal ve kanserli oriJine sahip dokulara gore farkli olmadigi tahmin edildiginde ve test edilen 17 genden 'inin dokunun kaynagindan dolayi dizilim varyasyonlari ortaya koymalari gerçegi goz onune alinarak, bu farklarin dogrudan EST 'lerin uretildigi hucrelerin durumundan (normale karsi kanserli) kaynaklandigini one surmekteyiz.
Yerlestirme ve silmelerin incelenmesi için benzer deneyler gerçeklestirilmektedir. F3 f`iltresi uygulandiktan sonra sonuçlar elde edilmektedir (bakiniz Ornek 4). Biyoloiik olmayan olaylarin (diziIim hatalari, Megablast yanlis hizalama ) Onune geçilmesi için daha siki bir kosul kullanilmistir: bir aralik veya bir yerlestirme sadece eger - /+10'Iuk bir pencere içerisinde hiçbir diger modifikasyon mevcut degilse dusunulmustur. Her bir pozisyon için, yukarida açiklandigi gibi bir iki tarafli test kullanilarak normal ve kanserli gruplar arasinda silmeye (deletion) (veya yerlestirmeye (insertion)) sahip pencerelerin diger pencerelere orani karsilastirilmistir. Sekil 5k elde edilen istatistiksel sonuçlarin bir ozetidir. Test edilen 17 genden 14'u (yerlestirme için 'u) kanserli dokulardan elde edilen EST 'lerde daha buyuk dizilim varyasyonlari (silmeler veya yerlestirmeler) ortaya koymustur (Sekil 51). Örnek 4. Normal sete N>C karsilik kanserli sette C>N varyasyon fazlaliginin dogrulanmasi Kanser veya normal orneklerden meydana gelen kutuphaneler temelde ayni sekilde islenmektedir. Bu nedenle kutuphanenin yapisi veya klon dizilimlerinden kaynaklanan rasgele hatalarin her iki sette de ayni oranda meydana gelmesi beklenmektedir ve normal ve kanserli EST gruplari arasinda gozlemlenen farklar için hesaba katilamamaktadir. Matematiksel analiz de bu yorum ile tutarlidir (Brulliard M., ve Daha sonra asagidaki mantiga dayanan filtreleme prosedurleri sirasiyla uygulanarak EST heterOJenliginin diger kaynaklari elimine edilmeye çalisilmistir. Baslangiçtaki gerekliliklerimiz EST 'nin en az 16 ardisik bazda RefSeq ile %100 denklikte ve en az 50 bazda %90'dan buyuk denklikte hizalanmis olmasiydi. Sekil 6b'de gosterildigi üzere, tum 17 gen için kanserli ve normal setler karsilastirildiginda, bu sirasiyla 2281 ve 725 istatistiksel olarak onemli farklar C>N ve N>C (sutun F1) ve varsayilan veya biyol01ik olarak dogrulanmis SNP'Ierden ayri vermistir. Ikinci filtre (F2) her bir EST 'nin uzunlugunun %70'inden fazlasinda RefSeq'e surekli olarak hizalanmis olmasini gerektirmektedir. Uçuncu f`iltre (F3) paraloglar ve psodogenlere gerçek RefSeq'ten daha yakin iliskili olan dizilimlere sahip EST 'Ieri ayirmaktadir. Dorduncu f`iltre (F4) analizden her bir EST hizalamasinin ilk ve son 50 bazini silmektedir. Bu f`iItre, MegaBLAST programi tarafindan hizalamalarin daha da optimize edilmesi için olusturulan ve/veya hizalanmis EST uçlarinda hata akumulasyonundan kaynaklanan, EST 'nin 3' ve 5' sinirlarindaki yanlis eslesmelerin kaldirilmasi için kullanilmistir. Son fîltre (F5) normal ve kanserli setler arasindaki herhangi bir uzunluk farkinin ortadan kaldirmak uzere her bir gen için EST dizilim uzunluklarini normalize etmistir. Aslinda, ilk 4 f`iltrenin uygulanmasinin ardindan, ortalama kanser EST uzunlugunun normal EST 'Ierinkinden daha buyuk oldugu fark normal ve kanserli setler arasinda farkli olmadigi 5 gende belirgin olçude daha fazla kanser EST heteroienligi de gozlenmistir (TPT1, VIM, HSPA8, LDHA, CALM2). kalmistir, ancak C/N orani .
Kanser EST heteroienliginin dizilim islemlerinin sonundaki hatalarin birikiminden kaynaklanmadigindan daha da emin olmak için, herhangi bir dizilim isleminin sadece ilk 50 bazindan sonra ve 450 bazindan once sunulan bilgiler goz onune alinmistir. Bu zorlayici ûltrelemenin ardindan, tum 17 gen için istatistiksel olarak onemli olan C>N testleri olmustur. Bu nedenle kanser seti içerisinde artan EST heterOJenIigine neden olan dizilim varyasyonlarinin kanser hucresi mRNA heterOJenliginin dogrudan bir yansimasi oldugu makul olarak varsayilabilir (Sekil Daha sonra kulture edilmis kanser hucrelerinden uretilen EST 'ler uzaklastirildiktan sonra kanser seti içerisinde daha fazla istatistiksel olarak onemli EST heteroienliginin kaldigi bagimsiz olarak dogrulanmistir. Bu filtrelemenin ardindan, tüm 17 gen için istatistiksel olarak onemli olan C>N testleri olmustur (Sekil 6e). Örnek 5. Kanser hücrelerinde transkiipsiyon infîdelitesinden dolayi olusan baz ikamesinin kodunun Ian/masi.
Bir sonraki hedef açiklanan transkripsiyon infidelitesinden kaynaklanan baz ikamesi olgusunun rasgele bir olgu olup olmadiginin veya spesifîk kurallari takip edip etmediginin belirlenmesidir. Bunu basarmak için C>N'nin istatistiksel olarak onemli oldugu EST varyasyonlari uzerine yogunlasilmistir. Filtreleme prosedurleri ile meydana gelebilecek egilimlerin onlenmesi için mevcut olan tum fîltrelenmemis veriler kullanilmistir.
Transkripsiyon infidelitesinin rasgele bir sureç olmadiginin birinci gostergesi baz ikamelerinin test edilen genlerin 5' bolgesinde nadiren meydana gelmis olmasidir. Test edilen butun genler için olgun mRNA'nin ilk 400-500 bazi içerisinde baz ikamesi olusma olgusu çok nadiren gozlenmistir. Transkripsiyon inndelitesinin rasgele bir sureç olmadiginin isaret eden ikinci bir gozlem, ikame olaylarinin ust ve alt kismindaki dizilimler (heteroien, H, n=2281) ile hiçbir ikame olayi tespit edilmeyenler (heterOJen olmayan, NH, n=12273) karsilastirilirken genomik DNA sablonu uzerinde gozlemlenen baz kompozisyonlarinda farklarin oldugunun gorulmesinden kaynaklanmaktadir. NH alanlari için kriterler %0.5'in altinda ve normal setten istatistiksel olarak farkli olmayan kanser seti varyasyonlaridir (Sekil 73). Bu analizde ikameye tabi olan baz bO olarak, meNA 5' ucunda konumlandirilmis olan bazlar b-n olarak ve 3' ucunda konumlandirilmis olan bazlar b+n olarak adlandirilmaktadir. Daha açik olmasi maksadiyla, bu analizde meNA'nin baz kompozisyonundan bahsedilmektedir: bu DNA uzerinde sablon-olmayan kola (RNAP tarafindan kopyalanmayan kola) karsilik gelmektedir. Veriler ilk olarak 4 bazinin tumunun varyasyona esit miktarda hassas olmadigini gostermektedir: b0 = A (33%) = T (32%) » C (21%) » G (14%). kompozisyonlari belirgin EST varyasyonu içermeyen alanlardan istatistiksel olarak farklidir (Sekil 7a, baz kompozisyonu % olarak ifade edilmektedir ve Gri gölgeleme zenginlestirilmis bazlari gostermektedir; daha koyu gri eksik bazlari gostermektedir).
Spesifik olarak varyasyonlarin olustugu alanlarin oncesinde ve sonrasinda A 2 G > T z C daha sik meydana gelmektedir.
Bu nedenle kanser EST heteroienliginin olusumu rasgele degildir, ancak ilk olarak ikameye tabi olan bazin dogasi tarafindan ve ikinci olarak olayin hemen oncesinde ve sonrasindaki bazlarin dogasi tarafindan belirlenmektedir.
Daha sonra degistirilen bazin rasgele seçilip seçilmedigi incelenmistir. Sekil 7b'den durumun bu olmadigi asikardir. Oranlardaki farkin istatistiksel onemi degistirilen bazin rasgele seçildigi sifir hipotezi ile hesaplanmistir (her uç degistirme bazi testinin duzgun ve G ise A ile (p = 2.2x10'32) degistirilmistir. C'nin ikamesi hafif bir T eksikligi ile daha esit bir dagilim gostermistir (p = 0.007).
Daha sonra tercihi baz degisimlerinin altinda yatan nedenler aranmistir. Bu amaçla bilgilendirici ve bilgilendirici olmayan olaylarin iki seti birbirinden ayrilmistir.
Bilgilendirici olaylar ikame edilen bazin onceki bazdan (b-i) veya takip eden bazdan (b+1) farkli oldugu durumlardir (n = 1676) (Sekil 7c). Bilgilendirici olmayan olaylar bu kriterlere uymayan durumlardir. Bilgilendirici olaylar analiz edildiginde iki durumla karsilasilmistir: ikame edilen baz b-1 veya b+1 ile (%79) veya b-1 veya b+1'den farkli olan diger bir baz ile (%21) degistirilmistir. 1) Birinci alt kumede degistirilen baz b-1 (N=799; Sekil 7c panel B) veya b+1 (N=530; Sekil 7c panel C) ile ozdestir.
(Sekil 7d panel A). A tercihen C ile degistirilmistir (durumlarin %71'inde). Degistirme panel B). T tercihen G ile degistirilmistir (%71). Ilginç sekilde, çevreleyen bazlarin istatistiksel onemi de farklidir (Sekil 7d panel A ve 7d panel B). b-1 ikameleri için baz kompozisyonunun nispi etki paterni b0 > b-1 > b-2 > b+1 >b-3 > b+2'dir. b+1 ikameleri için baz kompozisyonunun nispi etkisi bir b0 > b+1 > b-1 > b+2 > b-3 > b-2 paternini takip etmektedir. 2) Bilgilendirici olaylarin ikinci alt kumesinde degistirilen baz ne b-1'e ne de b+1'e karsilik gelmemektedir (n=347, Sekil 7c panel D). Etkilenen bazlar asagidaki duzendedir: A (%47) > T (%29) > C (%14) > G (%10). A en yaygin olarak C ile (durumlarin %91'i); T, C (%50) ve A (%42) ile; C, G ile (%46) ve G ise C (%73) ile degistirilmektedir. Bu nedenle degistirilen baz b-1 veya b+1'e karsilik gelmediginde, degistirilen baz rasgele seçilmemektedir, ancak C buyuk oranda asiridir.
Daha sonra bilgilendirici olmayan olaylarin seti, yani 1) b-1 = b+1 ve 2) b-1 = bO = b+1 oldugu durumlar ele alinmistir (Sekil 7::) b-1 ve b+1 ozdes oldugunda ancak bO'dan farkli oldugunda (n=339, Sekil 7c panel E) ikame edilen bazlar asagidaki tercih paternini takip etmektedir: T -> G, G -> A, A -> C. Uç ozdegi bazin tekrar merkez bazinda olusan ikameler (n=266; Sekil 7c panel F) asagidaki duzende gozlemlenmistir: olaylari: A -> C ve T -> C ve A. Nadir GGG ikameleri en yaygin olarak GCG ile ve CCC'Ier ise CAC ile degistinlmiStir (Sekil 7c).
Bu nedenle ikameler arka arkaya uç ozdes baz içerisinde meydana geldiginde ve ikameler ne b-1 ne de b+1'e karsilik gelmediginde C en yaygin degisim bazidir (Sekil 7c). Degisim bazi b-1'e karsilik geldiginde en yaygin ikame A->C'dir; degisim bazi b+1'e karsilik geldiginde en yaygin ikame T->G'dir.
Bu nedenle ne ikame edilen baz ne de yerine konan baz rasgele seçilmemektedir. Her iki olgu da ikame edilen baz ile bu olayin yukarisinda ve asagisinda konumlandirilmis olan bazlarin kompozisyonlari tarafindan belirlenen tahmin edilebilir paternleri takip etmektedir.
Verilen herhangi bir dizilim içerisinde baz ikamesinin olusumunu belirleyen motif bilesimin hassas olarak belirlenmesi için spesif`ik algoritmalar tanimlanabilir.
Daha sonra C>N seti N'in kararli oldugu (Normal sette ayni pozisyonda sapma gozlemlenmemis) veya olmadigi iki sete ayrilmistir. Sapma miktari Normal setteki sapmanin ortalama yuzdesi olarak tanimlanan belirli bir esigi asmasi durumunda ele alinmaktadir. Sekil 7e -4/+3 imzasinin N'in sapma yaptigi C>N seti tarafindan tasindigini gostermektedir. Diger sette içerigin uzunlugu daha az onemlidir. Sekil 7f N'in sapma yaptigi C>N setinde N'in stabil oldugu C>N setine gore daha onemli olan 500- 1000 araligindaki bir birikimi gostermektedir. Ikincisinde, daha erken olaylar (0-500 araligi) goruluyor gibidir. C>N alanlari için degisim bazlari iki set arasinda benzerdir Silme veya yerlestirme durumunda, sonuçlar goz ardi edilen bazlarin (398 C>N durumu) asagidaki duzende olduklarini gostermistir: C (%46.0) > T (%37.9) » A (%93) > G (%6.8) (Sekil 5m) ve yerlestirilen bazlasin (225 C>N durumu) asagidaki (Sekil 50). Silme veya yerlestirme olaylarinin siklikla korunan ozdes bazlar içerisinde ortaya çiktigi gozlemlenmistir. Bu tur olaylarin analiz edilmesi için ozel olarak dizayn edilmis bir program silmelerin %94.7'sinin ve yerlestirmelerin ise %81'inin degisken uzunluklannin uzantilarinda olustugunu etkili olarak gostermektedir. Uzantilar bipolar ve simetrik (ornek olarak AAATAA) olabilir veya olmayabilir (ornek olarak CCCGG) veya tek nukleotid tekrar edebilir (ornek olarak AAA) (Sekil 5m-5p'deki motiflere bakiniz). Silme durumunda, durumlarin %84'unde ihmal edilen bazlar b-1 veya b+1 bazina (uzanti) ozdestir. Çogu motif C > T > A-G'nin çifti veya uçlusudur. Yerlestirme durumunda da benzer sonuçlar gozlenmistir. Aslinda, uzanti motiflerinin C>N veya N>C arasinda farkli olmadigi gorulmustur. C>N veya N>C ozelligi uzantilarin etrafindaki diger bilgilerden gelebilir. Daha fazla gen uzerinde ilave analiz bu gozlemleri dogrulayacaktir. 17 genin tumu goz onune alindiginda, EST heterOJenligi 100 bazin 10'u oraninda gozlenmistir (Sekil 5j ve Sekil Sa-c). Bu oran genomik DNA içerisinde meydana gelen açiklanmis herhangi bir mutasyon oranini asmaktadir. Bir referans olarak, tek nukleotid polimorfizminin genom içerisinde her 300 bazda bir rasgele meydana geldigi tahmin edilebilir. Kopyalanan DNA'yi etkileyen tek nukleotid polimorFizminin orani ise çok daha dusuktur: her 3000 bazda bir meydana geldigi tahmin edilmektedir. Kanserde DNA mutasyonlarinin daha sik meydana geldigi açiktir. Ancak çalismamizda kullanilan 17 genden 14'unu içeren gogus ve kolon kanseri DNA dizilimi ile ilgili derinlemesine çalismalar 106 baz basina 3.1 mutasyonluk bir somatik mutasyon orani tahmin nedenle bu bulusta açiklanan transkripsiyon infîdelitesi DNA'yi etkileyen mutasyonlarinkinden çok daha buyuk bir oranda meydana gelmektedir. Daha onemlisi, DNA uzerindeki çogu baz ikamesi protein seviyesinde kisitli sonuçlara sahiptir, çunku genomik DNA'nin %10'undan azi mRNA'ya kopyalanmaktadir. Bunun aksine transkripsiyon infidelitesinden kaynaklanan baz ikameleri genellikle protein islevi uzerinde dogrudan sonuçlara sahiptir. Aslinda, burada açiklanan 2281 ikameden 1179'u ( protein AA ana dizilimi uzerinde ani etkiye sahip baz ikamelerine neden olmustur (Sekil 8d). En onemlisi, test edilen 17 genden 9'unda stop kodonunu etkileyen belirgin baz ikamelerl gozlenmistir. Ancak transkripslyon infidelitesi konseptinden once, insan proteinlerinin bu gune kadar “donusturulmemis bolgeler” olarak dusunulen RNA dizilimleri tarafindan kodlanmis ilave kodlama dizilimleri içerdigi one surulmekteydi. Burada transkripsiyon infîdelitesinden dolayi dogal stop kodonlari içerisinde meydana gelen baz ikamelerinin spesifik AA'Iari kodlayan ozgun kodlama bolgelerini ortaya çikardigini gostermekteyiz. Bu ozgun kodlama bolgesi dogal açik okuma çerçevesi ile uyum içerisindedir. Dogal stop kodonu bir kodlama kodonuna donusturulmektedir. Daha sonra bir sonraki baz uçlusu bir AA olarak okunmakta ve donusturme islemi yeni bir stop kodonuna erisinceye kadar ozgun bir kodlama bolgesi ile devam etmektedir. Tabiki transkripsiyon infîdelitesi ortaya koyan 17 genden 8'inde durumun bu oldugu dogrulanmistir. Tum 8'i karsilik gelen RefSeq ile çerçeve içerisinde alternatif stop kodonlari içermektedir (GAPDH alternatif bir STOP kodonu içermemektedir). Bu ani bir sonuca sahiptir, çunku her bir durumda sirasiyla TPT1, ozgun kodlama dizilimleri meydana getirmistir (Sekil 10). Bu AA'Iarin ilave edilmesi kanserde buyuk oranda gelismis olacak motiflerin yaratilmasi potansiyeline sahiptir; bu motifler proteinlerde ozgun islevler ile sonuçlanacak veya sonuçlanmayacaktir. Bu olusumun tahmin edilmesi tanilama, terapotik veya diger amaçlar için kullanilabilecek faydali araçlarin olasi gelisimine yol açmaktadir. Bu olusumun tahmin edilmesi ayrica proteinin karboksi-terminal ucundaki kansere ozgu dizilimleri taniyacak spesifik antikorlarin olasi gelisimine de yol açmaktadir. Karboksi-terminal ucunda dogrudan protein dizilimini yapabilen herhangi bir analitik yo'ntem mevcut durumda bulunmamaktadir. Ancak proteinlerin enzimatik olarak parçalanmasi ve parçalanma urunlerini NHz terminal uçlarindan dizmek mumkundur. Ayrica kutle spektrometrisi kullanilarak proteolisiz ile uretilen peptidlerin AA içeriginin analiz edilmesi de mumkundur. Bu alternatif stop kodonlarinin da transkripsiyon infidelitesinden etkilendigi gosterilmistir (9 genden 7'si etkilenmis ikinci alternatif STOP kodonuna sahiptir).
Yukarida açiklanan ayni olgu ozgun bir dizilim setinin okunmasina da genisletilebilir.
Bizim yontemimiz kullanilarak tum protein dizilimlerinin açiklanmasi donusturme makinesinin baz ikamesini dogru olarak donusturme veya donusturememe kabiliyetinin yani sira kodon kullanimina bagli olarak daha fazla veya daha verimli olarak kopyalanacak olan çesitli suphelenilmeyen kodlama mRNA dizilimi ortaya çikaracaktir.
Aslinda, baz ikameleri ribozomal okuma oranini modifiye edebilen mRNA yapisal degisikliklerine neden olabilir. Yine de baz ikamelerinin RNA yapisi degisiklikleri içermedigini varsaymaktayiz. Stop kodonu degisikliklerinin olusumu goz onune alinarak, etkilenen genlerde, kanser dokularindaki mRNA'nin %4'une kadarinin bu ilave kodlama bolgelerini içerdigini tahmin etmekteyiz.
Varsayimsal bir Post STOP Peptidinin (PSP) varligi için tum protein dizilimlerinin açiklanmasinda çesitli filtrelere dayanan spesifik bir program kullanilabilir. Incelenen proteine karsilik gelen nukleik dizilim elde edildikten sonra, program kanonik ST OP'tan sonra es fazli diger bir STOP ile es fazli olan bir nukleik dizilimin var olup olmadigini aramaktadir (bu alternatif STOP kodonlarini etkileyen transkripsiyon infidelitesi durumunda bir veya daha fazla ST OP'un by-pas edilme olasiligi goz onune alinabilir).
Potansiyel bir antiJenik patern tahminine için minimal kritere uygun olarak minimum bir uzunluk belirlenebilir (ornek olarak sadece 12'den fazla amino asidi kodlayan dizilimler, ancak sonuçta peptid uzunlugu daha kuçuk olabilir). Daha sonra antiJenik PSP depolanmaktadir (Sekil 1& Kanonik ST OP'un ogrenme makinesi egitilerek açiklamaya sahip adaylarin dogrulanmasi için ilave bir adim kullanilmaktadir: aslinda STOP kodonunun bir veya daha fazla kodonunun transkripsiyon inûdelitesi ile ikame edilebilmesi olasiligi belirlenebilmektedir. Ayrica kutle spektrometrisi kullanilarak proteolisiz ile olusturulan peptidlerin AA içeriklerinin analiz edilmesi de mumkundur.
Ozgun protein dizilimlerinin donusturulmesine olanak veren durumlarin yaratilmasinin yaninda transkripsiyon infîdelitesinin mRNA'da premature durmalar meydana getirebilecegi de gosterilmistir. Kanonik açik okuma çerçevesi içerisinde meydana gelen yirmi dort ozgun stop kodonu 17 genin 13'u içerisinde belirlenmistir. Bu durum transkripsiyon infidelitesinin spesifik alanlari eksik olan daha kisa proteinlerin uretimine neden olabilecegini gostermistir. Bu kisaltilmis proteinler bir islevin artmasina veya kaybina neden oluyor olabilir. Proteinin 3-D yapisi da buyuk ihtimalle etkilenmekte ve bu nedenle bagisiklik sistemi tarafindan taninabilecek ozgun varliklar meydana getirmektedir.
Nihai olarak, test edilen 17 gendeki transkripsiyon infidelitesi tanimlanan tum C>N ikamelerinin %50'sinin AA degisikliklerine neden oldugunu ortaya koymustur. %17'si AA'nin ayni aileden bir digeri ile degisimine karsilik gelmekte ve %33'u ise AA'nin fakli bir AA sinifi ile ikame edilmesine karsilik gelmektedir. Bu nedenle transkripsiyon infidelitesi potansiyel olarak modifiye edilmis isIevIer veya faaliyetlere sahip ozgun AA dizilimleri içeren proteinlerin uretilmesi kabiliyetine sahiptir. Yukarida açiklanan kurallar kullanilarak transkripsiyon infidelitesinin tahmin edilmesi protein davranisindaki degisikliklerin ve proteomik deneylerin sonuçlarinin rasyonel olarak tahmin edilmesine olanak verecektir. Örnek 6. Biyolojik dogrulamalar Biyol01ik dogrulamalar iki seviyede icra ediImistir: mRNA ve proteinler. edilecektir. Dizilim mutasyonlarinin tespit edilmesi için genis olçekli bir kromatografik yontem olan DHPLC (Denature Edici Yuksek Performansli Sivi Kromatografisi) kullanilmistir. Deneyin prensibi Sekil 11a-c'de açiklanmaktadir. Ilk olarak, ornek içerisinde heterodubleks formasyon ve teshis için yeterli olan mutasyona ugramis DNA yuzdesini tahmin etmek uzere Transgenom/'k DHPLC esigini test etmek için bir yontem gelistirilmistir. Aslinda, 1 ve 3 baz ikamelerine sahip 300 hp PCR parçalari kullanilmistir. etmektedir (Sekil 11d). Bu sonuçlar ilgilenilen genler için normal ve kanserli dokulardan mRNA'yi ayirt edebildigimizi gostermektedir. Uç genin test edilmesi için normal ve kanserli bitisik dokulardan (Biocha/n inc.) ekstrakte edilen mRNA'lar kullanilmistir: GAPDH, EN01 ve TMSB4X. DHPLC DNA uzerinde çalisirken ters transkriptaz kullanilarak mRNA ornekleri cDNA'ya donusturulmustur. Normal dokulardan gelen EST 'lerdekine gore kanser dokularindan gelen EST 'ler içerisinde çok daha belirgin ikameler ortaya koyan bolgeler seçilmistir. Amplifikasyon için kullanilan primerler Sekil 12'de gosterilmistir.
Bir birinci deney setinde, kanserli ve bitisikteki normal dokulardan (karaciger, bobrek, gogus ve kolon) alinan çesitli cDNA'lar bahsedilen primerler ile PCR ile amplifiye edilmis ve DHPLC sistemine enjekte edilmistir. Firinin sicakligi Navigator yazilimi (Transgenomic) ile seçilmistir. Yukarida açiklanan genler için proûller elde edilmis ve ENR01, GAPDH ve TMSB+X genleri için temsili bir deney Sekil 15'te sunulmustur. Sekil 15a-15c'de gosterildigi uzere, GAPDH ve EN01 genleri için kanser proûlleri normal profillerden açik sekilde farklidir. TMSB4X geni için beklenildigi gibi hiçbir fark gozlenmemistir (çok daha az transkripsiyon infidelite alani). Ayni PCR urununun ve diger 2 PCR urununun enjeksiyonu uçlu olarak gerçeklestirilmistir (Sekil 15b ve 15c) ve profiller ayni deney içerisinde yuksek seviyede yeniden uretilebilir olmustur. Ancak bu farkin nedeni bu deney ile açiklanamamaktadir.
Sonuç olarak mRNA'ya dayali bu biyoIOJik dogrulamanin devami gerçeklestirilmektedir.
Gerçekte, kanserli dokulardan olusturulan PCR urunlerinin dizilimi çogu bol miktarda bulunan mutasyonlarin hassas sekilde tespit edilmesine olanak verebilmektedir.
Ters kopyalanmis PCR ile amplifiye edilmis mRNA'larin Klasik Senger dizilim yontemi belirli bir pozisyonda %15-30'un altindaki oranlarda meydana gelen dizilim degisimlerini tespit etmemektedir (Sekil 16). Aslinda, bilinen mutasyona ugramis ve ugramamis dizilimlerden amplifikasyon urunlerinin karisimlarinin dizilmesi ile elde edilen mutasyona ugramis baz davetleri %50-50 karisimlari için elde edilmekte ve minor tepeler %15'ten tespit edilmektedir. Payro-dizilim ve Emulsiyon PCR, cDNA heterOJenliginin tespit edilmesine olanak veren daha hassas yontemlerdir ve bu nedenle kanserli ve normal hucrelerden elde edilen RT-PCR urunlerinin analizi mumkun olmaktadir (Thomas, R. K, Transkripsiyon infidelitesinden etkilenen bir genin tumu veya transkripsiyon infidelite alanini içeren veya içermeyen bir kismi klonlanmistir. Kanonik stop kodonu ile veya o olmadan yapi, neomisin direncini kodlayan gen ile çerçeve içerisinde baglanmistir.
Kanserli ve normal hucreler bu kimerik yapi ile ilk basta geçici olarak daha sonra kararli olarak transfekte edilmistir. Transkripsiyon infidelitesinin kanonik stop kodonunda degisiklige neden oldugu ve bu sayede neomisin geninin donusumune olanak verdigi ve nemoisine dirençli hucre olustugu tahmin edilmektedir. Neomisin direncine sahip olan hucrelerin daha hizli buyuyecegi ve bu hucrelerin sekillerinin normal hucrelerinkine gore belirgin farklilik gosterecegi tahmin edilmektedir. Ilaveten, bu hucrelerin daha istilaci (invazif) olduklari ve kanser ilerlemesinin ilerideki bir asamasinda hucreler ile karsilastirilabilecegi de tahmin edilmektedir. Bu nedenle bu teknik bireysel bir hastadan alinan fakli hucrelerin kanser asamalarinin belirlenmesinde kullanilabilir.
Neomisin direncinin transkripsiyon infidelitesinin bir sonucu olarak meydana geldiginin son delili, genomik DNA'dan amplifiye edilen yerlestirilmis yapinin dizilmesi ve genomik bilginin degismeden kaldiginin gosterilmesi ile elde edilecektir. Ayrica neomisin dirençli hucredeki mRNA'larin transkripsiyon infidelitesinden dolayi mutasyona ugramis bir stop kodonu içerdigi de dogrulanacaktir.
Transkripsiyon infidelite alanlarinin tespit edilmesine musaade eden bir teknik cDNA kutuphanelerinin olusturulmasidir ve kanserli ve normal hasta dokularindan ekstrakte edilen RNA'dan ters-kopyalanan cDNA'Iarin kopyalanmasini içermektedir. Spesifik bir genden amplifiye edilen veya edilmeyen her bir cDNA Escherich/a co/i içerisinde donusturulmus ayri plazmidler içerisinde klonlanmaktadir. Farkli E. co/i kolonileri toplanmis ve diziImisIerdir. Dizilmesi gereken klon sayisi klonlanmis cDNA parçasi içerisindeki ikamelerin yuzdesine baglidir. Istatistiksel bir analiz transkripsiyon infidelite alanlari içerisindeki dizilim varyasyonlarini verecektir. Bu teknik gelistirilebilir. Aslinda, spesifik primerler ile ters-transkripsiyon ve amplifikasyonun ardindan cDNA bir raportor gen, ornek olarak /acZ geni tasiyan bir plazmid içerisinde klonlanabilir. cDNA ve raportor geni es fazli olarak klonlanmaktadir. mRNA'nin STOP kodon diziliminde bir ikame göruldügünde raportor gen eksprese edilir. E. co/i' hucreleri bu yapi ile donusturuldugunde, cDNA'nin stop kodonu içerisinde mutasyona ugratildigi plazmidi tasiyan koloniler raportor genin ekspresyonu ile seçilmektedir. Bunun ardindan, stop kodonunun ikamesin,n mevcut olup olmadiginin dogrulanmasi için plazmid siralanabilir (sekanslanabilir).
Transkripsiyon infidelite alanlarinin tespit edilmesi için spesifik primerler ile gerçek- zamanli PCR'a dayali diger bir teknik kullanilmaktadir. Bu primerler Istatistiksel analizlere dayali dizilim varyasyon(lar)ina sahip cDNA ile eslesmek uzere dizayn edilmislerdir. Ikinci bir primer ise dizilim varyasyonuna sahip olmayan (referans) cDNA ile eslesmek için dizayn edilmistir. Primer diziIim içerisindeki varyasyon(lar)in sayisi çok onemlidir ve bilinen dizilim varyasyonu uzerinde bir test deneyinde spesifik bir floresan sinyali elde etmek için incelenen pozisyonlarin disinda 2 mutasyonun gerekli oldugu belirlenmistir.
Primer bir diziIim ikamesine sahip olmayan (referans) cDNA ile tumleyen oldugunda, floresan sinyaIi belirli bir amplifikasyon çevrimi sayisinda tespit edilmektedir. Dizilim ikamesi tasiyan primer ile amplifiye edilmis ayni cDNA daha fazla sayida amplifikasyon çevrimi ile ortaya çikan bir floresan sinyaline neden olmaktadir. 2 primer ile amplifikasyon çevrimlerinin sayilari arasindaki fark dizilim ikamesine sahip bir cDNA'nin varliginin dogrudan tahminidir. Ilaveten, yontemin bilinen dizilimlerin bir karisimi içerisinde mutasyona ugratilmis dizilimlerin %1'ini tespit edecek kadar hassas oldugu da dogrulanmistir.
Tipik bir denemede, kanserli ve normal hasta dokularindan ekstrakte edilen RNA'lar ters- kopyalanmakta ve bahsedilen spesifik primerlerin her biri ile amplifiye edilmektedir.
Daha sonra her iki primer ile amplifikasyon çevrimleri arasindaki fark olçulmektedir.
Son olarak, dogal stop kodonu etkilendiginde harekete geçen ozgun proteinler uzerine yogunlasabiliriz. Ilgilenilen 17 genden 9'u için stop kodonunun buyuk oranda etkilendigi gosterilmistir. Bu karboksi-terminal ucunda ozgun bir dizilime sahip ayri spesifik protein populasyonlarina neden olmaktadir. Etkilenen genler için kanserli dokularin normal genlerden daha uzun olan %4 protein içerdigi tahmin edilmektedir.
Bu hipotezin isiginda, bol miktarda bulunan 60 plazma proteini (Sekil 13) analiz edilmis ve olasi PSP'ler için aranmistir. Bir PSP'nin yeteri kadar uzun ve antiJenik oldugu 22 gen bulunmustur (Sekil 18). Daha sonra olusan daha uzun varsayimsal protein dizilimleri aranmistir (Sekil 18b-c). Sonrasinda normal ve kanserli bireylerden elde edilen plazmalar içerisindeki varsayilan yeni peptidler aranmistir (Sekil 18). Bu 22 ilginç proteinden 3'u seçilmistir: APOAI, APOAII ve APOCII. Yukaridaki analize dayanarak kanserli hastalarin plazmasi içerisinde daha uzun proteinlerin bulunmasi beklenmektedir (13, 16 ve . Bu transkripsiyon infidelitesi peptid dizilimlerinin immunOJenik olmalari beklenmektedir ve bu ozgun dizilimlere yonelik antikorlar transkripsiyon infidelitesinin olçulmesi için spesilik ligandlari temsil etmektedirler (Sekil 14). Kyte-Doolittle analizi bu dizilimlerin hidrofobik oldugunu belirttiginden, bu üç ozgun proteinin sirkülasyon içerisine salgilanmasi beklenilmektedir (asagiya bakiniz).
Kanon/k stop kodonu /çeri'sihdeki ikame neden/'y/e ApoAii ve ApoCII 'nin post-stop- pepÜain/n (P5P) tan/m/anmasi Kanonik stop kodonlari içerisindeki baz ikamelerinden kaynaklanan PSP'ler asagidaki sekilde tanimlanabilir ve karakterize edilebilir. Ilgili PSPlerin immunoienik kisim(Iar)ini taniyan tavsan poliklonal antikorlari hazirlanir. Bu anti-peptid antikorlari gerçekten PSP'leri tanidiklarinin dogrulanmasi için saflastirilmis peptid kullanilarak nokta Iekeleme ile kontrol edilebilirler. Daha sonra PSP'ye karsi yonlendirilmis antikorlar kullanilarak kanser hastalarindan elde edilen plazma ornekleri uzerinde Western lekeleri (blot) gerçeklestirilebilir. Sekil 17a (sag panel) anti-PSP ApoAII antikorunun prostat kanseri hastalarindan elde edilen plazma ornekleri uzerinde gerçeklestirilen Western Iekelemesi içerisinde bir bandi tanidigini gostermektedir ve bu durum negatif kontrol olarak tavsan pre-immun serumu kullanildiginda gozlenmemektedir (Sekil 17a, sol panel). Ayrica metastatik fazdaki kanser hastalarinda da ApoAII bandi gozlenmektedir (Sekil 17b, sag panel). Bu bant ApoAII'nin dogal monomer formununki ile karsilastirildiginda biraz daha fazla molekul kutlesine (. Bu molekul kutlesi ilave peptid dizilimine dayanarak tahmin edilene karsilik gelmektedir. Bu bandin daha da karakterize edilmesi için iki-boyutlu Jeller de gerçeklestirilebilir.
Anti-PSP antikoru kullanilarak ApoAII'nin PSP formunun izole edilmesi için afinite kromatografisi deneyleri gerçeklestirilebilir (Sekil 17e). Anti-PSP antikorlari matris tanecikleri uzerinde hareketsiz hale getirilmekte ve takip eden kolon, plazma veya delipide edilmis HDL'nin varliginda inkube edilmekte, sonrasinda spesifik olmadan baglanan proteinlerin uzaklastirilmasi için sirasiyla yikanmakta ve son olarak deterjan veya kaotropik reaktifler ile ayristirilmaktadir. Ayristirilan kisim hem anti-PSP hem de ticari anti-ApoAII antikorlari kullanilarak Western blot ile analiz edilmektedir. Ticari anti- apoAII antikoru ile 9 kDa ve 11.4 kDa'da iki bant taninmakta ve anti-PSP antikoru ile ise sadece 11.4 kDa bandi taninmaktadir. Bu nedenle 9 kDa bandi dogal ApoAII formuna ve 11.4 kDa ise ApoAII'nin PSP formuna karsilik gelmektedir. Ayristirilan kisimdaki dogal ApoAII'nin varligi PSP ApoAII proteininin dogal indirgeyici olmayan kosullar altinda dogal ApoAII proteini ile dimerler olusturabilecegini gostermektedir. Aslinda, ApoAII plazma içerisinde normalde tek bir disulfid koprusu tarafindan baglanmis 2 monomerin bir dimeri olarak bulunmaktadir.
ApoAII temel olarak plazma içerisinde HDL kisminda konumlandirilmaktadir ve sirali ultra- santrifugasyon ile izole edilebilmektedir. Western blot PSP ApoAII'nin VLDL ve LDL içeren d<1.07 g/ml kismi içerisinde tespit edilmedigini, ancak HDL ve plazma proteinleri içeren d>1.07 g/ml kismi içerisinde tespit edildiklerini gostermektedir (Sekil 17c). HDL'nin saflastirilmasi ve yikanmasi (d1.07-1.21 g/ml) için ilave ultra-santrifugasyon adimlarinin ardindan, Western blot PSP ApoAII'nin lipoprotein eksik serum (LPDS) olarak da adlandirilan d>1.21 g/ml kismindan ziyade HDL kismi ile iliskili kaldigini ortaya koymaktadir. Bu durumun saflastirma adimlari esnasinda d>1.21 g/ml kisminin seyrelmesinden dolayi olmadigi gostermek uzere karsilik gelen miktarda bir plazma Western blot uzerinde gosterilmektedir. Lipoproteinlerin plazmadan Superose GB (Amersham, GE Healthcare) kullanilarak Jel filtrasyonu ile ayrilmasi PSP ApoAII'nin de HDL ile iliskili ApoAII ile benzer sekilde ayristigini gostermektedir.
PSP ApoAII ile HDL'nin iliskisi ApoAII'nin PSP formunun ApoAII'ninkine benzer sekilde saflastirilmasina olanak vermistir. Ilk olarak tum Iipidlerin uzaklastirilmasi için HDL delipide edilmistir. Sonuçta ortaya çikan Iipid-içermeyen protein topagi daha sonra bir indirgeme aJaninin varliginda veya yoklugunda ure orguanidin içeren 10 mM Tris tamponu içerisinde yeniden askiya alinmis ve bir Jel filtreleme kolonuna (ornek olarak, Superdex 200, Amersham-GE Healthcare) uygulanmistir. Western blot (Sekil 17d) ApoAII'Nin PSP formunun delipide edilmis HDL içerisinde hala mevcut oldugunu gostermektedir. Hazirlayici (preparatif) elektroporoz ile iIave saflastirma elde edilmistir (ornek: DE52). ApoAII'nin PSP formu Western blot ile takip edilmistir. ApoAII'nin saflastirilmis PSP formu daha sonra enzimatik olarak (tripsin) parçalanmis ve sonuçta ortaya çikan peptidler tam AA dizilimi için MS-MS uzerinde analiz edilmistir. Sonuçlar kanonik ST OP'un tercihen ya (U'dan C'ye) ya da (U'dan A'ya) ikame ile Arginin vasitasi ile degistirildigini ve bunu Serin, Valin, Glutamik asit, Threonin, Izolozin, Valin, Fenilalanin, Glutamik asit, Prolin, Glutamik asit, Losin, Alanin, Serin, Arginin'in takip ettigini gostermektedir. Bu ApoAII kanonik STOP'un by-pasini muteakip olusmasi belenen amino asit diziliminin birebir aynisidir. Bu nedenle ApoAII'nin kanonik UGASTOP'u Arginine yol açan AGA veya CGA ile ikame edilmektedir. Henuz incelenmemis olan bir hipotez ise UGA'nin Glisin'e yol açan GGA'ya donusturulmesidir.
Ancak bu varyantin kutle spektrometrisi ile tespit edilmesi mevcut durumda teknoloiik limitlerin otesindedir.
Diger bir ornek ApoCII'nin PSP ile gosterilmektedir. Sekil 17f, Western'lerin ticari olarak mevcut anti-ApoCII veya anti PSP ApoCII antikorlari ile gerçeklestirilmesi haricinde Sekil 17a'ninkine benzer bir deneyi gostermektedir. ApoAII'nin PSP'si için olanlara benzer bir prosedur ApoCII için de takip edilebilir. Ancak apoCII plazma içerisinde daha az bulunmaktadir. Bu nedenle MS-MS uzerinde analiz için yeterli miktarin elde edilmesi için PSP ApoCII içeren çok daha fazla miktarda plazma gerekmektedir.
Sonuçlar Burada çogunlukla kodlama diziliminin 3' ucunda ve mRNA'nin donusturulmemis bolgesinde meydana gelen baz ikamelerine yol açan ozgun bir mekanizma açiklanmaktadir. Bu baz ikameleri AA taniminin degismesinden dolayi protein AA dizilimlerinde degisikliklere, premature stop kodonlarinin ortaya çikmasina ve ozgun kodlama bolgelerinin sunulmasindan kaynaklanan dogal olusan stop kodonlarinda modifikasyonlara neden olmaktadir. Bu transkripsiyon infidelitesi olgusu ayrica ncRNA dunyasini da etkileyebilir ve bu RNA'lar tarafindan aracilik edilen duzenlemeleri de bozabilir. Bu durum çogu gen içerisinde DNA mutasyonuna yol açan herhangi bir açiklanan olguyu asan bir oranda meydana gelmektedir. Transkripsiyon infidelitesi kanser hucreleri içerisinde buyuk oranda artmaktadir. Transkripsiyon infidelitesi kanser patol0Jisinin, hastaligin siddetinin ve hastaligin iIerIemesinin anlasilmasi içi ozgun bir model sunmaktadir. Sadece ozgun transkriptomik ve proteomik deneylerin dizayn edilmesi için degil, spesifik tanilarin ve terapotiklerin gelistirilmesi için de onemli uygulamalara sahiptir.

Claims (12)

ISTEMLER
1. Bir memeli oznedeki bir kansere yatkinligin veya asamasinin belirlenmesi için bir yontem olup, bu yontem in vitro veya ex vivo olarak; a) bahsedilen ozneden alinan bir ornekteki nukleotid molekulleri içerisindeki bir veya daha fazla dizilim varyasyonunun varliginin veya oraninin degerlendirilmesini içermektedir; bahsedilen varyasyon(lar) nukleotid baz silmeleri (bosluklar), yerlestirmeler ve baz ailesi degisimlerinden seçilmektedir; ve/veya b) a) adimindaki dizilim varyasyonlarindan kaynaklanan bir veya daha fazla protein modifikasyonunun varliginin veya oraninin degerlendirilmesini içermektedir; bahsedilen dizilim varyasyonlari RNA ana transkripti içerisine DNA'nin transkripsiyon infidelitesi CI'I) vasitasi ile RNA' a transkripsiyonu esnasinda sokulmaktadir ve dizilim varyasyonlari ve/veya protein modifikasyonlarinin bahsedilen varligi veya orani bahsedilen oznede bir kansere yatkinligin veya asamasinin bir gostergesidir.
2. Bir anti-kanser ilacinin taranmasi, belirlenmesi veya optimize edilmesi için bir yontem olup, bu yontem bahsedilen ilacin Istem 1'de tanimlandigi gibi dizilim varyasyon(lar)inin ve/veya protein modifîkasyon(lar)inin oranini degistirip degistirmediginin degerlendirilmesi adimini içermektedir.
3. Bir memeli geninin in vitro olarak modifiye edilmesi için bir yontem olup, bu yontem azaltilmasi için genin diziliminin modifîye edilmesini içermektedir.
4. Bir anti-kanser ilaci veya ilaç adayinin etkisinin degerlendirilmesi için bir yontem olup, bu yontem bahsedilen ilacin Istem 1'de tanimlandigi gibi dizilim varyasyonlarinin ve/veya protein modifikasyonlarinin oranini degistirip degistirmediginin degerlendirilmesi adimini içermektedir ve bu tur bir degisiklik ilacin etkisinin bir gostergesidir.
5. Baz ailesi degisiklik(ler)inin A-›C, T-›G, G-›T, A-›T, A-›U, G-›C, G-›U, T-›A, C-›A, ve C-›G'den, tercihen A-›C ve T-›G'den seçildigi, Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine gore yontem.
6. Transkripsiyon infîdelitesi tarafindan olusturulan dizilim varyasyonlarinin ve/veya protein modifikasyonlarinin varligi veya oraninin en az bir spesifîk Iigand kullanilarak degerlendirildigi, Istemler 1 ila 5'ten herhangi birine gore yontem.
7. Kanser biyo-isaretleyicilerinin (biyo-markerlerinin) tanimlanmasi için bir yontem olup, bu yontem bir kansere sahip bir ozneden alinan bir ornekte Istem 1'de tanimlandigi gibi bir hedef protein veya RNA içerisinde TI tarafindan olusturulan dizilim varyasyonlarinin ve/veya protein modifîkasyonlarin varliginin tanimlanmasini ve tercihe bagli olarak bahsedilen dizilim varyasyonlarinin ve/veya protein modifikasyonlarinin dizilimlerinin belirlenmesini içermektedir ve bahsedilen dizilim varyasyonlari ve/veya protein modifikasyonlarina sahip bahsedilen protein veya RNA'lar bir biyo-isaretleyici olmaktadir.
8. Proteinin bir hucre yuzey proteini veya salgilanmis bir protein oldugu, tercihen bir plazma proteini veya bir reseptor oldugu, Istemler 1 ila 7'den herhangi birine gore yontem veya kullanim.
9. Proteinin SEQ ID NO:1-32'den seçilmis bir peptid dizilimi içerdigi, Istemler 1 ila 8'den herhangi birine gore yontem veya kullanim.
10. Dizilim varyasyonunun asagidaki; - A'nin ikamesinin tercihen A'dan once veya sonra C oldugunda gerçeklesmesi, - T'nin ikamesinin tercihen T'den once veya sonra G oldugunda gerçeklesmesi, - C'nin ikamesinin tercihen C'den once veya sonra G veya A oldugunda gerçeklesmesi, ve - G'nin ikamesinin tercihen G'dan once veya sonra A oldugunda gerçeklesmesi, kurallarini takip ettigi, Istemler 1 iIa 9'dan herhangi birine gore yontem veya kullanim.
11. Kanserin gogus veya kolon kanseri oldugu, Istemler 1 ila 10'dan herhangi birine gore yontem veya kullanim.
12. Bir memeli oznedeki bir kansere yatkinligin, varliginin veya asamasinin belirlenmesi için Istem 1'e gore bir yontem olup, bu yontem in vitro veya ex vivo olarak; a) bahsedilen ozneden alinan bir ornekteki nukleotid molekulleri içerisindeki bir veya daha fazla dizilim varyasyonunun varliginin veya oraninin degerlendirilmesini içermektedir; bahsedilen varyasyon(lar) A-›C ve T-›G nukleotid baz degisikliklerinden seçilmektedir; ve/veya b) a) adimindaki dizilim varyasyonlarindan kaynaklanan bir veya daha fazla protein modifikasyonunun varliginin veya oraninin degerlendirilmesini içermektedir; bahsedilen dizilim varyasyonlari RNA ana transkripti içerisine DNA'nin transkripsiyon infîdelitesi (TI) vasitasi ile RNA'ya transkripsiyonu esnasinda sokulmaktadir ve dizilim varyasyonlari ve/veya protein modifikasyonlarinin bahsedilen varligi veya orani bahsedilen oznede bir kansere yatkinligin, varliginin veya asamasinin bir gostergesidir.
TR2011/12295U 2006-07-20 2007-07-20 transkripsiyon infidelitesi, tespit edilmesi ve kullanımları TR201112295Y (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06291176A EP1887088A1 (en) 2006-07-20 2006-07-20 Transcription infidelity, detection and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201112295Y true TR201112295Y (tr) 2018-08-27

Family

ID=37496681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2011/12295U TR201112295Y (tr) 2006-07-20 2007-07-20 transkripsiyon infidelitesi, tespit edilmesi ve kullanımları

Country Status (18)

Country Link
US (1) US8288091B2 (tr)
EP (3) EP1887088A1 (tr)
JP (1) JP5298013B2 (tr)
KR (1) KR101502179B1 (tr)
AT (1) ATE524565T1 (tr)
AU (1) AU2007275068B2 (tr)
BR (1) BRPI0714563B8 (tr)
CA (1) CA2658305C (tr)
CY (2) CY1112125T1 (tr)
DK (2) DK2046986T3 (tr)
ES (2) ES2373428T3 (tr)
HU (1) HUE028135T2 (tr)
IL (1) IL196600A0 (tr)
PL (2) PL2046986T3 (tr)
PT (2) PT2468885E (tr)
SI (2) SI2468885T1 (tr)
TR (1) TR201112295Y (tr)
WO (1) WO2008009751A2 (tr)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2071334A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Transmedi SA Compositions and methods of detecting TIABS
EP2080812A1 (en) 2008-01-18 2009-07-22 Transmedi SA Compositions and methods of detecting post-stop peptides
EP2995688A1 (en) 2014-09-12 2016-03-16 Genclis Methods of prognosing and treating triple negative breast cancer
EP3387430A4 (en) * 2015-12-11 2019-08-14 Expression Pathology, Inc. SRM / MRM TESTS
JP6899890B2 (ja) * 2016-03-18 2021-07-07 ジェンクリＧｅｎｃｌｉｓ アレルギーの分子起源
WO2018187216A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Expression cassettes and methods for detecting transcription errors
EP3700856A4 (en) 2017-10-26 2021-12-15 Ultima Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR SEQUENCE CALL
WO2020185790A1 (en) 2019-03-10 2020-09-17 Ultima Genomics, Inc. Methods and systems for sequence calling
MX2022001664A (es) 2019-08-09 2022-07-19 Nutcracker Therapeutics Inc Aparato microfluídico y metodos de uso del mismo.
KR102334576B1 (ko) * 2019-08-12 2021-12-07 한국생명공학연구원 융합 단백질 및 이를 포함하는 바이오 이미징용 조성물
US20230343416A1 (en) * 2020-09-10 2023-10-26 Ultima Genomics, Inc. Methods and systems for sequence and variant calling
US20250263453A1 (en) * 2020-11-18 2025-08-21 Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University Erica Campus Method for preventing or treating cancer by blocking excessive production of phosphorylated vimentin
EP4162948A1 (en) 2021-10-05 2023-04-12 Genclis Transcription infidelity derived chimeric immunogens and uses thereof
WO2023104904A2 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Genclis The sars-cov-2 and variants use two independent cell receptors to replicate

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4979330A (en) 1989-10-10 1990-12-25 Rorant Julius W Suction insect trap device
US6120992A (en) 1993-11-04 2000-09-19 Valigene Corporation Use of immobilized mismatch binding protein for detection of mutations and polymorphisms, and allele identification in a diseased human
WO2001040804A2 (en) * 1999-12-03 2001-06-07 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Clearance of aberrant protein in correlation with disease
WO2002077286A1 (en) 2001-02-21 2002-10-03 Gene Check, Inc. Mutation detection using muts and reca
US20060110762A1 (en) * 2004-11-10 2006-05-25 Sanjay Kapil Porcine reproductive and respiratory syndrome virus receptor components and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
PT2046986E (pt) 2011-12-29
IL196600A0 (en) 2009-11-18
CA2658305A1 (en) 2008-01-24
PT2468885E (pt) 2015-11-26
AU2007275068A1 (en) 2008-01-24
PL2468885T3 (pl) 2016-04-29
DK2046986T3 (da) 2012-01-02
KR101502179B1 (ko) 2015-03-12
EP2046986A2 (en) 2009-04-15
SI2468885T1 (sl) 2016-02-29
WO2008009751A2 (en) 2008-01-24
EP2468885A2 (en) 2012-06-27
EP2468885A3 (en) 2012-08-29
ES2553435T3 (es) 2015-12-09
AU2007275068B2 (en) 2013-06-06
HUE028135T2 (en) 2016-12-28
US8288091B2 (en) 2012-10-16
DK2468885T3 (da) 2016-02-29
EP2046986B1 (en) 2011-09-14
BRPI0714563B1 (pt) 2019-07-02
US20090317386A1 (en) 2009-12-24
EP2468885B1 (en) 2015-08-19
JP2009544284A (ja) 2009-12-17
CY1116939T1 (el) 2017-04-05
BRPI0714563A2 (pt) 2015-04-14
ATE524565T1 (de) 2011-09-15
CY1112125T1 (el) 2015-11-04
PL2046986T3 (pl) 2012-02-29
JP5298013B2 (ja) 2013-09-25
CA2658305C (en) 2017-07-18
HK1128937A1 (en) 2009-11-13
BRPI0714563B8 (pt) 2021-05-25
SI2046986T1 (sl) 2012-05-31
EP1887088A1 (en) 2008-02-13
WO2008009751A3 (en) 2008-07-31
ES2373428T3 (es) 2012-02-03
KR20090052861A (ko) 2009-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201112295Y (tr) transkripsiyon infidelitesi, tespit edilmesi ve kullanımları
Liu et al. circFL-seq reveals full-length circular RNAs with rolling circular reverse transcription and nanopore sequencing
Knupp et al. NOVA2 regulates neural circRNA biogenesis
EP2080812A1 (en) Compositions and methods of detecting post-stop peptides
CN103134938B (zh) 适体在蛋白质组学中的用途
KR20130100051A (ko) 공간적으로 엔코딩된 생물학적 검정
CN102105585A (zh) 对dna进行定量或检测的方法
CN112442530B (zh) 检测cah相关真假基因的方法
Sirica et al. Advancing non-invasive prenatal screening: a targeted 1069-gene panel for comprehensive detection of monogenic disorders and copy number variations
WO2003107249A1 (en) Method for predicting a drug transport capability by abcg2 polymorphisms
Qi et al. Cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing unveils coordinated RNA and protein landscape in ovary at single-cell resolution
Alvikas et al. Modern Techniques for DNA, RNA, and Protein Assessment
Stingl Separate & analyze: Improved mass spectrometry-based clinical proteomics by fractionation
KIM et al. Review Recent methodological advances towards single-cell proteomics
CN121518658A (zh) 一种基于co ii基因测序的通用引物及其在多细胞种属鉴定和交叉污染检测中的应用
CN119242803A (zh) 一种检测白血病患者dna结构变异区域的方法及其应用
HK1128937B (en) Transcription infidelity, detection and uses thereof
Chisti et al. " GENETIC BASIS OF RARE DISEASES: ADVANCES IN DIAGNOSIS AND THERAPEUTIC APPROACHES
SYNtheSiS article watch
Clive article watch