KR20090052861A - 전사 부정확, 검출 및 이의 용도 - Google Patents

전사 부정확, 검출 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20090052861A
KR20090052861A KR1020097003423A KR20097003423A KR20090052861A KR 20090052861 A KR20090052861 A KR 20090052861A KR 1020097003423 A KR1020097003423 A KR 1020097003423A KR 20097003423 A KR20097003423 A KR 20097003423A KR 20090052861 A KR20090052861 A KR 20090052861A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
transcriptional
inaccuracy
protein
sequence
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020097003423A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101502179B1 (ko
Inventor
베르나드 비하인
Original Assignee
트랜스메디 에스에이
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 트랜스메디 에스에이 filed Critical 트랜스메디 에스에이
Publication of KR20090052861A publication Critical patent/KR20090052861A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101502179B1 publication Critical patent/KR101502179B1/ko
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Glass Compositions (AREA)
  • Pit Excavations, Shoring, Fill Or Stabilisation Of Slopes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 세포에서 전사 부정확의 신규한 기작을 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 시료에서 전사 부정확의 수준을 검사하는 조성물 및 방법, 뿐만 아니라 치료, 진단, 약물유전체학 또는 약물 디자인에 사용되는 이의 용도에 관한 것이다. 기술된 바와 같이, 본 발명은 약물의 디자인 및/또는 스크리닝을 위해서, 환자 또는 질병 프로파일링(profiling), 질병 심각도의 예측 및 약물 유효성의 평가에 있어서 증식 세포 질환을 검출, 모니터링 또는 치료하는데 특히 적당하다.

Description

전사 부정확, 검출 및 이의 용도{TRANSCRIPTION INFIDELITY, DETECTION AND USES THEREOF}
본 발명은 세포에서 전사 부정확(transcription infidelity)의 신규한 기작을 동정(identification)하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 시료에서 전사 부정확의 수준을 검출하는 조성물 및 방법, 뿐만 아니라 치료, 진단, 약물유전체학 또는 약물 디자인에 사용되는 이의 용도에 관한 것이다. 기술된 바와 같이, 본 발명은 약물의 디자인 및/또는 스크리닝을 위해서, 환자 또는 질병 프로파일링(profiling), 질병 심각도의 예측 및 약물 유효성의 평가에 있어서 증식 세포 질환을 검출, 모니터링 또는 치료하는데 특히 적당하다.
발명의 도입
핵산 DNA 및 RNA은 세포 핵(DNA)에 유전 정보를 저장하고 단백질을 생성하기 위한 메신저 RNA를 발생하는 전사 공정 이후에 세포질로 유전 정보를 전달하는 거대분자이다. 상기 둘 다는 뉴클레오티드로 불리는 모노머로 이루어진 직쇄형 폴리머이다. DNA 및 RNA 각각은 4개의 뉴클레오티드 형태의 조합을 나타낸다. 모든 뉴클레오티드는 공통의 구조를 갖는다: 유기 염기[DNA에 있어서 아데닌, 시토신, 티민 및 구아닌 (A, C, T, G) 및 RNA에 있어서 아데닌, 시토신, 우라실 및 구아닌 (A, C, U, G)]에 차례로 연결된 펜토스에 포스포디에스테르 결합에 의해서 연결된 포스페이트기. RNA에서 상기 펜토스는 리보스이고, DNA에서 펜토스는 데옥시리보스이다. DNA 분자는 이중 나선 구조로 배열된 정연한 뉴클레오티드의 이중 가닥으로 조직되었다. RNA 분자는 주로 하기의 4가지 형태의 분자를 수득하는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드이다: (1) 메신저 RNA (mRNA)(DNA로부터 전사되어 세포질내 단백질로 해독되는 단일 가닥 뉴클레오티드임), (2) 전달 RNA (tRNA)(잘 정의된 3차원 구조를 채용하고, 해독 과정에서 특이적 AA 서열을 갖는 단백질을 형성하도록 폴리펩티드 사슬로 전달되는 특이적 아미노산(AA)을 결합함), (3) 리보좀 RNA (rRNA)(특이적 단백질과 함께 리보좀을 포함하는 더 큰 분자이며, 구조는 AA의 조합체를 단백질로 처리하여 mRNA에서 주어진 순서로 존재하는 코돈(하나의 코돈 = 3개의 뉴클레오티드에 의해서 특이적 서열에 의해서 정보를 제공하는 구조임) 및 (4) 비(非)-코딩 RNA(ncRNA)로 불리는 쇼트 조절 RNA (short regulating RNA).
mRNA의 서열은 그후 다른 기호, 예컨대 해독 과정에 의해서 AA 기호로 형질전환된다.
여기서, 본 발명자는 먼저 전사의 정확도, 예컨대 DNA 정보를 mRNA로 전달하는 것이 병변 세포, 특히 암세포에서 크게 감소되는 것을 입증하였다. 암세포에서 전사 정확도의 결여는 모든 암 및 보고된 실시예에서 시험된 대부분의 유전자, 뿐만 아니라 이용가능한 데이터베이스에 존재하는 대부분의 전사에 영향을 주며, 수 개의 직접적이고 중요한 함의(implication)를 갖는 일반적 현상이다. 특히, 전사 부정확의 발견은 병변 조건의 조사에 있어서 현재 사용된 단백질체(proteomic) 및 전사체학(transcriptomic) 접근법의 개선시킨다. 전사 부정확의 발견은 이의 심각도와 관련하여 질병을 더 잘 분류할 수 있으며, 치료 효과의 예측을 개선하고, 전사 정확도의 변형 또는 결여를 보정할 수 있는 역량에 근거하여 약물의 유효성을 스크린하는 신규한 방법을 디자인할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 약물의 개발 및 진단의 유용성, 뿐만 아니라 환자의 치료, 검출 및 모니터링 방법 및 약물 유효성을 갖는다.
하기에 기술된 발견의 효과를 이해하기위해서, 현재 DNA를 RNA로의 전사에서 절대 정확도는 정상 세포 기능에 있어서 요구되는 것으로 사료되는 것으로 인정되는 것이 중요하다. 그러나, 현재 중요하지만 해결되지 않은 문제가 계속되고 있다. 실제로, 사람 게놈의 시퀀싱(sequencing) 및 주석(annotation)으로 30,000-40,000개의 유전자가 코딩된다는 의견을 나타낸다. 상기 평가는 단백질체 방법에 의해서 동정될 수 있는 현재 단백질 수보다 훨씬 낮게 유지된다: 300,000 미만의 단백질이 동정되었다. 상기 차이점을 조정하기위해서, 한개의 유전자는 선택적 스플라이싱(splicing) 과정을 통해 상이한 단백질을 코딩하는 수개의 상이한 mRNA를 생성할 수 있다는 것을 제안하였다. 선택적 스플라이싱으로 예비-메신저 RNA(pre-messenger RNA, pmRNA)의 상이한 부분을 제거함으로써, 특이적 인트론(intron)에 해당하는 상이한 원소를 제거하여, 다른 성숙한 mRNA를 생성한다. RefSeq 데이터베이스의 분석으로 6946개 유전자에 해당하는 11259개 전사를 포함하는 것을 나타 낸다. 그러므로, 선택적 스플라이싱으로 76%까지 전사 불균일성(transcripts heterogeneity)이 증가된다. 본 발명자가 본원에 기술한 기작은 선택적 스플라이싱과는 다르며, 더 큰 단백질 불균일성을 유도한다. 실제로, 본 발명자는 코딩된 AA에서의 변화, 더 짧은 단백질 이소 형태를 수득한 미성숙 정지 코돈의 도입, 연장된 단백질 이소 형태를 수득하는 신규한 코딩 서열의 도입을 수반하는 자연의 정지 코돈을 변경시키는 mRNA 서열의 비(非)-랜덤 변형의 발생(occurrence)을 입증하였다. 갭(gap)의 도입 및 삽입으로 mRNA 리딩 프레임(mRNA reading frame)을 변경함으로써 뜻밖의 단백질 서열을 형성한다. 본 발명에 기술된 데이터는 전사 부정확 현상이 정상 세포에는 존재하지만, 병변 세포, 가령 암-유래된 세포에서는 크게 증가되는 것을 나타낸다. 그러므로, 전사 부정확(transcription infidelity, TI)은 DNA에서 RNA로 전달된 정보의 다양화에 기여하는 것을 나타낸다. 본 발명자에 의해 수득된 전사 부정확은 임의적으로 발생하지는 않지만 특이적 규칙을 따르며 TI 이벤트에 의해서 영향을 받는 염기인 b0 주변의 상황이 중요하다.
RNA 불균일성은 게놈에서 발생하지 않지만 RNA 수준:RNA 에디팅에서 발생하는 것을 설명하기위해서 고려될 수 있다. 그러나, RNA 에디팅은 2가지 형태의 TI 이벤트인, 갭의 도입 및 삽입을 설명할 수 없다. RNA 에디팅은 진핵생물에서 mRNA 및 tRNA에서 포스트-전사(post-transcriptional) 염기 변화를 특징으로 한다. 공지된 치환 에디팅 이벤트의 대부분은 C에서 U 또는 A에서 I(G로 읽음) 전환으로 구성된다(Gott, J. M. & Emeson, R. B. (2000) Annu Rev Genet 34, 499-531 - Maas, S. & Rich, A. (2000) Bioessays 22, 790-802. - Niswender, C. M. (1998) Cell Mol Life Sci 54, 946-64). 다른 연구로 상기 전환은 디아민화 기작을 통해 일어나며, 아데노신 및 시티딘 디아미나제에 의해서 촉매화되는 것을 보여준다. 하나의 다른 치환 에디팅 이벤트는 "U에서 C로" 전환이다. 미시적 가역성(microscopic reversibility)은 시티딘 디아미나제 반응이 상기 전환을 발생하기위해서 되돌아갈 수 있다는 것을 나타내며, 또한 CTP 합성 효소-타입 활성을 초래할 수 있다는 것을 제시하였다. 몇개의 실시예에서, RNA 에디팅은 정상 세포에 대한 암 세포에 대해서 특이성이 있다고 개시되어 있다. 더우기, 상기 현상의 비율은 암 조건에서 영향을 받을 수 있다.
암 세트에서, 본 발명자는 cDNA 수준 5.7% C → T, 9.2% T → C 및 4.7% A → G 변경 수준에서 관찰된다. 그러므로, mRNA 에디팅은 본원에 기술된 단일 염기 치환의 20% 이상을 설명할 수 없다. 실제로, 대부분의 공통 염기 치환: A → C (24.6%) 및 T → G (16.8%)은 공지된 사람의 효소적 RNA 에디팅 과정(human enzymatic RNA editing processes)에 의해서 현재 설명될 수 없는 염기 패밀리 변경을 나타낸다.
또한, 전사 부정확은 mRNA 에디팅과 다른 기작(또는 기작들)을 통해서 염기 결실 및/또는 삽입을 일으킬 것으로 기대된다. 더우기, 최근 연구에서는 dbSNP 리코드의 수(Single Nucleotide Polymorphism database)가 사실상 에디팅 부위인 것을 나타낸다(Eisenberg, E. et al. (2005) Nucleic Acids Res.33 (14), 4612-7). 본 발명자의 접근법에서, dbSNP로부터의 모든 SNPs는 고려되지 않았으며, 그러므로 에디팅 부위에 해당하는 공지된 SNPs 또는 거짓(false) SNPs는 배제되었다. 관찰 된 암 mRNA 불균일성을 설명하기위한 기작은 전사 부정확이다.
발명의 요약
본 발명은 세포, 특히 포유류 세포에서 전사 부정확을 사용, 검출, 또는 변경하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 예를 들면 전사 부정확의 증가되거나 또는 감소된 수준에 의한 질병 또는 상기 수준과 결합된 질병을 검출 및/또는 치료하기위해 치료 및 진단 목적에 특히 적당하다.
본 발명의 특정 목적은 피험체에서 질병의 존재 또는 단계를 검출하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 피험체로부터 유래된 시료에서 전사 부정확의 존재 또는 비율을 (시험관내 또는 생체외에서) 평가하는 단계를 포함하며, 상기 존재 또는 비율은 상기 피험체에서 질병의 존재 또는 단계의 지표(indication)가 된다.
본 발명의 부가의 목적은 약물을 스크리닝, 동정 또는 최적화하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 약물이 유전자의 전사 부정확 비율을 변경시키는지(예컨대, 감소 또는 증가) 여부를 평가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 부가의 목적은 이를 필요로 하는 피험체를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 포유류 유전자의 전사 부정확 비율을 변경하는(예컨대, 감소 또는 증가하는) 화합물의 유효량을 피험체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 부가의 목적은 사람 또는 동물의 치료 방법, 특히 이에 한정되는 것은 아니지만 암, 면역 질환, 염증 질환 또는 노화를 포함하는 증식 세포 질 환(proliferative cell disorder)을 치료하는데 사용되는 약학적 조성물의 제조에 대한 포유류 유전자의 전사 부정확 비율을 변경하는데(예컨대, 감소 또는 증가하는데) 사용되는 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 부가의 목적은 약물 또는 후보 약물의 유효성을 평가하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 약물이 포유류 유전자의 전사 부정확 비율을 변경하는지(예컨대, 감소 또는 증가하는지) 여부를 평가하는 단계를 포함하며, 상기 변경은 약물 유효성의 지표가 된다.
본 발명은 시료에서 전사 부정확(의 수준)를 검출 또는 측정하는 방법 및 생성물(가령, 프로브, 프라이머, 항체 또는 이의 유도체), 뿐만 아니라 해당하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 단백질 또는 핵산에서 전사 부정확 서열을 동정하는 방법, 뿐만 아니라 이의 용도(예컨대, 마커, 면역원) 및/또는 이의 특정 리간드를 생성하는 방법에 관한 것이다.
상기 측면에서, 본 발명은 바이오마커를 동정 및/또는 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 피험체로부터 유래된 시료에서 표적의 단백질 또는 핵산에서 전사 부정확 부위(들)의 존재를 동정하고, 선택적으로 상기 전사 부정확 부위(들)의 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 특정 및 바람직한 실시양태에서, 표적 단백질은 세포 표면 단백질 또는 분비 단백질, 특히 세포 표면 단백질 또는 혈장 단백질이다.
본 발명의 부가의 목적은 특성 또는 병리학적 조건에 특이적인 리간드를 동 정 및/또는 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 특성 또는 병리학적 조건을 갖는 피험체로부터 유래된 시료에서 하나 또는 수개의 표적 단백질 또는 핵산에서 적어도 하나의 전사 부정확의 존재를 동정하고, 선택적으로 상기 적어도 하나의 전사 부정확 부위의 서열을 결정하며, 전사 부정확에 의해서 형성된 적어도 하나의 단백질(또는 영역) 또는 핵산에 특이적으로 결합된 리간드를 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명은 특히 증식 세포 질환, 가령 암, 면역 질환, 염증 질환 또는 노화의 바이오마커를 동정하는데 적당하다. 특히 포유류 피험체에서 상기 질환에 특이성이 있는 리간드, 특히 피험체에서 증식 세포 질환의 존재 또는 심각도를 검출할 수 있는 리간드를 제조하는데 유용하다.
본 발명의 부가의 목적은 전사 부정확에 의해서 형성된 단백질(또는 영역) 또는 핵산을 특이적으로 결합하는 리간드에 관한 것이다. 상기 리간드는 항체(또는 절편(가령, Fab, Fab', CDR, 등) 또는 이의 유도체, 이후에 기술됨)일 수 있으며, 이는 전사 부정확에 의해서 형성된 단백질(또는 영역)을 특이적으로 결합한다. 상기 리간드는 또한 전사 부정확(예컨대, 프로브, 프라이머, RNAi (간섭 RNA) 등)에 의해서 형성된 핵산을 특이적으로 결합하는 핵산일 수 있다.
본 발명의 부가적 측면은 전사 부정확에 의해서 형성된 단백질, 특히 포유류 단백질, 더 바람직하게는 사람의 단백질의 영역을 포함하는 펩티드에 관한 것이다. 펩티드는 전형적으로 합성 펩티드, 예컨대 화학 합성, 아미노산 합성 및/또는 연장, 단백질 분해, 펩티드 어젬블링(assembling), 재조합 발현 등에 의해서 인위적 으로 제조된 펩티드이다. 상기 펩티드는 전형적으로 상기 단백질의 C-말단 절편의 서열을 포함한다. 상기 펩티드는 바람직하게는 100, 80, 75, 70, 65, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25 또는 20개 이하의 아미노산(비록, 다른 실시양태에서 펩티드 길이는 더 길 수 있음)을 포함할 수 있다. 상기 단백질은 세포 표면 단백질(예컨대, 수용체 등), 분비 단백질(예컨대, 혈장 단백질 등), 또는 세포내 단백질일 수 있다.
본 발명의 부가적 측면은 상기에 정의된 바와 같이 전사 부정확에 의해서 형성된 펩티드를 면역원으로서 사용하는 펩티드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기에 정의된 바와 같이 전사 부정확에 의해서 형성된 단백질의 일부를 포함하는 펩티드, 및 선택적으로 적당한 담체, 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 부가적 측면은 항체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기에 정의된 바와 같이 전사 부정확에 의해서 형성된 펩티드로 비(非)-사람 포유류를 면역화하고 상기 펩티드 또는 해당하는 항체-생성 세포를 결합하는 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 항체의 유도체가 제조될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 (i) 전사 부정확에 의해서 형성된 단백질 영역을 동정하는 단계 및 (ii) 상기 영역을 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 항체의 유도체가 제조될 수 있다.
본 발명의 부가적 측면은 전사 부정확에 의해서 형성된 단백질의 일부를 특 이적으로 결합하는 항체, 또는 실질적으로 동일한 항원 특이성을 갖는 항체의 유도체에 관한 것이다. 상기 항체는 폴리클로날(polyclonal) 또는 모노클로날(monoclonal)일 수 있다. 용어인 유도체(derivative)는 절편(예컨대, Fab, Fab', CDR, 등) 또는 다른 유도체, 가령 단일 사슬 항체, 이관능성 항체, 사람화 항체, 사람 항체, 키메라 항체 등을 포함한다.
본 발명의 부가적 측면은 상기에 정의된 바와 같이 분자에 콘쥬게이트된 항체 또는 이의 유도체에 관한 것이다. 상기 분자는 약물, 레이블(label), 독성 분자, 방사성 동위 원소(radioisotope) 등일 수 있다.
본 발명은 또한 상기에 정의된 바와 같이 유전자의 전사 부정확을 (예컨대 시험관내에서) 검출 또는 정량화하는데 사용되는 항체 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기에 정의된 바와 같이 약제 또는 진단 제제로서 사용되는 콘쥬게이트 항체 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 전사 부정확에 의해서 형성된 단백질 또는 핵산을 특이적으로 결합하는 지지체상에 고정시킨 시약을 포함하는 장치 또는 생성물에 관한 것이다. 상기 시약은 예를 들면 프로브 또는 항체 또는 이의 유도체일 수 있다.
본 발명의 부가적 측면은 세포 또는 조직 또는 생물체에서 전사 부정확을 일으키거나 또는 유도하거나 또는 자극하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 전형적으로 유전자 치료 벡터(gene therapy vector)에 의해서 정상 게놈 서열로 전사 부정확 부위를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 변형은 세포 또는 조직의 파괴를 일으킨다. 특히, 세포 독성 단백질 또는 화합물을 제조하는 유전자 서열에서 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 형성할 수 있다. 또한, 질병에 걸린(또는 표적) 세포에서 독성 또는 치료 분자를 사용하여 표적화될 수 있는 특이적 바이오마커의 발현을 일으킬 수 있다. 상기 접근법을 사용하여, 전사 부정확이 발생하거나 또는 특정 비율을 초과하는 경우 세포사 또는 치료될 수 있다.
상기 관점에서, 본 발명의 부가의 목적은 이를 필요로 하는 피험체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 피험체의 세포로 전사 부정확 부위(들)를 포함하는 핵산을 도입하고 상기 핵산의 발현으로 상기 피험체를 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 부가적 목적은 이를 필요로 하는 피험체에서 전사 부정확을 일으키거나 또는 자극하거나 또는 조절하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 피험체의 세포로 전사 부정확 부위(들)를 포함하는 핵산을 도입하는 단계를 포함한다.
본 발명의 부가적 목적은 사람 또는 동물의 치료 방법에 사용하기위한 약학적 조성물을 제조하는데 사용되는 전사 부정확 부위(들)를 포함하는 핵산의 용도에 관한 것이다. 상기 유전자는 바이러스 유전자, 박테리아 유전자 등과 같은 병원균(pathogenic agent)으로부터의 유전자 또는 포유류 유전자를 포함하는 유전자일 수 있다. 상기 관점에서, 본 발명은 병원균(pathogen)에 의한 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 병원균에 의해서 코딩되는 유전자의 전사 부정확을 일으키거나 또는 자극하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 감소된 전사 부정확을 갖는 재조합 폴리펩티드를 시험관내에서 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 재조합 폴리펩티드에서 미세불균일성(microheterogeneity)을 감소시킨다. 상기 방법은 전사 부정확의 발생을 감소시키기위해서 조절된 코돈 사용을 갖는 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포를 사용하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 전사 부정확의 발생을 감소시키는 화합물 또는 치료의 용도를 포함할 수 있다. 상기 방법은 원핵 생물 또는 진핵 생물 숙주 세포, 예를 들면 E. coli 또는 CHO 균주에서 사용될 수 있다.
본 발명은 포유류 피험체, 특히 사람 피험체에서 증가되거나 또는 감소된 전사 부정확 비율, 가령 증식 세포 질환(예컨대, 암), 면역 질환(예컨대, 자가면역질환(다발 경화증, 근위축성 측삭경화증(ALS), 이식편 거부반응), 노화, 염증 질환, 당뇨병 등과 결합된 다양한 병리학적 상태를 검출, 모니터 또는 치료하고/하거나 치료적 활성 약물을 제조, 디자인 또는 스크린하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 원핵 세포, 하등 진핵생물(예컨대, 효모), 곤충 세포, 식물 세포, 균류(fungi) 등과 같은 다른 조직 또는 세포 형태에서 전사 부정확을 검출, 모니터, 조절 또는 표적화하는데 사용될 수 있다.
도 1: cDNA 라이브러리 구성 및 시퀀싱의 원리.
도 2: (a-q) 분석에 사용되는 mRNA 참고 서열들. 상기 블라스트(blast)의 뒤틀림을 회피하기위해서, mRNA 참고 서열의 폴리A 테일(tail)이 전체적으로 제거 된다. 도 2r은 시험된 유전자의 목록을 제공한다.
도 3: 전형적인 MegaBLAST 출력 파일.
도 4: 각 연구된 유전자에 있어서 특정 위치에서 뉴클레오티드 서열 편차의 퍼센트.
도 5: TPT1, VIM = ESTs의 수 및 비율 시험 분석.
도 6: 전자 필터의 순차적 적용 이전 또는 이후에 EST에서 변동. Clip 400 및 세포주 제거 효과.
도 7: DNA 상황(context): (a) 염기 b0 불균일성에 있어서 pmRNA 염기 조성물의 효과. (b) 각 치환된 염기에 있어서 대체 염기의 조성물. (c) 통계적으로 상당한 C>N 시험안에서 영향을 받고 대체 염기의 재분배. (d) b-1 또는 b+1의 반복에 해당하는 치환 염기에 있어서 pmRNA 염기 조성물의 효과.
도 8: VIM에 대한 실질상 변이체 mRNA 및 단백질.
도 9: 코딩 효과(coding impact)
도 10: 정지 코돈이 통계적으로 영향을 받은 경우 목적의 단백질 = 아미노산 서열.
도 11: DHPLC = 검출 원리 및 한계.
도 12: DHPLC = 프라이머 및 기대된 PCR 생성물.
도 13: 60개의 연구된 단백질 목록.
도 14: 항체 제조.
도 15: DHPLC 결과.
도 16: Sanger 감수성(sensibility)
도 17: 암 환자 혈장에서 APOAII 및 APOCII PSP의 검출.
도 18: 혈장 단백질에서 가능한 PSP.
도 19: mRNA 서열 치환 예측의 평가
정의
전사 부정확
용어인 전사 부정확(transcription infidelity)은 수개의 별개의 RNA 분자가 단일 유전자 서열로부터 세포에서 제조되는 신규한 기작을 나타낸다. 상기 새로운 확인된 기작은 하기에 기술된 바와 같이 유전자에 영향을 주며, 비(非)-램덤이고 특정 규칙을 따른다. 실시예에서 개시된 바와 같이, 전사 부정확은 RNA 분자에서 치환, 결실 및 삽입을 도입할 수 있고, 단일 유전자로부터 단백질의 다양성을 형성할 수 있다. 전사 부정확은 비(非) 코딩 RNA 서열에 영향을 줄 수 있으며, 이들의 기능을 조절한다. 그러므로, 전사 부정확의 측정, 조절 또는 표적화 방법은 질환을 검출 또는 치료, 뿐만 아니라 약물 개발에 있어서 새로운 접근법을 나타낸다.
전사 부정확 부위
본 발명의 명세서 안에서, 용어 전사 부정확 부위(Transcription Infidelity Site)는 전사 부정확에 의해서 영향을 받는 서열 및/또는 위치를 나타낸다. 상기는 전사 부정확의 결과로서 생성된 적어도 하나의 변형을 포함하는 핵산 또는 아미노산 영역일 수 있다. 상기 변형은 예를 들면 코딩 프레임내 스위치(삽입 및/또는 결실), 정지 코돈의 도입 또는 억제, 새로운 개시 코돈의 도입, 뉴클레오티드(들) 치환(들)(AA의 수반 또는 변경되지 않음) 등에서 기인될 수 있다. 전사 부정확 부위는 전사 부정확으로부터 기인된 1개 또는 수개의 서열 변이를 포함할 수 있다. 전사 부정확 부위는 예를들면 1개의 변형된 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 내지 예를들면 150개의 변형된 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기들, 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 전사 부정확 부위는 전형적으로 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 아미노산 변형(예컨대, 치환, 결실, 삽입, 역위 등)에 의한 정확한 전사로부터 기인된 서열과는 다르다. 전사 부정확에 의해서 형성된 영역 또는 단백질(TI-단백질)은 전형적으로 1-50개의 아미노산(또는 그 이상)을 포함하며, 적어도 하나의 변형된 아미노산 잔기를 갖는다. 핵산 전사 부정확 서열은 전형적으로 1-150개의 뉴클레오티드(또는 그 이상)를 포함하며, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 잔기를 갖는다.
전사 부정확 규칙 및 동정
본 출원에서 정의된 바와 같이 전사 부정확의 검출 및/또는 특정 규칙의 특이적 기술에 근거하여, 유전자 또는 단백질에 있어서 전사 부정확 부위를 예측 및 동정할 수 있다. 상기 부위는 또한 주어진 RNA에 대해서 이용할 수 있는 서열을 정렬하고 염기 치환을 동정함으로써 수득될 수 있다. 이들은 최종적으로 다양한 기술, 예를 들면 예측된 TI-단백질에 특이적인 리간드를 사용함으로써 입증될 수 있다.
전사 부정확 부위를 동정하는 특정 방법은 하기를 포함한다:
- 주어진 유전자, RNA 또는 cDNA 분자의 서열, 또는 이의 일부를 준비하는 단계, 및
- 상기 서열안에서, 전사 부정확으로부터 기인된 뉴클레오티드 변형(예컨대, 치환, 결실, 삽입, 역위)의 존재를 동정하고, 하기 (iii)에 기술된 바와 같이 전사 부정확 규칙을 적용하는 단계.
전사 부정확 부위를 동정하는 부가의 특정 방법은 하기를 포함한다:
- 주어진 단백질의 서열, 또는 이의 일부를 준비하는 단계, 및
- 상기 서열안에서, 전사 부정확으로부터 기인된 아미노산 변형(예컨대, 치환, 결실, 삽입, 역위)의 존재를 동정하고, 하기 (iii)에 기술된 바와 같이 전사 부정확 규칙을 적용하는 단계.
분자에서 전사 부정확으로부터 기인된 변화의 존재는 하기를 포함하는 3개의 단계 과정으로 동정될 수 있다:
(i) MCFA(Multiple Correspondence Factorial Analysis) 인자들에 있어서 이차 식별(quadratic discrimination)에 의지하는 러닝 머신(learning machine)으로 전사 부정확을 동정하는 단계,
(ii) 동일한 방법으로 전사 부정확 부위의 카테고리(b-1 또는 b+1 또는 그외)의 동정, 및
(iii) 하기의 전사 부정확 규칙을 사용하여 대체 염기의 예측:
Figure 112009010362612-PCT00001
하나로(singleton)로 존재하는 염기, 예를들면 선행되지 않거나 또는 이후에 오는 염기에 있어서, 치환된 염기는 치환된 것(b-1 카테고리의 경우)에 선행하는 염기와 동일하거나 또는 다음에 오는 치환된 염기(b+1 카테고리의 경우)와 동일하다. 예를 들면 CAT는 CCT (b-1 규칙)가 되고; ATG는 AGG (b+1 규칙)가 될 것이다;
Figure 112009010362612-PCT00002
치환이 3개의 연속된 A내에서 일어나는 경우, 두번째 A의 치환은 우선적으로 C가 된다;
Figure 112009010362612-PCT00003
치환이 3개의 연속된 T내에서 일어나는 경우, 두번째 T의 치환은 우선적으로 C가 되고, 그 후 A가 되고, 그후 G가 된다;
Figure 112009010362612-PCT00004
C와 G의 스트레치(stretch)는 두번째에서 드물게 치환되지만, 그러나 두번째 C의 치환은 우선적으로 A가 되고, 두번째 G의 치환은 우선적으로 C가 된다;
Figure 112009010362612-PCT00005
다른 경우에, 대체 염기는 우선적으로 C이다.
표적 단백질 또는 핵산의 서열안에서 전사 부정확을 동정하는 부가의 방법은 예를들면 존재하는 발현 서열 태그(ESTs)의 비교, 동정된 서열의 직접 증폭 및 특정 서열화 방법에 의한 증폭 생성물의 서열화를 포함한다(Sanger, chemical, Pyro-sequencing). 상기 접근법은 AA 변경, 단백질 길이의 변형 등을 포함하는 변이체 서열을 수득한다. 전사 부정확 부위를 포함하는 mRNA 또는 cDNA를 선택적으로 매칭하는 올리고뉴클레오티드가 디자인되고, 서열 풀(pool)로부터 전사 부정확 부위에 의해 뉴클레오티드를 선택적으로 증폭시킨다. TI-단백질 표적화 항체가 제조될 수 있다.
선택적으로, 서열 분석 또는 생물정보 규칙에 의한 전사 부정확 부위를 동정할 수 있다. 수득된 서열은 형질감염 벡터에서 클로닝될 수 있다. 또한, 수용체 유전자 프레임에서 상기 전사 부정확 서열을 포함하는 구조로 디자인할 수 있으며, 전사 부정확이 발생하는 경우에만 전사 및 해독될 것이다. 수용체 유전자는 표적 세포를 민감하게 만들거나 또는 독성 노출에 저항하는 효소 또는 형광 단백질 또는 유전자일 수 있다.
전사 부정확 부위(또는 치환)를 동정할 수 있는 상세한 방법은 하기에 기술된 바와 같은 TDG 방법을 포함한다.
Pan and Weissman and Liu et al.(PNAS, 2002, 99(14), 9346-9351 and Anal Biochem. 2006 Sep 1;356(1):117-24)에 의해 기술된 기술은 RNA에서 전사 부정확 부위(들)를 검출하기위해서 조절될 수 있다. 상기 기술은 복합 혼합물로부터 DNA 듀플렉스를 포함하는 별개의 풍부한 미스매치(mismatch)할 수 있는 효소, 티민 DNA 글리코실라제(TDG)의 사용에 근거한다. 상기 효소는 특이적으로 뉴클레오티드 미스매치를 인식하고 비염기성 부위를 생성한다(데옥시리보스와 DNA 염기들 중 하나 사이의 결합이 분해됨). 그후 TDG는 상기 비염기성 부위와 비가역적으로 결합할 수 있으므로, 미스매치-포함 DNA 절편의 친화성 정제에 사용될 수 있다. 전형적인 실험에서, RNA는 2개의 세포 타입(정상 세포 및 암 세포)으로부터 추출되며, 가역적으로 전사되어 이중가닥 cDNA를 만든다. 각 시료의 열 변성 및 느린 복귀(slow renaturation) 이후에, 미스매치(들)을 갖는 cDNA가 생성되고, 완전한 듀플렉스로부터 분리될 수 있다. 그후 상기 cDNA는 직접 시퀀싱에 의해서 분석되거나 또는 DHPLC에 의해서 비교된다(이후 참조).
전사 부정확 부위 또는 돌연변이화를 동정하기위해서 조절될 수 있는 부가의 기술은 예를들면 US6,329,147; US4,979,330; WO02/077286 또는 US6,120,992에 기술되었다.
전형적으로, 전사 부정확 부위를 동정하는 방법은 동정된 서열을 포함하는 분자를 제조함으로써 전사 부정확 부위의 서열을 유효화하는 단계, 상기 분자에 특이적으로 결합하는 리간드를 생성하는 단계, 및 생물학적 시료에서 상기 리간드에 의해서 특이적으로 인식된 항원의 존재를 입증하는 단계를 추가로 포함한다.
핵산의 전형적인 전사 부정확 서열은 전사 부정확에 의해서 발생되는 적어도 하나의 염기 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 길이 1-150개의 뉴클레오티드 서열이며, 바람직하게는 실시예 5에 기술된 바와 같은 규칙을 따른다. 전사 부정확 서열은 더 높을 수 있다.
TI-단백질의 전형적인 영역은 전사 부정확에 의해서 발생하는 적어도 하나의 아미노산 치환(또는 염기 결실 또는 삽입에 의해서 기인된 코딩 프레임에서 변형에 의한 더 큰 변화)를 포함하는 길이 1-50개의 아미노산의 아미노산 서열이며, 바람직하게는 실시예 5에 기술된 바와 같은 규칙을 따른다. TI-단백질의 영역이 더 높다. TI-단백질 영역의 예가 예를들면 도 13 및 도 14에서 실험 부분에 제공된다.
전사 부정확의 검출 또는 결정
본 발명은 DNA에서 RNA로의 전사 중 또는 전사 직후에 발생하는 자연 서열 이상의 높은 비율의 예기치 못한 발견에 근거한다. 상기 공정은 정상 세포에서 존재할 수 있지만, 암세포와 같은 병변 세포에서 크게 증가될 수 있다. DNA에서 RNA로의 전사는 하나에서 하나로의 염기 상보성으로 정의되는 것과는 다른 규칙을 따르는 서열 변이를 도입하는 발견으로 전사 부정확에 의해서 형성되는 핵산 또는 단백질에 특이적인 신규한 시약(예컨대, 프로브, 프라이머, 항체, 압타머(aptamer) 등)을 합리적으로 디자인할 수 있다. 그러므로, 상기 시약은 전사 부정확을 검출 또는 측정할 수 있으며, 정상 상태와 질병 상태 사이를 구별할 뿐만 아니라 전사 부정확을 나타내는 세포로 분자를 표적화할 수 있다.
또한, 본 발명은 질병(예컨대, 암) 심각도를 예측하는 시약(예컨대, 프로브, 프라이머, 항체 압타머)을 합리적으로 디자인할 수 있다. 실제로, 전사 부정확의 비율이 더 커지면 질병의 심각도와의 연관성을 기대할 수 있으며, 상기 비율은 유전자 생성물이 영향을 받을 수 있도록 점진적으로 증가될 수 있다. 본원에 기술된 방법 또는 다른 기술을 사용하여 질병에 걸린 세포(들)에서 전사 (부)정확도의 직접 측정으로 주어진 조직에서 질병 진행의 상이한 단계에서 세포를 검출할 수 있다. 유전자 발현(전사물 및 단백질)에서 상기 변이를 정확하게 측정하는 것은 질병 심각도와 관련된 약물 유효성을 평가할 수 있는 능력을 개선시킨다. 현재, 다양한 마이크로어레이 기술은 유전자 실험에서 변화를 측정한다. 그러나, 상기 데이터의 신뢰성(reliability), 더 중요하게는 재현성(reproducibility)은 현재 충분하지 않다. 본 발명자는 현재 전사체학 실험의 다수 변이성은 본 발명자에 의해서 발견된 바와 같이 전사 부정확에 의해서 일부 발생하는 것으로 가정할 수 있다. 그러므로, 상기 공통 현상의 발견으로 전사 부정확에 의해서 최소로 영향을 받거나 또는 본 출원에 기술된 규칙에 따라서 특정 서열에서 발생하는 전사 부정확을 간접적으로 반영하는 유전자 발현 시약을 디자인할 수 있다.
또한, 전사 부정확은 전사 비율에 의해서 조절될 수 있다. 본 발명자는 병변 상태에서 주어진 유전자의 증가된 발현으로 TI를 증가시킴으로써 단백질 불균일성을 증가시킬 것으로 추측된다.
전사 부정확은 본 발명에서 채용할 수 있는 당분야에 공지된 다수의 기술을 사용하여 검출 또는 측정될 수 있다. 특히, 전사 부정확은 전사 부정확에 의해서 형성된 핵산 또는 단백질에 특이적인 시약, 가령 특정 프로브, 프라이머 또는 항체를 사용하여 전기영동, 겔 이동 분석, 분광분석 등에 의해서 측정될 수 있으며, 단백질 또는 핵산의 다양한 형태들 사이에서 검출될 수 있다. 전사 부정확의 비율은 전사 부정확처리된 세포에서 유전자의 수 및/또는 주어진 유전자에 있어서 발생된 전사 부정확 부위의 수를 평가함으로써 측정될 수 있다. 상기 비율은 시험 시료에서 전사 부정확에 의해서 형성된 핵산 또는 단백질의 수준을 참고 시료에서 수득된 것과 비교함으로써 측정될 수 있다.
핵산 수준에서 전사 부정확의 검출
상기에 기술된 바와 같이, 전사 부정확은 RNA 분자에서 서열 변이(들)를 도입한다. 그러므로 전사 부정확의 검출 또는 측정으로 1개 또는 수개의 유전자에 의해서 코딩된 RNA에서, 또는 전체 세포 또는 조직 또는 시료에서 상기 서열 변화(들)의 존재 또는 (절대 또는 상대) 양을 검출함으로써 달성될 수 있다. 핵산에서 전사 부정확의 검출은 하이브리드화, 증폭, 헤테로듀플렉스 형성 등과 같은 다양한 기술에 의해서 실시될 수 있다.
다른 조직 형태에 존재하는 뉴클레오티드의 동정에 사용되는 실제 모든 기술은 하이브리드화에 의존한다. 하이브리드화는 유전자 발현에서 변화를 조사하고 다형을 동정하는데 사용되는 마이크로어레이와 같은 기술에서 중요하다. 상기 기술은 유전자 발현 수준을 측정하기위해서 적용된다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 하이브리드화가 사용되어 풍부하게 발현된 유전자 서열을 제거하여 적은 풍부한 메시지를 잘 연구할 수 있으며, 상기 과정을 감산 하이브리드화(subtractive hybridization)라고 한다. 하이브드리화는 또한 RNA 타입으로부터 DNA 타입 서열로 메시지 서열을 전환시키기위해서 직접적 형태하에서 또는 가역 트랜스크립타제(reverse transcriptase)의 적용 후에 PCR 실험에서 통상 사용되는 유전자 증폭 반응 제1 단계이다.
하이브리드화를 실시하는 기본 기작은 단일가닥 뉴클레오티드(들) 서열은 다른 뉴클레오티드에 결합하며, 이들 각자 서열은 상보적이다. 4개 염기 각각의 길이 및 특정 순서는 하이브리드화의 유효성 및 서열 특이성을 정의한다. 상기는 각각의 특이적 염기는 비공유 결합 방식으로 이의 상보적 염기에 결합하는 것을 의미한다: A → T 및 C → G 및 그 반대의 경우. 서열 매치에서 비공유 결합은 염기 순서에 의해서 조절된다. 그러므로, 일반적 실시에서, 염기의 정의된 서열은 단일 상보 서열에 결합된다. 상기 특정 결합 반응은 주어진 뉴클레오티드 혼합물에서 상보 서열을 동정할 수 있는 하이브리드화에 대한 근거를 제공한다. 하이브리드화의 유효성은 적당한 순서로 다른 것에 매치되는 염기의 수에 의해서 결정되며, 실험 조건, 가령 결합 완충액의 엄격함, CG 대 TA의 상대적 함량(CG 및 TA는 각각 3개 및 2개의 수소 결합에 의해서 결합됨)에 의해서 결정되며, 50%의 이중가닥 DNA를 분리시키는데 요구되는 온도인 용융 온도에 의해서 결정된다.
하이브리드화를 사용하는 전사 부정확의 검출은 전사 부정확 서열에 특이적인 핵산 프로브와 접촉하는 시료를 넣고, 형성된 하이브리드의 존재(또는 양)을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 존재 또는 양은 전사 부정확의 존재 또는 비율의 직접적인 지표가 된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 각각 1개 또는 수개의 유전자들의 개별의 전사 부정확 서열에 대해서 특이적인 핵산 프로브 세트를 사용한다. 전사 부정확 서열에 대해서 특이적인 핵산 프로브는 본 출원에 기술된 서열 정보 및 뉴클레오티드 치환, 삽입 또는 결실 규칙을 사용하여 유전자가 제조될 수 있다(실시예 5 참조).
본 발명의 명세서안에서, 핵산 "프로브(probe)"는 전사 부정확 서열 또는 이의 상보 서열로 선택적으로 하이브리드화될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내며, 상기 서열 또는 상보 서열을 포함하는 시료에서 존재(또는 이의 양)를 검출하는데 적당하다. 그러나, 프로브는 전사 부정확 서열에 완전한 상보물이며, 약간의 미스매치는 허용될 수 있다. 프로브는 전형적으로 길이 8-1500개의 뉴클레오티드, 예를들면 10-1000개, 더 바람직하게는 10-800개, 전형적으로 20-700개의 뉴클레오티드의 단일 가닥 핵산을 포함한다. 더 긴 프로브를 또한 사용할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 바람직한 프로브는 길이 8-400개의 단일가닥 핵산 분자이며, 전사 부정확 서열에 특이적으로 하이브리드화된다.
본 발명의 특정 실시양태는 전사 부정확 서열을 포함하지 않는 핵산 분자의 영역으로 선택적으로 하이브리드화되는 핵산 프로브이다.
선택성(selectivity)이 핵산 하이브리드화를 나타내기위해 사용되는 경우, 표적 서열로 프로브의 하이브리드화는 상기 프로브가 다른 서열로의 하이브리드화와 구별되는 것을 나타낸다. 상기 관점에서, 비록 프로브와 표적 서열 사이의 완전한 상보성은 요구되지 않을 지라도, 선택적 하이브리드화하기위해서 충분히 높아야 한다.
본 발명의 바람직한 프로브는 세포 표면 단백질 또는 분비 단백질을 코딩하는 RNA 분자(또는 상응하는 cDNA 분자)에서 전사 부정확 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 프로브의 특정 실시예는 전사 부정확 서열에 상보적인 서열 또는 서열번호 1 내지 서열번호 32 중 어느 하나의 펩티드 서열을 코딩하는 서열을 갖는다.
프로브의 서열은 예를들면 화학적으로, 예컨대 하이브리드의 안정성을 증가시키기위해서(예를 들면, 삽입 그룹 또는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대, 2' 알콕시리보뉴클레오티드) 또는 상기 프로브를 레이블하기위해서 변형될 수 있다. 레이블의 전형적인 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 방사능, 형광, 발광, 효소 레이블링 등을 포함한다. 상기 프로브는 용액, 현탁액내 표적 핵산으로 하이브리드되거나, 또는 고체 지지체(가령, 이에 한정되는 것은 아니지만, 비드, 컬럼, 플레이트, 기재(핵산 어레이 또는 칩을 제조하는) 등)에 부착될 수 있다.
(하이브리드화 프로브와 결합하여 사용될 수 있는) 또다른 실시양태에 따르면, 전사 부정확은 특정 프라이머를 사용하여 선택적 증폭에 의해서 검출 또는 측정된다. 선택적 증폭에 의해 전사 부정확을 검출하는 것은 전사 부정확 서열을 특이적으로 증폭하는 핵산 프라이머와 접촉하도록 시료를 놓고, 형성된 증폭 생성물의 존재(또는 양)을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 존재 또는 양은 전사 부정확의 존재 또는 비율의 직접적 지표가 된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 각각 1개 또는 수개 유전자들의 개별의 전사 부정확 서열을 특이적으로 증폭시키는 핵산 프라이머의 세포를 사용한다. 증폭은 당분야에 공지된 다양한 기술로서, 이에 한정되는 것은 아니지만 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사-매개 증폭(TMA), 가닥 변위 증폭(SDA) 및 핵산 서열계 증폭(NASBA)에 의해서 실시될 수 있다.
전사 부정확 서열에 특이적 핵산 프라이머는 본 출원에 기술된 바와 같은 서열 정보 및 뉴클레오티드 치환, 삽입 또는 결실 규칙을 사용하여 유전자를 제조할 수 있다(예를 들면, 실시예 5 참조).
용어 "프라이머(primer)"는 전사 부정확 서열 또는 이의 상보물, 또는 전사 부정확 부위를 플랭킹하고(flanking) 상기 서열 또는 상보물을 포함하는 시료에서 상기 전사 부정확 부위의 전부 또는 일부를 증폭하기에 적당한 핵산의 영역으로 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 본 발명의 전형적인 프라이머는 길이 약 5-60개의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 길이 약 5-50개의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 약 10-40개, 35개, 30개 또는 25개의 뉴클레오티드의 단일가닥 핵산 분자이다. 높은 특이성을 유지하기위해서 완전한 상보성이 바람직하다. 그러나, 특정 미스매치는 프로브에 대해서 상기에서 기술된 바와 같이 허용될 수 있다.
용어 "플랭크(flanks)"는 종래의 폴리머라제 활성과 상용가능한 전사 부정확 부위의 거리에서 위치해야 하며, 예를들면 상기 부위의 상향으로 250 bp 이하, 바람직하게는 200, 150, 100을 초과하지 않으며, 더 바람직하게는 50 bp이다.
본 발명의 부가적 측면은 또한 핵산 프라이머의 적어도 한쌍을 포함하며, 상기 한쌍의 프라이머는 센스(sense) 및 리버스(reverse) 프라이머를 포함하며, 상기 센스 및 리버스 프라이머는 전사 부정확 서열 또는 정확한 상보 서열을 선택적으로 증폭시킨다. 본 발명의 프라이머의 특정 예로는 예를 들면 도 12에 기술되어 있다.
본 발명의 부가의 실시양태에 따르면, 전사 부정확은 DHPLC(Denaturing High Performance Liquid Chromatography)에 의해서 측정된다. 상기 방법의 원리는 예를 들면 도 11에 기술되어 있다. 기본적으로, 증폭 생성물은 변성 및 리어닐링(reannealing)된다. 리어닐링되는 동안, 호모듀플렉스(homoduplexes)와 헤테로듀플렉스(heteroduplexes)는 전사 부정확 서열의 존재의 결과로서 형성된다. 그후 상기 혼합물은 DHPLC에 의해서 분석된다. 헤테로듀플렉스 및 호모듀플렉스 DNA 구조가 분석 온도에서 상이하기 때문에, 이들은 다르게 용리되며, 이들의 (상대) 양이 평가될 수 있다.
정상 세포에서보다 더 큰 빈도수를 갖는 암세포에 존재하는 전사 부정확 서열을 입증하기위해서, 선택된 유전자(ENO1, GAPDH, TMSB4X)의 예측된 전사 부정확은 지시된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 RT-PCR에 의해서 증폭된다(실시예 6 참조). 호모듀플렉스와 헤테로듀플렉스의 변이가 입증되었다(도 15).
핵산을 검출하기에 적당한 다른 기술이 사용될 수 있거나 또는 전사 부정확을 검출, 정량화 또는 모니터하기위해서 본 발명에서 사용하기위해서 조정될 수 있다.
단백질 수준에서 전사 부정확의 검출
전사 부정확은 단백질 서열에서 변경을 유도하기 때문에, 전사 부정확의 존재 또는 수준은 TI-단백질의 존재 또는 양을 검출함으로써 측정될 수 있다.
당분야에 공지된 다양한 기술은 단백질에서 전사 부정확을 측정하기위해서 사용되고/되거나 조절될 수 있다. 특히, 전사 부정확은 단백질의 변형을 일으켜서 이들의 거동을 직접적으로 변경시키기 때문에, 상기 변경은 예를들면 2-차원 겔 전기영동 및 질량 분광분석, 또는 표면 개선 레이저 탈착 이온화(surface enhanced laser desorption ionization)에 의해서 검출될 수 있다. TI 단백질이 사람 혈장에 존재하는 것을 입증하기위해서, 본 발명자는 표준의 ApoAII의 STOP 이후에 위치한 펩티드의 질량 분광분석 프로파일을 나타낸다. 질량 분광분석 데이터는 아르기닌이 표준의 STOP로 치환되는 것을 보여준다. 또한, 전사 부정확은 더 길고 더 짧은 (세포성 및 혈장) 단백질 이성체를 발생시키며(염기 치환에 의한 미성숙 정지 코돈, 또는 결실 또는 삽입의 경우에 오픈 리딩 프레임에서 스위치의 결과로서), 상기 이성체는 이의 특정 리간드 및/또는 단백질 서열 계획을 사용하여 검출 또는 정량화될 수 있다. 이 점에 있어서, 본 발명자는 단백질 길이 및 AA 프라이머리 서열에서 변경은 단백질의 카르복시-말단 영역에서 우세하게 발생되는 것을 입증하였다. 따라서, 시퀀싱 계획은 이전에 의심받지 않았던 영역인 단백질의 C-말단을 향하여 일어난다(실제로, 현재 사용된 직접 단백질 시퀀싱 방법이 NH2 말단 AA에서 시작하여 달성될 수 있음).
특정 리간드를 사용하여 전사 부정확을 검출하는 것은 전형적으로 TI-단백질 영역에 특이적인 리간드와 접촉하는 시료를 놓고, 형성된 복합체의 존재(또는 양)을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 존재 또는 양은 전사 부정확의 존재 또는 비율의 직접적 지표가 된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 각각 1개 또는 수개의 TI-단백질의 개별 영역에 특이적인 리간드 세트를 사용한다. 상기 영역에 특이적인 리간드는 본 출원에서 기술된 바와 같이 서열 정보 및 아미노산 치환 규칙을 사용하여 단백질을 제조할 수 있다(예를들면, 실시예 5 참조). 상기 리간드는 용해성 형태로 사용되거나 또는 표면 또는 지지체상에 코팅될 수 있다.
상기 관점에서, 본 발명은 또한 TI-단백질 영역을 선택적으로 결합하는 리간드에 관한 것이다. 리간드의 다른 형태, 가령 특정 항체, 합성 분자, 압타머, 펩티드 등이 관찰될 수 있다.
특정 실시양태에서, 리간드는 항체, 또는 이의 절편 또는 유도체이다. 따라서, 본 발명의 특정 측면은 TI-단백질의 영역을 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 명세서에서, 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 뿐만 아니라 실질적으로 동일한 항원 특이성을 갖는 이의 절편 또는 유도체를 나타낸다. 절편은 예를들면 Fab, Fab'2, CDR 영역 등을 포함한다. 유도체는 단일-사슬 항체, 인간화 항체, 사람 항체, 다관능성 항체 등을 포함한다.
TI-단백질의 영역에 대한 항체는 당분야에 일반적으로 공지된 절차에 의해서 생성될 수 있다. 예를들면, 폴리클로날 항체는 TI-단백질의 영역(예컨대, 단백질 또는 펩티드로서) 단독으로 또는 적당한 단백질과 결합된 TI-단백질의 영역을 비(非)사람 동물로 주입함으로써 제조될 수 있다. 적당한 기간 이후에, 동물을 채혈하고, 혈청을 회수하여 당분야에 공지된 기술을 사용하여 정제한다(Paul, W.E. "Fundamental Immunology" Second Ed. Raven Press, NY, p. 176, 1989; Harlow et al. "Antibodies: A laboratory Manual", CSH Press, 1988 ; Ward et al (Nature 341 (1989) 544).
TI-단백질과 동일한 서열을 갖는 펩티드는 당분야에 일반적으로 공지된 절차에 의해서 제조될 수 있다. 상기 펩티드는 적당한 지지체에 결합되어 생물학적 시료(예를들면 체액)에 존재하는 자가-항체(auto-antibodies)의 검출에 사용된다.
TI-단백질의 영역에 대한 모노클로날 항체는 예를들면 면역 B-임파구를 골수종세포(myeloma cell)로 융합시키는 단계를 포함하는 Kohler-Millstein (2) 기술(Kohler-Millstein, Galfre, G., and Milstein, C, Methods Enz. 73 p. 1 (1981))에 의해서 제조될 수 있다. 예를들면, 상기에 기술된 바와 같은 면역원은 기술된 바와 같이 비(非)사람 포유류로 주입될 수 있다. 연이어, 비장이 제거되고, 다양한 방법에 따라 실시된 골수종과 융합된다. 그후 수득된 하이브리도마 세포(hybridoma cells)는 TI-단백질의 영역에 대한 항체 분비를 시험할 수 있다.
TI-단백질의 특정 영역에 대한 항체 "선택성(selective)"은 상기 영역(또는 이의 에피토프-포함 절편)에 결합되는 항체를 나타내며, 비특이적 결합(예를들면, 또다른 항원, 특히 상기 영역을 포함하지 않는 네이티브 단백질과의 결합)과 구별될 수 있다. TI-단백질의 영역에 대한 항체 선택성은 시료에서 상기 영역을 포함하는 단백질의 존재를 검출할 수 있다.
진단법
본 발명은 피험체로부터 유래된 시료로부터 질병의 존재, 부재, 소인(predisposition), 위험 또는 심각도를 검출하기위해서 사용될 수 있는 검출 또는 진단 분석의 실시에 관한 것이다. 용어 "진단법(diagnostics)"은 약물유전체학(pharmacogenomics) 방법, 예후(prognostic) 등을 포함하는 것으로 설명되어야 한다.
특정 측면에서, 본 발명은 생물학적 시료, 바람직하게는 사람의 생물학적 시료에서 질병의 존재, 부재, 소인, 위험 또는 심각도를 시험관내 또는 생체외에서 검출하는 방법에 관한 것으로서, 전사 부정확 부위를 특이적으로 결합하는 리간드와 접촉하는 상기 시료를 놓고, 복합체의 형성을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 특정 목적은 피험체에서 암의 존재, 부재, 소인, 위험 또는 심각도를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 암세포에 의해서 발현된 전사 부정확 부위와 특이적으로 결합하는 리간드와 접촉하는 피험체로부터 유래된 시료를 시험관내 또는 생체외에서 놓고, 복합체의 형성을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태는 암의 치료에 대해서 피험체의 반응 또는 반응성을 평가하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 치료 과정 이전 또는 치료 과정 중에 다른 시점에서 피험체로부터 유래된 시료에서 전사 부정확의 존재 또는 비율을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 암 질환의 치료 유효성을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 (i) 상기 치료 중에 또는 치료 이후에 피험체로부터 조직 시료를 준비하는 단계, (ii) 상기 시료에서 전사 부정확의 존재 및/또는 비율을 측정하는 단계, 및 (iii) 상기 존재 및/또는 비율을 치료 이전 또는 치료 초기 단계에 얻어진 상기 피험체로부터 유래된 참고 시료에서의 전사 부정확의 양과 비교하는 단계를 포함한다.
시료에서 전사 부정확의 존재(또는 증가)는 암 질환의 존재, 소인, 또는 진행 단계의 지표가 된다. 그러므로, 본 발명은 적당한 치료 조정을 디자인하여, 더 효과적으로 맞춤화시킨다. 또한, 사전 증상 수준에서 측정으로 적용될 요양법을 방지한다.
본 발명의 진단 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내, 바람직하게는 시험관내 또는 생체외에서 실시될 수 있다. 상기 시료는 피험체로부터 유래된 생물학적 시료일 수 있으며, 적당하게 핵산 또는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 시료의 예로는 체액, 조직, 세포 시료, 기관, 생체조직편 등을 포함한다. 가장 바람직한 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 정액 등이다. 상기 시료는 상기 방법을 실시하기 이전에 시험을 위한 핵산 또는 폴리펩티드의 이용가능성을 만들고 향상시키기위해서 처리될 수 있다. 처리로는 예를 들면 하나 이상의 하기의 것을 포함한다: 세포 용해(예컨대, 기계적, 물리적, 화학적 등), 원심분리, 추출, 컬럼 크로마토그래피 등. 본 발명의 방법은 전사 부정확에 의해서 생성된 신규한 펩티드에 대한 항체의 시료가 사람에서 존재를 측정하고, 항체 생성을 유도하기위해서 면역 자극을 발생시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 제2 방법은 전사 부정확 펩티드에 대한 면역학적 구조를 갖는 세포를 검출하는 방법에 관한 것이다.
약물 디자인 및 요법
상기에 기술된 바와 같이, 본 발명은 전사 부정확을 조절하기위해서 후보 분자의 역량을 평가함으로써 신규한 약물을 디자인(또는 스크리닝)한다. 상기 방법은 결합 분석 및/또는 관능 (활성) 분석을 포함하며, 동물에서 시험관내에서(예컨대, 세포계 또는 비(非)세포성 분석에서) 실시할 수 있다.
본 발명의 특정 목적은 생물학적 활성 화합물을 선택, 특징화, 스크리닝 또는 최적화하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 시험 화합물이 전사 부정확을 조절하는지의 여부를 시험관내에서 결정하는 단계를 포함한다. 전사 부정확의 조절은 특정 유전자 또는 단백질에 관련하여 평가될 수 있거나, 또는 유전자 또는 단백질의 선정된 세트에 관련하여 평가될 수 있다.
본 발명의 부가의 실시양태는 생물학적 활성 물질을 선택, 특징화, 스크리닝 또는 최적화하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 유전자와 접촉하는 시험 화합물을 시험관내에서 놓고 상기 유전자로부터 전사 부정확 부위를 포함하는 RNA 분자의 생성을 조절하기위해서 상기 시험 화합물의 역량을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 부가의 실시양태는 생물학적 활성 화합물을 선택, 특징화, 스크리닝 및/또는 최적화하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 세포와 시험 화합물을 접촉하고, 상기 세포에서 시험 화합물이 전사 부정확을 조절하는지의 여부를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 스크리닝 분석은 적당한 장치, 가령 플레이트, 튜브, 디쉬(dishes), 플라스크 등에서 실시될 수 있다. 전형적으로, 상기 분석은 다중-웰 마이크로타이터 디쉬(multi-well microtiter dishes)에서 실시된다. 본 발명을 사용하여, 수개의 시험 화합물들이 병렬로 분석될 수 있다. 또한, 시험 화합물은 다양한 기원, 특성 및 조성을 가질 수 있다. 상기는 유기 또는 무기 물질, 가령 리피드, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, 작은 분자가 분리된 형태 또는 다른 물질과의 혼합된 형태일 수 있다. 상기 화합물들은 예를들면 화합물들의 조합 라이브러리(combinatorial library)의 전부 또는 일부일 수 있다.
본 발명의 전사 부정확을 조절하는 화합물은 세포에서 전사 부정확을 감소시키거나 또는 증가시키기위한 많은 용도, 가령 치료적 용도를 갖는다. 상기 화합물을 사용하여 비정상 전사 부정확에 기인한 질병 또는 비정상 전사 부정확과 조합된 질병, 가령 증식 질환(예컨대, 암), 면역 질환, 노화, 염증 질환 등을 치료(또는 예방)할 수 있다.
본 발명의 다른 화합물은 표적 전사 부정확과 결합하는 화합물, 예컨대 전사 부정확 부위와 선택적으로 결합하는 화합물이다. 상기 화합물들(예컨대, 항체, RNAi 등)은 진단 시약 또는 치료제로서 단독으로 또는 레이블에 콘쥬게이트하여 사용될 수 있다.
본 발명의 전사 부정확을 조절하거나 또는 표적화하는 화합물은 경구를 포함하는 적당한 경로, 또는 전신 송달(systemic delivery), 정맥, 동맥내, 뇌내 또는 척수관 주사에 의해서 투여될 수 있다. 상기 투여는 매우 넓은 범위안에서 다양할 수 있으며, 각 특정의 경우에서 당분야에 공지된 다양한 요인에 따라서 개별 요건으로 조절될 것이다. 당분야에 공지된 약학적으로 허용가능한 제형(dosage), 가령 용액, 현탁액, 분말, 겔 등을 등장성 용액, 완충 용액 및 식염수 용액 등을 포함하여 사용될 수 있다. 상기 화합물은 단독으로 투여될 수 있지만, 그러나 일반적으로 표준 약학적 실시에 따라 약학적 담체와 투여된다(가령, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing에서 기술됨). 항체는 현재 사람 시험 및 요법에 사용되는 당분야에 공지된 방법 및 프로토콜에 따라 투여될 수 있다.
정상 세포 기능에 있어서 전사 부정확의 효과
단백질은 대부분의 세포 기능에 관여하는 것이 일반적으로 받아들여 진다. 그러나, 비(非)-코딩 RNA로서 알려져 있는 RNA는 기능성 분자임이 명확하다. 이전에 그 중요성이 경시되었던 전사물(transcripts)은 많은 생물체에서 존재하며 수많은 세포 기능을 조절한다. 이들 중에서, 하나는 rRNA, tRNA, tmRNA (트랜스메신저 RNA)이며, 또한 다른 비(非)코딩 RNA (snoRNA, snRNA 등)는 RNA의 포스트-전사 변형(post-transcriptional modifications), 스플라이싱(splicing) 또는 다른 세포성 기능에서 관여한다. RNA와 단백질의 기능은 본 출원에 기술된 전사 부정확의 결여에 의해서 영향을 받을 수 있다. DNA 서열은 핵에서 DNA 분자의 서열을 인식하고 모 DNA 주형에 상보적인 뉴클레오티드의 단일가닥 폴리머를 합성하는 RNA 폴리머라제 II로 불리는 단백질의 작용에 의해서 mRNA로 전사된다. 주어진 위치에서 RNA 염기의 순서 및 형태는 주형으로서 제공되는 DNA 가닥에 존재하는 염기의 순서 및 형태에 의해서 결정된다. mRNA의 제1 염기에 상응하는 전사된 RNA의 5' 말단은 개시 뉴클레오티드에 부착된 7-메틸구아닐레이트에 연결되어 RNA가 분해되는 것을 보호하는 5' CAP을 구성한다. 상기 변형은 전사가 완료되기 전에 일어난다. 1차 전사물의 3' 말단에서 공정은 아데닌 잔기의 스트링(string)이 폴리(A) 폴리머라제로 불리는 효소에 의해서 첨가된 유리 3'-히드록실기를 수득하기위한 엔도뉴클레아제에 의한 분해를 포함한다. 수득된 폴리(A) 테일은 100-250개의 뉴클레오티드를 포함한다. 공정의 최종 단계는 스플라이싱이며, 인트론 서열에 해당하는 원소의 제1 전사물로부터의 분해 이후에 엑손의 결찰로 구성된다. 상기 공정은 수많은 단백질 및 ncRNA에 의해서 조절되며, 일부는 RNA에 결합된다. 상기 결합은 전사 정확의 결여에 의해서 영향을 받을 수 있는 1개의 단계인 것이 가능하다. 실제로, 상기 모든 단백질은 특정 RNA에 의해서 코딩되며; 그러므로 상기 단백질의 기능은 전사 정확의 결여에 잠재적인 영향을 받는다. RNA 성숙의 매우 복잡한 공정으로 핵으로부터 해독이 일어나는 mRNA가 생성된다. 상기 단계에서 성숙한 mRNA에 존재하는 모든 뉴클레오티드 트리플렛(triplet)이 AA로 해독되는 것은 아니다. 성숙한 메신저 RNA는 mRNA의 전체 안정성 및 해독에서 다른 역할을 결정하는데 중요한 기능을 갖는 5' 및 3' 비해독 영역으로서 언급되는 비(非)코딩 영역을 포함한다. DNA에 포함된 정보를 적당한 단백질 AA 서열로 효과적으로 송달하기위하여, 절대 전사 정확이 요구된다. 실제로, 전사 중 또는 성숙 과정 중에 에러 발생은 mRNA 안정성에서의 변화, 최종적으로 단백질 AA 1차 서열에서의 변화를 일으킬 것이다. 그후 단백질 서열에서의 변화는 전사 개시, 전사 자체, RNA의 5' 캡핑, 3' 폴리아데닐화, RNA 스플라이싱 및/또는 RNA의 엑스포트(export)에 포함된 단백질 서열의 변경에 의해서 악화될 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 암세포에서 분리된 다수의 유전자에 영향을 주는 전사 부정확의 증명은 상기 현상이 자체를 악화시킴으로써 질병 심각도에서 진행 증가로 유도할 수 있는 가능성을 열었다. 전사 부정확에 의해서 도입된 RNA 서열에서 변이는 세포 기능에서 즉시의 결과를 가질 수 있다. 실제로, DNA 주형의 염기와 상보적이지 않은 RNA 1차 전사물로 염기의 도입은 수득된 단백질 AA 1차 서열에서 즉각적인 가능한 결과를 갖는다. 상기 변경은 코돈의 처음 2개 염기에 영향을 주며, 전형적으로 AA 서열에서 직접적인 영향을 준다. 코돈의 제3 염기에 영향을 주는 변이는 유전자 코드가 변성되기 때문에 단백질 AA 서열에서 더 적은 영향을 가질 것이다. 그러므로, 코돈의 제3 위치에 위치한 염기의 변화는 단백질 AA 서열에 직접적인 영향을 주지 않을 것이다. 하기에 기술된 데이터에 근거하여, 본 발명자는 전사 부정확은 코돈의 이들 위치에도 불구하고 모든 염기에 영향을 주며 그러므로 단백질 AA 1차 서열에 영향을 주는 현상이다. 단백질에서의 변화는 중성일 수 있거나 또는 단백질 기능의 변화를 일으키며, 활성을 증가시키거나 또는 손실시킨다. 전사 부정확 현상은 성숙 mRNA의 적어도 처음 400-500개 염기를 코딩하는 것이 완료된 이후에 주로 관찰되며; mRNA의 5' 말단은 상대적으로 덜 영향을 받는다. 단백질 절편이 더 짧을 뿐만 아니라 더 긴 것이 암세포 뿐만 아니라 암 환자로부터 유래된 혈장에서 존재할 것으로 사료된다. 상기 더 짧고 더 긴 이소형태는 하기에 기술된 전사 부정확 규칙으로부터 직접적으로 추론될 수 있다. 상기는 암의 특이적 마커 또는 면역 질환 심각도의 동정에 있어서 합리적인 디자인 방법을 제조한다. 대부분 유전자의 전사율이 세포 요구로 조절되기 때문에, 전사 부정확은 단백질 기능이 과도하거나 또는 결여에 의한 유전자 발현에서 변화를 일으킨다. 그러므로, 전사 부정확의 현상은 이의 과업을 실시하기위한 세포 용량에 있어서 완전한 효과를 발휘한다. 그러므로, 모든 타입의 암세포로부터 분리된 대부분의 유전자의 공통의 특징인 결점의 동정으로 주어진 세포에서 전사 부정확 비율을 정량적으로 측정하는 새로운 방법에 논리적 근거를 제공한다. 상기 스크린 분석은 전사 부정확을 제한할 수 있는 신규한 약물을 시험함으로써, 질병의 진행을 막고, 정상 세포 기능을 회복할 수 있다.
전사 부정확 및 병리학
본 발명은 전사 부정확이 단백질 서열에서 중요한 변화를 일으키는 것을 보여준다. 주어진 단백질의 기능은 이의 AA 서열에 따라 직접적으로 좌우되는 이의 3-D 구조에 의해서 결정된다. 변이체 AA를 갖는 단백질, 단백질 절단 또는 단백질 연장으로 단백질 활성의 완전한 변형을 일으키거나 또는 중성을 유지한다. 정상 호모로그의 기능을 상당히 저해하는 변형된 단백질의 예가 기술되었다. 전사 부정확은 다수의 유전자에 영향을 주므로, 다수의 단백질을 수득할 수 있는 현상이다. 상기 수개의 단백질이 안정한 DNA 구조를 유지하는데 참여하고 DNA 리페어(repair)에 참여하기 때문에, 상기 단백질의 불완전한 기능으로 불완전한 DNA 리페어를 일으키고, 손상된 DNA를 성공적으로 리페어하기위한 세포의 용량이 상당히 감소된다. 정상 세포에서 전사 정확은 전사를 조절하는 수개의 단백질 복합체의 활성에 기인하기 때문에, 상기 단백질의 초기 작은 변경은 상기 현상을 점진적으로 악화시킬 수 있다. 상기는 최종적으로 세포 분화 상태를 억제하고 점진적으로 질병의 심각한 형태로 유도하는 전사 부정확의 비율을 더 크게 한다. 전사 부정확이 실제로 암세포에서 발생하여 주어진 유전자에 의해서 코딩되는 단백질은 넓은 다양화로 유도한다는 증명은 신규 진단 프로브에 대한 스크리닝과 신규한 치료 타겟을 디자인하는데 새로운 영역을 열었다.
본 발명은 DNA에 존재하는 정보의 다양화에 기여하고 특정 규칙을 따르는 신규한 현상을 기술하였다. 상기 비(非)랜덤 전사 부정확 공정은 암세포에서 크게 악화될 뿐만 아니라 동일한 규칙에 따라 정상 세포에서 발생한다. 상기 기작은 mRNA에 신규한 염기를 도입함으로써 리보좀 수준에서 해독될 메시지에서 완전한 변화를 일으킨다. 상기 현상은 대부분의 시험된 유전자에서 존재하기 때문에 꽤 일반적이다. 전사 부정확의 직접적인 결과는 단일 유전자가 의심되는 유전자보다 더 많은 단백질을 제조할 수 있다는 것이다. 그러므로, 본 발명자의 발견은 게놈에 존재하는 제한된 수의 유전자와 생물학적 시료에 존재하는 다수의 단백질 사이에서 상대적 불일치를 일부 설명할 수 있는 가능성을 갖는다. 본 발명자는 전사 부정확은 비(非)랜덤 공정이며, 특정 규칙에 의해 지배를 받는 것을 보여주며, 일부는 본원에서 이미 기술되었다. 일부는 바이오인포메틱스 및 생물학적 방법을 사용하여 공정의 부가적 특징화에 의해서 밝혀질 것이다. 본 발명자는 상기 공정이 일반적이며 단백질의 다양성을 발생하는데 기여할 수 있는 것으로 사료된다. 상기 단백질의 다양성은 특정 단백질 패턴을 인식하기위한 면역계의 용량에 상당한 영향을 줄 것이다. 상기에 있어서, 전사 부정확은 면역 질병의 질병발생론에 역할을 할 것으로 사료된다. 본 발명자는 본원에서 단일 염기의 치환을 일으키는 전사 부정확 경우를 고려하였다. 본 발명자는 상기 기작이 mRNA 구조의 상당한 탈안정화를 일으키지 않기 때문에 단일 염기 치환에 집중하였다. 그러므로, 단일 염기 치환은 해독을 방해하지는 않지만, 그러나 선의의 신규한 메시지로서 인정되어야 한다. 본 발명자는 전사 부정확이 염기 결실 및/또는 삽입을 일으키는 것을 알았다. 상기에 기술된 동일한 방법은 전사 부정확의 대체 기작을 찾아낼 것이다.
본 출원에서 기술된 신규한 방법은 몇가지 직접적인 실제 적용을 갖는다.
신규 질병-특이 바이오마커를 규명하고, 특이 질병 프로테인을 표적으로 하는 신규의 항체를 도안하기 위한 단백질체학 실험의 최적화
본 발명의 이론을 기초로 현재 전사 부정확의 결과로서 임의의 프로테인 서열에서 발생할 수 있는 변화를 예견하여 명확한 분자 질량 및 등전점과 같은 이화학적 특성의 변화를 예견할 수 있다. 상기에 의해서 2-D 겔 및 질량 분석법에서 변형된 프로테인 패턴을 야기할 수 있다. 전사 부정확이 대부분의 유전자에 영향을 주므로 현재 한정된 프로테인 세트에 촛점을 맞추고, 질병(예를 들면 암) 특이 바이오마커를 규명하기 위해서 이들의 변화를 특성화시킬 수 있다. 전사 부정확 알고리즘으로 바이오마커 발견 공정을 촉진시킬 수 있다. 대안적으로 TI-프로테인의 도메인, 즉 전사 부정확에 의해서 발생되는 네이티브 프로테인을 연장시키는 추가의 신규 AA 뿐만 아니라 변형된 AA를 함유하는 프로테인 도메인 쪽으로 향하는 특이 항체를 도안할 수 있다. 이러한 도메인에 반하여 움직이는 항체는 프로테인 변이체에 특이적일 수 있으므로 세포 표면 도는 암 세포 내부의 체액에 존재하는 질병(예를 들면 암)-특이 프로테인 쪽으로 향한다. 이러한 항체는 유액에서의 병리적 상태의 프로테인 특성을 검출하고, 플라즈마에서 순환하는 질병 세포를 검출하며, 조직학적 샘플에서의 질병 세포를 규명하고, 질병의 심각성을 평가하며, 또한 특이 질병 세포 쪽으로 약물 치료를 목적으로 하는데 사용될 것이다. 상기는 유전자 치료 벡터, 예를 들면 아데노바이러스, 리포좀 등에 의해서 전사 부정확-경향이 있는 서열의 유전자 도입에 의해서 획득될 수 있다. 대안적으로 본 연구자들은 TI로부터의 결과인 도메인으로서 동일한 서열을 갖는 특이 펩티드를 도안하였다. 상기는 예를 들면 체액에 존재하는 TI-프로테인의 도메인 쪽으로 향하는 특이적 및 자연적 자가-항체를 검출하기 위해서 사용될 수 있다.
전사 부정확은 비-랜덤하게 발생하며, 자주 대부분의 시험 유전자에서의 mRNA 정지 코돈에 영향을 준다. 추가로 임의의 주어진 mRNA 집단의 6%까지가 이러한 추가 유전자를 함유하는 것을 추정할 수 있으므로, 카르복시-터미널 말단에서의 신규 서열을 나타내는 특이적 프로테인 집단을 주어진 암 세포에서 확인할 수 있다. DNA에 영향을 주는 희귀한 유전적 질병을 제외하고는 캐노니칼 정지 코돈 직전의 서열의 인-프레임 판독을 도입시킬 수 있는 보고된 공정이 없으므로 상기 서열의 표적화는 생각할 수 없다. 이러한 숨겨진 서열의 존재는 이전에 짐작하지 못했다. 캐노니칼 정지 코돈 상에서 발생하는 단일 염기 치환을 유도하는 전사 부정확의 발견은 이러한 코딩 서열의 존재를 나타내며, 추가로 세포에서의 강화된 전사 부정확 때문에 암 세포에서 이들의 존재가 증가한다. 따라서 신규의 암-특이 약물을 도안하기 위해서 이러한 정상적으로 숨겨진 서열을 규명 및 표적화할 수 있다.
코딩 서열상에서 발생하는 단일 염기 결손 또는 삽입에 관한 TI는 코딩 프레임에서의 스위치로 안내한다. 집합점으로서 상응하는 프로테인에서의 서열이 변형된다(AA 서열 및 프로테인 길이의 변화). 따라서 주어진 암세포에서 신규의 서열을 나타내는 특이적 프로테인 집단을 검출할 수 있다. 따라서 신규의 암-특이 약물을 도안하기 위해 이러한 정상적인 숨겨진 서열을 규명 및 표적화할 수 있다.
신규 또는 변형된 프로테인 서열의 존재 때문에, 및 이러한 변경이 세포 표면 상에 존재하는 프로테인 상에 존재하므로 질병-특이 서열에 대한 백신 접종을 위해서 이러한 서열을 사용하는 것이 제안되었다. 이러한 예방접종은 임의의 주어진 질병 형태(예를 들면 암)로 진단된 환자의 면역 반응을 유발시키거나, 또는 환경적인 독성 또는 위험으로의 노출이 증가하거나 또는 유전자 소인 때문에 특이 질병(예를 들면 암)의 발병 위험이 증가한 환자의 예방적인 면역 반응을 개시하기 위해서 사용할 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 피험체에서의 질병의 존재 또는 단계를 검출하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 피험체의 샘플에서의 전사 부정확의 존재 또는 전사 부정확 비율을 (실험실 내 도는 생체 외)에서 평가하는 단계를 포함하며, 상기의 존재 또는 비율은 상기 피험체에서의 질병의 존재 또는 단계의 징후이다. 상기 샘플은 임의의 조직, 세포, 유액, 생체조직 등(핵산 및/또는 프로테인 포함)일 수 있다. 상기 샘플을 반응시키기 전에 희석, 농축, 투석 등에 의해 처리할 수 있다. 상기 방법은 통상적으로 다수의 별개의 유전자 또는 프로테인, 예컨대 플라즈마 프로테인, 세포 표면 프로테인 등의 전사 부정확을 평가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가 목적은 이것을 필요로하는 피험체의 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 포유류 유전자의 전사 부정확의 비율을 변경(예를 들면 감소 또는 증가시키는 효과적인 양의 화합물을 상기 피험체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 목적은 인간 또는 동물의 치료 방법에 사용하기 위해, 특히 증식성 세포 질환, 예컨대 암 및 면역 질병을 치료하기 위해 약물학적 조성물의 제조용으로 포유류 유전자의 전사 부정확의 비율을 변경(예를 들면 감소 또는 증가)시키는 화합물을 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가 목적은 약물 또는 후보 약물의 효능의 평가 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 포유류 유전자의 전사 부정확 비율을 상기 약물이 변경시키는지의 여부를 평가하는 단계를 포함하며, 이러한 변경은 약물 효능이 있음을 암시한다.
본 발명은 추가로 샘플에서의 전사 부정확(전사 부정확의 수준)를 검출 또는 평가하기 위한 방법 및 제품(예컨대 프로브, 프라이머, 항체 또는 이의 유도체)뿐만 아니라 상승하는 킷트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 바이오마커의 규명 및/또는 제조를 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 표적 프로테인, RNA 또는 유전자에서의 전사 부정확 부위(들)의 존재를 피험체의 샘플에서 규명하는 단계, 및 선택적으로 상기 전사 부정확 부위(들)의 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 특정 및 바람직한 실시양태에서 표적 프로테인 또는 분비 프로테인, 특히 세포 표면 프로테인 또는 플라즈마 프로테인이다.
본 발명의 추가의 목적은 형질 또는 병리학적 상태에 특이적인 리간드를 제조 또는 규명하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 형질 또는 병리학적 상태의 피험체의 샘플에서 1개 또는 수개의 표적 프로테인, RNA 또는 유전자의 전사 부정확 부위(들)의 존재를 규명하는 단계, 및 선택적으로 상기 전사 부정확 부위(들)의 서열을 결정하는 단계, 및 상기 전사 부정확 부위(들)에 특이적으로 결합하는 리간드(들)의 제조 단계를 포함한다.
본 발명은 세포 증식성 질환, 예컨대 암, 면역 질병, 염증 또는 노화의 바이오마커를 규명하기 위해 특히 적합하다. 특히 포유류 피험체에서 이러한 질병에 특이적인 리간드, 특히 피험체에서의 세포 증식성 질환의 존재 또는 심각성을 검출할 수 있는 리간드의 제조에 유리하다.
본 발명의 추가 측면은 프로테인, 특히 포유류 프로테인, 보다 특히 인간 프로테인의 전사 부정확 부위를 포함하는 (합성) 펩티드에 관한 것이다. 상기 펩티드는 통상적으로 프로테인의 내부 단편, 또는 상기 프로테인의 C-말단 단편의 서열을 포함한다. 상기 펩티드는 100, 80, 75, 70, 65, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25 또는 20개 이하의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 프로테인은 세포 표면 프로테인(예를 들면 리셉터 등), 분리 프로테인(예를 들면 플라즈마 프로테인) 또는 세포내 프로테인일 수 있다. 이러한 플라즈마 프로테인의 예는 도 13에서 제공하며, 아포리포프로테인(예를 들면 AI, AII, AI, CII, CIII, D, E), 보체 성분(예를 들면 Cls, C3, C7), C-반응성 프로테인, 서핀 펩티다아제 억제제, 피브리노겐(예를 들면 FGA1, FGA2), 플라즈미노겐, 트랜스페린, 트렌스티레틴 등을 포함한다. 세포 표면 리셉터의 예로는 예를 들면 사이토카인 리셉터 및 호르몬 리셉터 등을 포함한다. 특이적 실시양태에서 본 발명은 상기에서 언급한 풍부한 인간 플라즈마 프로테인 또는 세포 표면 리셉터의 전사 부정확 부위를 포함하는 합성 펩티드에 관한 것이다.
상기 펩티드의 특이적 예는 도 10, 14 및 18에서 개시하고 있다. 보다 특히 본 발명의 합성 펩티드의 예로는 하기의 아미노산 서열 모두 또는 단편을 포함한다:
Figure 112009010362612-PCT00006
본 발명의 추가의 측면은 면역원과 같은 상기에서 언급한 전사 부정확 부위를 포함하는 펩티드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기에서 언급한 전사 부정확 부위를 포함하는 펩티드, 및 선택적으로 적당한 담체, 부형제 및/또는 보조약을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 전사 부정확 부위에 특이적으로 결합하는 시약을 지지체 상에 고정시키는 장비 또는 지지체 상에 상기 시약이 고정된 제품에 관한 것이다. 시약은 예를 들면 프로브 또는 항체 또는 이의 유도체일 수 있다.
본 발명은 임의의 포유류 피험체, 특히 임의의 인간 피험체에서 예를 들면 세포 증식성 질환(예를 들면 암), 면역 질병(예를 들면 자가-면역 질병(다발성 경화증, ALS), 이식편 거부반응), 노화, 감염 질병, 당뇨 등과 같은 증가 또는 감소된 전사 부정확 비율과 관련되는 다양한 병리학적 상태를 검출, 모니터 또는 치료하고, 및/또는 치료적 활성 약물을 제조, 도안 또는 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 임의의 다른 세포 타입, 예컨대 원핵 세포, 하급 진핵 세포(예를 들면 효모), 곤충 세포, 식물 세포, 곰팡이 등에서의 전사 부정확을 검출, 모니터, 조정 또는 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
전사 부정확 부위를 표적으로 하는 약품의 제조 및 용도
본 발명의 이론을 사용하면 예를 들어 전사 부정확 부위를 함유하는 핵산 또는 프로테인, 또는 상기 프로테인 또는 핵산을 함유하거나 또는 발현시키는 세포 또는 조직과 결합하는 전사 부정확 부위를 표적으로 할 수 있는 약품을 제조할 수 있다. 상기 표적화 약품은 상기에서 기재한 것과 같은 항체(또는 이의 유도체), 프로브, 프라이머, 앱타머 등일 수 있다.
상기 표적화 약품은 샘플, 조직, 피험체 등에서의 전사 부정확의 검출, 모니터 등을 위한 진단 약품으로서 사용될 수 있다. 이러한 목적에 있어서 상기 약품은 라벨링 부분, 예컨대 방사성 라벨, 효소, 형광성 라벨, 발광성 염료 등과 결합시킬 수 있다.
표적화 약품은 또한 비정상 전사 부정확을 나타내는 세포 또는 조직 또는 유기체에 치료적 분자로서 사용될 수도 있다. 상기 약품은 독성 분자, 약물 등과 같은 활성 분자로서 사용하거나 또는 바람직하게는 활성 분자, 예컨대 독성 분자, 약물 등과 결합할 수 있다.
따라서 본 발명의 특정 실시양태는 전사 부정확을 표적으로 하는 약품을 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (i) 프로테인 또는 핵산의 전사 부정확 부위를 규명하는 단계 및 (ii) 상기 부위에 선별적으로 결합하는 약품을 제조하는 단계를 포함한다. 전사 부정확 부위는 예를 들면 주어진 RNA 분자에 유용한 서열의 정렬 및 특히 3' 말단에서 서열 변이체의 규명에 의해서 확인할 수 있다. 전사 부정확 부위는 또한 임의의 유전자 서열에서 본 발명에서 기재한 것과 같이 전사 부정확 규칙을 적용시키거나(예를 들어 실시예 5 참조) 또는 이후에 기재된 새로운 규칙을 적용시켜 확인할 수도 있다. 다음에 상기에서 규명된 부위를 포함하는 펩티드 또는 핵산 분자는 종래 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직한 실시양태에서 상기 방법의 단계 (i)는 핵산 또는 분비 또는 세포 표면 프로테인(예를 들면 리셉터 등)의 전사 부정확 부위를 규명하는 단계를 포함한다. 실제로 분비 프로테인 및 세포 표면 프로테인은 피험체에 투여하거나 또는 세포에 접촉시키는 표적화 약품을 사용하여 용이하게 표적화시킬 수 있다. 상기 TI-프로테인의 도메인의 예는 실시예에 기재하였다.
TI-프로테인 도메인에 대한 면역 반응의 야기 또는 자극 또는 억제 백신의 제조 및 용도
본 발명의 이론을 사용하면 TI-프로테인에 대한 면역 반응의 야기 또는 억제, 또는 상기 TI-프로테인 또는 상응하는 핵산을 함유하거나 또는 발현하는 세포 또는 조직에 대한 면역 반응의 야기 또는 억제에 대한 백신 조성물을 제조할 수 있다.
통상적으로 상기 백신 조성물은 면역원으로서 전사 부정확 부위의 서열을 포함하는 분자를 포함한다. 백신 조성물은 임의의 약물학적 허용 담체, 부형제 또는 보조제를 포함한다. 백신 조성물은 면역 시스템에 의해 세포 또는 조직이 파괴되는 결과로서 TI-프로테인의 발현 조직 또는 질병 세포에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해서 사용될 수 있다. 대안적으로 백신 조성물은 자가-면역 질병과 관련된 전사 부정확 부위에 대항하는 내성을 유도하기 위해서 사용할 수 있다.
따라서 본 발명의 특정 실시양태는 TI-프로테인, 또는 상기 프로테인을 발현시키는 세포 또는 조직에 대한 면역 반응을 야기, 자극 또는 억제시키는 면역원을 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (i) 프로테인 또는 핵산의 전사 부정확 부위의 규명 단계 및 (ii) 상기 부위 또는 이의 변이체를 포함하는 펩티드의 제조 단계를 포함한다. 전사 부정확 부위는 예를 들면 주어진 RNA 분자에 유용한 서열의 정렬 및 특히 3' 말단에서의 서열 변이체의 규명에 의해서 확인할 수 있다. 전사 부정확 부위는 또한 임의의 유전자 서열에서 본 발명에서 기재한 것과 같이 전사 부정확 규칙을 적용시키거나(예를 들어 실시예 5 참조) 또는 이후에 기재된 새로운 규칙을 적용시켜 확인할 수도 있다. 다음에 상기에서 규명된 부위를 포함하는 펩티드 또는 핵산 분자는 종래 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직한 실시양태에서 상기 방법의 단계 (i)는 핵산 또는 분비 또는 세포 표면 프로테인(예를 들면 리셉터 등)의 전사 부정확 부위를 규명하는 단계를 포함한다. 실제로 분비 프로테인 및 세포 표면 프로테인은 피험체에 투여하거나 또는 세포에 접촉시키는 표적화 약품을 사용하여 용이하게 표적화시킬 수 있다. 상기 TI-프로테인의 도메인의 예는 실시예에 기재하였다.
재조합 프로테인 제조 시스템에서의 전사 부정확의 감소
본 발명의 특정 목적은 재조합 제조 시스템, 특히 치료학적 프로테인 제조 시스템에서 발생할 수 있는 전사 부정확을 예방하거나 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다. 실제로 이러한 전사 부정확은 시스템의 제조 수율을 감소시키거나 또는 다양한 활성 프로파일을 나타낼 수 있는 비특성화 프로테인 상의 혼합물의 제조의 결과를 가져올 수 있다. 따라서 진핵 생물(예를 들면 효모, 포유류 세포 등) 제조 시스템으로서 세균성 제조 시스템(만약 원핵 생물 시스템에서과 전사 부정확 규칙이 동일한 경우)과 같은 재조합 제조 시스템에서의 전사 부정확의 발생 또는 비율을 감소시키는 데 크기 가치가 있으며, 추천된다. 이러한 감소는 핵산 분자를 코딩하는 서열을 개조하거나 및/또는 전사 부정확을 통해 발생하는 RNA 분자를 억제시킴으로써 획득될 수 있다. 대안적으로 전사 부정확 부위를 함유하는 프로테인은 배지에서 제거할 수 있다.
유전자에 있어서 전사 부정확의 민감성의 감소
본 발명의 특정 목적은 유전자에서 발생할 수 있는 TI를 예방하거나 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다. 실제로 이러한 TI는 프로테인의 활성 또는 발현에 영향을 미치거나 또는 다양한 활성 프로파일을 나타낼 수 있는 비특성화 프로테인 혼합물이 제조될 수 있다. 따라서 상기 유전자에 있어서 TI의 발생 또는 비율을 감소시킬 수 있는 것이 추천되며, 가치가 높다. 상기 감소는 유전자 서열을 변형시키거나(유전자 치료), 및/또는 전사 부정확을 통해 발생하는 RNA 분자를 억제시킴으로써 획득될 수 있다. 대안적으로 TI 함유 프로테인을 특이적으로 분해할 수 있다(예를 들면 분해를 표적으로 함).
RNA 수준에서 전사 부정확의 측정
전사체학은 암이 가장 빈번하게 발생하는 다양한 병리학적 상태에서 발생하는 RNA(우선적으로 mRNA) 수준에서 변이체를 측정하는 과학이다. 전사체학은 미리 규정한 유전자 서브세트를 규명하는 특이적 올리고뉴클레오티드 세트와 cDNA의 하이브리드화에 의존한다. 하이브리드화 효능은 cDNA로 역전사되는 임의의 주어진 RNA의 특이 서열에 따라 달라진다. 주어진 RNA에서 생각지도 않은 서열 변이체의 도입은 하이브리드화 효능을 감소시킬 것이므로 전사체학 칩에 의해 인지되는 변이가 야기된다. 전사 부정확이 RNA 염기 서열의 변경을 야기시킨 다는 사실의 발견은 두 가지의 직접적인 결과를 가진다: 첫째로 전사 부정확 때문에 염기 미스매칭의 결과를 최소화하기 위해서 전사체학 칩을 최적화하여 전사체학 실험의 효능을 개선시킨다. 실제로 전사체학 실험의 현재 한계는 연구들 사이의 재현성의 부족이다. 본 연구자들은 현재 상기 변이성의 주요한 부분은 전사 부정확에 의해 야기된다고 믿는다. 상기에서 언급한 전사 부정확의 규칙을 이해하면 정상 또는 질병 세포로부터 수득된 임의의 주어진 cDNA 혼합물에서의 전사 부정확의 비율을 특이적으로 측정하는 마이크로어레이 칩을 도안할 수 있다. RNA 수준에서 전사 부정확의 모니터링으로 주어진 세포에서 발생하는 전사 부정확의 상대적인 비율의 높은 작업 처리량의 스크리닝이 가능해진다. 상기는 질병 심각성을 결정하고, 치료학적 전략을 한정하며, 이들의 약리학적 민감 프로파일에 다른 질병 세포를 분류하는 기본적 정조를 제공한다. 동일한 스크린으로 또한 암 치료에서의 신규 약물의 효능을 시험할 수도 있다.
전사 부정확의 추가적 응용
전사 부정확은 확립된 유전자 코드에 다양성을 부여하는 새롭게 발견된 자연적 기작이다. 본 연구자들은 전사 부정확은 정상 조직에서 조차도 낮은 비율이기는 하지만 발생한다는 것을 관찰하였다. 본 연구자들은 전사 부정확이 생체 유액 및 조직의 살아있는 세포에 존재하는 매우 다양한 프로테인 및 게놈 상에서 규명되는 비교적 극미량의 유전자를 설명하는데 기여한다는 것을 제안한다.
본 발명자들은 전사 부정확이 면역학적 수준에서 특이적 기능에 기여한다는 것을 제안한다. 또한 본 발명자들은 면역 시스템은 그 자체를 규명하기 위해서 우선적으로 특이적 유전자에 영향을 주는 주어진 비율의 전사 부정확의 일부 또는 전부에 의존한다는 것을 제안한다. 따라서 아직 공지되어 있지 않은 이유로 발생하는 전사 부정확의 비율의 이상은 자가-면역 및 알러지 질병의 병리학에 기여하며 특이적 면역 반응을 유발시키는데 기여할 수 있다. 전사 부정확의 개개 사이의 차이는 또한 면역 시스템의 유전자의 다형성을 조건으로 하므로 면역 시스템, 예를 들면 T 또는 B 림프구의 세포의 순환에서 발생하는 전사 부정확의 비율을 결정하며, 또한 질병의 숙주 심각성 대 이식 조직의 심각성을 결정하고, 이식 조직의 제공자와 수락자의 적합성을 평가하는데 기여할 수도 있다.
본 연구자들은 또한 전사 부정확이 정상 노화 과정 중에 더 큰 비율로 발생한다는 것을 가정한다. 상기는 세포 복제, DNA 수선 및 정상적 비율의 전사 부정확 유지와 관련이 있는 모든 일반적인 효소 및 가장 특이적인 프로테인에 영향을 주는 결과를 점진적으로 감소시키는 상태를 만들 것이다. 따라서 상기에서 언급한 개념은 노화 기작에 대한 연구의 방향을 바꿀 것이다. 따라서 DNA에 의해 특이화 된 것에의 적합도 및 mRNA 및 cDNA 서열에 있어서의 스크리닝을 가능하게 하는 생화학적, 단백질학적, 전사체학적 및 기타 방법을 사용하여 주어진 개개에서 발생하는 전사 부정확의 비율을 정량할 수 있다. 따라서 전사 부정확의 비율을 감소시키는 신규 분자의 시험으로 생물학적 스크리닝을 받을 수 있으며, 노화 속도를 감소시키는 약물의 개발을 유도할 것이다.
본 발명의 추가 측면 및 이점은 본 발명을 설명하며, 본 발명의 범주를 이에 제한하지는 않는 하기 실시예 부분에서 기재할 것이다.
실시예 1. 통상적인 cDNA 라이브러리 구조 및 시퀀싱의 원리(도 1 참조)
상보적인 DNA(cDNA) 라이브러리를 제조하기 위한 첫번째 단계는 원하는 세포 또는 조직 타입에서 성순한 mRNA를 분리하는 것이다. 이들의 폴리(A) 테일때문에 매트릭스에 공유적으로 연결된 상보적인 올리고 dT로 하이브리드화하여 모든 세포 mRNA의 혼합물을 수득하는 것은 간단하다. 다음에 결합 mRNA는 낮은 염 완충액으로 용출시킨다. 다음에는 mRNA의 폴리(A) 테일을 mRNA 템플레이트로부터의 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 효소인 역 전사효소의 존재하에 올리고 dT로 하이브리드화 한다. 상기로 인해 원래의 mRNA 템플레이트와 이의 상보적인 DNA 서열을 함유하는 이중 가닥 뉴클레오티드가 수득된다. 단일 가닥 DNA는 다음에 알칼리 처리 또는 RNase H의 활성에 의해서 RNA 가닥에서 제거됨으로써 수득된다. 일련의 dG를 다음에 각 cDNA 가닥의 유리 3' 말단에 템플레이트는 요구되지 않지만 데옥시올리고뉴클레오티드를 첨가하는 DNA 폴리머라제인 말단 트랜스퍼라제라고 하는 효소의 활성에 의해서 단일 가닥 DNA의 3' 말단에 첨가한다. 올리고 dG로 원래 cDNA 가닥에 상보적인 DNA 가닥인 DNA 폴리머라제에 의해 합성하기 위한 플라이머로서 활성을 갖는 올리고 dC와 하이브리드화된다. 이러한 반응으로 원래의 제조에서 발견되는 mRNA 분자에 상응하는 완전한 이중 가닥 DNA 분자가 제조된다. 이러한 이중 가닥 DNA 분자 각각은 cDNA라고 하는 것이 일반적이며, 각각은 하나의 말단에 올리고 dC - 올리고 dG 이중 가닥 및 다른쪽 말단에는 올리고 dT - 올리고 dA 이중 가닥을 함유한다. 다음에 상기 DNA는 제한 부위에서 메틸화에 의해서 보호된다. 다음에 짧은 제한 링커로 두개의 발단을 라이게이션한다. 상기는 특정 제한 효소에 있어서의 인식 부위를 함유하는 이중 가닥 합성 DNA 세그먼트이다. 상기 라이게이션은 "평활 말단(blunt ended)" 이중 가닥 DNA 분자와 결합할 수 있는 박테리오파지 T4로부터의 DNA 라이게이즈에 의해서 실행된다. 다음에 각 말단에서 제한 부위에 의해 수득된 이중 가닥 평활 말단 DNA는 점착 말단을 만들기 위해서 제한 효소로 처리한다. cDNA 라이브러리의 구성에서 마지막 단계는 박테리아로 트랜스펙션된 특이적 플라즈미드로 제한 분해 이중 가닥을 라이게이션한다. 다음에 재조합 박테리아는 플라즈미드의 특이적 항체 저항력에 상응하는 항체의 존재하에 플라즈미드 라이브 러리의 제조를 위해 증식시킨다. 각 클론은 단일 부분의 mRNA로부터 유도된 cDNA를 운반한다. 다음에 이러한 클론 각각을 분리하고, 전통적인 시퀀싱 방법을 사용하여 시퀀싱한다. 시퀀싱의 통상적인 진행은 삽입 부위에서 개시하고, 각 클론에 있어서 400 내지 800 염기 쌍 서열을 수득한다. 상기 서열은 시퀀싱의 두번째 진행을 개시하기 위한 템플레이트로서 제공된다. 이러한 전방 전진도는 전체적인 플라즈미드 삽입물의 시퀀싱 진행이 유도된다. 다수의 cDNA 지정 ESTs의 시퀀싱 결과로 다수의 공개 데이타베이스가 축적된다.
실시예 2. 데이타베이스 해석
EST 데이타베이스는 cDNA로부터 수득된 cDNA 서열에 상응하므로 상기 라이브러리를 제조하기 위해 사용되는 조직에서의 임의의 주어진 시간에 존재하는 개개 mRNA의 서열에 기본적으로 상응한다는 서열 정보를 함유한다. 이러한 서열의 품질은 몇 가지 이유에 있어서 문제가 발생했다. 첫째로 상기에서 언급한 것과 같이 cDNA 라이브러리의 생성 방법은 초기에 진핵 생물 mRNA의 3' 말단에서 폴리(A) 테일의 존재에 크게 의존한다. 두번째로 mRNA는 RNase라고 하는 매우 풍부한 뉴클레아제에 의해 쉽게 분해되는 매우 깨지기 쉬운 분자이다. 세번째로 이러한 라이브러리를 쌓고 시퀀싱하는 동안에 사용된 원래 물질의 품질과 이의 저장에 거의 신경을 쓰지 않는다. 상기 이유때문에 EST 서열은 규명되고 완전하게 서열이 확인된 게놈 DNA의 단편이 임의의 특이적 mRNA를 암호화하는 지의 여부를 결정하기 위한 게놈 정보의 해석에 사용된다. 이러한 정황에 있어서는 EST 서열이 코딩 게놈 서열을 규명하기 위해서 유용하다. 그러나 EST 서열 자체에 의해 형성된 정보에 거의 주의를 기울이지 않았다. 실제로 DNA 게놈 서열은 이러한 입장을 지지하여 강한 기술적인 논쟁으로 보다 더 믿을 수 있는 것으로 생각된다. 본 연구자들은 EST 서열에 포함된 다양성은 생물학적, 분석학적 또는 임상적으로 확실한 정보를 함유할 것이라고 추측한다. 실제로 EST 데이타베이스는 모두 다양한 방법을 사용하는 다수의 연구자들에 의해서 제조되었다: 이러한 것이 본 연구자들이 각 방법론적인 편견이 특정 수의 오차로 배경의 노이즈 수준에 기여해야 한다는 것을 추측하도록 했다. 그러나 오차의 차이가 라이브러리를 생성하는데 사용된 특정의 물질 공급원때문에 존재한다면 오차 비율의 차이는 직접적으로 근원적인 공급원과 관련이 있을 수 있다.
이것을 시험하기 위해서 본 연구자들은 NCBI ftp 부위에서 이용가능한 est_human 데이타베이스를 검색했다. 본 연구자들은 이러한 서열이 인간 또는 생물정보학 방법에 의해서 해석 또는 해결되지 않으므로 이러한 데이타베이스를 선택하였다.
본 연구자들은 EST가 암 조직 또는 정상 조직에서 수득되었는지의 여부를 결정하기 위한 라이브러리 규명 시스템을 사용하였다. 각 라이브러리는 정상 또는 암 으로 라벨링하였다. 상응하는 라이브러리의 식별자와 각 EST의 가입 수를 매칭하여 본 연구자들은 정상 조직에서 수득된 것으로서 2.8 밀리언 EST와 암 조직에서 수득된 것으로서 2.6 밀리언 EST를 분류하였다.
EST 정렬을 수득하기 위해 본 연구자들은 이용가능한 megaBLAST 2.2.13 소프트웨어(Basic Local Alignment Search Tool, Zheng Zhang, A greedy algorithm for nucleotide sequence alignement search, J Comput Biol, 2000)를 공개적으로 사용하여 하기의 선택 파라메터를 명기하였다:
-d est_human : (dbEST로부터의 모든 인간 EST)에 대해 조사하기 위한 데이타베이스;
-i sequences.fasta : 풍부하게 발현된 유전자에 상응하는 참조 서열을 ㅎ하함유하는 FASTA 파일 포맷( 도 2 );
-D 2 : 통상적인 블라스트 아웃풋;
-q -2 : 뉴클레오티드 미스매칭에 있어서의 스코어 -2;
-r 1 : 단일 뉴클레오티드 매칭에 있어서의 스코어 1;
-b 100000 : 정렬이 기록된 서열의 최대 수;
-p 90 : EST와 참조 서열 사이의 최소 퍼센트 동일성;
-S 3 : 참조 서열과 매칭되는 EST 참작;
-W 16 : 정렬 연장으로 개시하기 위한 가장 완벽한 매칭 길이;
-e 10 : Karlin 및 Altschul(1990)의 스토매스틱 모델에 따라, 주어진 데이타베이스와 주어진 서열에 있어서 우연히 주로 발견될 것으로 기대되는 정렬의 수 인 기대 값(E -값);
-F F : 참조 서열을 거르지 않은 것;
-o NonFiltre_test_90.out : megaBLAST 리포트 아웃파일;
-v 0 : 한 줄 서술을 나타내기 위한 최대 서열 수;
-R T : (진짜는 T) : megaBLAST 아웃풋의 말단에서의 로그 정보 기록;
-I T : defiines에서의 GI's를 나타냄[T/F]
블라스트의 커맨드 라인:
megablast -d est_human -i C:＼SeqRef＼TPTl＼sequences.fasta
-o C:＼blast＼NonFiltre_test_90.out -R T -D 2 -I T -q -2 -r 1 -v 0 -b 100000 -p 90.00 -S 3 - W 16 -e 10.0 -F F
도 2(a-q)에서는 분석 용으로 사용된 17개 서열을 보여주고 있다; 블라스트의 뒤틀림을 피하기 위해서 mRNA의 참조 서열의 폴리A 테일을 조직적으로 제거하였다. 도 2r은 서열 변이체의 발생을 시험하기 위해서 사용된 유전자 리스트를 제공한다.
실시예 3. 정상 및 암 유래의 EST 사이의 서열 변이체의 규명
데이터베이스에서 이들의 풍부한 설명을 기초로 17개의 유전자를 선별했다. 다음에 각 EST 서열은 MegaBLAST를 사용해서 NCBI로부터의 이의 검증된 mRNA 참조 서열(RefSeq)에 대항해 정렬시켰다. 상기로 인해 임의의 주어진 염기가 이의 위치에서 매칭된 EST의 수에 의해서 한정된 매트릭스가 형성된다. 다음에 본 연구자들은 임의의 주어진 위치에서 RefSeq로부터 벗어난 EST의 비율을 측정하였다. 조직 유래에 상응하는 정렬 EST 서열을 비교하여 암 또는 정상 군의 각 염기 위치에서 발생하는 서열 변이체를 규명하였다. 도 4는 17개의 선별된 유전자에 있어서 정상 및 암 세트엣 발생하는 이러한 변이체의 그래픽 표현이다. 결과의 시각 시험으로 서열 변이체가 암 세트에서 가장 빈번하게 발생하였으며, 추가로 이러한 현상은 특이적 mRNA 위치에서 가장 우세하게 나타났다는 것을 확인하였다. 대부분의 관찰은 유전자의 3' 부분으로부터 우세하게 mRNA 서열의 초기 후에 적어도 400 내지 500 염기에 위치하고 있다. 아주 많은 수의 변이체가 SNPs에 의해서 설명할 수 없었다. 추정 SNPs (D)와 생물학적으로 유용한 SNPs (O)는 그래프 상에 나타내었다; 이러한 SNPs는 NCBI 데이터베이스(dbSNP, build 126, September 2006)로부터 수득하였다(Sherry, S. T., 등. (2001) Nucleic Acids Res 29, 308-11). EST 변이체(n=442)를 유도하는 추정 및 생물학적으로 유용한 SNPs 둘 다는 추가 분석으로부터 제외하였다(따라서 RNA 편집 부위(거짓 SNPs)도 또한 제외함).
상기 분석의 다음 단계는 암 및 정상 ESTs 사이에서 발생하는 서열 변이체에서의 통계적으로 유의한 차이를 시험하는 것이다. 각 위치에서 본 연구자들은 양면 비율 시험(two-sided proportion test)을 사용하여 정상 및 암 군 사이의 3개의 다른 염기의 것과 RefSeq 염기의 비율을 비교하였다. 상기 시험은 하기 조건이 충 족되도록 조직적으로 제공된다: n > 70 및 ((ni. * n.j)/n >5 i=l,2 ; j=l,2(여기서, n = 유전자에 있어서의 암 및 정상 ESTs의 수, n1. = 암 ESTs의 수, n2. = 정상 ESTs의 수, n.1 = RefSeq를 갖는 ESTs의 수, n.2 = 치환체를 갖는 ESTs의 수). 통계 시험은 상응하는 P-값이 0.05 이하라면 언제든지 역치 값이 5 %에서 양성이라고 하며; 이러한 경우에 귀무가설(즉 둘 다 비율이 동일함)은 거부된다.
또한 2개의 하기 단면 비율 시험은 변이성을 더 크게하기 위한 것으로 본다. 첫번째 시험에서는 통계 시험이 양성으로 나오는 경우 두개의 군에서 변이성에 차이가 나며, 다음에 이러한 경우에는 변이성이 암 세트에서 통계적으로 더 큰 지의 여부를 결정한 다는 결론이 나왔다. 대조적으로 두번째 시험으로는 변이성이 정상 세트에서 현저하게 높다는 가설을 확인하였다. 단면 시험 둘 다는 양면 시험에서 충족되는 것 보다는 동일한 조건인 경우에는 언제나 실행하였다.
도 3에서는 통상적인 블라스트 결과를 설명한다. 도 5a 및 5b에서 나타낸 것과 같이 대표적인 유전자 TPT1에 있어서 유전자 상의 임의의 주어진 위치에서 ESTs의 수는 암과 정상 군 둘 다에서 유사하다. 도 5c에서는 830개의 가능 비율 시험 중에서 489개가 선정된 표준을 충족한다는 것을 보여준다. 5 % 수준에서 통계적으로 유의한 비율 시험은 도 5d에 나타냈다. 위치 기준 평가기(Location Based Estimator, C.Dalmasso, P.Broet (2005) Journal de Ia Societe Francaise de Statistique, tome 146, nl-2, 2005)로 규정된 멀티 시험으로부터 수득된 평가 오차를 계산할 수 있다. 26개 비율 시험의 양성은 도 5d(n = 26; LBE = 33)에서 정상 조직(N>C)에서 발생하는 염기 치환체 때문이다. 상기는 암 군(C>N), (n= 145; LBE = 15)에서의 서열 변이체 때문에 발생하는 통계적으로 현저한 비율 시험의 축적과는 대조된다. 유사한 분석이 두번째 유전자 VIM에서 실행되었다( 도 5e-5h ). 또한 임의의 주어진 유전자 위치에서의 ESTs의 수는 암 및 정상 군에서 겹쳐진다. 1874개의 비율 시험 중 752개가 표준과 매칭된다. 또한 본 연구자들은 양성 비율 시험의 수에서의 큰 차이를 관찰했다: n=78 변이체는 정상 군때문이며(LBE = 50), n=269 변이체는 암 군때문이다(LBE = 24). 본 연구자들은 EST 데이터베이스에 풍부하게 존재하는 17개 유전자상에서 동일한 분석을 반복하였다. 17개 시험 유전자 중에서 15개에서 암 조직으로부터 수득된 ESTs에서의 서열 변이체가 더 크게 나타났다( 도 5j ). 상기 단계에서 통계적 시험의 압박으로 각 유전자의 위치 중 단지 9 내지 91 %(평균 32 %)만이 통계적 분석이 미친다.
상기의 본석의 첫번째 라운드의 결론은 동일한 유전자의 ESTs는 mRNA를 추출하는 조직 공급원(정상 대 암)에 따라 비교하는 경우에 차이가 있다는 것이다. 조직의 정상 또는 암 유래에 따라 EST 서열 변이체가 차이가 없는 기술적 오차 비율을 가정하고, 17개 시험 유전자 중에서 15개에서 조직 공급원때문에 서열 변이체를 보여준다는 사실을 고려하여, 본 연구자들은 이러한 차이는 직접적으로 ESTs가 생성되는 세포의 상태(정상 대 암 세포의 상태)로부터 나온다고 제안한다.
삽입과 결손을 연구하기 위해 유사한 실험을 실행하였다. 결론은 F3 필터를 적용시킨 후에 수득하였다(실시예 4 참조). 보다 엄격한 조건을 사용하여 비 생물학적인 이벤트(시퀀싱 오차, 메가블라스트 비정렬...)를 피했다: -10/+10 윈도우에 서 다른 변형이 존재하지 않는 경우에만 갭 또는 삽입이 일어났다. 각 위치에서 본 연구자들은 상기에서 기술한 양면 비율 시험을 사용하여 정상 및 암 사이의 다른 윈도우에 결손(또는 삽입)의 위도우 비율을 비교하였다. 도 5k 는 수득된 통계적 결과의 요약이다. 17개 시험 유전자 중에서 14개(또는 삽입에 있어서는 10개)에서는 암 조직으로부터 수득된 ESTs에서 더 큰 서열 변이체(결손 및 삽입)가 나타났다( Fig 5l ).
실시예 4: 암 세트 C>N 대 정상 세트 N>C에서의 변이체 초과 확인
암 또는 정상 샘플에서 유래된 라이브러리를 동일한 조건을 기본으로 진행시켰다. 따라서 라이브러리 구조 또는 클론 시퀀싱으로부터 수득된 램던 오차는 세트 두 개에서 동일한 비율로 발생하는 것으로 기대되며, 정상 및 암 EST 군 사이에서 관찰되는 차이는 기대할 수 없다. 수학적인 분석은 상기 해석가 일치한다(Brulliard M., 등 PNAS May 1, 2007 vol. 104 no. 18 7522-7527 - 보충 자료 도 7 참조).
본 연구자들은 다음에 하기의 이론적인 해석을 기본으로 필터링 절차를 순차적으로 적용시킴으로써 EST 이질성의 다른 공급원을 제거하기 위해 연구하였다. 우리의 초기 요구사항은 EST를 50개 이상의 염기와 ≥90 % 동일성을 가지며, 16개 이상의 연속적인 염기 상에 100 % 동일성을 갖는 RefSeq에 정렬하는 것이다. 도 6b에서 보여주는 것과 같이 모든 17개 우전자에 있어서 암과 정상 세트를 비교하는 경우 각각 2281 및 725개의 통계적으로 유의한 차이 C>N 및 N>C가 수득되었고(컬럼 F1), 추정 및 생물학적으로 확인된 SNPs와는 별개인 것이 수득되었다. 두번째 필터(F2)에서는 각 EST를 이의 길이 중 70 % ld상이 연속적으로 RefSeq에 정렬되는 것이 요구되었다. 세번째 필터(F3)는 bona fide RefSeq에서 보다 잘못 추정 및 위 유전자와 매우 밀접하게 관련된 서열의 ESTs는 제거하였다. 네번째 필터(F4)는 각 EST 정렬 중 첫번째 및 마지막 50개 염기를 분석에서 삭제하였다. 본 연구자들은 정렬된 EST 말단에서의 오차 축적으로부터 수득되고 및/또는 추가의 최적의 정렬을 위해 MegaBLAST 프로그램에 의해 만들어질 수 있는 EST의 3' 및 5' 경계선에서 미시매칭을 제거하기 위해서 상기 필터를 사용하였다. 마지막 필터(F5)는 정상 및 암 세트 사이의 길이에서의 임의의 차이를 제거하기 위해서 각 유전자에 있어서의 EST 서열 길이를 정상화하였다. 실제로 본 연구자들은 첫번째 4 필터를 적용시킨 후에 정상 ESTs의 것 보다 평균 암 EST 길이가 더 길다는 것을 확인하였다(각각 640 ± 248 및 554 ± 229 염기). 그러나 본 연구자들은 또한 평균 EST 길이가 ㅈ정상 및 암 세트 사이에 차이가 없는 5개 유전자에서 현저하게 더 큰 암 EST 이질성을 관찰하였다(TPTl, VIM, HSPA8, LDHA, CALM2).
통계적으로 현저한 C>N 시험의 수는 N>C 시험의 수 보다 더 크게 남아있지만, 비율 C/N은 3.15 (Fl)에서 2.05 (F5)로 감소하였다( Fig 6c ).
암 EST 이질성이 시퀀싱 진행의 말단에서의 오차 축적에 의한 것이 아님을 추가로 확인하기 위해서 본 연구자들은 단지 임의의 시퀀싱 진행 중 450개 염기 보다 길지않으며 첫번째 50개 염기 후에 제공되는 정보만 고려하였다. 이러한 철저 한 필터링 후 통계적으로 현저한 C>N 시험은 모든 17개 유전자에 있어서 455(LBE = 92)이었으며, N>C 시험은 292(LBE = 119)이었다. 따라서 암 세트에서의 증가된 EST 이질성을 야기하는 서열 변이체는 암 세포 mRNA 이질성의 직접적인 영향이라는 것을 합리적으로 가정할 수 있다( Fig 6d ).
본 연구자들은 다음에 배양 암 세포로부터 생성된 ESTs를 제거한 후에 암 세트에서 더 큰 통계적으로 현저한 EST 이질성이 지속되었다는 것을 독립적으로 확인하였다. 이러한 필터링 후 통계적으로 현저한 C>N 시험은 모든 17개 유전자에 있어서 1009(LBE = 117)이며, N>C 시험은 445(LBE = 193)였다( Fig 6e ).
실시예 5. 암 세포에서의 전사 부정확때문에 발생하는 염기 치환체 코드의 파괴.
본 연구자의 다음 목표는 전사 부정확 때문에 발생하는 기재된 염기 치환체 현상이 랜덤한 현상이거나 또는 특이적이 규칙을 따르는 지의 여부를 결정하는 것이다. 상기를 획득하기 위해서 본 연구자들은 C>N이 통계적으로 현저한 EST 변이체 상에 촛점을 맞추었다. 필터링 절차에 의해 생길 수 있는 편견을 피하기 위해서 본 연구자들은 모든 유용한 비-필터된 결과를 사용하였다. 전사 부정확이 랜덤한 과정이 아니라는 첫번째 지적은 염기 치환이 시험 유전자의 5' 부위에서 드물게 발생한다는 것이다. 모든 시험 유전자에 있어서 본 연구자들은 성숙한 mRNA의 첫번째 400-500 염기에서 발생하는 염기 치환 현상을 매우 드물게 관찰하였다. 두번 째 관찰로 전사 부정확은 치환 이벤트가 검출되지 않은 것(비 이질성, NH, n=12273)과 치환 이벤트의 상부 및 하부스트림(이질성, H, n=2281) 서열을 비교하는 경우 관찰되는 게놈 DNA 템플레이트 상의 염기 조성물에서 차이가 있다는 관찰로부터 유래된 랜덤한 것이 아니라는 것이다. NH 부위에 있어서의 표준은 0.5 % 이하의 암 세트 변이체이며, 정상 세트 변이체와는 통계적으로 차이가 없었다( 도 7a ). 이러한 분석에서 본 연구자들은 b0로서 치환이 일어난 염기를 참조하고, pmRNA 5' 상에 위치한 염기는 b-n로서 참조하고, 3' 말단에 위치하는 염기는 b+n으로서 참조했다. 명확함을 위해서 본 연구자들은 상기 분석에서 pmRNA의 염기 조성물을 참조했다: 상기는 비-템플레이트 가닥(RNAP에 의해 전사되지 않은 가닥)에 DNA에 상응한다. 상기 결과로 인해 첫째로 모든 4개의 염기는 동일하게 변이체에 영향을 받기 쉬운 것은 아니라는 것을 확인하였다: bO = A (33%) ~ T (32%) ≫ C (21%) ≫ G (14%). 추가로 이벤트 부위의 4개 염기의 업스트림과 3개 염기의 다운스트림의 조성물은 현저한 EST 변이체가 없는 부위의 것과 통계적으로 차이가 있다( 도 7a , 상기 염기 조성물은 %로 나타내며, 회색 음영은 풍부한 염기를 나타내고; 어두운 회색은 소수 염기를 나타냄). 특이적으로 변이체가 발생하는 부위는 보다 빈번하게 선행하며, A ≥ G > T = C가 뒤따른다.
따라서 암 EST 이질성의 발생은 랜덤하지 않지만 치환이 일어난 염기의 ㅌ트특성에 의해서 첫째로 결정되며, 둘째로는 근접하게 선행하고, 이벤트에 뒤따르는 염기의 특성에 의해 결정된다.
본 연구자들은 다음에 대체 염기가 랜덤하게 선택되는지의 여부가 궁금했다. 도 7b에서 이러한 경우가 아닌 것을 제거한다. 비율에서의 통계적으로 현저한 차이는 대체 염기가 랜덤하게 선택되는 귀무가설로 계산하였다(모든 3개의 대체 염기를 균일한 분포로 하는 조정 시험). A는 C(p = 2.8xlO-125)로 대체하는 것이 바람직하고, T는 G(p = 5.7xlO-29)로 및 G는 A(p = 2.2x10-32)로 대체하는 것이 바람직하다. C의 치환은 아주 작은 T로 보다 평탄하게 분포하는 것을 보여준다(p=0.007).
다음에 본 연구자들은 바람직한 염기 대체를 기본으로 하는 원인을 찾았다. 이것을 획득하기 위해서 본 연구자들은 2개 세트의 유익한 및 비-유익한 이벤트를 구분하였다.
유익한 이벤트는 치환 염기가 선행하는 염기(b-1) 또는 이후의 염기(b+1)과는 상이한 상황이다(n=1676)( 도 7c ). 비-유익한 이벤트는 이러한 표준에 매칭하지 않는 상황이다. 유익한 이벤트를 분석하는 경우에 2개의 경우를 고려하였다: 치환 염기를 b-1 또는 b+1(79%)으로 대체하거나 또는 b-1 및 b+1(21%)로 아진 다른 염기로 대체하였다. 1) 첫번째 서브세트에서 대체 염기는 b-1(n = 799; 도 7c 패널 B) 또는 b+1(n = 530; 도 7c 패널 C)와 동일하다. 대체 염기가 b-1인 경우 다음에 b0=A (36%) > C (30%) ≫ T (21%) ≫ G (13%)이다( 도 7d 패널 A). A는 우선적으로 C로 대체된다(경우의 71%). 대체 염기가 b+1인 경우 b0 = T (47%) ≫ A (21%) > C (19%) ≫ G (13%)이다( 도 7a 패널 B). T는 우선적으로 G로 대체된다(71%). 흥미롭게 주의 염기의 통계적 중요성도 또한 상이하다( 도 7d 패널 A 및 7d 패널 B). b-1 치환에 있어서, 염기 조성물의 상대적인 영향 패턴은 bO > b-1 > b-2 > b+1 > b- 3 > b+2이다. b+1 치환에 있어서는 주의 염기의 상대적인 영향은 패턴 bO > b+1 > b-1 > b+2 > b-3 > b-2 뒤에 온다. 2) 유익한 이벤트의 두번째 서브세트에서 대체 염기는 b-1 또는 b+1에 일치하지 않는다(n = 347; 도 7c 패널 D). 영향을 받은 염기는 하기 순서이다: A (47%) > T (29%) > C (14%) > G (10%). A는 가장 일반적으로 C로 대체되며(경우의 91%), T는 C(50%) 및 A(42%)로, C는 G(46%)로 및 G는 C(73%)로 대체된다. 따라서 대체 염기가 b-1 또는 b+1와 일치하지 않는 경우, 대체 염기는 랜덤하게 선택되지 않지만 C가 큰 초과량이다.
본 연구자들은 다음에 1)b-1 = b+1이며, 2) b-1 = bO = b+1의 상황인 비-유익성 이벤트 세트를 고려하였다( 도 7c ). b-1 및 b+1가 동일하지만 b0과는 상이한 경우(n = 339; 도 7c 패널 E), 치환 염기는 하기의 순서이며: T (34.8%) > G (23.6%) > C (21.2%) > A (20.4%) 및 도 7b에서의 바람직한 동일 패턴 이후에 온다: T -> G, G -> A, A -> C. 3개의 동일한 염기의 반복 중심 염기 상에서 발생하는 치환(n = 266; 도 7c 패널 F)은 하기 순서로 관찰된다: A (46.2%) > T (36.9%) > G (10.5%) > C (6.4%). 상기의 경우에 대부분의 일반적인 치환 이벤트는 하기와 같다: A -> C 및 T -> C 및 A. 희귀한 GGG 치환은 GCG로 대체되는 것이 가장 일반적이며, CCC는 CAC로 대체된다( 도 7c ).
따라서 치환이 연속적인 동일 염기 내에서 발생하고, 치환이 b-1 또는 b+1에 일치하지 않는 경우에 C는 가장 일반적인 대체 염기이다( Fig 7c ). 대체 염기가 b-1에 일치하는 경우, 대부분의 일반적 치환은 A -> C이며; 대체 염기가 b+1에 일치하면, 대부분의 일반적인 치환은 T -> G이다.
따라서 치환이 일어나는 염기 또는 대체 염기 어느 것도 랜덤하게 선택되지 않는다는 결론이 나올 수 있다. 현상 둘 다는 치환이 일어나는 염기의 조성물 및 상기 이벤트의 업스트림 및 다운스트림에 위치하는 염기의 것에 의해서 규정되는 예측할 수 있는 패턴을 따른다
특이적 알고리즘은 임의의 주어진 서얼에서의 염기 치환 발생을 측정하는 동기 조성물을 명확하게 규명하기 위해서 규정될 수 있다.
본 연구자들은 다음에 N이 안정하거나(정상 세트에서의 동일한 위치에서 관찰되는 일탈이 없음) 또는 그렇지 않은 두개의 세트에서 세트 C>N를 분리하였다. 만약 정상 세트에서의 평균 일탈 퍼센트로서 규정된 특정 역치를 초과한다면 일탈이라고 한다. 도 7e에서는 -4/+3 사인이 N이 일탈하는 C>N 세트에 의해서 운반되는 것을 보여준다. 배경 길이는 다른 세트에서는 덜 중요하다. 도 7f에서는 N이안정한 C>N 세트에서 보다 N이 일탈하는 C>N 세트에서 보다 중요한 500-1000 간격으로 축전되는 것을 보여준다. 후자는 초기 이벤트(0-500 간격)가 나타났음을 보여준다. C>N 위치에서의 대체 염기는 두개의 세트 사이에서 유사했다( Fig 7g ).
결손 또는 삽입의 경우에는 결과로서 방출된 염기(398 C>N 경우)는 하기 순서이며: C (46.0%) > T (37.9%) ≫ A (9.3%) > G (6.8%)( 도 5m ), 삽입 염기(225 C>N 경우)는 하기 순서임을 확인하였다: G (36.0%) > C (30.2%) > A (21.8%) > T (12.0%)( 도 5o ). 본 연구자들은 결손 또는 삽입 이벤트가 종종 보존된 동일 염기에서 발생한다는 것을 관찰하였다. 이벤트가 가변 길이의 확장에서 94.7%의 결손과 81%의 삽입이 발생하는 것을 효과적으로 보여주도록 분석하기 위해 특수 프로그 램을 도안하였다. 확장은 양극일 수 있으며, 대칭적(예를 들면 AAATAA)이거나 또는 그렇지 않거나(예를 들면 CCCGG) 또는 단일 뉴클레오티드 반복(예를 들면 AAA)일 수 있다( 도 5m-5p 의 모티프 참조). 결손의 경우에 방출 염기는 경우의 84 %에서 b-1 또는 b+1 염기(확장)와 동일하다. 대부분의 모티프는 C > T > A∼G의 이중 또는 삼중이다. 유사한 결과가 삽입의 경우에도 관찰된다. 실제로 확장 모티프는 C>N 및 N>C에서 차이나게 나타나지 않았다. C>N 또는 N>C는 특이적으로 확장 주위의 다른 정보로부터 나올 수 있다. 더 많은 유전자 상에서의 추가 분석으로 상기 관찰 결과를 확인할 것이다.
모든 17개 유전자를 고려하여 본 연구자들은 100 염기 당 10의 비율로 EST 이질성을 관찰했다( 도 5j 및 도 8a - c ). 상기 비율은 게놈 DNA에서 발생하는 돌연변이의 임의의 기술된 비율을 초과한다. 참조로서 단일 뉴클레오티드 다형성은 매 300 염기마다 게놈에서 랜덤하게 발생하는 것으로 평가할 수 있다. 전사 DNA에 영향을 주는 단일 뉴클레오티드 다형성의 비율은 매우 낮다. 매 3000 염기 마다 발생하는 것으로 평가되었다. DNA 돌연변이는 암에서 보다 빈번하게 발생한다는 것이 명백하다. 그러나 본 연구에서 사용하는 17개 유전자 중에서 14개를 포함하는 유방 및 콜론 암 DNA 시퀀싱의 큰 효과로 106 염기 당 3.1 돌연변이로 평가된 신체 돌연변이 비율이 유도된다(Sjoblom, T., 등. (2006) Science 314, 268-74). 따라서 본 발명에서 기재된 전사 부정확은 DNA에 영향을 주는 돌연변이에서보다 더 큰 비율로 발생한다. 보다 중요하게 DNA 상의 대부분의 염기 치환은 게놈 DNA의 10 % ld하가 mRNA로 전사되므로 단백질 수준에서 제한된 결과를 가진다. 대조적으로 전사 부정확에 의한 염기 치환은 단백질 기능에 직접적인 영향을 준다. 실제로 여기서 기재한 2281 치환 중 1179는(1548 CDS - 369 잠복 치환) 단백질 AA 일차 서열 상에 즉각 충돌하는 염기 치환을 유도한다( 도 8d ). 가장 중요하게 정지 코돈에 영향을 주는 현저한 염기 치환은 17개 시험 유전자 중에서 7개에서 관찰되었다. 전사 부정확의 개념 이전에 그러나 인간 단백질은 "비번역 부위(untranslated regions)"이라고 하는 RNA 서열에 의해 암호화되는 추가의 코딩 서열을 함유할 것이라는 것을 제안되지 않았다. 본 연구자들은 전사 부정확 때문에 자연 정지 코돈에서 발생하는 염기 치환이 특이 AA를 암호화하는 신규의 코딩 부위를 드러낸다는 것을 보여준다. 상기 신규의 코딩 부위는 자연적인 열린 해독틀(native open reading frame)과 일치한다. 자연적인 정지 코돈은 코딩 코돈으로 형질 변환된다. 염기의 다음 트리플릿은 AA로서 해독되며, 신규의 정지 코돈에 도달할 때까지 신규의 코딩 부위와 함께 번역을 진행한다. 본 연구자들은 상기는 실제로 전사 부정확을 설명하는 17개 유전자 중 8개의 경우라는 것을 입증하였다. 8개 모두는 상응하는 RefSeq와 함께 틀 내에 대안적인 정지 코돈을 함유한다(GAPDH는 대안적인 정지 코돈을 함유하지 않음). 상기는 각 경우에 각각 TPTl, RPS6, RPL7A, VIM, RPS4X, FTHl, FTL 및 TPIl에서의 14, 7, 13, 15, 13, 4, 9, 55 AA의 신규의 코딩 서열을 만들므로 즉각적인 결과를 가진다( 도 10 ). 이러한 AA의 추가로 암에서 크게 강화될 것인 모티프를 만드는 잠재력을 가지며; 이러한 모티프는 단백질의 신규 기능을 가져오거나 또는 그렇지 않을 것이다. 이러한 발생의 예견으로 진단, 치료 또는 다른 목적에 유용할 수 있는 유용한 기술의 개발이 가능해진다. 이러한 발생의 예견으로 또한 단백질의 카르복시-터미널 말단에서의 특이 서열의 암을 인식할 수 있는 특이적 항체의 개발이 가능해진다. 현재까지는 카르복시-터미날 말단에서직접적인 단백질 시퀀싱을 할 수 있는 분석 방법은 없다. 그러나 이들의 NH2 터미널 말단으로부터의 분해 생성물의 서열과 단백질을 효소적으로 분리할 수 있다. 또한 질량 분석기를 사용하여 단백질 가수 분해에 의해서 제조되는 펩티드의 AA 함량을 분석할 수도 있다. 본 연구자들은 추가로 이러한 대안적인 정지 코돈은 또한 전사 부정확에 의해서 영향을 받는다는 것을 보여준다(7/9 유전자는 두번째의 영향을 받은 대안적인 코돈을 가짐). 상기에서 기재한 동일한 현상은 서열의 신규 세트의 판독을 추가로 확장시킬 수 있다. 본 발명의 사용하는 모든 단백질 서열의 해석으로 염기 치환을 정확하게 번역하거나 또는 그렇지 않은 번역 기계의 능력뿐만 아니라 코돈 사용빈도에 따라서 다르게 보다 또는 덜 효과적으로 전사되는 몇 가지의 기대하지 않은 코딩 mRNA 서열을 밝혀질 것이다. 사실은 염기 치환으로 리보좀 판독 비율을 변결할 수 있는 mRNA 구조 변화를 유도할 수 있다. 그럼에도 불구하고 본 연구자들은 염기 치환이 RNA 구조 변화와 관련이 없다는 것을 가정한다. 정지 코돈 변경 발생을 기본으로 본 연구자들은 암 조직에서 mRNA 중 4 % 까지 이러한 추가의 코딩 부위를 함유하는 영향을 받은 유전자에서 평가한다.
몇 가지의 필터를 기준으로 하는 특이 프로그램을 사용하여 추정 포스트 정지 펩티드(PSP)의 존재에 있어서 모든 단백질 서열에서 해석할 수 있다. 연구 단 백질에 상응하는 핵 서열을 회수한 후 상기 프로그램으로 상에서 다른 정지를 갖는 캐노니칼 정지 후의 핵 서열의 존재 또는 부재를 확인한다(이러한 변경 정지 코돈에 영향을 주는 전사 부정확의 경우 1개 이상의 정지를 우회할 수 있는 가능성을 고려할 수 있음). 최소한의 길이를 잠재적인 항원 패턴 예견에 있어서의 최소 표준에 따라서 고정할 수 있다(예를 들면 단지 12개 아미노산 이상을 암호화하는 서열로 결국에는 펩티드 길이가 더 작아질 수 있음). 다음에 항원 PSP를 저장한다( 도 18 ). 추가 단계를 사용하여 캐노니칼 정지의 러닝 머신을 트레이닝시켜 해석된 후보물을 확인한다: 실제로 1개 이상의 정지 코돈의 염기를 전사 부정확에 의해서 치환될 수 있는 가능성을 결정할 수 있다. 또한 질량 분석기를 사용하여 단백질 가수 분해에 의해 발생된 펩티드의 AA 함량을 분석할 수도 있다.
본 연구자들은 또한 신규의 프로테인 서열의 번역을 가능하게 하는 조건을 만드는 것 이외에 전사 부정확을 mRNA에 조숙한 정지를 도입시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 캐노니칼 열린 판독틀 내에 발생하는 24개의 신규 정지 코돈은 17개 유전자 중 13개 내에서 확인되었다. 상기는 전사 부정확이 특이 도메인이 부족한 더 짧은 프로테인의 제조를 야기할 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 면처리된 프로테인으로 기능의 증가 또는 손실을 초래할 수 있다. 프로테인의 3-D 구조가 영향을 받아 면역 시스템에 의해 인식될 수 있는 신규 본체를 제조할 수 있다.
마지막으로 17개 시험 유전자에서의 전사 부정확이 모든 규명된 C>N 치환 중 50 %가 AA 변경을 유도한다는 것이 밝혀졌다. 17%는 동일한 군으로부터의 또 다른 것에 의한 AA의 대체에 일치하며, 33%는 AA의 상이한 분류로부터의 AA의 치환과 일 치한다. 따라서 전사 부정확은 잠재적 변형 기능 또는 활성을 갖는 신규의 AA 서열을 갖는 프로테인을 발생시킬 수 있다. 상기에서 기재한 규칙을 사용하여 전사 부정확을 예견하면 프로테옴 실험의 결과와 프로테인 특성의 변화를 합리적으로 예견할 수 있을 것이ㄷ.
실시예 6. 생물학적 확인
생물학적인 확인 두가지 수준에서 실행한다: mRNA와 프로테인.
첫째로 흥미로운 17개 유전자 중 mRNA 치환은 인간 암 조직에서 검출할 것이다. 본 연구자들은 서열 돌연변이를 검출하기 위한 대규모의 크로마토그래프 방법인 DHPLC(Denaturing High Performance Liquid Chromatography)를 사용하였다. 실험의 원리는 도 11a-c에 기재하였다. 첫번째로 본 연구자들은 이형접합자 형성 및 검출을 효과적으로 하는 샘플 중의 돌연변이 DNA의 퍼센트를 평가하기 위한 Transgenomic DHPLC 역치를 시험하는 방법을 개발하였다. 실제로 1 및 3 염기 치환을 갖는 300bp PCR 단편을 사용하였다. 상기 단편의 상이한 비율을 제조하였다: 0%, 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, 20% 또는 50%. DHPLC로 샘플이 2.5 내지 5 % 돌연변이 DNA를 함유하면 [정상] 및 [정상 플러스 돌연변이] DNA를 구분할 수 있다( Fig 11d ).
상기 결과는 본 연구자들이 흥미로운 유전자에 있어서의 정상 및 암 조직으로부터의 mRNA를 구분할 수 있다는 것을 나타낸다. 정상 및 암 인접 조직으로부터 추출된 mRNA를 사용하여 세개의 유전자를 시험하였다: GAPDH, ENOl 및 TMSB4X. DHPLC가 DNA 상에서 활동하므로, mRNA 샘플은 역 전사효소를 사용하여 cDNA로 전환된다. 본 연구자들은 정상 조직으로부터 발생하는 EST에서 보다 암 조직으로부터 나오는 EST에서 보다 현저한 치환을 나타내는 부위를 선택하였다. 증폭 용의 프라이머는 도 12에 나타냈다.
실험의 첫번째 세트에서 암 및 인접 정상 조직(간, 신장, 유방 및 콜론)으로부터의 몇 가지의 cDNA를 상기 프라이머를 가지고 PCT로 증폭하고 DHPLC 시스템에 주입하였다. 오븐의 온도는 Navigator 소프트웨어(Transgenomic)로 선택했다. 상기에서 기재한 유전자에 있어서의 프로파일을 수득하고, 대표적인 실험은 ENOl, GAPDH 및 TMSB4X 유전자에 있어서 도 15에 나타냈다. 도 15a 내지 15c에서 보여주는 것과 같이, 암 프로파일은 GAPDH 및 ENOl 유전자에 있어서 정상 프로파일과는 명백하게 상이했다. 기대하던 것 처럼 TMSB4X 유전자에서는 차이가 관찰되지 않았다(적은 전사 부정확 부위). 동일한 PCR 생성물 및 2개의 다른 PCR 생성물의 주입은 3회 실행하고(도 15b 및 15 c), 상기 프로파일은 동일한 실험에서 재현성이 매우 높았다. 그러나 차이의 특성은 상기 실험으로부터 추론할 수 없었다.
결론적으로 mRNA 기본으로 하는 상기 생물학적 확인을 연속적으로 실행한다. 사실 암 조직으로부터 나온 PCR 생성물의 시퀀싱으로 가장 많은 돌연변이를 정확하게 검출할 수 있다.
역 전사 PCR 증폭 mRNA의 전통적인 생거 시퀀싱 방법으로는 특이 위치에서 15-30% 이하의 비율로 발생하는 서열 변이체를 검출할 수 없다( Fig 16 ). 실제로 돌연변이 및 비 돌연변이로 공지된 서열로부터의 증폭 생성물 혼합물의 시퀀싱으로 수득된 돌연변이 염기 결정은 50-50% 혼합으로 수득되며, 최소의 피크가 15%ㅇInd에p에서jEmulsion PCR are more sensitive methods allowing the detection of ㄱ검출된다. 피로시퀀싱 및 에멀젼 PCR은 cDNA 이질성을 검출할 수 있는 보다 민감한 방법이므로 암 및 정상 세포로부터 수득된 RT-PCR 생서물의 분석이 가능하다(Thomas, R. K, 등. (2006) Nat Med 12, 852-5).
전사 부정확에 의해 영향을 받는 유전자는 이의 전사 부정확 부위를 포함하고, 포함하지 않는 전체 또는 단편을 암호화한다. 캐노니칼 정지 코돈이 있고 및 없는 구조물은 네오마이신 저항성을 암호화하는 유전자로 틀 내에서 라이게이션한다. 암 및 정상 세포는 처음에는 일시적으로 다음에는 지속적으로 이러한 키메릭 구조물로 형질전환된다. 본 연구자들은 전사 부정확이 캐노니칼 정지 코돈을 변화시켜 네오마이신 유전자를 번역하고 네오마이신 저항 세포를 제조한다는 것을 예견한다. 본 연구자들은 네오마이신 저항성이 있는 암 세포를 보다 더 신속하게 성장시키며, 이러한 세포의 모양을 정상 세포의 모양과 현저하게 상이하게 할 것임을 예견한다. 또한 본 연구자들은 이러한 세포가 보다 침략적이며, 암 진행의 마지막 단계에서 세포와 비교할 수 있다는 것을 예견한다. 따라서 상기 기술은 개개 환자로부터의 상이한 세포의 암 상태를 결정하기 위해 사용할 수 있다.
전사 부정확의 결과로서 발생하는 네오마이신 저항성의 최종 증거는 게놈 정보가 변하지 않고 남아있다는 것을 보여주고, 게놈 DNA로부터 증폭된 삽입 구조물을 시퀀심하여 수득될 것이다. 본 연구자들은 또한 네오마이신 저항성 세포로부터의 mRNA가 전사 부정확때문에 돌연변이된 정지 코돈을 함유한다는 것도 확인할 것 이다.
전사 부정확 부위를 검출할 수 있는 하나의 기술은 암 및 정상 환자 조직으로부터 추출한 RNA로부터 역전사된 cDNA를 클로닝하는 것으로 구성되는 cDNA 라이브러리의 작성이다. 특이 유전자로부터 증폭 또는 증폭되지 않은 각 cDNA를 대장균에 형질전환시킨 분리 플라즈미드에서 클로닝한다. 상이한 대장균 콜론을 피킹하여 플라즈미드를 시퀀싱한다. 시퀀싱할 필요가 있는 클론의 수는 클론된 cDNA 단편에서의 치환 퍼센트에 따라 달라진다. 통계적인 분석으로 전사 부정확 부위에서의 서열 변이체를 알 수 있을 것이다. 이러한 기술은 개선시킬 수 있다. 실제로 특이 플라즈미드로 역전사 및 증폭시킨 후에 cDNA를 예를 들면 lacZ 유전자와 같은 리포터 유전자를 운반하는 플라즈미드 내에서 클로닝할 수 있다. 상기 cDNA와 리포터 유전자는 단계적으로 클로닝한다. mRNA의 정지 코돈 서열에서 치환이 발생하는 경우에 리포터 유전자가 발현된다. 대장균 세포가 이의 구조로 형질전환되는 경우 cDNA가 정지 코돈에서 돌연변이된 플라즈미드를 운반하는 콜론을 리포터 유전자의 발현으로 선택한다. 상기 후에 플라즈미드를 정지 코돈의 치환이 존재하는 경우 확인하기 위해서 시퀀싱할 수 있다.
특이 플라이머로 실시간 RCR을 기본으로하는 또 다른 기술을 사용하여 전사 부정확 부위를 검출한다. 이러한 프라이머는 통계적 분석을 기본으로 서열 변이체(들)와 cDNA가 매칭되도록 도안한다. 두번째 프라이머는 서열 변이 없는 cDNA와 매칭하도록 도안한다(참조). 프라이머 서열에서의 변이체(들) 수는 매우 중요하며, 본 연구자들은 연구되는 위치외의 2개의 돌연변이가 특이적 형광성 신호를 수 득하기 위해서 필요하다는 공지된 서열 변이 상에서 시험 실험을 결정하였다. 프라이머가 서열 치환없는 cDNA(참조)와 상보적인 경우에 형광성 신호는 특이적 증폭 사이클 수에서 검출된다. 서열 치환을 포함하는 프라이머로 증폭된 동일한 cDNA로 더 큰 수의 증폭 사이클로 나타나는 형광성 신호를 유도한다. 2개 프라이머와 증폭 사이클 수 사이의 차이는 서열 치환이 있는 cDNA의 존재를 직접 평가한다. 또한 본 연구자들은 상기 방법이 공지된 서열 믹스에서 돌연변이 서열 중 1%를 검출하기에 충분하게 민감하다는 것을 확인하였다.
통상적인 실험에서 암 및 정상 환자 조직으로부터 추출한 RNA를 역전사하고, 상기 특이 프라이머 각각으로 증폭시킨다. 다음에 두개의 프라이머로 증폭 사이클 사이의 차이를 측정한다.
마지막으로 본 연구자들은 자연적인 정지 코돈에 영향을 주는 경우 유도되는 신규의 프로테인에 촛점을 맞출 수 있다. 본 연구자들은 정지 코돈은 흥미로운 17개 유전자 중 9개 있어서 현저하게 영향을 받은 것으로 확인했다. 상기로 인해서 카로복시-터미널 말단에서 신규의 서열을 갖는 별개의 특수 프로테인 집단이 유도된다. 본 연구자들은 영향을 받은 유전자에 있어서의 암 조직은 정상 조직에서 보다 더 긴 4% 프로테인을 함유한다는 것을 평가했다.
이러한 가설에 의해 본 연구자들은 60개의 풍부한 플라즈미드 프로테인( 도 13 )을 분석하고, 가능한 PSP를 연구했다. 본 연구자들은 PSP가 충분히 길며 항원성인 22개 유전자를 발견했다( 도 18 ). 다음에 본 연구자들은 유도된 추정의 긴 프로테인 서열을 연구했다( 도 18b-c ). 본 연구자들은 이러한 22개의 흥미로운 프로 테인 중 2개를 선별했다: APOAI, APOAII 및 APOCII. 상기 분석을 기본으로 본 연구자들은 암-환자 플라즈미드에 더 긴 프로테인을 발견하는 것을 기대한다(13, 16 및 17 AA 더 김). 이러한 전사 부정확 펩티드 서열은 면역원성인 것으로 예상되며, 이러한 신규의 서열에 직접적으로 대항하는 항체는 전사 부정확을 측정하기 위해서 특이적 리간드를 나타낸다( 도 14 ). Kyte-Doolittle 분석으로 이러한 ㅅ서성서열이 소수성이 아니라는 것을 알 수 있으므로 본 연구자들은 순환으로 분비되는 이러한 세개의 신규 프로테인을 기대한다(하기 참조).
케노니칼 정지 코돈의 치환에 의한 ApoAII 및 ApoCII의 포스트 정지 펩티드(PSP)의 규명
캐노니칼 저잊 코돈에서의 염기 치환의 결과로서 나타나는 PSPs는 하기의 방법으로 규명 및 특성화시킬 수 있다. 토끼 다클론 항체를 문제가되는 PSP의 면역원성 부분(들)을 인식하도록 제조한다. 이러한 항-펩티드 항체는 실제로 PSP를 인식하는 것을 확인하기 위해서 정제된 펩티드를 사용하여 닷 블럿으로 확인할 수 있다. 다음에 웨스턴 블럿을 PSP에 대항하는 항체를 사용하여 암 환자로부터 수득된 플라즈마 샘플 상에서 실행할 수 있다. 도 17a(오른쪽 패널)에서는 항-PSP ApoAII 항체가 음성 대조군(도 17a, 왼쪽 패널)에서처럼 토끼 전-면역 혈청을 사용하는 경우 관찰되지 않으며, 전립선 암 환자로부터 수득된 플라즈마 샘플 상에서 실행한 웨스턴 블럿에서 밴드를 인식한다는 것을 보여준다. PSP ApoAII 밴드는 또한 전이 성 상태에서의 암 환자에서 관찰된다(도 17b, 오른쪽 패널). 상기 밴드는 ApoAII의 자연 모노머 형태의 것과 비교해서 분자 질량이 약간 더 크다(도 17a, 중간 ㅍ패널, 17b, 왼쪽 패널). 상기 분자 질량은 추가의 펩티드 서열을 기본으로 예견했던 것과 일치한다. 상기 밴드를 추가 특성화시키기 위해서 이차원적 겔을 실행할 수도 있다.
친화성 크로마토그래피 실험을 실행하여 항-PSP 항체를 사용하여 ApoAII의 PSP 형태를 분리시킬 수 있다( 도 17e ). 상기 항-PSP 항체를 매트릭스 비드 상에 고정시키고, 이후의 컬럼을 이후에 비특이적으로 결합한 프로테인을 제거하기 위해 세척될 delipidated HDL 또는 플라즈마의 존재하에 배양한 후에 최종적으로 세제 또는 무질서 유발제로 용출시킨다. 용출된 분획물을 항-PSP와 시판되는 항-ApoAII 항체를 사용하여 웨스턴 블럿팅으로 분석한다. 9 kDa 및 11.4 kDa에서 두개의 밴드가 시판되는 항-apoAII 항체에 의해 인지된 반면에 단지 11.4 kDa 밴드는 항-PSP 항체에 의해 인식되었다. 따라서 9 kDa 밴드는 자연적인 ApoAII 형태와 일치하며, 11.4 kDa 밴드는 ApoAII의 PSP 형태와 일치한다. 용출된 분획물에서의 자연적인 ApoAII의 존재는 PSP ApoAII 프로테인이 자연적인 비-환원 상태하에서 자연적인 ApoAII 프로테인과 다이머 형태일 수 있다는 것을 나타낸다. 실제로 ApoAII는 단일 이황화물 결합에 의해 연결된 2 모노머의 다이머로서 정상적으로 플라즈마에 존재한다.
ApoAII는 순차적인 초고속원심분리에 의해 분리할 수 있으며, 플라즈마내의 HDL 분획물 상에 주로 위치한다. 웨스턴 블럿팅으로 PSP ApoAII가 VLDL 및 LDL를 함유하는 d<1.07 g/ml 분획에서 검출되지 않고 오히려 HDL 및 플라즈마 프로테인을 함유하는 d>1.07 g/ml 분획에서 검출된다는 것을 확인했다( Fig 17c ). 추가로 초고속원심분리 단계를 실행하여 HDL 세척 및 정제한 후(dl.07- 1.21 g/ml), 웨스턴 블럿팅으로 PSP ApoAII가 리포프로테인 부족 혈청(LPDS)이라고 하는 d>1.21 g/ml 분획에서 보다는 HDL 분획과 관련있는 것으로 남아있다는 것을 확인했다. 유사한 양의 플라즈마가 웨스턴 블럿팅 상에 나타났으며, 상기는 정제 단계 중에 d>1.21 g/ml 분획의 희석에 의한 것이 아님을 설명한다. 슈퍼로스 6B((Amersham, GE Healthcare)를 사용하는 겔 여과에 의해 플라즈마에서 리포프로테인을 분리하는 것으로 PSP ApoAII가 HDL 관련 ApoAII에서와 유사한 방법으로 용출됨을 설명한다.
HDL 관련 PSP ApoAII는 ApoAII의 것과 유사한 방법으로 ApoAII의 PSP 형태의 정제를 한다. HDL은 모든 지질을 제거하기 위해 우선 탈지질화시킨다. 다음에 수득된 지질이 없는 프로테인 펠릿을 환원제의 존재 또는 부재하에 우레아 또는 구아니딘을 함유하는 10 mM 트리스 완충액으로 재현탁하고, 겔 여과 컬럼(예로서, Superdex 200, Amersham-GE Healthcare)에 적용한다. 웨스턴 블럿팅(Figure 17d)으로 ApoAII의 PSP 형태는 여전히 탈지질화 HDL에 존재한다는 것을 확인하였다. 예비 전기영동으로 추가 정제하였다(예: DE52). ApoAII의 PSP 형태는 웨스턴 블럿팅으로 추적하였다. ApoAII의 정제된 PSP 형태는 다음에 효소적으로(트립신) 분해하고, 수득된 펩티드는 완전한 AA 시퀀싱에 있어서 MS-MS 상에서 분석하였다. 결과로서 캐노니칼 정지는 (U to C) 또는 (U to A) 치환으로 알기닌으로 우선적으로 대체되며, 이후에는 세린, 발린, 글루타민산, 트레오닌, 이소루이신, 발린, 페닐알 라닌, 글루타민산, 프롤린, 글루타민산, 루이신, 알라닌, 세린, 알기닌이 순서이다. 상기는 ApoAII 캐노니칼 정지의 이후 통과를 발생시키기 위해 예견된 아미노산의 정확한 서열이다. 따라서 ApoAII의 캐노니칼 UGA 정지는 알기닌을 이끄는 AGA 또는 CGA로 치환된다. 아직 밝혀지지 않은 가설은 UGA가 글리신을 유도하는 GGA로 대체된다는 것이다. 그러나 질량 분석법에 의한 상기 변이체의 검출은 현재 기술적인 한계 이상이다.
또 다른 예는 ApoCII의 PSP에 의해 설명하였다. 도 17f에서는 시판되는 항-ApoCII 또는 항 PSP ApoCII 항체로 웨스턴 블럿팅을 실행하는 것을 제외하고 도 17a의 것과 유사한 실험을 보여주고 있다. ApoAII의 PSP에 있어서와 동일한 절차를 ApoCII에도 이용할 수 있다. 그러나 ApoCII는 플라즈마에서 덜 풍부하게 존재한다. 따라서 MS-MS 분석에 효과적인 양을 수득하기 위해 PSP ApoCII를 함유하는 다량의 플라즈마가 필요하다.
결론
본 연구자들은 여기에 mRNA의 비번역 부위와 코딩 서열의 3' 말단에서 대부분 발생하는 염기 치환을 유도하는 신규의 기작을 기재하였다. 이러한 염기 치환으로 AA 동일성이 변화하여 프로테인 AA 서열이 변화하고, 조성숙 정지 코돈의 도입뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 정지 코돈의 변형으로 신규의 코딩 부위가 도입된다. 전사 부정확의 이러한 현상은 또한 ncRNA 월드에도 영향을 줄 수 있으며, 이러한 RNA에 의해 변형되는 조정을 방해할 수 있다. 대부분의 유전자에서는 DNA 돌연변이를 유도하는 임의의 기재된 현상이 초과 비율로 발생한다. 전사 부정확은 암 세포를 크게 증가시킨다. 전사 부정확은 암 병리학, 질병의 심각성 및 질병의 진행을 이해하기 위한 신규의 패러다임을 제공한다. 이것은 신규의 전사체학 및 단백질체학 실험의 도안뿐만 아니라 또한 특이적 진단 및 치료의 개발에도 중요한 의미를 갖는다.
SEQUENCE LISTING <110> TRANSMEDI SA <120> Transcription Infidelity, Detection And Uses Thereof <130> B0478WO <160> 32 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Met Trp Gln Leu Phe Trp Ile Tyr His Leu Ser Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Leu His Thr Leu Ser Ala Ala Ile Tyr Tyr Gln Gln Glu 1 5 10 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Phe Leu Ser Asn Lys 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Tyr Thr Val Glu Phe Ser Val His Lys Asn Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asn Gly Ser Leu Gly Asp Met Ser Asp Leu Cys Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Ser Gly 1 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Pro Ser Glu Pro Ser Asp Phe 1 5 <210> 8 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Pro Ser Ile Phe Pro Thr Leu Pro Ala Lys Pro Gly Thr Lys Gln 1 5 10 15 Pro Arg Ser Pro Val Thr Ala Leu Ser Leu His Met Leu Leu Met Val 20 25 30 Ser Ser Ala Pro Ser Cys Gly Leu Ile Gln Thr Val Ser Ser Phe Thr 35 40 45 Val Tyr Ile Phe Thr Leu 50 <210> 9 <211> 69 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Arg His Gly Arg Asp Glu Glu Val Trp His Arg Lys His Ser His 1 5 10 15 His Phe Val Gln Ala Trp Ala Trp Val Gly Gly Leu Val Cys Trp Pro 20 25 30 Arg Lys Cys His Met Arg Ser Thr Leu Ile Ser Ser Leu Asp Ser Leu 35 40 45 Leu Pro Val Ile Pro His Arg Thr Glu Ala Glu Trp Val Val Val Met 50 55 60 Phe Asp Arg Arg His 65 <210> 10 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Ser Val Phe Leu Phe Arg Trp Cys Lys Ala 1 5 10 15 Asn Thr Leu Ser Lys Lys His Lys Phe Leu 20 25 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Leu Asp Ser Thr Arg Ala Leu Glu Asn Glu Met Thr Val 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gly Ala Arg Arg Arg Pro Pro Ser Arg Cys Ser Glu 1 5 10 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Val Gln Thr Ile Val Phe Gln Pro Gln Leu Ala Ser Arg Thr Pro 1 5 10 15 Thr Gly Gln Ser 20 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ile Val Phe Gln Pro Gln Leu Ala Ser Arg Thr Pro Thr Gly Gln Ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gln Pro Asp Pro Pro Ser Val Asp Lys Gly Arg Val Pro Tyr Ser Pro 1 5 10 15 Asp Pro Pro Gly Ser Asp 20 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asp Pro Pro Ser Val Asp Lys Gly Arg Val Pro Tyr Ser Pro Asp 1 5 10 15 <210> 17 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Asp Leu Asn Thr Pro Ser Pro Pro Ala Tyr Pro Ser Cys Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Ser Cys Asn Leu Gln Gly Cys Pro Cys Arg Leu Leu Lys Arg Asp 20 25 30 Ser Ile Leu Ser Ala Leu Leu Pro His Leu Met Pro Gly Pro Pro Pro 35 40 45 Gly Met Leu Ala Ser Gln 50 <210> 18 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Pro Gly Ser Thr Gly Arg Leu His Pro Leu His Val Thr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ser Pro Thr Pro Pro Pro Pro His Lys Asp Lys Pro Ile Asn His 20 25 30 Asp Lys Gly Ser 35 <210> 19 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Thr Pro Lys Pro Ala Ala Met Arg Pro His Ala Thr Pro Cys Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Arg Ser Leu Gln Arg Glu Thr Leu Ser Pro Pro Gln Pro Ser 20 25 30 Ser Trp Gly Gly Pro 35 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Glu Ala Arg Val Gly Gly Asn Val Gly Ser Gln Thr Gln 1 5 10 <210> 21 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Pro Ser Val Leu His Thr Ala Arg Gly Pro Arg Met Pro Arg Pro Pro 1 5 10 15 Leu Ala Pro Ala Gly Arg Glu Pro Asp His Leu Pro Cys 20 25 <210> 22 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asp Val Asp Val Ala Phe Ala Pro Thr Gly Ala Ser Glu Ser Ser Ser 1 5 10 15 Pro Gln Asp Glu Leu Gln Pro Pro Arg Glu Ser Ser Ala Arg His Gln 20 25 30 Val Thr Arg Pro Gln Pro Pro Gly Pro Gln Leu Arg Pro Ala Ser Pro 35 40 45 Arg Ser Gly Ser Cys Thr Leu Thr Leu Asp Ser Ala Ala His Gly Lys 50 55 60 Asn Arg Ile Ala Pro Ala Cys Asn 65 70 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Asn Val Ile Pro Leu Lys Arg Lys Met Asn Asn Thr Leu Asn 1 5 10 <210> 24 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Thr Pro Ala Ala Arg Leu Met Trp Ser Ser Asn Met Pro Tyr Phe Ala 1 5 10 15 Gln Lys Thr Ala Lys Asp Met Thr Ser Ser Trp Leu Gln Pro Arg Phe 20 25 30 Ile Phe Leu Phe Val Val Asn 35 <210> 25 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Gly Trp Gly Val Phe Leu Leu Asn Pro Met Ala Gly Gly His Ala Pro 1 5 10 15 Thr Ile Ile Ser Trp Glu Glu Arg Gln Ser Trp Glu Ile Asp Gly Ser 20 25 30 His Ser Ser Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Trp Ala Thr Leu Pro Thr 35 40 45 Pro Leu Leu Ser Gln 50 <210> 26 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Thr Gly Pro Thr His His Ser Pro Ser Pro Ser Ile Ser Thr Trp Cys 1 5 10 15 Leu Val Pro Val His Ser Val Asn Lys Lys Pro 20 25 <210> 27 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Trp Thr Pro Glu Pro Leu Leu Gln Pro Leu Ser His Pro Leu Pro Pro 1 5 10 15 Ala His Pro Leu Gly Gln Gln Arg Leu 20 25 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Leu Asp Gly Arg Gln Ser Asp Ala Leu Thr His Leu Glu Ala Gly Thr 1 5 10 15 Trp Val Gly Ile 20 <210> 29 <211> 71 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ser Leu Pro Ser Ser Ser Gly Ala Leu Ser Lys Glu Leu Gly Met Gln 1 5 10 15 Ala Gly Cys Leu Gly Leu Trp Ala Gln Pro Gly Pro Cys Ala Pro Ser 20 25 30 Gly His Gly Met Cys Gly Pro Val Cys Leu Ser Leu Glu Gly Asp Ser 35 40 45 Asp Ser Leu Cys Ser Ser His Met His Arg Gly Pro Trp Thr Leu Gln 50 55 60 Ser Gly Gly Ser Trp Ala Ser 65 70 <210> 30 <211> 48 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Asn Leu Arg Gly Arg Ala Ala Thr Lys Val Lys Met Gly Thr Gln Met 1 5 10 15 Ile His Glu Phe Ala Leu Val Ser Leu Ala Gln Val Val Cys Ala Asn 20 25 30 His Val Cys Leu His Ser Ser Val Leu Pro Cys Val Leu Asn Lys Lys 35 40 45 <210> 31 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gly Pro Ala Pro Pro Arg Pro Ala Pro Ala Gly Pro Ala Pro Pro Arg 1 5 10 15 Pro Ala Pro Ala Ala Leu Pro Met Gly Ala Val Phe Lys Asp Thr Arg 20 25 30 Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ala Pro Leu Lys Met Glu Arg Gly Leu Arg 35 40 45 Ile Ser Val Ser Leu Gly Ala Cys Leu Gly Ser Pro Ser Leu Thr Phe 50 55 60 Pro His Ser His Ser Leu Ser Leu Pro Leu Cys Leu Leu Leu Pro Val 65 70 75 80 Cys Thr Ile Pro Leu Pro Gly Ile Lys Ala Gln Gly Thr Ser Gly Glu 85 90 95 His Tyr Cys Ser 100 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gly Thr Ser Pro Pro Val Asp Leu Lys Asp Glu Gly Trp Asp Phe Met 1 5 10 15

Claims (27)

  1. 피험체(subject)에서 질병의 존재 또는 단계(stage)를 검사하는 방법으로서,
    상기 피험체로부터 유래된 시료에서 전사 부정확(transcription infidelity)의 존재 또는 비율을 시험관내 또는 생체외에서 평가하는 단계를 포함하며, 상기 전사 부정확의 존재 또는 비율은 상기 피험체에서 질병의 존재 또는 단계의 지표(indication)가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 약물을 스크리닝(screening), 동정(identifying) 또는 최적화(optimising)하는 방법으로서,
    상기 약물이 유전자의 전사 부정확의 비율을 변경하는지의 여부를 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    (청구항 3)
    사람 또는 동물의 치료 방법, 특히 증식 세포 질환(proliferative cell disorder)을 치료하는데 사용되는 약학적 조성물의 제조를 위한 포유류 유전자의 전사 부정확 비율을 변경하는 화합물의 용도.
  3. 사람 또는 동물의 치료 방법, 특히 증식 세포 질환을 치료하는데 사용하기 위하여 포유류 유전자를 전사 부정확에 대한 저항성 또는 감수성 유전자로 변형시키는 방법.
  4. 약물 또는 후보 약물의 유효성을 평가하는 방법으로서,
    상기 약물이 포유류 유전자의 전사 부정확 비율을 변경하는지 여부를 평가하는 단계를 포함하며, 상기 변경은 약물 유효성의 지표가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 바이오마커(biomarkers)를 동정 또는 제조하는 방법으로서,
    피험체로부터의 시료에서 표적 단백질, RNA 또는 유전자내 전사 부정확 부위(들)의 존재를 동정하고, 선택적으로 상기 전사 부정확 부위(들)의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 특징(trait) 또는 병리학적 증후에 특이적인 리간드를 동정 또는 제조하는 방법으로서,
    상기 특징 또는 병리학적 증후를 갖는 피험체로부터의 시료에서 1개 또는 수개의 표적 단백질 또는 유전자내 1 이상의 전사 부정확 부위의 존재를 동정하고, 선택적으로 상기 1 이상의 전사 부정확 부위의 서열을 결정하며, 상기 1 이상의 전사 부정확 부위에 특이적으로 결합하는 리간드를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    전사 부정확은 단백질 또는 핵산의 전사 부정확 부위에 대해 특이적인 1 이상의 리간드를 사용하여 평가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    질병 또는 병리학적 증후는 세포 증식 질환, 가령 암, 면역 질환, 염증 질환 또는 노화로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. TI-단백질, 특히 포유류 단백질, 더 바람직하게는 사람의 단백질의 영역을 포함하는 합성 펩티드.
  10. 제 9 항에 있어서,
    전사 부정확 부위는 하기 규칙을 따르는 핵산 변경에 의해서 코딩된 1 이상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드:
    Figure 112009010362612-PCT00007
    A의 앞 또는 뒤에 C가 오는 경우 A의 치환이 우선적으로 일어남;
    Figure 112009010362612-PCT00008
    T의 앞 또는 뒤에 G가 오는 경우 T의 치환이 우선적으로 일어남;
    Figure 112009010362612-PCT00009
    C의 앞에 G 또는 A가 오는 경우 C의 치환이 우선적으로 일어남; 및
    Figure 112009010362612-PCT00010
    G의 앞 또는 뒤에 A가 오는 경우 G의 치환이 우선적으로 일어남.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    상기 펩티드는 전사 부정확에 의해 발생한 1 이상의 아미노산 변이를 포함하 는 상기 단백질의 C-말단 절편의 서열을 포함하고/하거나, 100, 80, 75, 70, 65, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25 또는 20개 이하의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단백질은 세포 표면 단백질[예컨대, 수용체(receptor)] 또는 분비 단백질[예컨대, 혈장 단백질(plasma protein)]인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  13. 서열번호 1 내지 서열번호 32로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  14. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 면역원(immunogen)으로서 사용하는 펩티드의 용도.
  15. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 및 선택적으로 적당한 담체(carrier), 부형제(excipient) 및/또는 보조제(adjuvant)를 포함하는 백신 조성물.
  16. RNA 분자의 전사 부정확 부위의 서열을 포함하는 합성 핵산 분자.
  17. 항체의 제조 방법으로서,
    제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드로 비(非)사람 포유류를 면역화하는 단계, 및 상기 펩티드를 결합하는 항체 또는 상응하는 항체-생성 세포를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 항체의 제조 방법으로서,
    (i) TI-단백질의 영역을 동정하는 단계;
    (ii) 상기 영역을 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 단계; 및
    (iii) 선택적으로, 실질적으로 동일한 항원 특이성을 갖는 항체 유도체를 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    전사 부정확 부위를 동정하는 것은 하기의 규칙을 따르는 핵산 변경에 의해서 코딩된 1 이상의 변형을 동정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112009010362612-PCT00011
    A의 앞 또는 뒤에 C가 오는 경우 A의 치환이 우선적으로 일어남;
    Figure 112009010362612-PCT00012
    T의 앞 또는 뒤에 G가 오는 경우 T의 치환이 우선적으로 일어남;
    Figure 112009010362612-PCT00013
    C의 앞 또는 뒤에 G 또는 A가 오는 경우 C의 치환이 우선적으로 일어남; 및
    Figure 112009010362612-PCT00014
    G의 앞 또는 뒤에 A가 오는 경우 G의 치환이 우선적으로 일어남.
  20. 단백질 또는 RNA의 전사 부정확 부위를 특이적으로 결합하는 리간드.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 리간드는 항체(또는 절편 또는 이의 유도체), 핵산 프라이머(primer) 또는 핵산 프로브(probe)인 것을 특징으로 하는 리간드.
  22. TI-단백질의 영역을 특이적으로 결합하는 항체, 또는 실질적으로 동일한 항원 특이성을 갖는 상기 항체의 유도체.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 항체는 분자, 가령 약물, 레이블(label), 독소 분자 또는 방사성동위원소(radioisotope)에 콘쥬게이트되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 유도체.
  24. 제 20 항 또는 제 21 항에 따른 리간드를 유전자의 전사 부정확을 시험관내에서 검출 또는 정량화하는데 사용하는 리간드의 용도.
  25. 제 23 항에 따른 콘쥬게이트 항체 또는 이의 유도체를 약제 또는 진단 시약으로서 사용하는 콘쥬게이트 항체 또는 이의 유도체의 용도.
  26. 사람 또는 동물의 치료 방법에 사용되는 약학적 조성물의 제조에 사용되는 유전자의 전사 부정확 부위를 포함하는 핵산의 용도.
  27. 지지체(support) 상에 고정된 제 20 항 또는 제 21 항에 따른 리간드를 포함하는 장치 또는 물품.
KR1020097003423A 2006-07-20 2007-07-20 전사 부정확, 검출 및 이의 용도 Expired - Fee Related KR101502179B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06291176A EP1887088A1 (en) 2006-07-20 2006-07-20 Transcription infidelity, detection and uses thereof
EP06291176.3 2006-07-20
PCT/EP2007/057541 WO2008009751A2 (en) 2006-07-20 2007-07-20 Transcription infidelity, detection and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090052861A true KR20090052861A (ko) 2009-05-26
KR101502179B1 KR101502179B1 (ko) 2015-03-12

Family

ID=37496681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097003423A Expired - Fee Related KR101502179B1 (ko) 2006-07-20 2007-07-20 전사 부정확, 검출 및 이의 용도

Country Status (18)

Country Link
US (1) US8288091B2 (ko)
EP (3) EP1887088A1 (ko)
JP (1) JP5298013B2 (ko)
KR (1) KR101502179B1 (ko)
AT (1) ATE524565T1 (ko)
AU (1) AU2007275068B2 (ko)
BR (1) BRPI0714563B8 (ko)
CA (1) CA2658305C (ko)
CY (2) CY1112125T1 (ko)
DK (2) DK2468885T3 (ko)
ES (2) ES2373428T3 (ko)
HU (1) HUE028135T2 (ko)
IL (1) IL196600A0 (ko)
PL (2) PL2468885T3 (ko)
PT (2) PT2046986E (ko)
SI (2) SI2046986T1 (ko)
TR (1) TR201112295Y (ko)
WO (1) WO2008009751A2 (ko)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2071334A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Transmedi SA Compositions and methods of detecting TIABS
EP2080812A1 (en) 2008-01-18 2009-07-22 Transmedi SA Compositions and methods of detecting post-stop peptides
EP2995688A1 (en) 2014-09-12 2016-03-16 Genclis Methods of prognosing and treating triple negative breast cancer
US20170168055A1 (en) * 2015-12-11 2017-06-15 Expression Pathology, Inc. SRM/MRM Assays
US11234445B2 (en) 2016-03-18 2022-02-01 Genclis Molecular origin of allergy
WO2018187216A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Expression cassettes and methods for detecting transcription errors
WO2019084158A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 Ultima Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR SEQUENCE CALL
CN113795887A (zh) 2019-03-10 2021-12-14 阿尔缇玛基因组学公司 用于序列判定的方法和系统
US11926817B2 (en) 2019-08-09 2024-03-12 Nutcracker Therapeutics, Inc. Microfluidic apparatus and methods of use thereof
KR102334576B1 (ko) * 2019-08-12 2021-12-07 한국생명공학연구원 융합 단백질 및 이를 포함하는 바이오 이미징용 조성물
EP4211268A4 (en) * 2020-09-10 2024-09-18 Ultima Genomics, Inc. SEQUENCE AND VARIANT CALLING METHODS AND SYSTEMS
WO2022108309A1 (ko) * 2020-11-18 2022-05-27 한양대학교 에리카산학협력단 인산화된 비멘틴의 과도한 생성을 차단하여 암을 예방 또는 치료하는 방법
EP4162948A1 (en) 2021-10-05 2023-04-12 Genclis Transcription infidelity derived chimeric immunogens and uses thereof
WO2023104904A2 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Genclis The sars-cov-2 and variants use two independent cell receptors to replicate

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4979330A (en) 1989-10-10 1990-12-25 Rorant Julius W Suction insect trap device
US6120992A (en) 1993-11-04 2000-09-19 Valigene Corporation Use of immobilized mismatch binding protein for detection of mutations and polymorphisms, and allele identification in a diseased human
AU2715601A (en) * 1999-12-03 2001-06-12 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Clearance of aberrant protein in correlation with disease
WO2002077286A1 (en) 2001-02-21 2002-10-03 Gene Check, Inc. Mutation detection using muts and reca
US20060110762A1 (en) * 2004-11-10 2006-05-25 Sanjay Kapil Porcine reproductive and respiratory syndrome virus receptor components and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP2046986B1 (en) 2011-09-14
AU2007275068B2 (en) 2013-06-06
TR201112295Y (tr) 2018-08-27
BRPI0714563B1 (pt) 2019-07-02
BRPI0714563A2 (pt) 2015-04-14
KR101502179B1 (ko) 2015-03-12
EP1887088A1 (en) 2008-02-13
BRPI0714563B8 (pt) 2021-05-25
ES2373428T3 (es) 2012-02-03
EP2468885B1 (en) 2015-08-19
WO2008009751A2 (en) 2008-01-24
SI2046986T1 (sl) 2012-05-31
US20090317386A1 (en) 2009-12-24
AU2007275068A1 (en) 2008-01-24
EP2468885A3 (en) 2012-08-29
US8288091B2 (en) 2012-10-16
EP2468885A2 (en) 2012-06-27
CY1112125T1 (el) 2015-11-04
HUE028135T2 (en) 2016-12-28
PL2046986T3 (pl) 2012-02-29
ES2553435T3 (es) 2015-12-09
CY1116939T1 (el) 2017-04-05
CA2658305A1 (en) 2008-01-24
CA2658305C (en) 2017-07-18
JP5298013B2 (ja) 2013-09-25
ATE524565T1 (de) 2011-09-15
PT2046986E (pt) 2011-12-29
EP2046986A2 (en) 2009-04-15
DK2468885T3 (da) 2016-02-29
IL196600A0 (en) 2009-11-18
PL2468885T3 (pl) 2016-04-29
SI2468885T1 (sl) 2016-02-29
DK2046986T3 (da) 2012-01-02
HK1128937A1 (en) 2009-11-13
PT2468885E (pt) 2015-11-26
WO2008009751A3 (en) 2008-07-31
JP2009544284A (ja) 2009-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101502179B1 (ko) 전사 부정확, 검출 및 이의 용도
EP1787126B1 (en) A procedure for characterization of a polyclonal cell line
EP2080812A1 (en) Compositions and methods of detecting post-stop peptides
KR20100016568A (ko) 녹내장 발증 리스크의 판정 방법
CN113564162B (zh) 同源重组修复基因捕获探针组、试剂盒及其应用
CN111363809A (zh) 用于开发阿尔茨海默诊断产品的分子标志物
CN109161587A (zh) 一种检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法
WO2010071405A1 (en) Markers for detecting predisposition for risk, incidence and progression of osteoarthritis
EP1192273B1 (en) Method for detecting mismatches or mutations in nucleic acid
WO2003107249A1 (en) Method for predicting a drug transport capability by abcg2 polymorphisms
HK1128937B (en) Transcription infidelity, detection and uses thereof
CN112359096A (zh) 一种检测dna碱基切除修复通路关键突变基因的试剂盒
WO2011116244A2 (en) Methods of diagnosing and treating conditions associated with metabolic clearance rate of insulin
HK1101043B (en) A procedure for characterization of a polyclonal cell line
HK1133076B (en) A procedure for structural characterization of a recombinant polyclonal protein or a polyclonal cell line

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A15-nap-PA0105

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

T11-X000 Administrative time limit extension requested

St.27 status event code: U-3-3-T10-T11-oth-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

R17-X000 Change to representative recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R17-oth-X000

R17-X000 Change to representative recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R17-oth-X000

R17-X000 Change to representative recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R17-oth-X000

A201 Request for examination
P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

R17-X000 Change to representative recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R17-oth-X000

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

T11-X000 Administrative time limit extension requested

St.27 status event code: U-3-3-T10-T11-oth-X000

T11-X000 Administrative time limit extension requested

St.27 status event code: U-3-3-T10-T11-oth-X000

T11-X000 Administrative time limit extension requested

St.27 status event code: U-3-3-T10-T11-oth-X000

E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

St.27 status event code: A-1-2-D10-D22-exm-PE0701

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

St.27 status event code: A-2-4-F10-F11-exm-PR0701

PR1002 Payment of registration fee

St.27 status event code: A-2-2-U10-U12-oth-PR1002

Fee payment year number: 1

PG1601 Publication of registration

St.27 status event code: A-4-4-Q10-Q13-nap-PG1601

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180307

Year of fee payment: 4

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190307

Year of fee payment: 5

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 5

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 6

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 7

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 8

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 9

PC1903 Unpaid annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U13-oth-PC1903

Not in force date: 20240307

Payment event data comment text: Termination Category : DEFAULT_OF_REGISTRATION_FEE

PC1903 Unpaid annual fee

St.27 status event code: N-4-6-H10-H13-oth-PC1903

Ip right cessation event data comment text: Termination Category : DEFAULT_OF_REGISTRATION_FEE

Not in force date: 20240307