ES2553575T3 - Polinucleótidos que codifican polipéptidos antigénicos del VIH tipo C, polipéptidos y usos de los mismos - Google Patents

Polinucleótidos que codifican polipéptidos antigénicos del VIH tipo C, polipéptidos y usos de los mismos Download PDF

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ES2553575T3
ES2553575T3 ES10183206.1T ES10183206T ES2553575T3 ES 2553575 T3 ES2553575 T3 ES 2553575T3 ES 10183206 T ES10183206 T ES 10183206T ES 2553575 T3 ES2553575 T3 ES 2553575T3
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env
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Abstract

Un casete de expresión que comprende: (a) un polinucleótido que comprende al menos 480 nucleótidos contiguos de SEC ID Nº: 132; o (b) un polinucleótido que tiene más del 98 % de identidad de secuencias con (a).

Description

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transcripción, señales de terminación de la transcripción, secuencias de poliadenilación, secuencias para la optimización del inicio de la traducción, y secuencias de terminación de la traducción. Promotores de la transcripción a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de CMV, CMV+intrón A, SV40, RSV, VIH-Ltr, MML V-1tr y metalotioneína.
En otro aspecto, la invención incluye células que comprenden uno o más de los casetes de expresión de la presente invención en las que las secuencias de polinucleótidos están operativamente enlazadas a elementos de control compatibles con la expresión en la célula seleccionada. En una realización, tales células son células de mamífero. Células de mamífero a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, células BHK, VERO, HT1080,293, RD, COS7 y CHO. Otras células, tipos de células, tipos de tejido, etc., que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos obtenidos de lo siguiente: insectos (por ejemplo, Trichoplusia ni (Tn5) y Sf9), bacterias, levadura, plantas, células presentadoras de antígeno (por ejemplo, macrófago, monocitos, células dendríticas, linfocitos B, linfocitos T, citoblastos, y células progenitoras de los mismos), células primarias, células inmortalizadas, células derivadas de tumor.
En otro aspecto, la presente invención incluye composiciones para generar una respuesta inmunológica, en la que la composición normalmente comprende al menos uno de los casetes de expresión de la presente invención y puede, por ejemplo, contener combinaciones de casetes de expresión (tales como uno o más casetes de expresión que llevan un polinucleótido que codifica polipéptidos Pol, uno o más casetes de expresión que llevan un polinucleótido que codifica polipéptidos Gag, uno o más casetes de expresión que llevan polinucleótidos que codifican polipéptidos auxiliares (por ejemplo, vpu, vpr, nef, vif, tat, rev nativos o sintéticos), además de uno o más casetes de expresión que llevan un polinucleótido que codifica polipéptidos Env como se define en las reivindicaciones. Tales composiciones pueden contener adicionalmente un adyuvante o adyuvantes. Las composiciones también pueden contener uno o más polipéptidos del VIH tipo C. Los polipéptidos del VIH tipo C pueden corresponderse con los polipéptidos codificados por el (los) casete(s) de expresión en la composición, o pueden ser diferentes de aquellos codificados por los casetes de expresión. Un ejemplo del polinucleótido en el casete de expresión que codifica el mismo polipéptido que está siendo proporcionado en la composición es del siguiente modo: el polinucleótido en el casete de expresión codifica el polipéptido Gag de la Figura 1 (SEC ID Nº: 3) y el polipéptido (SEC ID Nº: 17) es el polipéptido codificado por la secuencia mostrada en la Figura 1. Un ejemplo del polinucleótido en el casete de expresión que codifica un polipéptido diferente del que está siendo proporcionado en la composición es del siguiente modo: un casete de expresión que tiene un polinucleótido que codifica un polipéptido Gag-polimerasa, y el polipéptido proporcionado en la composición puede ser un polipéptido Gag y/o Gag-proteasa. Si las composiciones contienen ambos casetes de expresión (o polinucleótidos) y polipéptidos, diversos casetes de expresión de la presente divulgación pueden mezclarse y/o hacerse coincidir con diversos polipéptidos del VIH tipo C descritos en el presente documento.
En otro aspecto, la presente divulgación incluye métodos de inmunización de un sujeto. En el método, cualquiera de las composiciones anteriormente descritas se en el sujeto en condiciones que son compatibles con la expresión del (de los) casete(s) de expresión en el sujeto. En una realización, los casetes de expresión (o polinucleótido) pueden introducirse usando un vector de administración génica. El vector de administración génica puede, por ejemplo, ser un vector no viral o un vector viral. Vectores virales a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, vectores derivados del virus de Sindbis, vectores retrovirales y vectores lentivirales. También pueden administrarse composiciones útiles para generar una respuesta inmunológica usando un vehículo en partículas. Además, tales composiciones pueden recubrirse sobre, por ejemplo, partículas de oro o de tungsteno y administrarse las partículas recubiertas al sujeto usando, por ejemplo, una pistola de genes. Las composiciones también pueden formularse como liposomas. El sujeto puede ser un mamífero y puede, por ejemplo, ser un ser humano.
En otro aspecto, la divulgación incluye métodos de generación de una respuesta inmunitaria en un sujeto. Cualquiera de los casetes de expresión descritos en el presente documento puede expresarse en una célula adecuada para proporcionar la expresión de polipéptidos del VIH tipo C codificados por los polinucleótidos de la presente divulgación. El (Los) polipéptido(s) se aíslan entonces (por ejemplo, se purifican sustancialmente) y se administran al sujeto en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunitaria. Los métodos pueden comprender la administración de uno o más de los casetes de expresión o polinucleótidos de la presente divulgación, usando cualquiera de las técnicas de administración génica descritas en el presente documento. Los métodos pueden comprender la co-administración de uno o más de los casetes de expresión o polinucleótidos de la presente divulgación y uno o más polipéptidos, en los que los polipéptidos pueden expresarse a partir de de estos polinucleótidos o pueden ser otros polipéptidos del VIH subtipo C. Por tanto, los métodos pueden comprender la coadministración de múltiples casetes de expresión o polinucleótidos de la presente divulgación. Además, los métodos pueden comprender la co-administración de múltiples polipéptidos, por ejemplo, polipéptidos expresados a partir de los polinucleótidos de la presente divulgación y/u otros polipéptidos del VIH subtipo C.
La divulgación incluye adicionalmente métodos de generación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, en los que células de un sujeto se transfectan con cualquiera de los casetes de expresión o polinucleótidos anteriormente descritos, en condiciones que permiten la expresión de un polinucleótido seleccionado y la producción de un polipéptido de interés (por ejemplo, codificado por cualquier casete de expresión de la presente divulgación). Por este método se provoca una respuesta inmunológica al polipéptido en el sujeto. La transfección de las células puede
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Tabla C
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Nombre
SEQ ID Descripción
C4_Env_TV1_C_ZA_opt short
46 secuencia sintética de corta Env "región común"
C4_Env_TV1_C_ZA_opt
47 secuencia sintética de Env "región común"
C4_Env_TV1_C_ZA_wt
48 tipo salvaje secuencia 8_5_TV1_C.ZA Env
Envgp160_TV1_C_ZAopt
49 gp160 sintético Env
Envgp160_TV1_C_ZAwt
50 tipo salvaje secuencia gp160 8_5_TV1_C.ZA Env
Gag_TV1_C_ZAopt
51 secuencia sintética de la mordaza
Gag_TV1_C_ZAwt
52 tipo salvaje secuencia 8_5_TV1_C.ZA Gag
Gag_TV1_ZA_MHRopt
53 secuencia sintética de Gag principales regiones de homología
Gag_TV1_ZA_MHRwt
54 Gag_TV1_ZA_MHRwt 54 de tipo salvaje 8_5_TV1_C.ZA Gag importante secuencia de la región
Nef_TV1_C_ZAopt
55 secuencia sintética de Nef
Nef_TV1_C_ZAwt
56 tipo salvaje secuencia 8_5_TV1_C.ZA Nef
NefD125G_TVI_C_ZAopt
57 secuencia sintética de Nef, incluyendo mutación en la posición 125 resultante en producto del gen no funcional
p15RNaseH_TV1_C_ZAopt
58 secuencia sintética de RNAseH (p15 de Pol)
p15RNaseH_TV1_C_ZAwt
59 tipo salvaje secuencia 8_5_TV1_C.ZA RNAseH
p31Int_TV1_C_ZAopt
60 secuencia sintética de la integrasa (p31 de Pol)
p31Int_TV1_C_ZAwt
61 tipo salvaje secuencia 8_5_TV1_C.ZA integrasa
Po1_TV1_C_ZAopt
62 secuencia sintética de Pol
Pol_TV1_C_ZAwt
63 tipo salvaje secuencia 8_5_TV1_C.ZA Pol
Prot_TV1_C_ZAopt
64 secuencia sintética de Prot
Prot_TV1_C_ZAwt
65 tipo salvaje secuencia 8_5_TV1_C.ZA Prot
Protina_TV1_C_ZAopt
66 secuencia sintética de Prot incluyendo mutación que resulta en la inactivación de la proteasa
Protma_TV1_C_ZAwt
67 tipo salvaje secuencia 8_5_TV1_C.ZA Prot, incluyendo la mutación que resulta en la inactivación de la proteasa.
ProtinaRTmut_TV1_C_ZAo p
68 secuencia sintética de Prot y la transcriptasa inversa (RT), incluyendo la mutación que resulta en la inactivación de la proteasa y la mutación que resulta en la inactivación de RT.
ProtinaRTmut_TV1_C_ZA wt
69 tipo salvaje 8_5_TV1_C.ZA Prot y RT, la mutación que resulta en la inactivación de la proteasa y la mutación que resulta en la inactivación de RT.
ProtwtRTwt_TV1_C_ZAopt
70 secuencias sintéticas de Prot y RT
ProtwtRTwt_TV1_C_ZAwt
71 tipo salvaje 8_5_TV1_C.ZA Prot y RT
RevExon1_TV1_C_ZAopt
72 secuencia sintética del exón 1 de Rev
RevExon1_TV1_C_ZAwt
73 tipo salvaje 8_5_TV1_C.ZA del exón 1 de Rev
RevExon2_TV1_C_ZAopt-2
74 secuencia sintética del exón 2 de Rev
RevExon2_TV1_C_ZAwt
75 tipo salvaje 8_5_TV1_C.ZA del exón 2 de Rev
RT_TV1_C_ZAopt
76 secuencia sintética de RT
RT_TV1_C_ZAwt
77 tipo salvaje 8_5_TV1_C.ZA RT
RTmut_TV1_C_ZAopt
78 secuencia sintética de RT, incluyendo la mutación que resulta en la inactivación de RT
RTmut_TV1_C_ZAwt
79 tipo salvaje 8_5_TV1_C.ZA RT, incluyendo la mutación que resulta en la inactivación de RT
TatC22Exon1_TV1_C_ZAo pt
80 secuencia sintética del exón 1 de Tat, incluyendo la mutación que resulta en producto del gen Tat no funcional
TatExon1_TV1_C_ZAopt
81 secuencia sintética del exón 1 de Tat
TatExon1_TV1_C_ZAwt
82 tipo salvaje 8_5_TV1_C.ZA exón 1 de Tat
TatExon2_TV1_C_ZAopt
83 secuencia sintética del exón 2 de Tat
TatExon2_TV1_C_ZAwt
84 tipo salvaje 8_5_TV1_C.ZA exón 2 de Tat
Vif_TV1_C_ZAopt
85 secuencia sintética de Vif
VifTV1_C_ZAwt
86 tipo salvaje 8_5_TV1_C.ZA Vif
Vpr_TV1_C_ZAopt
87 secuencia sintética de VPR
Vpr_TV1_C_ZAwt
88 tipo salvaje 8_5_TV1_C.ZA VPR
Vpu_TV1_C_ZAopt
89 secuencia sintética de Vpu
Vpu_TV1_C_ZAwt
90 tipo salvaje 8_5_TV1_C.ZA Vpu
revexon1_2 TV1 C ZAopt
91 secuencia sintética de los exones 1 y 2 de Rev
RevExon1_2_TV1_C_ZAwt
92 tipo salvaje 8_5_TV1_C.ZA Rev (exones 1 y 2)
TatC22Exon1_2_TV1_C_Z Aopt
93 secuencia sintética de los exones 1 y 2 de Tat, incluyendo la mutación en el exón 1 que resulta en producto del gen Tat no funcional
46
(continuación)
Nombre
SEQ ID Descripción
TatExon1_2_TV1_C_ZAopt
94 secuencia sintética de los exones 1 y 2 de Tat
TatExon1_2_TV1_C_ZAwt
95 tipo salvaje 8_5_TV1_C.ZA Tat (exones 1 y 2)
NefD125G-Myr_TV1_C_ZAopt
96 secuencia sintética de Nef, incluyendo la eliminación de la mutación sitio de miristoilación.
Tabla D
Nombre
SEQ ID Descripción
gp120mod.TV1.delV2
119 secuencia sintética de gp120 Env, incluido el borrado V2 y secuencias líder modificados derivados de secuencias 8_2_TV1_C.ZA de tipo salvaje
gp140mod.TV1.delV2
120 secuencia sintética de gp140 Env, incluido el borrado V2 y secuencias líder modificados derivados de secuencias 8_2_TV1_C.ZA de tipo salvaje
gp140mod.TV1.mut7.delV2
121 secuencia sintética de gp140 Env, incluido el borrado V2 y mutación en sitio de corte y secuencias líder modificados derivados de secuencias 8_2_TV1_C.ZA de tipo salvaje
gp160mod.TV1.delV1V2
122 secuencia sintética de Env gp160, incluyendo V1 / V2 eliminación y líder modificado derivado de secuencias 8_2_TV1_C.ZA de tipo salvaje
gp160mod.TV1.delV2
123 secuencia sintética de gp160 Env, incluido el borrado V2 y secuencias líder modificados derivados de secuencias 8_2_TV1_C.ZA de tipo salvaje
gp160mod.TV1.mut7.delV2
124 secuencia sintética de Env gp 160, incluido el borrado V2; una mutación en sitio de escisión; y secuencias líder modificados derivados de secuencias 8_2_TV1_C.ZA de tipo salvaje
gp160mod.TV1.tpa1
125 secuencia sintética de Env gp160, líder TPA1
gp160mod.TV1
126 Secuencia sintética de Env gp160, TPA1 Líder
gp160mod.TV1.wtLnative
127 secuencia sintética de Env gp160, incluyendo tipo salvaje 8_2_TV1_C.ZA (sin modificar) líder
gp140.mod.TV1.tpa1
131 secuencia sintética de Env gp140, líder TPA1
gp140mod.TV1
132 secuencia sintética de gp140 Env, incluyendo secuencias líder modificados derivados de secuencias 8_2_TV1_C.ZA de tipo salvaje
gp140mod.TV1.wtLnative
133 secuencia sintética de Env gp120, incluyendo tipo salvaje 8_2_TV1_C.ZA (sin modificar) secuencia líder.
15
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Como se observa anteriormente, las construcciones que codifican Env pueden prepararse usando cualquiera de la longitud completa de las construcciones de gp160. Por ejemplo, se preparó una forma de gp140 (SEC ID Nº: 132)
45 truncando gp160 (SEC ID Nº: 126) en el nucleótido 2064; se preparó gp120 truncando gp160 (SEC ID Nº: 126) en el nucleótido 1551 (SEC ID Nº: 126). Pueden prepararse formas de gp140 y gp120 adicionales usando los métodos descritos en el presente documento. Normalmente se añaden uno o más codones de terminación (por ejemplo, nucleótidos 2608 a 2610 de SEC ID Nº: 126). Además, la secuencia conductora no mutante puede modificarse y/o sustituirse con otras secuencias conductoras (por ejemplo, secuencias conductoras de TPA1).
Así, el polipéptido gp160 incluye las secuencias codificantes para gp120 y gp41. El polipéptido gp41 comprende varios dominios que incluyen un dominio de oligomerización (OD) y un dominio que atraviesa la membrana de un lado a otro (TM). En la envuelta nativa, el dominio de oligomerización se requiere para la asociación no covalente de tres polipéptidos gp41 para formar una estructura trímera: mediante interacciones no covalentes con el trímero gp41 55 (y consigo mismo), los polipéptidos gp120 también están organizados en una estructura trimérica. Existe un sitio de escisión (o sitios de escisión) aproximadamente entre las secuencias de polipéptidos para gp 120 y las secuencias de polipéptidos correspondientes a gp41. Este (Estos) sitio(s) de escisión puede(n) mutarse para prevenir la escisión en el sitio. El polipéptido resultante gp140 se corresponde con una forma truncada de gp160 en la que se ha delecionado el dominio que atraviesa la membrana de un lado a otro de gp41. Este polipéptido gp140 puede existir en tanto formas monoméricas como oligoméricas (es decir, trímeras) en virtud de la presencia del dominio de oligomerización en el resto de gp41. En la situación en la que el sitio de escisión se ha mutado para prevenir la escisión y la porción transmembranaria de gp41 se ha delecionado, el producto de polipéptido resultante se designa gp140 “mutado” (por ejemplo, gp140.mut). Como será evidente para aquellos en el campo, el sitio de escisión puede mutarse en una variedad de formas. En las construcciones a modo de ejemplo descritas en el presente documento
65 (por ejemplo, SEC ID Nº: 121 y SEC ID Nº: 124), la mutación en el sitio de escisión de gp120/gp41 cambia la secuencia de aminoácidos no mutante IKR_R_WQREKR (SEC ID Nº: 129) a ISSWQSEKS (SEC ID Nº: 130).
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En todavía otros aspectos, se delecionaron región (regiones) hipervariable(s), se eliminaron sitios de N-glicosilación y/o se mutaron sitios de escisión. Construcciones a modo de ejemplo que tienen deleciones de la región variable (V1 y/o V2), se construyeron deleciones V2 delecionando nucleótidos de aproximadamente 499 a aproximadamente 593 (con respecto a SEC ID Nº: 128) y se construyeron deleciones V1/V2 delecionando nucleótidos de aproximadamente 375 a aproximadamente 602 (con respecto a SEC ID Nº: 128). Las localizaciones relativas de las regiones V1 y/o V2 también pueden determinarse fácilmente por el alineamiento con las regiones mostradas en la Tabla A. La Tabla E muestra secuencias no mutantes y sintéticas derivadas de la cepa del VIH tipo C sudafricana 12-5_1_TV2_C.ZA.
Tabla E
Nombre
SEQ ID Descripción
Envgp160_TV2_C_ZAopt
97 secuencia sintética de gp160 Env
Envgp160_TV2_C_ZAwt
98 tipo salvaje 12-5_1_TV2_C.ZA Env gp160.
Gag_TV2_C_ZAopt
99 secuencia sintética de la mordaza
Gag_TV2_C_ZAwt
100 tipo salvaje 12-5_1_TV2_C.ZA Gag
Nef _V2_C_ZAopt
101 secuencia sintética de Nef
Nef_TV2_C_ZAwt
102 tipo salvaje 12-5_1_TV2_C.ZA Nef
Pol_TV2_C_ZAopt
103 secuencia sintética de Pol
Pol_TV2_C_ZAwt
104 tipo salvaje 12-5_1_TV2_C.ZA de Pol
RevExon1TV2_C_ZAopt
105 secuencia sintética del exón 1 de Rev
RevExonl_TV2_C_ZAwt
106 tipo salvaje 12-5_1_TV2_C.ZA del exón 1 de Rev
RevExon2_TV2_C_ZAopt
107 secuencia sintética del exón 2 de Rev
RevExon2_TV2_C_ZAwt
108 tipo salvaje 12-5_1_TV2_C.ZA del exón 2 de Rev
TatExon1_TV2_C_ZAopt
109 secuencia sintética del exón 1 de Tat
TatExon1_TV2_C_ZAwt
110 tipo salvaje 12-5_1_TV2_C.ZA del exón 1 de Tat
TatExon2_TV2_C_ZAopt
111 secuencia sintética del exón 2 de Tat
TatExon2_TV2_C_ZAwt
112 tipo salvaje 12-5_1_TV2_C.ZA del exón 2 de Tat
Vif_TV2_C_ZAopt
113 secuencia sintética de Vif
Vif_TV2_C_ZAwt
114 tipo salvaje 12-5_1_TV2_C.ZA de Vif
Vpr_TV2_C_ZAopt
115 secuencia sintética de VPR
Vpr_TV2_C_ZAwt
116 tipo salvaje 12-5_1_TV2_C.ZA de VPR
Vpu_TV2_C_ZAopt
117 secuencia sintética de Vpu
Vpu_TV2_C_ZAwt
118 tipo salvaje 12-5_1_TV2_C.ZA de Vpu
Será rápidamente evidente que pueden modificarse secuencias derivadas de cualquier cepa del VIH tipo C o clon como se describe en el presente documento con el fin de lograr modificaciones deseables en esa cepa. Adicionalmente, pueden construirse poliproteínas fusionando en marco dos o más secuencias de polinucleótidos que codifican productos de polipéptido o de péptido. Además, pueden producirse secuencias codificantes policistrónicas disponiendo dos o más secuencias de polinucleótidos que codifican productos de polipéptido adyacentes entre sí, normalmente bajo el control de un promotor, en las que cada secuencia codificante de polipéptidos puede modificarse para incluir secuencias para sitios internos de unión a ribosoma.
Las secuencias de la presente divulgación, por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos (sintéticas) modificadas que codifican polipéptidos del VIH, pueden modificarse por deleciones, mutaciones puntuales, sustituciones, desplazamiento del marco, y/u otras modificaciones genéticas (por ejemplo, mutaciones que conducen a la inactivación de una actividad asociada a un polipéptido, por ejemplo, mutaciones que inactivan proteasa, tat, o actividad de transcriptasa inversa). Tales modificaciones se enseñan generalmente en la materia y pueden aplicarse en el contexto de las enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, sitios correspondientes a las “Regiones del genoma del VIH” enumeradas en la Tabla A pueden modificarse en las regiones correspondientes de las novedosas secuencias desveladas en el presente documento con el fin de lograr modificaciones deseables. Además, las secuencias de polinucleótidos (sintéticas) modificadas de la presente invención puede combinarse para su uso, por ejemplo, en una composición para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto, en una variedad de formas, que incluyen, pero no se limitan a, las siguientes formas: múltiples casetes de expresión individuales que comprenden cada uno una secuencia de polinucleótidos de la presente invención (por ejemplo, un casete de expresión de gag, un casete de expresión de env y un casete de expresión de rev, o un casete de expresión de pol, un casete de expresión de vif y un casete de expresión de vpr, etc.); poliproteínas producidas por fusiones en el marco de múltiples polinucleótidos de la presente invención, y polinucleótidos policistrónicos producidos usando múltiples polinucleótidos de la presente divulgación.
Ejemplo 2
Ensayos de expresión para las secuencias codificantes sintéticas
A. Secuencias codificantes del VIH tipo C
48
Se clonan las secuencias codificantes del VIH subtipo C no mutantes (por ejemplo, de AF110965, AF110967, AF110968, AF110975, además de novedosas cepas sudafricanas 8_5_TV1_C.ZA, 8_2_TV1_C.ZA y 12-5_1_TV2_C.ZA) en vectores de expresión que tienen las mismas características que los vectores en los que se
5 clonan las secuencias sintéticas.
Las eficiencias de expresión para diversos vectores que llevan las secuencias no mutantes y sintéticas se evalúan del siguiente modo. Células de varias líneas celulares de mamífero (293, RD, COS-7 y CHO; todas obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) se transfectan con 2
10 µg de ADN en reactivo de transfección LT1 (PanVera Corporation, 545 Science Dr., Madison, WI). Las células se incuban durante 5 horas en medio de suero reducido (Opti-MEM, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). El medio se sustituye entonces por medio normal del siguiente modo: células 293, IMDM, 10 % de suero de ternero fetal, 2 % de glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD); células RD y COS-7, D-MEM, 10 % de suero de ternero fetal, 2 % de glutamina (Opti-MEM, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD); y células CHO, Ham's F-12, 10 % de suero de ternero fetal, 2
15 % de glutamina (Opti-MEM, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). Las células se incuban durante tanto 48 como 60 horas. Se recogen los lisados celulares como se describe más adelante en el Ejemplo 3. Se recogen los sobrenadantes y se filtran a través de filtros de jeringa de 0,45 µm. Los sobrenadantes se evalúan usando placas de 96 pocillos recubiertas con un anticuerpo monoclonal murino dirigido contra el antígeno del VIH, por ejemplo, un ensayo p24 de Coulter (Coulter Corporation, Hialeah, FL, US). El antígeno del VIH-1 se une a los pocillos recubiertos. Anticuerpos
20 biotinilados contra el VIH reconocen el antígeno unido. La estreptavidina-peroxidasa de rábano picante conjugada reacciona con la biotina. El color se desarrolla de la reacción de peroxidasa con el sustrato TMB. La reacción se termina mediante la adición de H2SO4 4 N. La intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de antígeno del VIH en una muestra.
25 Casetes de expresión del VIH tipo C sintéticos proporcionan un espectacular aumento en la producción de sus productos de proteína, con respecto a las secuencias nativas (subtipo C no mutante), cuando se expresan en una variedad de líneas celulares.
B. Secuencias conductoras del péptido señal
30 Se probó la capacidad de diversas secuencias conductoras para conducir la expresión transfectando células con casetes de expresión que codifican Env no mutantes o sintéticos operativamente enlazados a diferentes secuencias conductoras y evaluar la expresión del polipéptido Env por ELISA o transferencia Western. La secuencia de aminoácidos y de nucleótidos de diversas secuencias conductoras de péptido señal se muestran en la Tabla 4.
35 Tabla 4
40
45
50
55
60
Líder
Secuencia de Aminoácidos Secuencia ADN
WTnative (8_2_TV 1_C.ZA)
MRVMGTQKNCQQWWIWGILGFWMLMIC imagen44
WTmod (8_2_TV 1_C.ZA)
MRVMGTQKNCQQWWIWGILGFWMLMIC
Tpa1
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS AS
Tpa2
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS imagen45
49
Se transfectaron células 293 transitoriamente usando métodos convencionales con construcciones nativas y modificadas en la secuencia que codifican las formas de gp120 y gp140 de la envoltura de 8_2_TV1_C.ZA (TV1c8.2). La proteína Env se midió en lisados celulares y sobrenadantes usando un ELISA de captura de Env interno. Los resultados se muestran en la Tabla 5 más adelante e indican que la secuencia conductora de péptido señal no mutante de TV1c8.2 puede usarse para expresar eficazmente la proteína de la envuelta codificada a niveles que son mejores o comparables a aquellos observados usando las secuencias conductoras de tpa heterólogo. Además, el conductor TV1c8.2 trabaja en sus formas nativas o modificadas en la secuencia y puede usarse con genes env nativos o modificados en la secuencia. Todas las construcciones se probaron después de clonar los casetes de gen en los sitios EcoR1 y Xho1 del vector de expresión pCMVlink.
Tabla 5
imagen46
Se subclonaron los casetes del gen de variante de la envoltura TV1c8.2 modificado en la secuencia en un vector de
35 expresión pCMV de Chiron para la derivación de líneas celulares de mamífero estables. Se derivaron líneas celulares CHO estables que expresan las proteínas de la envuelta TV1c8.2 usando métodos estándar de transfección, amplificación con metotrexato y cribado. Se encontró que estas líneas celulares secretaban niveles de proteína de la envuelta que fueron comparables a aquellos observados para proteínas expresadas usando las secuencias conductoras de tpa. Resultados representativos se muestran en la Tabla 6 para dos clones de la línea celular que expresan gp120 TV1c8.2; se comparan con dos clones de referencia que expresan gp120 subtipo B SF162 derivado de un modo similar, pero usando el conductor tpa. Las concentraciones de proteína se determinaron siguiendo densitometría de geles escaneados de proteínas semi-purificadas. Se generaron curvas patrón usando una preparación altamente purificada y bien caracterizada de la proteína gp120 SF2 y se determinaron las concentraciones de las proteínas de prueba.
45 Tabla 6
Línea celular CHO
Clon # Expresión (ng/ml)
gp120 SF162
Clon 65 921
Clon 71
972
gp120TV1.C8.2
Clon 159 1977
Clon 210
1920
55 Los resultados también se confirmaron por análisis de transferencia Western, esencialmente como se describe en el Ejemplo 3. Ejemplo 3 Análisis de transferencia Western de la expresión
A. Secuencias codificantes del VIH tipo C
Se transfectan células 293 humanas como se describe en el Ejemplo 2 con vectores basados en pCMV que 65 contienen casetes de expresión del VIH tipo C nativos o sintéticos. Las células se cultivan durante 60 horas después de la transfección. Se preparan sobrenadantes como se ha descrito. Se preparan lisados celulares del siguiente
50
imagen47
5
15
25
35
45
55
65
Tabla 1
Grupo
Gag o Env Expresión Casete La concentración de ADN plásmido Gag o Env (µg) Imnunizado tiempo (semanas)
1
Sintético 20 01,4
2
Sintético 2 0.4
3
Sintético 0.2 0.4
4
Sintético 0.02 0.4
5
Sintético 0.002 0.4
6
Sintético 20 0
7
Sintético 2 0
8
Sintético 0.2 0
9
Sintético 0.02 0
10
Sintético 0.002 0
11
Nativo 20 0.4
12
Nativo 2 0.4
13
Nativo 0.2 0.4
14
Nativo 0.02 0.4
15
Nativo 0.002 0.4
16
Nativo 20 0
17
Nativo 2 0
18
Nativo 0.2 0
19
Nativo 0.02 0
20
Nativo 0.002 0
1 = inmunización inicial en "semana 0"
Se extrae sangre de los grupos 1-5 y 11-15 en la semana 0 (antes de la inmunización), semana 4, semana 6, semana 8 y semana 12. Se extrae sangre de los grupos 6-20 y 16-20 en la semana 0 (antes de la inmunización) y en la semana 4.
B. Respuesta inmunitaria humoral
La respuesta inmunitaria humoral se comprueba con ELISA de anticuerpos anti-VIH (enzimoinmunoanálisis de adsorción) de los sueros de ratones 0 y 4 semanas después de la inmunización (grupos 5-12) y, además, 6 y 8 semanas después de la inmunización, respectivamente, 2 y 4 semanas después de la segunda inmunización (grupos 1-4).
Los títulos de anticuerpos de los sueros se determinan usando ELISA de anticuerpos anti-polipéptidos VIH apropiados (por ejemplo, anti-Pol, anti-Gag, anti-Env, anti-Vif, anti-Vpu, etc.). Brevemente, sueros de ratones inmunizados se criban para anticuerpos dirigidos contra las proteínas del VIH (por ejemplo, proteína Gag p55, una proteína Env, por ejemplo, gp160 o gp120 o una proteína Pol, por ejemplo, p6, prot o RT, etc). Se recubren placas de microtitulación de ELISA con 0,2 µg de proteína del VIH por pocillo durante la noche y se lavan cuatro veces; posteriormente, el bloqueo se hace con PBS-0,2 % de Tween (Sigma) durante 2 horas. Después de eliminar la disolución de bloqueo, se añaden 100 µl de suero de ratón diluido. Lo sueros se prueban a 1/25 diluciones y por diluciones triples sucesivas, a partir de aquí. Las placas de microtitulación se lavan cuatro veces y se incuban con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón acoplado a peroxidasa (Pierce, Rockford, IL). Las placas de ELISA se lavan y se añade 100 µl de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB; Pierce) por pocillo. La densidad óptica de cada pocillo se mide después de 15 minutos. Los títulos informados son el recíproco de la dilución de suero que dieron una densidad óptica al 50 % (D.O.).
Los casetes de expresión sintéticos proporcionarán una clara mejora de la inmunogenicidad con respecto a los casetes de expresión nativos.
C. Respuesta inmunitaria celular
La frecuencia de linfocitos T citotóxicos específicos (CTL) se evalúa por un ensayo de liberación de cromo estándar de células CD4 (Balb/c, CB6F1 y/o C3H) de ratón pulsadas con péptidos. Se usan células CD-8 infectadas con virus de la variolovacuna que expresan polipéptidos del VIH (por ejemplo, Pol, Gag o Env) como control positivo. Brevemente, se obtienen células del bazo (células efectoras, E) de los ratones inmunizados como se ha descrito anteriormente, se cultivan, se re-estimulan y se ensayan para actividad de CTL contra células diana pulsadas con péptidos Gag como se ha descrito (Doe, B., y Walker, C.M., AIDS 10(7):793-794, 1996). La actividad citotóxica se mide en un ensayo de liberación de 51Cr patrón. Se cultivan células diana (T) con células efectoras (E) a diversas relaciones E:T durante 4 horas y se usan las cpm promedio de los pocillos por duplicado para calcular el porcentaje de liberación de 51Cr específica.
52
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  1. imagen1
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