ES2555381T3 - Moléculas biespecíficas de unión a EGFR/IGFIR - Google Patents

Abstract

Un dímero de proteína similar a anticuerpo que comprende un décimo dominio de fibronectina de tipo III (10Fn3) que se une a IGF-IR con una KD menor de 500 nM unido a un 10Fn3 que se une a EGFR con una KD menor de 500 nM; en el que el 10Fn3 de unión a IGF-IR comprende un bucle BC que tiene la secuencia de aminoácidos XaSARLKVAXb (SEC ID Nº: 46), un bucle DE que tiene la secuencia de aminoácidos XcKNVYXd (SEC ID Nº: 48) y un bucle FG que tiene la secuencia de aminoácidos XeRFRDYQXf (SEC ID Nº: 50), en el que el 10Fn3 de unión a EGFR comprende un bucle BC que tiene la secuencia de aminoácidos XgWAPVDRYQXh (SEC ID Nº: 137), un bucle DE que tiene la secuencia de aminoácidos XiRDVYXj (SEC ID Nº: 138) y un bucle FG que tiene la secuencia de aminoácidos XkDYKPHADGPHTYHESXl (SEC ID Nº: 139); y en el que X es cualquier aminoácido y a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k y l son números enteros seleccionados independientemente de 0 a 5.

Description

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En otra realización, la invención proporciona un 10Fn3 de unión a EGFR que comprende un bucle BC que comprende la secuencia de aminoácidos XXXXXXYQ, un bucle DE que comprende la secuencia de aminoácidos XX(V/I/L/M/A)X, y un bucle FG que comprende la secuencia de aminoácidos (D/N)Xn, donde X es cualquier aminoácido y n es 9-14 aminoácidos. En un ejemplo de realización, n es 14 aminoácidos.

5 En otra realización, la invención proporciona un 10Fn3 de unión a EGFR que comprende un bucle BC que corresponde a los aminoácidos 23-30 de la SEC ID Nº: 1 que comprende la secuencia de aminoácidos XXXXXXYQ, un bucle DE que corresponde a los aminoácidos 52-55 de la SEC ID Nº: 1 que comprende la secuencia de aminoácidos XX(V/I/L/M/A)X, y un bucle FG que corresponde a los aminoácidos 77-86 de la SEC ID Nº: 1 que comprende la secuencia de aminoácidos (D/N)Xn, donde X es cualquier aminoácido y n es 9-14 aminoácidos. En un ejemplo de realización, n es 14 aminoácidos.

En otra realización, la invención proporciona un 10Fn3 de unión a EGFR que comprende un bucle BC que comprende la secuencia de aminoácidos XXXXXXYQ, un bucle DE que comprende la secuencia de aminoácidos

15 XX(V/I/L/M/A)X y un bucle FG que comprende una secuencia de aminoácidos:

D(Y/F/W)(Y/F/K)(N/D/P)(P/H/L)(A/T/V)(T/D/S)(H/Y/G)(E/P/V)(Y/H)(T/K/I)(Y/F)(H/N/Q)(T/Q/E)(T/S/I);

donde X es cualquier aminoácido.

En otra realización, la invención proporciona un 10Fn3 de unión a EGFR que comprende un bucle BC que comprende la secuencia de aminoácidos XXXXXXYQ, un bucle DE que comprende la secuencia de aminoácidos XX(V/I/L/M/A)X y un bucle FG que comprende una secuencia de aminoácidos:

25 D(Y/F)(K/R)PHXDGPH(T/I)S/Y) (SEC ID Nº: 483);

donde X es cualquier aminoácido.

En otra realización, la invención proporciona un 10Fn3 de unión a EGFR que comprende un bucle BC que comprende la secuencia de aminoácidos XXXXXXYQ, un bucle DE que comprende la secuencia de aminoácidos XX(V/I/L/M/A)X y un bucle FG que comprende la secuencia de aminoácidos D(Y/F/W)(Y/F/K)(N/P/D)(P/H/L)X(T/D/S)(H/G/Y)(E/P/Y)(Y/H)XYXXX, donde X es cualquier aminoácido.

En otra realización, la invención proporciona un 10Fn3 de unión a EGFR que comprende un bucle FG que 35 comprende una secuencia de aminoácidos:

D(Y/F)(K/R)PHXDGPH(T/I)YXE(S/Y) (SEC ID Nº: 483);

donde X es cualquier aminoácido.

En ciertas realizaciones, el 10Fn3 de unión a EGFR comprende cualquiera de las secuencias consenso proporcionadas anteriormente, con la condición de que el 10Fn3 de unión a EGFR no comprenda una o más de las siguientes secuencias:

45 i.

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWQVPRPMYQRYYRITYGETGGNSPVQ

EFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYMHSEYRQYPISINYRT (SEC ID Nº: 484),

y

ii.

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWQVPRPMYQYYRITYGETGGNSPVQE

FTVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYMHSEYRQYPISINYRT (SEC ID Nº: 485),

55 y

iii.

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWQVPRPMYQRYYRITYGETGGNSPVQ EFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYMHSEYRQYPISINYRTEIDKPCQ (SEC ID Nº: 486).

En ciertas realizaciones, un 10Fn3 de unión a EGFR que comprende una de las secuencias consenso proporcionadas anteriormente tiene al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 % o 80 % de identidad con la SEC ID Nº: 1. En ciertas realizaciones, la estructura global de un 10Fn3 de unión a EGFR que comprende una de las

65 secuencias consenso proporcionadas anteriormente se parece al plegamiento de las inmunoglobulinas. En cierta realización, un 10Fn3 de unión a EGFR que comprende una de las secuencias consenso proporcionadas

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procedimiento conocido para un especialista en la técnica, incluyendo tecnología de resonancia de plasmón superficial (BIACORE) y/o análisis de ELISA en fase sólida. Como alternativa, los ensayos in vitro diseñados para medir un acontecimiento de activación de células T también son indicativos de inmunogenicidad.

5 Modificaciones Adicionales

En ciertas realizaciones, los agentes de unión a E y agentes de unión a E/I, en particular, multímeros de proteína similar a anticuerpo tales como un dímero de un 10Fn3 de unión a EGFR y un 10Fn3 de unión a IGFIR, pueden comprender además modificaciones post-traducción. La modificación de proteína post-traducción ejemplar incluye fosforilación, acetilación, metilación, ADP-ribosilación, ubiquitinación, glucosilación, carbonilación, sumoilación, biotinilación o adición de una cadena lateral de polipéptido o de un grupo hidrófobo. Como resultado, los agentes de unión a E y agentes de unión a E/I modificados pueden contener elementos no aminoacídicos, tales como lípidos, poli-o mono-sacáridos y fosfatos. Una forma preferida de glucosilación es la sialilación, que conjuga uno o más restos de ácido siálico al polipéptido. Los restos de ácido siálico mejoran la solubilidad y la semivida sérica mientras

15 que también reducen la posible inmunogenicidad de la proteína. Véase, por ejemplo, Raju y col. Biochemistry. 31 de jul de 2001; 40(30): 8868-76. Los efectos de tales elementos no aminoacídicos sobre la funcionalidad de un agente de unión a E o agente de unión a E/I se pueden ensayar para su papel de antagonización en la función de señalización de EGFR e IGFIR.

En algunas realizaciones, los agentes de unión a E y agentes de unión a E/I se modifican para potenciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En algunas realizaciones, el agente de unión a E/I es un dímero de un 10Fn3 de unión a EGFR y un 10Fn3 de unión a IGFIR que comprende además una región Fc. En algunas realizaciones, la región Fc es una variante que potencia ADCC o CDC. La variante de región Fc puede comprender una secuencia de región Fc humana (por

25 ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos, incluyendo las posiciones 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 360, 378 o 430, en las que la numeración de los restos en la región Fc es la del índice EU como en Kabat.

Realizaciones de Vectores y Polinucleótidos

También se incluyen en la presente descripción secuencias de ácido nucleico que codifican cualquiera de las proteínas descritas en este documento. Como se entenderá por los especialistas en la técnica, debido a la degeneración de tercera base, prácticamente cualquier aminoácido se puede representar por más de un codón de

35 triplete en una secuencia de nucleótidos codificante. Además, cambios de pares de bases menores pueden dar como resultado una sustitución conservativa en la secuencia de aminoácidos codificada pero no se espera que alteren sustancialmente la actividad biológica del producto génico. Por lo tanto, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína descrita en este documento se puede modificar ligeramente en la secuencia y todavía codificar su producto génico respectivo.

Los ejemplos de ácidos nucleicos que codifican los agentes de unión a E/I descritos en este documento incluyen ácidos nucleicos que tienen las SEC ID Nº: 448, 455 y 460-465 o ácidos nucleicos que tienen una secuencia idéntica en al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % a una cualquiera de las SEC ID Nº: 448, 455 y 460-465. También están dentro del alcance de la invención ácidos nucleicos aislados que difieren de los ácidos

45 nucleicos indicados en la SEC ID Nº: 442-465 debido a la degeneración del código genético. En ciertas realizaciones, las secuencias de nucleótidos que codifican los agentes de unión a E/I, un monómero de E o un monómero de I no contienen una secuencia que codifica un marcador de 6XHis (SEC ID Nº: 487 [???]).

Pueden sintetizarse químicamente ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las diversas proteínas o polipéptidos descritos en este documento. Puede seleccionarse el uso de codones a fin de mejorar la expresión en una célula. Dicho uso de codones dependerá del tipo celular seleccionado. Se han desarrollado patrones de uso de codones especializados para E. coli y otras bacterias, así como células de mamífero, células vegetales, células de levadura y células de insecto. Véase, por ejemplo: Mayfield y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100 (2): 438-42; Sinclair y col. Protein Expr Purif. 2002 (1): 96-105; Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001 (5): 446-9; Makrides y col.

55 Microbiol Rev. 1996 60 (3): 512-38; y Sharp y col. Yeast. 1991 7 (7): 657-78.

Las técnicas generales para manipulación de ácidos nucleicos pertenecen al ámbito del especialista en la técnica y también se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed., 1989, o F. Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: Nueva York, 1987) y actualizaciones periódicas. El ADN que codifica una proteína está unido operativamente a elementos reguladores de la transcripción o de la traducción adecuados procedentes de genes de mamífero, virus o insecto. Tales elementos reguladores incluyen un promotor de la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión al ribosoma del ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y de la traducción. La capacidad 65 para replicarse en un huésped, habitualmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes, se incorporan adicionalmente. En la técnica se conocen bien los

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gelatina dura en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte o como cápsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a una dosis que produce los efectos terapéuticos para los que se

5 administra. La dosis exacta dependerá del trastorno a tratar y se puede evaluar por el especialista en la técnica usando técnicas conocidas. En general, el agente de unión a E o agente de unión a E/I se administra con de aproximadamente 0,01 µg/kg a aproximadamente 50 mg/kg pro día, preferiblemente de 0,01 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg por día, más preferiblemente de 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg por día. El polipéptido se puede administrar diariamente (por ejemplo, una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces al día) o

10 menos frecuentemente (por ejemplo, una vez cada dos días, una o dos veces por semana o mensualmente). Además, como se conoce en la técnica, pueden ser necesarios ajustes para la edad así como el peso corporal, estado general, sexo, alimentación, momento de la administración, interacción con fármaco y la gravedad de la enfermedad y se podrán evaluar con experimentación rutinaria por los especialistas en la técnica.

15 EJEMPLIFICACIÓN

La invención que se está describiendo ahora de forma general se comprenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos que se incluyen únicamente con propósitos de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención y no tienen por objeto limitar la invención de ningún modo.

20

Resumen de Secuencias

Muchas de las secuencias a las que se hace referencia en esta solicitud se resumen en la siguiente tabla. A menos que se especifique de otro modo, la extensiones N-terminales se indican con un subrayado sencillo, las colas C

25 terminales se indican con un subrayado doble, y las secuencias enlazadoras se indican en negrita.

SEC ID Nº:

Descripción Secuencia

1

Dominio 10Fn3 humano de tipo silvestre VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITY GETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTIT VYAVTGRGDSPASSKPISINYRT

2

10Fn3 humano variante con el motivo de unión a integrina eliminado (RGD cambiado a SGE; los cambios de la SEC ID Nº: 1 están subrayados) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITY GETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTIT VYAVTGSGESPASSKPISINYRT

3

Monómero de I1 IGF-IR con extensión N-terminal (N+8) y sin cola VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRT

4

Monómero de I1 IGF-IR con extensión N-terminal (N+10) y cola de Ser con marcador de His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQHHHHHH

5*

Monómero de EGFR E2 con extensión N terminal (N+8) y sin cola VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSGRGSYQYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPGPVHTATISGLKPGVDYTI TVYAVTDHKPHADGPHTYHESPISINYRT

6*

Monómero de EGFR E2 con extensión N terminal (N+10) y cola de Ser con marcador de His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSGRGSYQYY RITYGETGGNSPVQEFTVPGPVHTATISGLKPGVD YTITVYAVTDHKPHADGPHTYHESPISINYRTEIDKP SQHHHHHH

7*

monómero de EGFR E1 con extensión N-terminal (N+8) y sin cola VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVAGAEDYQYYRITY GETGGNSPVQEFTVPHDLVTATISGLKPGVDYTITV YAVTDMMHVEYTEHPISINYRT

8*

monómero de EGFR E1 con extensión N-terminal (N+10) y cola de Ser con marcador de His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVAGAEDYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPHDLVTATISGLKPGVDYT ITVYAVTDMMHVEYTEHPISINYRTEIDKPSQHHHH HH

9

Cola de Ser EIDKPSQ

10

Cola de Cys EIDKPCQ

11

Adaptador (GS)10 GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS

12

Adaptador basado en Fn PSTSTST

13

Adaptador (GS)5 GSGSGSGSGS

14

Adaptador (GGGGS)3 GGGGS GGGGS GGGGS

15

Adaptador (GGGGS)4 GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS

16

Adaptador (GGGGS)5 GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS

17

Adaptador G4SG4SG3SG GGGGS GGGGS GGGSG

18

Adaptador GPGPGPG

19

Adaptador GPGPGPGPGPG

20*

I1-GS10-E2: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E2 (con extensión N-terminal (N+8) y sin cola) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSG SGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSGRG SYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGPVHTATISGL KPGVDYTITVYAVTDHKPHADGPHTYHESPISINYR T

21*

I1-GS10-E2: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E2 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSG RGSYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGPVHTATIS GLKPGVDYTITVYAVTDHKPHADGPHTYHESPISIN YRTEIDKPSQ

22*

I1-GS10-E2: Tándem de I/E I1 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E2 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser con marcador de His) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSG RGSYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGPVHTATIS GLKPGVDYTITVYAVTDHKPHADGPHTYHESPISIN YRTEIDKPSQHHHHHH

23*

E2-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E2 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través de adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSGRGSYQYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPGPVHTATISGLKPGVDYTI TVYAVTDHKPHADGPHTYHESPISINYRTEIDKGSG SGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTS LLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYR TEIDKPSQ

24*

E2-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E2 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSGRGSYQYY RITYGETGGNSPVQEFTVPGPVHTATISGLKPGVD YTITVYAVTDHKPHADGPHTYHESPISINYRTEIDKG SGSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTV PKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISIN YRTEIDKPSQ

25*

E2-GS10-I1:Tándem de E/I que tiene E2 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser con marcador de His) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSGRGSYQYY RITYGETGGNSPVQEFTVPGPVHTATISGLKPGVD YTITVYAVTDHKPHADGPHTYHESPISINYRTEIDKG SGSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTV PKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISIN YRTEIDKPSQHHHHHH

26*

I1-GS10-E1: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E1 (con extensión N-terminal (N+8) y sin cola) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSG SGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVAGAED YQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPHDLVTATISGLKP GVDYTITVYAVTDMMHVEYTEHPISINYRT

27*

I1-GS10-E1: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVAGA EDYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPHDLVTATISG LKPGVDYTITVYAVTDMMHVEYTEHPISINYRTEIDK PSQ

28*

I1-GS10-E1: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser con marcador de His) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVAGA EDYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPHDLVTATISG LKPGVDYTITVYAVTDMMHVEYTEHPISINYRTEIDK PSQHHHHHH

29*

E1-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y sin cola) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVAGAEDYQYYRITY GETGGNSPVQEFTVPHDLVTATISGLKPGVDYTITV YAVTDMMHVEYTEHPISINYRTEIDKGSGSGSGSG SGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSA RLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATIS GLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT

30*

E1-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E1 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVAGAEDYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPHDLVTATISGLKPGVDYT ITVYAVTDMMHVEYTEHPISINYRTEIDKGSGSGSG SGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLIS WSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYT ATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEID KPSQ

31*

E1-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E1 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser con marcador de His) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVAGAEDYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPHDLVTATISGLKPGVDYT ITVYAVTDMMHVEYTEHPISINYRTEIDKGSGSGSG SGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLIS WSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYT ATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEID KPSQHHHHHH

32

Armazón de 10Fn3, donde los bucles BC, DE y FG se representan por (X)n, (X)o, y (X)p, respectivamente, y n es un número entero de 1-20, o es un número entero de 1-20, y p es un número entero de 1-40 VSDVPRDLEVVAATPTSLLI (X)nYYRITYGETGGNSPVQEFTV(X)oATISGLKPGV DYTITVYAV(X)pISINYRT

33*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E1 SWVAGAEDYQ

34*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E1, donde X es cualquier aminoácido y m y n se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XmVAGAEDYQXn

35*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E1 PHDLVT

36*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E1, donde X es cualquier aminoácido y o y p se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XoHDLVXp

37*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E1 TDMMHVEYTEHP

38*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E1, donde X es cualquier aminoácido y q y r se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XqDMMHVEYTEHXr

39*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E2 SWDSGRGSYQ

40*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E2, donde X es cualquier aminoácido y g y h se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XgDSGRGSYQXh

41*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E2 PGPVHT

42*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E2, donde X es cualquier aminoácido y i y j se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XiGPVHXj

43**

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E2 TDHKPHADGPHTYHESP

44*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E2, donde X es cualquier aminoácido y k y l se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XkDHKPHADGPHTYHEXl

45

Secuencia de bucle BC de agente de unión a IGF-IR I1 SWSARLKVAR

46

Secuencia de bucle BC de agente de unión a IGF-IR I1, donde X es cualquier aminoácido y a y b se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XaSARLKVAXb

47

Secuencia de bucle DE de agente de unión a IGF-IR I1 PKNVYT

48

Secuencia de bucle DE de agente de unión a IGF-IR I1, donde X es cualquier aminoácido y c y d se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XcKNVYXd

49

Secuencia de bucle FG de agente de unión a IGF-IR I1 TRFRDYQP

50

Secuencia de bucle FG de agente de unión a IGF-IR I1, donde X es cualquier aminoácido y e y f se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XeRFRDYQXf

51

Adaptador GPG

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monómero de EGFR E3 con extensión N-terminal (N+10), cola de Ser y marcador de his MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWLPGKLRYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPHDLRTATISGLKPGVDYT ITVYAVTNMMHVEYSEYPISINYRTEIDKPSQHHHH HH

53*

E3-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E3 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys con marcador de his) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWLPGKLRYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPHDLRTATISGLKPGVDYT ITVYAVTNMMHVEYSEYPISINYRTEIDKGSGSGSG SGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLIS WSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYT ATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEID KPCQHHHHHH

54*

I1-GS10-E3: Tándem de I/E que tiene I1 con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E3 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys con marcador de his) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWLPGK LRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPHDLRTATISGL KPGVDYTITVYAVTNMMHVEYSEYPISINYRTEIDK PCQHHHHHH

55*

E1-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E1 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys con marcador de his) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVAGAEDYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPHDLVTATISGLKPGVDYT ITVYAVTDMMHVEYTEHPISINYRTEIDKGSGSGSG SGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLIS WSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYT ATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEID KPCQHHHHHH

56*

E2-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E2 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys con marcador de his) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSGRGSYQYY RITYGETGGNSPVQEFTVPGPVHTATISGLKPGVD YTITVYAVTDHKPHADGPHTYHESPISINYRTEIDKG SGSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTV PKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISIN YRTEIDKPCQHHHHHH

57*

I1-GS10-E1: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys con marcador de his) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVAGA EDYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPHDLVTATISG LKPGVDYTITVYAVTDMMHVEYTEHPISINYRTEIDK PCQHHHHHH

58*

I1-GS10-E2: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E2 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys con marcador de his) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSG RGSYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGPVHTATIS GLKPGVDYTITVYAVTDHKPHADGPHTYHESPISIN YRTEIDKPCQHHHHHH

59*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E3 SWLPGKLRYQ

60*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E3, donde X es cualquier aminoácido y s y t se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XsLPGKLRYQXt

61*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E3 PHDLRT

62*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E3, donde X es cualquier aminoácido y u y w se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XuHDLRXw

63*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E3 TNMMHVEYSEYP

64*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E3, donde X es cualquier aminoácido y y y z se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XyNMMHVEYSEYXz

65*

Secuencia central de monómero de IGF-IR I1: I1 sin extensión N-terminal o cola C-terminal EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSP VQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRD YQPISINYRT

66*

Secuencia central de monómero de EGFR E1: E1 sin extensión Nterminal o cola C-terminal EVVAATPTSLLISWVAGAEDYQYYRITYGETGGNS PVQEFTVPHDLVTATISGLKPGVDYTITVYAVTDMM HVEYTEHPISINYRT

67*

Secuencia central de monómero de EGFR E2: E2 sin extensión Nterminal o cola C-terminal EVVAATPTSLLISWDSGRGSYQYYRITYGETGGNS PVQEFTVPGPVHTATISGLKPGVDYTITVYAVTDHK PHADGPHTYHESPISINYRT

68*

Secuencia central de monómero de EGFR E3: SEC ID Nº: 82 sin extensión N-terminal o cola Cterminal EVVAATPTSLLISWLPGKLRYQYYRITYGETGGNSP VQEFTVPHDLRTATISGLKPGVDYTITVYAVTNMM HVEYSEYPISINYRT

69

Ejemplo de extensión N-terminal (N+10) MGVSDVPRDL

70

Ejemplo de extensión N-terminal GVSDVPRDL

71

Ejemplo de extensión N-terminal (N+8) VSDVPRDL

72

Ejemplo de extensión N-terminal, donde X es cualquier aminoácido y n es 0, 1 o 2, preferiblemente cuando n=1, X es Met o Gly y cuando n=2, X es Met-Gly XnSDVPRDL

73

Ejemplo de extensión N-terminal, donde X es cualquier aminoácido y n es 0, 1 o 2, preferiblemente cuando n=1, X es Met o Gly y cuando n=2, X es Met-Gly XnDVPRDL

74

Ejemplo de extensión N-terminal, donde X es cualquier aminoácido y n es 0, 1 o 2, preferiblemente cuando n=1, X es Met o Gly y cuando n=2, X es Met-Gly XnVPRDL

75

Ejemplo de extensión N-terminal, donde X es cualquier aminoácido y n es 0, 1 o 2, preferiblemente cuando n=1, X es Met o Gly y cuando n=2, X es Met-Gly XnPRDL

76

Ejemplo de extensión N-terminal, donde X es cualquier aminoácido y n es 0, 1 o 2, preferiblemente cuando n=1, X es Met o Gly y cuando n=2, X es Met-Gly XnRDL

77

Ejemplo de extensión N-terminal, donde X es cualquier aminoácido y n es 0, 1 o 2, preferiblemente cuando n=1, X es Met o Gly y cuando n=2, X es Met-Gly XnDL

78

Cola corta EIDK

79

Ejemplo de cola C-terminal EIDKP

80

Ejemplo de cola C-terminal EIDKPS

81

Ejemplo de cola C-terminal EIDKPC

82*

Monómero de EGFR E3 con extensión N-terminal (N+8) y sin cola VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWLPGKLRYQYYRITY GETGGNSPVQEFTVPHDLRTATISGLKPGVDYTITV YAVTNMMHVEYSEYPISINYRT

87*

E3-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E3 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWLPGKLRYQYYRITY GETGGNSPVQEFTVPHDLRTATISGLKPGVDYTITV YAVTNMMHVEYSEYPISINYRTEIDKGSGSGSGSG SGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSA RLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATIS GLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPC Q

88*

I1-GS10-E3: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E3 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSG SGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWLPGKLR YQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPHDLRTATISGLK PGVDYTITVYAVTNMMHVEYSEYPISINYRTEIDKP CQ

89*

E1-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVAGAEDYQYYRITY GETGGNSPVQEFTVPHDLVTATISGLKPGVDYTITV YAVTDMMHVEYTEHPISINYRTEIDKGSGSGSGSG SGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSA RLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATIS GLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPC Q

90*

E2-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E2 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSGRGSYQYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPGPVHTATISGLKPGVDYTI TVYAVTDHKPHADGPHTYHESPISINYRTEIDKGSG SGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTS LLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYR TEIDKPCQ

91*

I1-GS10-E1: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSG SGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVAGAED YQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPHDLVTATISGLKP GVDYTITVYAVTDMMHVEYTEHPISINYRTEIDKPC Q

92*

I1-GS10-E2: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E2 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSG SGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSGRG SYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGPVHTATISGL KPGVDYTITVYAVTDHKPHADGPHTYHESPISINYR TEIDKPCQ

93

Adaptador PA3 PAPAPA

94

Adaptador PA6 PAPAPAPAPAPA

95

Adaptador PA9 PAPAPAPAPAPAPAPAPA

96

Cola de Ser modificada EGSGS

97

Cola de Cys modificada EGSGC

98*

E3-(PA)n-I1: Tándem de E/I que tiene E3 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola E) fusionado a través del adaptador (PA)n a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola de Ser o Cys modificada), donde n = 3, 6 o 9, y X = Ser o Cys VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWLPGKLRYQYYRITY GETGGNSPVQEFTVPHDLRTATISGLKPGVDYTITV YAVTNMMHVEYSEYPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLE VVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPV QEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDY QPISINYRTEGSGX

99*

I1-(PA)n-E3: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola E) fusionado a través del adaptador (PA)n a E3 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola de Ser o Cys modificada), donde n = 3, 6 o 9, y X = Ser o Cys VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEVVAA TPTSLLISWLPGKLRYQYYRITYGETGGNSPVQEFT VPHDLRTATISGLKPGVDYTITVYAVTNMMHVEYS EYPISINYRTEGSGX

100*

E1-(PA)n-I1: Tándem de E/I que tiene E1 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola E) fusionado a través del adaptador (PA)n a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola de Ser o Cys modificada), donde n = 3, 6 o 9, y X = Ser o Cys VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVAGAEDYQYYRITY GETGGNSPVQEFTVPHDLVTATISGLKPGVDYTITV YAVTDMMHVEYTEHPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLE VVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPV QEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDY QPISINYRTEGSGX

101*

E2-(PA)n-I1: Tándem de E/I que tiene E2 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola E) fusionado a través del adaptador (PA)n a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola de Ser o Cys modificada), donde n = 3, 6 o 9, y X = Ser o Cys VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSGRGSYQYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPGPVHTATISGLKPGVDYTI TVYAVTDHKPHADGPHTYHESPISINYRTE(PA)nVS DVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGE TGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYA VTRFRDYQPISINYRTEGSGX

102*

I1-(PA)n-E1: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola E) fusionado a través del adaptador (PA)n a E1 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola de Ser o Cys modificada), donde n = 3, 6 o 9, y X = Ser o Cys VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEVVAA TPTSLLISWVAGAEDYQYYRITYGETGGNSPVQEF TVPHDLVTATISGLKPGVDYTITVYAVTDMMHVEYT EHPISINYRTEGSGX

103*

I1-(PA)n-E2: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola E) fusionado a través del adaptador (PA)n a E2 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola de Ser o Cys modificada), donde n = 3, 6 o 9, y X = Ser o Cys VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEVVAA TPTSLLISWDSGRGSYQYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGPVHTATISGLKPGVDYTITVYAVTDHKPHADG PHTYHESPISINYRTEGSGX

104*

E3-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E3 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWLPGKLRYQYYRITY GETGGNSPVQEFTVPHDLRTATISGLKPGVDYTITV YAVTNMMHVEYSEYPISINYRTEIDKGSGSGSGSG SGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSA RLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATIS GLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ

105*

I1-GS10-E3: Tándem de I/E que tiene I1 con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E3 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSG SGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWLPGKLR YQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPHDLRTATISGLK PGVDYTITVYAVTNMMHVEYSEYPISINYRTEIDKP SQ

106*

Monómero de EGFR E4 con extensión N-terminal (N+8) y sin cola VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHERDGSRQYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTI TVYAVTDYFNPTTHEYIYQTTPISINYRT

107*

Monómero de EGFR E4 con extensión N-terminal (N+10) y una Ser con marcador de His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHERDGSRQYY RITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVD YTITVYAVTDYFNPTTHEYIYQTTPISINYRTEIDKPS QHHHHHH

108*

E4 secuencia central de monómero de EGFR: E4 sin extensión Nterminal o cola C-terminal EVVAATPTSLLISWHERDGSRQYYRITYGETGGNS PVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYF NPTTHEYIYQTTPISINYRT

109*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E4 SWHERDGSRQ

110*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E4 PGGVRT

111*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E4 TDYFNPTTHEYIYQTTP

112

Monómero de EGFR E5 con extensión N-terminal (N+8) y sin cola VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAPVDRYQYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYRT

113

Monómero de EGFR E5 con extensión N-terminal (N+10) y una cola de Ser o Cys modificada, donde X = Ser o Cys; puede comprender opcionalmente un marcador de 6X His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAPVDRYQYY RITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYRTEIDKP XQ

114

E5 secuencia central de monómero de EGFR: E5 sin extensión Nterminal o cola C-terminal EVVAATPTSLLISWWAPVDRYQYYRITYGETGGNS PVQEFTVPRDVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYK PHADGPHTYHESPISINYRT

115

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E5 SWWAPVDRYQ

116

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E5 PRDVYT

117

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E5 TDYKPHADGPHTYHESP

118*

E4-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E4 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y sin cola) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHERDGSRQYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTI TVYAVTDYFNPTTHEYIYQTTPISINYRTEIDKGSGS GSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSL LISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKN VYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT

119*

E4-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E4 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser o Cys modificada), donde X = Ser o Cys; puede comprender opcionalmente un marcador de 6X His VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHERDGSRQYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTI TVYAVTDYFNPTTHEYIYQTTPISINYRTEIDKGSGS GSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSL LISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKN VYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT EIDKPXQ

120*

E4-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E4 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) con marcador de his MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHERDGSRQYY RITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVD YTITVYAVTDYFNPTTHEYIYQTTPISINYRTEIDKGS GSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATP TSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVP KNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINY RTEIDKPCQHHHHHH

121*

E4-(PA)n-I1: Tándem de E/I que tiene E4 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola E) fusionado a través del adaptador (PA)n a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser o Cys modificada), donde n = 3, 6 o 9, y X = Ser o Cys; puede comprender opcionalmente un marcador de 6X His VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHERDGSRQYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTI TVYAVTDYFNPTTHEYIYQTTPISINYRTE(PA)nVSD VPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGET GGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAV TRFRDYQPISINYRTEIDKPCQHHHHHH

122*

I1-GS10-E4: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E4 (que tiene extensión N-terminal (N+8) y sin cola) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSG SGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHERDGS RQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLK PGVDYTITVYAVTDYFNPTTHEYIYQTTPISINYRT

123*

I1-GS10-E4: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E4 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser o Cys modificada), donde X = Ser o Cys; puede comprender opcionalmente un marcador de 6X His VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSG SGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHERDGS RQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLK PGVDYTITVYAVTDYFNPTTHEYIYQTTPISINYRTEI DKPXQ

124*

I1-GS10-E4: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E4 (con extensión N-terminal (N+8) y a cola de Cys) con marcador de his MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHERD GSRQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISG LKPGVDYTITVYAVTDYFNPTTHEYIYQTTPISINYR TEIDKPCQHHHHHH

125*

I1-(PA)n-E4: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola E) fusionado a través del adaptador (PA)n a E4 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser o Cys modificada), donde n = 3, 6 o 9, y X = Ser o Cys; puede comprender opcionalmente un marcador de 6X His VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEVVAA TPTSLLISWHERDGSRQYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYFNPTTH EYIYQTTPISINYRTEIDKPXQ

126

E5-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E5 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 I1 (con extensión Nterminal (N+8) y sin cola) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAPVDRYQYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYRTEIDKGSG SGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTS LLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYR T

127

E5-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E5 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser o Cys modificada), donde X = Ser o Cys; puede comprender opcionalmente un marcador de 6X His VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAPVDRYQYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYRTEIDKGSG SGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTS LLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYR TEIDKPXQ

128

E5-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E5 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y a cola de Cys), con un marcador de His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAPVDRYQYY RITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYRTEIDKG SGSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTV PKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISIN YRTEIDKPCQHHHHHH

129

E5-(PA)n-I1: Tándem de E/I que tiene E5 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola E) fusionado a través del adaptador (PA)n a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser o Cys modificada), donde n = 3, 6 o 9, y X = Ser o Cys; puede comprender opcionalmente un marcador de 6X His VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAPVDRYQYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYRTE(PA)nVS DVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGE TGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYA VTRFRDYQPISINYRTEIDKPXQ

130

I1-GS10-E5: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E5 (con extensión N-terminal (N+8) y sin cola) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSG SGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAPVD RYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATISGL KPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYR T

131

I1-GS10-E5: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E5 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser o Cys modificada), donde X = Ser o Cys; puede comprender opcionalmente un marcador de 6X His VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITV YAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSG SGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAPVD RYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATISGL KPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYR TEIDKPXQ

132

I1-GS10-E5: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+10) y cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E5 (con extensión N-terminal (N+8) y a cola de Cys) con un marcador de His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAP VDRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATIS GLKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISIN YRTEIDKPCQHHHHHH

133

I1-(PA)n-E5: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola E) fusionado a través del adaptador (PA)n a E5 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Ser o Cys modificada), donde n = 3, 6 o 9, y X = Ser o Cys; puede comprender opcionalmente un marcador de 6X His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEVV AATPTSLLISWWAPVDRYQYYRITYGETGGNSPVQ EFTVPRDVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYKPHA DGPHTYHESPISINYRTEIDKPXQ

134*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E4, donde X es cualquier aminoácido y g y h se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XgHERDGSRQXh

135*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E4, donde X es cualquier aminoácido y i y j se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XiGGVRXj

136*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E4, donde X es cualquier aminoácido y k y l se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XkDYFNPTTHEYIYQTTXl

137

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E5, donde X es cualquier aminoácido y g y h se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XgWAPVDRYQXh

138

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E5, donde X es cualquier aminoácido y i y j se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XiRDVYXj

139

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E5, donde X es cualquier aminoácido y k y l se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XkDYKPHADGPHTYHESXl

140*

Monómero de EGFR E85 con extensión N-terminal (N+10) y cola de Ser con marcador de His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTQGSTHYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGMVYTATISGLKPGVDY TITVYAVTDYFDRSTHEYKYRTTPISINYRTEIDKPS QHHHHHH

141*

Núcleo de monómero de EGFR E85: monómero de E85 sin extensión Nterminal o cola C-terminal EVVAATPTSLLISWTQGSTHYQYYRITYGETGGNS PVQEFTVPGMVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYF DRSTHEYKYRTTPISINYRT

142*

monómero de EGFR E85, donde X1 se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77 y X2 se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10; puede comprender opcionalmente un marcador de his X1EVVAATPTSLLISWTQGSTHYQYYRITYGETGGN SPVQEFTVPGMVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTDY FDRSTHEYKYRTTPISINYRTX2

143*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E85 SWTQGSTHYQ

144*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E85 PGMVYT

145*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E85 TDYFDRSTHEYKYRTTP

146*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E85, donde X es cualquier aminoácido y g y h se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XgTQGSTHYQXh

147*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E85, donde X es cualquier aminoácido y i y j se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XiGMVYXj

148*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E85, donde X es cualquier aminoácido y k y l se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XkDYFDRSTHEYKYRTTXl

149*

E85-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E85 (con extensión N-terminal (N+10) y una cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) con un marcador de 6X His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTQGSTHYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGMVYTATISGLKPGVDY TITVYAVTDYFDRSTHEYKYRTTPISINYRTEIDKGS GSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATP TSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVP KNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINY RTEIDKPCQHHHHHH

150*

Núcleo de E85-GS10-I1, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWTQGSTHYQYYRITYGETGGN SPVQEFTVPGMVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTDY FDRSTHEYKYRTTPISINYRTEIDKGSGSGSGSGS GSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSAR LKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISG LKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTX2

151*

núcleo de E85-(PA)n-I1, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWTQGSTHYQYYRITYGETGGN SPVQEFTVPGMVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTDY FDRSTHEYKYRTTPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEV VAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPV QEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDY QPISINYRTX2

152*

I1-GS10-E85: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+10) y una cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E85 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) con un marcador de 6X His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTQGS THYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGMVYTATISG LKPGVDYTITVYAVTDYFDRSTHEYKYRTTPISINYR TEIDKPCQHHHHHH

153*

Núcleo de I1-GS10-E85, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGN SPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRF RDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSGSGSGS GSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTQGSTHYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGMVYTATISGLKPGVDY TITVYAVTDYFDRSTHEYKYRTTPISINYRTX2

154*

Núcleo de I1-(PA)n-E85, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGN SPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRF RDYQPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEVVAATPTSLLI SWTQGSTHYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGMV YTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYFDRSTHEYKYRT TPISINYRTX2

155*

Monómero de EGFR E90 con extensión N-terminal (N+10) y cola de Ser con marcador de His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWYWEGLPYQYY RITYGETGGNSPVQEFTVPRDVNTATISGLKPGVD YTITVYAVTDWYNPDTHEYIYHTIPISINYRTEIDKPS QHHHHHH

156*

Núcleo de monómero de EGFR E90: monómero de E90 sin extensión Nterminal o cola C-terminal EVVAATPTSLLISWYWEGLPYQYYRITYGETGGNS PVQEFTVPRDVNTATISGLKPGVDYTITVYAVTDW YNPDTHEYIYHTIPISINYRT

157*

Monómero de EGFR E90, donde X1 se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77 y X2 se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10; puede comprender opcionalmente un marcador de his X1EVVAATPTSLLISWYWEGLPYQYYRITYGETGG NSPVQEFTVPRDVNTATISGLKPGVDYTITVYAVTD WYNPDTHEYIYHTIPISINYRTX2

158*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E90 SWYWEGLPYQ

159*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E90 PRDVNT

160*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E90 TDWYNPDTHEYIYHTIP

161*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E90, donde X es cualquier aminoácido y g y h se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XgYWEGLPYQXh

162*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E90, donde X es cualquier aminoácido y i y j se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XiRDVNXj

163*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E90, donde X es cualquier aminoácido y k y l se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XkDWYNPDTHEYIYHTIXl

164*

E90-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E90 (con extensión N-terminal (N+10) y una cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) con un marcador de 6X His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWYWEGLPYQYY RITYGETGGNSPVQEFTVPRDVNTATISGLKPGVD YTITVYAVTDWYNPDTHEYIYHTIPISINYRTEIDKGS GSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATP TSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVP KNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINY RTEIDKPCQHHHHHH

165*

Núcleo de E90-GS10-I1, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWYWEGLPYQYYRITYGETGG NSPVQEFTVPRDVNTATISGLKPGVDYTITVYAVTD WYNPDTHEYIYHTIPISINYRTEIDKGSGSGSGSGS GSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSAR LKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISG LKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTX2

166*

Núcleo de E90-(PA)n-I1, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWYWEGLPYQYYRITYGETGG NSPVQEFTVPRDVNTATISGLKPGVDYTITVYAVTD WYNPDTHEYIYHTIPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEV VAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPV QEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDY QPISINYRTX2

167*

I1-GS10-E90: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+10) y una cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E90 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) con un marcador de 6X His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWYWE GLPYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVNTATIS GLKPGVDYTITVYAVTDWYNPDTHEYIYHTIPISINY RTEIDKPCQHHHHHH

168*

Núcleo de I1-GS10-E90, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGN SPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRF RDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSGSGSGS GSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWYWEGLPYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPRDVNTATISGLKPGVDY TITVYAVTDWYNPDTHEYIYHTIPISINYRTX2

169*

Núcleo de I1-(PA)n-E90, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGN SPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRF RDYQPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEVVAATPTSLLI SWYWEGLPYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDV NTATISGLKPGVDYTITVYAVTDWYNPDTHEYIYHTI PISINYRTX2

170*

Monómero de EGFR E96 con extensión N-terminal (N+10) y cola de Ser con marcador de His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWASNRGTYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGGVSTATISGLKPGVDY TITVYAVTDAFNPTTHEYNYFTTPISINYRTEIDKPS QHHHHHH

171*

Núcleo de monómero de EGFR E96: monómero de E96 sin extensión Nterminal o cola C-terminal EVVAATPTSLLISWASNRGTYQYYRITYGETGGNS PVQEFTVPGGVSTATISGLKPGVDYTITVYAVTDAF NPTTHEYNYFTTPISINYRT

172*

Monómero de EGFR E96, donde X1 se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77 y X2 se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10; puede comprender opcionalmente un marcador de his X1EVVAATPTSLLISWASNRGTYQYYRITYGETGGN SPVQEFTVPGGVSTATISGLKPGVDYTITVYAVTDA FNPTTHEYNYFTTPISINYRTX2

173*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E96 SWASNRGTYQ

174*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E96 PGGVST

175*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E96 TDAFNPTTHEYNYFTTP

176*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E96, donde X es cualquier aminoácido y g y h se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XgASNRGTYQXh

177*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E96, donde X es cualquier aminoácido y i y j se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XiGGVSXj

178*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E96, donde X es cualquier aminoácido y k y l se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XkDAFNPTTHEYNYFTTXl

179*

E96-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E96 (con extensión N-terminal (N+10) y una cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) con un marcador de 6X His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWASNRGTYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGGVSTATISGLKPGVDY TITVYAVTDAFNPTTHEYNYFTTPISINYRTEIDKGS GSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATP TSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVP KNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINY RTEIDKPCQHHHHHH

180*

Núcleo de E96-GS10-I1, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWASNRGTYQYYRITYGETGGN SPVQEFTVPGGVSTATISGLKPGVDYTITVYAVTDA FNPTTHEYNYFTTPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARL KVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGL KPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTX2

181*

Núcleo de E96-(PA)n-I1, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWASNRGTYQYYRITYGETGGN SPVQEFTVPGGVSTATISGLKPGVDYTITVYAVTDA FNPTTHEYNYFTTPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEV VAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPV QEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDY QPISINYRTX2

182*

I1-GS10-E96: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+10) y una cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E96 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) con un marcador de 6X His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWASNR GTYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGVSTATISG LKPGVDYTITVYAVTDAFNPTTHEYNYFTTPISINYR TEIDKPCQHHHHHH

183*

Núcleo de I1-GS10-E96, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGN SPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRF RDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSGSGSGS GSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWASNRGTYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGGVSTATISGLKPGVDY TITVYAVTDAFNPTTHEYNYFTTPISINYRTX2

184*

Núcleo de I1-(PA)n-E96, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGN SPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRF RDYQPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEVVAATPTSLLI SWASNRGTYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGV STATISGLKPGVDYTITVYAVTDAFNPTTHEYNYFT TPISINYRTX2

185*

Monómero de EGFR E105 con extensión N-terminal (N+10) y cola de Ser con marcador de His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPTSRYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGGLSTATISGLKPGVDY TITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYRTEIDKPS QHHHHHH

186*

Núcleo de monómero de EGFR E105: monómero de E105 sin extensión N-terminal o cola Cterminal EVVAATPTSLLISWDAPTSRYQYYRITYGETGGNS PVQEFTVPGGLSTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYK PHADGPHTYHESPISINYRT

187*

Monómero de EGFR E105, donde X1 se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77 y X2 se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10; puede comprender opcionalmente un marcador de his X1EVVAATPTSLLISWDAPTSRYQYYRITYGETGGN SPVQEFTVPGGLSTATISGLKPGVDYTITVYAVTDY KPHADGPHTYHESPISINYRTX2

188*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E105 SWDAPTSRYQ

189*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E105 PGGLST

117*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E105 TDYKPHADGPHTYHESP

190*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E105, donde X es cualquier aminoácido y g y h se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XgDAPTSRYQXh

191*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E105, donde X es cualquier aminoácido y i y j se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XiGGLSXj

139*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E105, donde X es cualquier aminoácido y k y l se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XkDYKPHADGPHTYHESXl

192*

E105-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E105 (con extensión N-terminal (N+10) y una cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) con un marcador de 6X His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPTSRYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGGLSTATISGLKPGVDY TITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYRTEIDKGS GSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATP TSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVP KNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINY RTEIDKPCQHHHHHH

193*

Núcleo de E105-GS10-I1, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWDAPTSRYQYYRITYGETGGN SPVQEFTVPGGLSTATISGLKPGVDYTITVYAVTDY KPHADGPHTYHESPISINYRTEIDKGSGSGSGSGS GSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSAR LKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISG LKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTX2

194*

Núcleo de E105-(PA)n-I1, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWDAPTSRYQYYRITYGETGGN SPVQEFTVPGGLSTATISGLKPGVDYTITVYAVTDY KPHADGPHTYHESPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEV VAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPV QEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDY QPISINYRTX2

195*

I1-GS10-E105: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+10) y una cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E105 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) con un marcador de 6X His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPT SRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGLSTATISG LKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINY RTEIDKPCQHHHHHH

196*

Núcleo de I1-GS10-E105, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGN SPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRF RDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSGSGSGS GSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPTSRYQYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPGGLSTATISGLKPGVDYT ITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYRTX2

197*

Núcleo de I1-(PA)n-E105, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGN SPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRF RDYQPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEVVAATPTSLLI SWDAPTSRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGL STATISGLKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHE SPISINYRTX2

198*

Monómero de EGFR E112 con extensión N-terminal (N+10) y cola de Ser con marcador de His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAGAVTYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDY TITVYAVTDYKPHADGPHTYHEYPISINYRTEIDKPS QHHHHHH

199*

Núcleo de monómero de EGFR E112: monómero de E112 sin extensión N-terminal o cola Cterminal EVVAATPTSLLISWDAGAVTYQYYRITYGETGGNS PVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYK PHADGPHTYHEYPISINYRT

200*

Monómero de EGFR E112, donde X1 se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77 y X2 se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10; puede comprender opcionalmente un marcador de his X1EVVAATPTSLLISWDAGAVTYQYYRITYGETGGN SPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDY KPHADGPHTYHEYPISINYRTX2

201*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E112 SWDAGAVTYQ

110*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E112 PGGVRT

202*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E112 TDYKPHADGPHTYHEYP

203*

Secuencia de bucle BC de agente de unión a EGFR E112, donde X es cualquier aminoácido y g y h se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XgDAGAVTYQXh

135*

Secuencia de bucle DE de agente de unión a EGFR E112, donde X es cualquier aminoácido y i y j se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XiGGVRXj

204*

Secuencia de bucle FG de agente de unión a EGFR E112, donde X es cualquier aminoácido y k y l se seleccionan independientemente de 0 a 5 aminoácidos XkDYKPHADGPHTYHEYXl

205*

E112-GS10-I1: Tándem de E/I que tiene E112 (con extensión N-terminal (N+10) y una cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a I1 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) con un marcador de 6X His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAGAVTYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDY TITVYAVTDYKPHADGPHTYHEYPISINYRTEIDKGS GSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATP TSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVP KNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINY RTEIDKPCQHHHHHH

206*

Núcleo de E112-GS10-I1, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWDAGAVTYQYYRITYGETGGN SPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDY KPHADGPHTYHEYPISINYRTEIDKGSGSGSGSGS GSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSAR LKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISG LKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTX2

207*

Núcleo de E112-(PA)n-I1, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWDAGAVTYQYYRITYGETGGN SPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDY KPHADGPHTYHEYPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEV VAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPV QEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDY QPISINYRTX2

208*

I1-GS10-E112: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+10) y una cola corta) fusionado a través del adaptador GS10 a E112 (con extensión N-terminal (N+8) y cola de Cys) con un marcador de 6X His MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAGA VTYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISG LKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHEYPISINY RTEIDKPCQHHHHHH

209*

Núcleo de I1-GS10-E112, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGN SPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRF RDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSGSGSGS GSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAGAVTYQYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDY TITVYAVTDYKPHADGPHTYHEYPISINYRTX2

210*

Núcleo de I1-(PA)n-E112, donde X1 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 69-77, X2 es opcional y cuando está presente se selecciona entre el grupo consistente en SEC ID Nº: 9, 10, o 78-81, y n = 3, 6 o 9; en ejemplos de realizaciones, X1 es SEC ID Nº: 69 o 71 y X2 es SEC ID Nº: 9 o 10 X1EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGN SPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRF RDYQPISINYRTE(PA)nVSDVPRDLEVVAATPTSLLI SWDAGAVTYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGV RTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHE YPISINYRTX2

211

I1-GSGCGS8-E5: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión N-terminal (N+10) y una cola corta modificada) fusionado a través del adaptador GSGCGS8 a E5 (con extensión Nterminal (N+8) y una cola E) con un marcador de 6X His opcional MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIEKGSGCGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAP VDRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATIS GLKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISIN YRTEHHHHHH

212

I1-GS10-E5-GSGC: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión Nterminal (N+10) y una cola corta modificada) fusionado a través del adaptador GS10 a E5 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola de Cys modificada) con un marcador de 6X His opcional MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIEKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAP VDRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATIS GLKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISIN YRTEGSGCHHHHHH

213

I1(S62C)-GS10-E5: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión Nterminal (N+10), una sustitución S62C (recuadrada), y una cola corta modificada) fusionado a través del adaptador GS10 a E5 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola E) con un marcador de 6X His opcional; la posición 62 se refiere al aminoácido que corresponde a la posición 62 de la SEC ID Nº:1 MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATICGLKPGVDYT ITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIEKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAP VDRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATIS GLKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISIN YRTEHHHHHH

214

I1-GS10-E5(S62C): Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión Nterminal (N+10) y una cola corta modificada) fusionado a través del adaptador GS10 a E5 (con extensión N-terminal (N+8), una sustitución S62C (recuadrada), y una cola E) con un marcador de 6X His opcional; la posición 62 se refiere al aminoácido que corresponde a la posición 62 de la SEC ID Nº:1 MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIEKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAP VDRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATIC GLKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISIN YRTEHHHHHH

215

I1(S91C)-GS10-E5: Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión Nterminal (N+10), una sustitución S91C (recuadrada), y una cola corta modificada) fusionado a través del adaptador GS10 a E5 (con extensión N-terminal (N+8) y una cola E) con un marcador de 6X His opcional; la posición 91 se refiere al aminoácido correspondiente a la posición 91 de la SEC ID Nº:1 MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPICINYRTEIEKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAP VDRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATIS GLKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISIN YRTEHHHHHH

216

I1-GS10-E5(S91C): Tándem de I/E que tiene I1 (con extensión Nterminal (N+10) y una cola corta modificada) fusionado a través del adaptador GS10 a E5 (con extensión N-terminal (N+8), una sustitución S91C (recuadrada), y una cola E) con un marcador de 6X His opcional; la posición 91 se refiere al aminoácido correspondiente a la posición 91 de la SEC ID Nº:1 MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTI TVYAVTRFRDYQPISINYRTEIEKGSGSGSGSGSG SGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAP VDRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATIS GLKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPICIN YRTEHHHHHH

217

Cola corta modificada EIEK

218

Adaptador GSGCGS8 GSGCGSGSGSGSGSGSGSGS

*Secuencias proporcionadas con fines de referencia

Ejemplo 1: Ensayo de In Cell Western para Explorar para Actividad de EGFR

Se desarrollaron ensayos In Cell Western para explorar diversos clones de 10Fn3 únicos para la capacidad de inhibir

5 la actividad de EGFR para identificar los que se podrían unir con agentes de unión a IGF1R de 10Fn3 para construir agentes de unión a E/I. Los ensayos In Cell Western también se usaron para explorar y determinar la potencia relativa de agentes de unión a E/I de 10Fn3 específicos. Se desarrollaron dos ensayos de In Cell Western para medir 1) inhibición de fosforilación de EGFR estimulada por EGF o 2) inhibición de fosforilación de ERK estimulada por EGF. Las células se sembraron en placas de microtitulación de 96 pocillos revestidas con poli-D-lisina (Becton

10 Dickinson, Franklin Lakes, NJ) a 24.000 células/pocillo para células de carcinoma epidermoide A431 o de carcinoma de cabeza y cuello FaDu y se dejó que se adhirieran durante una noche. Las células se lavaron una vez y después se incubaron durante 24 horas en medio sin suero. A continuación se aplicaron diluciones seriadas de clones de los agentes de unión basados en 10Fn3 a las células y se incubaron durante 2-3 horas antes de la estimulación con 100 ng/ml de EGF durante 10 minutos. Después de la estimulación, las células se fijaron durante 20 minutos en PBS que

15 contenía formaldehído al 3,7 % y después se permeabilizaron en PBS que contenía triton-X-100 al 0,1 % durante 15 minutos. Las células se bloquearon durante una hora en bloqueante Odyssey (Li-Cor Biosciences, Lincoln, Nebraska) y se incubaron con anticuerpos para detectar EGFR fosforilado en tirosina 1068 (Cell Signaling, Beverly, MA) y β-actina (Sigma, St. Louis, MO) o pERK (MAP cinasa fosforilada en tirosina 202/treonina 204) y ERK total (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Después de lavar tres veces en PBS que contenía tween-20 al 0,1 %,

20 se añadieron anticuerpos secundarios (Invitrogen, Carlsbad, CA o Rockland, Gilbertsville, PA). Las células se lavaron tres veces en PBS que contenía tween-20 al 0,1 % y se visualizaron en un Sistema de Formación de Imágenes por Infrarrojos Li-Cor Odyssey (Li-Cor Biosciences, Lincoln, Nebraska). Cada clon se ensayó por duplicado o triplicado y los valores se normalizaron para β-actina para el ensayo de pEGFR y ERK total para el ensayo de pERK. Se calcularon valores de CI50 a partir del análisis de regresión lineal del porcentaje de inhibición

25 de la señal máxima menos el fondo.

Los resultados produjeron diversos clones de 10Fn3 que tenían la capacidad de inhibir la actividad de EGFR y mostraron que ciertos agentes de unión a E/I de 10Fn3 específicos poseían actividad similar al ejemplo mostrado en la Figura 9.

30

Ejemplo 2: Expresión de agentes de unión basados en 10Fn3

Se produjeron agentes de unión a E/I uniendo covalentemente un 10Fn3 de unión a EGFR a un 10Fn3 de unión a IGFIR usando un adaptador glicina-serina, generando de este modo dímeros de 10Fn3, en los que cada dominio de 35 10Fn3 se une a una diana diferente. El 10Fn3 de unión a IGFIR (I1) se describió propiamente como la SEC ID Nº: 226 en la Publicación PCT Nº WO 2008/066752. Se identificaron dos 10Fn3 de unión a EGFR novedosos (E2 y E1) explorando una biblioteca de fusión de ARN-proteína, como se describe en la Publicación PCT Nº WO 2008/066752, para agentes de unión a EGFR-Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los siguientes ejemplos describen resultados usando diversos agentes de unión a E/I basados en 10Fn3 marcados con His diferentes (no pegilados): E2-GS10-I1

40 (SEC ID Nº: 25), E1-GS10-I1 (SEC ID Nº: 31), I1-GS10-E1 (SEC ID Nº: 28) e I1-GS10-E2 (SEC ID Nº: 22).

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imagen26

recombinante (aa 1-645 del dominio extracelular de EGFR humano fusionado con Fc humano) se adquirió en R&D systems (Minneapolis, MN). Se capturó IGF1R-Fc en Proteína A inmovilizada mientras que EGFR-Fc se capturó con anticuerpo anti-ser humano inmovilizado.

5 En un experimento típico se inmovilizó IgG anti-ser humano en celdas de flujo 1 y 2 de un chip CM5 siguiendo las recomendaciones del fabricante (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Se inyectó EGFR-Fc (50 nM) a 5 µl durante 2 minutos en la celda de flujo 2 (Fc2). Se usaron dos inyecciones de 30 segundos de MgCl2 3 M para la regeneración del EGFR-Fc unido de la superficie de IgG anti-ser humano. La Proteína A se diluyó hasta 80 µg/ml en acetato pH 4,5 y se inmovilizó a ∼3000 UR en las celdas de flujo 3 y 4 de la superficie del chip CM5. Aproximadamente 1300 UR

10 de IGF1R-Fc se capturaron en la Fc 4. Se usaron dos inyecciones de 30 segundos de glicina 50 mM pH 1,5 para regenerar la superficie entre muestras.

Una serie de concentración de 100 nM a 1 nM de proteína purificada por HTPP (tres puntos de datos recogidos) o de 300 nM a 0,05 nM de proteína purificada a media escala (once puntos de datos recogidos) se evaluó para la unión a

15 EGFR-Fc o IGF1R-Fc. Los sensogramas se obtuvieron a cada concentración y se evaluaron usando el Software de Evaluación Biacore T100, Versión 1.1.1 (GE healthcare/Biacore) para determinar las constantes de velocidad ka (kon) y kd (koff). Para la evaluación de HTPP, la velocidad de disociación se ajustó a partir de las curvas de 3 puntos. La KD de afinidad se calculó a partir de la proporción de las constantes de velocidad koff/kon.

20 Los agentes de unión a EGFR basados en 10Fn3 se evaluaron para especificidad en un formato similar usando IgG anti-ser humano para capturar HER2-Fc. Los agentes de unión basados en 10Fn3 no mostraron ninguna unión apreciable a HER2-Fc capturado en condiciones en las que se observó una unión robusta para EGFR-Fc.

Como se muestra en la Tabla 2, ambos dominios de los agentes de unión a E/I basados en 10Fn3 son funcionales,

25 conservando sus propiedades de unión a las respectivas dianas. Las velocidades de disociación mostradas en la Tabla 2 son para material de media escala y son similares a los resultados cualitativos obtenidos con el material de HTPP.

Tabla 2: Resumen de las constantes de unión para agentes de unión basados en 10Fn3

Diana

Proteína ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)

EGFR-Fc

E1 1,9E+05 1,43E+05 1,18E-03 1,89E-03 9,92 13,2

E1-GS10-I1

6,29E+04 3,82E+04 4,74E-04 3,89E-04 7,53 10,17

I1-GS10-E1

1,26E+05 4,13E+04 6,03E-04 4,25E-04 4,8 10,28

E2

3,73E+05 3,27E+05 2,72E-04 3,2E-04 0,73 0,98

E2-GS10-I1

3,93E+05 3,75E+05 1,75E-04 1,67E-04 0,45 0,45

I1-GS10-E2

6,47E+05 3,90E+05 1,42E-04 1,14E-04 0,22 0,29

E3

2,83E+05 3,98E-04 3,4 1,4

E3-GS10-I1

3,49E+05 2,29E-04 0,66

I1-GS10-E3

1,17E+05 2,91E-04 2,48

IGF1R-Fc

I1 3,84E+06 4,34E-04 0,11

E1-GS10-I1

5,13E+05 3,38E-04 0,66

I1-GS10-E1

1,47E+06 3,98E-04 0,27

E2-GS10-I1

1,24E+06 3,95E-04 0,32

I1-GS10-E2

3,82E+06 4,79E-04 0,13

E3-GS10-I1

1,8E+06 2,09E-04 0,12

I1-GS10-E3

1,37E+06 4,54E 05 0,03

30

Ejemplo 6: Inhibición de actividad de IGFR en células H292

Se determinó la capacidad de agentes de unión a E/I basados en 10Fn3 de inhibir la fosforilación de IGF1R en la tirosina 1131 usando un ensayo in vitro de células H292. En resumen, 65 X 103 células H292 se sembraron en 35 microplacas de 96 pocillos (placa de 96 pocillos revestida con Poli-D-Lisina Biocoat, Nº de cat 356640, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) en medio de cultivo RPMI-1640 que contenía Hepes 10 mM pH 7,4 y suero fetal bovino al 10 %. Se dejó que las células se adhirieran durante 24 horas a 37 ºC, CO2 al 5 %. Al siguiente día, las

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recomienda por el fabricante (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD).

Los agentes de unión a E/I pegilados E2-GS10-I1 y E3-GS10-I1 se ensayaron en un NSCLC H292 en ratones atímicos. Los tumores se implantaron por vía subcutánea con fragmentos de tumor H292 de 1 mm3 en el flanco 5 posterior y se dejaron establecer hasta un tamaño de 50-150 mg antes del inicio del tratamiento el Día 6 postimplante de tumor. Los agentes de unión a E/I pegilados se administraron i.p. a una dosis de 100 mg/kg con un programa TIWX3 para evaluar la actividad antitumoral. Se obtuvo panitumumab como fármaco comercializado y se administró i.p. a su dosis óptima de 1 mg/ratón y a una dosis menor de 0,1 mg/ratón con un programa Q3DX5. Los tamaños medios de tumor calculados en grupos de 8 ratones se muestran en la Figura 12A. Las dosis de 1 mg/ratón 10 y 0,1 mg/ratón de panitumumab eran ambas activas en %TGI con valores del 101 % y 100 %, respectivamente y estos valores eran significativamente diferentes de los animales de control (p = 0,0002, Tabla 5). El E2-GS10-I1 pegilado también era significativamente activo en %TGI con un valor del 96 % (p = 0,0005). El E3-GS10-I1 pegilado no era activo en este estudio con un valor de %TGI del 31 % que no era estadísticamente diferente del grupo del grupo control (p = 0,416). Los análisis post-dosificación indicaron que aproximadamente dos tercios del E3-GS10-I1

15 pegilado se agregó (66,64 % de agregación/33,36 % de monómero para un lote y 72,53 % de agregación/27,47 % de monómero para otro lote) que podría explicar la mala actividad del E3-GS10-I1 pegilado en este ensayo. Por el contrario, el E2-GS10-I1 pegilado mostró solamente un pequeño porcentaje de agregación en estudios postdosificación (1,79 % de agregación/98,21 % de monómero).

20 Todos los tratamientos se toleraron bien sin ninguna muerte relacionada con tratamiento o pérdida de peso excesiva a lo largo del curso del estudio. Las observaciones clínicas no pusieron de manifiesto ninguna evidencia de toxicidad y el cambio promedio de peso a lo largo del curso de la terapia estaba dentro de límites aceptables (Figura 12B).

Tabla 5. Resultados del estudio de xenoinjerto de tumor humano H292

Grupo

Compuesto Programa, Vía Dosis (mg/kg) Cambio PRO de peso (g) %TGI valor p para %TGI Resultado en %TGI

1

Control (no tratado) -- -- 5,3 -- 1,0 --

2

panitumumab q3dx5;6 ipa 1 mg/ratón 9,6 101 0,0002 A

3

panitumumab q3dx5;6 ipa 0,1 mg/ratón 6,3 100 0,0002 A

4

E2-GS10-I1 (con PEG) TIWx3;6 ipa 100 -0,1 94 0,0005 A

5

E3-GS10-I1 (con PEG) TIWx3;6 ipa 100 9,5 28 0,416 I

a El vehículo era solución salina tamponada con fosfato. Las abreviaturas usadas son las siguientes: ip, vía intraperitoneal; %TGI, inhibición relativa de % de crecimiento de tumor calculada como %TGI=[(Ct-Tt)/(Ct-C0)] x 100 donde Ct = peso mediano de tumor de ratones de control en el momento t en días después del implante de tumor, Tt = peso mediano de tumor de ratones tratados en el momento t, C0 = peso mediano de tumor de ratones de control en el momento 0. El valor %TGI se calculó en dos momentos como la inhibición promedio del Día 12 y Día 20. Resultado, un régimen de tratamiento se consideró activo si produjo un valor estadísticamente significativo de %TGI de >50 %; q3dx5;6, el compuesto se administró cada tres días durante cinco dosis comenzando el sexto día después del implante de tumor; TIWx3;6, el compuesto se administró tres veces por semana durante tres semanas comenzando el sexto día después del implante de tumor. Los valores p se calcularon el Día 20 con respecto al grupo de control en un análisis emparejado de dos colas con 8 mediciones por grupo. Resultado en %TGI, A= activo e I= inactivo.

25 Criterios de valoración farmacodinámicos del estudio del tumor H292. Las muestras de tumores de grupos de control no tratados, tratados con panitumumab y con agente de unión a E/I se analizaron para niveles de EGFR, ErbB2 e IGFR fosforilado que indicarían supresión de diana. Los tumores también se analizaron para niveles de EGFR total para determinar si tuvo lugar la degradación del receptor de EGF. El día 20, se administró un tratamiento

30 final y los tumores se eliminaron de 2 animales 1 hora después de la dosificación, 3 animales 4 horas después de la dosificación y 3 animales 24 horas después de la dosificación. Todos los tratamientos mostraron supresión marcada de EGFR y ErbB2 fosforilado mientras que los niveles basales de IGFR fosforilado eran demasiado bajos para distinguir una diferencia en este estudio (Figura 13). Todos los tratamientos mostraron una reducción en la cantidad de EGFR total indicando que había tenido lugar la degradación del receptor.

35

Ejemplo 13: Selección y Caracterización de Células MCF7 Resistentes a Inhibidor de IGF1R

Se cultivaron células MCF7 (Colección Americana de Cultivos Tipo, Nº de Catálogo HTB-22, Manassas, VA) en medio RPMI que contenía hepes 10 mM y FBS al 10 % a 37 ºC en presencia de CO2 al 5 %. El inhibidor de IGF1R

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a El vehículo era solución salina tamponada con fosfato. Las abreviaturas usadas son las siguientes: ip, vía intraperitoneal; %TGI, inhibición relativa de % de crecimiento de tumor calculada como %TGI=[(Ct-Tt)/(Ct-C0)] x 100 donde Ct = peso mediano de tumor de ratones de control en el momento t en días después del implante de tumor, Tt = peso mediano de tumor de ratones tratados en el momento t, C0 = peso mediano de tumor de ratones de control en el momento 0. El valor %TGI se calculó en tres momentos como la inhibición promedio del Día 20, 24 y Día 27. Resultado, un régimen de tratamiento se consideró activo si produjo un valor estadísticamente significativo de %TGI de >50 %; q3dx5;13, el compuesto se administró cada tres días durante seis dosis comenzando el decimotercer día después del implante de tumor. Los valores p se calcularon el Día 24 con respecto al grupo de control en un análisis emparejado de dos colas con 8 mediciones por grupo. Resultado en %TGI, A= activo e I= inactivo.

Tabla 7. Resultados del estudio de xenoinjerto de tumor de carcinoma de mama humano MCF7r.

Grupo

Compuesto Programa, Vía Dosis (mg/ratón) %TGI valor p para %TGI Resultado en %TGI

1

Control (no tratado) -- -- -- 1,0 --

2

cetuximab q3dx5;6 ipa 1 mg/ratón 105 0,001 A

3

cetuximab q3dx5;6 ipa 0,1 mg/ratón 75 0,024 A

Véase las notas a pie de página de la Tabla 6. Los valores p se calcularon el Día 19 con respecto al grupo de control en un análisis emparejado de dos colas con 8 mediciones por grupo.

Ejemplo 15: Estudios Antitumorales en Xenoinjertos de GEO

5 Se establecieron tumores GEO implantando fragmentos de tumor de 1 mm3 por vía subcutánea en el flanco posterior de ratones atímicos y permitiendo que los mismos alcanzaran un tamaño de 50-150 mg antes del inicio del tratamiento el Día 18 post-implante de tumor. Se administró cetuximab ip a 0,25 mg/ratón en un programa Q3DX5 (dosis administradas el Día 18, 21, 24, 27, 30). El inhibidor de IGFR cinasa BMS-754807 se administró a 25 mg/kg

10 en un programa QDX21. Los tamaños medios de tumor calculados de grupos de 8 ratones se muestran en la Figura

16. Cetuximab fue activo a 0,25 mg/ratón con un valor de %TGI del 67 %. BMS-754807 fue activo con un %TGI del 80 % y la combinación de ambos era considerablemente más activa que cada agente en solitario con un %TGI del 94 % (Tabla 8). Todos los grupos de tratamiento eran estadísticamente diferentes del grupo de control el Día 26 (Tabla 8).

15 Tabla 8. Resultados del estudio de xenoinjerto de tumor de carcinoma de colon humano GEO.

Cetuximab

BMS-754807

Grupo

Programa, Vía Dosis (mg/ratón) Programa, Vía Dosis (mg/kg) %TGI Valor p Resultado en %TGI Sinergia

1

Control (no tratado) -- -- -- -- -- -- --

2

q3dx5;6 ipa 0,25 mg/ratón -- 80 A --

3

-- -- qdx21;18b 25 67 A --

4

q3dx5;6 ipa 0,25 mg/ratón qdx21;18b 25 94 A SÍ

a El vehículo para cetuximab era solución salina tamponada con fosfato. El vehículo para BMS-754807 era polietilenglicol 400 al 50 %, agua al 50 %. Las abreviaturas usadas son como se describen en la Tabla 6 y la sinergia se define como una actividad estadísticamente significativa que es mejor que cada agente en la combinación demostrada por sí mismo. Resultado en %TGI, A = activo e I = inactivo

Ejemplo 16: Estudios Antitumorales en Xenoinjertos de H292

20 Se implantaron por vía subcutánea células H292 en el flanco posterior de ratones atímicos como fragmentos de 1 mm3 y se dejó que se establecieran hasta un tamaño de 50-150 mg antes del inicio de tratamiento el Día 12 postimplante del tumor. Se administró cetuximab i.p. a 0,1 mg/ratón en un programa Q3DX5. MAB391 es un anticuerpo para IGF1R (R&D Systems, Minneapolis, MN, Nº de Cat. MAB391) y se administró a una dosis de 40 mg/kg en un programa BIWX3. Los tamaños medios de tumor calculados de grupos 8 ratones se muestran en la Figura 17.

25 Cetuximab fue activo a 0,1 mg/ratón con un valor de %TGI del 95,1 % y MAB391 fue inactivo a 40 mg/kg con un valor de %TGI del 10,5 % (Tabla 9). Los ratones dosificados con la combinación de cetuximab y MAB391 mostraron un valor de %TGI del 109,2 % indicando regresión de tumor en el grupo de combinación (Tabla 9). Después de que se hubiera suspendido la dosificación, los tumores volvieron a crecer en el grupo tratado con cetuximab más rápidamente que en el grupo tratado con la combinación de cetuximab y MAB391 (Figura 17).

30

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en el ensayo In Cell Western y eran apropiados para las especies de anticuerpos que se estaban detectando. Estos anticuerpos secundarios se diluyeron (1:800) en bloqueante Odyssey + Tween-20 al 0,2 % y se añadieron en un volumen de 50 µl por pocillo junto con TOPRO3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Catálogo Nº T3605) (1:3000) para teñir con colorante de contraste las células para la normalización. Las células se incubaron en una mesa de 5 experimentación durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario se eliminó por vertido y cada pocillo se lavó 4X con 200 µl de PBS+ Tween-20 al 0,1 % durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las placas se visualizaron en un instrumento Licor a una resolución de 160 µm, calidad media, desplazamiento de foco de 3 mm, intensidad de 5. Este ensayo también se realizó con los anticuerpos de fármaco comercializado cetuximab, panitumumab y nimotuzumab para determinar si los agentes de unión a EGFR basados en 10Fn3 estaban

10 interfiriendo con su unión a EGFR en células A431. Los resultados representativos se muestran en la Figura 19B.

Tabla 11. Anticuerpos disponibles en el mercado para el dominio extracelular de EGFR.

Clon

PROVEEDOR y Nº de cat ESPECIES UNE EPÍTOPE Motivo de Unión

1

Abcam ab38165 Con h Péptido AA 42-58 lineal

2

E234 Abcam ab32198 Con h,mu,rat a Péptido AA 40-80 (Sin ICC) lineal

3

N-20 Santa Cruz#31155 IgG de cabra h AA 110-160 lineal

4

ICR10 Abcam ab231 Santa Cruz #57095 IgG2a de rata h(HN5) AA 124-176b, neutralizantee conf

5

EGFR1 Abcam ab30 Chemicon MAB88910 Labvision MS311 IgG1 Mu h(A431) AA 176-294, neutralizanteb ab30&MAB88910@(1 mg/ml) conf

6

199.12 Labvision MS396-P IgG2a Mu h AA 124-176, no neutralizanteb conf

7

LA22 Upstate 05104 IgG2a Mu h(A431) AA 351-364, neutralizantea lineal

8

Abcam ab15669 Con Mu,rat Péptido AA376-394d lineal

9

225 Sigma E2156 Labvision MS269-P IgG1 Mu h(A431) AA 294-475, neutralizanteb,c conf

10

528 Abcam ab3103 Santa Cruz#120 Labvision MS268-P IgG2a Mu h(A431) AA 294-475, neutralizanteb,c conf

11

B1D8 Labvision MS666-P IgG2a Mu h(A431) AA 294-475b conf

12

LA1 Upstate 05101 IgG1 Mu h neutralizante

13

H11 Labvision MS316-P IgG1 Mu h AA 294-475, no neutralizanteb lineal

14

111.6 Labvision MS378-P Imgenex IMG80179 IgG1 Mu h AA 294-475, neutralizanteb lineal

15

29.1 Sigma E2760 Abcam ab10414 IgG1 Mu h(A431) Hidrato de carbono externo no neutralizante

Abreviaturas: conf: epítope específico conformacionalmente; lineal: epítope independiente de conformación. aJBC 264(1989)17469 Ala351-Asp364, bJ Immunological Methods 287(2004)147, cMol Biol Med1(1983)511, dGenerado contra un péptido para EGFR de ratón [FKGDSFTRTPPLDPRELEI], eInt J Oncol 4(1994)277. f[EEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDL SFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNY], gIle-Gln-Cys-Ala-His-Tyr-Ile-Asp-Gly-Pro-His-Cys (aminoácidos 580-591). hCancer Cell 7(2005)301.

Usando diversas estrategias, se ha confirmado que el monómero de EGFR E3 se une al domino I de EGFR. Ya que 15 otros monómeros de E tienen propiedades similares en diversos experimentos, se piensa que los otros monómeros

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Eparental

56 ND 42,5 2580 2370 1148 ± 21 ND 29 ± 12,73

E3

60 >80 3,4 NA 15 ± 8 11 ± 7 22 ± 1 >7000 4,75 ± 1,77

E1

64 >95 9,92 NA 24 ± 7 13 ± 3 9 ± 2 >3400 15,9 ± 2,97

E2

72 >95 0,7 NA 38 ± 15 40 ± 9 31 ± 1 >3400 9,4 ± 3,68

Iparental

ND ND NA 1,8 ND ND ND ND 13**

I1

61,5 >95 >6210 0,11 NA NA NA 0,2 8**

ND, no realizado; NA, no aplicable; SEC, cromatografía de exclusión por tamaño. *Los valores de CI50 para niveles de fosforilación de EGFR y ERK en células A431 se determinaron por ensayo In-Cell Western (ICW). Los niveles de fosforilación de EGFR e IGF-IR en células H292 se determinaron por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). ** Competición para unión a IGF-IR. Las desviaciones típicas son de 3 -6 experimentos.

Tabla 14. Propiedades de los agentes de unión a E/I basados en 10Fn3.

CI50 de

CI50 de

CI50 de

CI50 de

CI50 de

Nombre

Tm ºC KD de EGFR nM KD de IGF-IR nM pEGFR de H292, nM pIGF-IR de H292, nM pERK de A431, nM pEGFR de A431, nM Competición de EGF-EGFR, nM

E3-GS10-I1

52 0,7 0,1 7 6 12 14 25 ± 6,5

E3-GS10-I1-PEG

52,5 10,4 0,74 10 6 40 42 80,5 ± 12,02

E1-GS10-I1 E1-GS10-I1-PEG E2-GS10-I1 E2-GS10-I1-PEG I1-GS10-E2-PEG

48 49 56 57,5 60 3,8 57,9 0,5 10,1 3,6 0,8 2,4 0,2 1,17 0,46 30 123 8 32 47 1 4 0,1 0,3 0,8 51 295 20 78 118 36 297 19 77 97 51 396 ± 223 2,1 ± 0,57 56,5 ± 24,5 128 ± 4,95

Las mediciones de Tm son de fluorometría de exploración térmica. Los valores de KD son ensayos de unión Biacore usando dominios recombinantes de EGFR o IGF-IR adsorbidos sobre el chip. Se realizaron ensayos In-Cell Western (ICW) para determinar la capacidad de Tándems de EI de inhibir la fosforilación de EGFR o ERK en células A431. Se usaron ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para determinar la fosforilación de EGFR o IGF-IR en células H292.

Ejemplo 21: Reactividad Cruzada entre Especies de Agentes de Unión a E/I basados en 10Fn3

5 Se analizaron los agentes de unión a E/I basados en 10Fn3 pegilados con respecto a sus afinidades de unión a EGFR de ratón, rata y mono usando análisis de resonancia de plasmón superficial (BIAcore) (procedimientos idénticos al Ejemplo 5). El EGFR de ratón se adquirió de R&D Systems (Minneapolis, MN), el EGFR de rata se produjo internamente y el EGFR de mono se adquirió en KEMP (Frederick, MD)

10 Como se muestra en la Tabla 15, todos los agentes de unión a E/I basados en 10Fn3 pegilados se unieron a EGFR de ratón, rata y mono con afinidades nanomolares bajas, indicando que todos los agentes de unión a E/I pegilados presentan reactividad cruzada con EGFR humano, de ratón, de rata y de mono.

15 Tabla 15

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NaAc 50 mM pH 4,5. En cada muestra se realizaron adiciones de 1 µl de Naranja Sypro 200x en tampón DMSO para una concentración final de colorante al 0,5 %. Cada muestra se cargó en la bandeja de 96 pocillos y se revistió con 5 µl de de aceite de silicona. La bandeja se centrifugó a 1.000 RPM y se cargó en el sistema Bio-Rad CFX96 y se seleccionó al siguiente procedimiento: 25 ºC durante 10 minutos + Lectura de Placa a una temperatura de 25 ºC a 5 95 ºC a incrementos de 0,5 ºC durante 15 minutos + Lectura de Placa. El análisis de datos se realizó para el punto de inflexión con el software CFX. Como se muestra en la Figura 43, columna k, todos los agentes de unión a E/I basados en 10Fn3 pegilados tenían mediciones de Tm similares, que variaban entre 49-62,5 grados celsius. Las mediciones de Tm para los agentes de unión a E/I basados en 10Fn3 pegilados eran independientes de la concentración y permanecieron constantes a todas las concentraciones ensayadas. El análisis de un ejemplo de

10 agente de unión, I1-GS10-E5 pegilado, medido con un intervalo de exploración de 15-95 ºC a concentraciones de proteína de 1 mg/ml en PBS, dio como resultado una medición de Tm de 55,2 ºC como se muestra en la Figura 20.

Se realizó cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en los agentes de unión a E/I basados en 10Fn3 pegilados como se ha descrito previamente en el Ejemplo 4. El análisis de SEC puso de manifiesto que todos los agentes de

15 unión a E/I basados en 10Fn3 pegilados eran > 95 % monoméricos como se muestra en la 43 (columna l de Tabla).

Ejemplo 23: Propiedades bioquímicas y biofísicas del agente de unión a E/I basado en 10Fn3 I1-GS10-E5 pegilado con cambios de aminoácidos seleccionados

20 Se construyó el I1-GS10-E5 pegilado sin el marcador 6HIS y también con diversas alteraciones en la región adaptadora. Además, se realizó un cambio global en todas las construcciones donde la cola C-terminal del primer monómero tenía un único cambio puntual del ácido aspártico a ácido a ácido glutámico (de una D a una E). Se prepararon varios clones con restos de serina seleccionados mutados a cisteínas (de S a C) para proporcionar sitios de PEGilación alternativos. El efecto de estos cambios sobre las propiedades bioquímicas y biofísicas de la molécula

25 se compararon y se resume en la Tabla 17. Los procedimientos para medir la inhibición de pEGFR se describen en el Ejemplo 7, de pIGFR en el Ejemplo 6, de pERK en el Ejemplo 1, Tm en el Ejemplo 4, KD de EGFR e IGFR en el Ejemplo 5. También se realizó un análisis detallado de la cinética de unión en estos clones y se presentan en las Tablas 18 y 19 (usando procedimientos similares a los descritos en el Ejemplo 5).

30 Tabla 17.

NOMBRE DE CLON

CI50 de pEGFR (nM) CI50 de pIGFR (nM) CI50 de pERK (nM) Tm (ºC) KD de EGFR (nM) KD de IGFR (nM) % de mono de SEC

I1-GS10-E5 pegilado

28 2,2 12 56 2,7 0,25 96

I1-GS10-E5 pegilado(1)

30 1,2 11 56,8 Adhesivo(9) 0,23 94,1

I1-GSGCGS8-E5(3)

19,8 1,4 8 54,8 4 0,29 95,2

I1-GS10-E5-GSGC(4)

28,7 1,2 19 55 1,4 0,25 92,7

I1 (S62C)-GS10-E5(5)

21 1,9 10 55,5 8,7 0,7 97,45

I1-GS10-E5 (S62C) (6)

68,4 2,2 30 56 1,7 0,26 96,12

I1 (S91C)-GS10-E5(7)

22,7 6,2 15 52 17 7,16 95,98

I1-GS10-E5(S91C)(8)

22,6 2,1 29 50,5 17,9 0,28 93,39

(1) No se usó un marcador de His para esta construcción. (2) se realizó un cambio global en todas las construcciones alternativas de I1-GS10-E5 pegilado, donde la cola C-terminal del primer monómero tenía un único cambio puntual de ácido aspártico a ácido glutámico (de D a una E). (3) Monómero de I1 unido con GSGC más GS8, a E5. (4) I1 unido con GS10 a E5 con GSGC en la cola de E5. (5) I1 unido con GS10 a E5, donde I1 tiene un único cambio puntual de serina a cisteína en la posición 62. (6) I1 unido con GS10 a E5, donde E5 tiene un único cambio puntual de serina a cisteína en la posición 62. (7) I1 unido con GS10 a E5, donde I1 tiene un único cambio puntual de serina a cisteína en la posición 91. (8) I1 unido con GS10 a E5, donde el E5 tiene un único cambio puntual de serina a cisteína en la posición 91. (9) Esta construcción demuestra unión no específica a la celda de flujo de tal forma que no fue posible una determinación precisa de la afinidad en este experimento.

Tabla 18. Unión Biacore de clones pegilados de I1-GS10-E5 alterados a EGFR645-Fc.

Descripción

ka (1/Ms) kd (1/s) Kd (nm) ∆ka (veces) ∆kd (veces) ∆Kd (veces)

I1-GS10-E5 Pegilado

2,93 ± 0,67 E+04 7,24 ± 3,14 E-05 2,69 ± 1,53 -- -- ---

I1-GS10-E5 pegilado

2,27E+04 1,49E04 6,6 0,8 0,5 0,4

I1-GS10-E5 pegilado(1)

Unión no específica a superficie celular de referencia a mayores concentraciones de analito (600 nM, 200 nM de determinación de valor cinético prohibida)

CLONES ALTERNATIVOS(2)

I1-GSGCGS8-E5(3)

2,94E+04 1,18E04 4,0 1,0 0,6 0,7

I1-GS10-E5-GSGC(4)

3,34E+04 4,52E05 1,4 1,1 1,6 2,0

I1(S62C)-GS10-E5(5)

2,28E+04 1,99E04 8,7 0,8 0,4 0,3

I1-GS10-E5(S62C)(6)

1,78E+04 3,04E05 1,7 0,6 2,4 1,6

I1(S91C)-GS10-E5(7)

1,96E+04 3,34E04 17,0 0,7 0,2 0,2

I1-GS10-E5(S91C)(8)

1,08E+04 1,93E04 17,9 0,4 0,4 0,2

(1) No se usó marcador de His para esta construcción. (2) se realizó un cambio global en todas las construcciones alternativas de I1-GS10-E5 pegilado, donde la cola C-terminal del primer monómero tenía un único cambio puntual de ácido aspártico a ácido glutámico (de D a una E). (3) El monómero de I1 unido con GSGC más GS8, a E5. (4) I1 unido con GS10 a E5 con GSGC en la cola de E5. (5) I1 unido con GS10 a E5, donde el I1 tiene un único cambio puntual de serina a cisteína en la posición 62. (6) I1 unido con GS10 a E5, donde E5 tiene un único cambio puntual de serina a cisteína en la posición 62. (7) I1 unido con GS10 a E5, donde I1 tiene un único cambio puntual de serina a cisteína en la posición 91. (8) I1 unido con GS10 a E5, donde E5 tiene un único cambio puntual de serina a cisteína en la posición 91.

Tabla 19. Unión Biacore de clones pegilados de I1-GS10-E5 alterados a IGF1R-Fc.

Descripción

ka (1/Ms) kd (1/s) Kd (nm) ∆ka (veces) ∆kd (veces) ∆Kd (veces)

I1-GS10-E5 pegilado

1,04 ± 0,04 E+06 2,62 ± 0,21 E-04 0,25 ± 0,01 -- -- ---

I1-GS10-E5 pegilado

1,10E+06 2,78E04 0,25 1,1 0,9 1,0

I1-GS10-E5 pegilado(1)

1,28E+06, 1,22E+06 2,88E04, 2,76E04 0,22, 0,23 1,2 0,9 1,1

CLONES ALTERNATIVOS(2)

I1-GSGCGS8-E5(3)

8,52E+05 2,45E04 0,29 0,8 1,1 0,9

I1-GS10-E5-GSGC(4)

1,07E+06 2,65E04 0,25 1,0 1,0 1,0

I1(S62C)-GS10-E5(5)

3,34E+05 2,34E04 0,70 0,3 1,1 0,4

I1-GS10-E5(S62C) (6)

1,07E+06 2,79E04 0,26 1,0 0,9 1,0

I1(S91C)-GS10-E5(7)

8,22E+04 5,89E04 7,16 0,1 0,4 0,04

I1-GS10-E5(S91C) (8)

9,86E+05 2,81E04 0,28 0,9 0,9 0,9

(1) No se usó marcador de His para esta construcción. (2) Se realizó un cambio global en todas las construcciones alternativas de I1-GS10-E5 pegilado, donde la cola C-terminal del primer monómero tenía un único cambio puntual de ácido aspártico a ácido glutámico (de D a una E). (3) El monómero I1 unido con GSGC más GS8, a E5. (4) I1 unido con GS10 a E5 con GSGC en la cola de E5. (5) I1 unido con GS10 a E5, donde I1 tiene un único cambio puntual de serina a cisteína en la posición 62. (6) I1 unido con GS10 a E5, donde E5 tiene un único cambio puntual de serina a cisteína en la posición 62. (7) I1 unido con GS10 a E5, donde I1 tiene un único cambio puntual de serina a cisteína en la posición 91. (8) I1 unido con GS10 a E5, donde E5 tiene un único cambio puntual de serina a cisteína en la posición 91.

Ejemplo 24: inhibición de rutas de señalización aguas abajo compartidas de EGFR e IGFR

La inhibición de las rutas de señalización aguas abajo se analizó con un ELISA pAKT idéntico a los descritos previamente en el Ejemplo 8. Los resultados de este estudio demuestran que I1-GS10-E5 pegilado es más potente que I1 pegilado solo en el bloqueo de la activación de AKT estimulada por IGF1 en células H292. El E5 pegilado, el

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72 horas (Figura 28A). También se ensayaron muestras plasmáticas de ratones sin tumores con respecto a mIGF1 con un ELISA específico de ratón y también se observaron aumentos en este ligando (Figura 28B).

Ejemplo 29: Resultados de estudios de xenoinjerto de tumor humano in vivo para diversos agentes de unión 5 a E/I basados en 10Fn3

Se evaluaron varios agentes de unión a E/I basados en 10Fn3 en un estudio comparativo de NSCLC H292 (procedimientos descritos en el Ejemplo 12) a una dosis menor que la usada previamente de forma que pudieron averiguarse las diferencias en la actividad relativa. Se comparó la eficacia de los agentes de unión a E/I basados en

10 10Fn3 E2-GS10-I1 pegilado, E4-GS10-I1 pegilado, I1-GS10-E5 pegilado, I1-GS10-E85 pegilado, I1-GS10-E4 pegilado, I1-GS10-E105 pegilado a una sola dosis de 0,625 mg/ratón y panitumumab a dos dosis (1 mg/ratón y 0,1 mg/ratón).

Las dos dosis de panitumumab y todos los agentes de unión a E/I basados en 10Fn3 evaluados en este estudio

15 fueron activos por un punto final de inhibición del crecimiento tumoral (TGI). Durante la fase de dosificación, E4GS10-I1 pegilado, I1-GS10-E5 pegilado, I1-GS10-E4 pegilado y panitumumab produjeron regresión tumoral (Tabla 21, valores de TGI mayores del 100 %) mientras que E2-GS10-I1 pegilado, I1-GS10-E85 pegilado e I1-GS10-E105 pegilado produjeron inhibición del crecimiento tumoral (Tabla 21, valores de TGI hasta el 100 %). Las diferencias en actividad fueron estadísticamente significativas cuando se compararon con el grupo de control. Todos los

20 tratamientos fueron bien tolerados sin muertes relacionadas con el tratamiento o una pérdida de peso excesiva durante el transcurso del estudio. La comparación de la eficacia de los agentes de unión a E/I basados en 10Fn3 y panitumumab se presentan en la Tabla 21 mostrada a continuación y en la Figura 29. En la Figura 29A, las mediciones hasta el día 43 muestran el patrón de extensión de los tumores después de cesar la dosificación. La Figura 29B muestra las mediciones hasta el día 27 y el eje y se amplía para ilustrar las diferencias relativas en

25 actividad entre los grupos de tratamiento.

Tabla 21. Actividad antitumoral in vivo en el estudio de NSCLC H292

Grupo

Compuesto Programa, Vía Dosis (mg/kg) Cambio de peso MEDIO (g) %TGI valor de p para %TGI Resultado por %TGI

1

Control (sin tratar) -- -- 3,36 -- 1,0 --

2

panitumumab q3dx5;6 ipa 1 mg/ratón 5,19 107 0,0023 A

3

panitumumab q3dx5;6 ipa 0,1 mg/ratón 5,9 105 0,0029 A

4

E2-GS10-I1 pegilado TIWX3;6 ipa 0,625 mg/ratón -1,4 93 0,0067 A

5

E4-GS10-I1 pegilado TIWX3;6 ipa 0,625 mg/ratón -0,23 105 0,0023 A

6

I1-GS10-E5 pegilado TIWX3;6 ipa 0,625 mg/ratón -2,92 103 0,0033 A

7

I1-GS10-E85 pegilado TIWX3;6 ipa 0,625 mg/ratón 1,08 86 0,0114 A

8

I1-GS10-E4 pegilado TIWX3;6 ipa 0,625 mg/ratón -1,21 103 0,0034 A

9

I1-GS10-E105 pegilado TIWX3;6 ipa 0,625 mg/ratón -1,54 95 0,0035 A

a El vehículo era solución salina tamponada con fosfato. Las abreviaturas usadas son las siguientes: ip, vía intraperitoneal; %TGI, % relativo de inhibición del crecimiento tumoral calculado como %TGI=[(Ct-Tt)/(Ct-C0)] x 100 donde Ct = peso medio del tumor de ratones de control a tiempo t en días después del implante del tumor, Tt = peso medio del tumor de ratones tratados a tiempo t, C0 = peso medio del tumor de ratones de control a tiempo 0. El valor de %TGI se calculó en dos puntos como la inhibición media del Día 20, Día 24 y Día 27. Resultado, un régimen de tratamiento se considera activo si producía un valor de %TGI estadísticamente significativo > 50 %; q3dx5;6, el compuesto se administró cada tres días para seis dosis empezando el sexto día después del implante de tumor; 6 on/1 off; 6, el compuesto se administró una vez al día durante 6 días y después no hubo tratamiento durante 1 día y este régimen empezó el sexto día después del implante del tumor. Los valores de p se calcularon el Día 20 con respecto al grupo de control en un análisis de muestras emparejadas de dos colas con 8 mediciones por grupo.

Además se realizaron estudios in vivo con los agentes de unión a E/I basados en 10Fn3 seleccionados, en diversos

30 modelos de xenoinjerto usando los métodos descritos en el Ejemplo 12. A continuación se proporciona una descripción de los diversos modelos de xenoinjerto: H292 es un carcinoma pulmonar no microcítico (NSCLC) y se describe con más detalle en el Ejemplo 12; el carcinoma de mama MCF7r se describe en el Ejemplo 14; y el carcinoma de colon GEO se describe en el Ejemplo 15. El carcinoma de colón humano DiFi expresa altos niveles de

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Actividad antitumoral in vivo en el estudio de DiFi

1

Control (sin tratar) -- -- -0,5 -- 1,0 --

2

panitumumab Q3dx5;6 ipa 1 mg/ratón 5,3 109,7 0,006 A

3

panitumumab Q3dx5;6 ipa 0,1 mg/ratón 2,6 99,9 0,005 A

4

E4-GS10-I1 pegilado TIWX3;6 3 mg/ratón -10,8 -1,1 0,815 I

5

I1-GS10-E5 pegilado TIWX3;6 3 mg/ratón -16,4 43,8 0,310 I

6

I1-GS10-E4 pegilado TIWX3;6 3 mg/ratón -8,5 1,4 0,977 I

Actividad antitumoral in vivo en el estudio de RH41

1

Control (sin tratar) -- -- 7,2 -- 1,0 --

2

panitumumab q3dx5;6 ipa 1 mg/ratón 10,7 16,5 0,721 I

3

panitumumab q3dx5;6 ipa 0,1 mg/ratón 8,6 38,4 0,563 I

4

E4-GS10-I1 pegilado TIWX3;6 2,5 mg/ratón -5,3 72,7 0,02 A

5

I1-GS10-E5 pegilado TIWX3;6 2,5 mg/ratón -7,8 68 0,019 A

6

I1-GS10-E4 pegilado TIWX3;6 2,5 mg/ratón -2,9 64,5 0,018 A

7

Control (sin tratar) -- -- 12,3 -- 1,0 --

8

E2-GS10-I1 pegilado TIWX3;18 2,5 mg/ratón -1,8 58,6 0,044 A

9

E2-pegilado TIWX3;18 1,25 mg/ratón 5,9 20,2 0,530 I

10

I1 pegilado TIWX3;18 1,25 mg/ratón 7,1 58,6 0,025 A

Actividad antitumoral in vivo en el estudio de Cal27

1

Control (sin tratar) -- -- 9,4 -- 1,0 --

2

Panitumumab q3dx5;6 ipa 1 mg/ratón 6,1 109,8 0,0006 A

3

panitumumab q3dx5;6 ipa 0,1 mg/ratón 5,8 72,9 0,003 A

4

E4-GS10-I1 pegilado TIWX3;6 2 mg/ratón -1,2 -11,4 0,587 I

5

I1-GS10-E5 pegilado TIWX3;6 2 mg/ratón -11,6 57,6 0,037 A

6

I1-GS10-E4 pegilado TIWX3;6 2 mg/ratón -2,2 -9,2 0,177 I

a El vehículo era solución salina tamponada con fosfato para todos los tratamientos. Las abreviaturas usadas son las siguientes: ip, vía intraperitoneal; po, vía oral; %TGI, % de inhibición del crecimiento tumoral relativo calculado como %TGI=[(Ct-Tt)/(Ct-C0)] x 100 donde Ct = peso medio del tumor de ratones de control a tiempo t en días después del implante del tumor, Tt = peso medio del tumor de ratones tratados a tiempo t, C0 = peso medio del tumor de ratones de control a tiempo 0. El valor de %TGI se calculó a dos puntos como inhibición media el Día 19 y 23 para H292, Día 39 y 41 para DiFi, Día 34 y 37 para RH41 para los grupos 1-6 y Día 35, 36 y 39 para los grupos 7-10, Día 18 y 20 para Cal27. Resultado, un régimen de tratamiento se consideró activo si producía un valor de %TGI estadísticamente significativo >50 %; q3dx5;6, el compuesto se administró cada tres días durante seis dosis empezando el sexto día después del implante del tumor; TIWX3;6, el compuesto se administró tres veces por semana durante tres semanas y este régimen empezó el sexto día después del implante del tumor. Los valores de p se calcularon con respecto al grupo de control en un análisis de muestras emparejadas de dos colas con 8 mediciones por grupo el Día 23 para H292, el Día 39 para DiFi, Día 37 para RH41 para los grupos 1-6, el Día 39 para los grupos 7-10 y el Día 20 para Cal27.

Tabla 23. Resumen de experimentos in vivo con agentes de unión basados en 10Fn3 y comparadores

Grupo

Compuesto Programa Dosis (mg/kg)a Cambio de peso MEDIO (g) %TGI valor de p para %TGI Resultad o por %TGI

Actividad antitumoral in vivo en el estudio de MCF7r

1

Control (sin tratar) -- -- 6,1 -- 1,0 --

2

I1 pegilado a TIWX3;7 50 mg/kg, ip 17,1 -40,8 0,195 I

3

E5 pegiladoa TIWX3;7 50 mg/kg, ip 5,1 75,8 0,007 A

4

E5 pegiladoa + I1 pegiladoa TIWX3;7 50 mg/kg, ip -3,0 81,8 <0,0001 A

5

I1-GS10-E5 pegilado a TIWX3;7 100mg/kg, ip -4,5 78 0,009 A

6

cetuximaba Q3DX5;7 1 mg/ratón, ip 11,7 105,4 0,0009 A

7

cetuximaba Q3DX5;7 0,1 mg/ratón, ip 7,5 34,3 0,031 I

8

BMS-754807b QDX14;7 50 mg/kg, po -4,0 44,5 0,146 I

Actividad antitumoral in vivo en el estudio de BxPC3

1

Control (sin tratar) -- -- 3,1 -- 1,0 --

2

I1 pegilado TIWX3;9 50mg/kg, ip 4,3 14,3 0,315 I

3

E5 pegilado TIWX3;9 50mg/kg, ip -5,3 61,2 0,0003 A

4

E5 pegilado + I1 pegilado TIWX3;9 50mg/kg, ip -4,9 68,8 0,0019 A

5

I1-GS10-E5 pegilado TIWX3;9 100mg/kg, ip -14,0 78,0 0,0002 A

6

cetuximab Q3DX5;9 1 mg/ratón, ip 5,2 62,6 0,0026 A

7

cetuximab Q3DX5;9 0,25 mg/ratón, ip 2,5 62,8 0,0005 A

8

cetuximab +I1 pegilado Q3DX5;9 TIWX3;9 1 mg/ratón, ip 50mg/kg, ip 3,6 62,1 0,0005 A

Actividad antitumoral in vivo en el estudio de GEO

1

Control (sin tratar) -- -- 7,5 -- 1,0 --

2

I1 pegilado TIWX3;9 50 mg/kg, ip -7,2 26,8 0,594 I

3

E5 pegilado TIWX3;9 50 mg/kg, ip 9,7 83,5 0,0028 A

4

E5 pegilado + I1 pegilado TIWX3;9 50 mg/kg, ip 5,4 92,1 0,0005 A

5

I1-GS10-E5 pegilado TIWX3;9 100 mg/kg, ip -7,3 92,1 0,0006 A

6

cetuximab Q3DX5;9 1 mg/ratón, ip 7,7 91,8 0,0008 A

7

cetuximab Q3DX5;9 0,25 mg/ratón, ip 7,8 92,0 0,0007 A

8

cetuximab + I1 pegilado Q3DX5;9 TIWX3;9 1 mg/ratón, ip 50 mg/kg, ip 7,1 91,3 0,0006 A

Actividad antitumoral in vivo en el estudio de H441

1

Control (sin tratar) -- -- 12,4 -- 1,0 --

2

I1 pegilado TIWX3;9 50 mg/kg, ip 11,5 30,8 0,701 I

3

E5 pegilado TIWX3;9 50 mg/kg, ip -8,8 43,1 0,292 I

4

E5 pegilado + I1 pegilado TIWX3;9 50 mg/kg, ip -0,8 54,5 0,011 A

5

I1-GS10-E5 pegilado TIWX3;9 100 mg/kg, ip -3,9 69,2 0,022 A

6

cetuximab Q3DX5;9 1 mg/ratón, ip 12,6 65,2 0,002 A

7

cetuximab Q3DX5;9 0,25 mg/ratón, ip 13,7 43,9 0,110 I

8

cetuximab +I1 pegilado Q3DX5;9 TIWX3;9 1 mg/ratón, ip 50 mg/kg, ip 10,2 66,7 0,060 I

a El vehículo fue solución salina tamponada con fosfato para todos los tratamientos. Las abreviaturas usadas son las siguientes: ip, vía intraperitoneal; po, vía oral; %TGI, % de inhibición del crecimiento tumoral relativo calculado como %TGI=[(Ct-Tt)/(Ct-C0)] x 100 donde Ct = peso medio del tumor de ratones de control a tiempo t en días después del implante del tumor, Tt = peso medio del tumor de ratones tratados a tiempo t, C0 = peso medio del tumor de ratones de control a tiempo 0. El valor de %TGI se calculó a dos puntos como inhibición media el Día 22 y 26 para MCF7r, el Día 23 y 27 para BxPC3, el Día 29 y 31 para GEO y el Día 17 para H441. Resultado, un régimen de tratamiento se consideró activo si producía un valor de %TGI estadísticamente significativo > 50 %; q3dx5;6, el compuesto se administró cada tres días durante seis dosis empezando el sexto día después del implante del tumor; TIWX3;6, el compuesto se administró tres veces por semana durante tres semanas y este régimen empezó el sexto día después del implante del tumor. Los valores de p se calcularon con respecto al grupo de control en un análisis de muestras emparejadas de dos colas con 8 mediciones por grupo el Día 26 para MCF7r, el Día 27 para BxPC3, el Día 29 para GEO y el Día 17 para RH41.

Ejemplo 30: Perfil farmacocinética de diversos agente de unión a E/I basados en 10Fn3 en ratones

Los perfiles farmacocinéticos del agente de unión a E/I basado en 10Fn3 pegilado, E2-GS10-I1, se evaluaron en

5 ratones por inyección intraperitoneal. Tres ratones desnudos por grupo de dosificación se dosificaron con E2-GS10-I1, formulado en PBS, a 10 y 100 mg/kg, ip y se recogieron muestras plasmáticas en solución de citrato fosfato y dextrosa antes de la dosificación, y 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 144 y 168 horas después de la dosificación. En las muestras plasmáticas se evaluaron los niveles de agente de unión basado en Fn3 E2-GS10-I1 pegilado usando un ensayo de electroquimioluminiscencia (ECL) cuantitativo desarrollado para detectar y cuantificar el agente de unión a

10 E/I basado en 10Fn3 pegilado en muestras de plasma. En este ensayo, un anticuerpo monoclonal de ratón con especificidad por la región de unión a EGFR se adsorbió en placas Meso Scale Discovery durante una noche a 4 ºC para permitir la captura del agente de unión a E/I basado en 10Fn3 en las muestras plasmáticas. Las muestras plasmáticas se añadieron a las placas y se incubaron a 22 ºC durante 1 hora. El agente de unión a E/I basado en

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Claims (1)

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