JP2012509900A - 二重特異性ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子 - Google Patents

二重特異性ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子 Download PDF

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Abstract

本発明は、診断的、研究的および治療的応用における使用のためのＥＧＦＲ結合ドメインおよび別個のＩＧＦＩＲ結合ドメインを含む二重特異性分子に関する。本発明は、さらに、かかるタンパク質を含む細胞、かかるタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチド、および該革新的なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。例示的な二重特異性分子は、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを基礎とする抗体様タンパク質二量体を包含する。

Description

配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されており、これによってその全体が参照によって組み込まれる配列表を含有する。２００９年１１月２３日に作成された上述のＡＳＣＩＩコピーは、ＣＯＴＨ５２ＷＯ．ｔｘｔという名であり、サイズが５５２，５２９バイトである。
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年１１月２４日に提出された米国仮特許出願第６１／２００，１６４号；２００８年１１月２６日に提出された米国仮特許出願第６１／２００，２８２号；２００９年４月１７日に提出された米国仮特許出願第６１／２１２，９６６号；２００９年５月１４日に提出された米国仮特許出願第６１／１７８，２７９号；および２００９年７月２１日に提出された米国仮特許出願第６１／２２７，３３０号の利益を主張し、これらの出願は、それらの全体が参照によってこれによって組み込まれる。
本発明は、診断的、研究的および治療的応用における使用のためのＥＧＦＲ結合ドメインならびにＥＧＦＲ結合ドメインおよび別個のＩＧＦＩＲ結合ドメインを含む二重特異性分子に関する。本発明は、さらに、かかるタンパク質を含む細胞、かかるタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチド、および該革新的なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。例示的なＥＧＦＲ結合ドメインおよび二重特異性分子は、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを基礎とする抗体様タンパク質二量体を包含する。
序論
受容体チロシンキナーゼシグナリングの活性化は、癌の進展の中心となる［たとえばGrimberg A. Cancer Biol Ther. 2003 2(6):630-5およびMendelsohn J. J Clin Oncol. 2003 21(14):2787-99を参照されたい］。受容体チロシンキナーゼは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内チロシンキナーゼドメインを含む保存されたドメイン構造を有する。細胞外ドメインは、ポリペプチド増殖因子または細胞膜結合分子などのリガンドに結合することができる。典型的には、リガンド結合または受容体チロシンキナーゼのリガンド結合誘導性二量体化により、受容体の細胞内触媒チロシンキナーゼドメインおよびそれに続くシグナル伝達が活性化される。
受容体チロシンキナーゼの例は、ＥＲＢＢ受容体（たとえばＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４）、エリスロポエチン産生肝細胞（ＥＰＨ）受容体、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体（たとえばＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ５）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体（たとえばＰＤＧＦＲ−Ａ、ＰＤＧＦＲ−Ｂ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体（たとえばＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、ＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ１、ＶＥＧＦ３）、免疫グロブリン様ドメインおよびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ（ＴＩＥ）受容体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）受容体（たとえばＩＮＳ−Ｒ、ＩＧＦＩＲ、ＩＲ−Ｒ）、ジスコイジンドメイン（ＤＤ）受容体、ｃ−Ｍｅｔ（ＭＥＴ）の受容体、マクロファージ刺激１受容体としても知られているＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ｎａｎｔａｉｓ）、Ｆｌｔ３ ｆｉｎｓ関連チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ３）、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）受容体、接着関連キナーゼ受容体（たとえばＡｘｌ）、ｃ−ｋｉｔ（ＫＩＴ）の受容体、およびインスリン受容体関連（ＩＲＲ）受容体を含むが、これらに限定されない。
受容体チロシンキナーゼの阻害は、ある種のヒト悪性腫瘍のための有効な治療戦略として現われた（概説については、Roussidis AE, In Vivo. 2002 16(6):459-69を参照されたい）。
標的単独療法は、初めのうちは、癌を治療するのに有効であり得るが、おそらく他のシグナリングカスケードのアップレギュレーションの結果として、しばしば治療抵抗性が後続しうる（たとえばNahta R et al., Breast Cancer Res. 2006 8(6):215およびHorn L et al., Clin Lung Cancer. 2007 8:S68-73を参照されたい）。したがって、改善された癌治療法を開発する必要性が存在する。
一態様において、本出願は、新規な配列を有するＥＧＦＲ結合第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）を提供する。コンセンサス配列を有するＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３もまた、提供される。そのようなＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、単量体であってもよいまたは融合タンパク質の一部として含まれてもよい。
他の態様において、本出願は、本明細書において「Ｅ／Ｉ結合剤」と呼ばれる、ＥＧＦＲおよびＩＧＦＩＲを結合する二重特異性分子を提供する。本発明によって包含されるＥ／Ｉ結合剤は、二重特異性抗体、およびリガンド結合スキャフォールドタンパク質（たとえば、テンダミスタット、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、テトラネクチン、およびアンキリン）の二量体を含む。単一のポリペプチド鎖として構築する場合、Ｅ／Ｉ結合剤は、任意の向きで、たとえばＮ末端からＣ末端にＥ−Ｉ配置またはＩ−Ｅ配置のいずれで構築してもよい。
一態様において、ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合したＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体が提供される。１０Ｆｎ３は、５００ｎＭ未満のＫＤでそれらの標的（ＥＧＦＲまたはＩＧＦＩＲ）を結合する。個々の１０Ｆｎ３のそれぞれは、独立して、配列番号３２に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有し、ｎは１〜２０の整数であり、ｏは１〜２０の整数であり、ｐは１〜４０の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは８〜１２の整数であり、ｏは４〜８の整数であり、ｐは４〜２８の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは１０であり、ｏは６であり、ｐは１２である。
いくつかの実施形態において、抗体様タンパク質二量体は、ポリペプチドリンカーまたはポリエチレングリコール基を介してＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合したＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む。いくつかの実施形態において、抗体様タンパク質二量体は、配列番号２０〜３１、５３〜５８、８７〜９２、９８〜１０５、１１８〜１３３、１４９〜１５４、１６４〜１６９、１７９〜１８４、１９２〜１９７、２０５〜２１０、および２１１〜２１６のいずれか１つに対して少なくとも８０、９０、９５、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、配列番号２０〜３１、５３〜５８、８７〜９２、９８〜１０５、１１８〜１３３、１４９〜１５４、１６４〜１６９、１７９〜１８４、１９２〜１９７、２０５〜２１０、および２１１〜２１６のいずれか１つを有するアミノ酸配列を含み、ここに、（ｉ）ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３および／またはＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１の対応するスキャフォールドアミノ酸に比べて、約０〜２０、０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個の置換、保存的置換、欠失、または付加を有する１０Ｆｎ３スキャフォールドを含み、および／または（ｉｉ）ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号５〜８、５２、６６〜６８、１０６〜１０８、１１２〜１１４、１４０〜１４２、１５５〜１５７、１７０〜１７２、１８２、１８５〜１８７、１９８〜２００、または２１９〜３２７のいずれか１つの対応するループ配列に比べて、約０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個の置換、保存的置換、欠失、または付加を有し、および／またはＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３の対応するループ配列に比べて、約０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個の置換、保存的置換、欠失、または追加を有する。
一態様において、本明細書において記載される抗体様タンパク質二量体および薬学的に許容できるキャリアを含む薬学的に許容できる組成物が提供され、該組成物は本質的に発熱物質を含まない。
さらなる態様において、対象において、癌などの過剰増殖障害を治療するための方法であって、本明細書において記載される抗体様タンパク質二量体を含む薬学的に許容できる組成物の治療有効量をその必要性のある対象に投与することを含む方法が提供される。
他の態様において、本出願は、本明細書において記載される抗体様タンパク質二量体をコードする核酸を提供する。さらに、本明細書において記載される抗体様二量体をコードする核酸を含むベクターが提供される。適したベクターは、たとえば発現ベクターを含む。さらに、本明細書において記載される抗体様タンパク質二量体をコードする核酸を含む核酸、ベクター、または発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。適した宿主細胞は、原核生物および真核生物の宿主細胞を含む。例示的な原核細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞である。例示的な真核細胞は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞である。さらに、本明細書において記載される抗体様タンパク質二量体を産生するための方法であって、該抗体様タンパク質二量体をコードする核酸を含む核酸、ベクター、または発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、発現された抗体様タンパク質二量体を培養物から回収することを含む方法が提供される。
Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ２が発現され、ＨｉｓＴｒａｐクロマトグラフィーカラムによって精製されたＨＭＳ１７４（ＤＥ３）細菌細胞ペレットの溶解からの試料を４〜１２％ ＮｕＰＡＧＥミニゲル上に流し、Ｓｙｐｒｏ−Ｏｒａｎｇｅによって染色し、ＳＴＯＲＭイメージャーによって可視化した。Ｍａｒｋ１２分子量スタンダード（レーン１）；溶解物−可溶性（レーン２）；溶解物−不溶性（レーン３）；ＨｉｓＴｒａｐロード（レーン４）；ＨｉｓＴｒａｐ非結合（レーン５）；プールＨｉｓＴｒａｐ溶出物（レーン６）；５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５の中に透析（レーン７）；ＰＢＳの中に透析（レーン８）；Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５の中に透析（レーン９）。 Ａ．中規模精製Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ２のＳＥＣの分析。ＰＢＳ、ｐＨ７．４の中に透析した、２２μｇのＨｉｓＴｒａｐ精製Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ２を、１００ｍＭ ＮａＰＯ４、１００ｍＭ ＮａＳＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８の移動相と共にＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３０ＳＥＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に装填し、Ａ２８０を使用して測定した。Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ２は、球状ゲル濾過標準物質（ＢｉｏＲａｄ）に対して約２４．６ｋＤａの分子量範囲で単一の単量体種として主に溶出された。Ｂ．Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１のＳＥＣ分析。 Ａ．Ｔｍを決定するために、ＰＢＳ中の中規模精製Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ２の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を行った。１ｍｇ／ｍＬ溶液のＩ１−ＧＳ１０−Ｅ２を、３ａｔｍ圧力下で毎分１度の速度で５℃〜９５℃までスキャンした。データは、ＰＢＳ緩衝液の対照の実行に対して分析した。Ｂ．Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１のＤＳＣ。 Ｈ２９２細胞におけるＩＧＦＲ活性の阻害。細胞は、１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１および１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを用いて刺激し、●Ｉ１、□Ｅ１、または△Ｅ１−ＧＳ１０−Ｉ１のＨＴＰＰ調製物を用いて処理した。チロシン１１３１上でのＩＧＦＩＲのリン酸化は、ＥＬＩＳＡによって決定した。 Ｈ２９２細胞におけるＥＧＦＲ活性の阻害。細胞は、１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１および１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを用いて刺激し、●Ｉ１、□Ｅ１、または△Ｅ１−ＧＳ１０−Ｉ１のＨＴＰＰ調製物を用いて処理した。チロシン１０６８上でのＥＧＦＲのリン酸化は、ＥＬＩＳＡによって決定した。 Ｈ２９２細胞におけるＡＫＴリン酸化の阻害。細胞は、１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１および１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを用いて刺激し、●Ｉ１、□Ｅ１、または△Ｅ１−ＧＳ１０−Ｉ１のＨＴＰＰ調製物を用いて処理した。セリン４７３上でのＡＫＴのリン酸化は、ＥＬＩＳＡによって決定した。 ＲＨ４１細胞増殖の阻害。細胞は、●Ｉ１、□Ｅ１、または△Ｅ１−ＧＳ１０−Ｉ１のＨＴＰＰ調製物を用いて処理し、増殖の阻害パーセントを決定した。 Ｈ２９２細胞増殖の阻害。細胞は、●Ｉ１、□Ｅ１、または△Ｅ１−ＧＳ１０−Ｉ１のＨＴＰＰ調製物を用いて処理し、増殖の阻害パーセントを決定した。 単離ＥＧＦＲモノネクチン（ｍｏｎｏｎｅｃｔｉｎ）、ＰＥＧを追加していない、Ｃ末端位置にセリンを有するＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤、および４０ｋＤａ分岐ＰＥＧにコンジュゲートした、Ｃ末端位置にシステインを有するＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤についての細胞ベースの機能的アッセイにおけるＩＣ５０値を要約する。代表的なデータを示す。 Ｎ末端およびＣ末端位置においてＥ２を有するＰＥＧ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤のイムノブロット分析。両方のコンストラクトがＥＧＦＲの阻害についてＨ２９２細胞アッセイにおいて同等の活性を示すにもかかわらず、Ｃ末端位置にＥ２を有するＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、ＥＧＦＲを分解せず、Ｎ末端位置にＥ２を有するＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、分解した。両方のコンストラクトは、この細胞系においてＩＧＦＲ分解が非常に弱いまたはそれを全く示さない。β−アクチンは、すべてのレーンにわたって使用量が等しいことを示すために含めた。ＥＧＦＲ、ＥＲＫ、およびＳｈｃのリン酸化状態もまた、検査した。 Ｈ２９２細胞におけるＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害。両方のコンストラクトは、ＥＧＦＲの阻害についてＨ２９２細胞アッセイにおいて同等の活性を示した。Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１（ＰＥＧを有する）（○）、Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ２（ＰＥＧを有する）（□）、パニツムマブ（−−−−）。 腫瘍異種移植片研究の結果。図１２Ａ：Ｈ２９２ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける症状発現前抗腫瘍活性。８匹のマウスの群から計算した平均腫瘍サイズを、対照動物（■）、１００ｍｇ／ｋｇで投薬したＥ３−ＧＳ１０−Ｉ１（ｗ／ＰＥＧ）（○）、１００ｍｇ／ｋｇで投薬したＥ２−ＧＳ１０−Ｉ１（ＰＥＧを有する）（□）、１ｍｇ／マウス（△）または０．１ｍｇ／マウス（▽）で投薬したパニツムマブについて、ｍｇで示す。Ｘ軸上の文字ａは、Ｅ／Ｉ結合剤の投与を示し、ｐは、パニツムマブの投与を示す。図１２Ｂ：平均体重変化を研究の経過にわたってそれぞれの群について示す。記号は図１２Ａの説明文において記載されるとおりとする。 Ｈ２９２ ＮＳＣＬＣ腫瘍異種移植片モデルにおける薬力学的効果。示される分析物のレベルは、実施例１２において記載されるように腫瘍溶解物において決定した。（Ａ）ホスホ（ｐｈｏｓｐｈ）ＥＧＦＲ、（Ｂ）ホスホＥｒｂＢ２、（Ｃ）ホスホＩＧＦＲ、および（Ｄ）全ＥＧＦＲ。チェック模様の棒＝パニツムマブ、空の棒＝Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１（ＰＥＧを有する）、斜線を引いた棒＝Ｅ３−ＧＳ１０−Ｉ１（ＰＥＧを有する）。 ＭＣＦ７親細胞と比較したＭＣＦ７ｒ細胞のウェスタンブロット分析。 ヌードマウスにおけるＭＣＦ７（パネルＡ）およびＭＣＦ７ｒ（パネルＢ）ヒト腫瘍異種移植片研究。平均腫瘍サイズは、群当たり８匹のマウスから計算した両方の研究について示す。 ヌードマウスにおけるＧＥＯヒト腫瘍異種移植片研究。 ヌードマウスにおけるＨ２９２ヒト腫瘍異種移植片研究。 Ｈ２９２ ＮＳＣＬＣ細胞を用いるコロニー形成アッセイ。Ａ．代表的なデータを単一のプレートから示す。Ｂ．１つのＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤由来のＩＣ５０は、トリプリケートの測定値から計算した誤差バーと共に示す。 エピトープマッピングアッセイ。様々なＥＧＦＲ結合抗体についてのエピトープ結合の位置をパネルＡ中に示す。抗体については、実施例１８、表１１に記載する。表１１の左の列は、パネルＡにおいて示される、番号を付けた抗体と相関する個々の抗ＥＧＦＲ抗体についての番号を提供する。パネルＢは、実施例１８において記載される例示的なエピトープマッピングアッセイを示す。 ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で１５〜９５℃のスキャン範囲で測定し、５５．２℃のＴｍ測定値をもたらした、Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５のＤＳＣ分析。 ＥＬＩＳＡによって測定されるＨ２９２細胞におけるＡＫＴリン酸化の阻害についてのＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の評価。ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５（○）は、ペグ化Ｉ１のみ（■）またはペグ化Ｅ５のみ（▲）よりもＩＧＦ１刺激ＡＫＴリン酸化の遮断について強力であった。 Ｈ２９２細胞における細胞増殖の阻害についてのＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の評価。ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５（□）は、ペグ化Ｉ１のみ（▲）よりも強力であり、ペグ化Ｅ５のみ（●）では、Ｈ２９２細胞の増殖の阻害について弱い効果しか有していなかった。アッセイはトリプリケートで実行した。代表的なデータを示す。 ＲＨ４１細胞における細胞増殖の阻害についてのＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の評価。ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５（□）は、ペグ化Ｉ１のみ（▲）よりもわずかに強力であり、ペグ化Ｅ５のみ（●）またはパニツムマブ（点線）は、ＲＨ４１細胞の増殖の阻害についてほとんど効果を有していなかった。アッセイはトリプリケートで実行した。代表的なデータを示す。 １０Ｆｎ３ベースの結合剤（ペグ化）によるリガンド刺激シグナリングの阻害。ＤｉＦｉ（パネルＡ）、Ｈ２９２（パネルＢ）、またはＢｘＰＣ３（パネルＣ）細胞における受容体活性化および細胞シグナリングに対するＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤（ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５）の効果。細胞は、血清を欠乏させ、ＥＧＦ、ＩＧＦ１、またはＥＧＦ＋ＩＧＦ１の組合せを用いる刺激の前に１μＭ １０Ｆｎ３ベースの結合剤を用いて２時間処理した。ＧＡＰＤＨは、すべてのレーンにおいて使用量が等しいことを示すためにプローブした。 １０Ｆｎ３ベースの結合剤（非ペグ化）によるＨ２９２細胞におけるリガンド刺激シグナリングの阻害。Ｈ２９２細胞における受容体活性化および細胞シグナリングに対するＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤（Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１）の効果。細胞は、血清を欠乏させ、ＥＧＦ、ＩＧＦ１、またはＥＧＦ＋ＩＧＦ１の組合せを用いる刺激の前に１μＭ １０Ｆｎ３ベースの結合剤を用いて２時間処理した。ＧＡＰＤＨは、すべてのレーンにおいて使用量が等しいことを示すためにプローブした。 Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤を用いる競合結合研究。Ａ．ＥＧＦＲ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、ＥＧＦＲへのＥＧＦＲ抗体の結合について競合しない。ＥＧＦＲ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の最初の注入は、チップの表面上のＥＧＦＲへの結合を示す。等量のセツキシマブ、パニツムマブ、またはニモツズマブと混合したＥＧＦＲ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の第２の注入は、ＥＧＦＲ １０Ｆｎ３ベースの結合剤によるＥＧＦＲへの抗体の結合についての競合を示さない。Ｂ．Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−ＩＲを同時に結合することができる。Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の最初の注入は、チップ表面上に固定されたＥＧＦＲへの結合を示す。Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤可溶性ＩＧＦ−ＩＲの第２の注入は、固定されたＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の他端へのｓＩＧＦ−ＩＲの結合を示す。 異種移植片研究の最後の投与の４時間後のＴＧＦα血漿レベル。表２４中に記載されるＢｘＰＣ３（パネルＡ）、ＧＥＯ（パネルＢ）、およびＨ４４１（パネルＣ）異種移植片研究由来の処理の終了時に採取した血漿試料は、ＴＧＦαの循環レベルついて分析した。 ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５の投薬後の腫瘍を有していないヌードマウスにおけるＴＧＦαおよびＩＧＦ１の血漿レベル。腫瘍を有していないマウスに、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５１０Ｆｎ３ベースの結合剤の単一用量を与え、ＴＧＦα（パネルＡ）およびＩＧＦ１（パネルＢ）の循環レベルについて分析した。 パニツムマブと比較した、Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤を使用するＨ２９２異種移植片研究。Ｈ２９２異種移植片は、未処理（■）もしくは図中に記載される個々のコンストラクトと共に、ＰＢＳ中で処方した１０Ｆｎ３ベースの結合剤を１週当たり３回投薬した、または１ｍｇ／マウス（○）もしくは０．１ｍｇ／マウス（□）でパニツムマブを３日ごとにｉ．ｐ．投薬した。１０Ｆｎ３ベースの結合剤およびパニツムマブ（▲）の実際の投与を、１０Ｆｎ３ベースの結合剤の投与を示す三角より下のＸ軸に最も近いパニツムマブの投与と共にＸ軸上に示す。図２９Ａは、４３日目までの測定値を示す。図２９Ｂは、２７日目までの測定値を示す。 マウスにおけるペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉｌの薬物動態パラメータープロファイル。 様々なＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤における、１００ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰならびに１０ｍｇ／ｋｇおよび６４ｍｇ／ｋｇ ＳＣでの半減期の比較。 ＲＨ４１モデルにおけるペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１の抗腫瘍効能。 腫瘍における薬力学的エンドポイントの測定。処理の終了時に、腫瘍は、最終投与の４時間後にＤｉＦｉ異種移植片モデル（パネルＡ）およびＨ２９２異種移植片モデル（パネルＢ）から摘出し、ホスホＥＧＦＲ、ホスホＩＧＦＲ、全ＥＧＦＲ、および全ＩＧＦＲのレベルについて検査した。等量の総タンパク質量溶解物を、ゲルのそれぞれのレーンの中に装填し、ブロットもまた、すべてのレーンにわたって使用量が等しいことを示すために、ＧＡＰＤＨを用いてプローブした。 抗ＥＧＦＲ結合剤６７９Ｆ０９の配列（配列番号４９０）。変えたループ残基に下線を引く。 ＢＣループ配列分析Ｉ。ＥＧＦＲ結合配列由来のＢＣループにおけるそれぞれの位置のアミノ酸の頻度。ＷｅｂＬｏｇｏを使用して生成された画像（Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. WebLogo: A sequence logo generator. Genome Research, 14:1188-1190, 2004）。 ＤＥループ配列分析１。ＥＧＦＲ結合配列由来のＤＥループにおけるそれぞれの位置のアミノ酸の頻度（２６３の特有のＤＥループ配列を分析した）。 ＦＧループ（１０アミノ酸長）配列分析Ｉ。１０アミノ酸長ＦＧループを有するＥＧＦＲ結合配列由来のＦＧループにおけるそれぞれの位置のアミノ酸の頻度（２２８の特有の１０アミノ酸長ＦＧループを分析した）。 ＦＧループ（１５アミノ酸長）配列分析Ｉ。１５アミノ酸長ＦＧループを有するＥＧＦＲ結合配列由来のＦＧループにおけるそれぞれの位置のアミノ酸の頻度（３４９の特有の１５アミノ酸長ＦＧループを分析した）。 ＢＣループ配列分析ＩＩ。すべての「強力な」配列由来のＢＣループにおけるそれぞれの位置のアミノ酸の頻度（８５の特有のＢＣループ配列を分析した）。 ＤＥループ配列分析ＩＩ。すべての「強力な」配列由来のＤＥループにおけるそれぞれの位置のアミノ酸の頻度（６０の特有のＤＥループ配列を分析した）。 ＦＧループ（１０アミノ酸長）配列分析ＩＩ。１０アミノ酸長ＦＧループを有するすべての「強力な」配列由来のＦＧループにおけるそれぞれの位置のアミノ酸の頻度（６の特有の１０アミノ酸長ＦＧループを分析した）。 ＦＧループ（１５アミノ酸長）配列分析ＩＩ。１５アミノ酸長ＦＧループを有するすべての「強力な」配列由来のＦＧループにおけるそれぞれの位置のアミノ酸の頻度（６５の特有の１５アミノ酸長ＦＧループを分析した）。 実施例２２において記載されるＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の様々な特徴を概説する表。 実施例３０において記載されるＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の様々な薬物動態パラメーターを概説する表。 実施例３２において記載されるＥ単量体のアミノ酸配列。それぞれの配列におけるＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループに下線を引く。 Ｉ１コア（配列番号６５）、Ｅ１コア（配列番号６６）、Ｅ２コア（配列番号６７）、Ｅ３コア（配列番号６８）、Ｅ４コア（配列番号１０８）、Ｅ５コア（配列番号１１４）、Ｅ８５コア（配列番号１４１）、Ｅ９０コア（配列番号１５６）、Ｅ９６コア（配列番号１７１）、Ｅ１０５コア（配列番号１８６）およびＥ１１２コア（配列番号１９９）との野生型コア配列（配列番号１のアミノ酸９〜９４）のアライメント。野生型配列におけるＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループを太字で示し、下線を引く。ＩおよびＥのコアについて野生型と比較して実際に変化させたアミノ酸残基を太字で示し、下線を引く。 ＥおよびＩ単量体の核酸配列。別段の定めがない限り、ヌクレオチド配列は、Ｎ＋１０ Ｎ末端伸長、Ｓｅｒテール、およびｈｉｓタグを有する単量体をコードする。 Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の核酸配列。すべてのヌクレオチド配列は、コンストラクトにおける第１の単量体上にＮ＋１０ Ｎ末端伸長ならびにコンストラクトにおける第２の単量体上にＣｙｓテールおよびｈｉｓタグを有するＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤をコードする。ＧＳ１０は、配列番号１１であり、ＧＳＧＣＧＳ８は、配列番号２１８であり、ＧＳＧＣは、配列番号４８９である。
定義
本明細書において使用されるように、以下の用語および語句は、下記に説明される意味を有するものとする。他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者に共通して理解されるものと同じ意味を有する。
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に指示しない限り、複数の指示内容を含む。
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、すべてを含む、オープンな意味で使用され、追加のエレメントが含まれてもよいことを意味する。
用語「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「〜を含むが、これらに限定されない」を意味するために使用される。「〜を含む」および「〜を含むが、これらに限定されない」は、区別なく使用される。
用語「抗体様タンパク質」は、「免疫グロブリン様フォールド」を有する非免疫グロブリンタンパク質を指す、つまり、構造上、一組のベータストランドまたはベータ様ストランドに組織化され、ベータシートを形成する約８０〜１５０のアミノ酸残基を含み、ベータストランドまたはベータ様ストランドは、介在するループ部分によって結合される。ベータシートは、ベータストランドまたはベータ様ストランドを結合するループから構成される２つの「面」を生成しながら、抗体様タンパク質の安定したコアを形成する。本明細書において記載されるように、これらのループは、特化したリガンド結合部位を生成するために変えることができ、そのような変異は、タンパク質の全体的な安定性を破壊することなく起こすことができる。そのような抗体様タンパク質の例は、「フィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質」であり、これによって、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Ｆｎ３）をベースとするポリペプチドが意味される。一態様において、抗体様タンパク質は、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）をベースとする。
「ポリペプチド」によって、長さ、翻訳後修飾、または機能にかかわらず、２つ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において区別なく使用される。
本明細書における「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同一性の一部としてのいかなる保存的置換をも考慮せず、配列をアライメントし、必要であれば、最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後に、選択された配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当技術分野における技術の範囲内にある様々な方法で、たとえば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者らは、比較されている完全長の配列に関する最大のアライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アライメントを評価するための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって、下記に記載されるように得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著作され、ユーザードキュメンテーションと共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出されており、ここで、それは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されており、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．によって公的に入手可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄ上での使用のためにコンパイルするべきである。すべての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変わらない。
本明細書における目的のために、所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％は（別法では、所与のアミノ酸配列Ｂに対する一定のアミノ酸配列同一性％を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することができる）、以下のように計算される：１００×分数Ｘ／Ｙ、Ｘは、そのプログラムのＡおよびＢのアライメントにおいて配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一のマッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくないであろうということが十分に理解されるであろう。
用語「治療有効量」は、哺乳動物における疾患または障害を治療するのに有効な薬剤の量を指す。癌の場合には、薬剤の治療有効量は、癌細胞の数を低下させてもよい；腫瘍サイズを低下させてもよい；周辺の器官への癌細胞浸潤を阻害してもよい（つまり、ある程度まで遅らせ、好ましくは停止させてもよい）；腫瘍転移を阻害してもよい（つまり、ある程度まで遅らせ、好ましくは停止させてもよい）；腫瘍増殖をある程度まで阻害してもよい；および／または障害と関連する１つもしくは複数の症状ある程度まで軽減してもよい。薬剤が既存の癌細胞の増殖を予防してもよいおよび／またはそれらを死滅させてもよい程度まで、それは、細胞増殖抑制性および／または細胞毒性であってもよい。癌療法については、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）における効能は、たとえば、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）を評価することおよび／または奏効率（ＲＲ）を決定することによって測定することができる。
アミノ酸配列または化合物の半減期は、たとえば、自然のメカニズムによる配列もしくは化合物の分解および／または配列もしくは化合物のクリアランスもしくは隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）により、ポリペプチドの血清濃度がインビボにおいて５０％低下するのにかかる時間として一般に定義することができる。半減期は、薬物動態分析によってなどのように、当技術分野において知られている任意の方法において決定することができる。たとえばM Gibaldi & D Perron "Pharmacokinetics", published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)を参照されたい。
用語「Ｅ／Ｉ結合剤」は、ＥＧＦＲ結合ドメインおよび別個のＩＧＦＩＲＲ結合ドメインを含む二重特異性分子を指す。２つのドメインは、共有結合または非共有結合されていてもよい。例示的なＥ／Ｉ結合剤は、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３およびＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様二量体、つまりＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤である。
概要
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびインスリン様増殖因子受容体（ＩＦＧＲ）は、いくつかのタイプのヒト癌の腫瘍形成において重要な役割を果たす。どちらかの受容体の阻害は、症状発現前のモデルにおいて、および臨床的に、腫瘍増殖を有効に低下させる。ＥＧＦＲ経路が遮断されると、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）腫瘍モデルでの増殖を駆動するためにＩＧＦＲ経路への転換が誘発される。そのため、両方の受容体の遮断は、経路転換を抑えることによって、どちらかの経路のみを遮断することに比べて優れた効能を同時に達成するかもしれない。例示的な実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤の活性は、Ｅ／Ｉ結合剤の単量体の構成成分と比較して相乗的である。
本明細書は、とりわけ、本明細書において「Ｅ／Ｉ結合剤」と呼ばれる、ＥＧＦＲおよびＩＧＦＩＲに結合する二重特異性分子を記載する。出願人は、そのような二重特異性分子が、対応する単一特異的結合剤よりも大きな効力で癌モデル細胞系の増殖を阻害することを見出した（たとえば、実施例９および図８を参照されたい）。
Ｅ／Ｉ結合剤は、多数の治療上の適用において、特に癌の治療において有用となるであろう。治療上の適用に加えて、Ｅ／Ｉ結合剤は、ＥＧＦＲおよび／またはＩＧＦＩＲを検出することが望ましい任意の状況において使用され得る。
Ｅ／Ｉ結合剤は、ＥＧＦＲ結合ドメインおよび別個のＩＧＦＩＲ結合ドメインを有する。典型的な結合ドメインは、抗体を含み、そのため、二重特異性抗体は、Ｅ／Ｉ結合剤として機能するように生成され得る。相補的な対のＶＨ領域およびＶＬ領域を含む二重特異性抗体は、当技術分野において知られている。これらの二重特異性抗体は、２対のＶＨおよびＶＬを含み、それぞれのＶＨ／Ｌ対は、単一の抗原に結合する（たとえばHu et al., Cancer Res. 1996 56:3055-306；Neri et al., J. Mol. Biol. 1995 246:367-373；Atwell et al., Mol. Immunol. 1996 33:1301-1312；およびCarter et al., Protein Sci. 1997 6:781-788を参照されたい）。例示的な二重特異性抗体は、二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、つまり、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同じポリペプチド鎖中の軽鎖可変ドメインに結合した重鎖可変ドメインを含む（Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993 90: 6444-6448）。
Ｅ／Ｉ結合剤はまた、リガンド結合スキャフォールドタンパク質の二量体を包含する。スキャフォールドタンパク質は、文献においてよく記載されており、たとえば、テンダミスタット、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｃｅｃｔｉｎ）ＩＩＩ型ドメイン、アンチカリン、テトラネクチン、およびアンキリンを含む。Ｅ／Ｉ結合剤を生成するために使用され得る追加のスキャフォールドタンパク質は、Binz et al., Nature Biotech 23:1257-1268 (2005)において概説されている。スキャフォールドタンパク質は、三次元構造を決定し、安定化するのに重要な、強固なコア構造または「フレームワーク」を基礎とする。スキャフォールドの固定残基または保存残基の間に、リガンド結合を改変するために無作為化することができるループ、表面、またはキャビティーなどの可変領域が位置する。標的分子への特異的な結合を提供するために、多くの様々なアミノ酸が、固定スキャフォールド残基の間の可変領域中に提供される。
例示的なリガンド結合スキャフォールドタンパク質は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Ｆｎ３）をベースとする。フィブロネクチンは、細胞外マトリックスの形成および細胞間相互作用において本質的な役割を果たす、大きなタンパク質であり、それは、小さなドメインの３つの型（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）の多数のリピートから成る。
Ｆｎ３は、小さく、単量体で、可溶性で、かつ安定している。それは、ジスルフィド結合を欠き、そのため、還元条件下で安定である。Ｆｎ３の全体的な構造は、免疫グロブリンフォールドに類似している。Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順に、ベータまたはベータ様ストランド、Ａ；ループ、ＡＢ；ベータまたはベータ様ストランド、Ｂ；ループ、ＢＣ；ベータまたはベータ様ストランド、Ｃ；ループ、ＣＤ；ベータまたはベータ様ストランド、Ｄ；ループ、ＤＥ；ベータまたはベータ様ストランド、Ｅ；ループ、ＥＦ；ベータまたはベータ様ストランド、Ｆ；ループ、ＦＧ；およびベータまたはベータ様ストランド、Ｇを含む。該７つの逆平行β−ストランドは、ベータまたはベータ様ストランドを結合するループから構成される２つの「面」を生成しながら、安定したコアを形成する２つのベータシートとして配置される。ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦは一方の面に位置し、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧは反対の面に位置する。ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧのいずれかまたはすべてが、リガンド結合に関与してもよい。Ｆｎ３には少なくとも１５の異なるモジュールがあり、分子の間の配列相同性は低いが、それらはすべて、三次構造において高い類似性を共有する。
アドネクチン（ＡｄｎｅｃｔｉｎｓＴＭ（登録商標））（Ａｄｎｅｘｕｓ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｒ＆Ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）は、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、つまり、Ｆｎ３の第１０モジュール（１０Ｆｎ３）をベースとするリガンド結合スキャフォールドタンパク質である。天然に存在するヒト１０Ｆｎ３のアミノ酸配列は、配列番号１において記載される。
Figure 2012509900
 配列番号１において、ＡＢループは残基１５〜１６に相当し、ＢＣループは残基２１〜３０に相当し、ＣＤループは残基３９〜４５に相当し、ＤＥループは残基５１〜５６に相当し、ＥＦループは残基６０〜６６に相当し、ＦＧループは残基７６〜８７に相当する。（Xu et al., Chemistry & Biology 2002 9:933-942）。ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは分子の一方の面に沿って整列し、ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループは分子の反対の面に沿って整列する。配列番号１において、ベータストランドＡは残基９〜１４に相当し、ベータストランドＢは残基１７〜２０に相当し、ベータストランドＣは残基３１〜３８に相当し、ベータストランドＤは残基４６〜５０に相当し、ベータストランドＥは残基５７〜５９に相当し、ベータストランドＦは残基６７〜７５に相当し、ベータストランドＧは残基８８〜９４に相当する。ストランドは、対応するループを通して互いに結合しており、たとえば、ストランドＡおよびＢは、ストランドＡ、ループＡＢ、ストランドＢという構成でループＡＢを介して結合している、などである。疎水性コアの形成に関与する残基（「コアアミノ酸残基」）は、配列番号１の以下のアミノ酸：Ｌ８、Ｖ１０、Ａ１３、Ｌ１８、Ｉ２０、Ｗ２２、Ｙ３２、Ｉ３４、Ｙ３６、Ｆ４８、Ｖ５０、Ａ５７、Ｉ５９、Ｌ６２、Ｙ６８、Ｉ７０、Ｖ７２、Ａ７４、Ｉ８８、Ｉ９０、およびＹ９２に対応するアミノ酸を含み、ここに、コアアミノ酸残基は、１文字アミノ酸コード、次いで、配列番号１内でのそれらの位置によって表わされる。たとえば、Dickinson et al., J. Mol. Biol. 236: 1079-1092 (1994)を参照されたい。
上記に記載されるように、配列番号１の残基２１〜３０、５１〜５６、および７６〜８７に対応するアミノ酸残基は、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループをそれぞれ定める。しかしながら、ＩＧＦ−ＩＲまたはＥＧＦＲなどの所望の標的に対する強い親和性を有する１０Ｆｎ３結合剤を達成するために、ループ領域内のすべての残基を修飾する必要があるとは限らないことを理解されたい。たとえば、本明細書において記載される多くの実施例において、配列番号１のアミノ酸２３〜３０、５２〜５５、および７７〜８６に対応する残基だけが、高親和性１０Ｆｎ３結合剤を産生するために修飾された（図４６を参照されたい）。したがって、ある実施形態において、ＢＣループは、配列番号１の残基２３〜３０に対応するアミノ酸によって定められてもよく、ＤＥループは、配列番号１の残基５２〜５５に対応するアミノ酸によって定められてもよく、ＦＧループは、配列番号１の残基７７〜８６に対応するアミノ酸によって定められてもよい。
１０Ｆｎ３は、抗体、特に抗体の可変領域と、構造的かつ機能的に類似している。１０Ｆｎ３ドメインは、「抗体模倣物」または「抗体様タンパク質」として記載されていてもよいが、それらには、従来の抗体を越える多くの利点がある。特に、それらは、抗体と比較して、より良好なフォールディングおよび熱安定性の特性を示し、それらは、ある種の条件下でふさわしいフォールディングを妨害または予防することが知られているジスルフィド結合を欠く。例示的なＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、Ｔｍの平均〜５０℃で主に単量体である。
１０Ｆｎ３のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と類似している。これらのループ領域中のアミノ酸配列の改変は、１０Ｆｎ３の結合特異性を変化させる。ＣＤＲ様ループ以外のタンパク質配列は、免疫グロブリン由来のフレームワーク領域に類似しており、１０Ｆｎ３の構造のコンフォメーションにおいて役割を果たす。１０Ｆｎ３のフレームワーク様領域中の改変は、構造のコンフォメーションがリガンド結合を破壊するほど改変されない程度まで許容可能である。１０Ｆｎ３リガンド特異的結合剤を生成するための方法は、高親和性ＴＮＦα結合剤を開示するＰＣＴ公開ＷＯ００／０３４７８７、ＷＯ０１／６４９４２、およびＷＯ０２／０３２９２５、高親和性ＶＥＧＦＲ２結合剤を開示するＰＣＴ公開ＷＯ２００８／０９７４９７、ならびに高親和性ＩＧＦＩＲ結合剤を開示するＰＣＴ公開ＷＯ２００８／０６６７５２において記載されている。１０Ｆｎ３結合剤および結合剤を選択するための方法について議論する追加の参考文献は、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／０５６９１５、ＷＯ０２／０８１４９７、およびＷＯ２００８／０３１０９８ならびに米国特許出願公開第２００３１８６３８５号を含む。
１０Ｆｎ３スキャフォールドをベースとする抗体様タンパク質は、配列：
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩ（Ｘ）ｎＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶ（Ｘ）ｏＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶ（Ｘ）ｐＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号３２）によって一般に定めることができ、ここに、ｎは１〜２０の整数であり、ｏは１〜２０の整数であり、ｐは１〜４０の整数である。ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、それぞれ、（Ｘ）ｎ、（Ｘ）ｏ、および（Ｘ）ｐによって表わされる。
１０Ｆｎ３、一般に、配列番号１の番号１に対応するアミノ酸残基から始まる。しかしながら、アミノ酸欠失を有するドメインもまた、本発明によって包含される。いくつかの実施形態において、配列番号１の最初の８つのアミノ酸に対応するアミノ酸残基は、欠失している。また、付加配列をＮ末端またはＣ末端に付加してもよい。たとえば、付加的なＭＧ配列は、１０Ｆｎ３のＮ末端に配置され得る。通常、Ｍは切断され、Ｎ末端にＧが残るであろう。いくつかの実施形態において、配列、たとえばＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号９）、ＥＩＤＫＰＣＱ（配列番号１０）、ＥＧＳＧＳ（配列番号９６）、またはＥＧＳＧＣ（配列番号９７）は、１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端に配置され得る。
１０Ｆｎ３、つまり「１０Ｆｎ３スキャフォールド」の非リガンド結合配列は、１０Ｆｎ３がリガンド結合機能および／または構造安定性を保持するという条件で、改変され得る。いくつかの実施形態において、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９、およびＡｓｐ２３のうちの１つまたは複数は、たとえば、非負荷電アミノ酸残基（たとえばＡｓｎ、Ｌｙｓなど）などの他のアミノ酸と交換される。これらの変異は、野生型形態と比較して、中性ｐＨにて、変異体１０Ｆｎ３のより大きな安定性を促進する効果を有することが報告された（ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０４５２３を参照されたい）。有益なまたは中間的な１０Ｆｎ３スキャフォールドにおける様々な追加の改変が開示されている。たとえばBatori et al., Protein Eng. 2002 15(12):1015-20；Koide et al., Biochemistry 2001 40(34):10326-33を参照されたい。
１０Ｆｎ３スキャフォールドは、１つまたは複数の保存的置換によって修飾され得る。１０Ｆｎ３スキャフォールド中の５％、１０％、２０％、またはさらに３０％以上ものアミノ酸が、リガンドに対する１０Ｆｎ３の親和性を実質的に改変することなく、保存的置換によって改変され得る。たとえば、スキャフォールド修飾は、好ましくは、リガンドに対する１０Ｆｎ３結合剤の結合親和性を１００分の１、５０分の１、２５分の１、１０分の１、５分の１、または２分の１未満まで低下させる。かかる変化は、インビボにおいて１０Ｆｎ３の免疫原性を改変する場合があり、免疫原性が減少する場合には、かかる変化は望ましいであろう。本明細書において使用される場合、「保存的置換基」は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似している残基である。すなわち、保存的置換基およびその参照残基は、同様のサイズ、形状、電荷、共有結合もしくは水素結合を形成する能力を含む化学的特性などを有する。好ましい保存的置換は、Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 (1978 & Supp.)において承認された点突然変異について定義された基準を満たすものである。保存的置換の例は、以下のグループ内での置換である：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸；（ｅ）アスパラギン、グルタミン；（ｆ）セリン、トレオニン；（ｇ）リジン、アルギニン、メチオニン；および（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。
Ｅ 結合剤
一態様において、本開示は、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３ドメインを含む抗体様タンパク質を提供する。ある実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、融合タンパク質または多量体の一部として提供され得る。たとえば、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、少なくとも１つの第２の１０Ｆｎ３結合ドメインに共有結合または非共有結合され得る。第２の１０Ｆｎ３結合ドメインは、ＥＧＦＲまたは異なる標的に結合してもよい。例示的な実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合され得る。
例示的な実施形態において、本明細書において記載されるＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３タンパク質は、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、または１０ｐＭ未満のＫＤでＥＧＦＲに結合する。
例示的な実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３タンパク質のＢＣループは、配列番号１のアミノ酸２３〜３０に相当し、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３タンパク質のＤＥループは、配列番号１のアミノ酸５２〜５５に相当し、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３タンパク質のＦＧループは、配列番号１のアミノ酸７７〜８６に相当する。
一実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸２９および３０に対応する位置にＹＱを有するＢＣループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸２９および３０に対応する位置にＹＱを有するＢＣループならびに１５アミノ酸長であるＦＧループ、たとえば、配列番号１のアミノ酸７７〜８６に対応する残基の間の５アミノ酸の挿入により長さが５アミノ酸伸長したＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸２９および３０に対応する位置にＹＱを有するＢＣループならびに配列番号１のアミノ酸５４に対応する位置にＶ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、またはＡ残基を有するＤＥループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸２９および３０に対応する位置にＹＱを有するＢＣループ、配列番号１のアミノ酸５４に対応する位置にＶ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、またはＡ残基を有するＤＥループ、ならびに１５アミノ酸長であるＦＧループ、たとえば、配列番号１のアミノ酸７７〜８６に対応する残基の間の５アミノ酸の挿入により長さが５アミノ酸、伸長したＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸２９および３０に対応する位置にＹＱを有するＢＣループならびに配列番号１のアミノ酸７７に対応する位置にＤまたはＮを含むＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸２９および３０に対応する位置にＹＱを有するＢＣループ、ならびに（ｉ）１５アミノ酸長であり（たとえば、配列番号１のアミノ酸７７〜８６に対応する残基の間の５アミノ酸の挿入により長さが５アミノ酸伸長したＦＧループ）、かつ（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸７７に対応する位置にＤまたはＮを含むＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸５４に対応する位置にＶ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、またはＡ残基を含むＤＥループおよび配列番号１のアミノ酸７７に対応する位置にＤまたはＮを含むＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸５４に対応する位置にＶ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、またはＡ残基を含むＤＥループ、ならびに（ｉ）１５アミノ酸長であり（たとえば、配列番号１のアミノ酸７７〜８６に対応する残基の間の５アミノ酸の挿入により長さが５アミノ酸伸長したＦＧループ）、かつ（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸７７に対応する位置にＤまたはＮを含むＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸２９および３０に対応する位置にＹＱを有するＢＣループ、配列番号１のアミノ酸５４に対応する位置にＶ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、またはＡ残基を含むＤＥループ、ならびに配列番号１のアミノ酸７７に対応する位置にＤまたはＮを含むＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸２９および３０に対応する位置にＹＱを有するＢＣループ、配列番号１のアミノ酸５４に対応する位置にＶ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、またはＡ残基を含むＤＥループ、ならびに（ｉ）１５アミノ酸長であり（たとえば、配列番号１のアミノ酸７７〜８６に対応する残基の間の５アミノ酸の挿入により長さが５アミノ酸伸長したＦＧループ）、かつ（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸７７に対応する位置にＤまたはＮを含むＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＸＹＱを含むＢＣループ、アミノ酸配列ＸＸ（Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ａ）Ｘを含むＤＥループ、およびアミノ酸配列（Ｄ／Ｎ）Ｘｎを含むＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは９〜１４のアミノ酸である、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。例示的な実施形態において、ｎは１４アミノ酸である。
他の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＸＹＱを含む配列番号１のアミノ酸２３〜３０に対応するＢＣループ、アミノ酸配列ＸＸ（Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ａ）Ｘを含む配列番号１のアミノ酸５２〜５５に対応するＤＥループ、およびアミノ酸配列（Ｄ／Ｎ）Ｘｎを含む配列番号１のアミノ酸７７〜８６に対応するＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは９〜１４のアミノ酸である、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。例示的な実施形態において、ｎは１４アミノ酸である。
他の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＸＹＱを含むＢＣループ、アミノ酸配列ＸＸ（Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ａ）Ｘを含むＤＥループ、および
ｉ．
（Ｄ／Ｎ）（Ｙ／Ｍ）（Ｙ／Ａ／Ｍ）（Ｙ／Ｈ／Ｆ）（Ｋ／Ｑ／Ｖ）（Ｅ／Ｐ／Ｒ）（Ｙ／Ｔ／Ｋ）Ｘ（Ｅ／Ｙ／Ｑ）（Ｙ／Ｇ／Ｈ）および
ｉｉ．
Ｄ（Ｙ／Ｆ／Ｗ）（Ｙ／Ｆ／Ｋ）（Ｎ／Ｄ／Ｐ）（Ｐ／Ｈ／Ｌ）（Ａ／Ｔ／Ｖ）（Ｔ／Ｄ／Ｓ）（Ｈ／Ｙ／Ｇ）（Ｅ／Ｐ／Ｖ）（Ｙ／Ｈ）（Ｔ／Ｋ／Ｉ）（Ｙ／Ｆ）（Ｈ／Ｎ／Ｑ）（Ｔ／Ｑ／Ｅ）（Ｔ／Ｓ／Ｉ）
から選択されるアミノ酸配列を含むＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸である、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＸＹＱを含むＢＣループ、アミノ酸配列（Ｇ／Ｙ／Ｈ）（Ｄ／Ｍ／Ｇ）（Ｖ／Ｌ／Ｉ）Ｘを含むＤＥループ、およびアミノ酸配列（Ｄ／Ｎ）（Ｙ／Ｍ）（Ｙ／Ａ／Ｍ）（Ｙ／Ｈ／Ｆ）（Ｋ／Ｑ／Ｖ）（Ｅ／Ｐ／Ｒ）（Ｙ／Ｔ／Ｋ）Ｘ（Ｅ／Ｙ／Ｑ）（Ｙ／Ｇ／Ｈ）を含むＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸である、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＸＹＱを含むＢＣループ、アミノ酸配列（Ｇ／Ｙ／Ｈ）（Ｄ／Ｍ／Ｇ）（Ｖ／Ｌ／Ｉ）Ｘを含むＤＥループ、およびアミノ酸配列Ｄ（Ｙ／Ｆ／Ｗ）（Ｙ／Ｆ／Ｋ）（Ｎ／Ｄ／Ｐ）（Ｐ／Ｈ／Ｌ）（Ａ／Ｔ／Ｖ）（Ｔ／Ｄ／Ｓ）（Ｈ／Ｙ／Ｇ）（Ｅ／Ｐ／Ｖ）（Ｙ／Ｈ）（Ｔ／Ｋ／Ｉ）（Ｙ／Ｆ）（Ｈ／Ｎ／Ｑ）（Ｔ／Ｑ／Ｅ）（Ｔ／Ｓ／Ｉ）を含むＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸である、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＸＹＱを含むＢＣループ、アミノ酸配列ＸＸ（Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ａ）Ｘを含むＤＥループ、および
ｉ． ＤＹ（Ａ／Ｙ）ＧＫＰＹＸＥＹ（配列番号４７３）；
ｉｉ． ＤＹ（Ａ／Ｙ）Ｙ（Ｋ／Ｒ／Ｑ／Ｔ）ＰＹＸＥＹ（配列番号４７４）；
ｉｉｉ． （Ｄ／Ｎ）Ｙ（Ａ／Ｙ）（Ｙ／Ｆ）（Ｋ／Ｒ／Ｑ／Ｔ）ＥＹＸＥ（Ｙ／Ｈ）（配列番号４７５）；
ｉｖ． ＤＹＹ（Ｈ／Ｙ）Ｘ（Ｒ／Ｋ）Ｘ（Ｅ／Ｔ）ＹＸ（配列番号４７６）；
ｖ． ＤＹＹ（Ｈ／Ｙ）（Ｋ／Ｈ／Ｑ）（Ｒ／Ｋ）Ｔ（Ｅ／Ｔ）Ｙ（Ｇ／Ｐ）（配列番号４７７）；
ｖｉ． （Ｄ／Ｎ）ＭＭＨＶ（Ｅ／Ｄ）ＹＸＥＹ（配列番号４７８）；
ｖｉｉ． ＤＹＭＨＸＸＹＸＥＹ（配列番号４７９）；および
ｖｉｉｉ． Ｄ（Ｍ／Ｙ）ＹＨＸ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ）ＹＧ（配列番号４８０）；
から選択されるアミノ酸配列を含むＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸である、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＸＹＱを含むＢＣループ、アミノ酸配列ＸＸ（Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ａ）Ｘを含むＤＥループ、および
ｉ． Ｄ（Ｙ／Ｆ）（Ｙ／Ｆ）ＮＰＸＴＨＥＹＸＹＸＸＸ（配列番号４８１）；
ｉｉ． Ｄ（Ｙ／Ｆ）（Ｙ／Ｆ）Ｄ（Ｐ／Ｌ）Ｘ（Ｔ／Ｓ）ＨＸＹＸＹＸＸＸ（配列番号４８２）；および
ｉｉｉ． Ｄ（Ｙ／Ｆ）（Ｋ／Ｒ）ＰＨＸＤＧＰＨ（Ｔ／Ｉ）ＹＸＥ（Ｓ／Ｙ）（配列番号４８３）；
から選択されるアミノ酸配列を含むＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸である、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＸＹＱを含むＢＣループ、アミノ酸配列ＸＸ（Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ａ）Ｘを含むＤＥループ、およびアミノ酸配列（Ｄ／Ｎ）（Ｍ／Ｙ）（Ｍ／Ａ／Ｗ）（Ｈ／Ｆ／Ｙ）（Ｖ／Ｋ）ＥＹ（Ａ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ）Ｅ（Ｙ／Ｈ／Ｄ）を含むＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸である、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
他の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＸＹＱを含むＢＣループ、アミノ酸配列ＸＸ（Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ａ）Ｘを含むＤＥループ、およびアミノ酸配列Ｄ（Ｙ／Ｆ／Ｗ）（Ｙ／Ｆ／Ｋ）（Ｎ／Ｐ／Ｄ）（Ｐ／Ｈ／Ｌ）Ｘ（Ｔ／Ｄ／Ｓ）（Ｈ／Ｇ／Ｙ）（Ｅ／Ｐ／Ｙ）（Ｙ／Ｈ）ＸＹＸＸＸを含むＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸である、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
様々な実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３のＤＥループは、配列（Ｇ／Ｙ／Ｈ）（Ｄ／Ｍ／Ｇ）（Ｖ／Ｌ／Ｉ）Ｘを含んでいてもよい。
他の実施形態において、本発明は、
ｉ． Ｄ（Ｙ／Ｆ）（Ｙ／Ｆ）ＮＰＸＴＨＥＹＸＹＸＸＸ（配列番号４８１）；
ｉｉ． Ｄ（Ｙ／Ｆ）（Ｙ／Ｆ）Ｄ（Ｐ／Ｌ）Ｘ（Ｔ／Ｓ）ＨＸＹＸＹＸＸＸ（配列番号４８２）；および
ｉｉｉ． Ｄ（Ｙ／Ｆ）（Ｋ／Ｒ）ＰＨＸＤＧＰＨ（Ｔ／Ｉ）ＹＸＥ（Ｓ／Ｙ）（配列番号４８３）；
から選択されるアミノ酸配列を含むＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸である、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
ある実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、上記に提供されるコンセンサス配列のいずれかを含む、ただし、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、１つまたは複数の以下の配列を含まないことを条件とする。
ｉ． ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＱＶＰＲＰＭＹＱＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＧＶＲＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＹＭＨＳＥＹＲＱＹＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号４８４）、および
ｉｉ． ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＱＶＰＲＰＭＹＱＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＧＶＲＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＹＭＨＳＥＹＲＱＹＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号４８５）、および
ｉｉｉ． ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＱＶＰＲＰＭＹＱＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＧＶＲＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＹＭＨＳＥＹＲＱＹＰＩＳＩＮＹＲＴＥＩＤＫＰＣＱ（配列番号４８６）。
ある実施形態において、上記に提供されるコンセンサス配列のうちの１つを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、または８０％の同一性を有する。ある実施形態において、上記に提供されるコンセンサス配列のうちの１つを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３の全体的な構造は、免疫グロブリンフォールドに類似している。ある実施形態において、上記に提供されるコンセンサス配列のうちの１つを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、スキャフォールドのコアアミノ酸残基をさらに含む。ある実施形態において、上記に提供されるコンセンサス配列のうちの１つを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号５〜８、５２、６６〜６８、１０６〜１０８、１１２〜１１４、１４０〜１４２、１５５〜１５７、１７０〜１７２、１８２、１８５〜１８７、１９８〜２００、または２１９〜３２７のいずれか１つに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。ある実施形態において、上記に提供されるコンセンサス配列のうちの１つを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号５〜８、５２、６６〜６８、１０６〜１０８、１１２〜１１４、１４０〜１４２、１５５〜１５７、１７０〜１７２、１８２、１８５〜１８７、１９８〜２００、または２１９〜３２７のいずれか１つの、配列番号１のＥ９〜配列番号１のＴ９４に対応するアミノ酸残基のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。ある実施形態において、上記に提供されるコンセンサス配列のうちの１つを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１のスキャフォールドアミノ酸残基に比べて、約０〜２０、０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個の置換、保存的置換、欠失、または付加を有する１０Ｆｎ３スキャフォールドを含む。
ある実施形態において、本発明は、配列番号２１９〜３２７のいずれか１つのアミノ酸２３〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、アミノ酸５２〜５５において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、およびアミノ酸７７〜８６において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。ある実施形態において、本発明は、配列番号２１９〜３２７のいずれか１つのアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、アミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、およびアミノ酸７６〜８７において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。ある実施形態において、本発明は、配列番号２１９〜３２７のいずれか１つに対して少なくとも６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一のアミノ酸配列を含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を提供する。
一実施形態において、５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）を含む抗体様タンパク質が提供され、これは、配列番号５のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号５のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号５のアミノ酸７６〜９２において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｇＤＳＧＲＧＳＹＱＸｈ（配列番号４０）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＧＰＶＨＸｊ（配列番号４２）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＨＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＸｌ（配列番号４４）を有するＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＳＷＤＳＧＲＧＳＹＱ（配列番号３９）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＧＰＶＨＴ（配列番号４１）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＨＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＰ（配列番号４３）を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号５または６に対して少なくとも８０、９０、９５、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）を含む抗体様タンパク質が提供され、これは、配列番号７のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号７のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号７のアミノ酸７６〜８７において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｍＶＡＧＡＥＤＹＱＸｎ（配列番号３４）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｏＨＤＬＶＸｐ（配列番号３６）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｑＤＭＭＨＶＥＹＴＥＨＸｒ（配列番号３８）を有するＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、およびｒは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＳＷＶＡＧＡＥＤＹＱ（配列番号３３）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＨＤＬＶＴ（配列番号３５）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＭＭＨＶＥＹＴＥＨＰ（配列番号３７）を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号７または８に対して少なくとも８０、９０、９５、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）を含む抗体様タンパク質が提供され、これは、配列番号８２のアミノ酸２３〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号８２のアミノ酸５１〜５５において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号８２のアミノ酸７６〜８６において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｓＬＰＧＫＬＲＹＱＸｔ（配列番号６０）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｕＨＤＬＲＸｗ（配列番号６２）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｙＮＭＭＨＶＥＹＳＥＹＸｚ（配列番号６４）を有するＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｓ、ｔ、u、ｗ、ｙ、およびｚは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＬＰＧＫＬＲＹＱ（配列番号５９の残基３〜１３）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＨＤＬＲ（配列番号６１の残基１〜５）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＮＭＭＨＶＥＹＳＥＹ（配列番号６３の残基１〜１１）を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号５２または８２に対して少なくとも８０、９０、９５、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）を含む抗体様タンパク質が提供され、これは、配列番号１０６のアミノ酸２３〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１０６のアミノ酸５１〜５５において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１０６のアミノ酸７６〜８６において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｇＨＥＲＤＧＳＲＱＸｈ（配列番号１３４）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸiＧＧＶＲＸｊ（配列番号１３５）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸＫＤＹＦＮＰＴＴＨＥＹＩＹＱＴＴＸｌ（配列番号１３６）を有するＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＳＷＨＥＲＤＧＳＲＱ（配列番号１０９）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＧＧＶＲＴ（配列番号１１０）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＹＦＮＰＴＴＨＥＹＩＹＱＴＴＰ（配列番号１１１）を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１０６〜１０８のいずれか１つに対して少なくとも８０、９０、９５、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）を含む抗体様タンパク質が提供され、これは、配列番号１１２のアミノ酸２３〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１１２のアミノ酸５１〜５５において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１１２のアミノ酸７６〜８６において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｇＷＡＰＶＤＲＹＱＸｈ（配列番号１３７）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＲＤＶＹＸｊ（配列番号１３８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＸｌ（配列番号１３９）を有するＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＳＷＷＡＰＶＤＲＹＱ（配列番号１１５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＲＤＶＹＴ（配列番号１１６）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＰ（配列番号１１７）を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１１２〜１１４のいずれか１つに対して少なくとも８０、９０、９５、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）を含む抗体様タンパク質が提供され、これは、配列番号１４１のアミノ酸１３〜２２において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１４１のアミノ酸４３〜４８において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１４１のアミノ酸６８〜８４において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｇＴＱＧＳＴＨＹＱＸｈ（配列番号１４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＧＭＶＹＸｊ（配列番号１４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＹＦＤＲＳＴＨＥＹＫＹＲＴＴＸｌ（配列番号１４８）を有するＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＳＷＴＱＧＳＴＨＹＱ（配列番号１４３）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＧＭＶＹＴ（配列番号１４４）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＹＦＤＲＳＴＨＥＹＫＹＲＴＴＰ（配列番号１４５）を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１４０〜１４２のいずれか１つに対して少なくとも８０、９０、９５、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）を含む抗体様タンパク質が提供され、これは、配列番号１５６のアミノ酸１３〜２２において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１５６のアミノ酸４３〜４８において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１５６のアミノ酸６８〜８４において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｇＹＷＥＧＬＰＹＱＸｈ（配列番号１６１）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＲＤＶＮＸｊ（配列番号１６２）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＷＹＮＰＤＴＨＥＹＩＹＨＴＩＸｌ（配列番号１６３）を有するＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＳＷＹＷＥＧＬＰＹＱ（配列番号１５８）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＲＤＶＮＴ（配列番号１５９）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＷＹＮＰＤＴＨＥＹＩＹＨＴＩＰ（配列番号１６０）を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１５５〜１５７のいずれか１つに対して少なくとも８０、９０、９５、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）を含む抗体様タンパク質が提供され、これは、配列番号１７１のアミノ酸１３〜２２において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１７１のアミノ酸４３〜４８において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１７１のアミノ酸６８〜８４において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｇＡＳＮＲＧＴＹＱＸｈ（配列番号１７６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＧＧＶＳＸｊ（配列番号１７７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＡＦＮＰＴＴＨＥＹＮＹＦＴＴＸｌ（配列番号１７８）を有するＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＳＷＡＳＮＲＧＴＹＱ（配列番号１７３）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＧＧＶＳＴ（配列番号１７４）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＡＦＮＰＴＴＨＥＹＮＹＦＴＴＰ（配列番号１７５）を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１７０〜１７２のいずれか１つに対して少なくとも８０、９０、９５、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）を含む抗体様タンパク質が提供され、これは、配列番１８６のアミノ酸１３〜２２において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１８６のアミノ酸４３〜４８において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１８６のアミノ酸６８〜８４において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｇＤＡＰＴＳＲＹＱＸｈ（配列番号１９０）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＧＧＬＳＸｊ（配列番号１９１）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＸｌ（配列番号１３９）を有するＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＳＷＤＡＰＴＳＲＹＱ（配列番号１８８）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＧＧＬＳＴ（配列番号１８９）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＰ（配列番号１１７）を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１８５〜１８７のいずれか１つに対して少なくとも８０、９０、９５、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）を含む抗体様タンパク質が提供され、これは、配列番号１９９のアミノ酸１３〜２２において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１９９のアミノ酸４３〜４８において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番１９９のアミノ酸６８〜８４において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｇＤＡＧＡＶＴＹＱＸｈ（配列番号２０３）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＧＧＶＲＸｊ（配列番号１３５）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＹＸｌ（配列番号２０４）を有するＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＳＷＤＡＧＡＶＴＹＱ（配列番号２０１）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＧＧＶＲＴ（配列番号１１０）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＹＰ（配列番号２０２）を有するＦＧループを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１９８〜２００のいずれか１つに対して少なくとも８０、９０、９５、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
ある実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３ドメインは、ＥＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３ドメインに共有結合または非共有結合される。例示的な実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号３のアミノ酸７６〜８３において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含み、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数であるか、またはａは２であり、ｂ〜ｆは１であるか、またはａ〜ｆはゼロである。いくつかの実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、９９、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１のスキャフォールドアミノ酸残基に比べて、０〜２０、０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１あたりの置換、保存的置換、欠失、または追加を有する１０Ｆｎ３スキャフォールドを含む。ある実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３の対応するループ配列に比べて、約０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個の置換、保存的置換、欠失、または付加を有する。
１０Ｆｎ３ Ｅ／Ｉ結合剤
本開示の一態様は、抗体様タンパク質多量体から構築されたＥ／Ｉ結合剤を提供する。いくつかの実施形態において、抗体様タンパク質多量体は、少なくとも１つのＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した少なくとも１つのＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を含む。ある実施形態において、本明細書において記載されるＥ／Ｉ結合剤は、単一のポリペプチド鎖として構築されてもよく、ここに、ＥサブユニットおよびＩサブユニットは、どちらかの向き、たとえばＮ末端からＣ末端にＥ−Ｉの向きまたはＩ−Ｅの向きをしていてもよい。
本開示は、一部、ポリペプチドリンカーを介して結合した複数の１０Ｆｎ３が、互いに独立して正しくフォールドし、高親和性結合を保持し、それぞれのドメインがその機能特性を保持するという驚くべき知見に関する（たとえば実施例５〜１０を参照されたい）。さらに、これらのＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、低度の凝集および高い融解温度（Ｔｍ）などの望ましい生物物理的特性を示す（たとえば実施例４を参照されたい）。これらの実施例は、様々なＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤を特徴づける。例示的なＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号４において記載される。例示的なＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号６、８、５２、１０７、１１３、１４０、１５５、１７０、１８５、および１９８において記載される。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、配列番号１において示されるヒト１０Ｆｎ３ドメインに対して少なくとも４０、５０、６０、７０、または８０％同一のアミノ酸配列を独立して有するＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３およびＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む。変異性の多くが、一般に、１つまたは複数のループ中に生じるであろう。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、配列番号３２に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を独立して有するＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３およびＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含み、ここに、ｎは１〜２０の整数であり、ｏは１〜２０の整数であり、ｐは１〜４０の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは８〜１２の整数であり、ｏは４〜８の整数であり、ｐは４〜２８の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは１０であり、ｏは６であり、ｐは１２である。
いくつかの実施形態において、本開示は、ヒト１０Ｆｎ３の対応するループの配列に比べて改変したアミノ酸配列を有するループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有する１０Ｆｎ３の多量体を提供する。「改変した」によって、鋳型配列（対応するヒトフィブロネクチンドメイン）に比べて１つまたは複数のアミノ酸配列改変を意味し、アミノ酸付加、欠失、および置換を含む。アミノ酸配列の改変は、一般に核酸コード配列の意図的、盲目的、または自発的な配列変異を通して達成されてもよく、任意の技術、たとえばＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、または化学的ＤＮＡ合成によって生じてもよい。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、天然に存在するアミノ酸で置換する、または該アミノ酸を付加することによって改変される。
いくつかの実施形態において、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される１つまたは複数のループは、対応するヒトフィブロネクチンループに比べて長さを伸長してもよく、または短縮してもよい。特に、ヒト１０Ｆｎ３のＦＧループは、１２残基長であるのに対して、抗体重鎖中の対応するループは、４〜２８残基の範囲である。そのため、抗原結合を最適化するために、１０Ｆｎ３のＦＧループの長さは、抗原結合において最大限の柔軟性および親和性を得るために、長さおよび配列が改変され得る。
１０Ｆｎ３分子のいくつかの実施形態において、改変されたＢＣループは、１０までのアミノ酸置換、９までのアミノ酸欠失、１０までのアミノ酸挿入、または置換、欠失、もしくは挿入の組合せを有する。いくつかの実施形態において、改変されたＤＥループは、６までのアミノ酸置換、５までのアミノ酸欠失、１４までのアミノ酸挿入、または置換および欠失もしくは挿入の組合せを有する。いくつかの実施形態において、ＦＧループは、１２までのアミノ酸置換、１１までのアミノ酸欠失、２８までのアミノ酸挿入、または置換および欠失もしくは挿入の組合せを有する。
天然に存在する１０Ｆｎ３は、ＦＧループ中に「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」（ＲＧＤ）インテグリン結合モチーフを含む。１０Ｆｎ３の好ましい多量体は、ＲＧＤインテグリン結合モチーフを欠く。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ｂ）配列番号３のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号３のアミノ酸７６〜８３において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、ａ）配列番号５のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号５のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号５のアミノ酸７６〜９２において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号５に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、９９、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、９９、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、配列番号２０、２１、２３、２４、９０、９２、１０１、または１０３に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、９９、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ｂ）配列番号３のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号３のアミノ酸７６〜８３において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、ａ）配列番号７のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号７のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号７のアミノ酸７６〜８７において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号７に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、配列番号２６、２７、２９、３０、８９、９１、１００、または１０２に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ｂ）配列番号３のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号３のアミノ酸７６〜８３において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、ａ）配列番号８２アミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号８２のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番８２のアミノ酸７６〜８７において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号８２に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、配列番号５３、５４、８７、８８、９８、９９、１０４、または１０５に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ｂ）配列番号３のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号３のアミノ酸７６〜８３において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、ａ）配列番号１０６のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１０６のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１０６のアミノ酸７６〜９２において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１０６に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、配列番号１１８〜１２５に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ｂ）配列番号３のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号３のアミノ酸７６〜８３において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、ａ）配列番号１１２のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１１２のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１１２のアミノ酸７６〜９２において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１１２に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、配列番号１２６〜１３３に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ｂ）配列番号３のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号３のアミノ酸７６〜８３において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、ａ）配列番号１４１のアミノ酸１３〜２２において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１４１のアミノ酸４３〜４８において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１４１のアミノ酸６８〜８４において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１４０、１４１、１４２、または３００に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、配列番号１４９〜１５４に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ｂ）配列番号３のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号３のアミノ酸７６〜８３において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、ａ）配列番号１５６のアミノ酸１３〜２２において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１５６のアミノ酸４３〜４８において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１５６のアミノ酸６８〜８４において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１５５、１５６、１５７、または３０５に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、配列番号１５８〜１６６に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ｂ）配列番号３のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号３のアミノ酸７６〜８３において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、ａ）配列番号１７１のアミノ酸１３〜２２において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１７１のアミノ酸４３〜４８において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１７１のアミノ酸６８〜８４において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１７０、１７１、１７２、または３１１に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、配列番号１７９〜１８４に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ｂ）配列番号３のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号３のアミノ酸７６〜８３において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、ａ）配列番号１８６のアミノ酸１３〜２２において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１８６のアミノ酸４３〜４８において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１８６のアミノ酸６８〜８４において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１８５、１８６、１８７、または３２０に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、配列番号１９２〜１９７に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ｂ）配列番号３のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号３のアミノ酸７６〜８３において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、ａ）配列番号１９９のアミノ酸１３〜２２において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１９９のアミノ酸４３〜４８において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１９９のアミノ酸６８〜８４において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１９８、１９９、２００、または３２７に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、配列番号２０５〜２１０に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＸｇＤＳＧＲＧＳＹＱＸｈ（配列番号４０）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＧＰＶＨＸｊ（配列番号４２）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＨＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＸｌ（配列番号４４）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であり、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ａ、ｇ、およびｌは、２であり、ｂ〜ｆおよびｉ〜ｋは、１であり、ｈはゼロである。いくつかの実施形態において、ａ〜ｌはゼロである。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＳＷＤＳＧＲＧＳＹＱ（配列番号３９）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＧＰＶＨＴ（配列番号４１）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＨＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＰ（配列番号４３）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＸｍＶＡＧＡＥＤＹＱＸｎ（配列番号３４）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｏＨＤＬＶＸｐ（配列番号３６）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｑＤＭＭＨＶＥＹＴＥＨＸｒ（配列番号３８）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であり、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、およびｒは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ａおよびｍは、２であり、ｂ〜ｆおよびｏ〜ｒは、１であり、ｎはゼロである。いくつかの実施形態において、ａ〜ｆおよびｍ〜ｒはゼロである。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＳＷＶＡＧＡＥＤＹＱ（配列番号３３）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＨＤＬＶＴ（配列番号３５）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＭＭＨＶＥＹＴＥＨＰ（配列番号３７）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＸｓＬＰＧＫＬＲＹＱＸｔ（配列番号６０）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｕＨＤＬＲＸｗ（配列番号６２）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｙＮＭＭＨＶＥＹＳＥＹＸｚ（配列番号６４）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であり、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｓ、ｔ、ｕ、ｗ、ｙ、およびｚは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ａおよびｓは、２であり、ｂ〜ｆ、ｕ、ｗ、ｙおよびｚは、１であり、ｔはゼロである。いくつかの実施形態において、ａ〜ｆ、ｓ〜ｕ、ｗ、ｙおよびｚはゼロである。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＳＷＬＰＧＫＬＲＹＱ（配列番号５９）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＨＤＬＲＴ（配列番号６１）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＮＭＭＨＶＥＹＳＥＹＰ（配列番号６３）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＸｇＨＥＲＤＧＳＲＱＸｈ（配列番号１３４）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＧＧＶＲＸｊ（配列番号１３５）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＹＦＮＰＴＴＨＥＹＩＹＱＴＴＸｌ（配列番号１３６）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であり、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ａおよびｇは、２であり、ｂ〜ｆおよびｉ〜ｌは、１であり、ｈはゼロである。いくつかの実施形態において、ａ〜ｌはゼロである。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＳＷＨＥＲＤＧＳＲＱ（配列番号１０９）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＧＧＶＲＴ（配列番号１１０）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＹＦＮＰＴＴＨＥＹＩＹＱＴＴＰ（配列番号１１１）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＸｇＷＡＰＶＤＲＹＱＸｈ（配列番号１３７）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＲＤＶＹＸｊ（配列番号１３８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＸｌ（配列番号１３９）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であり、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ａおよびｇは、２であり、ｂ〜ｆおよびｉ〜ｌは、１であり、ｈはゼロである。いくつかの実施形態において、ａ〜ｌはゼロである。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＳＷＷＡＰＶＤＲＹＱ（配列番号１１５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＲＤＶＹＴ（配列番号１１６）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＰ（配列番号１１７）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＸｇＴＱＧＳＴＨＹＱＸｈ（配列番号１４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＧＭＶＹＸｊ（配列番号１４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＹＦＤＲＳＴＨＥＹＫＹＲＴＴＸｌ（配列番号１４８）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であり、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ａおよびｇは、２であり、ｂ〜ｆおよびｉ〜ｌは、１であり、ｈはゼロである。いくつかの実施形態において、ａ〜ｌはゼロである。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＳＷＴＱＧＳＴＨＹＱ（配列番号１４３）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＧＭＶＹＴ（配列番号１４４）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＹＦＤＲＳＴＨＥＹＫＹＲＴＴＰ（配列番号１４５）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＸｇＹＷＥＧＬＰＹＱＸｈ（配列番号１６１）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＲＤＶＮＸｊ（配列番号１６２）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＷＹＮＰＤＴＨＥＹＩＹＨＴＩＸｌ（配列番号１６３）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であり、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ａおよびｇは、２であり、ｂ〜ｆおよびｉ〜ｌは、１であり、ｈはゼロである。いくつかの実施形態において、ａ〜ｌはゼロである。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＳＷＹＷＥＧＬＰＹＱ（配列番号１５８）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＲＤＶＮＴ（配列番号１５９）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＷＹＮＰＤＴＨＥＹＩＹＨＴＩＰ（配列番号１６０）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＸｇＡＳＮＲＧＴＹＱＸｈ（配列番号１７６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＧＧＶＳＸｊ（配列番号１７７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＡＦＮＰＴＴＨＥＹＮＹＦＴＴＸｌ（配列番号１７８）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であり、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ａおよびｇは、２であり、ｂ〜ｆおよびｉ〜ｌは、１であり、ｈはゼロである。いくつかの実施形態において、ａ〜ｌはゼロである。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＳＷＡＳＮＲＧＴＹＱ（配列番号１７３）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＧＧＶＳＴ（配列番号１７４）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＡＦＮＰＴＴＨＥＹＮＹＦＴＴＰ（配列番号１７５）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＸｇＤＡＰＴＳＲＹＱＸｈ（配列番号１９０）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＧＧＬＳＸｊ（配列番号１９１）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＸｌ（配列番号１３９）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であり、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ａおよびｇは、２であり、ｂ〜ｆおよびｉ〜ｌは、１であり、ｈはゼロである。いくつかの実施形態において、ａ〜ｌはゼロである。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＳＷＤＡＰＴＳＲＹＱ（配列番号１８８）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＧＧＬＳＴ（配列番号１８９）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＰ（配列番号１１７）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＸｇＤＡＧＡＶＴＹＱＸｈ（配列番号２０３）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＧＧＶＲＸ（配列番号１３５）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＹＸｌ（配列番号２０４）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であり、ここに、Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態において、ａおよびｇは、２であり、ｂ〜ｆおよびｉ〜ｌは、１であり、ｈはゼロである。いくつかの実施形態において、ａ〜ｌはゼロである。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、アミノ酸配列ＳＷＤＡＧＡＶＴＹＱ（配列番号２０１）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＧＧＶＲＴ（配列番号１１０）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＹＰ（配列番号２０２）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ｂ）配列番号２１９〜３２７のいずれか１つにおいて記載される、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、ａ）配列番号３のアミノ酸２３〜２９において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸５２〜５５において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号３のアミノ酸７７〜８２において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である（たとえば図４５を参照されたい。それぞれのＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループ配列には下線を引く）。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ｂ）配列番号５〜８、５２、６６〜６８、１０６〜１０８、１１２〜１１４、１４０〜１４２、１５５〜１５７、１７０〜１７２、１８２、１８５〜１８７、１９８〜２００、または２１９〜３２７のいずれか１つの、配列番号１のアミノ酸残基２３〜３０に対応するアミノ酸において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号５〜８、５２、６６〜６８、１０６〜１０８、１１２〜１１４、１４０〜１４２、１５５〜１５７、１７０〜１７２、１８２、１８５〜１８７、１９８〜２００、または２１９〜３２７のいずれか１つの、配列番号１のアミノ酸残基５２〜５５に対応するアミノ酸において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１５〜８、５２、６６〜６８、１０６〜１０８、１１２〜１１４、１４０〜１４２、１５５〜１５７、１７０〜１７２、１８２、１８５〜１８７、１９８〜２００、または２１９〜３２７のアミノ酸残基７７〜８６に対応するアミノ酸において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、ａ）配列番号３のアミノ酸２３〜２９において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸５２〜５５において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号３のアミノ酸７７〜８２において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体である。いくつかの実施形態において、抗体様タンパク質二量体のＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号５〜８、５２、６６〜６８、１０６〜１０８、１１２〜１１４、１４０〜１４２、１５５〜１５７、１７０〜１７２、１８２、１８５〜１８７、１９８〜２００、または２１９〜３２７のいずれか１つの、配列番号１のＥ９〜配列番号１のＴ９４に対応するアミノ酸残基のアミノ酸配列に対して少なくとも８０、９０、９５、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体様タンパク質二量体のＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３の、配列番号１のＥ９〜配列番号１のＴ９４に対応するアミノ酸残基のアミノ酸配列に対して少なくとも８０、９０、９５、９８、９９、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、配列番号２０〜３１、５３〜５８、８７〜９２、９８〜１０５、１１８〜１３３、１４９〜１５４、１６４〜１６９、１７９〜１８４、１９２〜１９７、２０５〜２１０、および２１１〜２１６のいずれか１つに対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、９９、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
好ましくは、本明細書において定義されるＸは、天然に存在するアミノ酸である。
ある実施形態において、本明細書において記載されるＥ結合剤またはＥ／Ｉ結合剤のＥおよび／もしくはＩ単量体は、配列番号１のセリン６２またはセリン９１に対応する位置に、ＳｅｒからＣｙｓへのアミノ酸置換を含有してもよい。
ある態様において、本開示は、ＥＧＦＲ結合を仲介する短いペプチド配列を提供する。そのような配列の例は、配列番号５、７、８２、１０６、１１２、１４１、１５６、１７１、１８６および１９９由来のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループに相当するアミノ酸残基を含む。そのような配列の他の例は、配列番号２１９〜３２７由来のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループに相当するアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、５ｎＭまたはそれ以下より低い解離定数（ＫＤ）でそれぞれのリガンドに結合する。そのような配列は、単離形態でまたは免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン様ドメインなどの特定のタンパク質構造の中に挿入された場合にリガンド結合を仲介しうる。
一実施形態において、抗体様タンパク質二量体は、構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するポリペプチドを含み、ここに、Ａは、ＥＧＦＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインを含む、それから本質的に成る、またはそれから成るポリペプチドであり、Ｂは、ポリペプチドリンカーであり、Ｃは、ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインを含む、それから本質的に成る、それから成るポリペプチドである。他の実施形態において、抗体様タンパク質二量体は、構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するポリペプチドを含み、ここに、Ａは、ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインを含む、それから本質的に成る、またはそれから成るポリペプチドであり、Ｂは、ポリペプチドリンカーであり、Ｃは、ＥＧＦＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインを含む、それから本質的に成る、それから成るポリペプチドである。構造Ａ−Ｂ−Ｃを有する抗体様タンパク質二量体の特定の例は、（ｉ）配列番号２０〜３１、５３〜５８、８７〜９２、９８〜１０５、１１８〜１３３、１４９〜１５４、１６４〜１６９、１７９〜１８４、１９２〜１９７、２０５〜２１０、および２１１〜２１６のいずれか１つにおいて記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは（ｉｉ）配列番号２０〜３１、５３〜５８、８７〜９２、９８〜１０５、１１８〜１３３、１４９〜１５４、１６４〜１６９、１７９〜１８４、１９２〜１９７、２０５〜２１０、および２１１〜２１６において記載されるアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むポリペプチドである。
ある実施形態において、Ａ領域またはＣ領域は、ＥＧＦＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであり、１０Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に構造：ベータストランドＡ、ループＡＢ、ベータストランドＢ、ループＢＣ、ベータストランドＣ、ループＣＤ、ベータストランドＤ、ループＤＥ、ベータストランドＥ、ループＥＦ、ベータストランドＦ、ループＦＧ、ベータストランドＧを有し、（ｉ）ＢＣループは、配列番号３３もしくは３４のアミノ酸配列を有し、ＤＥループは、配列番号３５もしくは３６のアミノ酸配列を有し、ＦＧループは、配列番号３７もしくは３８のアミノ酸配列を有し、（ｉｉ）ＢＣループは、配列番号３９もしくは４０のアミノ酸配列を有し、ＤＥループは、配列番号４１もしくは４２のアミノ酸配列を有し、ＦＧループは、配列番号４３もしくは４４のアミノ酸配列を有し、（ｉｉｉ）ＢＣループは、配列番号５９もしくは６０のアミノ酸配列を有し、ＤＥループは、配列番号６１もしくは６２のアミノ酸配列を有し、ＦＧループは、配列番号６３もしくは６４のアミノ酸配列を有し、（ｉｖ）ＢＣループは、配列番号１０９もしくは１３４のアミノ酸配列を有し、ＤＥループは、配列番号１１０もしくは１３５のアミノ酸配列を有し、ＦＧループは、配列番号１１１もしくは１３６のアミノ酸配列を有し、（ｖ）ＢＣループは、配列番号１１５もしくは１３７のアミノ酸配列を有し、ＤＥループは、配列番号１１６もしくは１３８のアミノ酸配列を有し、ＦＧループは、配列番号１１７もしくは１３９のアミノ酸配列を有し、（ｖｉ）ＢＣループは、配列番号１４３もしくは１４６のアミノ酸配列を有し、ＤＥループは、配列番号１４４もしくは１４７のアミノ酸配列を有し、ＦＧループは、配列番号１４５もしくは１４８のアミノ酸配列を有し、（ｖｉｉ）ＢＣループは、配列番号１５８もしくは１６１のアミノ酸配列を有し、ＤＥループは、配列番号１５９もしくは１６２のアミノ酸配列を有し、ＦＧループは、配列番号１６０もしくは１６３のアミノ酸配列を有し、（ｖｉｉｉ）ＢＣループは、配列番号１７３もしくは１７６のアミノ酸配列を有し、ＤＥループは、配列番号１７４もしくは１７７のアミノ酸配列を有し、ＦＧループは、配列番号１７５もしくは１７８のアミノ酸配列を有し、（ｉｘ）ＢＣループは、配列番号１８８もしくは１９０のアミノ酸配列を有し、ＤＥループは、配列番号１８９もしくは１９１のアミノ酸配列を有し、ＦＧループは、配列番号１１７もしくは１３９のアミノ酸配列を有し、（ｘ）ＢＣループは、配列番号２０１もしくは２０３のアミノ酸配列を有し、ＤＥループは、配列番号１１０もしくは１３５のアミノ酸配列を有し、ＦＧループは、配列番号２０２もしくは２０４のアミノ酸配列を有し、または（ｘｉ）ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、配列番号２１９〜３２７のいずれか１つにおいて記載されるアミノ酸配列を有し（たとえば図４５を参照されたい。配列番号２１９〜３２７のそれぞれのＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループには下線を引く）、１０Ｆｎ３ドメインは、フォールドして、抗体重鎖可変領域様構造になり、ポリペプチドは、１００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲに結合する。ＥＧＦＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、好ましくは、フォールドして、７つのベータストランドが互いに包み合う２つのベータシートの間に分布して、安定したコアを形成し、ベータストランドが溶媒に曝露されている６つのループによって結合された構造になる。例示的な実施形態において、１０Ｆｎ３ドメインは、８０〜１５０アミノ酸長である。
例示的な実施形態において、Ａ領域またはＣ領域は、下記に示される配列番号８３〜８５および４６６〜４７２から成る群から選択される配列を有する、１００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインである。
Figure 2012509900
配列番号８３〜８５および４６６〜４７２において、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、太字で示される固定配列を有し、または太字で示される配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一の配列を有し、ＡＢループは、Ｘｎ１によって表わされ、ＣＤは、Ｘｎ２によって表わされ、ＥＦループは、Ｘｎ３によって表わされ、ベータストランドＡ〜Ｇには、下線を引く。Ｘは、任意のアミノ酸を表わし、Ｘに後続する下付き文字は、アミノ酸の数の整数を表わす。特に、ｎ１は、約１〜１５、２〜１５、１〜１０、２〜１０、１〜８、２〜８、１〜５、２〜５、１〜４、２〜４、１〜３、２〜３、または１〜２個のアミノ酸であってもよく、ｎ２およびｎ３は、それぞれ、独立して、約２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜８、５〜２０、５〜１５、５〜１０、５〜８、６〜２０、６〜１５、６〜１０、６〜８、２〜７、５〜７、または６〜７個のアミノ酸であってもよく、ａ１〜ａ６は、それぞれ、独立して、約０〜１０、０〜５、１〜１０、１〜５、または２〜５のアミノ酸を含んでもよい。好ましい実施形態において、ｎ１は２アミノ酸であり、ｎ２は７アミノ酸であり、ｎ３は７アミノ酸であり、ａ１〜ａ６は０アミノ酸である。ベータストランドの配列は、配列番号１において示される対応するアミノ酸に比べて、７つのスキャフォールド領域すべてにわたって、約０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個の置換、欠失、または付加を有していてもよい。例示的な実施形態において、ベータストランドの配列は、配列番号１において示される対応するアミノ酸に比べて、７つのスキャフォールド領域すべてにわたって、約０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個の保存的置換を有していてもよい。ある実施形態において、コアアミノ酸残基は、固定されており、任意の置換、保存的置換、欠失、または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。ある実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤は、以下のアミノ酸配列のうちの１つによって表わされる。
Figure 2012509900
配列番号６６〜６８、１０８、１１４、１４１、１５６、１７１、１８６、および１９９において、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループの配列は、太字で示される固定配列を有し、または太字で示される配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一の配列を有し、下線を引いた残りの配列（たとえば７つのベータストランドならびにＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループの配列）は、配列番号６６〜６８、１０８、１１４、１４１、１５６、１７１、１８６、および１９９において示される対応するアミノ酸に比べて、約０〜２０、０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個の置換、保存的置換、欠失、または付加を有する。ある実施形態において、コアアミノ酸残基は、固定されており、任意の置換、保存的置換、欠失、または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。ＥＧＦＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、所望により、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１アミノ酸長のＮ末端伸長を含んでいてもよい。例示的なＮ末端伸長（１文字アミノ酸コードによって表わされる）は、Ｍ、ＭＧ、Ｇ、ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号６９）、ＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号７０）、およびＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号７１）または配列番号６９、７０、もしくは７１のいずれか１つのＮ末端切断型を含む。他の適したＮ末端伸長は、たとえば、ＸｎＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号７２）、ＸｎＤＶＰＲＤＬ（配列番号７３）、ＸｎＶＰＲＤＬ（配列番号７４）、ＸｎＰＲＤＬ（配列番号７５）、ＸｎＲＤＬ（配列番号７６）、ＸｎＤＬ（配列番号７７）、またはＸｎＬを含み、ｎ＝０、１、または２アミノ酸であり、ｎ＝１である場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２である場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである。ＥＧＦＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、所望により、Ｃ末端テールを含んでいてもよい。例示的なＣ末端テールは、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１アミノ酸長のポリペプチドを含む。Ｃ末端テールの特定の例は、ＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号９）、ＥＩＤＫＰＣＱ（配列番号１０）、およびＥＩＤＫ（配列番号７８）を含む。他の実施形態において、適したＣ末端テールは、たとえば、以下のアミノ酸配列（１文字アミノ酸コードによって表わされる）：Ｅ、ＥＩ、ＥＩＤ、ＥＩＤＫＰ（配列番号７９）、ＥＩＤＫＰＳ（配列番号８０）、またはＥＩＤＫＰＣ（配列番号８１）のうちの１つを含む、配列番号９、１０、または７８のＣ末端切断型断片であってもよい。他の適したＣ末端テールは、たとえば、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳ、ＥＧＣ、ＥＧＳＧＳ（配列番号９６）、ＥＧＳＧＣ（配列番号９７）、またはＥＩＥＫ（配列番号２１７）を含む。ある実施形態において、ＥＧＦＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端伸長およびＣ末端テールの両方を含む。例示的な実施形態において、Ａ領域は、ＧｌｙまたはＭｅｔ−Ｇｌｙで始まるＮ末端伸長およびシステイン残基を含有していないＣ末端伸長を含み、Ｂ領域は、Ｍｅｔで始まらないＮ末端伸長およびシステイン残基を含むＣ末端伸長を含む。ＥＧＦＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインの特定の例は、（ｉ）配列番号５〜８、５２、６６〜６８、８２〜８５、１０６〜１０８、１１２〜１１４、１４０〜１４２、１５５〜１５７、１７０〜１７２、１８５〜１８７、１９８〜２００、および２１９〜３２７のいずれか１つにおいて記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは（ｉｉ）配列番号５〜８、５２、６６〜６８、８２〜８５、１０６〜１０８、１１２〜１１４、１４０〜１４２、１５５〜１５７、１７０〜１７２、１８５〜１８７、１９８〜２００、および２１９〜３２７のいずれか１つにおいて記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むポリペプチドである。
ある実施形態において、Ａ領域またはＣ領域は、ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであり、１０Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に構造：ベータストランドＡ、ループＡＢ、ベータストランドＢ、ループＢＣ、ベータストランドＣ、ループＣＤ、ベータストランドＤ、ループＤＥ、ベータストランドＥ、ループＥＦ、ベータストランドＦ、ループＦＧ、ベータストランドＧを有し、ＢＣループは、配列番号４５または４６のアミノ酸配列を有し、ＤＥループは、配列番号４７もしくは４８のアミノ酸配列を有し、ＦＧループは、配列番号４９もしくは５０のアミノ酸配列を有し、１０Ｆｎ３ドメインは、フォールドして、抗体重鎖可変領域様構造になり、ポリペプチドは、１００ｎＭ未満のＫＤでＩＧＦ−ＩＲに結合する。ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、好ましくは、フォールドして、７つのベータストランドが互いに包み合う２つのベータシートの間に分布して、安定したコアを形成し、ベータストランドが溶媒に曝露されている６つのループによって結合された構造になる。例示的な実施形態において、１０Ｆｎ３ドメインは、８０〜１５０アミノ酸長である。
例示的な実施形態において、Ａ領域またはＣ領域は、下記に示される配列を有する、１００ｎＭ未満のＫＤでＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインである。
Figure 2012509900
配列番号８６において、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、太字で示される固定配列を有しまたは太字で示される配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一の配列を有し、ＡＢループは、Ｘｎ１によって表わされ、ＣＤループは、Ｘｎ２によって表わされ、ＥＦループは、Ｘｎ３によって表わされ、ベータストランドＡ〜Ｇには、下線を引く。Ｘは、任意のアミノ酸を表わし、Ｘに後続する下付文字は、アミノ酸の数の整数を表わす。特に、ｎ１は、約１〜１５、２〜１５、１〜１０、２〜１０、１〜８、２〜８、１〜５、２〜５、１〜４、２〜４、１〜３、２〜３、または１〜２個のアミノ酸であってもよく、ｎ２およびｎ３は、それぞれ、独立して、約２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜８、５〜２０、５〜１５、５〜１０、５〜８、６〜２０、６〜１５、６〜１０、６〜８、２〜７、５〜７、または６〜７個のアミノ酸であってもよく、ａ１〜ａ６は、それぞれ、独立して、０〜１０、０〜５、１〜１０、１〜５、または２〜５個ののアミノ酸を含んでもよい。好ましい実施形態において、ｎ１は２アミノ酸であり、ｎ２は７アミノ酸であり、ｎ３は７アミノ酸であり、ａ１〜ａ６は０アミノ酸である。ベータストランドの配列は、配列番号１において示される対応するアミノ酸に比べて、７つのスキャフォールド領域すべてにわたって、約０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個の置換、欠失、または付加を有していてもよい。例示的な実施形態において、ベータストランドの配列は、配列番号１において示される対応するアミノ酸に比べて、７つのスキャフォールド領域すべてにわたって、約０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個の保存的置換を有していてもよい。ある実施形態において、コアアミノ酸残基は、固定されており、任意の置換、保存的置換、欠失、または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。ある実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ結合剤は、以下のアミノ酸配列によって表わされる。
Figure 2012509900
配列番号６５において、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループの配列は、太字で示される固定配列を有し、または太字で示される配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一の配列を有し、下線を引いた残りの配列（たとえば７つのベータストランドならびにＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループの配列）は、配列番号６５において示される対応するアミノ酸に比べて、約０〜２０、０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個の置換、保存的置換、欠失、または付加を有する。ある実施形態において、コアアミノ酸残基は、固定されており、任意の置換、保存的置換、欠失、または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、所望により、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１アミノ酸長のＮ末端伸長を含んでいてもよい。例示的なＮ末端伸長（１文字アミノ酸コードによって表わされる）は、Ｍ、ＭＧ、Ｇ、ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号６９）、ＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号７０）、およびＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号７１）または配列番号６９、７０、もしくは７１のいずれか１つのＮ末端切断型を含む。他の適したＮ末端伸長は、たとえば、ＸｎＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号７２）、ＸｎＤＶＰＲＤＬ（配列番号７３）、ＸｎＶＰＲＤＬ（配列番号７４）、ＸｎＰＲＤＬ（配列番号７５）、ＸｎＲＤＬ（配列番号７６）、ＸｎＤＬ（配列番号７７）、またはＸｎＬを含み、ｎ＝０、１、または２アミノ酸であり、ｎ＝１である場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２である場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである。ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、所望により、Ｃ末端テールを含んでいてもよい。例示的なＣ末端テールは、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１アミノ酸長であるポリペプチドを含む。Ｃ末端テールの特定の例は、ＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号９）、ＥＩＤＫＰＣＱ（配列番号１０）、およびＥＩＤＫ（配列番号７８）を含む。他の実施形態において、適したＣ末端テールは、たとえば、以下のアミノ酸配列（１文字アミノ酸コードによって表わされる）：Ｅ、ＥＩ、ＥＩＤ、ＥＩＤＫＰ（配列番号７９）、ＥＩＤＫＰＳ（配列番号８０）、またはＥＩＤＫＰＣ（配列番号８１）のうちの１つを含む、配列番号９、１０、または７８のＣ末端切断型断片であってもよい。他の適したＣ末端テールは、たとえば、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳ、ＥＧＣ、ＥＧＳＧＳ（配列番号９６）、ＥＧＳＧＣ（配列番号９７）、またはＥＩＥＫ（配列番号２１７）を含む。ある実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端伸長およびＣ末端テールの両方を含む。例示的な実施形態において、Ａ領域は、ＧｌｙまたはＭｅｔ−Ｇｌｙで始まるＮ末端伸長およびシステイン残基を含有していないＣ末端伸長を含み、Ｂ領域は、Ｍｅｔで始まらないＮ末端伸長およびシステイン残基を含むＣ末端伸長を含む。ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインの特定の例は、（ｉ）配列番号３、４、６５、もしくは８６のいずれか１つにおいて記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは（ｉｉ）配列番号３、４、６５、もしくは８６のいずれか１つにおいて記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むポリペプチドである。
Ｂ領域は、本明細書においてさらに記載されるリンカーである。例示的な実施形態において、Ｂ領域は、ポリペプチドリンカーである。例示的なポリペプチドリンカーは、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２アミノ酸を有するポリペプチドを含む。適したポリペプチドリンカーの特定の例は、本明細書においてさらに記載され、たとえば、配列番号１１〜１９、５１、９３〜９５、および２１８から成る群から選択される配列を有するリンカーを含む。ある実施形態において、リンカーは、本明細書において記載されるＣ末端テールポリペプチド、本明細書において記載されるＮ末端伸長ポリペプチド、またはその組合せであってもよい。
一実施形態において、抗体様タンパク質二量体は、構造Ｘ１−Ａ−Ｘ２−Ｂ−Ｘ３−Ｃ−Ｘ４を有するポリペプチドを含み、Ｘ１は、任意のＮ末端伸長であり、Ａは、ＥＧＦＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインであり、Ｘ２は、任意のＣ末端テールであり、Ｂは、ポリペプチドリンカーであり、Ｘ３は、任意のＮ末端伸長であり、Ｃは、ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインであり、Ｘ４は、任意のＣ末端テールである。他の実施形態において、抗体様タンパク質二量体は、構造Ｘ１−Ａ−Ｘ２−Ｂ−Ｘ３−Ｃ−Ｘ４を有するポリペプチドを含み、Ｘ１は、任意のＮ末端伸長であり、Ａは、ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインであり、Ｘ２は、任意のＣ末端テールであり、Ｂは、ポリペプチドリンカーであり、Ｘ３は、任意のＮ末端伸長であり、Ｃは、ＥＧＦＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインであり、Ｘ４は、任意のＣ末端テールである。適したＮ末端伸長およびＣ末端テールの特定の例は、上記に記載される。ある実施形態において、１つまたは複数のＸ１、Ｘ２、Ｂ、Ｘ３、またはＸ４は、システイン残基またはリジン残基などのペグ化に適したアミノ酸残基を含んでいてもよい。例示的な実施形態において、Ｘ４は、システイン残基またはリジン残基などのペグ化に適した少なくとも１つのアミノ酸を含む。適したポリペプチドリンカーの特定の例は、下記にさらに記載される。構造Ｘ１−Ａ−Ｘ２−Ｂ−Ｘ３−Ｃ−Ｘ４を有する抗体様タンパク質二量体の特定の例は、（ｉ）配列番号２０〜３１、５３〜５８、８７〜９２、９８〜１０５、１１８〜１３３、１４９〜１５４、１６４〜１６９、１７９〜１８４、１９２〜１９７、２０５〜２１０、および２１１〜２１６のいずれか１つにおいて記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは（ｉｉ）配列番号２０〜３１、５３〜５８、８７〜９２、９８〜１０５、１１８〜１３３、１４９〜１５４、１６４〜１６９、１７９〜１８４、１９２〜１９７、２０５〜２１０、および２１１〜２１６のいずれか１つにおいて記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むポリペプチドである。
ある実施形態において、本明細書において記載される抗体様タンパク質二量体中の他方の１０Ｆｎ３結合ドメインに比べて一方の１０Ｆｎ３結合ドメインの効力を調整することは望ましいかもしれない。たとえば、第１の１０Ｆｎ３ドメインの結合親和性が第２の１０Ｆｎ３ドメインの結合親和性よりも著しく高い場合、第１の１０Ｆｎ３ドメインの生物学的効果は、第２の１０Ｆｎ３ドメインの効果を圧倒することができる。したがって、ある実施形態において、抗体様タンパク質二量体の第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインの結合親和性は互いに類似していること、たとえば、互いに１００倍、３０倍、１０倍、３倍、１倍、０．３倍、もしくは０．１倍以内の結合親和性または互いに０．１倍〜１０倍以内の、０．３倍〜１０倍以内の、０．１倍〜３倍以内の、０．３倍〜３倍以内の、０．１倍〜１倍以内の、０．３倍〜１倍以内の、１倍〜１０倍以内の、３倍〜１０倍以内の、３倍〜３０倍以内の、もしくは１倍〜３倍に以内の結合親和性であることが望ましい場合がある。
コンジュゲーション
抗体様タンパク質の多量体は、共有結合または非共有結合され得る。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３に直接またはポリペプチドリンカーを介して間接的に結合され得る。Ｆｎ３を結合するのに適したリンカーは、個別のドメインが互いと独立してフォールドし、標的分子への高親和性結合を可能にする三次元構造を形成することを可能にするものである。
本開示は、グリシン−セリンベースのリンカー、グリシン−プロリンベースのリンカー、およびアミノ酸配列ＰＳＴＳＴＳＴ（配列番号１２）を有するリンカーを含む、これらの必要条件を満たす多くの適したリンカーを提供する。本明細書において記載される例は、ポリペプチドリンカーを介して結合されるＦｎ３ドメインがそれらの標的結合機能を保持することを実証する。いくつかの実施形態において、リンカーは、グリシン−セリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシン残基およびセリン残基を含み、８〜５０、１０〜３０、および１０〜２０アミノ酸長であってもよい。例として、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１１）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１３）、ＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ（配列番号１４）、ＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ（配列番号１５）、ＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ（配列番号１６）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１７）を有するリンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、グリシン−プロリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシン残基およびプロリン残基を含み、３〜３０、１０〜３０、および３〜２０アミノ酸長であってもよい。例として、アミノ酸配列ＧＰＧＰＧＰＧ（配列番号１８）、ＧＰＧＰＧＰＧＰＧＰＧ（配列番号１９）、およびＧＰＧ（配列番号５１）を有するリンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、プロリン−アラニンベースのリンカーである。これらのリンカーは、プロリン残基およびアラニン残基を含み、３および３０、１０および３０、３〜２０、ならびに６〜１８アミノ酸長であってもよい。そのようなリンカーの例は、配列番号９３、９４、および９５を含む。最適なリンカー長およびアミノ酸組成は、当技術分野においてよく知られている方法により、ルーチン的な実験法によって決定され得ることが意図される。
いくつかの実施形態において、抗体様タンパク質の多量体は、血液または標的組織中のプロテアーゼによって切断可能なプロテアーゼ部位を有するポリペプチドリンカーを介して結合される。そのような実施形態は、より良好なデリバリーまたは治療上の特性またはそのようなタンパク質を別々に産生することと比較してより効率的な産生のために、２つ以上の治療用タンパク質を放出するために使用することができる。
追加のリンカーまたはスペーサー、たとえば配列番号９および１０は、Ｆｎ３ドメインおよびポリペプチドリンカーの間のＦｎ３ドメインのＣ末端に導入され得る。追加のリンカーまたはスペーサーは、Ｆｎ３ドメインおよびポリペプチドリンカーの間のＦｎ３ドメインのＮ末端に導入され得る。
いくつかの実施形態において、抗体様タンパク質の多量体は、直接または多量体リンカーを介して間接的に結合される。多量体リンカーは、１つまたは複数の以下の特徴を有するタンパク質を生成するためにそれぞれのタンパク質成分の間の距離を最適に変えるために使用することができる：１）対象のタンパク質に結合する場合の、１つまたは複数のタンパク質ドメインの結合の立体障害の低下または増加２）タンパク質安定性または可溶性の増加、３）タンパク質凝集の減少、および４）タンパク質の全体的なアビディティー（avidity）または親和性の増加。
いくつかの実施形態において、抗体様タンパク質の多量体は、多量体の糖などの生体適合性ポリマーを介して結合される。多量体の糖は、血液または標的組織中の酵素によって切断可能な酵素切断部位を含むことができる。そのような実施形態は、より良好なデリバリーまたは治療上の特性またはそのようなタンパク質を別々に産生することと比較してより効率的な産生のために、２つ以上の治療用タンパク質を放出するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、抗体様タンパク質の多量体は、ポリオキシアルキレン、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分を介して結合される。抗体様タンパク質は、配列番号１０、８１、９７、または２１８において記載されるリンカーなどのシステイン含有リンカーを含んでいてもよい。ＰＥＧは、リンカー配列中のシステイン成分にコンジュゲートされ、２つのドメインを作動可能に結合してもよい。
薬物動態成分
一態様において、本開示は、薬物動態（ＰＫ）成分をさらに含むＥ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤を提供する。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、抗体様タンパク質の多量体、特に、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３およびＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３の二量体である。改善された薬物動態は、認知された治療上の必要性に従って評価され得る。多くの場合、おそらくタンパク質が投薬の後、血清において利用可能なまま残る時間を増加させることによって、生物学的利用能を増加させることおよび／または服用の間の時間を増加させることは望ましい。いくつかの実例において、タンパク質の血清濃度の継続を長い間にわたって改善する（たとえば、投与直後のおよび次の投与直前のタンパク質の血清濃度中の差異を減少させる）ことは望ましい。Ｅ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤は、哺乳動物（たとえばマウス、ラット、またはヒト）における該ポリペプチドのクリアランス速度を、未修飾ポリペプチドに比べて３分の１よりも大きく低下させる成分に結合され得る。改善された薬物動態についての他の手段は、血清半減期を含んでいてもよく、これは、アルファ相およびベータ相に分けられることが多い。いずれかまたは両方の相は、適切な成分の付加によって著しく改善され得る。
血液からのタンパク質のクリアランスを遅らせる傾向がある成分は、ポリオキシアルキレン成分（たとえばポリエチレングリコール）；糖（たとえばシアル酸）；および耐容性がよいタンパク質成分（たとえばＦｃ、Ｆｃ断片、トランスフェリン、または血清アルブミン）を含む。
いくつかの実施形態において、ＰＫ成分は、米国特許出願公開第２００７／０１７８０８２号および第２００７／０２６９４２２号において記載されるものなどの血清アルブミン結合タンパク質である。
いくつかの実施形態において、ＰＫ成分は、米国特許公開第２００７／０１７８０８２号において記載されるものなどの血清免疫グロブリン結合タンパク質である。
いくつかの実施形態において、ＰＫ成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
ＰＫ修飾抗体様タンパク質多量体の血清クリアランス速度は、未修飾Ｅ／Ｉ結合剤のクリアランス速度に比べて、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらに９０％減少されうる。ＰＫ修飾多量体は、未修飾多量体の半減期に比べて増強された半減期（ｔ１／２）を有していてもよい。ＰＫ結合ポリペプチドの半減期は、未修飾多量体の半減期に比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、もしくは５００％またはさらに１０００％増強され得る。いくつかの実施形態において、多量体半減期は、緩衝生理食塩水中でまたは血清中でなどのように、インビトロにおいて決定される。他の実施形態において、多量体半減期は、血清または動物の他の体液中の多量体の半減期などのインビボ半減期である。
いくつかの実施形態において、ＰＫ成分は、少なくとも１つのジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、多量体の糖、またはポリエチレングリコール成分を介して抗体様タンパク質多量体に結合される。例示的なポリペプチドリンカーは、ＰＳＴＳＴＳＴ（配列番号１２）、ＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号９）、およびＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１３）などのＧＳリンカー、ならびにその多量体を含む。
結合／スクリーニング
本開示は、Ｅ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤、特に、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３およびＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３の二量体などの抗体様タンパク質多量体を提供する。ＥＧＦＲまたはＩＧＦＩＲへの結合は、平衡定数（たとえば解離、ＫＤ）の点からおよび反応速度定数（たとえば、ｏｎ速度定数、ｋｏｎおよびｏｆｆ速度定数、ｋｏｆｆ）の点から評価され得る。いくつかの実施形態において、抗体様タンパク質単量体または多量体は、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、５ｎＭまたはそれ以下より小さいＫＤでＥＧＦＲに結合するであろう。いくつかの実施形態において、抗体様タンパク質多量体は、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、５ｎＭまたはそれ以下より小さいＫＤでＩＧＦＩＲに結合するであろう。ｋｏｆｆが十分に低いか、またはｋｏｎが十分に高い場合には、より高いＫＤ値が許容され得る。
Ｅ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤は、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン、特に、ＥＧＦＲのリガンド結合ドメインを含む、ＥＧＦＲの任意の部分に結合してもよい。ＥＧＦＲへのＥ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤の結合は、ＴＧＦ−アルファおよびＥＧＦを含む１つもしくは複数のリガンドとのＥＧＦＲの相互作用を破壊し、および／または受容体二量体化を破壊しうる。いくつかの実施形態において、Ｅ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤は、ＥＧＦＲへの結合について抗ＥＧＦＲ抗体と競合する。抗ＥＧＦＲ抗体は、パニツムマブ（Ａｍｇｅｎ）、ニモツズマブ（ＹＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ザルツムマブ（Ｇｅｎｍａｂ）、ＥＭＤ７２０００（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）、およびセツキシマブ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む任意の知られている抗ＥＧＦＲ抗体から選択され得る。
いくつかの実施形態において、Ｅ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤は、ＥＧＦＲの下流のシグナリングを阻害する。ＥＧＦＲリガンド結合は、ＥＧＦＲまたは他のＨＥＲファミリーメンバーとのホモまたはヘテロ二量体受容体二量体化を導く。二量体化は、受容体自己リン酸化を促進し、次いで、いくつかのシグナリング経路の活性化を導く。
Ｅ／Ｉ結合剤は、ＩＧＦＩＲの細胞外ドメイン、特に、ＩＧＦＩＲのリガンド結合ドメインを含む、ＩＧＦＩＲの任意の部分に結合してもよい。ＩＧＦＩＲへのＥ／Ｉ結合剤の結合は、１つもしくは複数のリガンド、たとえばＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩとのＩＧＦＩＲの相互作用を破壊し、および／または受容体ヘテロ四量体のアセンブリーを破壊しうる。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ＩＧＦＩＲへの結合について抗ＩＧＦＩＲ抗体と競合する。抗ＩＧＦＩＲ抗体は、任意の知られている抗ＩＧＦＩＲ抗体から選択され得る。
いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ＩＧＦＩＲの下流のシグナリングを阻害する。ＩＧＦ−Ｉ受容体は、２つのタイプのサブユニットから成る：アルファサブユニット（完全に細胞外のものであり、リガンド結合において機能する１３０〜１３５ｋＤａタンパク質）ならびにベータサブユニット（膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有する９５ｋＤａ膜貫通タンパク質）。ＩＧＦＩＲは、一本鎖レセプター前駆体ポリペプチドとして最初に合成され、グリコシル化、タンパク分解性の切断、および共有結合によって処理されて、２つのアルファサブユニットおよび２つのベータサブユニットを含む成熟４６０ｋＤａヘテロ四量体に会合する。ベータサブユニット（複数可）は、リガンド活性化チロシンキナーゼ活性を有する。
ＥＧＦＲおよびＩＧＦＩＲの受容体シグナリングは、ＭＥＫのリン酸化を含むＭＡＰＫ経路を独立して活性化する。他の活性化経路は、ＡＫＴのリン酸化を含むホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路である。受容体シグナリングは、核に伝達され、様々な転写因子の活性化をもたらす。
スクリーニングアッセイは、Ｅ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤を同定し、特徴づけるために設計され得る。表面プラズモン共鳴およびＥＬＩＳＡなどの結合アッセイならびに活性化されたシグナリング経路を検出するアッセイは、当技術分野においてよく知られており、たとえば実施例５を参照されたい。ＥＧＦＲおよびＩＧＦＩＲのリン酸化され、活性化されたアイソフォームに特異的に結合する多くの市販品を含む様々な抗体が生産されてきており、たとえば実施例６および７を参照されたい。下流シグナリング事象はまた、ＡＫＴリン酸化のレベルを測定することによってなどのように、受容体阻害の指標として使用されてもよく、たとえば実施例８を参照されたい。細胞増殖アッセイもまた、ＥＧＦＲシグナリングおよびＩＧＦＩＲシグナリングに対する候補Ｅ／Ｉ結合剤の結合および阻害能をを特徴づけるための有用な方法であり、たとえば実施例９を参照されたい。
ポリマーコンジュゲーション
生体適合性ポリマーへのコンジュゲーションは、抗体様タンパク質多量体を結合し、および／または該タンパク質の薬物動態を改善するために使用され得る。ポリマーの固有性、サイズ、および構造は、活性における許容できない減少を伴うことなく多量体の循環半減期を改善または多量体の抗原性を減少させるように選択される。
本発明において有用なポリマーの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレングリコール）を含むが、これらに限定されない。ポリマーは、特定の構造に限定されず、線状（たとえばアルコキシＰＥＧもしくは二官能性ＰＥＧ）、または分岐、枝分かれ、マルチアーム（たとえば、ポリオールコアに結合したＰＥＧ）、および樹状などのように非線状とすることができる。
典型的に、ＰＥＧおよび他の水溶性ポリマー（つまりポリマー試薬）は、ポリペプチド上の所望の部位に結合するのに適切な、適した活性基を用いて活性化される。したがって、ポリマー試薬は、ポリペプチドとの反応のための反応基を有するであろう。代表的なポリマー試薬および活性成分にこれらのポリマーをコンジュゲートするための方法は、当技術分野においてよく知られており、Zalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992)およびZalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16: 157-182においてさらに記載されている。
典型的に、該ポリマーの重量平均分子量は、約１００ダルトン〜約１５０，０００ダルトンである。生体適合性ポリマーについての例示的な重量平均分子量は、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、および約８０，０００ダルトンを含む。前述のいずれかの総分子量を有する生体適合性ポリマーの分岐バージョンもまた、使用することができる。
いくつかの実施形態において、該ポリマーは、ＰＥＧである。ＰＥＧは、市販で入手可能な、よく知られている水溶性ポリマーであるまたは当技術分野においてよく知られている方法によるエチレングリコールの開環重合によって調製することができる（Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161）。用語「ＰＥＧ」は、ＰＥＧのサイズまたはその末端の修飾を考慮せずに、任意のポリエチレングリコール分子を包含するように広く使用され、式：Ｘ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨによって表わすことができ、ｎは２０〜２３００であり、Ｘは、Ｈまたは末端の修飾、たとえばＣ１〜４アルキルである。ＰＥＧは、結合反応に必要な、分子の化学合成に由来する、または分子の部分の最適な距離のためのスペーサーとして作用する化学基をさらに含有することができる。さらに、そのようなＰＥＧは、ともに結合される１つまたは複数のＰＥＧ側鎖から成り得る。１つを超えるＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、マルチアームＰＥＧまたは分岐ＰＥＧと呼ばれる。分岐ＰＥＧは、たとえば、欧州特許出願公開第４７３０８４Ａ号および米国特許第５，９３２，４６２号において記載されている。
ポリペプチドへのポリマー分子の共有結合を達成するために、ポリマー分子のヒドロキシル末端基は、活性化形態で、つまり反応性官能基を伴って提供されなければならない。適切に活性化されたポリマー分子は、たとえばＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａ．、ＵＳＡ；ＰｏｌｙＭＡＳＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｐｌｃ、ＵＫ；またはＳｕｎＢｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａから市販で入手可能である。別法として、ポリマー分子は、当技術分野において知られている従来の方法によって、たとえばＷＯ９０／１３５４０において開示されるように活性化することができる。活性化ＰＥＧポリマーの特定の例は、以下の線状ＰＥＧ：ＮＨＳ−ＰＥＧ、ＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＢＡ−ＰＥＧ、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＳＡ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、ＳＧ−ＰＥＧ、ＳＣＭ−ＰＥＧ、ＮＯＲ−ＰＥＧ、ＢＴＣ−ＰＥＧ、ＥＰＯＸ−ＰＥＧ、ＮＣＯ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、ＣＤＩ−ＰＥＧ、ＡＬＤ−ＰＥＧ、ＴＲＥＳ−ＰＥＧ、ＶＳ−ＰＥＧ、ＯＰＳＳ−ＰＥＧ、ＩＯＤＯ−ＰＥＧ、およびＭＡＬ−ＰＥＧならびにＰＥＧ２−ＮＨＳ、ＰＥＧ２−ＭＡＬなどの分岐ＰＥＧならびにこれらの両方が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，９３２，４６２号および米国特許第５，６４３，５７５号において開示されるものを含む。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ分子が抗体様タンパク質多量体上のシステイン残基にコンジュゲートされる場合、システイン残基は、タンパク質に天然のものであるのに対して、他の実施形態において、１つまたは複数のシステイン残基は、タンパク質の中に操作されたものである。システイン残基を生成するために、タンパク質コード配列の中に変異を導入してもよい。これは、たとえば、１つまたは複数のアミノ酸残基をシステインに変異させることによって達成され得る。システイン残基に変異させるための好ましいアミノ酸は、セリン、トレオニン、アラニン、および他の親水性残基を含む。好ましくは、システインに変異させられることとなる残基は、表面に曝露した残基である。一次配列またはタンパク質に基づいて残基の表面露出度（ｓｕｒｆａｃｅ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を予測するためのアルゴリズムが当技術分野においてよく知られている。別法では、結合ポリペプチドの設計および作製の基礎となるフレームワークの結晶構造が解明されていることを考えれば（Himanen et al., Nature. (2001) 20-27;414(6866):933-8を参照されたい）、表面残基は、結合ポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって予測され得、したがって、表面に曝露した残基が同定される。いくつかの実施形態において、システイン残基は、抗体様タンパク質多量体の中のＮ末端および／もしくはＣ末端にもしくはその近くに、またはループ領域内に導入される。システイン残基のペグ化は、たとえばＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミド、またはＰＥＧ−オルトピリジル（ｏｒｔｈｏｐｙｒｉｄｙｌ）ジスルフィドを使用して実行され得る。
いくつかの実施形態において、ペグ化抗体様タンパク質多量体は、Ｎ末端アミノ酸のアルファアミノ基に共有結合したＰＥＧ分子を含む。部位特異的Ｎ末端還元的アミノ化が、Pepinsky et al., (2001) JPET, 297,1059および米国特許第５，８２４，７８４号において記載されている。他の利用可能な求核アミノ基を利用するタンパク質の還元的アミノ化のためのＰＥＧ−アルデヒドの使用が、米国特許第４，００２，５３１号において、Wieder et al., (1979) J. Biol. Chem. 254,12579において、およびChamow et al., (1994) Bioconjugate Chem. 5, 133において記載されている。
他の実施形態において、ペグ化抗体様タンパク質多量体は、リンカーに共有結合した１つまたは複数のＰＥＧ分子を含み、これは、次いで、結合ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸残基のアルファアミノ基に結合される。そのようなアプローチは、米国特許出願公開第２００２／００４４９２１号およびＰＣＴ公開ＷＯ９４／０１４５１において開示されている。
いくつかの実施形態において、抗体様タンパク質多量体は、Ｃ末端でペグ化されている。タンパク質は、Ｃ末端アジド−メチオニンの導入およびそれに続くシュタウディンガー反応を介するメチル−ＰＥＧ−トリアリールホスフィン化合物のコンジュゲーションによって、Ｃ末端でペグ化され得る。該Ｃ末端コンジュゲーション方法は、Cazalis et al., C-Terminal Site-Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity, Bioconjug Chem. 2004; 15(5):1005-1009.において記載されている。
サイズ排除（たとえばゲル濾過）クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーなどの当技術分野において知られている従来の分離および精製技術は、ペグ化抗体様タンパク質多量体を精製するために使用することができる。産物はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離され得る。分離され得る産物は、モノ、ジ、トリ、ポリ、および非ペグ化結合ポリペプチドならびに遊離ＰＥＧを含む。モノＰＥＧコンジュゲートの百分率は、組成物中のモノＰＥＧの百分率を増加させるために、溶出ピークのあたりのより広範囲の画分をプールすることによってコントロールすることができる。約９０パーセントのモノＰＥＧコンジュゲートは、収量および活性の良好なバランスを表わす。
いくつかの実施形態において、ペグ化抗体様タンパク質多量体は、好ましくは、未修飾タンパク質と関連する生物学的活性の少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％を保持するであろう。いくつかの実施形態において、生物学的活性は、ＫＤ、ｋｏｎ、またはｋｏｆｆによって評価される場合、ＥＧＦＲおよびＩＧＦＩＲに結合するためのその能力を指す。いくつかの実施形態において、ペグ化抗体様タンパク質多量体は、非ペグ化タンパク質に比べて、ＥＧＦＲおよび／またはＩＧＦＩＲへの結合における増加を示す。
結合ポリペプチドの脱免疫化
Ｅ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤、特に、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３およびＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３の二量体などの抗体様タンパク質多量体のアミノ酸配列は、１つまたは複数のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを排除するために改変され得る。タンパク質またはタンパク質の多量体は、所与の種に対してそれを非免疫原性にするか、またはそれほど免疫原性ではなくするために脱免疫化され得る。脱免疫化は、タンパク質に対する構造の改変を通して達成することができる。当業者らに知られている任意の脱免疫化技術を使用することができ、たとえば、その開示の全体が本明細書において組み込まれるＷＯ００／３４３１７を参照されたい。
一実施形態において、Ｅ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤の配列は、ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフの存在について分析することができる。たとえば、比較は、たとえば、ｓｉｔｅｗｅｈｉｌ．ｗｅｈｉ．ｅｄｕ．ａｕのワールドワイドウェブ上の「モチーフ」データベースを検索することによってなどのように、ＭＨＣ結合モチーフのデータベースを用いて実行され得る。別法として、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、Altuvia et al.［J. Mol. Biol. 249 244-250 (1995)］によって考案されたものなどの計算スレッディング法（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｔｈｒｅａｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して同定されてもよく、それによって、ポリペプチド由来の連続する重複するペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対するそれらの結合エネルギーについて試験されている。計算結合予測アルゴリズムは、ｉＴｏｐｅ（商標）、Ｔｅｐｉｔｏｐｅ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（ＥｐｉＶａｘ）、およびＭＨＣｐｒｅｄを含む。ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの同定を支援するために、両親媒性およびＲｏｔｈｂａｒｄモチーフならびにカテプシンＢおよび他の処理酵素についての切断部位などの、提示するのに成功したペプチドに関する関連する配列特徴を検索することができる。
可能性のある（たとえばヒト）Ｔ細胞エピトープを同定したならば、これらのエピトープは、次いで、Ｔ細胞エピトープを排除するために必要とされるように、１つまたは複数のアミノ酸の改変によって排除される。通常、これは、Ｔ細胞エピトープ自体のうちの１つまたは複数のアミノ酸の改変を含むであろう。これは、タンパク質の一次構造の点から、エピトープに隣接するアミノ酸、または一次構造において隣接しないが、該分子の二次構造において隣接するアミノ酸を改変することを含むことができる。意図される通常の改変は、アミノ酸置換となるであろうが、ある状況において、アミノ酸付加または欠失が適当な場合もある。すべての改変は、組換えＤＮＡ技術によって達成することができ、最終の分子は、たとえば十分に確立された方法によって、組換え宿主からの発現によって調製され得るが、タンパク質化学の使用または分子の改変の他の手段もまた、使用され得る。
一旦、同定されたＴ細胞エピトープが除去されたならば、新しいＴ細胞エピトープが生成されていないことを確実にするために、脱免疫化配列を再分析してもよく、それらが存在する場合、該エピトープ（複数可）を欠失させることができる。
計算上同定されたすべてのＴ細胞エピトープを除去する必要があるとは限らない。当業者は、特定のエピトープの「強度」、またはより正確に言えば、潜在的な免疫原性の有意性を十分に理解するであろう。様々な計算方法は、可能性のあるエピトープについてのスコアを生成する。当業者は、高スコアのエピトープだけが除去される必要がありうることを認識するであろう。当業者はまた、可能性のあるエピトープの除去およびタンパク質の結合親和性の維持の間にバランスがあることを認識するであろう。そのため、１つの戦略は、タンパク質の中に連続して置換を導入し、次いで、抗原結合および免疫原性について試験することである。
一態様において、脱免疫化タンパク質は、ヒト対象におけるその本来のタンパク質よりも免疫原性ではない（より正確に言えば低下したＨＡＭＡ応答を誘導する）。免疫原性を決定するためのアッセイは、十分に、当業者の知識の範囲内にある。免疫応答を決定するための当技術分野において認識される方法は、特定の対象においてまたは臨床試験の間にＨＡＭＡ応答をモニターするために実行することができる。脱免疫化タンパク質を投与された対象は、上述の療法の適用の開始時および適用の全体にわたって、免疫原性評価を行うことができる。ＨＡＭＡ応答は、たとえば、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ）および／または固相ＥＬＩＳＡ分析を含む当業者に知られている方法を使用して、対象由来の血清試料中の脱免疫化タンパク質に対する抗体を検出することによって測定される。別法では、Ｔ細胞活性化事象を測定するために設計されたインビトロアッセイもまた、免疫原性を示す。
追加の修飾
ある実施形態において、Ｅ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤、特に、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３およびＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３の二量体などの抗体様タンパク質多量体は、翻訳後修飾をさらに含んでいてもよい。例示的な翻訳後タンパク質修飾は、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化、あるいはポリペプチド側鎖または疎水基の付加を含む。その結果として、修飾されたＥ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤は、脂質、多糖類または単糖類、およびホスフェートなどの非アミノ酸エレメントを含有していてもよい。グリコシル化の好ましい形態は、シアリル化であり、これは、ポリペプチドに１つまたは複数のシアル酸成分をコンジュゲートする。シアル酸成分は、タンパク質の可能性のある免疫原性をも低下させながら、可溶性および血清半減期を改善する。たとえばRaju et al. Biochemistry. 2001 Jul 31; 40(30):8868-76を参照されたい。Ｅ結合剤またはＥ／Ｉ結合剤の機能性に対するそのような非アミノ酸エレメントの効果は、ＥＧＦＲシグナリング機能およびＩＧＦＩＲシグナリング機能におけるそのアンタゴナイズする役割について試験され得る。
いくつかの実施形態において、Ｅ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤は、抗原依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を増強するために修飾される。いくつかの実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、Ｆｃ領域をさらに含む、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３およびＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３の二量体である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを増強する変異体である。Ｆｃ領域変異体は、位置２５６、２９０、２９８、３１２、３２６、３３０、３３３、３３４、３６０、３７８、または４３０を含む１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（たとえば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（たとえばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでいてもよく、Ｆｃ領域中の残基のナンバリングは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスのナンバリングである。
ベクター＆ポリヌクレオチドの実施形態
本明細書において記載されるタンパク質のいずれかをコードする核酸配列もまた、本開示において含まれる。当業者らによって十分に理解されるように、３番目の塩基の縮重のために、ほとんどすべてのアミノ酸は、コードヌクレオチド配列における１つを超えるトリプレットコドンによって表わすことができる。さらに、軽微な塩基対変化は、コードされたアミノ酸配列における保存的置換をもたらしうるが、遺伝子産物の生物学的活性を実質的に改変するとは予想されない。そのため、本明細書において記載されるタンパク質をコードする核酸配列は、配列がわずかに修飾されるが、なおも各遺伝子産物をコードしうる。
本明細書において記載されるＥ／Ｉ結合剤をコードする例示的な核酸は、配列番号４４２〜４６５を有する核酸または配列番号４４２〜４６５のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一の配列を有する核酸を含む。遺伝暗号中の縮重により配列番号４４２〜４６５において記載される核酸と異なる単離核酸もまた、本発明の範囲内である。配列番号３２８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一のヌクレオチド配列によってコードされるＩ単量体を含むＥ／Ｉ結合剤および／または配列番号３２９〜４４１もしくは４９５のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一のヌクレオチド配列によってコードされるＥ単量体を含むＥ／Ｉ結合剤もまた提供される。配列番号３２９〜４４１または４９５のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列によってコードされるＥ結合剤もまた提供される。ある実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤、Ｅ単量体、またはＩ単量体をコードするヌクレオチド配列は、６×Ｈｉｓタグ（配列番号４８７）をコードする配列を含有していない。
本明細書において開示される様々なタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成され得る。コドン使用頻度は、細胞における発現を改善するように選択され得る。そのようなコドン使用頻度は、選択される細胞型に依存するであろう。特殊なコドン使用頻度パターンは、大腸菌および他の細菌ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、および昆虫細胞について明らかにされている。たとえばMayfield et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 100(2):438-42；Sinclair et al. Protein Expr Purif. 2002 (1):96-105;Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001 (5):446-9；Makrides et al. Microbiol Rev. 1996 60(3):512-38；およびSharp et al. Yeast. 1991 7(7):657-78を参照されたい。
核酸操作のための一般的な技術は、当業者の範囲内にあり、また、たとえば、参照によって本明細書において組み込まれるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989またはF. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987)および定期的な最新版においても記載されている。タンパク質をコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来する適した転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに作動可能に結合される。そのような調節エレメントは、転写プロモーター、転写をコントロールするための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結をコントロールする配列を含む。複製開始点によって通常与えられる、宿主において複製するための能力、および形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子がさらに組み込まれる。適した調節エレメントは、当技術分野においてよく知られている。
本明細書において記載されるタンパク質は、異種ポリペプチドとの融合タンパク質として産生されてもよく、該異種ポリペプチドは、好ましくは、シグナル配列または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有する他のポリペプチドである。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（つまりシグナルペプチダーゼによって切断される）配列である。天然のシグナル配列を認識せず、プロセシングを行わない原核生物の宿主細胞については、シグナル配列は、たとえば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または耐熱性毒素ＩＩリーダーからなる群から選択される原核生物のシグナル配列によって置換される。酵母分泌については、天然シグナル配列は、たとえば酵母インベルターゼリーダー、ファクターリーダー（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のアルファファクターリーダーを含む）、もしくは酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー、またはＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１３６４６において記載されるシグナルによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー、たとえば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。そのような前駆体領域のためのＤＮＡは、該タンパク質をコードするＤＮＡに対し、リーディング・フレーム内にライゲーションされ得る。
真核生物の宿主細胞（たとえば酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列をも含有するであろう。そのような配列は、一般に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域および時々、３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、多価抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。ある有用な転写終結構成成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１１０２６およびそこに開示される発現ベクターを参照されたい。
組換えＤＮＡはまた、タンパク質を精製するのに有用でありうる任意のタイプのタンパク質タグ配列を含むこともできる。タンパク質タグの例は、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグを含むが、これらに限定されない。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主での使用のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York, 1985)において見つけることができ、関連する開示は、参照によってこれによって組み込まれる。
発現コンストラクトは、当業者に明白であるように、宿主細胞に適切な方法を使用して宿主細胞の中に導入される。エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（ベクターは感染性作用物質である）を含むが、これらに限定されない宿主細胞の中に核酸を導入するための様々な方法は、当技術分野において知られている。
適した宿主細胞は、原核生物、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞を含む。適した細菌は、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、たとえば大腸菌またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種を含む。好ましくは、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種由来の酵母もまた、ポリペプチドの産生に使用され得る。様々な哺乳動物または昆虫細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いることができる。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）系は、Luckow and Summers, (Bio/Technology, 6:47, 1988)によって概説されている。ある実例において、グリコシル化のためになどのように脊椎動物細胞においてタンパク質を産生することが望ましく、また、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、ルーチン的な手順になっている。適した哺乳動物宿主細胞系の例は、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎培養細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児由来腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、およびＢＨＫの細胞系を含む。多数の適用のために、本明細書において記載されるタンパク質多量体の小さなサイズは、大腸菌を好ましい発現方法にするであろう。
タンパク質産生
宿主細胞は、タンパク質産生のために、本明細書において記載される発現ベクターまたはクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターの誘発、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために、適宜、修飾された従来の栄養培地中で培養される。
本発明のタンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地［（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ］、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ修飾イーグル培地［（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ］などの市販で入手可能な培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；もしくは第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号において記載されている培地のいずれも、培養基として宿主細胞に使用され得る。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標）薬剤など）、微量元素（マイクロモルの範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは等価なエネルギー源が補足され得る。任意の他の必要な補足物もまた、当業者らに知られているであろう適切な濃度で含まれていてもよい。温度、ｐＨ、およびその他同種のものなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者に明白であろう。
本明細書において開示されるタンパク質はまた、細胞翻訳系を使用して産生することもできる。そのような目的のために、タンパク質をコードする核酸は、ｍＲＮＡを産生するためにインビトロ転写を可能にするように、かつ利用されている特定の無細胞系においてｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするように修飾されなければならない。例示的な真核細胞を含まない翻訳系には、たとえば、哺乳動物または酵母細胞を含まない翻訳系があり、例示的な原核細胞を含まない翻訳系には、たとえば、細菌細胞を含まない翻訳系がある。
本明細書において開示されるタンパク質はまた、化学合成によっても産生することもできる（たとえば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, ILにおいて記載されている方法によって）。タンパク質に対する修飾もまた、化学合成によって生じることができる。
本明細書において開示されるタンパク質は、タンパク質化学の分野において一般に知られている、タンパク質のための単離／精製法によって精製することができる。非限定的な例は、抽出、再結晶、塩析（たとえば硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナトリウムを用いて、）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動、向流分配、またはこれらの任意の組合せを含む。精製の後に、タンパク質は、濾過および透析を含むが、これらに限定されない当技術分野に知られている様々な方法のいずれかによって、異なる緩衝液中に交換および／または濃縮され得る。
精製タンパク質は、好ましくは少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、および最も好ましくは少なくとも９８％純粋である。純度の厳密な数値に関係なく、タンパク質は、医薬品としての使用に十分に純粋である。
画像化、診断的、および他の応用
本明細書において記載されるＥ結合剤は、検出可能に標識することができ、画像化または診断的応用のために、ＥＧＦＲを発現する細胞と接触させるために使用することができる。本明細書において記載されるＥ／Ｉ結合剤は、検出可能に標識することができ、画像化または診断的応用のために、ＥＧＦＲおよび／またはＩＧＦＩＲを発現する細胞と接触させるために使用することができる。Hunter, et al., Nature 144:945 (1962)；David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974)；Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981)；およびNygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)によって記載されている方法を含む、検出可能な成分にタンパク質をコンジュゲートするための当技術分野において知られている任意の方法が用いられうる。
ある実施形態において、本明細書において記載されるＥ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤は、検出することができる標識にさらに結合される（たとえば、標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子とすることができる）。標識は、鉄キレートなどの放射性重金属、ガドリニウムもしくはマンガンの放射性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素、もしくはガリウムのポジトロン放射体、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、または９９Ｔｃなどの放射性作用物質であってもよい。そのような成分に付着されたＥ結合剤またはＥ／Ｉ結合剤は、造影剤として使用されてもよく、ヒトなどの哺乳動物において診断上の使用のために有効量で投与され、次いで、造影剤の局在化および蓄積が検出される。造影剤の局在化および蓄積は、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴画像法、計算断層像法、またはポジトロン放出断層撮影によって検出され得る。当業者に明らかなように、投与されることとなる放射性同位体の量は、放射性同位体に依存する。当業者らは、活性成分として使用される所与の放射性核種の比活性およびエネルギーに基づいて、投与されることとなる造影剤の量を容易に処方することができる。
Ｅ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤はまた、親和性精製作用物質としても有用である。このプロセスにおいて、タンパク質は、当技術分野においてよく知られている方法を使用して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙などの適した支持体上に固定される。タンパク質は、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどの任意の知られているアッセイ方法において用いることができる（Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)）。
Ｅ結合剤は、試料中のＥＧＦＲを検出するための方法において有用である。Ｅ／Ｉ結合剤もまた、試料中のＥＧＦＲおよび／またはＩＧＦＩＲを検出するための方法においても有用である。試料は、多くの場合、生検材料、特に、腫瘍、腫瘍の疑いのある生検材料などの生物学的試料となるであろう。試料は、ヒトまたは他の哺乳動物由来のものであってもよい。Ｅ結合剤またはＥ／Ｉ結合剤は、放射性成分、蛍光成分、色素成分、化学発光成分、またはハプテン成分などの標識成分を用いて標識されてもよく、固体支持体上に固定され得る。検出は、たとえば、ラジオグラフィー、免疫学的アッセイ、蛍光検出、質量分析法、または表面プラズモン共鳴などの、当技術分野において知られている任意の技術を使用して実行され得る。
治療的／インビボでの使用
本明細書において記載されるＥ結合剤はまた、ＥＧＦＲ生物学的活性の阻害に応答する状態を治療するための方法においても有用である。本明細書において記載されるＥ／Ｉ結合剤は、ＥＧＦＲおよび／またはＩＧＦＩＲの生物学的活性の阻害に応答する状態を治療するための方法においても有用である。ＥＧＦＲおよびＩＧＦＩＲは、増殖、接着、および遊走ならびに分化を含む様々な細胞活性のシグナル伝達経路に、直接または間接的に関与する。
一態様において、本出願は、Ｅ結合剤またはＥ／Ｉ結合剤の治療有効量を用いて過剰増殖障害に罹患した対象を治療するための方法を提供する。特に、Ｅ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤は、腫瘍および／または腫瘍転移の治療および／または予防処置に有用である。例示的な実施形態において、Ｅ／Ｉ結合剤は、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３およびＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３の二量体などの抗体様タンパク質多量体である。
いくつかの実施形態において、Ｅ結合剤またはＥ／Ｉ結合剤を含む医薬組成物は、脳腫瘍、泌尿生殖器管の腫瘍、リンパ系の腫瘍、胃腫瘍、喉頭の腫瘍、単球性白血病、肺腺癌、小細胞肺癌、膵癌、多形性膠芽腫、および乳癌を含むが、これらに限定されない腫瘍または扁平上皮癌、膀胱癌、胃癌、肝臓癌、腎臓癌、結腸直腸癌、乳がん、頭部癌、頚部癌、食道癌、婦人科の癌、甲状腺癌、リンパ腫、慢性白血病、および急性白血病を含むが、これらに限定されない癌疾患に罹患した対象に投与される。
Ｅ結合剤またはＥ／Ｉ結合剤は、単独で、または化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的処置、もしくはこれらの任意の組合せなどの１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせて投与することができる。長期療法は、本明細書において記載されるように、他の治療戦略との関連において、アジュバント療法と同じように、等しく可能である。投与のための技術および投薬量は、特異的なポリペプチドのタイプおよび治療されている特異的な状態に依存して変わるが、当業者によって容易に決定することができる。
Ｅ／Ｉ結合剤と共に使用され得る追加の作用物質
本出願の一態様は、Ｅ結合剤またはＥ／Ｉ結合剤および細胞毒剤などの追加の治療剤の組合せを提供する。いくつかの実施形態において、Ｅ結合剤またはＥ／Ｉ結合剤は、細胞毒剤に結合される。そのような実施形態は、適宜、インビトロまたはインビボにおける方法によって調製することができる。インビトロにおける方法は、システイン残基およびリジン残基へのコンジュゲーションなどの当技術分野において十分に知られているコンジュゲーション化学を含む。細胞毒剤をポリペプチドに結合するために、結合基または反応基が使用される。適した結合基は、当技術分野においてよく知られており、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、感光基、ペプチダーゼ不安定基（ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｌａｂｉｌｅ ｇｒｏｕｐ）、およびエステラーゼ不安定基（ｅｓｔｅｒａｓｅ ｌａｂｉｌｅ ｇｒｏｕｐ）を含む。細胞毒剤はまた、血清アルブミンなどの仲介キャリア分子を通してＥ結合剤またはＥ／Ｉ結合剤に結合することもできる。
Ｅ結合剤またはＥ／Ｉ結合剤に結合され得る例示的な細胞毒剤は、マイタンシノイド、タキサン、ＣＣ−１０６５の類似体、細菌毒素、植物毒素、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、プロテアーゼ、ブドウ球菌腸毒素Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア菌毒素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、シュードモナス内毒素、ランピマーゼ（Ｒａｎｐｉｍａｓｅ）（Ｒａｐ）、Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）、メトトレザト、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブチル、およびカリチェアミシン（calicheamicin）を含む。
他の治療法または組成物において、Ｅ結合剤またはＥ／Ｉ結合剤は、１つまたは複数の追加の治療剤と共に投与されるか、または連続して投与される。適した治療剤は、癌治療剤などの細胞毒または細胞分裂阻害剤を含むが、これらに限定されない。
癌治療剤は、患者に対する最小限の影響を有しながら、癌細胞を死滅させるまたはその増殖を制限しようとする作用物質である。したがって、そのような作用物質は、健常な宿主細胞との癌細胞特性の任意の差異（たとえば代謝、血管新生、または細胞表面抗原提示）を活用してもよい。癌治療効能の改善のためにＥ／Ｉ結合剤と組み合わせることができる治療剤は、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エキセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド、ベバシズマブ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミソール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリックス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ、トシツモマブ、インターフェロンアルファ−２ｂ、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｍ）、ボルテゾミブ、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ、エルロチニブ（ｅｒｌｏｎｉｔｉｂ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（たとえばセツキシマブまたはパニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍａｂ））、イクサベピロン、エポチロンまたはその誘導体、白金作用物質（カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチンなど）、タキサン（パクリタキセル、ドセタセルなど）、およびカンプトテシンなどの、腫瘍の診療において使用される種々の作用物質を含む（参考文献：Cancer, Principles & Practice of Oncology, DeVita, V. T., Hellman, S., Rosenberg, S. A., 6th edition, Lippincott-Raven, Philadelphia, 2001）。
治療処方および投与様式
本出願は、ＥＧＦＲおよび／またはＩＧＦＩＲの生物学的活性の阻害に応答する状態を治療するための方法を提供する。投与のための技術および投薬量は、特定のポリペプチドのタイプおよび治療されている特定の状態に依存して変わるが、当業者によって容易に決定することができる。一般に、規制当局は、治療薬として使用されることとなるタンパク質試薬が、受け入れられる程度に低レベルの発熱物質を有するように処方されることを要求する。したがって、治療製剤は、一般に、適切な規制当局（たとえばＦＤＡ）によって決定されるように、それらが実質的に発熱物質がないまたは少なくとも、許容できるレベル以下の発熱物質を含有するという点で、他の処方と区別されるであろう。
いくつかの実施形態において、Ｅ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤は、哺乳動物、特にヒトに対して薬学的に許容できるものである。「薬学的に許容できる」ポリペプチドは、有意な有害な医学的結果を伴うことなく動物に投与されるポリペプチドを指す。薬学的に許容できるＥ結合剤およびＥ／Ｉ結合剤の例は、インテグリン結合ドメイン（ＲＧＤ）を欠く１０Ｆｎ３ドメインおよび本質的に内毒素がないか、または非常に低い内毒素レベルを有する１０Ｆｎ３ドメインを含む。
治療組成物は、単位剤形で、薬学的に許容できる希釈剤、キャリア、または賦形剤と共に投与され得る。投与は、非限定的な例として、非経口（たとえば静脈内、皮下）、経口、または局所的であってもよい。さらに、ネイキッドＤＮＡデリバリー、組換え遺伝子およびベクター、患者の細胞のエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）操作を含む細胞ベースのデリバリー、ならびにその他同種のものを含む、Ｅ結合剤またはＥ／Ｉ結合剤をコードする核酸を使用する任意の遺伝子療法技術が用いられてもよい。
組成物は、経口投与のために丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、もしくは徐放性錠剤；静脈内、皮下、もしくは非経口投与のために液体；または局部投与のためにゲル剤、ローション剤、軟膏、クリーム、またはポリマービヒクルもしくは他の徐放性ビヒクル形態を取ることができる。
たとえば、処方を作製するための当技術分野においてよく知られている方法は、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A.R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)において見出される。非経口投与のための処方は、たとえば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、または水素添加ナフタレン（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅ）を含有していてもよい。生体適合性で生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、化合物の放出をコントロールするために使用され得る。ナノ粒子製剤（たとえば生分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム）は、化合物の体内分布をコントロールするために使用され得る。他の可能性として有用な非経口デリバリー系は、エチレン酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透性ポンプ、植込み型注入系、およびリポソームを含む。処方における化合物の濃度は、投与されることとなる薬剤の投薬量および投与のルートを含む多くの因子に依存して変わる。
該ポリペプチドは、所望により、医薬品産業において一般に使用される無毒な酸付加塩または金属複合物などの薬学的に許容できる塩として投与され得る。酸付加塩の例は、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、コルク酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、もしくはトリフルオロ酢酸、またはその他同種のものなどの有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロース、またはその他同種のものなどのポリマー酸；および塩酸、臭化水素酸、硫酸リン酸、またはその他同種のものなどの無機酸を含む。金属複合物は、亜鉛、鉄、およびその他同種のものを含む。一実施例において、ポリペプチドは、熱安定性を増加させるために酢酸ナトリウムの存在下において製剤される。
経口的な使用のための処方は、無毒な薬学的に許容できる賦形剤を有する混合物において活性成分（複数可）を含有する錠剤を含む。これらの賦形剤は、たとえば不活性希釈剤または充填剤（たとえばスクロースおよびソルビトール）、潤滑剤、流動化剤、ならびに癒着防止剤（たとえばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素添加植物油、または滑石）であってもよい。
経口的な使用のための処方はまた、咀嚼錠としてまたは活性成分が不活性固体希釈剤と混合される硬カプセルとしてまたは活性成分が水媒体もしくは油媒体と混合される軟カプセルとして提供され得る。
治療有効用量は、投与目的の治療効果をもたらす用量を指す。厳密な用量は、治療されることとなる障害に依存し、既知の技術を使用して当業者によって確定されうる。一般に、Ｅ結合剤またはＥ／Ｉ結合剤は、１日当たり約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇで投与される。ポリペプチドは、毎日（たとえば毎日１回、２回、３回、もしくは４回）与えられてもよく、またはそれほど頻繁でなくてもよい（たとえば１日おきに、毎週１回もしくは２回、または毎月）。さらに、当技術分野において知られているように、年齢ならびに体重、健康状態、性別、食事、投与の時間、薬物相互作用、および疾患の重症度についての調整が必要な場合もあり、当業者らによってルーチン的な実験法を用いて確定されるであろう。
ここで概して記載されている本発明は、単に、本発明のある態様および実施形態の説明の目的のために含まれ、決して、本発明を限定するようには意図されない以下の実施例に対する参照によってより容易に理解されるであろう。
配列の概要
本出願において参照される配列の多くは、下記の表において概説される。別段の定めがない限り、Ｎ末端伸長は、一重下線を用いて示され、Ｃ末端テールは、二重下線を用いて示され、リンカー配列は、太字で示される。
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実施例１
ＥＧＦＲ活性についてスクリーニングするためのＩｎ Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイ
Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイは、ＩＧＦ１Ｒ１０Ｆｎ３結合剤と結合してＥ／Ｉ結合剤を構築することができるものを同定するために、ＥＧＦＲ活性を阻害する能力について様々な単一の１０Ｆｎ３クローンをスクリーニングするために開発された。Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイはまた、特定のＥ／Ｉ１０Ｆｎ３結合剤の相対的な効力をスクリーニングし、決定するためにも使用された。２つのＩｎ Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイは、１）ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害または２）ＥＧＦ刺激ＥＲＫリン酸化の阻害を測定するために開発された。細胞は、Ａ４３１類表皮癌細胞またはＦａＤｕ頭頸部癌細胞について２４，０００細胞／ウェルで、ポリＤ−リジンで被覆された９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中に細胞を播種し、一晩接着させた。細胞を１回洗浄し、次いで、無血清培地中で２４時間インキュベートした。次に、１０Ｆｎ３ベースの結合剤の段階希釈液を細胞にアプライし、２〜３時間インキュベートした後、１００ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦで１０分間刺激した。刺激後、３．７％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中で２０分間細胞を固定し、次いで、１５分間、０．１％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中で透過処理した。細胞は、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッカー（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ）中で１時間ブロックし、チロシン１０６８上でリン酸化されたＥＧＦＲ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびβ−アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはｐＥＲＫ（チロシン２０２／トレオニン２０４上でリン酸化されたＭＡＰキナーゼ）および全ＥＲＫ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を検出するために、抗体と共にインキュベートした。０．１％ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中での３回の洗浄の後に、二次抗体を追加した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ｏｒ Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）。細胞は、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中で３回洗浄し、Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線画像システム（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ）上で画像処理した。それぞれのクローンを３連または４連でアッセイし、値は、ｐＥＧＦＲアッセイについてはβ−アクチンおよびｐＥＲＫアッセイについては全ＥＲＫに対して標準化した。ＩＣ５０値は、バックグラウンドを差し引いた最大シグナルの阻害パーセントについての線形回帰分析から計算した。
結果として、ＥＧＦＲの活性を阻害する能力を持つ様々な１０Ｆｎ３クローンがもたらされ、ある種の特異的なＥ／Ｉ１０Ｆｎ３結合剤が図９において示される例に類似する活性を有したことが示された。
実施例２
１０Ｆｎ３ベースの結合剤の発現
Ｅ／Ｉ結合剤は、グリシン−セリンリンカーを使用してＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３をＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合し、それによって、それぞれの１０Ｆｎ３ドメインが異なる標的に結合する１０Ｆｎ３二量体を生成することによって製造した。ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３（Ｉ１）は、ＰＣＴ公開ＷＯ ２００８／０６６７５２において配列番号２２６として以前に記載されている。新規な２つのＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３（Ｅ２およびＥ１）は、ＰＣＴ公開ＷＯ２００８／０６６７５２において記載されるように、ＥＧＦＲ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）に対する結合剤について、ＲＮＡ−タンパク質融合ライブラリーをスクリーニングすることによって同定した。以下の実施例は、様々なＨｉｓタグつきＥ／Ｉ１０Ｆｎ３ベースの結合剤（非ペグ化）：Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号２５）、Ｅ１−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号３１）、Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ１（配列番号２８）、およびＩ１−ＧＳ１０−Ｅ２（配列番号２２）を使用する結果を記載する。
以下の実施例はまた、以下のペグ化ＨｉｓタグつきＥ／Ｉ１０Ｆｎ３ベースの結合剤：
Ｅ１−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号５５）、Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号５６）、Ｅ３−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号５３）、Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ１（配列番号５７）、Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ２（配列番号５８）、Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ３（配列番号５４）、Ｅ４−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号１２０）、Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ４（配列番号１２４）、Ｅ５−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号１２８）、Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５（配列番号１３２）、Ｅ８５−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号１４９）、Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ８５（配列番号１５２）、Ｅ９０−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号１６４）、Ｅ９６−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号１７９）、Ｅ１０５−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号１９２）、Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ１０５（配列番号１９５）、Ｅ１１２−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号２０５）、Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ１１２（配列番号２０８）、Ｉ１−ＧＳＧＣＧＳ８−Ｅ５（配列番号２１１）、Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５−ＧＳＧＣ（配列番号２１２）、Ｉ１（Ｓ６２Ｃ）−ＧＳ１０−Ｅ５（配列番号２１３）、Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５（Ｓ６２Ｃ）（配列番号２１４）、Ｉ１（Ｓ９１Ｃ）−ＧＳ１０−Ｅ５（配列番号２１５）、およびＩ１−ＧＳ１０−Ｅ５（Ｓ９１Ｃ）（配列番号２１６）を用いる結果を記載する。
実施例はまた、ＨｉｓタグつきＩＧＦＲＩＲ１０Ｆｎ３ベースの結合剤、Ｉ１（配列番号４）ならびに１０種のＨｉｓタグつきＥＧＦＲ１０Ｆｎ３ベースの結合剤、Ｅ２（配列番号６）、Ｅ１（配列番号８）、Ｅ３（配列番号５２）、Ｅ４（配列番号１０７）、Ｅ５（配列番号１１３、Ｘ＝ＳｅｒおよびＣ末端にＨｉｓタグを有する）、ペグ化Ｅ５（配列番号１１３、Ｘ＝ＣｙｓおよびＣ末端にＨｉｓタグを有する）、Ｅ８５（配列番号１４０）、Ｅ９０（配列番号１５５）、Ｅ９６（配列番号１７０）、Ｅ１０５（配列番号１８５）、ならびにＥ１１２（配列番号１９８）を使用する結果をも記載する。実施例３２はまた、図４５において説明され、Ｃ末端にＨｉｓタグを含む配列を有する様々なＥ単量体をも記載する。
様々な１０Ｆｎ３ベースの結合剤は、ハイスループットタンパク質産生プロセス（ＨＴＰＰ）を使用して精製した。選択した結合剤を、Ｈｉｓ６タグ（配列番号４８７）融合体を生成するためにｐＥＴ９ｄベクターの中にクローニングした。ＤＮＡを、大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）の中に形質転換し、細胞は、２４ウェルフォーマット中に５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する５ｍｌ ＬＢ培地中に接種し、３７℃で一晩、成長させた。新鮮な５ｍｌ ＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬカナマイシン）培養物は、一晩培養物から２００μｌを吸引し、適切なウェルの中にそれを分注することによって、誘発性発現のために調製した。培養物は、Ａ６００ ０．６〜０．９まで３７℃で成長させた。１ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いる誘発の後に、培養物は、３０℃でさらに６時間成長させ、４℃で３２２０ｘｇでの１０分間の遠心分離によって採取した。細胞ペレットは８０℃で凍結させた。
細胞ペレット（２４ウェルフォーマット中）は、４５０μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル−ＥＤＴＡなし（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、３０ｕｇ／ｍｌ ＤＮアーゼ、２μｇ／ｍｌアプロチニン（ａｐｒｏｔｏｎｉｎ）、ｐＨ８．０）中での再懸濁によって溶解し、１時間室温で振盪した。溶解物は、清澄化し、９６ウェル ６５０μｌキャッチプレートが取り付けられた９６ウェルＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｄ Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒの中への移動によって、９６ウェルフォーマット中に再度載せ、２００ｘｇで５分間、遠心分離した。清澄化した溶解物は、平衡緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて平衡化した９６ウェル Ｎｉキレートプレートに移し、５分間インキュベートした。非結合物質は、吸引によって除去した。樹脂は、洗浄緩衝液＃１（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて２×０．３ｍｌ／ウェルで洗浄し、それぞれの洗浄液は、吸引によって除去した。次に、樹脂は、ＰＢＳを用いて３×０．３ｍｌ／ウェルで洗浄し、それぞれの洗浄液は、吸引によって除去した。溶出前に、それぞれのウェルは、５０μｌ溶出緩衝液（ＰＢＳ＋２０ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて洗浄し、５分間インキュベートし、洗浄液は、吸引によって廃棄した。タンパク質は、それぞれのウェルに溶出緩衝液をさらに１００μｌアプライすることによって溶出した。室温での３０分間のインキュベーションの後に、プレート（複数可）は、２００ｘｇで５分間遠心分離し、溶出タンパク質は、Ｎｉプレートの底面に装着した５μｌの０．５Ｍ ＭｇＣｌ２を含有する９６ウェルキャッチプレート中に収集した。溶出タンパク質は、タンパク質標準物質として配列番号２を用いて、ＢＣＡタンパク質アッセイを使用して定量した。
ＨＴＰＰにより、可溶性形態で発現され、細菌細胞質ゾルの可溶性画分から精製された活性な１０Ｆｎ３ベースの結合剤がもたらされた。図１は、Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤のうちの１つに由来する例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。１００ｍＭ ＮａＰＯ４、１００ｍＭ ＮａＳＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の移動相中のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ上でのＳＥＣ分析は、主に単量体のタンパク質を示した（実施例４を参照されたい）。
さらに、選択した１０Ｆｎ３ベースの結合剤の中規模発現および精製を実行した。Ｈｉｓ６タグ（配列番号４８７）に融合された選択した結合剤は、ｐＥＴ９ｄベクターまたはｐＥＴ２９ベクターの中にクローニングし、大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）細胞またはＢＬ２１２（ＤＥ３）（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）細胞中で発現させた。２０ｍｌの接種培養物（単一の平板培養コロニーから生成）は、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１リットルのＬＢ培地に接種するために使用した。培養物は、Ａ６００ ０．６〜１．０まで３７℃で成長させた。１ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いる誘発の後に、培養物は、３０℃にさらに６時間成長させた。別法では、発現は、自己誘発培地（「ＯＮＥ」培地、ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いる３７℃での最初の増殖の後に、１８℃で実行した。細胞ペレットは、４℃、≧１０，０００ｘｇでの３０分間の遠心分離によって採取し、８０℃で凍結させた。細胞ペレットは、氷上で、Ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘホモジナイザーを使用して、２５ｍＬの溶解緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル−ＥＤＴＡなし（Ｒｏｃｈｅ）、ｐＨ７．４）中に再懸濁した。細胞溶解は、モデルＭ−１１０Ｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して、高圧ホモジナイゼーション（≧１８，０００ｐｓｉ）によって達成した。可溶性画分は、４℃、２３，３００ｘｇでの３０分間の遠心分離によって分離した。上清は、０．４５μｍフィルターを介して清澄化した。清澄化した溶解物は、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いてあらかじめ平衡化したＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ）上に装填した。次いで、カラムは、２５カラム容量の２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、その後に続いて、２０カラム容量の２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４、および次いで、３５カラム容量の２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４を用いて洗浄した。タンパク質は、１５カラム容量の２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４を用いて溶出し、画分は、Ａ２８０の吸光度に基づいてプールし、１×ＰＢＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５または５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５に対して透析した。いかなる沈殿物も、０．２２μｍで濾過することによって除去した。
中規模発現および精製により、可溶性形態で発現され、細菌細胞質ゾルの可溶性画分から精製された、高度に純粋で活性のタンパク質がもたらされた。１００ｍＭ ＮａＰＯ４、１００ｍＭ ＮａＳＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の移動相中のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３０ＧＬ上でのＳＥＣ分析は、主に単量体のタンパク質を示した（実施例４を参照されたい）。
実施例３
Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤のペグ化
Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤などの多価フィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質は、様々なサイズおよびタイプのＰＥＧを用いてペグ化することができる。ペグ化を可能にするために、典型的には、該タンパク質は、アミノ酸（典型的にはセリン）のシステインへの単一点突然変異によって、Ｃ末端の近くで修飾される。単一のシステイン残基でのタンパク質のペグ化は、誘導体化ＰＥＧ試薬をタンパク質溶液と組み合わせ、インキュベートすることによって、様々なマレイミド誘導体化ＰＥＧ形態とのコンジュゲーションを通して達成される。ペグ化コンジュゲーション反応の進行および確認は、ペグ化タンパク質から非ペグ化タンパク質を分離するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはＳＥ−ＨＰＬＣ法によって確認することができる。
たとえば、コンストラクトＥ２−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号２５）は、位置２２１にあったセリンをシステインと交換することによってペグ化される。次いで、結果として生じるコンストラクト、配列番号５６は、マレイミド誘導体化４０ｋＤａ分岐ＰＥＧ（ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｉｎｓ、ＮＹ）とコンジュゲートされた。誘導体化ＰＥＧ試薬は、溶液中で該タンパク質コンストラクトと混合され、室温で反応が完了するまで、典型的に３０分間、または４℃で一晩、ｐＨ７．４０でインキュベートした。ｐＨは、５０ ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液の中への透析またはサイズ排除カラムクロマトグラフィーを使用する急速な脱塩によってｐＨ４．５またはｐＨ５．０まで低下させた。次いで、ペグ化反応由来の産物および過剰反応物質の混合物を、より低いｐＨで陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上に装填し、１５０ｍＭ〜１Ｍ ＮａＣｌの勾配を用いて溶出した。ペグ化を確認するための研究もまた、上記の段落において記載されるように行った。コンジュゲーションは、タンパク質のＨｉｓタグつきまたはＨｉｓタグなしバージョンを用いて実行することができる。
大腸菌内毒素混入を試料中で減らす必要がある場合、別々にまたは互いに関連して使用される２つの方法を用いた。第１に、典型的に、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を補足した５カラム容量のＮａＯＡｃ緩衝液、次いで、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有しない２０カラム容量（またはそれ以上）の同じ緩衝液を用いて、陽イオン交換カラムを洗浄した。さらに、またはこの手順の代わりに、該タンパク質を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｏｈｅｍｉａ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に非常にゆっくりと通過させた。
２つのＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤、Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１−ｃｙｓ（ｈｉｓを有する）（配列番号５６）およびＥ３−ＧＳ１０−Ｉ１−Ｃｙｓ（ｈｉｓを有する）（配列番号５３）は、代替手順を使用してペグ化した。Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１−ｃｙｓ（ｈｉｓを有する）またはＥ３−ＧＳ１０−Ｉ１−Ｃｙｓ（ｈｉｓを有する）をコードするＴ７ポリメラーゼ（ｐｌｏｙｍｅｒａｓｅ）駆動ｐＥＴ２９プラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞の５ｍｌの接種培養物を、単一の平板培養コロニーから生成し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１リットルの自己誘発培地（「ＯＮＥ」培地、ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に接種するために使用した。発現は、３７℃での最初の増殖の後に１８℃で実行し、４℃、約１０，０００ｘｇでの１０分間の遠心分離によって採取した。細胞ペレットは８０℃で凍結させた。細胞ペレットは、１０ｍＬの溶解緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール（Ｉｍｍｉｄａｚｏｌｅ）、ｐＨ７．４）中で再懸濁し、Ａｖｅｓｔｉｎホモジナイザーを使用して機械的に溶解した。可溶性画分は、４℃、２３，３００ｘｇでの１５分間の遠心分離によって分離した。上清は、デカントし、ペレットは、４Ｍ〜６Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）を補足した溶解緩衝液（上記）中で可溶化にした。次いで、可溶化したタンパク質は、ＧｄｎＨＣＬを補足した溶解緩衝液を用いてあらかじめ平衡化した、適切なサイズのＮｉＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）上で精製した。次いで、該カラムは、５〜１０カラム容量の同じ緩衝液を用いて洗浄し、その後、３００ｍＭイミダゾールを補足した同じ緩衝液を用いて溶出した。対象のタンパク質を含有するカラムから溶出した画分は、２〜３ｍｇｓ／ｍＬタンパク質に希釈し、次いで、１．２〜１．５モル過剰の固体ＮＥＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ分岐または他）と組み合わせた。混合物は、室温で３０分間または反応が完了するまで反応させた。次いで、全反応容量を透析バッグ（５，０００Ｄａ分子量カットオフ）の中に入れ、混合物を透析リフォールディングプロセスに付した。たとえば、このプロセスは、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１５０ｍｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５に対する２回の１０〜１６時間の５００：１（緩衝液：透析液）の透析交換から成ってもよい。この手順由来の透析液は、適切にフォールドしたペグ化物質および過剰反応物質を含有する。ペグ化反応由来の産物および過剰反応物質の混合物は、陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＳＰ ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にそれらを装填する前に、遠心分離または濾過を介して清澄化した。カラムは、ＮａＯＡｃバックグラウンド緩衝液中で１５０ｍＭ〜１Ｍ ＮａＣｌの勾配を用いて展開した。ペグ化を確認するための研究は、上記に記載されるように行った。
実施例４
１０Ｆｎ３ベースの結合剤の生物物理的特徴づけ
標準のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＴＰＰおよび中規模プロセスから精製したタンパク質について実行した（ＨＴＰＰについては０．１〜１μｇのタンパク質、中規模については１０〜５０ｕｇ）。ＨＴＰＰ由来物質のＳＥＣは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、または中規模の物質についてはＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、Ａ２１４ｎｍおよびＡ２８０ｎｍでのＵＶ検出ならびに蛍光検出（励起＝２８０ｎｍおよび放射＝３５０ｎｍ）を用いるＡｇｉｌｅｎｔ １１００または１２００ＨＰＬＣシステム上で実行した。該ＳＥＣカラムの適切な流速にて、１００ｍＭ硫酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８の緩衝液を用いた。ゲル濾過標準物質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を分子量較正のために使用した。
ＨＴＰＰ精製１０Ｆｎ３ベースの結合剤のＳＥＣについての結果は、主に、単量体のタンパク質、および球状ゲル濾過標準物質（ＢｉｏＲａｄ）に対する約２５ｋＤａの範囲の溶出を示した。
中規模の精製１０Ｆｎ３ベースの結合剤のＳＥＣについての結果は、主に単量体のタンパク質および球状ゲル濾過標準物質（ＢｉｏＲａｄ）に対して約２５ｋＤａの範囲の溶出を示した。図２は、Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤（図２ＡにおいてＩ１−ＧＳ１０−Ｅ２および図２ＢにおいてＥ２−ＧＳ１０−Ｉｌ）についての例示的なＳＥＣプロファイルを示す。
選択した中規模の１０Ｆｎ３ベースの結合剤は、ＬＣ−ＭＳによってさらに分析した（Ｗａｔｅｒｓ Ｑ−ＴＯＦ ＡＰＩ質量分析計と接続したＷａｔｅｒｓ（ｗａｔｅｒ’ｓ）２６９５液体クロマトグラフィーＨＰＬＣシステム、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）。試料は、ＨＰＬＣグレード水を用いて約０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。希釈した試料の約５μｌを、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８カラム（カタログ番号００Ｇ−４０５３−８０、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に注入した。緩衝液Ａ：ＨＰＬＣグレード水中、０．０２％ＴＦＡ＋０．０８％ギ酸。緩衝液Ｂ：ＨＰＬＣグレードアセトニトリル中、０．０２％ＴＦＡ＋０．０８％ギ酸。試料は、流速０．２ｍｌ／分で勾配（表１）を用いて溶出した。
Figure 2012509900
ＨＰＬＣ溶出液は、約１：１の比に分割し、半分はＵＶ検出器におよび他の半分は質量分析計に送った。質量分析計は、以下の機器設定を有した：キャピラリー電圧３．５ＫＶ、コーン電圧４０、ソース温度８０℃、脱溶媒和温度２５０℃、脱溶媒和ガスフロー４５０、および多チャネル光検出器電圧２２００。生のスペクトルは、ＭａｘＥｎ１（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてデコンボリュートした。
ＬＣ−ＭＳによって測定されるＩ１−ＧＳ１０−Ｅ２（配列番号２２）の分子量は、２４，４４５ダルトンであり、これは、アミノ酸組成から計算した分子量から１ダルトンの範囲内にある。これは、該タンパク質が正確なアミノ酸組成を有し、Ｎ末端メチオニンがプロセシングされることを示す。タンパク質上に他の翻訳後修飾はない。
中規模のＩ１−ＧＳ１０−Ｅ２の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析は、Ｔｍを決定するために実行した。１ｍｇ／ｍｌ溶液は、３気圧の圧力下で毎分１度の速度で５℃〜９５℃まで温度を上昇させることによって、Ｎ−ＤＳＣ ＩＩ熱量計（Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ）においてスキャンした。データは、Ｏｒｇｉｎソフトウェア（ＯｒｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐ）を使用し、ベストフィットを使用して適切な緩衝液の対照の実行に対して分析した。このアッセイの結果は、Ｅ／Ｉ結合剤が５０．６９℃のＴｍを有することを実証する（図３Ａを参照されたい）。同じ方法を使用して、Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１（Ｐｅｇを有する）のＴｍは、５０．７２℃であることが決定され、Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉｌ（Ｐｅｇなし）のＴｍは、５６．８２℃であることが決定された（図３Ｂを参照されたい）。
実施例５
結合親和性の測定
表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析は、捕捉されたＥＧＦＲ−ＦｃおよびＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃを使用して、ｏｆｆ速度および／または結合親和性を決定するために、溶液相の１０Ｆｎ３ベースの結合剤について実行した。ヒトＩＧＦ１Ｒ（アミノ酸１〜９３２）の細胞外ドメインは、ヒトＩｇＧ１のヒンジおよび定常領域を含有する哺乳動物発現ベクターの中にクローニングした。プラスミドの一時的なトランスフェクションにより、融合タンパク質、ＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃが産生され、続いて、これをプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。組換えヒトＥＧＦＲ−Ｆｃ（ヒトＦｃに融合されたヒトＥＧＦＲの細胞外ドメインのアミノ酸１〜６４５）は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。ＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃは、固定プロテインＡ上に捕捉したが、ＥＧＦＲ−Ｆｃは、固定抗ヒト抗体上に捕捉した。
典型的な実験において、抗ヒトＩｇＧは、メーカーの推奨（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に従って、ＣＭ５チップのフローセル１および２上に固定した。ＥＧＦＲ−Ｆｃ（５０ｎＭ）を、フローセル２（Ｆｃ２）に２分間、５ｕＬで注入した。３Ｍ ＭｇＣｌ２の２回の３０秒間の注入を、抗ヒトＩｇＧ表面からの結合ＥＧＦＲ−Ｆｃの再生のために使用した。プロテインＡは、アセテートｐＨ４．５中で８０ｕｇ／ｍＬに希釈し、ＣＭ５チップ表面のフローセル３および４上に〜３０００ＲＵまで固定した。約１３００ＲＵのＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃを、Ｆｃ４上に捕捉させた。５０ｍＭグリシンｐＨ１．５の２回の３０秒間の注入は、試料の間で表面を再生するために使用した。
１００ｎＭ〜１ｎＭのＨＴＰＰ精製タンパク質（３つのデータポイントを収集）または３００ｎＭ〜０．０５ｎＭの中規模の精製タンパク質（１１のデータポイントを収集）の濃度系列を、ＥＧＦＲ−ＦｃまたはＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃへの結合について評価した。センサーグラムは、それぞれの濃度で得、速度定数ｋａ（ｋｏｎ）およびｋｄ（ｋｏｆｆ）を決定するためにＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェア、バージョン１．１．１（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して評価した。ＨＴＰＰ評価のために、オフ速度は３ポイントの曲線からフィットさせた。親和性ＫＤは、速度定数ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比から計算した。
ＥＧＦＲ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、ＨＥＲ２−Ｆｃを捕捉するために抗ヒトＩｇＧを使用して、類似するフォーマットにおいて特異性について評価した。１０Ｆｎ３ベースの結合剤は、強い結合がＥＧＦＲ−Ｆｃについて見られた条件下で、捕捉ＨＥＲ２−Ｆｃへの識別可能な結合を全く示さなかった。
表２において示されるように、Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の両方のドメインは、機能的であり、それぞれの標的に対するそれらの結合特性を保持している。表２において示されるｏｆｆ速度は、中規模物質由来のものであり、ＨＴＰＰ物質を用いて得られた定質的な結果に類似している。
Figure 2012509900
実施例６
Ｈ２９２細胞におけるＩＧＦＲ活性の阻害
Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤がチロシン１１３１上でのＩＧＦ１Ｒのリン酸化を阻害する能力は、インビトロアッセイにおいてＨ２９２細胞を使用して決定した。手短かに言えば、６５×１０３ Ｈ２９２細胞は、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４および１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培養培地中、９６ウェルマイクロプレート（ＢｉｏｃｏａｔポリＤ−リシンコート９６ウェルプレート、カタログ＃３５６６４０、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中で培養した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間、接着させた。翌日、細胞は、ウェル当たり２００マイクロリットルの無血清ＲＰＭＩ−１６４０を用いて１回洗浄し、ウェル当たり１００μＬの無血清ＲＰＭＩ−１６４０中で一晩インキュベートした。ＨＴＰＰ物質の段階希釈液を追加し、細胞をさらに３時間インキュベートした。細胞は、３７℃で１０分間、１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（カタログ＃５００−Ｐ１１、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を用いて刺激した。培地をプレートから捨て、１００μＬの細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ＃９８０３、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）をそれぞれのウェルに追加した。細胞は、１５分間、室温でインキュベートし、溶解させ、溶解物は、ホスホＩＧＦＲ ＥＬＩＳＡ（カタログ＃７３０２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に移した。ＥＬＩＳＡを実行するためにメーカーの手順に従った。
図４において示されるように、ＨｉｓタグつきＥ１−ＧＳ１０−Ｉ１は、単離ＩＧＦ１Ｒ結合剤、Ｉ１（ＩＣ５０＝０．０１８ｕＭ）と同程度の効力でＩＧＦ１ＲのＩＧＦ１刺激リン酸化を阻害した（ＩＣ５０＝０．００４ｕＭ）。ＥＧＦＲ結合剤、Ｅ１のみでは、ＩＧＦ１Ｒリン酸化に対してほとんど効果を有していなかった（ＩＣ５０＞３．５ｕＭ）。図９において示されるように、さらなるＥ／Ｉ結合剤は、試験したいくつかのペグ化Ｅ／Ｉ結合剤を含めて、０．１ｎＭ〜１９ｎＭの範囲のＩＣ５０でＩＧＦ１Ｒ刺激リン酸化を阻害する能力を示した。特に、ペグ化Ｅ／Ｉ結合剤Ｅ１−ＧＳ１０−Ｉ１およびＩ１−ＧＳ１０−Ｅ１については、ｐＩＧＦＲの阻害は、０．９ｎＭおよび４ｎＭでそれぞれ示された。ペグ化Ｅ／Ｉ結合剤Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１およびＩ１−ＧＳ１０−Ｅ２については、ｐＩＧＦＲの阻害は、０．３ｎＭおよび０．８ｎＭでそれぞれ示された。
実施例７
Ｈ２９２細胞におけるＥＧＦＲ活性の阻害
Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤がチロシン１０６８上でのＥＧＦＲのリン酸化を阻害する能力は、インビトロアッセイにおいてＨ２９２細胞を使用して決定した。アッセイは、細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（カタログ＃２３６−ＥＧ−２００、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて刺激したという点を除いて実施例６において記載されるように実行し、ホスホＥＧＦＲ ＥＬＩＳＡを実行した（カタログ＃７２４０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）。ＥＬＩＳＡを実行するためにメーカーの手順に従った。
図５において示されるように、ＨｉｓタグつきＥ１−ＧＳ１０−Ｉ１は、単離ＥＧＦＲ結合剤、Ｅ１（ＩＣ５０＝０．００７ｕＭ）と同程度の効力でＥＧＦＲのＥＧＦ刺激リン酸化を阻害した（ＩＣ５０＝０．０２０ｕＭ）。ＩＧＦ１Ｒ結合剤、Ｉ１のみでは、ＥＧＦＲリン酸化に対してほとんど効果を有していなかった（ＩＣ５０＞６．２１ｕＭ）。図９において示されるように、さらなるＥ／Ｉ結合剤は、試験したいくつかのペグ化Ｅ／Ｉ結合剤を含めて、７ｎＭ〜１２７ｎＭの範囲のＩＣ５０でＥＧＦ刺激リン酸化を阻害する能力を示した。特に、ペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１およびＩ１−ＧＳ１０−Ｅ２については、ｐＥＧＦＲの阻害は、３２ｎＭおよび４７ｎＭでそれぞれ示された。類似するデータは、ペグ化Ｅ／Ｉ結合剤Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１およびＩ１−ＧＳ１０−Ｅ２について図１１に示す。
実施例８
Ｈ２９２細胞におけるＥＧＦ＋ＩＧＦ１誘発ｐＡＫＴの阻害
Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤がセリン４７３上でのＡＫＴのリン酸化を阻害する能力は、インビトロアッセイにおいてＨ２９２細胞を使用して決定した。アッセイは、細胞を上記に記載されるようにＥＧＦおよびＩＧＦ１の両方を用いて同時に刺激し、溶解物をホスホＡＫＴ ＥＬＩＳＡ（カタログ＃７１６０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて分析したという点を除いて、実施例６において記載されるように実行した。ＥＬＩＳＡを実行するためにメーカーの手順に従った。
ＥＧＦＲおよびＩＧＦ１Ｒでのシグナル伝達は、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナリング経路の中に送り込まれ、ＡＫＴのリン酸化を刺激する。図６において示されるように、Ｅ１−ＧＳ１０−Ｉ１は、Ｈ２９２細胞においてＡＫＴのＥＧＦおよびＩＧＦ１刺激リン酸化を阻害した。Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、ＩＧＦ１Ｒ結合剤、Ｉ１単独（ＩＣ５０＝０．０３１ｕＭ）よりもＡＫＴ活性化を遮断するその能力がわずかにより強力であった（ＩＣ５０＝０．００４ｕＭ）。ＥＧＦＲ結合剤、Ｅ１は、両方のリガンドによってＡＫＴ活性化を遮断するその能力においてわずかな活性を示した（ＩＣ５０＝１．２８ｕＭ）。図９において示されるように、さらなるＥ／Ｉ結合剤は、試験したいくつかのペグ化Ｅ／Ｉ結合剤を含めて、０．１ｎＭ〜２６ｎＭの範囲のＩＣ５０でＡＫＴのＥＧＦおよびＩＧＦ１刺激リン酸化を阻害する能力を示した。
実施例９
ＲＨ４１細胞およびＨ２９２細胞における細胞増殖の阻害
Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、増殖をＥＧＦＲシグナリングに依存するＨ２９２非小細胞肺癌細胞系、または増殖をＩＧＦ１Ｒシグナリングに依存するＲＨ４１ユーイング肉腫細胞系において、抗増殖性活性について評価した。結合剤の抗増殖性活性は、ＣｙＱｕａｎｔＮＦ蛍光染色（カタログ＃Ｃ３５００６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて細胞内ＤＮＡを染色することによって単層培養において評価した。手短かに言えば、２×１０３ Ｈ２９２または５×１０３ ＲＨ４１細胞は、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４および１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培養培地中、９６ウェルマイクロプレート（Ｖｉｅｗ Ｐｌａｔｅｓ ９６Ｆ カタログ＃６００５２２５、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の中に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間、接着させた。細胞は、対数増殖単層として維持され、アッセイの過程の間、コンフルエンスに達することなく、アッセイ期間中、対数増殖期にとどまった。播種から２４時間後に、中規模物質の段階希釈液を追加し、細胞をさらに７２時間インキュベートした。このインキュベーションの後に、細胞をＣｙＱｕａｎｔＮＦ試薬を用いて処理し、３７℃で１時間、細胞内ＤＮＡの中に色素を組み込ませた。全ＤＮＡは、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ ４０００機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）で４８５ｎｍの励起および５３０ｎｍの放射で蛍光を読み取ることによって定量した。細胞を薬剤に曝露した全時間は７２時間であった。アッセイの性能および再現性を確認するために、標準化合物を各実験に含ませた。試験化合物による阻害のパーセントの線形回帰分析は、ＩＣ５０値を決定するために使用した。
図７において示されるように、ＲＨ４１細胞において、ＨｉｓタグつきＥ１−ＧＳ１０−Ｉ１は、ＩＧＦＲ結合剤、Ｉ１（ＩＣ５０＝０．０２８ｕＭ）と同程度の効力（ＩＣ５０＝０．００９ｕＭ）で増殖を阻害した。ＥＧＦＲ結合剤、Ｅ１は、単独では、この細胞系における増殖に対してほとんど効果を有していなかった（ＩＣ５０＞１２．５ｕＭ）。
図８において示されるように、Ｈ２９２細胞において、ＨｉｓタグつきＥ２−ＧＳ１０−Ｉ１は、ＩＧＦＲ結合剤、Ｉ１（ＩＣ５０＝０．６９９ｕＭ）またはＥＧＦＲ結合剤、Ｅ２（ＩＣ５０＝０．５５３ｕＭ）よりも大きな効力（ＩＣ５０＝０．３２９ｕＭ）で増殖を阻害した。Ｅ単量体およびＩ単量体についてのＩＣ５０値については、下記の表４を参照されたい。
実施例１０
競合的ＥＧＦリガンド結合アッセイ
Ｅ／Ｉ結合剤Ｅ１−ＧＳ１０−Ｉ１、Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ１、Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１、およびＩ１−ＧＳ１０−Ｅ２（ＨＴＰＰ物質）は、Ａ４３１細胞においてＥＧＦリガンド結合細胞ベースの競合アッセイにおいて試験し、ＥＧＦＲ １０Ｆｎ３ベースの結合剤Ｅ１およびＥ２（中規模物質）と比較した。Ａ４３１細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で９６ウェルプレート中、１５０００細胞／ウェルで播種し、４８時間インキュベートした。細胞は、飢餓培地（ＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡ）を用いて洗浄し、１時間飢餓培地中でインキュベートした。飢餓培地を除去し、飢餓培地中で希釈した１０Ｆｎ３ベースの結合剤と交換し、細胞は、３７℃で３０分間、プレインキュベートし、タンパク質が細胞表面上のＥＧＦ受容体に結合することを可能にした。飢餓培地中で希釈した、１０ｎＭ最終濃度のユウロピウム（Ｅｕ）標識ＥＧＦ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）をプレインキュベートした細胞に追加し、プレートは、暗中で４℃で３時間インキュベートした。プレートは、冷ＰＢＳを用いて２回洗浄し、５０ｕｌ／ウェルのＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）をプレートに追加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートは、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で読み取った。データは、Ｓｏｆｔｍａｘ ｐｌｕｓソフトウェアを用いてプロットし、ＩＣ５０値、つまり、Ｅｕ−ＥＧＦリガンドの５０％を細胞表面上のＥＧＦ受容体に結合させないようにするのに必要とされる１０Ｆｎ３ベースの結合剤の濃度を計算した。
Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１、Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ２、Ｅ１−ＧＳ１０−Ｉ１、およびＩ１−ＧＳ１０−Ｅ１と比較したＥ２およびＥ１についての結果を表３に概説する。このデータは、Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤が、ＥＧＦＲ １０Ｆｎ３ベースの結合剤に類似する効力で、Ａ４３１細胞上のＥＧＦＲ受容体へのＥＧＦの結合と競合し、それを阻害することを示す。Ｅ単量体およびＩ単量体についてのＩＣ５０値については、下記の表４を参照されたい。
Figure 2012509900
実施例１１
細胞ベースのアッセイにおける活性化およびシグナリング活性
様々なＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の標的効果を、イムノブロッティングによってＤｉＦｉ結腸癌細胞において評価した。細胞は、それぞれの２５ｃｍ２フラスコ中に４×１０５細胞で接種し、５％ＣＯ２中で３７℃で一晩インキュベートした。翌日、処理を開始し、細胞は、１．５〜１２０時間までの様々な時間、さらにインキュベートした。次いで、細胞は、ＨＮＴＧ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、８％グリセロール、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦを含有する１ｍＭ ＥＤＴＡ、アプロチニン、ロイペプチン、ベスタチン、ペプスタチン−Ａ、およびＥ６４）中で溶解し、総タンパク質量をＢＣＡタンパク質アッセイを用いて定量した（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。全ＥＧＦＲ、全ＩＧＦ１Ｒ、およびＥＧＦＲ、ＭＡＰキナーゼタンパク質ＥＲＫ１／２アイソフォームのリン酸化状態のレベルを、２０マイクログラムの総タンパク質量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、その後に続く、ニトロセルロースへのタンパク質の転写および特異的な抗体を用いるイムノブロッティングによって検出した。ブロットはまた、それぞれの試料の使用量が等しいことを示すためにβ−アクチンを用いてプローブした。
ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤Ｅ１−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号５５）、Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号５６）、およびＥ３−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号５３）は、このアッセイにおいてＥＧＦＲを分解する能力を示した。さらに、Ｅ３−ＧＳ１０−Ｉ１（配列番号５３）については、ＩＧＦ１Ｒの分解もまた観察された。ペグ化結合剤Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１についてのＥＧＦＲ分解に対する効果を、シグナリング分子に対する他の効果と同様に、図１０に示す。さらに、結合剤Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１の非ペグ化バージョンは、類似するＥＧＦＲ分解を示した（データ示さず）。図１０は、ペグ化結合剤Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ２について、ＥＧＦＲ分解がなかったことを示す。下記の表４は、Ｅ単量体の様々な特性を概説する。
Figure 2012509900
実施例１２
ヌードマウスにおいて成長させたＨ２９２腫瘍異種移植片に対するある種のＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の評価
ペグ化Ｅ／Ｉ結合剤Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１およびＥ３−ＧＳ１０−Ｉ１ならびにモノクローナル抗体パニツムマブを、Ｈ２９２腫瘍異種移植片モデルにおいて評価した。インビボモデルについては、パニツムマブは、市販の薬剤として得、Ｅ／Ｉ結合剤は上記に記載されるように精製した。すべてのＥ／Ｉ結合剤のインビトロ活性は、動物への投与前に、Ｈ２９２細胞におけるＥＧＦ刺激ｐＥＧＦＲアッセイおよびＩＧＦ１刺激ｐＩＧＦＲアッセイにおいて各末端の機能性を試験することによって、確認した。Ｅ／Ｉ結合剤は、実験の初めにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈し、それぞれの研究の期間、２〜４℃で保存した。両方の化合物は、５００μｌ／注射／マウスの全容量でｉ．ｐ．投与し、投与前に室温に平衡化した。
マウスおよび腫瘍増殖。５〜６週齢のメス無胸腺（ヌード）マウスを、Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ Ｃｏ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から得、腫瘍増殖試験または薬剤効能試験にそれらを使用する前に約３週間隔離した。動物に飼料および水を適宜提供した。動物の世話は、ＡＡＡＬＡＣおよびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂのガイドラインに合わせて実行した。腫瘍は、ヌードマウスへの皮下（ｓ．ｃ．）移植によって増殖させた。腫瘍の継代は、約２〜４週ごとに行った。
インビボ抗腫瘍試験。推定腫瘍重量は、式：腫瘍重量（ｍｇ）＝（ｗ２＊ｌ）／２を使用して計算し、式中、ｗ＝幅およびｌ＝ｍｍでの長さとする。抗腫瘍活性は、腫瘍増殖阻害％（ＴＧＩ）の点から評価し、＞５０％のＴＧＩ％は、活性であると見なした。相対的腫瘍増殖阻害％はＴＧＩ％＝［（Ｃｔ−Ｔｔ）／（Ｃｔ−Ｃ０）］×１００として計算し、式中、Ｃｔ＝腫瘍移植後の日数の時間ｔでの対照マウスの中央腫瘍重量、Ｔｔ＝時間ｔでの処理マウスの中央腫瘍重量、Ｃ０＝時間０での対照マウスの中央腫瘍重量とする。ＴＧＩ％値は、１．５腫瘍量倍加時間の後に開始して様々な時点で計算し、可能な場合には３腫瘍量倍加時間（ＴＶＤＴ）の期間にわたって維持した。ここで、ＴＶＤＴ＝対照腫瘍が標的サイズに達する中央時間（日）−対照腫瘍が標的サイズの半分に達する中央時間（日）とする。治癒したマウスの定義は、処理後１０ＴＶＤＴを超えて評価した場合に、腫瘍が検出できなかった、または＜３５ｍｇであったマウスとした。最大の治療効果をもたらした化合物の用量は、最適用量（ＯＤ）と称した。薬剤毒性に起因する死亡が１匹を超えた処理群（典型的に８匹のマウス）は、過度に毒性の処理を受けたと見なし、それらのデータは抗腫瘍活性の評価において使用しなかった。最大耐用量（ＭＴＤ）は、過度の毒性（つまり１匹を超える死亡）が生じた直下の用量レベルとして定義する。腫瘍が標的サイズに達する前に死にかけている処理マウスは、薬剤毒性で死亡したと見なした。データの統計評価は、Ｇｅｈａｎの一般化ウイルコクソン検定を使用して実行した（Gehan, EA, A Generalized Wilcoxon Test for Comparing Arbitrarily Slightly-Censored Samples, Biometrika 52:203-223, 1965）。
腫瘍における薬力学的エンドポイントの測定。腫瘍は、未処理マウスまたは薬剤処理マウスから採取し、液体窒素中でスナップ凍結した。試料を量り、１ｍｇの組織について１０μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、８％グリセロール、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍｌ緩衝液当たり完全ミニプロテアーゼ阻害剤タブレットＳｉｇｍａ＃Ｓ８８２０およびホスファターゼ阻害剤カクテルＳｉｇｍａ＃Ｐ５７２６を含有する１ｍＭ ＥＤＴＡ）中でホモジナイズした。組織は、２本のメスを用いて１００ｍｍペトリ皿中で分割し、Ｆａｌｃｏｎ＃２０５９ポリプロピレン丸底チューブに移し、３０秒間、手持ち型ホモジナイザーを用いてばらした。ホモジネートは、１．５ｍｌ エッペンドルフチューブに移し、微量遠心管中で２分間１５０００ｘｇで遠心分離した。清澄化した上清を、新しいチューブに移し、総タンパク質量濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイを用いて決定した（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。試料は、イムノブロッティングによって、またはＭｅｓｏ ｓｃａｌｅ ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００マルチスポットアッセイシステム（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）においてメーカーによって推奨されるように分析した。
ペグ化Ｅ／Ｉ結合剤Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１およびＥ３−ＧＳ１０−Ｉ１は、無胸腺マウスにおけるＨ２９２ ＮＳＣＬＣにおいて試験した。腫瘍は、１ｍｍ３ Ｈ２９２腫瘍断片を用いて後方の側腹部中に皮下移植し、腫瘍移植後の６日目に処理を開始する前に５０〜１５０ｍｇのサイズまで確立させた。ペグ化Ｅ／Ｉ結合剤は、抗腫瘍活性を評価するためにＴＩＷＸ３スケジュールに基づいて１００ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．投与した。パニツムマブは市販の薬剤として得、Ｑ３ＤＸ５スケジュールに基づいて１ｍｇ／マウスのその最適用量およびより低用量の０．１ｍｇ／マウスでｉ．ｐ．投与した。８匹のマウスの群から計算した平均腫瘍サイズを図１２Ａに示す。パニツムマブの１ｍｇ／マウスおよび０．１ｍｇ／マウスの用量は、両方とも、それぞれ１０１％および１００％の値を有するＴＧＩ％によって活性となり、これらの値は、対照動物とは有意に異なった（ｐ＝０．０００２、表５）。ペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１もまた、９６％（ｐ＝０．０００５）の値を有するＴＧＩ％によって有意に活性となった。ペグ化Ｅ３−ＧＳ１０−Ｉ１は、対照群とは統計的に異ならない３１％のＴＧＩ％値を有し、本研究において活性とならなかった（ｐ＝０．４１６）。投薬後分析は、約３分の２のペグ化Ｅ３−ＧＳ１０−Ｉ１が凝集したことを示し（あるバッチについては６６．６４％凝集／３３．３６％単量体および他のバッチについては７２．５３％凝集／２７．４７％単量体）、これは、このアッセイにおけるペグ化Ｅ３−ＧＳ１０−Ｉ１の不十分な活性を説明することができた。対照的に、ペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１は、投薬後研究においてわずかな百分率の凝集のみを示した（１．７９％凝集／９８．２１％単量体）。
処理はすべて、研究の経過にわたって処理に関連する死亡または過度の体重減少はなく、十分に耐性であった。臨床観察は、毒性の証拠を示さず、治療過程にわたる平均体重変化は許容できる範囲内にあった（図１２Ｂ）。
Figure 2012509900
 aビヒクルはリン酸緩衝生理食塩水とした。使用される略語は以下のとおりとする:ip、腹腔内ルート;TGI%、TGI%=[(Ct-Tt)/(CtC0)]×100として計算した相対的腫瘍増殖阻害%、式中、Ct=腫瘍移植後の日数の時間tでの対照マウスの中央腫瘍重量、Tt=時間tでの処理マウスの中央腫瘍重量、C0=時間0での対照マウスの中央腫瘍重量とする。TGI%値は、12日目および20日目の平均阻害として2つの時点で計算した。結果、>50%の統計的に有意なTGI%値をもたらした場合、処理レジメンは、活性であると見なした;q3dx5;6、化合物は腫瘍移植後の6日目にスタートして5回の服用について3日ごとに投与した;TIWx3;6、化合物は、腫瘍移植後の6日目にスタートして3週間、1週当たり3回投与した。p値は、群当たり8つの測定値を用いる両側対応検定（two tailed paired analysis）において対照群に比べて20日目に計算した。TGI%による結果、A=活性およびI=不活性。
Ｈ２９２腫瘍研究からの薬力学的エンドポイント。未処理対照群、パニツムマブ処理群、およびＥ／Ｉ結合剤処理群由来の腫瘍の試料は、標的抑制を示すであろうリン酸化ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、およびＩＧＦＲのレベルについて分析した。腫瘍はまた、ＥＧＦ受容体分解が生じたかどうかを決定するために、全ＥＧＦＲのレベルについて分析した。２０日目に、最終処理を施し、腫瘍は、投薬の１時間後に２匹の動物、投薬の４時間後に３匹の動物、および投薬の２４時間後に３匹の動物から摘出した。すべての処理は、リン酸化ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ２の著しい抑制を示したが、リン酸化ＩＧＦＲの基本レベルが低すぎたので、本研究において差異を識別することができなかった（図１３）。すべての処理は、全ＥＧＦＲの量の低下を示し、受容体の分解が生じたことを示した。
実施例１３
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤に対して抵抗性のＭＣＦ７細胞の選択および特徴づけ
ＭＣＦ７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、カタログ番号ＨＴＢ−２２、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、５％ＣＯ２の存在下において、３７℃で、１０ｍＭ ｈｅｐｅｓおよび１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中で培養した。小分子ＩＧＦ１Ｒ阻害剤ＢＭＳ−７５４８０７を培養培地に追加し、細胞が、２００ｍＭ ＢＭＳ−７５４８０７の存在下において継続的な増殖を示すまで、濃度は、１０か月の期間にわたって段階的な増分で増加させた。抵抗性細胞は、ＭＣＦ７ｒと呼び、ＢＭＳ−７５４８０７についてのＩＣ５０は、以前に記載されるように（Carboni et al., Cancer Res. 69: 161-170 (2009)）実行した増殖アッセイにおいて測定された場合、親ＭＣＦ７細胞についての１２０ｎＭと比較して、１２３９ｎＭであった。次いで、該薬剤を培養培地から除去し、残存性のＢＭＳ−７５４８０７をすべて除去するために、ＭＣＦ７ｒ細胞をさらに２０日または６０日間、完全培地中で継代した。イムノブロッティングによるＭＣＦ７ｒ細胞の分析により、ＥＧＦＲが、親ＭＣＦ７細胞と比較して、抵抗性細胞中で有意に過剰表現されることが明らかにされた（図１４）。さらに、ＭＣＦ７細胞およびＭＣＦ７ｒ細胞を血清欠乏にさせ、次いで、７分間、ＥＧＦを用いて刺激した場合、リン酸化ＥＧＦＲは、親ＭＣＦ７細胞において検出することができなかったが（おそらく低いレベルのＥＧＦＲにより）、ＭＣＦ７ｒ細胞において強く可視的であった。ＩＧＦリガンドを用いて刺激した、血清を欠乏させた細胞において、リン酸化ＩＧＦＲは、親ＭＣＦ７細胞において見られたが、ＭＣＦ７ｒ細胞中に存在するわずかに高いレベルの全ＩＧＦＲにもかかわらず、ｐＩＧＦＲはほとんど観察されなかった。これは、抵抗性ＭＣＦ７ｒ細胞におけるＩＧＦＲがＩＧＦ１刺激に応じてＩＧＦＲを活性化する能力を失ったことを示す（図１４）。ＥＧＦ刺激に応じたＭＡＰキナーゼ経路の活性化は、ｐＥＲＫ活性化によって測定されるようにＭＣＦ７ｒ細胞においてより強かった。
実施例１４
ＭＣＦ７異種移植片およびＭＣＦ７ｒ異種移植片における抗腫瘍研究
ＭＣＦ７ｒ細胞は、Ｔ７５フラスコ中で増大させ、遠心分離によって単離した。生存細胞数は、Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いてトリパンブルー排除法によって測定し、５×１０６生存細胞／ｍｌまでＰＢＳ中に再懸濁し、０．２ｍｌの容量で無胸腺マウスの後方の側腹部中に皮下移植した。ＭＣＦ７腫瘍増殖およびＭＣＦ７ｒ腫瘍増殖のために、すべてのマウスに、１７−β−エストラジオール（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ、カタログ番号ＮＥ−１２１）の０．２５ｍｇの９０日間放出ペレットを補足した。腫瘍は、それらを切除した場合に５００〜１０００ｍｇの中央サイズに達するまで増殖させ、１ｍｍ３断片を新しい無胸腺マウスの後方の側腹部中に再移植した。腫瘍は、腫瘍量倍加時間および生着率をそれぞれの継代についてモニターした少なくとも４ラウンドの増殖を通して、マウスにおける連続的トロッカー継代（serial trocar passage）によって固形腫瘍増殖に適合させた。増殖特徴は、異種移植片が信頼できる再生可能なモデルとして役立つのに許容できる特性を示すかどうかを決定するために観察された。ＭＣＦ７ｒ腫瘍型は、許容できる生着率および倍加時間を示し、そのため、異種移植片モデルとしての使用のための基準を満たした。ＭＣＦ７親腫瘍モデルは、同じ技術を使用して、以前に確立された。ＭＣＦ７親異種移植片については、１ｍｍ３腫瘍断片を、後方の側腹部中に皮下移植し、腫瘍移植後１３日目の処理の開始前に、５０〜１５０ｍｇのサイズまで確立させた。セツキシマブは市販の薬剤として得、Ｑ３ＤＸ５スケジュールに基づいて１ｍｇ／マウスのその最適用量および低用量の０．１ｍｇ／マウスでｉ．ｐ．投与した（１３、１６、１９、２２、２５日目に用量を投与）。８匹のマウスの群から計算した平均腫瘍サイズを図１５Ａに示す。ＭＣＦ７異種移植片モデルにおいて、セツキシマブの１ｍｇ／マウスまたは０．１ｍｇ／マウスの用量のいずれも、それぞれ−９％および３．２％の値を有するＴＧＩ％によって活性とならず、腫瘍サイズは、対照群とは統計的に異なっていなかった（表６）。
ＭＣＦ７ｒ抵抗性異種移植片については、１ｍｍ３腫瘍断片を、後方の側腹部中に皮下移植し、腫瘍移植後の６日目に処理を開始する前に５０〜１５０ｍｇのサイズまで確立させた。セツキシマブは市販の薬剤として得、Ｑ３ＤＸ５スケジュールに基づいて１ｍｇ／マウスのその最適用量および低用量の０．１ｍｇ／マウスでｉ．ｐ．投与した（６、９、１２、１５、１８日目に用量を投与）。８匹のマウスの群から計算した平均腫瘍サイズを図１５Ｂに示す。ＭＣＦ７ｒ異種移植片モデルにおいて、セツキシマブの用量は、それぞれ１０５％および７５％の値を有するＴＧＩ％によって活性となった。高用量のセツキシマブは、１００％を超えるＴＧＩ値を有し、これは、処理の開始時のスタートサイズ未満まで腫瘍退縮を引き起こしたことを示す。両方の用量は、対照群と比較して、腫瘍サイズにおける統計的有意差をもたらした（表７）。
Figure 2012509900
 aビヒクルはリン酸緩衝生理食塩水とした。使用される略語は以下のとおりとする:ip、腹腔内ルート;TGI%、TGI%=[(Ct-Tt)/(CtC0)]×100として計算した相対的腫瘍増殖阻害%、式中、Ct=腫瘍移植後の日数の時間tでの対照マウスの中央腫瘍重量、Tt=時間tでの処理マウスの中央腫瘍重量、C0=時間0での対照マウスの中央腫瘍重量とする。TGI%値は、20、24、および27日目の平均阻害として3つの時点で計算した。結果、>50%の統計的に有意なTGI%値をもたらした場合、処理レジメンは、活性であると見なした;q3dx5;13、化合物は腫瘍移植後の13日目にスタートして6回の服用について3日ごとに投与した;p値は、群当たり8つの測定値を用いる両側対応検定において対照群に比べて24日目に計算した。TGI%による結果、A=活性およびI=不活性。
Figure 2012509900
 表6の脚注を参照されたい。p値は、群当たり8つの測定値を用いる両側対応検定において対照群に比べて19日目に計算した。
実施例１５
ＧＥＯ異種移植片における抗腫瘍研究
ＧＥＯ腫瘍は、無胸腺マウスの後方の側腹部中に１ｍｍ３腫瘍断片を皮下移植することによって確立し、腫瘍移植後１８日目の処理の開始前に、５０〜１５０ｍｇのサイズまで達することを可能にした。セツキシマブは、Ｑ３ＤＸ５スケジュールに基づいて０．２５ｍｇ／マウスでｉｐ投与した（１８、２１、２４、２７、３０日目に用量を投与した）。ＩＧＦＲキナーゼ阻害剤ＢＭＳ−７５４８０７は、ＱＤＸ２１スケジュールに基づいて２５ｍｇ／ｋｇで投与した。８匹のマウスの群から計算した平均腫瘍サイズを図１６に示す。セツキシマブは、６７％のＴＧＩ％値を有する０．２５ｍｇ／マウスで活性となった。ＢＭＳ−７５４８０７は、８０％のＴＧＩ％により活性となり、２つの組合せは、９４％のＴＧＩ％により、どちらかの作用物質のみよりも、相当に活性となった（表８）。すべての処理群は、２６日目に対照群とは統計的に異なっていた（表８）。
Figure 2012509900
 aセツキシマブのためのビヒクルは、リン酸緩衝生理食塩水とした。BMS-754807のためのビヒクルは、50%ポリエチレングリコール400、50%水とした。使用する略語は、表6において記載されるとおりとし、相乗効果は、それ自体、示される組合せにおいて、どちらかの作用物質よりもよい、統計的に有意な活性として定義される。TGI%による結果、A=活性およびI=不活性。
実施例１６
Ｈ２９２異種移植片における抗腫瘍研究
Ｈ２９２細胞は、１ｍｍ３断片として無胸腺マウスの後方の側腹部中に皮下移植し、腫瘍移植後の１２日目に処理を開始する前に５０〜１５０ｍｇのサイズまで確立させた。セツキシマブは、Ｑ３ＤＸ５スケジュールに基づいて０．１ｍｇ／マウスでｉｐ投与した。ＭＡＢ３９１は、ＩＧＦ１Ｒに対する抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、カタログ番号ＭＡＢ３９１）であり、ＢＩＷＸ３スケジュールに基づいて４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。８匹のマウスの群から計算した平均腫瘍サイズを図１７に示す。セツキシマブは、９５．１％のＴＧＩ％値により０．１ｍｇ／マウスで活性となり、ＭＡＢ３９１は、１０．５％のＴＧＩ％値により４０ｍｇ／ｋｇで不活性となった（表９）。セツキシマブおよびＭＡＢ３９１の組合せを投薬したマウスは、１０９．２％のＴＧＩ％値を示し、組合せの群において腫瘍退縮を示した（表９）。投薬を停止した後、腫瘍は、セツキシマブおよびＭＡＢ３９１の組合せにより処理された群におけるよりも、セツキシマブ処理群においてより急速に再増殖した（図１７）。
Figure 2012509900
 aセツキシマブおよびMAB391のためのビヒクルは、リン酸緩衝生理食塩水とした。使用する略語は、表6および8において記載されるとおりとする。
実施例１７
コロニー形成アッセイ
Ｈ２９２細胞のコロニー形成を阻害するための能力に対する試験化合物の効果を決定するために、４００の細胞を、完全培地中、２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、カタログ番号３５１１４３）の中に接種し、一晩、接着させた。翌日、培地を除去し、２％ＦＢＳを含有する培地と交換した。試験化合物は、２％ＦＢＳを含有する培地の中に希釈し、段階希釈において細胞に加えた。細胞は、１４日間、３７℃でインキュベートした。１４日後に、培地を廃棄し、ウェルを２ｍｌ ＰＢＳを用いて１回すすいだ。細胞は、２０分間、０．５ｍｌクーマシー染色溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、カタログ番号１６１−０４３６）を用いて染色した。染色液は吸引し、ウェルは、１×脱染溶液クーマシーＲ−２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１６１−０４３８）を用いて素速く洗浄した。ウェル当たり１ｍｌの水を用いる最終のすすぎを実行し、プレートを逆さにし、乾した。（少なくとも）５０以上の細胞から成るコロニーは、低拡大倍率（１０×〜２０×）下で目によってカウントした。すべての試料は、３連で試験し、ＩＣ５０値は、対照の阻害パーセントの線形回帰から計算した。ペグ化Ｅ／Ｉ結合剤についての代表的な結果を図１８に示し、様々なＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤、単一特異的ＩＧＦ１Ｒ １０Ｆｎ３ベースの結合剤、およびＥＧＦＲ抗体についてのＩＣ５０値を表１０に示す。
Figure 2012509900
実施例１８
エピトープマッピングアッセイ
エピトープマッピングアッセイは、ＥＧＦＲ細胞外ドメイン上の結合部位が様々な文献の報告によっておおよそ知られている市販の抗体を利用して開発された。このアッセイにおいて使用する抗体は、表１１に挙げ、図１９Ａは、抗体がＥＧＦＲ上のおよその結合ドメインにどのように局在化するのかを示す。アッセイは、以前に記載したＩｎ Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイの変形であり、ＥＧＦＲを発現するＡ４３１細胞または他の細胞と共にプレインキュベートしたＥＧＦＲ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の、表１１に挙げたパネル由来の検出抗体の結合を遮断する能力を評価する。アッセイは、以下のように実行した：対数期増殖のＡ４３１細胞をトリプシン処理によって採取し、１００μｌ／ウェルの全容量において、２４，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に接種した。翌日、培地を捨て、冷ＤＭＥＭベースの培地中で希釈したＥＧＦＲ １０Ｆｎ３ベースの結合剤をプレートに追加し、ＥＧＦＲのインターナリゼーション（internalization）を予防するために４℃で１時間、結合させた。結合後、細胞は、０．２ｍｌ ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて洗浄し、室温でＰＢＳ＋３．７％ホルムアルデヒド中で２０分間、固定した。細胞は、室温で１時間、０．２ｍｌのＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中でブロックした。次に、一次抗体を、ウェル当たり５０μｌのＯｄｙｓｓｅｙブロッカー中で希釈し、室温で１〜２時間インキュベートした。一次抗体は、プレートを逆にすることによって捨て、それぞれのウェルは、２００μｌのＰＢＳ＋０．１％ ｔｗｅｅｎ−２０を用いて３×洗浄した。二次抗体は、Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイにおいて使用した同じ二次抗体とし、検出している抗体の種類に適切であった。これらの二次抗体は、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッカー＋０．２％ Ｔｔｗｅｅｎ−２０中で希釈し（１：８００）、標準化のために細胞を対比染色するために希釈した（１：３０００）ＴＯＰＲＯ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、カタログ＃Ｔ３６０５）と共にウェル当たり５０μｌの容量で加えた。細胞は、室温で１時間ベンチ上でインキュベートした。二次抗体を捨て、それぞれのウェルは、室温で５分間、２００μｌのＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて４×洗浄した。プレートは、１６０μｍの解像度、中程度の品質、３ｍｍの焦点オフセット、５の強度でＬｉｃｏｒ機器で画像処理した。このアッセイもまた、市販の薬剤抗体セツキシマブ、パニツムマブ、およびニモツズマブを用いて、それらがＡ４３１細胞上のＥＧＦＲに結合することにＥＧＦＲ １０Ｆｎ３ベースの結合剤が干渉するかどうかを決定するために実行した。代表的な結果を図１９Ｂに示す。
Figure 2012509900
 略語:conf:高次構造的に特異的なエピトープ;線状:高次構造と無関係のエピトープ。aJBC 264(1989)17469 Ala351-Asp364、bJ Immunological Methods 287(2004)147、cMol Biol Med1(1983)511、dマウスEGFR[FKGDSFTRTPPLDPRELEI(配列番号491)]に対するペプチドに対して産生される、eInt J Oncol 4(1994)277。f[EEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNY(配列番号492)]、gIle-Gln-Cys-Ala-His-Tyr-Ile-Asp-Gly-Pro-His-Cys(配列番号493)(アミノ酸580〜591)。hCancer Cell 7(2005)301。
様々なアプローチを使用して、発明者らは、ＥＧＦＲ単量体Ｅ３がＥＧＦＲのドメインＩに結合することを確認した。他のＥ単量体が様々な実験において類似する特性を有するので、他のＥ単量体もまた、ＥＧＦＲのドメインＩに結合すると考えられる。
実施例１９
Ｉ単量体の特性
可溶性フィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質のＢＩＡｃｏｒｅ分析
標的に結合するＩ単量体の反応速度は、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００または３０００バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を使用して測定した。捕獲アッセイは、ＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃ融合体を利用して開発した。類似する試薬は、Ｆｏｒｂｅｓらによって記載されている（Forbes et al. 2002, European J. Biochemistry, 269, 961-968）。ヒトＩＧＦ−ＩＲ（アミノ酸１〜９３２）の細胞外ドメインは、ヒトＩｇＧ１のヒンジおよび定常領域を含有する哺乳動物発現ベクターの中にクローニングした。プラスミドの一時的なトランスフェクションにより融合タンパク質、ＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃを生産し、これを、続いて、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、アミンカップリングによってＢｉａｓｅｎｓｏｒ ＣＭ５チップ上に固定したプロテインＡ上に捕捉した。動態分析は、プロテインＡ上でのＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃの捕獲、その後に続く、溶液中のフィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質の注入およびグリシンｐＨ２．０によるプロテインＡ表面の再生を含んだ。センサーグラムは、それぞれの濃度で得、速度定数ｋａ（ｋｏｎ）およびｋｄ（ｋｏｆｆ）を決定するために、プログラムＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．０（ＢＩＡｃｏｒｅ）を使用して評価した。解離定数（ＫＤ）は、速度定数ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比から計算した。典型的に、精製フィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質の濃度系列（２ｕＭ〜０ｕＭ）は、プロテインＡに捕捉されたヒトＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃ融合タンパク質への結合について評価した。
ヒトインスリン受容体への結合を決定する実験のために、組換えヒトインスリン受容体（ＩＲ）および組換えヒトＶＥＧＦ−Ｒ２−Ｆｃは、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によって推奨される標準の手順に従って、アミン基結合によってＣＭ５ Ｂｉａｓｅｎｓｏｒチップに直接結合した。手短かに言えば、フローセル２および３上に、アセテート４．５中で希釈した６０ｕｇ／ｍＬのＩＲを、８３００ＲＵのレベルまで結合／固定し、アセテート５．０中で希釈した１１．９ｕｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ｒ２−Ｆｃを、９７００ＲＵのレベルまで固定した。ブランク参照表面はＦＣ１上で調製した。ＩＲまたはＶＥＧＦ−Ｒ２−Ｆｃへの特異的な結合は、ブランク参照フローセル１に対して観察された結合を差し引くことによって計算した。フィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質は、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）中で１０ｕＭまで希釈し、２５℃で、フローセルに対して３分間、２０ｕＬ／分で注入し、解離を１０分間、観察した。
細胞ベースの受容体遮断アッセイ
ヒト乳腺癌ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中、ウェル当たり５０，０００細胞の濃度で２４ウェルプレートに播種した。翌日、細胞は、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＲＰＭＩ １６４０から成る結合緩衝液中で洗浄し、次いで、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗剤を含有する２００μＬ結合緩衝液において氷上で３０分間、プレインキュベートした。プレインキュベーション期間の後に、約６００００カウント毎分に等しい４０ｐＭ［１２５Ｉ］ＩＧＦ−Ｉ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）をそれぞれのウェルに追加し、緩やかに撹拌しながら氷上でさらに３時間インキュベートした。次いで、ウェルは、０．１％ ＢＳＡを含有する氷冷ＰＢＳを用いて洗浄した。細胞は、０．１％ ＳＤＳ＋０．５Ｎ ＮａＯＨから成る５００μＬ緩衝液を用いて溶解した。溶解物の放射能は、Ｗａｌｌａｃ １４７０ Ｇａｍｍａ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）を使用して測定し、データは、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｏｉｎｔ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を使用して分析した。
ｐＩＧＦＲアッセイ
Ｆｃに融合されたフィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質は、Ｒｈ４１ヒト横紋筋肉腫細胞におけるＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する能力について評価された。ウェスタンブロットは、Ｉ単量体がＲｈ４１ヒト横紋筋肉腫細胞においてＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する能力を評価するために用いた。細胞は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インスリンリガンド（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激し、または無刺激（ＮＳ）とし、次いで、様々な濃度のＩ単量体を用いて処理した。膜は、リン酸特異的抗体を用いてプローブした。
Ｒｈ４１における細胞の増殖（ヒト横紋筋肉腫およびＨ９２９ヒト多発性骨髄腫）
増殖は、試薬に対する７２時間の曝露の後のＤＮＡの中への［３Ｈ］−チミジンの取り込みによって評価した。Ｒｈ４１細胞は、９６ウェルマイクロタイタープレート中、３５００細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間後、それらを一連のＩ単量体濃度に対して曝露した。３７℃でのインキュベーションの７２時間後、細胞は、３時間、４μＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＫ）を用いてパルスし、トリプシン処理し、ＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６、ＧＦ／Ｂプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）上に採取し、シンチレーションは、ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ（Ｐａｃｋａｒｄ、ＣＴ）上で測定した。結果は、未処理対照細胞の細胞増殖に対して５０％細胞増殖を阻害するために必要とされる薬剤濃度であるＩＣ５０として表現する。データは、示される標準偏差と共に、３連のウェルの平均を表わす。
Ｉ単量体の特徴づけの結果は、下記の表１２中に示す。
Figure 2012509900
実施例２０
単一特異的および二重特異性ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−ＩＲの１０Ｆｎ３ベースの結合剤のさらなる特徴
ＥＧＦＲまたはＩＧＦ−ＩＲを結合した１０Ｆｎ３ベースの結合剤を、タンパク質がそのコード核酸配列に共有結合されるｍＲＮＡディスプレイの生化学的な選択技術を使用して同定した。受容体が１〜１０ｎＭの濃度で提示される場合にＩＧＦ−ＩＲまたはＥＧＦＲを結合する１０Ｆｎ３ベースのタンパク質−ｍＲＮＡ融合体の集団を、大腸菌の中にクローニングし、１０Ｆｎ３ベースのタンパク質として発現させた。ＥＧＦＲまたはＩＧＦ−ＩＲシグナリングを遮断し、適した生物物理的特性を有した標的結合剤のサブセットを同定した（表１３）。これらの最初のクローンは、標的結合親和性、およびますます低い標的濃度でのさらなるｍＲＮＡの選択を有する細胞の効力、およびより低い解離速度定数の選択について最適化した。選択手順の間に得られたＩＣ５０値は、９〜３０４ｎＭの範囲であり、二重特異性１０Ｆｎ３ベースの結合剤の構築のために広範囲の効力の値から分子を選ぶ機会があることを示す。ＥＧＦＲ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、ＥＧＦＲおよびＥＲＫ、ＥＧＦＲ活性化の下流シグナリング分子のリン酸化の遮断についてＩｎ Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎスクリーニングアッセイによって試験した（方法は実施例１に類似）。類似している研究を最適化ＩＧＦ−ＩＲ結合剤で実行した。最適化ＥＧＦＲ結合クローン（Ｅ３、Ｅ１、およびＥ２）は、インビトロにおいてｐ４２／ｐ４４のＹ１０６８上でのＥＧＦＲリン酸化およびＹ２０４上でのＥＲＫの下流のリン酸化を阻害し、ＩＣ５０値は９〜４０ｎＭの範囲であり、効力は、親ＥＧＦＲクローンよりも１００倍以上高かった（表１３、方法は実施例１に類似）。
Ｉ１は、０．１１ｎＭのＫＤ値でＩＧＦ−ＩＲに結合し、０．２ｎＭのＩＣ５０でＩＧＦ−Ｉ−刺激ＩＧＦ−ＩＲリン酸化を阻害した（表１３、方法は実施例６に類似）。最適化されたＩＧＦ−ＩＲおよびＥＧＦＲ単一ドメイン１０Ｆｎ３ベースの結合剤は、サイズ排除クロマトグラフィーに基づいて＞９５％単量体であり、融解温度＞５６℃を有し（表１３、方法は実施例４に類似）、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（６つのループのうちの５つについて＜７）、Ｔ細胞エピトープマッピングのためのマトリックスベースのアルゴリズムから予測されるように、最小限の免疫原性の可能性を示した［De Groot AS, Moise L (2007) Prediction of immunogenicity for therapeutic proteins: state of the art. Curr Opin Drug Discovery Devel 10:332-340］。１０Ｆｎ３ベースの結合剤Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３は、さらなる開発のために選択し、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイから決定されるように０．７〜１０ｎＭの範囲のＥＧＦＲ結合定数を有した（表１３、方法は実施例５に類似）。これらの１０Ｆｎ３ベースの結合剤のＥＧＦＲ結合は、ユウロピウム標識ＥＧＦを使用する置換アッセイによって測定されるように、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ結合について競合的であった（表１３）（方法は実施例１０に類似）。同様に、ＩＧＦ−ＩＲに対するＩＧＦ−Ｉ結合は、Ｉ１によって阻害された（表１３、方法は実施例１９に類似）。
二重特異性１０Ｆｎ３ベースの結合剤の生物物理的特徴づけ。選択されたＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤のＴｍ値は、４９〜５８℃の範囲であり、それらのＳＥＣプロファイルは、タンパク質が＞９０％単量体であることを示した（表１４、方法は実施例４に類似）。単一特異的１０Ｆｎ３ベースの結合剤およびＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、同等の結合親和性を示したが、単一ドメイン１０Ｆｎ３ベースの結合剤が一緒に結合した場合、Ｔｍ値はわずかに減少した（表１３および１４）。インビボ適用のために血清半減期を増加させるために、Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、４０ｋＤａ分岐ＰＥＧを用いてペグ化した（方法は実施例３に類似）。Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤のペグ化は、結合速度定数の減少により、非ペグ化コンストラクトに比べて結合親和性の１０〜２０倍の低下をもたらしたが、Ｔｍを減少させなかった。さらに、ペグ化は、細胞においてＥＧＦＲ／ＩＧＦ−ＩＲリン酸化の阻害を著しく低下させなかった。ペグ化Ｅ−Ｉの配向（ここに、ＥＧＦＲ結合剤はＮ末端にあり、ＩＧＦ１ＲはＣ末端にある）は、Ｉ−Ｅの配向と比較して、ＥＬＩＳＡによって、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−ＩＲのリン酸化の阻害についてわずかに低いＩＣ５０値を示した。ＫＤ値および生物学的活性における小さな差異がペグ化Ｅ−Ｉ配向 対 Ｉ−Ｅ配向の間で見出されたが、一貫した傾向はなかった。
Figure 2012509900
 ND、行わず;NA、適用可能でない;SEC、サイズ排除クロマトグラフィー。*A431細胞におけるEGFRおよびERKのリン酸化レベルについてのIC50値は、In Cell Westernアッセイ(ICW)によって決定した。H292細胞におけるEGFRおよびIGF-IRのリン酸化レベルは、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)によって決定した。
**IGF-IR結合についての競合。標準偏差は3〜6回の実験からのものとする。
Figure 2012509900
 Tm測定値は、サーマルスキャニングフルロメトリー(thermal scanning flurometry)からのものとする。KD値は、チップ上に吸着した組換えEGFRドメインまたは組換えIGF-IRドメインを使用するBiacore結合アッセイからのものとする。In Cell Westernアッセイ(ICW)は、EI-直列型が、A431細胞におけるEGFRまたはERKのリン酸化を阻害する能力を決定するために行った。酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)は、H292細胞におけるEGFRまたはIGF-IRのリン酸化を決定するために使用した。
実施例２１
Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の種交差反応性
ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析を使用してマウス、ラット、およびサル由来のＥＧＦＲに対するそれらの結合親和性について分析した（実施例５と同一の方法）。マウスＥＧＦＲはＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入し、ラットＥＧＦＲは社内で産生し、サルＥＧＦＲはＫＥＭＰ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から購入した。
表１５中に示されるように、すべてのペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、低ナノモル親和性でマウス、ラット、およびサルのＥＧＦＲに結合したことから、すべてのペグ化Ｅ／Ｉ結合剤がヒト、マウス、ラット、およびサルのＥＧＦＲと交差反応性であることを示す。
Figure 2012509900
実施例２２
さらなるＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の特徴づけ
図４３は、さらなるＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の様々な特徴を要約する。
ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、実施例１において先に記載される方法を使用して、Ａ４３１における、ＥＧＦに誘発されるＥＧＦＲおよびＥＲＫのリン酸化の阻害を決定するために試験した。結果は、ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤が、１２ｎＭ〜２９７ｎＭのＩＣ５０の範囲でＥＧＦに誘発されるＥＧＦＲリン酸化、１２ｎＭ〜２９５ｎＭのＩＣ５０の範囲でＥＲＫのリン酸化を阻害することを実証した（図４３、列ａおよびｂ）。
ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤がＩＧＦＲおよびＥＧＦＲの活性を阻害する能力もまた、実施例６および７において先に記載される方法を使用してＨ２９２細胞において検査した。結果は、ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤が、０．２ｎＭ〜６ｎＭのＩＣ５０の範囲でＩＧＦＲ活性を阻害し（図４３、列ｄ）、１．３ｎＭ〜１２３ｎＭのＩＣ５０の範囲でＥＧＦＲ活性を阻害した（図４３、列ｃ）ことを示した。
ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、それらが、表１６の列ｅおよびｆにおいて示されるように、Ｄｉｆｉ細胞において、ＥＧＦＲおよびＩＧＦＲの分解を誘発することができるかどうかを決定するために試験した。細胞は、１ｕＭのペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤を用いて処理し、７時間でスタートし、１２０時間で終了する時点で採取し、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ１Ｒのレベルは、ウェスタンブロット分析によって決定した。分解の強度は、直列型がその受容体を分解したが、分解が維持されず、受容体発現が時間的経過の間に再現したことを示す（＋）、または直列型が受容体を分解し、時間的経過の全体にわたってその分解を維持したことを示す（＋＋）としてスコア化した。結果（図４３、列ｅおよびｆ）は、ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤が様々なパターンのＥＧＦＲおよびＩＧＦ１Ｒの分解；ＩＧＦＲのみの分解、ＥＧＦＲおよびＩＧＦＲの両方の分解、またはいずれの受容体も分解しない、を示すことを実証した。どの試験した直列型も、ＥＧＦＲのみを分解する能力を示さなかった。
ＥＧＦＲおよびＩＧＦ１Ｒに対するペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の結合親和性は、実施例５において先に記載されるように表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析によって評価した。結果は、ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤が、３．３５ｎＭ〜５７．９ｎＭの間の範囲の親和性でＥＧＦＲに結合し、０．３７ｎＭ〜２．４３ｎＭの間の範囲の親和性でＩＧＦ１Ｒに結合することを実証した（図４３、列ｇおよびｈ）。
ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、実施例１０において先に記載される方法を使用して、Ａ４３１細胞の表面上のＥＧＦＲへのＥＧＦ結合の遮断についてのそれらの効力を決定するために試験した。ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、１９．５ｎＭ〜２３８ｎＭの範囲のＩＣ５０でＡ４３１細胞へのＥＧＦ結合を遮断した（図４３、列ｉ）。
ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、実施例１７において記載される方法を使用して、Ｈ２９２細胞のコロニー形成を阻害するそれらの能力について評価した。図４３、列ｊにおいて示されるように、ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、１ｎＭ〜５６０ｎＭの範囲のＩＣ５０値でコロニー形成を阻害し、試験した４つのペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤のうちの３つは、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体パニツムマブよりも２３〜１４０倍強力であった。４番目のペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、パニツムマブほど強力でなく、パニツムマブの４分の１であった。ペグ化Ｉ１単量体は、ＩＣ５０＞１５ｕＭでＨ２９２においてコロニー形成を阻害するのにわずかにのみ活性であり、これは、Ｈ２９２細胞増殖がＩＧＦ１ＲシグナリングではなくＥＧＦＲシグナリングによって主に駆動されるからであると予想される。
融解温度は、ＤＳＣ（実施例４において先に記載される）または熱色素溶解方法論（ｔｈｅｒｍａｌ ｄｙｅ ｍｅｌｔ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）によってペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤について評価した。熱色素溶解評価については、ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、５０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液ｐＨ４．５中で０．２ｍｇ／ｍＬまで希釈した。それぞれの試料に、０．５％の色素の最終濃度に向けて、ＤＭＳＯ緩衝液中における２００×Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ １ｕｌをスパイクした。それぞれの試料を、９６ウェルトレーの中に装填し、５ｕｌのシリコーンオイルを用いてコートした。トレーは、１，０００ＲＰＭで回転させ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ９６システムに装填し、下記方法を選択した：１０分間２５℃＋１５分間にわたり０．５℃ずつ増やして２５℃〜９５℃プレート読み取り＋プレート読み取り。データ分析は、ＣＦＸソフトウェアを用いて変曲点について実行した。図４３、ｋ列中に示されるように、すべてのペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、４９〜６２．５℃の範囲で、類似するＴｍ測定値を有した。ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤についてのＴｍ測定値は、濃度に無関係であり、試験したすべての濃度で一貫したままであった。ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で１５〜９５℃の走査範囲で測定した例示的な結合剤、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５のＤＳＣ分析は、図２０中に示されるように５５．２℃のＴｍ測定値をもたらした。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、実施例４において先に記載されるようにペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤に対して実行した。ＳＥＣの分析は、図４３（表の列ｌ）中に示されるようにペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤のすべてが＞９５％単量体であることを明らかにした。
実施例２３
選択されたアミノ酸変化を有するＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５の生化学的および生物物理的特性
ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５は、６ＨＩＳタグ（配列番号４８７）なしで、かつさらにリンカー領域に対する様々な改変を用いて構築した。さらに、全体的な変化をすべてのコンストラクトに対して成し、第１の単量体のＣ末端テールは、アスパラギン酸からグルタミン酸（ＤからＥ）への単一の点変化を有した。いくつかのクローンは、代替ペグ化部位をもたらすために、選択したセリン残基をシステインに（ＳからＣに）変異させて作製した。該分子の生化学的および生物物理的特性に対するこれらの変化の効果を比較し、表１７中に概説する。ｐＥＧＦＲの阻害を測定するための方法は、実施例７において記載されており、ｐＩＧＦＲについては実施例６に、ｐＥＲＫについては実施例１において、Ｔｍについては実施例４において、ＥＧＦＲおよびＩＧＦＲのＫＤについては実施例５において記載されている。結合反応速度の詳細な分析もまた、これらのクローンに対して実行し、表１８および１９中に提示する（実施例５において記載されるものに類似している方法を使用）。
Figure 2012509900
 (1)Hisタグはこのコンストラクトに使用しなかった。(2)全体的な変化をペグ化I1-GS10-E5のすべての代替コンストラクトに対して成し、第1の単量体のC末端テールは、アスパラギン酸からグルタミン酸(DからE)への単一の点変化を有した。(3)GSGC(配列番号489)およびGS8(配列番号494)を用いてE5に結合させたI1単量体。(4)E5のテールにGSGC(配列番号489)を有する、GS10を用いてE5に結合させたI1。(5) GS10を用いてE5に結合させたI1、ここにIlは位置62でセリンからシステインへの単一の点変化を有する。(6) GS10を用いてE5に結合させたI1、ここにE5は位置62でセリンからシステインへの単一の点変化を有する。(7)GS10を用いてE5に結合させたI1、ここにIlは位置91でセリンからシステインへの単一の点変化を有する。(8)GS10を用いてE5に結合させたI1、ここにE5は位置91でセリンからシステインへの単一の点変化を有する。(9)このコンストラクトは フローセルへの非特異的結合を示したので、親和性の正確な測定はこの実験において可能ではなかった。
Figure 2012509900
 (1)Hisタグはこのコンストラクトに使用しなかった。(2)全体的な変化をペグ化I1-GS10-E5のすべての代替コンストラクトに対して成し、第1の単量体のC末端テールは、アスパラギン酸からグルタミン酸(DからE)への単一の点変化を有した。(3)GSGC(配列番号489)およびGS8(配列番号494)を用いてE5に結合させたI1単量体。(4)E5のテールにGSGC(配列番号489)を有する、GS10を用いてE5に結合させたI1。(5)GS10を用いてE5に結合させたI1、ここにIlは位置62でセリンからシステインへの単一の点変化を有する。(6) GS10を用いてE5に結合させたI1、ここにE5は位置62でセリンからシステインへの単一の点変化を有する。(7)GS10を用いてE5に結合させたI1、ここにIlは位置91でセリンからシステインへの単一の点変化を有する。(8) GS10を用いてE5に結合させたI1、ここにE5は位置91でセリンからシステインへの単一の点変化を有する。
Figure 2012509900
 (1)Hisタグはこのコンストラクトに使用しなかった。(2)全体的な変化をペグ化I1-GS10-E5のすべての代替コンストラクトに対して成し、第1の単量体のC末端テールは、アスパラギン酸からグルタミン酸(DからE)への単一の点変化を有した。(3)GSGC(配列番号489)およびGS8(配列番号494)を用いてE5に結合させたI1単量体。(4)E5のテールにGSGC(配列番号489)を有する、GS10を用いてE5に結合させたI1。(5) GS10を用いてE5に結合させたI1、ここにIlは位置62でセリンからシステインへの単一の点変化を有する。(6) GS10を用いてE5に結合させたI1、ここにE5は位置62でセリンからシステインへの単一の点変化を有する。(7) GS10を用いてE5に結合させたI1、ここにIlは位置91でセリンからシステインへの単一の点変化を有する。(8) GS10を用いてE5に結合させたI1、ここにE5は位置91でセリンからシステインへの単一の点変化を有する。
実施例２４
ＥＧＦＲおよびＩＧＦＲの共有下流シグナリング経路の阻害
下流シグナリング経路の阻害は、実施例８において先に記載されるものに同一のｐＡＫＴ ＥＬＩＳＡを用いて分析した。この研究の結果は、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５が、Ｈ２９２細胞におけるＩＧＦ１刺激ＡＫＴ活性化の遮断にて、ペグ化Ｉ１単独よりも強力であることを実証する。ペグ化Ｅ５、ＥＧＦＲ単一特異的結合剤のみでは、ＩＧＦ１刺激によるＡＫＴの活性化を効率的に予防しなかった（図２１）。
実施例２５
１０Ｆｎ３ベースの結合剤およびコンパレーター（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）抗体による細胞増殖の阻害
Ｈ２９２およびＲＨ４１の細胞増殖実験は、実施例９において記載されるように行った。ＥＧＦＲ単一特異的１０Ｆｎ３ベースの結合剤、ペグ化Ｅ５は、０．０１６μＭのＩＣ５０値でＨ２９２細胞の増殖を阻害した。ＩＧＦＲ単一特異的１０Ｆｎ３ベースの結合剤、ペグ化Ｉ１は、＞８．４μＭのＩＣ５０値を有したが、Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５は、０．００６μＭのＩＣ５０値でわずかにより強力であった（図２２）。Ｈ２９２細胞系は、肺癌起源のものであり、ＩＧＦＲおよびＥＧＦＲの阻害に対して感受性であった［(Akashi Y, et al. (2008) Enhancement of the antitumor activity of ionising radiation by nimotuzumab, a humanised monoclonal antibody to the epidermal growth factor receptor, in non-small cell lung cancer cell lines of differing epidermal growth factor receptor status. Br. J. Cancer 98:749-755およびBuck E, et al. (2008) Feedback mechanisms promote cooperativity for small molecule inhibitors of epidermal and insulin-like growth factor receptors. Cancer Res. 68:8322-8332.)］。対照的に、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５結合剤およびペグ化Ｉ１結合剤のみでは、ＲＨ４１細胞の増殖を阻害した（ＩＣ５０値は、それぞれ、０．０００２および０．０００４μＭであった、図２３）。これは、ＲＨ４１が、ＩＧＦＲシグナリングによって主に駆動されることが知られている小児横紋筋肉腫細胞系であり［(Huang F, et al. (2009). The mechanisms of differential sensitivity to an insulin-like growth factor-1 receptor inhibitor (BMS-536924) and rationale for combining with EGFR/HER2 inhibitors. Cancer Res. 69:161-170)］、したがって、ＥＧＦＲ遮断に対して感受性でないからであると予想された。
実施例２６
ペグ化および非ペグ化１０Ｆｎ３ベースの結合剤によるインビトロ受容体活性化および下流シグナリングの阻害
ＥＧＦＲ／ＩＧＦＲシグナリングの動態およびペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５によるその阻害を理解するために、ＤｉＦｉ、Ｈ２９２、またはＢｘＰＣ３細胞は、血清を欠乏させ、１μＭまたは０．１μＭのペグ化Ｅ５、ペグ化Ｉ１、もしくはペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５またはビヒクル対照に２時間曝露し、次いで、１０分間、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、またはＥＧＦ＋ＩＧＦ−Ｉを用いて刺激した。
細胞は、インビトロにおいて培養し、一晩、血清を欠乏させ、次いで、１０Ｆｎ３ベースの結合剤に２時間曝露した後、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦまたはＩＧＦを用いて刺激した。細胞溶解物は、溶解緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％グリセロール、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、Ｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット［Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ］、およびホスファターゼ阻害剤カクテル２［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．］）中で調製した。溶解物（３０μｇ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、膜に転写し、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を有するＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）中で、ホスホＥＧＦＲおよび全ＥＧＦＲ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ホスホＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ホスホｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、または全アクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）に対する抗体を用いてイムノブロットした。膜は、適切な二次抗体と共にインキュベートした。タンパク質の可視化は、ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線画像システムを使用して実行した。
図２４中で示されるように、リン酸化ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、およびＡＫＴの基本レベルは、血清廃除後ほとんど検出不可能であった。ＤｉＦｉ細胞において、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５もペグ化Ｅ５（単一特異的ＥＧＦＲ結合剤）も、ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化を完全に抑制することができない。Ｈ２９２細胞およびＢｘＰＣ３細胞において、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５およびペグ化Ｅ５の両方によってＥＧＦＲリン酸化が強く阻害されている。ＤｉＦｉ細胞およびＢｘＰＣ３細胞において、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５は、ペグ化Ｉ１（単一特異的ＩＧＦＲ結合剤）単独よりもＩＧＦ刺激ＩＧＦＲリン酸化を遮断する。Ｈ２９２細胞において、ＥＧＦＲが遮断される場合に限り、ＩＧＦ刺激はＥＧＦＲを交差活性化する。ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５は、ＤｉＦｉにおいてＥＧＦ刺激ｐＡＫＴを阻害し、ＥＧＦ刺激Ｈ２９２においてｐＡＫＴを増加させ、ＢｘＰＣ３においてＥＧＦはｐＡＫＴを活性化しなかった。ＤｉＦｉ、Ｈ２９２、およびＢｘＰＣ３細胞において、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５は、個々のペグ化Ｅ５およびペグ化Ｉ１単独よりもＩＧＦ刺激ｐＩＧＦＲを阻害した。ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５は、ＤｉＦｉ、Ｈ２９２、またはＢｘＰＣ３において、ＥＧＦ刺激ｐＥＲＫに対する効果を、あったとしてもほとんど有していなかった。ＩＧＦ刺激は、検査したあらゆる細胞系においてｐＥＲＫを誘発しなかった。
非ペグ化 １０Ｆｎ３ベースの結合剤を用いる他の実験において、Ｈ２９２細胞は、血清を欠乏させ、１μＭ非ペグ化単一特異的ＥＧＦＲ結合剤Ｅ２、ＩＧＦＲ結合剤Ｉ１、もしくはＥ２−ＧＳ１０−Ｉ１またはビヒクル対照に１時間曝露し、次いで、１０分間、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、またはＥＧＦ＋ＩＧＦ−Ｉを用いて刺激した。リン酸化ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、およびＡＫＴの基本レベルは、血清廃除後ほとんど検出不可能だった（図２５）。ＥＧＦを用いる刺激は、ＥＧＦＲリン酸化を誘発したが、ＩＧＦＲをトランス活性化しなかった。ＥＧＦＲリン酸化は、Ｅ２およびＥ２−ＧＳ１０−Ｉ１によって遮断されたが、Ｉ１によって遮断されなかった。同様に、ＩＧＦ−Ｉを用いる刺激は、ＩＧＦＲの強いリン酸化を誘発し、それは、Ｉ１およびＥ２−ＧＳ１０−Ｉ１によって遮断されたが、Ｅ２によって遮断されなかった。ＥＧＦ刺激は、わずかにのみＡＫＴリン酸化を増加させたが、ＩＧＦ−ＩまたはＥＧＦ＋ＩＧＦ−Ｉは、ＡＫＴのリン酸化を強く誘発し、それは、Ｉ１およびＥ２−ＧＳ１０−Ｉ１の両方によって基本レベルまで抑制された。ＩＧＦ−ＩおよびＥＧＦの組合せは、どちらかの単独の増殖因子よりも、ＡＫＴリン酸化を大きく誘発した。Ｅ２は、ＥＧＦおよびＩＧＦ−Ｉの組合せによって誘発されたｐＡＫＴを部分的に低下させた。しかしながら、Ｉ１は、ｐＡＫＴにおいて最も劇的な低下を示し、このことは、ＥＧＦ＋ＩＧＦ−Ｉを用いる刺激がＩＧＦＲ経路を通しての強いＡＫＴリン酸化を導いたことを示唆する。驚いたことに、Ｅ２によるＥＧＦＲ経路の遮断、次いでＥＧＦリガンドでの刺激は、おそらくＡＫＴのＥＧＦＲ非依存性の活性化の結果として、ＡＫＴのリン酸化を実際に増加させた（(Dobashi Y, et al. (2009) EGFR-dependent and independent activation of Akt/mTOR cascade in bone and soft tissue tumors. Mod Pathol (Epub Ahead of Print)）。これらの結果は、ＥＧＦＲ経路およびＩＧＦＲ経路の間の複雑なクロストークならびにフィードバックメカニズムを示す。
実施例２７
Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤を用いる競合結合研究
Ｂｉａｃｏｒｅ競合実験については、ＥＧＦＲ−Ｆｃ（Ｎａアセテート ｐＨ５．０中３μｇ／ｍＬ）は、３００ＲＵの表面密度まで、標準ＥＤＣ／ＮＨＳアミドカップリング化学反応を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５チップ表面上に固定した。ＥＧＦＲ抗体は、市販の薬剤として得、ＥＧＦＲ−Ｆｃへの結合についての単一特異的ＥＧＦＲ結合剤Ｅ２および抗体の間の競合は、４５０ｎＭ Ｅ２（３０μＬ／分、２００秒の接触時間）、直後に４５０ｎＭ Ｅ２のみ、または４５０ｎＭ Ｅ２および４５０ｎＭセツキシマブ、パニツムマブ、もしくはニモツズマブの混合物（３０μＬ／分、２００秒間の接触時間）を結合することによって評価した。表面は、３０μＬ／分の流速で５０ｍＭ ＮａＯＨの２回の１０秒間のパルスを使用して、サイクルの間に再生するのに成功した。Ｅ２の最初の注入は、チップの表面上のＥＧＦＲへの結合を示す。等量のセツキシマブ、パニツムマブ、またはニモツズマブと混合したＥ２の第２の注入は、Ｅ２による、ＥＧＦＲへの抗体の結合についての競合を示さない（図２６Ａ）。
表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析は、Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤による、捕捉ＥＧＦＲ−Ｆｃおよび溶液相ＩＧＦ１Ｒの同時の結合を示すために利用した。組換えヒトＥＧＦＲ−Ｆｃ（ヒトＦｃに融合されたヒトＥＧＦＲの細胞外ドメインのアミノ酸１〜６４５）は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。組換えＩＧＦ１Ｒ（タンパク分解性で切断し、ジスルフィド結合したヒトＩＧＦ１Ｒプロペプチドのアミノ酸１〜９３２）は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。同時の結合を明らかにするために、抗ヒトＩｇＧは、メーカーの推奨（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に従って、ＣＭ５チップのフローセル１および２上に固定した。ＥＧＦＲ−Ｆｃ（５０ｎＭ）は、２分間、１０ｕｌ／分でフローセル２上に捕捉した。ＥＧＦＲ−ＦｃへのＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の結合は、２分間、１０ｕｌ／分で両方のフローセルに対して１０Ｆｎ３ベースのタンパク質試料（１００ｎＭ）を注入することによって達成した。ＥＧＦＲ−ＦｃおよびＩＧＦ１Ｒの同時の結合は、続いて２分間、３０ｕｌ／分で両方のフローセルに対してＩＧＦ１Ｒ（０，１００ｎＭ）を注入することによってプローブした。複合体の解離は、３００秒間モニターした。３Ｍ ＭｇＣｌ２の２回の３０秒間の注入を、抗ヒトＩｇＧ表面からの結合複合体の再生のために使用した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、バージョン２．０．１（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ｂｉａｃｏｒｅ）は、センサーグラムをオーバーレイし、エアースパイクを除去するために利用した。図２６Ｂにおいて示されるように、Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の両方のドメインは、機能的であり、ＥＧＦＲ−ＦｃおよびＩＧＦ１Ｒに同時に結合することができる。
ＨＥＲファミリー受容体へのペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１の結合特異性は、実施例５において記載されるようにＢｉａｃｏｒｅによって評価した。ＨＥＲ−２−Ｆｃ、ＨＥＲ−３−Ｆｃ、およびＨＥＲ−４−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、抗ヒトＩｇＧを用いてＣＭ５チップの表面上に捕捉した。ペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１は、強い結合がＥＧＦＲ−Ｆｃ（ＨＥＲ−１）について見られた条件下で、他のＨＥＲファミリーメンバーへのいかなる識別可能結合も示さなかった（表２０）。
Figure 2012509900
実施例２８
血漿バイオマーカーの測定
可溶性バイオマーカーＴＧＦαおよびｍＩＧＦ１のレベルは、異種移植片研究の終了時にマウス血漿において、または処理後の様々な時間に腫瘍を有していないマウスにおいて測定された。血液は、抗凝固薬としてＥＤＴＡを含有するチューブの中に末端心穿刺（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃａｒｄｉａｃ ｐｕｎｃｔｕｒｅ）によって得た。血漿は、４℃で１０分間、１３００ｘｇで血液を遠心分離し、個別のチューブに清澄化した上清を移すことによって調製した。メーカー（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によって推奨されるようにＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＴＧＦαレベルは、０．１ｍｌの血漿中で測定し、ｍＩＧＦ１レベルは、０．０２ｍｌの血漿中で測定した。ＴＧＦαの血漿レベルは、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５またはペグ化単一特異的ＥＧＦＲ結合剤Ｅ５を用いて処理したマウスにおいて増加したが、セツキシマブでは増加しなかった（図２７Ａ〜Ｃ）。このＴＧＦαは、ヒト腫瘍から分泌されることができ、または内因的なマウスＴＧＦαを表わすこともある。ヒトおよびマウスのＴＧＦαの間の高い相同性（９３％のアミノ酸同一性）により、ＥＬＩＳＡは、マウスＴＧＦαと交差反応しうる。さらに、移植腫瘍によって分泌されたヒトＴＧＦαは、マウスＥＧＦＲに結合することができる。ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５およびペグ化Ｅ５がヒトおよびマウスのＥＧＦＲの両方を結合することができるので、すべての宿主および腫瘍ＥＧＦＲ結合部位は、これらの１０Ｆｎ３ベースの結合剤によって遮断されるが、セツキシマブは、マウスＥＧＦＲを結合しない。これらの１０Ｆｎ３ベースの結合剤が内因的なマウスＴＧＦαの増加を引き起こすかどうか、およびＥＬＩＳＡがマウスＴＧＦαと交差反応するかどうかを決定するために、腫瘍を有していないヌードマウスに、１００ｍｇ／ｋｇでペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５を投薬し、血漿試料を服用の４、２４、４８、７２時間後に採取した。マウスＴＧＦαの増加は、実際、７２時間以上持続することが観察された（図２８Ａ）。非腫瘍マウス由来の血漿試料もまた、マウス特異的ＥＬＩＳＡを用いて、ｍＩＧＦ１について試験し、該リガンドの増加も観察された（図２８Ｂ）。
実施例２９
様々なＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤についてのインビボヒト腫瘍異種移植片研究の結果
いくつかのＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、相対的活性の差異を確かめることができるように、先に使用したよりも低用量で一対一のＨ２９２ ＮＳＣＬＣ研究において評価した（実施例１２において記載される方法）。０．６２５ｍｇ／マウスの単一の用量でのＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤 ペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１、ペグ化Ｅ４−ＧＳ１０−Ｉ１、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ８５、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ４、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ１０５ならびに２つの用量（１ｍｇ／マウスおよび０．１ｍｇ／マウス）でのパニツムマブの効能を比較した。
この研究において評価したパニツムマブおよびすべてのＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の両方の用量は、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）エンドポイントまで活性であった。投薬フェーズの間に、ペグ化Ｅ４−ＧＳ１０−Ｉ１、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ４、およびパニツムマブはすべて、腫瘍退縮を引き起こしたが（表２１、１００％を超えるＴＧＩ値）、ペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ８５、およびペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ１０５は、腫瘍増殖阻害を引き起こした（表２１、１００％までのＴＧＩ値）。対照群と比較した場合、活性の差異は統計的に有意であった。すべての処理は、研究の経過にわたって処理に関連する死亡または過度の体重減少はなく、十分に耐性であった。Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤およびパニツムマブの効能の比較は、下記の表２１および図２９中に提示する。図２９Ａにおいて、４３日目までの測定値は、投薬を停止した後の腫瘍の再増殖のパターンを示す。図２９Ｂは、２７日目までの測定値を示し、Ｙ軸は、処理群の間の活性の相対的差異を示すために拡大する。
Figure 2012509900
 aビヒクルはリン酸緩衝生理食塩水とした。使用される略語は以下のとおりとする:ip、腹腔内ルート;TGI%、TGI%=[(Ct-Tt)/(CtC0)]×100として計算した相対的腫瘍増殖阻害%、式中、Ct=腫瘍移植後の日数の時間tでの対照マウスの中央腫瘍重量、Tt=時間tでの処理マウスの中央腫瘍重量、C0=時間0での対照マウスの中央腫瘍重量とする。TGI%値は、20日目、24日目、および27日目の平均阻害として2つの時点で計算した。結果、>50%の統計的に有意なTGI%値をもたらした場合、処理レジメンは、活性であると見なした;q3dx5;6、化合物は腫瘍移植後の6日目にスタートして6回の服用について3日ごとに投与した;6オン/1オフ;6、化合物は6日間1日1回投与し、次いで、1日間は未処理とし、このレジメンは腫瘍移植後6日目にスタートした。p値は、群当たり8つの測定値を用いる両側対応検定において対照群に比べて20日目に計算した。
さらに、インビボ研究は、実施例１２において記載される方法を使用して、様々な異種移植片モデルにおいて、下記の選択したＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤を用いて実行した。様々な異種移植片モデルの種類は以下のとおりである：Ｈ２９２は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であり、より詳細に実施例１２において記載されている；ＭＣＦ７ｒ乳癌は、実施例１４において記載されている；ＧＥＯ結腸癌は、実施例１５において記載されている。ＤｉＦｉヒト結腸癌は、高レベルの活性化ＥＧＦＲを発現し、また、ＩＧＦＲをも発現する；ＲＨ４１は、ＩＧＦＲシグナリングによって主に駆動されることが知られている小児横紋筋肉腫細胞系であり［(Huang F, et al. (2009). The mechanisms of differential sensitivity to an insulin-like growth factor-1 receptor inhibitor (BMS-536924) and rationale for combining with EGFR/HER2 inhibitors. Cancer Res. 69:161-170)］、したがって、ＥＧＦＲ遮断に対して感受性でない；Ｃａｌ２７は、高レベルのＥＧＦＲおよび中程度のレベルのＩＧＦＲを発現するヒト頭頸部癌である；ＢｘＰＣ３は、ヒト膵臓癌である；Ｈ４４１は、ＮＳＣＬＣである。
選択したＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の効能の比較を表２２中に示す。これらの効能研究において、すべてのＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、パニツムマブに対する等しい活性を示し、すべての処理により、１００％を超えるＴＧＩ％値によって示されるように、それらのスタートサイズ未満にＨ２９２腫瘍を退縮させることができた。ＤｉＦｉ研究において、パニツムマブは、１ｍｇ／マウスの用量で腫瘍を退縮し、０．１ｍｇ／マウスの用量で活性であったが、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５が腫瘍増殖のいくらかの阻害を示した（ＴＧＩ＝４３．８％）が、すべてのＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、不活性であった。ＲＨ４１研究において、パニツムマブは、どちらかの用量でも活性ではなく、ペグ化Ｅ２コンストラクトは、活性ではなかったが、Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤およびペグ化Ｉ１コンストラクトはすべて活性であった。図３２は、代表的なコンストラクト ペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１についてのＲＨ４１モデルにおける抗腫瘍効能を示す（データはまた表２３中でも示される）。Ｃａｌ２７研究において、パニツムマブは、１ｍｇ／マウスの用量で腫瘍を退縮し、０．１ｍｇ／マウスの用量で活性であったが、Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤のなかでは、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５ Ｅ／Ｉ１０Ｆｎ３コンストラクトのみが活性であった。
相乗効果を評価するために設計したペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５ならびに個々のＩ１およびＥ５の構成成分を用いるヒト腫瘍異種移植片研究の結果を表２３中に提示する。これらの組合せ（相乗効果）の研究は、Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の個々の部分（つまりペグ化ＩＧＦＲおよびＥＧＦＲ単一特異的バージョン）が含まれるように組み立てた、そのため、単離末端の寄与以上の抗腫瘍効果を識別することができた。ＭＣＦ７ｒ研究において、ペグ化Ｉ１は、活性ではなかったが、ペグ化Ｅ５、（ペグ化Ｅ５＋ペグ化Ｉ１）、およびペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５クローンはすべて活性であり、類似する活性を示し、このことは、すべての抗腫瘍活性がおそらくＥＧＦＲの阻害から生じ、ＩＧＦＲ経路の遮断はいかなる増強をももたらさなかったことを意味する。セツキシマブは１ｍｇ／マウスの用量で腫瘍を退縮し、０．１ｍｇ／マウスの用量で活性ではなかった。ＢＭＳ−７５４８０７もまた、活性ではなく、このことは、小分子阻害剤を用いるＩＧＦＲ経路の遮断は、このモデルにおいて効能をもたらさなかったことを示す。
ＢｘＰＣ３研究において、ペグ化Ｉ１は、活性ではなかったが、ペグ化Ｅ５および（ペグ化Ｅ５＋ペグ化Ｉ１）クローンは、活性であった（それぞれＴＧＩ＝６１．２％および６８．８％）。ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５クローンは、該クローンを構成する個々の部分よりも活性であり（ＴＧＩ＝７８％）、差異は、両側対応ｔ検定によって統計的に有意であり、このことは、該モデルにおいて相乗的な活性を有することを示す。セツキシマブは、研究したすべての用量で活性であったが、ＩＧＦＲ阻害において、ペグ化Ｉ１とそれを組み合わせることによる追加は、相乗効果をもたらさなかった。
ＧＥＯ研究において、ペグ化Ｉ１は、活性ではなかったが、ペグ化Ｅ５および（ペグ化Ｅ５＋ペグ化Ｉ１）およびペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５クローンは、活性であった（それぞれＴＧＩ＝８３．５％、９２．１、および９２．１％）。このモデルにおいてＥＧＦＲおよびＩＧＦＲの阻害を相互に組み合わせることによってもたらされたいくらかの増強があったかもしれないが、差異は、ペグ化Ｅ５単独ほど有意に効果的ではなかった。セツキシマブは、研究した両方の用量で活性であったが、ＩＧＦＲ阻害において、ペグ化Ｉ１と組み合わせることによる追加は、相乗効果をもたらさなかった。
Ｈ４４１研究において、ペグ化Ｉ１およびペグ化Ｅ５は、単独で活性でなかったが、（ペグ化Ｅ５＋ペグ化Ｉ１）は活性であった（ＴＧＩ＝５４．５％）。ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５クローンは、該クローンを構成する個々の部分よりも活性であったが（ＴＧＩ＝６９．２％）、差異は統計的に有意ではなく、このことは、該モデルにおいて活性の増強をもたらしたが、相乗効果をもたらさなかったことを示す。セツキシマブは１ｍｇ／マウスの用量で活性であり、０．１ｍｇ／マウスの用量で活性ではなかった。ＩＧＦＲ阻害においおて、ペグ化Ｉ１とそれを組み合わせることによる追加は、このモデルにおいていかなる増強をももたらさなかった。
Figure 2012509900
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実施例３０
マウスにおける様々なＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の薬物動態プロファイル
ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤、Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１の薬物動態プロファイルは、腹腔内注射を介してマウスにおいて評価した。用量群当たり３匹のヌードマウスに、１０および１００ｍｇ／ｋｇ、ｉｐでＰＢＳ中で処方したＥ２−ＧＳ１０−Ｉ１を投薬し、血漿試料は、投薬前、投薬の０．５、２、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、１４４、および１６８時間後に、クエン酸リン酸デキストロース溶液中に収集した。血漿試料は、血漿試料中のペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤を検出し、定量するために開発された定量的電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイを使用して、ペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１ Ｆｎ３ベースの結合剤レベルについて評価した。このアッセイにおいて、血漿試料中のペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の捕獲を可能にするために、ＥＧＦＲ結合領域への特異性を有するマウスモノクローナル抗体をＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプレートに４℃で一晩吸着させた。血漿試料はプレートに追加し、１時間２２℃でインキュベートした。捕捉されたペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤は、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧと結合したヤギ抗ウサギ抗体と混合したＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤のスキャフォールド領域に対して特異的なウサギポリクローナル抗体によって検出した。非結合ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ試薬を除去するために洗浄した後に、読み取り緩衝液（ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ）を追加し、ＥＣＬ検出を使用した。血漿試料中のペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１のレベルは、ペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１ Ｆｎ３ベースの結合剤の標準曲線の４パラメーターフィットに対する比較に基づいて計算した。
１０または１００ｍｇ／ｋｇのペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１を腹腔内（ｉｐ）投与したマウスは、約２００および１７００μｇ／ｍＬのピークレベルをそれぞれもたらし、用量に比例する薬物動態を示した（図３０）。図３０についての薬物動態パラメーターは、下記の節において記載されるものに類似する方法で計算した（「Ｔ １／２」は「ＨＬ ｌａｍｂｄａ ｚ」と交換可能であり、ＡＵＣは「ＡＵＣＩＮＦ ｏｂｓ」と交換可能であることに注意されたい）。マウスにおけるペグ化Ｅ２−ＧＳ１０−Ｉ１の半減期は、１５．７５±１．５２時間であった（図３０）。これらの薬物動態パラメーターに基づいて、ヒト腫瘍異種移植片研究における、毎週３回（ＴＩＷ）の１００ｍｇ／ｋｇの投与は、インビトロにおけるＩＣ５０値よりも１０〜１００倍高い薬剤レベルを維持することができた。
さらなる薬物動態実験を、いくつかのペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤に対して行い、マウスに、１０または１００ｍｇ／ｋｇを腹腔内に（ｉｐ）、ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５については１０または６４ｍｇ／ｋｇを皮下に（ｓｃ）投与し、上記のように血漿を収集および分析して、ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤のレベルを測定した。これらの様々なＥ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤の薬物動態パラメーターは、血漿（血清）濃度 対 時間データの非コンパートメント解析によって得た。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（バージョン５．１、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣＡ）は、終末相半減期（ＨＬ ｌａｍｂｄａ ｚ）、最高血中濃度（Ｃｍａｘ）、０時間から無限時間までの曲線下面積（ＡＵＣＩＮＦ ｏｂｓ）、クリアランス（ＣＬ Ｆ ｏｂｓ）、終末相に基づく分布容積（Ｖｚ Ｆ ｏｂｓ）、および無限時間までの平均滞留時間（ＭＲＴＩＮＦ ｏｂｓ）を計算するために使用した。結果は、ペグ化Ｅ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースの結合剤についての半減期が、図４４および図３１中に示されるように、１２．１〜２０．９時間であったことを示した。
実施例３１
薬力学
試料は、研究の終了時に表２２中に記載されるＨ２９２およびＤｉＦｉ異種移植片モデルから採取し、ＥＧＦＲおよびＩＧＦＲタンパク質の全レベルならびにリン酸化ＥＧＦＲおよびＩＧＦＲの分析のために実施例１２における「腫瘍における薬力学的エンドポイントの測定」で概説されるように処理した。ペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５およびパニツムマブの標的効果は、実施例１１において記載されるようにイムノブロットすることによって評価した。図３３Ａにおいて、全ＥＧＦＲ、ｐＥＧＦＲ、および全ＩＧＦＲのレベルは、ＤｉＦｉ異種移植片モデルの終了時に未処理腫瘍よりもペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５処理腫瘍においてより低かった。図３３Ｂにおいて、ｐＥＧＦＲのレベルは、パニツムマブおよびペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５を用いて処理した腫瘍においてより低かった。全ＥＧＦＲのレベルは、パニツムマブ処理腫瘍においてではなくペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５処理腫瘍においてのみ、より低かった。全ＩＧＦＲのレベルは、両方のペグ化Ｉ１−ＧＳ１０−Ｅ５処理腫瘍および一方のパニツムマブ処理腫瘍においてより低かったが、他方は低くなかった。これらのモデルにおけるｐＩＧＦＲの量は低すぎたので、処理後に検出することができなかった。イムノブロットは、タンパク質の負荷量が等しいことを明らかにするために、ＧＡＰＤＨを用いてプローブした。
実施例３２
ＥＧＦＲ １０Ｆｎ３ベースの結合剤最適化およびコンセンサス配列分析
１０Ｆｎ３ベースの結合剤６７９Ｆ０９（ＰＣＴ ＷＯ２００９／１０２４２１において記載される）（図３４）は、ＥＧＦＲ外部ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する結合剤として同定した。結合活性は、ＥＧＦＲ−Ｆｃを用いてコートしたビーズおよびそれらの核酸コード配列に結合した１０Ｆｎ３ベースの結合剤を使用して選択した［たとえばXu et al., Directed Evolution of High-Affinity Antibody Mimics Using MRNA Display, Chem. Biol. 9: 933-942 (2002)を参照されたい］。ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループにおいてアミノ酸配列に対する改変を有する親ＥＧＦＲ結合剤６７９Ｆ０９のより強力な変異体もまた、同定した。
配列分析Ｉ：ＥＧＦＲに対する高親和性結合について選択したすべての１０Ｆｎ３ベースの結合剤
ＥＧＦＲに対する強い親和性を特徴づけた配列パターンを示すために、すべての特有のＥＧＦＲ結合配列（１０４４）をいくつかの方法を使用して分析した。最初に、該配列は、ループ中のそれぞれの位置のアミノ酸の頻度によって分析した（図３５〜３８）。それぞれのループについての特有の配列のみを分析した。
上記の配列分析から、以下の広範囲の配列モチーフが特徴づけられた：
配列モチーフ＃１
（ａ）ＢＣループ：位置７〜８における「ＹＱ」（つまり、配列番号１の位置２９および３０に対応する）
（ｂ）ＤＥループ：位置３における脂肪族残基（「Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ａ」）（つまり、配列番号１の位置５４に対応する）
（ｃ）ＦＧループ：位置１における「Ｄ／Ｎ」（つまり、配列番号１の位置７７に対応する）
分析した１０４４の配列は、１つを除きすべてが、ＦＧループ配列パターン（ｃ）に従う。分析したすべての特有の配列のうち、９０％は、ＢＣループについてのパターン（ａ）に従い、９５％は、ＤＥループについてのパターン（ｂ）に従う。分析した配列は、４つを除きすべてが、３つの上記のパターンのうちの少なくとも２つに従う。さらに、１５アミノ酸ＦＧループ長は、注目すべき配列特徴である。
上記に特徴づけた広範囲の配列モチーフ＃１に加えて、図３５〜３８におけるデータは、それぞれの位置の優勢な残基に基づいて第２の配列モチーフを特徴づけるために使用した。残基は、最も頻繁なアミノ酸の上位３つの合計が５０％を超えた場合、このモチーフ中に含めた。
配列モチーフ＃２
（ａ）ＢＣループ：ＸＸＸＸＸＸＹＱ（モチーフ＃１と同じ）、Ｘは任意のアミノ酸とする
（ｂ）ＤＥループ：（Ｇ／Ｙ／Ｈ）（Ｄ／Ｍ／Ｇ）（Ｖ／Ｌ／Ｉ）Ｘ、Ｘは任意のアミノ酸とする
（ｃ）ＦＧループ、１０アミノ酸長：
（Ｄ／Ｎ）（Ｙ／Ｍ）（Ｙ／Ａ／Ｍ）（Ｙ／Ｈ／Ｆ）（Ｋ／Ｑ／Ｖ）（Ｅ／Ｐ／Ｒ）（Ｙ／Ｔ／Ｋ）Ｘ（Ｅ／Ｙ／Ｑ）（Ｙ／Ｇ／Ｈ）、ここで、Ｘは任意のアミノ酸とする
（ｄ）ＦＧループ、１５アミノ酸長：
Ｄ（Ｙ／Ｆ／Ｗ）（Ｙ／Ｆ／Ｋ）（Ｎ／Ｄ／Ｐ）（Ｐ／Ｈ／Ｌ）（Ａ／Ｔ／Ｖ）（Ｔ／Ｄ／Ｓ）（Ｈ／Ｙ／Ｇ）（Ｅ／Ｐ／Ｖ）（Ｙ／Ｈ）（Ｔ／Ｋ／Ｉ）（Ｙ／Ｆ）（Ｈ／Ｎ／Ｑ）（Ｔ／Ｑ／Ｅ）（Ｔ／Ｓ／Ｉ）
配列モチーフ＃１および＃２を特徴づけるために使用した分析法は、ループ内のそれぞれの残基位置を別々に評価する。ループ内の複数の残基にわたるあらゆる配列モチーフを示すために、１０Ｆｎ３ベースの結合剤はさらなる分析に付した。該分析において、ループ配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用してアライメントした（Thompson JD et al. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994）。このアライメントから、配列のファミリーは、手動の検査を使用してグループ化した。ＢＣおよびＤＥのループについては、配列モチーフ＃１および＃２に類似している配列パターンが観察された。しかしながら、さらなる配列モチーフを１０および１５アミノ酸長のＦＧループについて特徴づけることができた。
配列モチーフ＃３
（ａ）ＦＧループ、１０アミノ酸長
（１）ＤＹ（Ａ／Ｙ）ＧＫＰＹＸＥＹ（配列番号４７３）、Ｘは任意のアミノ酸とする
（２）ＤＹ（Ａ／Ｙ）Ｙ（Ｋ／Ｒ／Ｑ／Ｔ）ＰＹＸＥＹ（配列番号４７４）、Ｘは任意のアミノ酸とする
（３）（Ｄ／Ｎ）Ｙ（Ａ／Ｙ）（Ｙ／Ｆ）（Ｋ／Ｒ／Ｑ／Ｔ）ＥＹＸＥ（Ｙ／Ｈ）（配列番号４７５）、Ｘは任意のアミノ酸とする
（４）ＤＹＹ（Ｈ／Ｙ）Ｘ（Ｒ／Ｋ）Ｘ（Ｅ／Ｔ）ＹＸ（配列番号４７６）、Ｘは任意のアミノ酸とする
（５）ＤＹＹ（Ｈ／Ｙ）（Ｋ／Ｈ／Ｑ）（Ｒ／Ｋ）Ｔ（Ｅ／Ｔ）Ｙ（Ｇ／Ｐ）（配列番号４７７）
（６）（Ｄ／Ｎ）ＭＭＨＶ（Ｅ／Ｄ）ＹＸＥＹ（配列番号４７８）、Ｘは任意のアミノ酸とする
（７）ＤＹＭＨＸＸＹＸＥＹ（配列番号４７９）（６７９Ｆ０９のＦＧループと同様）、Ｘは任意のアミノ酸とする
（８）Ｄ（Ｍ／Ｙ）ＹＨＸ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ）ＹＧ（配列番号４８０）、Ｘは任意のアミノ酸とする
（ｂ）ＦＧループ、１５アミノ酸長
（１）Ｄ（Ｙ／Ｆ）（Ｙ／Ｆ）ＮＰＸＴＨＥＹＸＹＸＸＸ（配列番号４８１）、Ｘは任意のアミノ酸とする
（２）Ｄ（Ｙ／Ｆ）（Ｙ／Ｆ）Ｄ（Ｐ／Ｌ）Ｘ（Ｔ／Ｓ）ＨＸＹＸＹＸＸＸ（配列番号４８２）、Ｘは任意のアミノ酸とする
（３）Ｄ（Ｙ／Ｆ）（Ｋ／Ｒ）ＰＨＸＤＧＰＨ（Ｔ／Ｉ）ＹＸＥ（Ｓ／Ｙ）（配列番号４８３）、Ｘは任意のアミノ酸とする
配列分析ＩＩ：ＥＧＦＲリン酸化のより強力な阻害を示す１０Ｆｎ３ベースの結合剤
他の全体的な配列分析は、細胞ベースのアッセイにおいて最も強力な活性を示した１０Ｆｎ３ベースの結合剤のサブセットに対して実行した（配列分析Ｉとは対照的に、これらは、Ｐｒｏｆｕｓｉｏｎを通してＥＧＦＲに対する高親和性結合について選択したすべての結合剤に対して実行した）。結合剤の多くが、単一ポイントでの細胞ベースのアッセイによって実行したのみであったので、１００ｎＭの一定濃度で７５％を超えるＥＧＦＲリン酸化の阻害を示した結合剤がこの分析中に含まれた。所与の濃度での阻害パーセントは、阻害％＝１００×濃度／（濃度＋ＩＣ５０）により、ＩＣ５０に関係がある。
通常、ＩＣ５０は、様々な濃度での阻害％についてデータをフィットさせることによって計算する。しかしながら、単一のデータポイントのみがそれぞれの結合剤について入手可能であることを考慮すれば、ＩＣ５０を計算するためにこの単一のデータポイントを使用することは不適当である。そのため、単一の濃度ポイントでのＥＧＦＲシグナリングの阻害パーセントは、結合剤の効力の近似値として使用した。結合剤は１００ｎＭの濃度で７５％の阻害を示しうるが、濃度を増加させると、該クローンはより高い濃度で１００％の阻害を示すであろう。阻害％は、ＩＣ５０に反比例する；つまり、阻害％が高いほど、ＩＣ５０は低くなり、結合剤はより強力になる。結合剤が１００ｎＭの濃度で７５％の阻害を示した場合、発明者らは、これを配列分析ＩＩのための「強力な」結合剤と見なした。しかしながら、１００ｎＭ濃度で７５％未満の阻害を示した結合剤は、大部分、ＥＧＦＲにまだ結合し、ＥＧＦＲシグナリングに対してまだ効果を有する。たとえば抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体ニモツズマブ（Friedlander E et al. ErbB-directed immunotherapy: antibodies in current practice and promising new agents. Immunol Lett 116: 126-140, 2008）については、治療薬として現在開発中であるが、それは、ＥＧＦＲリン酸化アッセイにおいて１００ｎＭ濃度で＜５％の阻害を示す（データ示さず）。アッセイしたすべての「強力な」結合剤の配列および１００ｎＭ濃度でのＥＧＦＲリン酸化のそれらの阻害％を図４５中に示す。
１００ｎＭ濃度で＞７５％の阻害を示した特有の１０Ｆｎ３ベースの結合剤の総数は、１１１であった。先のように、最初に、配列は、ループ中のそれぞれの位置のアミノ酸の頻度によって分析した（図３９〜４２）。これらの結合剤は、Ｐｒｏｆｕｓｉｏｎの間にＥＧＦＲに対する高親和性結合について選択されたすべての結合剤のサブセットであるので、それらはまた、配列モチーフ＃１に従う（上記を参照されたい）。分析したすべての「強力な」配列は、ＦＧループ配列パターン（位置１において「Ｄ／Ｎ」）に従う。すべての分析した特有の「強力な」配列のうち、９３％は、ＢＣループ（位置７〜８において「ＹＱ」）についてのパターンに従い、９８％は、ＤＥループ（位置３において脂肪族残基（「Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ａ」））についてのパターンに従う。分析したすべての「強力な」配列は、３つのパターンの配列モチーフ＃１のうちの少なくとも２つに従う。
注目すべきことに、１５アミノ酸ＦＧループ長もまた、「最も強力な」結合剤において高度に表わされるようである。１５アミノ酸長ＦＧループは、ＥＧＦＲに対する高親和性結合について選択されたすべての結合剤のうちのわずか５５％にしか相当しないが（配列分析Ｉ）、１５アミノ酸ＦＧループは、１００ｎＭ濃度でＥＧＦＲリン酸化の＞５０％の阻害を有する結合剤の８６％に相当し、＞７５％の阻害を有する結合剤の９１％に相当する（配列分析ＩＩにおける「強力な」結合剤）。そのため、より長い１５アミノ酸のＦＧループは、より大きな効力と関連する配列パターンであるようである。
分析した１１１の「強力な」配列のうち、１０のみが１０アミノ酸長ＦＧループを含有し、それらのうちの６つは特有である。そのため、単一配列モチーフは、あらゆる「強力な」１０アミノ酸ＦＧループ配列を包含し得る。配列モチーフ＃４は、これらの６つの配列に基づいて特徴づけた。
配列モチーフ＃４
ＦＧループ、１０アミノ酸長、「強力な」結合剤
（Ｄ／Ｎ）（Ｍ／Ｙ）（Ｍ／Ａ／Ｗ）（Ｈ／Ｆ／Ｙ）（Ｖ／Ｋ）ＥＹ（Ａ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ）Ｅ（Ｙ／Ｈ／Ｄ）
１５アミノ酸ＦＧループを有する「強力な」結合剤の配列分析はまた、どの残基位置が最も保存されているかをさらに明らかにし、配列モチーフ＃５を特徴づけることを可能にした。この配列モチーフ中の「Ｘ」は、優勢な３つのアミノ酸がない位置を示す。
配列モチーフ＃５
ＦＧループ、１５アミノ酸長、「強力な」結合剤
Ｄ（Ｙ／Ｆ／Ｗ）（Ｙ／Ｆ／Ｋ）（Ｎ／Ｐ／Ｄ）（Ｐ／Ｈ／Ｌ）Ｘ（Ｔ／Ｄ／Ｓ）（Ｈ／Ｇ／Ｙ）（Ｅ／Ｐ／Ｙ）（Ｙ／Ｈ）ＸＹＸＸＸ、
Ｘは任意のアミノ酸とする
分析したすべてのＥＧＦＲ結合剤は、親６７９Ｆ０９の子孫であり、配列「ファミリー」を構成する、つまり、それらはすべて前述の配列モチーフによる配列に関係がある。結合剤の６７９Ｆ０９ファミリーの様々なメンバーは、Ｔ５１Ｉスキャフォールド変異に耐性があり、結合活性を保持することができる。そのため、ＥＧＦＲに対する高親和性結合を有する結合剤をさらにもたらすために、Ｔ５１Ｉスキャフォールド変異は、前述の配列モチーフのいずれかと組み合わせることができた。
最後に、構造または機能に対してほとんど効果がないか、または全く効果がないタンパク質配列の中に類似する特性を有するアミノ酸を置換することができることが多いことに注意されたい。これは、実際、同様に１０Ｆｎ３ベースの結合剤についての場合であり、ループまたはスキャフォールド領域における保存的アミノ酸置換は、ＥＧＦＲに結合する結合剤をなおもたらすことができる。たとえば、結合剤Ｅ９８のＦＧループの第２の位置における「Ｈ」の「Ｙ」への置換は、結合剤Ｅ９９をもたらし、両方の結合剤は、ＥＧＦＲリン酸化を阻害する際に類似する効力を示す（図４５）。

Claims (41)

  1. ｂ）５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）に共有結合または非共有結合した、ａ）５００ｎＭ未満のＫＤでＩＧＦ−ＩＲを結合する１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であって、ここに、
    該ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号３のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号３のアミノ酸７６〜８３において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含み、
    該ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、配列番号１１２のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１１２のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１１２のアミノ酸７６〜９２において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含む、抗体様タンパク質二量体。
  2. ５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）に共有結合または非共有結合した、５００ｎＭ未満のＫＤでＩＧＦ−ＩＲを結合する１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であって、ここに、
    該ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含み、
    該ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｇＷＡＰＶＤＲＹＱＸｈ（配列番号１３７）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＲＤＶＹＸｊ（配列番号１３８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＸｌ（配列番号１３９）を有するＦＧループを含み、
    Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である、抗体様タンパク質二量体。
  3. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３が、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含み、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３が、アミノ酸配列ＳＷＷＡＰＶＤＲＹＱ（配列番号１１５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＲＤＶＹＴ（配列番号１１６）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＰ（配列番号１１７）を有するＦＧループを含む、請求項２に記載の抗体様タンパク質二量体。
  4. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３が、配列番号３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３スキャフォールドが、配列番号１１２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体様タンパク質二量体。
  5. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３が、ポリペプチドリンカーまたはポリエチレングリコール成分を介してＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合している、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体様タンパク質二量体。
  6. 配列番号１２６〜１３２のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗体様タンパク質二量体。
  7. ５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）を含む抗体様タンパク質であって、該ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３が、配列番号１１２のアミノ酸２１〜３０において記載されるアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号１１２のアミノ酸５１〜５６において記載されるアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号１１２のアミノ酸７６〜９２において記載されるアミノ酸配列を有するＦＧループを含む、抗体様タンパク質。
  8. ５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）を含む抗体様タンパク質であって、該ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３が、アミノ酸配列ＸｇＷＡＰＶＤＲＹＱＸｈ（配列番号１３７）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＲＤＶＹＸｊ（配列番号１３８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＸｌ（配列番号１３９）を有するＦＧループを含み、Ｘが任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌが０〜５から独立して選択される整数である、抗体様タンパク質。
  9. ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３が、アミノ酸配列ＳＷＷＡＰＶＤＲＹＱ（配列番号１１５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＲＤＶＹＴ（配列番号１１６）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＰ（配列番号１１７）を有するＦＧループを含む、請求項８に記載の抗体様タンパク質。
  10. 第２の第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）をさらに含む、請求項７から９のいずれか一項に記載の抗体様タンパク質。
  11. 第２の１０Ｆｎ３がＩＧＦ−ＩＲに結合する、請求項１０に記載の抗体様タンパク質。
  12. 第２の１０Ｆｎ３がポリペプチドリンカーまたはポリエチレングリコール成分を介してＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合している、請求項１０または１１に記載の抗体様タンパク質。
  13. ５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに共有結合または非共有結合した、５００ｎＭ未満のＫＤでＩＧＦ−ＩＲを結合する１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であって、ここに、
    該ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含み、
    該ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｇＤＳＧＲＧＳＹＱＸｈ（配列番号４０）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＧＰＶＨＸｊ（配列番号４２）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＨＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＸｌ（配列番号４４）を有するＦＧループを含み、
    Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である、抗体様タンパク質二量体。
  14. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３が、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含み、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３が、アミノ酸配列ＳＷＤＳＧＲＧＳＹＱ（配列番号３９）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＧＰＶＨＴ（配列番号４１）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＨＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＰ（配列番号４３）を有するＦＧループを含む、請求項１３に記載の抗体様タンパク質二量体。
  15. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３が、配列番号３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３スキャフォールドが、配列番号５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１３または１４に記載の抗体様タンパク質二量体。
  16. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３がポリペプチドリンカーまたはポリエチレングリコール成分を介してＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合している、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の抗体様タンパク質二量体。
  17. 配列番号２０、２１、２３、または２４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗体様タンパク質二量体。
  18. ５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）に共有結合または非共有結合した、５００ｎＭ未満のＫＤでＩＧＦ−ＩＲを結合する１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であって、ここに、
    該ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含み、
    該ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｍＶＡＧＡＥＤＹＱＸｎ（配列番号３４）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｏＨＤＬＶＸｐ（配列番号３６）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｑＤＭＭＨＶＥＹＴＥＨＸｒ（配列番号３８）を有するＦＧループを含み、
    Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、およびｒは、０〜５から独立して選択される整数である、抗体様タンパク質二量体。
  19. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３が、アミノ酸配列ＳＷＶＡＧＡＥＤＹＱ（配列番号３３）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＨＤＬＶＴ（配列番号３５）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＭＭＨＶＥＹＴＥＨＰ（配列番号３７）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含む、請求項１８に記載の抗体様タンパク質二量体。
  20. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３が、配列番号３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３が、配列番号７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１８または１９に記載の抗体様タンパク質二量体。
  21. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３スキャフォールドが、ポリペプチドリンカーまたはポリエチレングリコール成分を介してＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３スキャフォールドに共有結合している、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の抗体様タンパク質二量体。
  22. 配列番号２６、２７、２９、または３０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の抗体様タンパク質二量体。
  23. ５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）に共有結合または非共有結合した、５００ｎＭ未満のＫＤでＩＧＦ−ＩＲを結合する１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であって、ここに、
    該ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含み、
    該ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｓＬＰＧＫＬＲＹＱＸｔ（配列番号６０）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｕＨＤＬＲＸｗ（配列番号６２）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｙＮＭＭＨＶＥＹＳＥＹＸｚ（配列番号６４）を有するＦＧループを含み、
    Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｓ、ｔ、ｕ、ｗ、ｙ、およびｚは、０〜５から独立して選択される整数である、抗体様タンパク質二量体。
  24. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３が、アミノ酸配列ＬＰＧＫＬＲＹＱ（配列番号５９の残基３〜１３）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＨＤＬＲ（配列番号６１の残基１〜５）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＮＭＭＨＶＥＹＳＥＹ（配列番号６３の残基１〜１１）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または非共有結合した、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含む、請求項２３に記載の抗体様タンパク質二量体。
  25. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３が、配列番号３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３が、配列番号８２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２３または２４に記載の抗体様タンパク質二量体。
  26. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３スキャフォールドが、ポリペプチドリンカーまたはポリエチレングリコール成分を介してＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３スキャフォールドに共有結合している、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の抗体様タンパク質二量体。
  27. 配列番号５３、５４、８７、８８、９８、９９、１０４、または１０５のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の抗体様タンパク質二量体。
  28. ５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）に共有結合または非共有結合した、５００ｎＭ未満のＫＤでＩＧＦ−ＩＲを結合する１０Ｆｎ３を含む抗体様タンパク質二量体であって、ここに
    該ＩＧＦＩＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸａＳＡＲＬＫＶＡＸｂ（配列番号４６）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｃＫＮＶＹＸｄ（配列番号４８）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｅＲＦＲＤＹＱＸｆ（配列番号５０）を有するＦＧループを含み、
    該ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸｇＨＥＲＤＧＳＲＱＸｈ（配列番号１３４）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＸｉＧＧＶＲＸｊ（配列番号１３５）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＸｋＤＹＦＮＰＴＴＨＥＹＩＹＱＴＴＸｌ（配列番号１３６）を有するＦＧループを含み、
    Ｘは任意のアミノ酸であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、０〜５から独立して選択される整数である、抗体様タンパク質二量体。
  29. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３が、アミノ酸配列ＳＷＨＥＲＤＧＳＲＱ（配列番号１０９）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＧＧＶＲＴ（配列番号１１０）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＤＹＦＮＰＴＴＨＥＹＩＹＱＴＴＰ（配列番号１１１）を有するＦＧループを含むＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合または共有結合した、アミノ酸配列ＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲ（配列番号４５）を有するＢＣループ、アミノ酸配列ＰＫＮＶＹＴ（配列番号４７）を有するＤＥループ、およびアミノ酸配列ＴＲＦＲＤＹＱＰ（配列番号４９）を有するＦＧループを含む、請求項２８に記載の抗体様タンパク質二量体。
  30. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３が、配列番号３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３が、配列番号１０７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２８または２９に記載の抗体様タンパク質二量体。
  31. ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３スキャフォールドが、ポリペプチドリンカーまたはポリエチレングリコール成分を介してＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３スキャフォールドに共有結合している、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の抗体様タンパク質二量体。
  32. 配列番号１１８〜１２５のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の抗体様タンパク質二量体。
  33. 請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体様タンパク質二量体または抗体様タンパク質を含み、本質的に発熱物質を含まない、薬学的に許容できる組成物。
  34. 請求項３３に記載の組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、対象における過剰増殖障害を治療するための方法。
  35. ５００ｎＭ未満のＫＤでＥＧＦＲを結合する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）を含む抗体様タンパク質であって、該ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３は、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＸＹＱを含むＢＣループ、アミノ酸配列ＸＸ（Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ａ）Ｘを含むＤＥループ、およびアミノ酸配列（Ｄ／Ｎ）Ｘｎを含むＦＧループを含み、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは９〜１４のアミノ酸である、抗体様タンパク質。
  36. ｎは１４である、請求項３５に記載の抗体様タンパク質。
  37. 第２の第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）をさらに含む、請求項３５または３６に記載の抗体様タンパク質。
  38. 第２の１０Ｆｎ３がＩＧＦ−ＩＲに結合する、請求項３７に記載の抗体様タンパク質。
  39. 第２の１０Ｆｎ３がポリペプチドリンカーまたはポリエチレングリコール成分を介してＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３に共有結合している、請求項３７または３８に記載の抗体様タンパク質。
  40. 請求項３５から３９のいずれか一項に記載の抗体様タンパク質を含み、本質的に発熱物質を含まない、薬学的に許容できる組成物。
  41. 請求項４０に記載の組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、対象における過剰増殖障害を治療するための方法。
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